JPH07503014A - 癌の治療におけるカロチノイド類の処方及び用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 癌の治療におけるカロチノイド類の処方及び用法この出願は１９９０年９月２５ 日付で出願された米国出願第５８８．１４３号の一部継続であり、後者は１９８ ８年２月４日付で出願された米国出願第１５２．１８３号の分割であって、現在 放棄されている。

２つの上記出願は参考のため本明細書に組み込まれる。

本発明はリポソーム又は他の脂質キャリア粒子中に封入されたカロチノイド類の 治療組成物に関する。

レチノイド類は、その分子群にはレチノール（ビタミンＡ）の天然及び合成双方 のアナログを含むが、細胞分化及び細胞増殖双方のコントロールにとり強力な作 用物質であることが５０年以上にわたり知られていた（Ｗｏｌｂａｃｈ　ｃｔ　 ａｌ、、Ｉ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、４２ニア５３−７７７．１９２５）　。いくつ かの研究では、レチノイド類が実験動物においてインビボで発癌プロセスを抑制 できることを示した（考察のため、例えばＢｏｌｌａｇ、Ｃａｎｃｅ＋　Ｃｈｅ ｍｏｔｂｅ＋、Ｐｈａｔｍａｃｏ１．．３：２０７−２１５、１９７９及び５ｐ ｏｏｎ　ｅ＋　＋１．、Ｉｎ　１ｅｄｅｃｋ　ｅｌ　１＋、　（ｅｄｓ、）。

１ｎｂｉｂｉｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｏｏｏ＋　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（腫瘍誘導及び発生の阻害）、Ｈ，７１−１００，Ｎ！ｖ　 Ｙｏｌｋ：　ＰｌｅｎｏｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｌ３．、＋９８１参照）。

これらの結果はヒトで癌予防にレチノイド類を用いる現試行の基礎である。更に 、レチノイド類が悪性表現型の発生をインビトロで抑制できることを示唆する証 拠もあり（考察のため、例えばＢｅ＋ｔ＋ａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ：　Ｍ、Ｓ 、Ａ＋ｎｏｔｔ　ｅ）　ａｌ、　（ｅｄｓ、）。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　１ｎｌｅ＋ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　 ａｎｄ　ｃａｎｃｅ＋（栄養及び癌の分子相互作用）、　ｐｐ、　３１５−３３ ５．　Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ、　ＲｉｙｅｎＰｒｅｓＳ＋１９８２；　Ｌｏｔａｎ　 ｃｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄｔｎｅｄＩａｌｉｏｎ　 ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　ｖｉｔａｍｉｎｓ（ビタミンによる癌の調節及び媒 介）、　ｐｐ、　２１１−２２３．　Ｂａ＋ｅｌ：　Ｓ、　ｌａｒｇｅ「ＡＧ、 　１９８３参照）、このため癌予防におけるレチノイド類の使用可能性について 示唆している。しかも、最近になり、レチノイド類はある十分に形質転換された 侵襲性新生物細胞で効果を発揮できて、ある場合には増殖を抑制しくＬａｕｉｎ 。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｔ＋ｙｓ、　Ａｃｔａ、　６０５：３３−９１．１ ９８０）、他の場合にはこれら細胞の終期分化を起こし、より良性の非新生物表 現型にすることが示された（例えば、Ｂ＋ｉｅ１ｍａｎ　ｅｌ　ａｔ、。

？ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７７： ２９３６−２９４０．１９８０参照）。

レチノイド類は嚢腫性ざそうの治療に有効であることも示された（例えば、Ｐｅ ｃｋ　ｅｌ　ａｌ、、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、１．Ｍｅｄ、。

３００：３２９−３３３．１９７９参照）。嚢腫性ざそうに加えて、レチノイド 療法はグラム陰性毛嚢炎、激症性ざそう、集展性ざそう、汗腺嚢瘍、頭皮の解離 性蜂巣炎及びしゅさ性ざそうに有効であることが示された（例えば、Ｐｌｅｖｉ ｇ　ｅｔａｔ、　、　１．　Ａｍ、Ａｃａｄ、　Ｄｅ＋ｍａｔｏ１．　、６：７ ６６−７８５．１９８２参照）。

しかしながら、治療用量レベルにおける天然形のビタミンＡの高毒性副作用（ビ タミンＡ過剰症）のせいで、レチノイド類の臨床使用は制限されている（Ｋｔ■ ｅ（ｉｔ、、Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｒｅ１ｉｎｏｉｄｓ、Ｓｐｏ＋ｎ　ｅ　（ｉｆ、 、（ｅｄ（）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、ｐｐ、２２ｇ−３２６ ，１９８４；Ｌｉｐｐｍｘｎ　ｅｔ　ｘｉ、、Ｃｘｎｃｅ＋丁＋！ｊ１ｍｅｎｌ 　Ｒｅｐｏｒ口、　７１：４９３−５１５．１９８７）。遊離形のとき、レチノ イド類は周辺正常組織に接近でき、これが肝臓、中枢神経系及び骨格組織に対す るそれらの深い毒性の根拠になるかもしれない。

したがって、レチノイド投与に伴う毒性を減少させる１つの可能な方法は薬物送 達系の使用である。リポソーム方式はインビボにおいて薬物分布の態様をコント ロールする上で有用なものである。これは本質的に有益な効果が起こるターゲッ ト（例えば、腫瘍）部位で高濃度及び／又は長期薬物作用を達成し、一方有害な 副作用が起こる他の部位で低濃度及び／又は短期間を維持する（Ｊｕｌｉａｎｏ 　ｅｌ　ａｌ、、　Ｉｎ：　Ｄｔｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒ７５７ｓｆｅａ＋ｓ、Ｊ ｏｌｉｘｎ。

ｅｄ、　、　０ｘｆｏＩｄ　Ｐ＋ｅｓ３　Ｎ、　Ｙ、　、　ｐｐ、　１８９−２ ３０．１９８０１゜薬物のリポソーム封入は制御的薬物送達の全問題に影響を与 えると予想されるが、その理由は封入が薬物の薬物動態学、分布及び代謝を根本 的に変えるからである。

治療目的でレチノイドのリポソーム処方を用いる上で更に困難がある。例えば、 プレリポソーム粉末の形態で組成物を貯蔵することがよく望まれるが、多くの従 来の処方はこのような使用に満足できず、その理由はそれらが不適当な量のレチ ノイドを含有しているか、又はそれらが水溶液で再調製されたときにそれらが望 ましくないリポソームを生じるからである。

静脈内投与される組成物の場合、典型的には組成物は単一容器で少くとも約１０ ０ｍｇの活性成分を与えられねばならない；それがもっと少量の活性成分を含有 しているならば、実際上不可能なほど多数のバイアルが一人の患者に投薬する上 で要求される。

典型的には１２０ｃｃの容量を有するバイアルが市販凍結乾燥機に収容できる最 大であり、５０ｃｃがこのようなバイアルに充填できる液体の最大量である。１ ｇ以上の脂質が５０ｃｃの液体容量中に含有されているならば、再調製後に得ら れたリポソームは非経口投与上許容されないサイズ分布を有する。これは凍結乾 燥時における脂質の充填が溶液中における脂質の濃度により影響されるからであ る。このため、溶液中における脂質の濃度は制限されねばならない。しかしなが ら、これが以前に知られているリポソームレチノイド処方で行われるとき、レチ ノイドは結晶化して、再調製後じきにリポソームから分離しがちである。

脂質の濃度を制限して十分量のレチノイドを供給するためには、約１対１０以上 のレチノイド対脂質モル比にすることが必要である。以前に知られている処方は リポソーム中でこのような高充填量のレチノイドを有してぃなかったか、又は有 することができないと考えられる。

したがって、先行技術の問題を最少にするか又は解消する改善された組成物及び 方法に関する必要性が存在している。

本発明はカロチノイド類の治療上有用な低毒性組成物に関する。組成物はカロチ ノイド、脂質キャリア粒子及び挿入プロモーター剤を含む。“カロチノイド”は レチノイド類、プロレチノイド類、カロチン類、キサントフィル類及びそれらの アナログを含めて本発明では用いられる。好ましい例は全トランスのレチノイン 酸である。

カロチノイドは脂質キャリア粒子中で脂質と共に実質上均一に分布されている。

更に具体的には、カロチノイドは、水相ではなく、脂質キャリア粒子の疎水性部 分全体に挿入位置で実質上均一に分布されている。“実質上均一に分布された” とは、脂質キャリア粒子の少くとも５０％が力ロチノイド二脂質約５：８５〜約 １５ニア０のモル比でカロチノイドを含有していることを意味する。

好ましくは、全脂質キャリア粒子の少くとも７５％はこのような比率の活性成分 を含有する。

組成物は水性環境中で安定である。この関係において、“水性環境中で安定”と は、組成物が（１）少くとも２４時間にわたりいかなる治療上重要な分解も示さ ず、（２）その同期間にわたりリポソームの融合を実質的程亥で示さず、（３） リポソームの水相中への薬物の実質的移動がなく及び結晶形への実質的状態変化 がないことを含めてその同期間にわたりカロチノイドの実質的再分布を示さない ことを意味する。

脂質キャリア粒子中におけるカロチノイド対脂質のモル比は約１：１０以上であ り、最も好ましくは少くとも約１５　：　８５である。挿入プロモーター剤は好 ましくは組成物の少くとも約１５重量％であり、適切には例えばトリグリセリド である。

“脂質キャリア粒子”は、極性頭部と非極性尾部を有する１以上の脂質から形成 される二層構造を有したリポソームと、脂質のミセル、非晶質粒子及び他の脂質 エマルジョン状態存在物を含めて本発明では用いられる。粒子がリポソームであ る場合、適切な形態には多重膜リポソームを含む。

本発明はカロチノイド、脂質キャリア粒子、挿入プロモーター剤及び薬学上許容 されるキャリアを含んだカロチノイドの医薬単位投薬製剤にも関する。前記のよ うに、カロチノイドは脂質キャリア粒子中で脂質と共に実質上均一に分布され、 組成物は水性環境中で安定である。

もう１つの面において、本発明は、治療上有効量のカロチノイド組成物が生体に 投与される、癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。カロチノイド組成物は前記 されたとおりでもよい。組成物は力ロチノイド二脂質約５：８５〜約１５・７０ に維持されたモル比で被治療体に投与されることが好ましい。この関係において １維持された”とは、前記の薬物対脂質比が少くとも２４時間続くことを意味す る。

