PT687270E

PT687270E - Oligopeptidos de crescimento osteogenico e composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT687270E
Application number: PT94908419T
Authority: PT
Inventors: Michael Chorev; Itai Bab; Andras Muhlrad; Arie Shteyer; Zvi Greenberg; Nura Mansur
Original assignee: Yissum Res Dev Comp The Hebrew
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 2000-11-30
Also published as: ATE193305T1; DE69424657D1; GR3034218T3; EP0687270B1; JPH08509960A; US5814610A; AU6146794A; EP0687270A1; CA2157506C; WO1994020529A1; JP3621099B2; DK0687270T3; ES2149258T3; DE69424657T2; IL104954A0; CA2157506A1; IL104954A

Description

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DESCRICÃQ "Oligopéptidos de crescimento osteogénico e composições farmacêuticas que os contêm"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a oligopéptidos de crescimento osteogénico que possuem actividade estimulante sobre células osteoblásticas e fibroblásticas.

Antecedentes da invenção

Foi estabelecido que a regeneração da medula óssea induz uma resposta osteogénica em locais esqueléticos distantes e que esta actividade é mediada por factores libertados na circulação pelo tecido em cicatrização [Bab I. et a! (1985) Calcif. Tissue Int. 37:551; Foldes, J. et al (1989) J. Bone Min. Res. 4:643; Einhorn, T. A. et a! (1990) J. Bone Joint Surg. Am. 72:1374; Gazit D., et a! (1990) Endocrinoiogy 1 26:2607; Mueller, M. et a! (1991) J. Bone Min. Res. 6:401]. Um destes factores, um polipéptido de crescimento osteogénico (OGP) de 14 aminoácidos, idêntico ao terminal C da histona H4, foi recentemente identificado [Bab, I. et ai (1992) EMBO J. 11:1867; Pedidos de Patente Europeia Nos. 89201608.0 e 90301862.0]. Está descrito um fragmento de histona H4 com a fórmula Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, em Kharchenko, E.P. et a! (1989) Vopr. Med. Khim. 35( 2):106-9 e em Kharchenko, E.P. et ai (1987) Biuii. Eksp. Biol. Med. 103(4):41 8-20. Este péptido demonstrou possuir actividade analgésica e opióde. 0 polipéptido de crescimento osteogénico sintético 14-mero (sOGP), de estrutura idêntica à molécula nativa, mostrou-se um potente estimulante da proliferação de células osteoblásticas e fibroblásticas in vitro. Este polipéptido sintético estimula também a actividade da fosfatase alcalina de células osteoblásticas. Quando injectado in vivo a ratos, em doses muito pequenas, o polipéptido de crescimento osteogénico sintético aumenta a formação de osso e a massa óssea trabecular.

Tal como no caso de outros reguladores do crescimento polipeptídicos, tais como a hormona do crescimento e o factor de crescimento semelhante a insulina [Hintz, R. L. (1990) Horm. Res. 33:105], proteína de ligação ao

85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 2 polipéptido de crescimento osteogénico (OGPBP) podem proteger o polipéptido de crescimento osteogénico contra degradação proteolítica [Bab, I. et al (1992) EMBOJ. 11:1867],

Análogos modificados no terminal C do polipéptido de crescimento osteogénico, tais como [Cys15(NEM)]OGP-NH2, ligam-se às OGPBP. Os análogos modificados não partilham a estimulação do OGP da proliferação celular e não reagem com certos anticorpos anti-OGP. Estes análogos polipeptídicos podem ser utilizados para libertar o OGP do seu complexo com uma OGPBP. Se ocorre a reacção competitiva num meio de cultura de tecidos, previamente incubado com células ou um fluido biológico possuindo actividade de peptidase, o OGP libertado fica exposto à degradação proteolítica resultante da referida actividade de peptidase. Contudo, existe a possibilidade de que péptidos curtos, resultantes da degradação proteolítica, possam reter a actividade do OGP.

