PT689426E

PT689426E - Agente terapeutico para o tratamento de melanomas

Info

Publication number: PT689426E
Application number: PT94911013T
Authority: PT
Inventors: Lance Elliott Schlipalius
Original assignee: Cognis Australia Pty Ltd
Priority date: 1993-03-22
Filing date: 1994-03-22
Publication date: 2000-11-30
Also published as: WO1994021231A1; DK0689426T3; ATE192921T1; ES2149264T3; US5897871A; US5705180A; JPH08510994A; EP0689426B1; DE69424537D1; EP0689426A1; DE69424537T2; EP0689426A4; GR3034167T3

Description

DESCRIÇÃO "AGENTE TERAPÊUTICO PARA O TRATAMENTO DE MELANOMAS"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a um agente terapêutico para o tratamento de um melanoma ou melanomas e, ainda, a um método para o tratamento.

Antecedentes da Invenção

Os melanomas são provocados geralmente pela exposição da pele ao sol. As pessoas de pele clara são as que correm o maior risco, em especial, as com propensão para o desenvolvimento de sinais.

Os melanomas surgem devido a uma alteração nas células normais da pele, os melanócitos, os quais produzem o pigmento castanho denominado melanina e que é reconhecido por bronzeado. Os sinais e sardas são o resultado de áreas da pele com muitos melanócitos. A incidência de luz nos melanócitos é um dos factores que pode provocar o seu crescimento e divisão anormais, podendo originar um melanoma. Os melanomas podem ser malignos, espalhando-se a outras partes do corpo. Os melanomas que não se propagam são denominados de benignos.

Apesar dos melanomas se formarem normalmente na pele exposta, eles podem começar em locais como a boca ou o intestino.

Os melanomas crescem em dimensão e necessitam de ser retirados cirurgicamente antes que se espalhem e tomem outras partes do corpo. No caso de serem atingidos os órgãos internos, a remoção e o tratamento tornam- se mais difíceis, radioterapia. sendo necessário a utilização de quimioterapia ou Têm sido posta a hipótese dos carotenoides e, em particular o beta-caroteno, poderem reduzir o risco de cancro da mama, pulmões, cólon, próstata e cervical, doenças e ataque do coração e poderem retardar a degeneração macular. A este respeito, uma das hipóteses é que nos mamíferos o beta-caroteno é convertido em vitamina A e análogos ou retinoides (ver Moon RC: Aspectos comparativos de carotenoides e retinoides como agentes quimiopreventivos para o cancro. J Nutr 119:127-134, 1989). É esta actividade da pró-vitamina A e a sua capacidade em prevenir os efeitos oxidantes nocivos que tornou os carotenoides e, em particular, o beta-caroteno um composto de interesse nos estudos quimiopreventivos. Os anti-oxidantes são utilizados, entre outras coisas, para eliminar os radicais livres, produtos secundários do metabolismo normal nas células. O beta-caroteno tem também sido utilizado no tratamento de erythropoietic protoporphyria (EPP). A EPP é uma doença genética que provoca uma insuficiência no metabolismo de compostos de porfirina, o que causa um empolamento rápido da pele quando exposta à luz solar.

Ao considerar-se a utilização de composições de carotenoides para aplicação em seres humanos surge de imediato uma dificuldade resultante da natureza dos mesmos. Na EP 0479066 o beta-caroteno estabilizado em oposição a recristalização, de acordo com o método aí descrito, foi utilizado para melhorar a fertilidade de animais agrícolas. A estabilização do beta-caroteno foi conseguida utilizando equipamento e procedimentos que permitiram controlar com precisão a reacção de isomerização. β «*«4·

Os carotenoides são lipófilos, ou seja, insolúveis em água em quantidades úteis. Pensa-se que eles sejam transportados na corrente sanguínea sob a forma de lipoproteinas de baixa densidade.