本発明は、遊離薬物と比較して、組成物の望ましくない毒性を実質上減少させな がら、カロチノイドの治療利益を提供する。例えば、リポソーム中におけるレチ ノイン酸の封入で、遊離薬物と比較して、毒性が少くとも１５倍減少している。

更に、挿入プロモーター剤の存在は活性成分対脂質の比率を以前に知られていた 以上に増加させ、このため凍結乾燥で粉末にしてから患者に非経口投与しうる溶 液に再調製するという実用上の意味でこのような処方を有用にしている。いかな る特定の理論にも拘束されないならば、挿入プロモーター剤は、例えばリポソー ム中に取り込まれるカロチノイドの量を制限している立体障害を克服すると考え られる。

例えばリポソーム内−・のカロチノイド類の封入はそれらを細胞内部位に直接送 達し、こうして細胞表面レセプターに関する必要性を回避している。これは、例 えば血清レチノール結合タンパク質に関する細胞表面レセプターを欠くが、レチ ノイン酸に関する細胞内レセプターを有する腫瘍の治療にとり、特に重要であろ う。

本発明の組成物は、薬物分布の均一性に関して、従来のリポソームレチノイド処 方よりも実質上改善されている。従来の組成物は本質的に薬物を含有していない リポソームを実質的パーセンテージでしばしば有していた。

本発明において、組成物中で全リポソームの少くとも５０％、好ましくは少くと も７５％は前記範囲内で薬物を含有している。

図１は血清の存在（・）及び不存在（○）下におけるリポソームレチノイン酸（ Ｌ　−ＲＡ）安定性の時間プロフィールについて示している。

図２はＲＡ（・）及びＬ−ＲＡ（ム）存在下で時間の関数としてヒト赤血球（Ｒ Ｂ　Ｃ）溶解について示している。

図３はレチノイン酸（ＲＡ）濃度（・）及びＬ−ＲＡ濃度（ム）の関数としてＲ ＢＣ溶解について示している。

図４はＲＡ濃度（・）、Ｌ−ＲＡ濃度（０）又は空リポソーム濃度（△）の関数 としてＴＨＰ−１細胞増殖の阻害について示している。

図５はＲＡ又はＬ−ＲＡ存在下で治療の関数としてヒト単球ＴＨＰ−１細胞にお けるトランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）の誘導について示している。

図６はＲＡ濃度（・）、Ｌ−ＲＡ濃度（０）及び空リポソーム濃度（△）の関数 としてヒト組織法Ｕ−９３７細胞増殖の阻害について示している。

図７は培養ヒト末梢血単球（ＨＰＢＭ）における組織ＴＧアーゼ活性の蓄積の時 間経緯について示している。

ＨＰ　Ｂ　Ｍは遠心水簸で小さい（○）及び大きい（・）部分集団に分別され、 それらは物質及び方法のところで記載されたように３５ｍｍウェル組織培養プレ ートで培養された。指定された時点で細胞が洗浄され、音波処理され、ＴＧアー ゼ活性に関して調べられた。値は２つの皿で６回の測定の平均である。

図８はＨＰ　Ｂ　Ｍ部分集団において組織ＴＧアーゼ活性の誘導に関する組換え インターフェロン−ガンマ（ｒＩＦＮ−γ）の用量依存性効果について示してい る。

小（○）及び大（・）単球は血清含有培地単独で又はｒｌＦＮ−γの濃度を増加 させて含有した培地で培養した。７２時間後、細胞が回収され、細胞溶解物が組 織ＴＧアーゼ活性について調べられた。示された結果は個別ドナーで３回の測定 の平均±ＳＤを表している。

図９は培養ＨＰＢＭにおいて組織ＴＧアーゼ活性の誘導に関するレチノール（Ｒ ＯＨ）及びＲＡの効果について示している。細胞は様々な時間にわたり５％ヒト ＡＢ血清の存在下でかつ５００ｎＭＲＯＨ（ム）又はＲＡ（・）の不存在又は存 在下で培養された。各時点の最後において、細胞が回収され、酵素活性に関して 調べられた。示された値は２つの独立した実験で６回の測定の平均上ＳＤである 。補足図、７２時間培養後にＨＰＢＭでＲＯＨ（ム）及びＲＡ（・）による組織 ＴＧアーゼ誘導に関する用量依存性曲線。

図１０はＨＰＢＭにおいて組織ＴＧアーゼの誘導に関する遊離及びリポソーム封 入ＲＡの効果について示している。Ａ、細胞は指示された時間にわたり血清含有 培地単独（△）、５００ｎＭ’ノポソームＲＡ（・）、５００ｎＭ遊離ＲＡ含有 培地（ム）又は“空リポソーム”　（○）の存在下において組織培養皿で培養さ れた。リポソームＲＡ及び“空リポソーム”双方は脂質２００μｇ／ｍ　ｌを含 有していた。各時点の最後において、培養物が洗浄され、細胞溶解物はＴＧアー ゼ活性に関して調べられた。示された値は２つの独立した実験で６回の測定の平 均±ＳＤである。Ｂ：単離されたばかりのＨＰＢＭ（列１）と血清含有培地単独 （列２）、５００ｎＭ遊離ＲＡ含有培地（列３）、５００ｎＭリポソームＲＡ（ 列４）又は“空リポソーム”　（列５）の存在下において７２時間培養されたＨ ＰＢＭにおける組織ＴＧアーゼレベルのウェスタンプロット分析。２５μｇのタ ンパク質を含有した細胞溶解物が物質及び方法のところで記載されたようにウェ スタンプロット分析に付された。

図１１はＨＰＢＭにおいて組織ＴＧアーゼの誘導に関する遊離及びリポソーム封 入ＲＯＨの効果について示している。Ａ：ＨＰＢＭ単層が７２時間にわたり血清 含有培地単独（△）又は１μＭの遊離（○）もしくはリポソーム−ＲＯＨ（ム） を含有した培地で培養された。次いで、培養物が洗浄され、細胞溶解物が物質及 び方法のところで記載されたように酵素活性に関して調べられた。

Ｂ：物質及び方法のところで記載されたように、単離されたばかりのＨＰＢＭ（ 列１）と血清含有培地単独（列２）、１μＭの遊離ＲＯＨ（列３）もしくはリポ ソーム封入ＲＯＨ（列４）を含有した培地の存在下において７２時間培養された Ｈ　Ｐ　Ｂ　Ｍにおける組織ＴＧアーゼレベルのウェスタンプロット分析。２５ μｇの細胞タンパク質が各列におかれた。

本発明による封入に適した治療カロチノイド類には様々なレチノイド類を含んで いる。トランス−レチノイン酸及び全トランス−レチノールが好ましい。適切と 考えられる他のレチノイド類には：レチノイン酸メチルエステル、レチノイン酸 エチルエステル、レチノイン酸のフェニルアナログ、エトレチネート、レチノー ル、酢酸レチニル、レチンアルデヒド、全トランス−レチノイン酸及び１３−シ ス−レチノイン酸がある。

リポソームのような脂質キャリア粒子は、この分野でよく知られる方法により形 成できる。適切なリン脂質化合物としてはホスファチジルコリン、ホスファチジ ン酸、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、カルシオ リピン、糖脂質、ガングリオシド、セレブロシド、ホスファチド、ステロール等 がある。更に具体的には、使用できるリン脂質としては、シミリストイルホスフ ァチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、シラウリロイルホスファチジルコリ ン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリ ン、１−ミリストイル−２−バルミトイルホスファチジルコリン、１−バルミト イル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−バルミトイル−２−ステア ロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−バルミトイルホスファチ ジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、シミリストイルホスファチジ ン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、シミリストイルホスファチジルエタノ ールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、シミリストイル ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジ ルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン及びジス テアロイルスフィンゴミエリンがある。

ホスファチジルグリセロール、更に具体的にはシミリストイルホスファチジルグ リセロール（ＤＭＰＧ）は本発明で使用上好ましくない。本発明のカロチノイド 組成物において、ＤＭＰＧの存在は異常サイズの非晶質構造の出現と関係してお り、これは組成物を静脈内投与にもっと適さなくすると考えられる。ＤＭＰＧが 除かれると、非晶質構造は観察されない。ＤＭＰＧの存在により明らかに引き起 こされる望ましくない効果は、ＤＭＰＧが負電荷を有して、カロチノイドのカル ボキシレートと相互作用するという事実に起因しているのであろう。

加えて、ステロイド及びコレステロールのような他の脂質は、得られるリポソー ムにある望ましい及び既知の性質を付与するためにリン脂質成分と混和してもよ い。

更に、ヒドロキシル基、分岐炭素鎖、環式誘導体、芳香族誘導体、エーテル、ア ミド、多不飽和誘導体、ハロゲン化誘導体のような変化させた脂肪族部分又は炭 化水素１、グリコール、ホスフェート、ホスホネート、四級アミン、サルフェー ト、スルホネート、カルボキシ、アミン、スルフヒドリル、イミダゾール基及び このような基の組合せを含む変化させた親水性部分を有した合成リン脂質は置換 しても、あるいはリン脂質及び当業者に知られるその他と混和してもよい。

適切な挿入プロモーター剤は、顕微鏡分析、浮遊密度に基づく分離技術又は当業 者に周知の他の技術から観察できるように、それらが水溶液で再調製された後に リポソームから実質上結晶化せずに、本発明にとり望ましいカロチノイド対脂質 の高モル比を与える。トリグリセリドが好ましい挿入プロモーター剤であって、 １つの具体例としては大豆油がある。他の適切な剤にはコレステロールのような ステロール、脂肪アルコール、脂肪酸、ポリソルベート、プロピレングリコール 、モノ及びジグリセリドのようないくつかの部分にエステル化された脂肪酸とポ リビニルアルコールのようなポリマーがある。

凍結乾燥前に、カロチノイド、脂質及び挿入プロモーター剤はｔ−ブタノールの ような有機溶媒に溶解させることができる。プレリポソーム粉末を形成するため の凍結乾燥は当業者に知られる市販装置を用いて行える。凍結乾燥後、その粉末 は、攪拌及び場合により加熱の適用下で、無菌水、塩水溶液又はデキストロース 溶液のような薬学上許容されるキャリアを加えることにより、例えばリポソーム として再調製することができる。

４５の１のも一ブタノールに溶解させることができる好ましい処方は下記のとお りである： 成分　Ｕ　ミリモル　モル％　リ ＤＭＰＣ８５０１，２８７２７７ 大豆油　１５０　０．１７　９　１４ トレチノイン　１００　Ｇ、３３　１９　９本発明の組成物は、例えば静脈内、 動脈内、筋肉内、リンパ内、腹腔内、皮下、胸膜腔内又は髄腔内注射により、非 経口的に患者に投与されることが好ましい。投与は局所適用又は経口投薬によっ てもよい。好ましい投与量は４０〜２００ｍｇ１０ｆである。投薬は好ましくは 腫瘍退化又は消失が達成されるまで時間スケジュールどおりに反復されるが、手 術、放射線のような他の形態の腫瘍療法又は他の剤での化学療法と一緒であって もよい。