Uma vez que a molécula de OGP é demasiado grande para uma administração oral eficaz, seria importante do ponto de vista terapêutico encontrar oligopéptidos de seis ou menos resíduos de aminoácido, que retenham a actividade biológica do OGP. Estes oligopéptidos curtos podem ser modificados numa preparação farmacêutica estável adequada para um tratamento oral adequado ou outro tratamento sistémico, de várias condições patológicas, em particular condições que envolvem a perda de tecido ósseo. Adicionalmente, a identificação de oligopéptidos deste tipo constituiria um passo essencial no sentido da definição da sequência de aminoácidos mínima que ainda reteria a actividade do OGP, a qual pode proporcionar a base para a concepção de mais drogas. A presente invenção refere-se na realidade a tais oligopéptidos nativos ou sintéticos, activos do ponto de vista osteogénico. São aqui utilizadas as seguintes abreviaturas: OGP - polipéptido de crescimento osteogénico. OGPBP - proteína de ligação a polipéptidos de crescimento osteogénico. irOGP - OGP imunorreactivo. sOGP - OGP sintético.

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Sumário da invenção A invenção proporciona um oligopéptido bioquimicamente puro possuindo actividade estimulante sobre células osteoblásticas e/ou fibroblásticas, um peso molecular de 200 a 1 000, e uma fórmula seleccionada de entre (a) Tyr-Gly-Phe-His-Gly; (b) ) Tyr-Gly-Phe-Gly; (c) ) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; e (d) Gly-Phe-Gly-Gly-NH2. A invenção proporciona também um método de isolamento de um oligopéptido bioquimicamente puro como definido em (a) acima ou com a fórmula (e) Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly ou (f) Gly-Phe-Gly-Gly a partir de uma amostra biológica, compreendendo os passos de: (a) rejeitar, da referida amostra biológica, péptidos com um peso molecular inferior a 3000; (b) incubar o meio obtido no passo (a) com um polipéptido que se liga a uma proteína/s de ligação a polipéptidos de crescimento osteogénico e não se liga a um anticorpo dirigido contra o polipéptido de crescimento osteogénico na presença de inibidores de protease para competir com o referido polipéptido de crescimento osteogénico na libertação a partir do seu complexo com a referida proteína de ligação ao polipéptido de crescimento osteogénico; e (c) separação do péptido de crescimento osteogénico imunorreactivo do meio reaccional obtido no passo (b) por métodos cromatográficos e para de péptidos bioquimicamente puros possuindo actividade estimulante sobre células osteoblásticas ou fibroblásticas preparadas por este método.

Em adição, a invenção refere-se a composições farmacêuticas para estimulação da formação de células osteoblásticas ou fibroblásticas, e consequente formação de osso, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de oligopéptido (a), (b), (c), (d) ou (f) de acordo com a invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Breve descrição das figuras A Figura 1 apresenta a produção de irOGP total e em estado estacionário por células osteoblásticas ROS 17/2.8 e células osteoblásticas MC3T 3E1 e células fibroblásticas NIH 3T3. Durante o período de medição as células foram crescidas em meio quimicamente definido contendo Albumina de Soro Bovino (BSA) a 4%. Obtiveram-se alíquotas de meio para a determinação do irOGP imediatamente após a adição do meio contendo BSA (ponto de tempo "0") e 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 4