Actualmente, a principal forma de introdução dos carotenoides no corpo é por via oral. WO 93/04598 descreve um processo de produção de uma composição carotenoide sem necessidade de ingredientes não naturais ou sintéticos. Desta forma, o produto carotenoide apresenta uma composição inteiramente natural e pode ser utilizado como aditivo ou agente corante em produtos alimentares, bebidas e outros produtos comestíveis. A utilização de produtos naturais em detrimento de ingredientes sintéticos atrai o consumidor, aumentando assim a procura do produto. A introdução dos carotenoides por via oral é frequentemente insatisfatória, pois a fraca absorção da composição pelo canal alimentar limita as concentrações obtidas no sangue. Além disso, irá existir um atraso substancial até se atingir o nível exigido de carotenoides na corrente sanguínea ou num órgão específico. Por vezes, não é de todo possível atingir o nível exigido devido à incapacidade de alguns indivíduos em absorver capazmente os carotenoides, em especial o beta-caroteno. A capacidade de absorção do beta-caroteno nos diferentes indivíduos apresenta um intervalo com uma diferença aproximadamente décupla. Existem mais de 500 tipos de carotenoides isolados, mas só cerca de 15 foram identificados na corrente sanguínea.

Os médicos procuram muitas vezes administrar os compostos por injecção ou por via intravenosa, em vez de por ingestão oral. No entanto, é muito difícil a administração das composições carotenoides por injecção ou via intravenosa devido à sua insolubilidade em água. Para que o composto fique acessível às células do corpo, terá que ser dispersível numa base aquosa. A este respeito, a base tem de ser compatível com, por exemplo, a corrente sanguínea ou linfa e o material deve ser preparado numa forma esterilizada biologicamente. A base não pode ser tóxica para as células humanas.

Tem sido realizados vários estudos in vitro para determinar o efeito do beta-caroteno em células normais e transformadas, usando solventes para a solubilização do beta-caroteno, por exemplo, tetrahidrofurano, butanol, clorofórmio, hexano, dimetilsulfóxido, etanol ou uma micela liposómica. A WO 89/06977 utiliza a capsulação de retinóides em liposomas para aumentar a disponibilidade do retinoide no local alvo, contornando assim a necessidade de receptores na superfície celular. A capsulação do retinoide em liposomas contribui também para uma redução da toxicidade.

Em WO 93/13751, os retinóides são formulados da mesma forma que em WO 89/06977 (Supra). No entanto, o retinoide é usado em conjunção com um agente promotor da sua intercalação na região hidrófoba do liposoma, o que contribuí para o aumento da quantidade de retinoide entregue pelo liposoma. As preparações anteriores de liposomas apresentam toxicidade nas culturas de células, para além de terem uma aplicação muito limitada (ver Bertram JS, Pung A, Churley M, et al: Protecção de diversos carotenoides contra a transformação neoplásica por indução química. Carcinogénese 12:671-678,1991; Hazuka MB, Prasad-Edwards, J). Newman F, et al: Indução da diferenciação morfológica pelo beta-caroteno e diminuição da actividade do adenilato de ciclase na cultura de células de melanoma. J am Coll Nutr 9:143-149, 1990; Schultz TD, Chew BP, Seaman WR, et al: Efeito inibitório conjugado de derivados diénicos do ácido linoleico e beta-caroteno no crescimento in vitro de células humanas cancerígenas. Canc Letters 63; 125-133, 1992; Schwartz JL, Shklar G: O efeito citotóxico selectivo de carotenoides e um tocoferol em células humanas cancerígenas in vitro. J Oral Maxilloc Surg 50:367-373, 1992; Schwarz JL, Tanaka J, Khandekar V, et al: Beta-caroteno e/ou Vitamina E como modeladores de agentes de alquilação em células de carcinoma humano escamoso. Can Chemother Pharmacol 29:207-213, 1992; Zhang L-X, Cooney RV, Bertram JS: Lacuna na transmissão de comunicação e inibição da peroxidação de lípidos em células C3H/10T1/2 proporcionadas pelos carotenoides: relação com a sua acção quimiopreventiva do cancro.