本発明は下記具体例：白血病及びリンパ腫のような血液悪性疾患、乳房、肺及び 結腸のような癌とカポジ肉腫のような肉腫を含めた癌の治療に有用である。

例１ 全トランス−レチノイン酸及びリン脂質を含有した凍結乾燥粉末の調製は下記の ように行った。ｔ−ブタノール中レチノイン酸（１〜５　ｍｇ／ｍｌ）の溶液を ７：３モル比でシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びシミリス トイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含有した乾燥脂質フィルムに 加えた。リン脂質を全トランス−レチノイン酸を含有したｔ−ブタノールに溶解 し、溶液を一夜凍結乾燥させた。シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰ Ｃ）、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）及び全トランス −レチノイン酸を含有した粉末を得た。用いられた脂質・薬物比は１０・１〜１ ５：１であった。

凍結乾燥粉末からリポソームレチノイン酸の再調製は下記のように行った。凍結 乾燥粉末は、全トランスーレヂノイン酸を含有した多重膜リポソームを形成する ために、室温で正常塩水とミックスした。この再調製法では、凝集物又は凝塊が ない調製物を得るため、１分間マイルにされた調製物は狭いサイズ範囲の多重膜 リポソームを含有していた。凝集物又は薬物塊は３回の異なる実験におけるリポ ソーム調製物で全く確認されなかった。

リポソーム全トランス−レチノイン酸調製物の封入効率及びサイズ分布は下記の ように調べた。リポソーム全トランス−レチノイン酸調製物を３０．ＯＯＯＸｇ で４５分間遠心した。レチノイン酸及び脂質を含有した黄色がかったペレットを 得た。光学顕微鏡によると、そのペレットは結晶又は薬物凝集物がないリポソー ムから構成されていた。封入効率は、ＵＶスペクトル測定で上澄中における遊離 レチノイン酸の量を測定することにより、９０％以上であると計算された。リポ ソームをコールタ−（Ｃｏｕｐｅｌ）　カウンター及びチャネライザ−（Ｃｈａ ｎｎｅｌｉｓｅ＋）でサイズ分けした。サイズ分布は下記のとおり：２マイクロ メーター（μｍ）以下のリポソーム２７％、２〜３μｍ　６５％、３〜５μｍ　 １４％、５μｍ以上１％であった。レチノイド類の封入に用いられた方法は単純 で再現可能であり、大規模生産、例えば臨床試験に用いることができた。

更に、異なる脂質、脂質の比率及び３Ｈ−全トランス−レチノイン酸の使用を除 いて、同一の操作により実験を行った。利用された別の脂質はジパルミトイルホ スファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ステアリルアミン（ＳＡ）及びコレステロー ルであった。リポソームの沈降後、残留３Ｈを調べ、封入効率を計算した。表１ は様々なし−ＲＡ調製物に関（、てこの方法で調べられた封入効率について示し ている。

表１ 試験された脂質組成の中では、比率７：３〜９：１のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧが優れ た封入効率を示した。リボンーム全トランスーレチノール（Ｌ−ＲＯＨ）をＤＭ ＰＣ・ＤＭＰＣ７：３でＬ−ＲＡに関して前記された方法により製造した。

例２ リポソームレチノイン酸の安定性 リポソーム　Ｈ−レチノイン酸（Ｌ−３８−ＲＡ）を例１で記載されたようにＤ ＭＰＣ：　ＤＭＰＣ７：　３で製造した。Ｌ−Ｈ−ＲＡのサンプルをリン酸緩衝 液（ＰＢＳ）又は２０％（容量による）牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）含有ＰＢＳいず れかと共にインキュベートした。約３７℃で様々なインキュベート時間後に、一 部を取出し、リポソームを沈降させるために遠心した。上澄溶液中のトリチウム を測定して、３Ｈ−ＲＡ放出率を調べた。図１は２日間にわたる３Ｈ−ＲＡの放 出率について示している。Ｌ−Ｈ−ＲＡは、２０％ＦＣ３の存在下であっても、 実験期間中約８０％以上安定であった。

３Ｈ−全トランス−レチノールがＬ−ＲＯＨを標識するために用いられて、ＰＢ Ｓ中における安定率が測定されたときには、３Ｈ−ＲＯＨの約５％が３７℃で２ ４時間のインキュベート後に放出されただけであった。

例３ ヒト赤血球（ＲＢ　Ｃ）の溶解は、以前に記載されたように（ｈｌｅｈｌａ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＢｉｏｐｈＢ、＾ｃ＋ａ、、　Ｍｏ１．７７０． 　ｐｐ、　２３０−２３４　（１９８４１）　、５５０ナノメーター（ｎｍ）に おける光学密度の増加の観察により上澄中でヘモグロビンの放出量を測定するこ とにより定量した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）に溶解された遊離ＲＡを ＲＢＣに加えた。

適切な溶媒コントロール、空のリポソーム及び空のリポソーム＋遊離薬物に関す る結果にも留意した。水による同数のヒｌ−ＲＢ　Ｃの低張性溶解によるヘモグ ロビン放出量を１００％陽性コントロー゛ルとし、一方ＰＢＳで処理された細胞 を陰性コントロールとした。

様々な脂質を含んだＬ−ＲＡの調製物を３７℃で４時間にわたりＰＢＳ中ＲＢＣ と共にＲＡ２０マイクログラム（μｇ）／ｍｌの濃度でインキュベートした。Ｒ ＢＣ溶解率に基づ＜Ｌ−ＲＡ調製物の毒性は表２で示されている。

表２ ＲＢＣに対するＬ−ＲＡ調製物のインビトロ毒性リポソーム組成　ＲＢＣ溶解％ ＤＭＰＣコレステロール　９：１　４．５ＤＭＰＣ＋コレステロール　９：３　 ９０．２ＤＰＰＣ６，７ ＤＭＰＣ：　ＳＡ　：コレステロール　８：Ｉ：１　７０．４ＤＭＰＣ：ＤＭＰ Ｇ　？：３　８ ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ　９・１８．３ 表２のデ・−夕かられかるように、ＤＭＰＣ：コレステロール、ＤＰＰＣｌＤＭ ＰＣ＋ＤＭＰＧ　（７：　３）及びＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ　（９：　１）のＬ− ＲＡはこれらの条件下で低いＲＢＣ毒性を示した。後者２つのＬ−ＲＡ組成が優 れた封入効率を示したことに注目することは興味深い（表１）。

ＲＢＣに対する遊離ＲＡ及びＬ−ＲＡ　（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ−７：３）の経時 的な毒性に関する別の実験を行った。ヒト赤血球を遊離ＲＡＩＯμｇ／ｌ又はＬ −ＲＡｌ　２０　ｕ　ｇ／ｍｌと共にＰＢＳ中３７℃でインキュベ−１−Ｌ、、 ＲＢＣ溶解を５時間にわたりモニターした。図２はＲＢＣ溶解の時間経緯につい て示している。約１〜約３時間で、遊離ＲＡは大部分の赤血球を大量に溶解させ た。

同様の操作を１２０Ｈｇ／ｍ　ｌのＲＡ濃度でＬ−ＲＡ（ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ 　（７：　３）’］　で行ったとき、はとんどＲＢＣ溶解は起きなかった（例え ば、６時間後に１０％以下）。

様々な濃度で遊離ＲＡ及びＬ−ＲＡ　ＣＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ　（７：　３））の ２時間にわたるＲＢＣ溶解の効果に関する試験も行った。図３はこの試験の結果 を示している。遊離ＲＡはＲＡ約５〜約３０μｇ／ｍｌで直線的にＲＢＣ溶解増 加を示した。リポソームＲＡはＲＡ　１６０Ｈｇ／ｍｌの濃度で約５％のＲＢＣ 溶解を起こしただけであった。

例４ 遊離及びリポソームレチノイン酸の急性毒性遊離及びリポソーム全トランスレチ ノイン酸の急性毒性をＣＤＩマウスで試験した。遊離全トランスレチノイン酸は ３〜５　ｍｇ／ｍｌの濃度で１０％ＤＭＳＯ及び２％ツイーン　８０含有正常塩 水中のエマルジョンとして調製した。リポソーム全トランスレチノイン酸は１５ ：１の脂質：薬物比を用いて調製した。リポソーム調製物中における全トランス レチノイン酸の最終濃度は３　ｍｇ／ｍｌであった。同脂質組成（ＤＭＰＣ：　 ＤＭＰＣ７：　３）の空のリポソームも８０　ｍｇ／ｋｇ　、　１００　ｍｇ／ ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇのリポソーム全トランスレチノイン酸に相当する用量 で試験した。１０％ＤＭＳＯ及び２％ツイーン８０を含有した正常塩水も５０　 ｍｇ／ｋｇの遊離全トランスレチノイン酸に相当する用量でコントロールとして 試験した。

試験されたすべての薬物は１回のポーラスで尾部血管から静脈内注射した。遊離 及びリポソーム全トランスレチノイン酸の注射容量は各投与分とも同一であった 。

表３はこれらの急性毒性実験から得られたデータについて示している。

表３ 遊離及びリポソーム全トランスレチノイン酸の急性毒性Ｌ−ＲＡ　４０　０／６ 　６／６ ６０　ロ／６　６／６ １０ロ　０／６　６／６ ＋２０　０／６　Ｂ／６ 空のリポソーム　８０　０／６　６／６！００　０／６　５／６ 正常塩水 １０％ＤＭＳＯ ２％ツイーン８０　５０　０／６　５１５遊離全トランスレチノイン酸の最大無 毒性用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。それより高い用量では注射直後に発作を起 こした。遊離全トランスレチノイン酸の急性ＬＤ５０（注射後７２時間以内に起 きる死）は３２　ｍｇ／ｋｇであった。死亡の原因はすべての動物で１〜２分間 の発作後における心肺停止であった。発作又は死亡は１２０　ｍｇ／ｋＨの用量 でリポソーム全トランスレチノイン酸により処理された動物で観察されなかった （最大無毒性用量及びＬＤ　は　１２０　ｍｇ／ｋｇより大きい）。それより高 い用量は試験されなかった。発作は空のリポソーム又は１０％ＤＭＳＯ及び２％ ツイーン８０含有の正常塩水で処理された動物で観察されなかった。