nos tempos posteriores indicados. Determinaram-se o irOGP total e em estado estacionário tal como anteriormente [Bab et a! (1 992) EMBO J. U_: 1867]. A Figura 2 é um diagrama de fluxos que descreve a purificação de irOGP a partir de um meio de cultura de tecidos de 24h preparado como descrito na Fig. 1 anterior utilizando células MC3T 3E1. Os péptidos com um peso molecular inferior a 3000 foram separados através de três ciclos repetidos de diluição/centrifugação. 0 retentado foi então incubado com [Cys15(NEM)]OGP-NH2, and novamente centrifugado. O filtrado foi recolhido, e o irOGP foi separado do [Cys'5(NEM)]OGP-NH2 utilizando HPLC de fase inversa e adicionalmente purificado como mostrado na Fig. 3. O irOGP purificado nos picos observados na Fig. 3 foi submetido a sequenciação de aminoácidos através de degradação de Edam automatizada e testado quanto à actividade proliferativa como mostrado na Fig. 4. A Figura 3 apresenta a separação por HPLC de A- irOGP e [Cys15(NEM)]OGP-NH2 utilizando uma coluna C4 Vydac de fase inversa; e B- os dois picos de irOGP, utilizando uma coluna C18 Merck de fase inversa. As linhas a ponteado e contínua representam a absorvância de luz e a imunorreactividade, respectivamente. A Figura 4 apresenta o efeito de OGP( 10-14) (A) and 0GP(10-14)His13 (B) (veja-se Tabela D) (recuperados dos respectivos picos B-1 e B-2 da Fig. 3) sobre o número de células osteoblásticas MC3T 3E1 in vitro. Linha a ponteado - efeito de controlo positivo de SOGP. Os dados são a média ± SEM de culturas em triplicado. A Figura 5 apresenta o efeito de OGP(10-14) (0--0-0--0--0) e OGP(10-14)His13 (a-a-a) sintéticos sobre 0 número de células osteoblásticas MC3T 3E1(A) e fibroblásticas NIH 3T3 (B) in vitro. As culturas de células foram estabelecidas e desafiadas como nas Figs. 1 e 4. Cf. efeito de controlo positivo de sOGP (□-□-□). Os dados são a média ± SEM de culturas em triplicado representadas como a razão de tratamento para controlo com apenas BSA (razão T/C). 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 5

A Figura 6 apresenta ο efeito de Ac-Met°OGP(10-14) sintético sobre o número de células osteoblásticas MC3T 3E1 (A) e fibroblásticas NIH 3T3 (B) in vitro. As culturas de células foram estabelecidas e desafiadas como nas Figs. 1 e 4. Linha a ponteado - efeito de SOGP de controlo positivo. Os dados são a média ± SEM de culturas em triplicado representadas como a razão de tratamento para controlo com apenas BSA (razão T/C).

Descrição detalhada da invenção O OGP é um polipéptido de 14 resíduos identificado a partir de medula óssea em regeneração que se mostrou estimular a proliferação e a actividade da fosfatase alcalina de células osteoblásticas e fibroblásticas in vitro e aumentar a formação de osso e de massa óssea trabecular em ratos quando injectado in vivo. A sequência de aminoácidos do OGP é a seguinte:

Ala-Leu-Lys-Arg-GIn-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly O OGP sintético, com uma sequência de aminoácidos e actividade biológica idênticas tem sido preparado através de metodologia Standard em fase sólida. Verificou-se também que em diferentes fluidos biológicos o OGP forma um complexo com OGPBP(s) e que análogos de sOGP modificados na sua região C-terminal podem ser utilizados para libertar de modo competitivo o irOGP total dos complexos de OGP-OGPBP, como anteriormente se descreveu.

Os inventores verificaram que se a reacção competitiva ocorrer num meio de cultura de tecidos, previamente incubado com células ou com um fluido biológico possuindo actividade de peptidase, o OGP libertado do complexo de OGP-OGPBP fica exposto a degradação proteolítica pela referida actividade de peptidase. Surpreendentemente, os inventores verificaram que oligopéptidos curtos, que se verificou estarem presentes no referido meio reaccional competitivo, retêm a actividade estimulante sobre células osteoblásticas e fibroblásticas, e consequentemente sobre a formação de osso. A invenção proporciona assim um oligopéptido bioquimicamente puro possuindo actividade estimulante sobre células osteoblásticas e/ou fibroblásticas, com um peso molecular de 200 a 1 000, e uma fórmula seleccionada de entre (a) Tyr-Gly-Phe-His-Gly; (b) Tyr-Gly-Phe-Gly; (c) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; e (d) Gly-Phe-Gly-Gly-NH2. 6 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ A invenção proporciona também um método de isolamento de um oligopéptido bioquimicamente puro possuindo a fórmula (a) ou (e) de acordo com a invenção e possuindo actividade estimulante sobre células osteoblásticas ou fibroblásticas a partir de uma amostra biológica compreendendo os passos de: (a) rejeição, a partir da referida amostra biológica, de péptidos com um peso molecular inferior a 3000; (b) incubação do meio obtido no passo (a) com um polipéptido que se liga a uma proteína/s de ligação ao polipéptido de crescimento osteogénico e não se liga a um anticorpo dirigido contra o polipéptido de crescimento osteogénico na presença de inibidores de protease para competir com o referido polipéptido de crescimento osteogénico na libertação a partir do seu complexo com a referida proteína/s de ligação ao polipéptido de crescimento osteogénico; e (c) separação do péptido de crescimento osteogénico imunorreactivo do meio reaccional obtido no passo (b) por métodos cromatográficos.