Carcinogénese12:2109-2114, 1991; e Zhang L-X, Cooney RV, Bertràm JS: Sobre-regulação conexiva dos carotenoides na expressão do gene 43 independente da sua provitamina A ou das propriedades anti-oxidantes. Canc Res 52: 5707-5712,1992). Estes solventes revelaram possuir um efeito tóxico, o qual é função da concentração. Além disso, como são incompatíveis com o sangue e linfa humanos, é impossível a sua aplicação em preparações injectáveis ou intravenosas.

Por conseguinte, as investigações evoluíram no sentido de desenvolver uma composição carotenoide fosse bem aceite pelo corpo humano e outros animais e fosse eficaz no tratamento de melanomas.

Descrição da Invenção

Numa versão da invenção é fornecido um agente terapêutico para o tratamento de um melanoma ou melanomas, o qual inclui uma mistura de: (a) um componente solúvel ou dispersível em água; (b) um componente emulsionante; e (c) um componente carotenoide insolúvel em água num meio portador apropriado.

De preferência, o composto solúvel ou dispersível em água varia entre 30% a 90%, em massa.

Numa versão mais aconselhável da invenção, o componente solúvel ou dispersível em água é seleccionado do conjunto formado por: álcoois açucarados, açucares, aminoácidos, água, vitaminas, plasma ou soro sanguíneo, linfa, soluções tampão e combinações e polímeros destes materiais, e injectáveis que são bastante conhecidos na industria, como sejam preparações minerais salinas e soluções de dextrose ou combinações destes componentes.

De preferência, o álcool açucarado é o glicerol, numa concentração, em massa, entre 30% e 90%.

Em outra versão da invenção, o componente emulsionante é seleccionado de entre glicéridos (de preferencia estruturas mono- ou diglicéridas de origem vegetal ou animal), ésteres poligliceróis, lecitinas e outros fosfolípidos. O glicérido preferido é o Oleato de glicerilo.

Em outra versão da invenção, o componente carotenóide insolúvel em água é o beta-caroteno. Este componente é compreende uma composição com 2% a 50 %, em massa, de beta-caroteno em óleo de soja. De preferencia uma concentração em beta-caroteno entre 20% e 40%, em massa, sendo mais aconselhável 30 %. O beta-caroteno é, de preferência, uma mistura de cis e trans-beta-caroteno. Usualmente, o teor de cis-beta-caroteno varia entre 50% e 90%, se possível entre 70% e 85%. É aconselhável o predomínio de 9-cis-beta-caroteno numa gama entre 60% a 90%. Na versão mais aconselhada, o componente carotenóide activo da composição varia entre 0,1% e 10%, em massa, de preferência entre 1% e 5%. O meio portador utilizado para transportar o componente carotenóide insolúvel em água é seleccionado de um grupo formado por: preparações de ácidos gordos, lípidos triglicéridos e lípidos não saponificáveis, certos hidrocarbonetos derivados do petróleo incluindo o octadecano e combinações dos compostos citados.

Os lípidos triglicéridos são seleccionados de um grupo composto por: gorduras ou óleos de origem vegetal, tal como óleos provenientes de sementes, incluindo as sementes de soja, algodão e girassol, e de origem animal

incluindo peixe e vaca. O meio portador corresponde a um teor enfre 0,1% e 40%, em massa, de preferencia entre 1% e 20%.

Em outra versão da invenção, o agente é diluído para introdução directa na corrente sanguínea ou no melanoma ou melanomas. A solução de diluição é escolhida, de preferência, de entre um conjunto formado por: soluções aquosas tampão, preparações intravenosas normais (incluindo solução salina isotónica ou solução de dextrose a 5%) e soro sanguíneo e combinações dos compostos anteriores para administração a células in vivo e meios de cultura. A invenção apresenta também um método de tratamento de um melanoma ou melanomas, incluindo o passo de introdução directa, na corrente sanguínea ou no melanoma ou melanomas, de uma quantidade eficaz do agente terapêutico anteriormente descrito. A quantidade eficaz varia entre 0,1 e 10 microgramas/ml, de preferencia entre 0,3 e 3 microgramas/ml de agente terapêutico em contacto com as células de melanoma.