例５ 腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害 リポソーム全トランスレチノイン酸（Ｌ−ＲＡ）は例１で記載されたように製造 した。

ヒト単球細胞系ＴＨＰ−１の細胞を、１マイクロモル（μＭ）の最終ＲＡ濃度で Ｌ−ＲＡの存在下又は不存在下において、真核細胞培地のサンプル中に接種した 。

３７℃で２４時間後、３Ｈ−チミジンを各培養物に加え、細胞ポリヌクレオチド 中へのその取込み量を測定した。

表４は異なる脂質組成のＬ−ＲＡにより誘導される３Ｈ−チミジン取込み量の減 少で反映される腫瘍増殖阻害率について示している。

表４ 腫瘍細胞増殖のＬ−ＲＡ阻害 腫瘍細胞 リポソーム組成　（ＴＨＰ−１）阻害（％）ＤＭＰＣ：コレステロール　９１１ 　７２ＤＭＰＣ：コレステロール　９：３　２２ＤＰＰＣ８ ＤＭＰＣ：　ＳＡ　：コレステロール　８１１：１　８４ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ 　７：３　７０ ＤＭＰＣ＋　ＤＭＰＧ　９１１　３２ 表４から、Ｌ−ＲＡ　（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ−７：３）は前記のように優れた封 入効率を示し、低ＲＢＣ毒性を示しく表１及び２）、腫瘍細胞増殖も効果的に阻 害したことに留意するべきである。

ヒト単球細胞系ＴＨＰ−１及びヒト組織球細胞系Ｕ−９３７の細胞を、９６ウ工 ル微量滴定プレートのウェルに含有された真核細胞培地の一部に、約２０，００ ０細胞／細胞で接種した。様々なウェル中の培地は異なる量の遊離ＲＡ又はＬ− ＲＡ　（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＣ７：　３）を含有していた。細胞を３７℃で７２時 間インキュベートし、細胞増殖を調べ、いがなる形のレチノイン酸もないコント ロールの場合と比較した。図４は遊離ＲＡ又はＬ　−ＲＡ　（ＤＭＰＣ：　ＤＭ ＰＣ７：　３）の濃度を増加させることによるＴＨＰ−１細胞増殖の阻害率につ いて示している。ＲＡ　１μｇ／ｍ　ｌ以下の濃度で、双方の調製物は９０％以 上まで細胞増殖を阻害した。

ヒト単球白血病ＴＨＰ−１細胞は、ＲＡｏ、３μｇ／ｉｆの濃度で遊離ＲＡ又は Ｌ−ＲＡいずれがと７２時間のインキュベート後に、それらの全体的な卵形を失 い、細胞分化にしばしば伴うよりもっと平坦で広がった形態学的外観を有するこ とが観察された。全体的な卵形は、細胞がいかなる遊離又はリポソームレチノイ ン酸も不存在下で培養されたときに留められていた。

もう１つの実験においてＲＡ又はＬ−ＲＡｏ、３〜０．６μｇ／ｍ　Ｉと共に２ ４時間インキュベート後に、ＴＨＰ−１細胞は単球細胞分化に関するマーカーで ある組織トランスグルタミナーゼ酵素活性のレベルを増加させた。図５で示され たように、ＴＨＰ−１細胞は４×１０６細胞／ｍｌのとき、相当レチノイン酸濃 度の遊離ＲＡと比較すると、Ｌ−ＲＡと共にインキュベートした場合約５０％大 きなトランスグルタミナーゼ酵素活性を示した。

ヒト組織球細胞系Ｕ−９３７の細胞を前実験のＴＨＰ−１細胞と同一の条件下で 分配及び培養した。図６は遊離全トランスレチノイン酸（ＲＡ）　、リポソーム （ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＣ７：　３）　、全トランスレチノイン酸（Ｌ−ＲＡ）及 び空のリポソーム（レチノイン酸はない）の濃度を増加させた細胞増殖に関する 効果について示している。Ｕ−９３７細胞は約１０μｇ／ｍ　ｌのレチノイン酸 濃度でＬ−ＲＡによりほぼ完全に増殖阻害され、一方この量の遊離ＲＡは５０％ 以下で増殖を阻害したにすぎないことに注目するべきである。

例６ リポソーム全トランスレチノイン酸のインビボ抗腫瘍活性リポソーム全トランス レチノイン酸（ＤＭＰ　Ｃ：　ＤＭＰＣ７１３）の抗腫瘍活性をＭ５０７６細網 肉腫の肝臓転移に対してインビボで試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目に ２０．０００のＭ５０７６細胞で接種した。

リポソーム全トランスレチノイン酸６０　ｍｇ／ｋｇでの静脈内処理を４日目に 行った。コントロール動物（無処理）の平均生存日は２１．８±１．６日であっ た。処理動物の平均生存日は２７．０±１．６日であった。したがって、リポソ ーム全トランスレチノイン酸は、インビトロ試験でｉｎ離レチノイン酸に耐性で あった細胞系（〜１５０７６）に対して、最大無毒性用量より十分低い用量で抗 腫瘍活性を有することが示された。インビトロにおいてＲＡ（１ｍＭ）で７２時 間処理されたＴＨＰ−１細胞は雄性マウスに皮下注射されたとき腫瘍に発育でき なかったが、未処理細胞はこのようなマウスで大きな塊の腫瘍を形成した。

例７ 循環面単球は、腫瘍拒絶（２）、遅延過敏症（２５）、慢性炎症（６）の部位と 治癒プロセス（１１）の一部として損傷組織の部位で蓄積するマクロファージの 前駆体である（セクションＤの参考文献引用参照）。これらの部位において、末 梢血単球は成熟又は分化プロセスに関連する新たな機能的及び生化学特徴を獲得 する。分化に関与するメカニズムを明確に理解するためには、細胞外環境を操作 して、様々な細胞機能及び生化学活性を正確に評価することが必要である。

ビタミンＡ及びそのアナログ（レチノイド類）は単球細胞の分化に大きな効果を 発揮することが示された。正常（１９）及び白血病＜７．１７．２８）双方の単 球細胞はレチノイド類に応答して分化するが、これはレチノイド類がこれら細胞 の分化を調節する上で役割を果たすことを示唆しているのであろう。最近の報告 によると、タンパク質の共有結合架橋を触媒する酵素であるトランスグルタミナ ーゼ（ＴＧアーゼ）の細胞活性がレチノイドの作用に直接関係しているらしい（ ４，１５，２１，２３，３５，３９，３９）。最近、本発明者らは、マクロファ ージ様細胞へのヒト末梢血単球（ＨＰ　Ｂ　Ｍ）のインビトロ成熟が特定の細胞 内ＴＧアーゼ、組織ＴＧアーゼの誘導及び蓄積に関連していることを発見した（ １９．２２）。ＨＰＢＭで殺腫瘍性質を促進するガンマ（γ）−インターフェロ ンも組織ＴＧアーゼの発現を増加させた（１９）。同様に、モルモット及びマウ スマクロファージのインビボ活性化は組織ＴＧアーゼ活性の著しい増加と関連し ていた（１０．２４．３４）。ホルボールエステル及びレチノイン酸により誘導 されるヒト単球白血病細胞（ＴＨＰ−１）の終期分化は組織ＴＧアーゼの誘導及 び蓄積に関連していたが（１７）、これは組織ＴＧアーゼの誘導が単球細胞分化 のマーカーであることを示唆した。本発明はＨＰＢＭの分化及び成熟におけるレ チノイド類の役割について更に明確にし、組織ＴＧアーゼの発現に関するＨＰＢ Ｍによるレチノイド類のインターナリゼーション（ｉｎｌｅ＋ｎａｌｉｚＮｉｏ ｎ）を阻害又は促進する培養条件の研究にも係わっている。本発明の研究では、 ２つの部分集団に分けられたＨＰＢＭがインビトロ培養又は組換えインターフェ ロンガンマ（ｒ　Ｉ　ＦＮ−γ）との接触のいずれかで誘導された組織ＴＧアー ゼ活性を発現するそれらの能力に有意差を示さず、培養ＨＰＢＭにおける組織Ｔ Ｇアーゼの発現が細胞内部位へのレチノイド類の直接送達により誘導されること を証明している。

Ｌ−グルタミン及びヒトＡＢ血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地はギブコ ・ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉ＋＋）　（グランド・アイ ランド、ＮＹ）製であった；大腸菌由来ヒト組換えγ−インターフェロン（ｒｌ ＦＮ−γ）はゲネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｂ　Ｉｎｃ、）（サウス・サン フランシスコ、ＣＡ）から親切にも供与された；全トランス−レチノール（ＲＯ Ｈ）及び全トランス−レチノイン酸（ＲＡ）はシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍｉ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（セントルイス、ＭＯ）から購入した。

クロマトグラフィーで純粋な脂質、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭ ＰＣ）及びシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）はアバンチ ・ポラ−・リピッズ（＾ｙａｎｊｉ　Ｐｏ１ａｒＬｉｐｉｄｓ）　（バーミンガ ム、ＡＬ）製；トリチウム化プトレシン（ｓｐ、ａｃ＋、２８．　ｓｃｉ／ｍｍ ｏｌ）はニュー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅ ａｒ）　（ボストン、ＭＡ）製；トリチウム化ＲＯＨ（＋ｐ、ａｃｔ、１５ｍＣ １／ａ＋ｍｏｌ）はアマ−ジャム（Ａｍｅｚｂａｍ）（アーリントン・ハイツ、 ＩＬ）製であった。脂質、培地及び血清はリムルス属変形細胞溶解物アッセイ（ ＭＡバイオプロダクツ（ＭＡ　Ｂｉｏｐ＋ｏｄｕｃ）＋）、ウォーカーズビル。

ＭＤ〕で内毒素に関してスクリーニングし、それらは内毒素汚染が０．２５ｎｇ ／ｍｌ以下であるときのみ用いた。

２、ＨＰＢＭ単離、精製及び培養 ＨＰＢＭの純粋な集団は、ルーチンの血小板フエレーシスをうけた正常ドナーか ら得られた単核白血球に富むフラクションの向流速心水簸により得た（１２）。