De preferencia, o agente terapêutico é introduzido directamente na corrente sanguínea por injecção ou via intravenosa. É mais aconselhável a injecção directa do agente terapêutico no local do melanoma ou melanomas. O conceito “mistura” como é aqui utilizado pretende abarcar vários estados físicos, incluindo emulsões, soluções e suspensões cristalinas.

Exemplos

Os seguintes exemplos demonstram a eficácia das composições carotenoides no tratamento de melanomas e a relativa não toxicidade dessas composições. A figura 1 é composta por gráficos que apresentam o efeito dos portadores na síntese do DNA em melanoma humano metastático e em melanócitos neonatais. Em resumo, a estirpe de células de melanoma c81-46a e

melanócitos foram incubados durante 72 horas com tetrahidrofurano e uma mistura de dimetilsulfóxido:etanol de 3:1. Cada ponto de dados corresponde à média de 6 cavidades +/- erro Standard em percentagem quando comparado com o controlo. A figura 2 apresenta um gráfico com o efeito do beta-caroteno na síntese do DNA em melanoma humano metastático e em melanócitos neonatais. Em resumo, as estirpes de células de melanoma c83-2c, c81-46c, c81-46a, c81-61 e melanócitos (MC) foram incubados durante 72 horas com beta-caroteno. Cada ponto de dados corresponde à média de 6 cavidades +/- erro Standard em percentagem quando comparado com o controlo. Concentração de diluente (soja) = 0,05% O gráfico da figura 3 evidencia o efeito do beta-caroteno na proliferação do melanoma humano metastático e de melanócitos neonatais. Em resumo, as estirpes de células de melanoma c83-2c, c81-46c, c81-46a e melanócitos (MC) foram incubados durante 72 horas com beta-caroteno e a viabilidade avaliada através de exclusão azul trypan. Cada ponto de dados corresponde à média de 3 cavidades +/- erro Standard em percentagem quando comparado com o controlo. Concentração de diluente (soja) = 0,05%. A figura 4 apresenta um gráfico com o efeito do beta-caroteno na síntese do DNA em células normais e de tumor humano. Em resumo, carcinoma epidermoide A431, adenocarcinoma do cólon WiDr, fibroblastos pulmonares fetais e adenocarcinoma pulmonar Lu-CSF-1 foram incubados durante 72 horas com beta-caroteno. Cada ponto de dados corresponde à média de 6 cavidades +/- erro Standard em percentagem quando comparado com o controlo. Concentração de diluente (soja) = 0,05%. A figura 5 corresponde a um gráfico que apresenta efeito do 9-cis-beta-caroteno na síntese do DNA em melanoma humano metastático e em

melanócitos neonatais. Em resumo, a estirpe de células de melanoma cB1-46a e melanócitos foram incubados durante 72 horas com 9-cis-beta-caroteno. Cada ponto de dados corresponde à média de 6 cavidades +/- erro Standard em percentagem quando comparado com o controlo. Concentração de diluente (soja) = 0,05%.

As figuras 1, 2 e 4 referem-se à “Percentagem de Incorporação de Timidina Tritiada” que é uma medida da actividade de síntese do DNA.

Em seguida, são apresentadas em pormenor as experiências realizadas no âmbito desta invenção.

Materiais (a) Culturas de células O método utilizado para isolar e desenvolver a cultura de melanócitos é uma combinação de procedimentos elaborados por Eisinger e Marko (ver Eisinger M, Marko O: Multiplicação selectiva in vitro de melanócitos humanos normais em presença de éster forbólico e toxina da cólera. Proc Natl Acad Sei 79:2018-2022,1982) e Halaban e Alfano (ver Halaban R, Alfano FD: Eliminação selectiva de fibroblastos de culturas de melanócitos humanos normais. In Vitro 20: 45-47, 1984).