ＨＰＢＭをコールタ−ＺＢＩカウンター及びＣ−１０００チャネライザ−〔コー ルタ−・エレクトロニクス（ＣｏｑｕｅｒＨｅｃＨｏｎｉｃｓ）、　バイアレア 、ＦＬ）でサイズに従い２つの部分集団に分けた。小さな単球の中間容量は２５ ５−であり、大きな単球の場合は２８０−であった。小さな単球は９５±３％非 特異的エステラーゼ陽性であり、大きな単球は９８±２％陽性であった。これら 部分集団の単離及び特徴付けに関する詳細な操作は他で公表されている（３６． ３７）。小さな、大きな又は混合された（等量の小さな及び大きなＨＰＢＭをミ ックスすることで得られた）ＨＰＢＭ部分集団を培地（Ｌ−グルタミン、２０ｍ ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、２０Ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び５％ヒトＡＢ血清で補 充されたＲＰＭＩ−１６４０）で一度洗浄し、同培地に０，５百方／ｍｌ密度ま で再懸濁した。

細胞を３５ｍｍウェルプレート中に４ｍｌサンプルで分配し、適切な条件下で培 養した。

３、酵素アッセイ 細胞抽出物中における組織ＴＧアーゼ活性をジメチルカゼイン中へのＣＨ）プト レシンのＣａ２＋依存性取込みとして測定した。簡単に言えば、培養ＨＰＢＭを トリス緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣＩ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，６）で ３回洗浄し、１ｍＭＥＤＴＡ及び１５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有した 最少量の同緩衝液゛で皿からかきとった。細胞を音波処理で溶解させ、溶解物中 におけるＴＧアーゼ活性を以前に記載されたように調べた（１３．２０）。細胞 溶解物中におけるタンパク質含有量は標準として牛γ−グロブリンを用いてロー リ−（Ｌｏｖ＋７）の方法（１４）により調べた。酵素活性はジメチルカゼイン ／ｌ＋＋／ｍｇ細胞タンパク質中に取り込まれたプトレシンのナノモルとして表 示した。

４、組織ＴＧアーゼの免疫化学検出 細胞抽出物で組織ＴＧアーゼを検出するために、細胞溶解物を１％ドデシル硫酸 ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）、０．７５Ｍ　β−メルカプトエタノール、２．５％ スクロース及び０．００１％ブロモフェノールブルーを含有した２０ＩトリスＨ ＣＩ　（ｐＨ６，８）に溶解させた。

溶解された抽出物を６．５％不連続ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により 分別し、ニトロセルロースペーパー上にエレクトロプロットした。そのペーパー を５％牛血清アルブミンで中和し、ヨウ素化抗組織ＴＧアーゼ抗体で処理した； この抗体の産生、特徴及び性質は他で記載されている（２４）。未結合抗体を２ ００ｍＭＮａＣ１゜５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００，０，１％Ｓ ＤＳ及び０．２５％ゼラチンを含有したトリスＨＣＩ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７ ，５）　でペーパーを洗浄すルコとにより除去し、ペーパーを乾燥し、以前に記 載された（２０，２４）のようにオートラジオグラフィーに付した。

５、リポソームの製造 ７：３のモル比でＤＭＰＣ及びＤＭＰＧを含有した多重膜小胞（リポソーム）は 記載されたように製造した（１６．１８）。全トランスＲＯＭ又はＲＡを真空乾 燥前に必要量の薬物（エタノールに前溶解されている）を指貫含有有機溶媒に加 えることで封入した。乾燥された脂質−薬物フィルムを無菌塩水溶液に攪拌によ り分散さぜた。

１：１０薬物：脂質比重内のレチノイド類であればリポソーム内に完全に封入す ることができ、高度に安定であった。リポソーム調製物の安定性及び封入効率は 放射性同位元素標識レチノールを用いて試験し、取込まれた放射能の５±２％が ３７℃で２４時間のインキュベート後に上澄に漏出しただけであることを示した 。

６、［３Ｈ）ＲＯＨに関する結合アッセイ単離したばかりのＨＰＢＭを血清含有 培地単独又は培地＋５０単位（Ｕ）／ｍｌ　ｒ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ中で様々な時間 にわたり培養した。示された時間の最後に、ＨＰＢＭ単層を水冷培地で２回洗浄 し、５％脱脂質化ヒｈＡＢ血清（血清脱脂質化は以前に記載されたように有機溶 媒抽出により行った（３３）　）で補充されたＲＰＭＩ培地中に５．０μＣ！／ １［１１，１２（ｎ）　３８）ビタミンＡ（遊離ＲＯＨ）を含有し、た前冷却反 応混合液０．　５ｍｌに再懸濁した。結合アッセイは水浴中で１時間行った。１ 時間のインキュベート後、単球単層を水冷培地で６回洗浄し、細胞をトリトンＸ −１００２００μｌに溶解した。細胞溶解物の一部５０μ！を三重に細胞関連放 射能についてカウントした。

回収前に１時間インキュベートの最後の方で反応混合液を加えることにより得ら れたバックグラウンドカウントは実験値から差し引いた。

Ｂ、結果 １、ＨＰＢＭのインビトロ培養時における組織ＴＧアーゼ誘導 １０日間以内で血清含有培地の存在下におけるＨＰＢＭの培養は小さな及び大き な双方のＨＰＢＭで組織ＴＧアーゼ活性の顕著な誘導と関連しており（図７）、 酵素活性の増加は約４日間の培養後に更に急速であった。

培養１０日後、小さな単球は酵素活性について（０，４４から４１　、　１　ｎ ｍｏｌ／ｈ＋／ｍｇに）９３倍の増加を示し、一方大きなＨＰＢＭは酵素活性に ついて（０，３６から３７　、　４　ｎｍｏｌ／ｂ＋／ｍｇに）約１０３倍の増 加を蓄積した。−緒にミックスされて同様の条件下で培養された小さな及び大き なＨＰＢＭは、個々のＨＰＢＭフラクションの場合と比較して、組織ＴＧアーゼ 活性の蓄積の速度及び量に有意差を示さなかった（データ示さず）。酵素活性の 誘導は培養された単球の形態上における変化と関連していた。単離されたばかり のＨＰＢＭは丸くみえたが、培養６〜８日後に大きな及び小さな双方のＨＰ　Ｂ 　Ｍはプラスチック表面に堅固に付着するようになり、もっと広がり平坦化して 、成熟マクロファージに典型的な外観を有していた。１０日までに、細胞は酵素 活性の最高レベルに蓄積し、このレベルは次いでプラトーに達するか、あるいは 下降し始めた。

２、組織ＴＧアーゼ発現に関するｒＩＦＮ−γの効果ＨＰＢＭ中組織ＴＧアーゼ 活性の誘導に関するｒＩＦＮ−γへの連続接触の効果は図８で示されている。

小さな及び大きな単球は濃度を増加させながらｒｌＦＮ−γの存在下で７２時間 にわたり血清含有培地で培養した。ＨＰＢＭ集団の酵素活性は、培地単独の存在 下で培養された細胞の場合と比較して、ｒｌＦＮ−γとのそれらの連続接触後に 有意に増加した。しかしながら、ｒｌＦＮ−γ用量サイズは２つのＨＰＢＭ集団 間で酵素活性に有意差を生じなかった。以前に記載されたように（１９）、１０ ０　Ｕ／ｍｌ用量のｒＩＦＮ−７がＴＧアーゼ活性を増加させる上で最適のよう であった；それ以上のｒｌＦＮ−γ濃度はそれほど有効でなかった。組織ＴＧア ーゼ活性に関するｒＩＦＮ−γの誘導効果は５Ｕ／ｍｌで明白であり、ｒ　Ｉ　 ＦＮ　−７（１００Ｌｉ／ｍｌ）によるＨ　Ｐ　Ｂ　Ｍ培養物の前処理、しかる 後洗浄、次いで培地単独での培養は組織ＴＧアーゼの発現を高めなかった。組織 子ＧアーゼのｒｌＦＮ−γ誘導増加はＨＰＢＭの形態的変化と関連しており、ｒ ＩＦＮ−γ処理細胞は培養３日後に未処理コントロール細胞よりも広がって平坦 化した。

３゜組織ＴＧアーゼ誘導に関するレチノイド類の効果２つのＨＰＢＭ集団は誘導 された組織ＴＧアーゼレベルに関して不均一性を示さなかったため、我々のその 後の研究は部分集団に分離せず全ＨＰＢＭフラクションで行った。５００ｎＭＲ Ａの存在下で２４時間培養されたＨＰＢＭは、培地単独で培養されたコントロー ル細胞の場合よりも少くとも３倍高い酵素活性を蓄積した（図９）。ＲＡとの連 続接触は酵素活性に関して急速で直線的な増加を引き起こし、一方コントロール 細胞では組織ＴＧアーゼ活性のレベルに関する有意の変化が２日以内の培養で観 察されなかった。３日目までに、コントロール細胞は単離されたばかりのＨＰＢ Ｍの場合（０，６ｎｍｏ　ｌ／ｈ　＋／ｍｇ）よりも約６倍高い酵素活性（３， ４ｎｍｏｌ／ｈ＋／ｍｇ　）を蓄積したが、それらはＲＡ処理細胞（９，８ｎｍ ｏ　ｌ／ｂ　＋／ｍｇ）よりもかなり低い酵素活性を有していた。

組織ＴＧアーゼのレチノイン酸誘導発現は用量依存性であった（図９補足）。Ｒ Ａの生理学的アナログＲＯＨは１μＭの用量であってもＨＰＢＭで組織ＴＧアー ゼの発現を誘導しなかった。このため、３日以内にわたりＲＯＨの存在下で培養 されたＨＰＢＭは、培地単独で培養されたコントロール細胞の場合と比較して、 組織ＴＧアーゼ活性の蓄積に関し有意差を示さなかった（図９）。

４、組織ＴＧアーゼ誘導に関するリポソーム封入レチノイド類の効果 リポソーム封入ＲＡは、等モル濃度の遊離ＲＡの場合よりも、組織ＴＧアーゼ発 現を誘導する上で有効であった。２４時間の培養後、５００　ｎＭの等モル濃度 で遊離又はリポソームＲＡにより誘導されたＨＰＢＭにおける組織ＴＧアーゼ活 性の量は有意には異ならなかった（各々３．４及び３　、　７　＋＋＋ｎｏｌ／ ｂ＋／ｍｇ）　；　Ｌかしながら、４８及び７２時間後、リポソームＲＡ処理細 胞は遊離ＲＡ処理細胞の場合よりも少くとも５０％多く酵素活性を蓄積した（図 １ＯＡ）。リポソーム封入ＲＡによる酵素活性の増加が脂質ではなくＲＡに特有 の効果であることは、“空のリポソーム”の存在下で等量の脂質を含有したＨＰ ＢＭの培養物がインキュベート時間中に酵素活性を誘導しなかったという事実に より証明された。以前に報告された“空のリポソーム”（２０）は７２時間の培 養後に組織ＴＧアーゼの血清誘導発現を阻害した（図１ＯＡ）。