Resumidamente, foram recolhidas amostras de foreskin de recém-nascidos e procedeu-se ao isolamento e transferencia dos melanócitos para um frasco T-75. Os melanócitos neonatais primários foram cultivados num meio MCDB 153 (Irvine Sei) como descrito por Halaban (ver Halaban R, Ghosh S, Baird A: bFGF é o factor de crescimento putativo para os melanócitos humanos normais. In Vitro Cell Develop Biol 23: 47-52,1987) e modificado por Kath (ver Kath R, Rodecsk U, Menssen HD et al: Progressão de tumores no sistema melanócito humano: Anticancer Res 9: 865-872, 1987). A contaminação por

fibroblastos foi eliminada adicionando geneticina (250 microgramas/ml) ao meio durante 2 dias. As estirpes de células de melanomas (c81-46a, c81-46c, c81 -61, c83-2c) foram desenvolvidas em F-10 (Fischer sei.) com 5% de soro de vitela fetal, 5% de soro de vitela recém-nascida (Gemini Sei.), penicilina (100 unidades/ml) e estreptomicina (0,1 miligramas/ml) (Sigma). O número de passagens para as estirpes de células de melanoma usadas foi inferior a 8 e para os melanócitos inferior a 5. As estirpes de células de melanonas tinham sido previamente caracterizadas (ver Bregman MD, Meyskens FL: Inibição in vitro da formação de colónia de células de melanona humano maligno por acção da prostaglandine A1. Can Res 43:1642-1645, 1983; Thomson SP, Meyskens FL: Métodos para a medição da capacidade de auto-renovação de células clonogénicas provenientes de biópsias de melanoma humano metastático e maligno. Can Res 42:4606-4613, 1982; e Yohem KH, Slymen DJ, Bregman MD, et al: Sobrevivência à radiação da murina e células de melanoma humano utilizando dois sistemas de análise: monocamada agar suave. Br J Canc 57:64-69, 1987). Foram também testado outras linhas de células de tumores, nomeadamente A-431 ( um carcinoma epidermoide humano), WiDr (um adenocarcinoma do cólon humano), WI-38 (fibroblastos pulmonares normais de fetos humanos) (todos obtidos na Colecção Americana de Tipos de Culturas) e Lu-CSF-1 (adenocarcinoma pulmonar humano) (fornecido pela Universidade da Califórnia em Irvine). Estas quatro linhas de células foram desenvolvidas em meio DMEM (Fischer Sei.), com 5% de soro de vitela fetal, 5% de soro de vitela recém-nascida, penicilina (100 unidades/ml) e estreptomicina (0,1 miligramas/ml). (b) Produtos Químicos O beta-caroteno foi isolado da alga Dunaliella salina e representa 85-90% do total de carotenoides, sendo metade do restante oxi-carotenoides (luteina e zeaxantina) e a outra metade alfa-caroteno. O gama-caroteno não é normalmente detectado na caracterização por cromatografia liquida de alta pressão. O óleo de soja foi obtido da semente de soja. Foi feita uma

suspensão cristalina de beta-caroteno e óleo de soja. Esta fase resultante foi então emulsionada formando a composição descrita, a qual em seguida esterilizada a quente ou por filtração. Antes da testagem nas células, cada recipiente da composição foi sub-aliquotada em ampolas criogénicas (Costar), sendo utilizado uma ampola nova em cada experiência. Ao longo de todo o procedimento, o beta-caroteno foi protegido da luz directa.

Foi utilizado tetrahidrofurano e etanol (Fischer Sei.) da melhor qualidade disponível. O dimetilsulfóxido foi adquirido à Sigma.

Os pormenores da composição de beta-caroteno emulsionado são os seguintes: % em massa (i) Beta-caroteno 2,4 e (ii) Mistura de soja Óleo de soja 6,8 Oleato de glicerilo 7,2 Glicerol 66,7 Água 16,9 A composição acima mencionada pode ser preparada utilizando o seguinte método. A suspensão cristalina de beta-caroteno em óleo de soja é aquecida e é adicionado o oleato de glicerilo. Esta fase oleosa é dispersada numa fase de glicerol-água por mistura vigorosa, seguida de homogeneização a 60-70°C. A pressão de homogeneização depende do tipo de máquina utilizada, mas situa-se, normalmente, entre os 8000 e 10000 PSI. O produto obtido é então esterilizado por processamento a quente. Em geral, o processamento a quente é realizado num autoclave a 121°C durante 15 minutos num recipiente