酵素活性に関する遊離又はリポソームＲＡ誘導増加は、組織ＴＧアーゼに対する ヨウ素化抗体を用いた細胞溶解物のウェスタンプロット分析により示されるよう に、酵素ペプチド量の増加により引き起こされた（図１０Ｂ）。

酵素活性の増加は酵素ペプチドの増加に比例しており、先夜酵素の活性化により 起きたわけではなかった。

レチノールは、その遊離形のときＨＰＢＭで組織ＴＧアーゼの発現を高めること ができないが、リポソーム形態で与えられたとき活性になった。リポソーム封入 ＲＯＨは培養時間経過に従い組織ＴＧアーゼ活性の急速で直線的な増加を起こし た（図１１Ａ）。７２時間の培養後、リポソーム−ＲＯＨは、同様の条件下で遊 離ＲＯＨに接触されたコントロール細胞の場合（０、８ｎｍｏｌ／ｈｒ／＋１） と比較して、９倍の酵素活性増加（７、１ｎａ＋ｏｌ／ｈｒ／ｌりを起こした。

組織ＴＧアーゼのリポソームＲＯＨ誘導発現は、ウェスタンプロット分析により 証明されるように、酵素ペプチドの蓄積増加に起因していた（図１１Ｂ）。

５、組織ＴＧアーゼ誘導はレチノイド類のＨＰＢＭ取込みと関連している ＨＰＢＭによるトリチウム化ＲＯＨの結合に関するインビトロ成熟及びｒｌＦＮ −γ処理の効果を試験した。

４日間のコントロール培養（中間用量）後、ＨＰ　Ｂ　Ｍによるトリチウム化Ｒ ＯＨ結合は単離されたばかりの細胞によるこの結合と比較して５０％増加した。

９日後、コントロール培養結合値は３５０％まで増加した。ＲＯＨ結合の増加は 組織ＴＧアーゼ活性の並行した増加と関連していた（表５）。

表５ ＨＰ　Ｂ　Ｍによる〔３Ｈ〕ＲＯＨ結合に関するａＨＰＢＭを血清含有培地単独 又は５０Ｕ／ｍｌｒ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−γ含有培地で指示期間にわたり培養した。

５異なる培養期間でｌ・リチウム化ＲＯＨの結合を物質及び方法のところで記載 されたように調べた。

０同様の条件下で維持されたＨＰＢＭの並行培養物を物質及び方法のところで記 載されたように酵素活性を調べるために用いた。

ｒｌＦＮ−７へのＨＰＢＭの接触はＲＯＨ結合及び酵素活性の発現を増加させた 。ｒｌＦＮ−γ処理細胞は、同期間にわたり血清含有培地単独の存在下でインキ ュベートされたコントロール細胞の場合よりも３倍高い〔３Ｈ〕ＲＯＨ結合を示 した。反応混合液中における脱脂質化血清の存在は必須であった；全カウントの １０％だけが脱脂質化血清が反応混合液から省かれたときに細胞関連であった。

Ｃ１結論 この例で報告された結果は、ＨＰＢＭがそれらのサイズ及び密度に基づき２つの 集団に分けられたとき、成熟マクロファージに分化する可能性を同等に有するこ とを示唆した。マクロファージへのＨＰＢＭのインビトロ成熟は、おそらく血清 レチノール結合タンパク質に関する細胞表面レセプターの獲得の結果として、レ チノールの結合及び取込み増加と関連していた。７２時間にわたるｒＩＦＮ−７ へのＨＰＢＭの接触は〔３Ｈ〕ＲＯＨの結合増加を導いたが、これはインビトロ で９日間培養されたコントロールＨＰＢＭの結合活性に匹敵した。インビトロ培 養又はｒｌＦＮ−γへの接触により誘導されるＨＰＢＭ成熟は類似した形態的及 び酵素的変化を伴った。

血清レチノール結合タンパク質に関する細胞表面レセプターの必要性はＲＯＨの 直接細胞内送達で回避することができた。

最近、いくつかのレポートでは単球細胞分化と組織ＴＧアーゼの誘導との関連性 について示唆した（１０．１７゜１９、２１−２４．３４＋。非常に低レベルの 組織ＴＧアーゼを有する単離されたばかりのＨＰＢＭは、それらのインビトロ成 熟後に大量にこの酵素を蓄積する（１９．２２）。２つの部分集団のＨＰ　Ｂ　 Ｍがマクロファージへのインビトロ分化時に組織ＴＧアーゼ活性を誘導及び蓄積 するそれらの能力に関して有意差を示さなかったように、双方のフラクションは 酵素発現増加に関するｒＩＦＮ−γの効果に対して等しく応答した（図８）。同 様の基準で分けられたＨ　Ｐ　Ｂ　Ｍ部分集団の機能的不均一性は既に報告され ている。このため、小さな及び大きな集団に分けられたＨ　Ｐ　Ｂ　Ｍの部分集 団は異なる量の反応性酸素種（３７）、プロスタグランジン（１，３Ｇ）、抗体 依存性細胞媒介細胞毒性（２７）及び殺腫瘍細胞性（２６）を生じることが報告 された。

ＨＰ　Ｂ　Ｍ部分集団間におけるこの機能的不均一性は成熟又はクローンいずれ かの差異に関与していた。しかしながら、本明細書で示されたデータは、単球細 胞分化のマーカーである組織ＴＧアーゼの誘導に関してＨＰＢＭ部分集団間で不 均一性を示さず、成熟マクロファージへの分化に関して等しい可能性を示す。双 方のＨＰＢＭ部分集団で組織ＴＧアーゼ発現を高めるｒｌＦＮ−γの能力は、こ の内因性サイトカインが単球細胞で成熟、分化及び分化された機能の発現に重要 な役割を果たすことを示唆している。

培養ＨＰＢＭ及びマクロファージで組織ＴＧアーゼの誘導及び蓄積に関与する血 清中の因子は内因性レチノイド類及び血清レチノール結合タンパク質であること が示された（２１）。血清からレチノール結合タンパク質の脱脂資化又は枯渇化 によりレチノイド類を抽出すると、その酵素誘導能力を完全に失った（１９．２ １）。血清レチノール結合タンパク質は特定のターゲット組織へのレチノールの 血管内輸送及び送達に関与していると考えられる（８゜９、２９．３１）。ター ゲット細胞の表面上に存在する血清レチノール結合タンパク質に関するレセプタ ーは送達プロセスの特異性に関与している（９，３＋）。細胞表面レセプターへ のＲＯＨ−レチノール結合タンパク質複合体の結合は、細胞の内部へのＲＯＨの 送達を明らかに促進する（９．３１）。

他方、過生理学的用量（１０ｎＭ以上）で、ＲＡはレチノール結合タンパク質に 関する表面レセプターの関与なしに単純な拡散で直接細胞に入ることができる（ ２１）。これは、単離したばかりのＨＰＢＭが血清レチノール結合タンパク質に 関する細胞表面レセプターをたぶん欠いており、そのため内因性又は外来レチノ イド類をインターナリゼーションできないことを示唆した。実際に、レセプター 媒介送達が無関係になる用量（例えば、１０ｎＭ以上）でＨＰＢＭ培養物への外 来ＲＡの添加は、組織ＴＧアーゼ活性の著しい誘導を起こした（図９）。ＲＡの 酵素誘導能力はリポソーム内にＲＡを封入することで更に増加され、食作用でそ のインターナリゼーションを行う（図１０）。

遊離形のとき単離されたばかりのＨＰＢＭで組織ＴＧアーゼの発現を誘導しない ＲＯＨの効果は特に興味深かった。しかしながら、ＲＯＨがリポソーム内に封入 されると、血清レチノール結合タンパク質に関する細胞表面レセプターの必要性 は回避された。このため、リポソームＲＯＨは）（Ｐ　Ｂ　Ｍで有意レベルの組 織ＴＧアーゼ活性を誘導した（図１１）。これは毒性作用なしで又は最少でレチ ノール又はその不活性アナログを単球細胞に向ける有効なアプローチについて示 唆した。血清レチノール結合タンパク質に関する細胞表面レセプターを欠いたＨ ＰＢＭは、投与されたＲＯＨを他の細胞タイプで非特異的にインターナリゼーシ ョンしやすくしているためである。更に本研究では、ＲＯＨ−レチノール結合タ ンパク質複合体と細胞表面レセプターとの相互作用がレチノールの細胞内送達に 関してのみ要求され、他のホルモン（３）のケースとは異なり、リガンド−レセ プター相互作用が最終局面の発現に第二メツセンジャーを必要としないことを示 唆した。遊離ＲＡ又はリポソーム封入ＲＡもしくはＲＯＨにより誘導されたＴＧ アーゼ酵素活性の増加は、組織ＴＧアーゼに対するヨウ素化抗体を用いた細胞溶 解物の免疫プロットにより示されるように、先夜酵素の活性化によるよりもむし ろ酵素タンパク質の蓄積の結果であった（図１０．１１）。

トリチウム化ＲＯＨ結合に関する予備データ（表５）は、成熟マクロファージへ のＨＰＢＭのインビトロ分化がレチノール結合タンパク質に関する細胞表面レセ プターの獲得と関連しており、ｒｌＦＮ−γでの処理がこれらレセプターの発現 を増加させるという概念を更に支持した。ＨＰＢＭがこれらのレセプターを獲得 すると、それらは内因性レチノイド類をインターナリゼーション化して、組織Ｔ Ｇアーゼの発現を誘導できる。実際に、レチノイド類は骨髄法細胞で組織ＴＧア ーゼに関する遺伝子を誘発することが特に示された（２３）。

レチノイド欠乏動物におけるマクロファージ機能の陳害は、感染率を増加して殺 腫瘍細胞性を減少させることが十分に証明されている（５）。モルモット末梢マ クロファージの培養で、ＲＡは殺腫瘍細胞性アルギナーゼに関する細胞内レベル を増加させることが報告された（３２）。

レチノイド類がＨＰＢＭの分化プロセスで重要な役割を果たすという本発見は、 レチノイド類が単球／マクロファージ機能の重要なレギュレーターであるという 考えを支持している。