I apropriado para distribuição (ampola de vidro de 3 ml). Opcionalmentè, é adicionado 0,3% do anti-oxidante tocoferol, por forma a dominar qualquer toxicidade que possa surgir durante algum período de tempo. (c) Condições Experimentais É, em seguida, descrito o processo de medição da incorporação de timidina tritiada no DNA. As células foram colocadas numa placa de 96 cavidades (Falcon) e deixadas desenvolver até 50% de confluência (24 horas), após o qual foi adicionado meio fresco, meio fresco com beta-caroteno ou meio fresco com um portador (concentração do portador = 0,05%) e incubado durante 72 horas. A síntese de DNA foi medida por marcação com [metil - 3H]-timidina (2,5 uCi/ml, 20 Ci/mmol Dupont - New England Nuclear), o qual foi adicionado ao meio durante as últimas 15 horas do período de tratamento. Após a incubação, procedeu-se à colheita das células utilizando um aparelho de colheita de células PhD (Cambridge Research Inc.). A radioactividade incorporada foi determinada por contagem de cintilação líquida (LS5000TD, Beckman Instruments) com uma eficácia de 62,7%. Cada ponto corresponde à media de 6 cavidades +/- a percentagem de erro padrão. A multiplicação celular foi determinada da seguinte maneira. As células foram cultivadas em 6 placas de cavidades (Falcon) e desenvolveram até 50% de confluência (24 horas). Em seguida, foi adicionado meio fresco e as células ficaram a incubar durante 72 horas. Após a incubação, procedeu-se à colheita das células com tripsina 0,25% e à lavagem. As células foram contadas num contador Coulter (Coulter Instruments) e a viabilidade determinada por exclusão azul trypan. Cada ponto corresponde à média de 3 cavidades +/- a percentagem de erro padrão.

Resultados

Para determinar o efeito de alguns portadores de beta-caroteno na actividade de melanócitos normais e de uma estirpe de célula de melanoma metastático ί c81-46a, foi medida a incorporação de timidina. Juntamente com as células foram incubados, durante 72 horas, tetrahidrofurano ("THF”), uma mistura de dimetilsulfóxido/etanol (“DMSO/ETOH”) 3:1 e a mistura de soja, a 0,005%, 0,05% e 0,5% de concentração.

Como é possível verificar na figura 1, a mistura de soja não provocou qualquer efeito nas células de melanoma, independentemente da concentração de diluente. O THF apresentou apenas um pequeno efeito nas células de melanoma, enquanto que a mistura DMSO/ETOH provocou, com a concentração mais elevada, uma diminuição na incorporação de 40%. A figura 2 mostra o efeito causado pelo beta-caroteno no portador de soja em melanócitos normais e em quatro estirpes de células de melanoma metastático. Para uma concentração de 0,1 microgramas/ml, o beta-caroteno apresenta um ligeiro efeito inibitório no crescimento da célula de melanoma. A estirpe mais sensível foi a c81-61, com um decréscimo de 20% na síntese de DNA. No entanto, os melanomas apresentaram uma resposta bastante distinta à acção do beta-caroteno a uma concentração de 1,0 microgramas/ml, desde a inexistência de qualquer efeito até uma inibição de 40%. Para a concentração mais elevada de beta-caroteno (10 microgramas/ml), os melanócitos normais e dois dos melanomas (c81-61, c81-46c) apresentaram uma inibição superior a 95%. No entanto, as estirpes c81-46a e c83-2c não foram afectadas em cerca de 20-25%.

Para além disso foi determinada, por exclusão azul trypan, a viabilidade dos melanócitos normais e dos quatro melanomas metastáticos (figura 3). A uma concentração de 1,0 microgramas/ml, o beta-caroteno reduziu a viabilidade em 20%, enquanto que, para 10 microgramas/ml não foram detectados quaisquer melanócitos em bom estado. O mais surpreendente é que o beta-caroteno em concentração mais elevada causou a inviabilidade das células de melanócitos, não sendo afectados 60% dos melanomas.

Também foi avaliada a resposta de outro tipo de tumores ao beta-carotenb. A linha de células de carcinoma epidermoide humano A-431 não foi afectada, mesmo com uma concentração de beta-caroteno de 10 microgramas/ml. A linha de célula de cólon, os fibroblastos pulmonares normais e o adenocarcinoma pulmonar apresentaram uma inibição mínima. (10-20%). A figura 5 apresenta o efeito do 9-cis-beta-caroteno diluído em mistura de soja nos melanócitos normais e numa estirpe de células de melanoma metastático. Para uma concentração de 1,0 microgramas/ml, tanto o melanócito normal como a estirpe c81-46a foram inibidas em cerca de 50 %. Para uma concentração superior de 9-cis beta-caroteno (10,0 microgramas/ml), a estirpe de células de melanona metastático teve uma inibição de 90%, enquanto que no melanócito a inibição foi ligeiramente inferior à obtida com 1,0 micrograma/ml.

Sem querer ficar limitado a qualquer teoria específica, parece que a mistura acima ilustrada é uma emulsão superfina.

Nos estudos in vitro realizados até à data foram utilizados variados solventes químicos como portadores do beta-caroteno. Foi descoberto que esses solventes tem um efeito citotóxico. O teste actual, tal como descrito anteriormente, revelou pela medição da incorporação de timidina tritiada que a mistura de soja não afectou o crescimento dos melanócitos humanos normais ou estirpes de células de melanoma metastático. No entanto, solventes como o THF e mistura DMSO/ETOH inibem, em função da concentração utilizada, a síntese de DNA. O inovador portador de beta-caroterio - a mistura de soja - permite avaliar o efeito do beta-caroteno sem a perturbação da toxicidade dos solventes duros que interfere com a resposta.

Os melanócitos foram seleccionados como o tipo de célula humana que é sensível à inibição por variados produtos químicos. Os resultados dos testes indicam que a mistura de soja não impede a incorporação da timidina tritiada no DNA do melanócito ou a viabilidade da célula, como foi determinado pela exclusão azul de trypan.

Lisboa, \ 6 A6Q. 2000

Agents Gíí

Dra. Maria. Silvina Ferreira R. Castilho, 201-3.° E - 1070-051US30A Telefs. 213 851 339-213 854613

Claims

1. Utilização de uma composição para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um melanoma ou melanomas, contendo a referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz de: (a) um componente solúvel ou dispersível em água; (b) um componente emulsionante; e (c ) um componente carotenoide insolúvel em água, o qual é constituído por beta-caroteno num meio portador apropriado.
2. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que o componente solúvel ou dispersível em água varia entre 30% e 90% em massa.
3. Utilização de uma composição de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que (a) é seleccionado de entre álcoois açucarados, açucares, aminoácidos, soro ou plasma sanguíneo, linfa, soluções tampão, combinações dos anteriores, polímeros dos anteriores, preparações minerais salinas e soluções de dextrose ou combinações dos anteriores.
4. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 3, em que o álcool açucarado é o glicerol.
5. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 4, em que o teor de glicerol varia entre 30% e 90% em massa.
6. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o teor do componente emulsionante varia entre 0,2% e 20% em massa.
7. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o teor do componente emulsionante varia entre1.0% e 10% em massa.
8. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o componente emulsionante é seleccionado de entre glicéridos (incluindo estruturas mono- e diglicérídas de origem animal e vegetal), ésteres de poliglicerol, lecitinas e outros fosfolípidos.
9. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 8., em que o glicérido é o oleato de glicerilo.
10. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o componente carotenoide insolúvel em água é formado predominantemente por beta-caroteno.
11. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o componente carotenoide insolúvel em água inclui pelo menos 85%, em massa, de beta-caroteno.
12. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 9, em que o componente carotenoide insolúvel em água inclui entre 85% e 90%, em massa, de beta-caroteno.
13. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que o componente carotenoide insolúvel em água inclui 10% a 15% em massa de oxi-carotenoides e alfa-caroteno.
14. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, em que o beta-caroteno é uma mistura de cis beta-caroteno e todo trans-beta-caroteno.
15. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 14, erri que o teor de cis-beta-caroteno no beta-caroteno varia entre 50% e 90%.
16. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 14, em que o teor de cis-beta-caroteno no beta-caroteno varia entre 70% e 85%.
17. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, em que o cis-beta-caroteno é constituído essencialmente por 9-cis-beta-caroteno.
18. A utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 14. a 16., em que o teor de 9-cis-beta-caroteno no beta-caroteno varia entre 60% e 90%.
19. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o componente carotenoide insolúvel em água varia entre 0,1% e 10%, em massa, da composição.
20. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o componente carotenoide insolúvel em água varia entre 1% e 5% em massa.
21. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que o meio portador utilizado para transportar o componente carotenoide insolúvel em água é seleccionado do grupo formado por preparações de ácidos gordos e lípidos triglicéridos e lípidos não saponificáveis, hidrocarbonetos derivados do petróleo incluindo o octadecano e combinações dos compostos anteriores.
22. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 21, em que os lípidos triglicéridos são seleccionados do grupo formado por gorduras e/ou