Ｄ、参考文献 １．　Ｂａｎｋｈｕｒｓｔ、　Ａ、Ｄ、、　Ｈａｓｔｅｉｎ、　Ｅ、、　Ｇｏｏ ｄｗｉｎ、　Ｊ、Ｓ、、　ａｎｄＰｅａｋｅ、　Ｊ、Ｅ、（ヒト末梢血中におけ るプロスタグランジン産生単核細胞の性質） ｙ、Ｌａｂ、Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ、（１７，１７９，１９８１２、Ｂａｕｍ、　Ｍ 、、　ａｎｄ　Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｓ、　（腫瘍担持マウスノ骨髄によるマクロフ ァージ産生）　（ＪＢ’１（ａｒ　Ｒａｓ、コ２゜２８１３．１９７２゜ コ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、　Ｐ、　（ホルモンレセプター、膜リン脂質及 びタンパク質キナーゼ）゛ Ｈａｒｖｅｙ　Ｌｅｃｔ、８０，８９．１９８６４、　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｐ、Ｊ 、Ａ、、Ｍｕｒｔａｕｇｈ、Ｍ、Ｐ、、Ｍｏｏｒｓ、Ｗ、Ｔ、。

Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｇ、Ｓ、、　ａｎｄ　Ｌｕｃａｓ、　Ｄ、Ｓ、　（ヒト前骨 髄球白血病（ＨＬ−６０）細胞における組織トランスグルタミナーゼのレチノイ ン酸誘導発現）Ｊ・Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０，５１１６．１９８５５、　Ｄ ａｎｎｅｒｔ、　ｃ、（レチノイド類及び免疫系；ビタミンＡによる免疫刺激） 　工ｎ　ｔｈｅ　Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ。

Ｖｏｌ、　２　（Ｓｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ａ、Ｂ、、　 ａｎｄ　Ｇｏｏｄｍａｎ。

Ｄ、Ｓ、、Ｅｄｓ、）　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　八ｃａｄｅｒｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、ｐ、３７コ、１９８４Ｃａｎｃｅｒ　１６．　１２８Ｂ、１９６コｓ、　Ｇａ ｎｇｕｌｙ、　Ｊ、、　Ｒｏａ、　Ｍ、Ｒ，Ｓ、、　Ｍｕｒｔｈｙ、　Ｓ、に、 、　ａｎｄ　５ａｒａｄａ。

Ｋ、　（ビタミンへの作用の体系様式）　Ｖｉｔａｍ。

Ｈｏｒｎ、　３８．　ｌ、　１９８０゜Ｃｈｅ！Ｉ１．　２４８．　コロ１：ｌ 、４９７５１０、　Ｌｅｕ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｈｅｒｒｉｏｔ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｍ ｏｏｒｓ、　Ｐ、Ｅ、、　Ｏｒｒ、　Ｇ、Ｒ，。

ａｎｄ　Ｂｉｒｃｋｂｉｃｈｌｅｒ、　Ｐ、Ｊ、　（７クロフアージ活性化に関 連したトランスグルタミナーゼ活性増加）Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１４１ ．　１９１．　１９８２１２、　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔａｉｎ、　Ｇ、、　 Ｒｅｕｂｅｎ、　Ｊ、、　Ｈｅｒｓｈ、　Ｅ、Ｍ、。

Ｋ１１ｂｏｕｒｎ、　Ｒ，、Ｈｅ５ｔｅｒ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｂｉｅｌｓｋｉ、　 Ｍ、、　Ｔａ１ｐａｚ。

Ｍ、、ａｎｄ　Ｍａｖｌｉｇｉｔ、　Ｇ、Ｍ、　（血小板フエレーシスによるリ ンパ球及び単球の比較機能分析）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　２：ｌ、２０１．　 １９８３１３−　Ｌｏｒａｎｄ、　Ｌｌ、　Ｒｕ１ｅ、　Ｎ、Ｇ、、Ｏｎｑ、　 Ｈ−Ｇ、、ｒｕｒｌａｎｅｔｔｏ、　Ｒ，ＩＪａｃｏｂｓｅｎ、Ａ、、Ｄｏｗｎ ｅｙ、Ｊ、、０ｖｅｒ、Ｎ、、ａｎｄ　Ｌｏｒａｎｄ、Ｊ。

（ペプチド転移におけるアミン特異性°フィブコ４．　Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ， 、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｊ、、　Ｆａｒｒ、　Ａ、Ｌ、、　ａｎｄ１５ 、　Ｍｅｈｔａ、に、、Ｃｌａｒｉｎｇｂｏｌｄ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｌｏｐｅｚ− Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、Ｇ。

現を阻害する）＋　、Ｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１：１６．４３０６゜（細胞内 部位へのムラミルジペプチド誘導体のリポソーム送達によるマクロファージプロ テアーゼ分泌の刺激）・　工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５１．５１７．１９８４トラ ンスグルタミナーゼの発−現） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６．　１３８１１．　１９８６Ｘ８−　Ｍｅｈｔａ　 ｒ　Ｋ　−ＬｏｐｅＺ−Ｂｅｒａｓｔｅ　ｌｎ　ｒ　Ｇ　−、ＨｅｒＳｈ　ｒ　 Ｅ　０Ｍ　−ｒ　ａｎｄＪｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，Ｌ、　’（ヒト末梢血単球によ るリポソーム及びリポソーム封入ムラミルジペプチドの取込、、　）　・’　Ｊ 、　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｓｏｃ、　３２゜１５５、　１ ９８２ Ｊ、　工ｍｍｕｎｏ１．　１３４．　２０５コ、１９８５２０、　Ｍｅｈｔａ、 Ｋ、、Ｍｕｒｔａｕｇｈ、Ｍ、Ｐ、、Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｒ，Ｌ、、ａｎｄＤａｖ ｉｅｓ、　Ｐ、Ｊ、Ａ、　（食作用はマウス末梢７クロ７ｙ−ジで組織トランス グルタミナーゼの発現を阻害す６　〕〕Ｊ−工ｍｒｎｕｎｏ１　Ｄ２．２５５２ ．１９８４２１、　Ｍｏｏｒｅ、　Ｗ、Ｔ、、　Ｍｕｒｔａｕｇｈ、　Ｍ、Ｐ、 、　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｐ、Ｊ、７％。

（レチノイン酸はマウス末梢マクロファージテ組織トランスグルタミナーゼの発 現を誘導した）Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．１２７９４．１９８４２２、　Ｍｕｒｔａｕ ｇｈ、　Ｍ、Ｐ、、　Ａｒｅｎｄ、　Ｗ、Ｐ、、　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｐ 、Ｊ、Ａ。

（ヒト末梢血単球における組織トランスグルタミナーゼの誘導）　Ｊ、　Ｅｘｐ 、　Ｍｅｄ、　１５９．１１４゜２３、　Ｍｕｒｔａｕｇｈ、Ｍ、Ｐ、、Ｄｅｎ ｎｉｓｏｎ、Ｏ，、５ｔｅｉｎ、Ｊ、Ｐ、、ａｎｃｌＤａｖｉｅｓ、Ｐ、Ｊ、Ａ 、（レチノイン酸は正常酸白血病骨髄様細胞で遺伝子発現を誘導した） Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６３．１３２５．１９８６２４、　Ｍｕｒｔａｕ ｇｈ、　Ｍ、Ｐ、、　Ｍｅｈｔａ、　Ｋ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｊ、、　Ｍｅ ｙｅｒｓ、　Ｍ、。

Ｊｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，■６．　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｐ、Ｊ、Ａ、　（マ ウス末梢マクロファージにおける組織トランスグルタミナーゼの誘導＞Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５Ｂ、　１１０７４．１９Ｂ３２５、　Ｎｅ１ｓｏｎ 、　Ｄ、Ｓ、（細胞性免疫のエフェクターとしてのマクロファージ）　ＣＲＣＣ ｒｉセ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１．４５゜２６、　Ｎｏｒｍａｎｎ 、　Ｓ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｅｒ、　Ｒ，（ヒト末梢血単球の細胞毒性） 　Ｃｅ１ｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８１．４１３゜２’）、　Ｎｏｒｒｉｓ、Ｄ 、Ａ、、Ｍｏｒｒｉｓ　Ｒ，Ｍ、、５ａｎｄａｒｓｏｎ、Ｒ，、Ｔ、、ａｎｄＫ ｏｈｌｅｒ、　Ｐ、Ｆ、　（ヒト末梢血単球の機能的部分集団の単離）Ｊ、工ｍ ｍｕｎｏ１．１２］、　１６す１９７９２Ｂ、　０１ｓｓｏｎ、工、Ｌ、、ａｎ ｄ　Ｂｒｉｅｔｍａｎ、　Ｔ、Ｒ，（レチノイン酸２９、　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、 　Ｐ、Ａ、（ヒト血清中に存在するビタミンＡ輸送タンパク質複合体の特徴） Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４６，３４．１９７１３０、　Ｐｉｃｋｅｒ、Ｌ、 Ｊ、、Ｒａｆｆ、Ｈ，Ｖ、、Ｇｏｌｄｙｎｅ、Ｍ、Ｅ、、ａｎｄ　５ｔｏｂｏ。

３１　Ｒａ５ｋ、　Ｌ、、　ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｐ、Ａ、　（サル小 腸由来粘膜Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２５１，６３６０．１９７６３２、　Ｒｏ ｂｅｒｔｓ　、八、Ｂ、　、　ａｎｄｓｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ、　（レチノイド類 の細胞生物学及び生化学）　工ｎ　Ｔｈｅ　Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ。

Ｖｏｌ、２　（Ｓｐｏｒｎ、Ｍ、Ｂ、、Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ａ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｇ ｏｏｄｍａｎ。

Ｄ、Ｓ、、Ｅｄｓ、）Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ 、２０９．１９８４］３．　Ｒｏｔｈｂｌａｔ、　Ｇ、Ｈ，、Ａｒｂｏｒｇａｓ ｔ、　Ｌ、Ｙ、、　Ｑｕｅｌｌｅｔｔ、　Ｌｌ、　ａｎｄＨｏｗａｒｄ・　Ｂ、 Ｖ・　（細胞培養系で使用される脱脂資化血清タンパク質の調製）　Ｉｎ　Ｖｉ ｔｒ。

１２．５５４．１９７６ ３４、　５ｃｈｒｏｆｆ、　Ｇ、、　Ｎｅｕｍａｎｎ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｓｏｒ ｇ、　Ｃ。

（ネズミマクロファージの部分集団に関する７３５、５ｃｏｔｔ、　Ｋ、　Ｆ、 、　Ｍｅｙｓｋｅｎｓ、　Ｆ、Ｌ、、　Ｊｒ、、　ａｎｃｌ　Ｒｕ５ｓｅｌ、　 Ｄ、Ｈ。

（レチノイド類はチャイニーズハムスター卵巣髄膜細胞では分化を促進する） Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９−０５３．１ ９８２３６、　Ｔｕｒｐｉｎ、　Ｊ’、、　Ｈｅ５ｔｅｒ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｈｅ ｒｓｈ、　Ｅ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、　Ｇ、　（ 多数の機能上完全なヒト末梢血単球の単離用方法としての遠心水筆） Ｊ、（：１ｊ−ｎ、ｋｐｈｅｒｅＳｉＳ、３，１１１．１９８６３７、　Ｔｕｒ ｐｉｎ、Ｊ、、Ｈａｒｓｈ、Ｅ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｒｅｓｔｅｉ ｎ、Ｇ。

（小さな及び大きなヒト末梢血単球の特徴・過酸化水素放出とマクロファーシア クチベーターへの応答に関するインビトロ成熟の効果）′Ｊ、工關ｕｎｏ１．１ ：１６，４１９４．１９８６３Ｂ、　Ｙｕｓｐａ、　Ｓ、　Ｂｅｎ、　Ｔ、、　 ａｎｄ　Ｌｉｔｃｈｉ、肌（レチノイド類及びホルボールエステルによる表皮ト ランスグルタミナーゼ活性及び終期分化の調節） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４３．　５７０７．　１９８］。

コ９．　Ｙｕｓｐａ、　Ｓ、、　Ｂｅｎ、　Ｔ、、　ａｎｄ　５ｔａｉｎｅｒｔ 、　Ｐ、（レチノイン酸はトランスグルタミナーゼ活性を誘導するが、培養表皮 細胞の角質化を阻害する）、Ｊ、Ｂｉｏｌ・Ｃｈｅｗ、２５７，９９０６．１９ ８２以上の記載は本発明の具体的態様について説明するためである。それはすべ ての可能な態様の網羅的リストであるわけではない。当業者であれば、開示され た具体的な態様に変更が加えられ、しかもこれが本発明の範囲内に留まることを 認識するであろう。

水　１）　ａ 富田店ωＶ８−Ｈｃ （％）＊呆ｍＰｆ棗 （＊田盾／′：２０乙丑ν）η窪○日日（％）寓ｊＩｌ告棗 （６ｕ、＋７Ｊｑ／１ｏｕ、＋ｕｌ　ｍ　Ｗ　Ｋ　ＩＲ（６ｕ＋７」ｑ７１０ｕ ｌＬＩｌ　ロ値目−メ○上曹１Ｍ（ＩＩｕｕ／］Ｉ４／１ｏｕｕｕｌｎ９！Ｉｎ −（Ｏｆ菖［（６ｗ／〕ｑ７１ｏｕ、＋ｕｌ 斜？４−ど○、ＬＩ１ｇｌ ＋６ＬＬＪ／Ｊ！／１ｏｕＪｕｌ　ｎ５４−　ｃ（Ｏ１ｍ！［培養日数 国際調査報告 ρＣＴ／ＬＩ５　９３１００２３３ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｍ Ｇ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＮＺ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、 　５Ｅ（７２）発明者　ペレッズーソーラー、ローマンアメリカ合衆国テキサス 州、ヒユーストン、ライス、ブールバード、２９０４ （７２）発明者　ロペッズーバーステイン、ガブリエルアメリカ合衆国テキサス 州、ヒユーストン、ラザーグレン、５６３０ （７２）発明者　レンク、ロバート　ビー。

アメリカ合衆国テキサス州、ニュー、ウェイバリー、バラフナ−、ロード、ピー 、オー、ボックス、９３７ （７２）発明者　ハイマン、アラン　シー。

アメリカ合衆国テキサス州、ザ、ウッドランズ、スラッシュ、パイン、ブレイス 、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カロチノイド、脂質キャリア粒子及び挿入プロモーター剤を含むカロチノイ ド組成物であって、カロチノイドが脂質キャリア粒子中で脂質と共に実質上均一 に分布されており、かつ、該組成物が水性環境中で安定であることを特徴とする 組成物。 ２．カロチノイドが脂質キャリァ粒子の疎水性部分全体に挿入位置で実質上均一 に分布されている、請求項１に記載の組成物。 ３．カロチノイド対脂質のモル比が約１：１０以上である、請求項１に記載の組 成物。 ４．カロチノイド対脂質のモル比が少くとも約１５：８５である、請求項１に記 載の組成物。 ５．挿入プロモーター剤が組成物の少くとも約１５重量％である、請求項１に記 載の組成物。 ６．挿入プロモーター剤がトリグリセリドである、請求項１に記載の組成物。 ７．脂質キャリア粒子がリポソームである、請求項１に記載の組成物。 ８．リポソームが多重膜である、請求項７に記載の組成物。 ９．カロチノイドがレチノイン酸である、請求項１に記載の組成物。 １０．レチノイド、リポソーム及びトリグリセリドを含むレチノイド組成物であ って、 レチノイドがリポソーム中で脂質と共に実質上均一に分布されており、レチノイ ド対脂質のモル比が少くとも約１５：８５であり、トリグリセリドが組成物の少 くとも約１５重量％であり、かつ該組成物が水性環境中で安定であるこを特徴と する組成物。 １１．レチノイドがレチノイン酸である、請求項１０に記載の組成物。 １２．レチノイン酸、脂質成分がジミリストイルホスファチジルコリンから本質 的になるリポソーム及びトリグリセリドを含む組成物であって、 レチノイン酸がりボソーム中でジミリストイルホスファチジルコリンと共に実質 上均一に分布されており、レチノイン酸対ジミリストイルホスファチジルコリン のモル比が少くとも約１５：８５であり、トリグリセリドが組成物の少くとも約 １５重量％であり、かつ該組成物が水性環境中で安定であることを特徴とする組 成物。 １３．カロチノイド、脂質キャリア粒子、挿入プロモーター剤及び薬学上許容さ れるキャリアを含むカロチノイドの医薬単位投薬製剤であって、 カロチノイドが脂質キャリア粒子中で脂質と共に実質上均一に分布されており、 かつ製剤が水性環境中で安定であることを特徴とする製剤。 １４．脂質キャリア粒子中の脂質対製剤の全液体容量の比率が約１ｇ：５０ｃｃ 以下である、請求項１３に記載の製剤。 １５．カロチノイド対脂質キャリア粒子中脂質のモル比が約１：１０以上である 、請求項１３に記載の製剤。 １６．カロチノイド対脂質のモル比が少くとも約１５：８５である、請求項１３ に記載の製剤。 １７．挿入プロモーター剤がキャリアの重量を除いた製剤の少くとも約１５重量 ％である、請求項１３に記載の製剤。 １８．挿入プロモーター剤がトリグリセリドである、請求項１３に記載の製剤。 １９．製剤が少くとも約１００ｍｇのカロチノイドを含有している、請求項１３ に記載の製剤。 ２０．製剤の全液体容量が約５０ｃｃ以下である、請求項１３に記載の製剤。 ２１．脂質キャリア粒子がリポソームである、請求項１３に記載の製剤。 ２２．リポソームが多重膜である、請求項２１に記載の製剤。 ２３．カロチノイドがレチノイン酸である、請求項１３に記載の製剤。 ２４．レチノイド、リポソーム及びトリグリセリドを含むレチノイドの医薬単位 投薬製剤であって、レチノイドがリポソーム中で脂質と共に実質上均一に分布さ れており、レチノイド対脂質のモル比が少くとも約１５：８５であり、トリグリ セリドが組成物の少くとも約１５重量％であり、かつ該組成物が水性環境中で安 定であることを特徴とする製剤。 ２５．レチノイドがレチノイン酸である、請求項２４に記載の製剤。 ２６．レチノイン酸、脂質成分がジミリストイルホスファチジルコリンから本質 的になるリポソーム及びトリグリセリドを含むレチノイン酸の医薬単位投薬製剤 であって、 レチノイン酸がリポソーム中でジミリストイルホスファチジルコリンと共に実質 上均一に分布され、レチノイン酸対ジミリストイルホスファチジルコリンのモル 比が少くとも約１５：８５であり、トリグリセリドが組成物の少くとも約１５重 量％であり、かつ該組成物が水性環境中で安定であることを特徴とする製剤。 ２７．カロチノイド、脂質キャリア粒子及び挿入プロモーター剤を含むカロチノ イド組成物であって、カロチノイドが脂質キャリア粒子中で脂質と共に実質上均 一に分布されており、かつ該組成物が水性環境中で安定である組成物の治療上有 効量を生体に投与することからなる、癌細胞の増殖を阻害する方法。 ２８．組成物が約５：８５〜１５：７０に維持されたカロチノイド：脂質モル比 で被治療体に投与され、組成物が遊離カロチノイドと比較して正常細胞に対し低 い毒性を有する、請求項２７に記載の方法。 ２９．カロチノイドが脂質キャリア粒子の疎水性部分全体に挿入位置で実質上均 一に分布されている、請求項２７に記載の方法。 ３０．カロチノイド対脂質のモル比が約１：１０以上である、請求項２７に記載 の方法。 ３１．カロチノイド対脂質のモル比が少くとも約１５：８５である、請求項２７ に記載の方法。 ３２．挿入プロモーター剤が組成物の少くとも約１５重量％である、請求項２７ に記載の方法。 ３３．挿入プロモーター剤がトリグリセリドである、請求項２７に記載の方法。 ３４，脂質キャリア粒子がリポソームである、請求項２７に記載の方法。 ３５．リポソームが多重膜である、請求項３４に記載の方法。 ３６．カロチノイドがレチノイン酸である、請求項２７に記載の方法。 ３７．レチノイド、リポソーム及びトリグリセリドを含むレチノイド組成物であ って、レチノイドがリボソーム中で脂質と共に実質上均一に分布され、レチノイ ド対脂質のモル比が少くとも約１５：８５であり、トリグリセリドが組成物の少 くとも約１５重量％であり、かつ該組成物が水性環境中で安定である組成物の治 療上有効量を生体に投与することからなる、癌細胞の増殖を阻害する方法。 ３８．レチノイドがレチノイン酸である、請求項３７に記載の方法。 ３９．レチノイン酸、脂質成分がジミリストイルホスファチジルコリンから本質 的になるリポソーム及びトリグリセリドを含むレチノイン組成物であって、レチ ノイン酸がリポソーム中でジミリストイルホスファチジルコリンと共に実質上均 一に分布されており、レチノイン酸対ジミリストイルホスファチジルコリンのモ ル比が少くとも約１５：８５であり、トリグリセリドが組成物の少くとも約１５ 重量％であり、かつ該組成物が水性環境中で安定である組成物の治療上有効量を 生体に投与することからなる、癌細胞の増殖を阻害する方法。