jr óleos de origem vegetal, incluindo óleos provenientes de semente como as sementes de soja, algodão ou girassol, e de origem animal, incluindo peixe e vaca.
23. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que o meio portador varia entre 0,1% e 40% em massa.
24. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que o meio portador varia entre 1% e 20% em massa.
25. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de (a), (b) e (c ) para o tratamento de melanoma ou melanomas é utilizada de forma diluída.
26. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 25, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de (a), (b) e (c ) é diluída com um solvente seleccionado do conjunto formado por soluções tampão aquosas, preparações intravenosas normais, soro sanguíneo e combinações dos compostos anteriores.
27. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de (a), (b) e (c ) é introduzida na corrente sanguínea ou entra em contacto com as células de melanoma.
28. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 27, em que a quantidade eficaz compreende entre 0,1 e 10,00 microgramas de beta-

caroteno por ml de composição que entra em contacto com as células de melanoma.
29. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 27, em que a quantidade eficaz compreende entre 0,1 e 3,0 microgramas de beta-caroteno por ml de composição que entra em contacto com as células de melanoma.
30. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 27, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de (a), (b) e (c ) é introduzida por injecção ou via intravenosa.
31. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 27. a 29., em que a quantidade terapeuticamente eficaz de (a), (b) e (c ) é introduzida por injecção no local do melanoma ou melanomas.
32. Utilização de uma composição para o fabrico de um medicamento para o tratamento de melanomas ou melanoma, contendo a referida composição uma quantidade eficaz de agente terapêutico que incluí: (a) um álcool açucarado; (b) um glicérido; e (c) um componente carotenóide insolúvel em água que contem beta-caroteno eficaz no tratamento de melanoma ou melanomas, diluído em óleo.
33. Agente terapêutico para o tratamento de um melanoma ou melanomas, contendo uma quantidade eficaz de uma composição formada por: (a) um álcool açucarado; (b) um glicérido; e (c) um componente carotenóide insolúvel em água que contem beta-caroteno eficaz no tratamento de melanomas, diluído em óleo.
34. Agente anti-tumor que inibe o crescimento da célula de melanoma, formado por: (a) 30% a 90%, em massa, de água e/ou um componente solúvel ou dispersível em água; (b) 0,2% a 20%, em massa, de um componente emulsionante; e (c ) 0,1% a 10%, em massa, de um carotenoide insolúvel em água contendo beta-caroteno num meio portador apropriado. 1 6 A60. 2000

Lisboa Dra. Maria Siivina Ferreira Agente Oíis;;! d? frcr-sit^is industrial R. Castilho, 2GÍ-3.0 E- 107C-051 LISBOA Telefs. 213 851 339- 213 854 613