Os péptidos com pesos moleculares inferiores a 3000 podem ser rejeitados, por exemplo, por ultrafiltração com peso molecular de exclusão nominal de 3000. Os inibidores de protease podem ser inibidores disponíveis no comércio, por exemplo E-64, Leupeptina ou PMSF ou suas misturas. A separação do péptido de crescimento osteogénico imunorreactivo no passo (c) pode ser realizada por técnicas de HPLC disponíveis. Está descrita nos

Exemplos uma concretização específica do método da invenção.

Como se mostrará nos Exemplos seguintes, os. oligopéptidos de acordo com a invenção, quer obtidos pelo referido método de isolamento quer sintetizados, possuem actividade estimulante sobre células osteoblásticas e fibroblásticas, e podem assim ter grande valor terapêutico. A invenção refere-se portanto também a composições farmacêuticas para a estimulação da formação de células osteoblásticas ou fibroblásticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligopéptido bioquimicamente puro com a fórmula (a), (b), (c), (d) ou (f) da invenção.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção preferidas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligopéptido compreendendo a sequência de aminoácidos Tyr-Gly-Phe-His-Gly ou

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Gly-Phe-Gly-Gly ou uma sua mistura; e um transportador farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser particularmente úteis para a estimulação de células osteoblásticas e/ou células fibroblásticas, e consequentemente, para a formação óssea aumentada em várias condições patológicas, por exemplo osteoporose (ou osteopenia de qualquer etiologia), reparação de fracturas, cicatrização de ferimentos, implantes intra-ósseos e suplementação de ossos, ou outras condições que requeiram formação de ossos aumentada.

Assim, a invenção proporciona um oligopéptido bioquimicamente puro de fórmula (a), (b), (c), (d) ou (f) de acordo com a invenção, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia ou em diagnóstico, preferivelmente quando o método de tratamento é para a estimulação da formação de células osteoblásticas ou fibroblásticas, formação óssea aumentada em condições patológicas osteopénicas, reparação de fracturas, cicatrização de ferimentos, implantes intra-ósseos e suplementação de ossos, formação óssea e outras condições que requeiram formação óssea aumentada. A invenção proporciona também a utilização destes péptidos no fabrico de medicamentos para utilização nestes tratamentos. A invenção proporciona também a utilização de um oligopéptido com a fórmula (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) de acordo com a invenção no fabrico de um medicamento para a estimulação de formação de células osteoblásticas ou fibroblásticas, formação óssea aumentada em condições patológicas osteopénicas, reparação de fracturas, cicatrização de ferimentos, implantes intra-ósseos e suplementação de ossos e outras condições que requeiram formação óssea aumentada. A grandeza da dose terapêutica de um polipéptido da invenção variará evidentemente com o grupo de pacientes (idade, sexo, etc.), a natureza da condição a tratar e com o polipéptido particular empregue e sua via de administração. Em qualquer caso a dose terapêutica será determinada pelo médico assistente.

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Pode ser empregue qualquer via de administração adequada para proporcionar a um mamífero, em especial ao homem, uma dosagem eficaz de um polipéptido de acordo com a invenção. Preferem-se a administração intravenosa e oral.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em formas de dosagem unitária. As formas de dosagem podem também incluir dispositivos de libertação sustentada. As composições podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na arte da farmácia.

As composições farmacêuticas da invenção compreendem como um ingrediente activo um oligopéptido com a fórmula (a), (b), (c), (d) ou (f) da presente invenção ou uma mistura destes oligopéptidos num transportador, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente outros constituintes terapêuticos. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis, não são tóxicos para os receptores nas dosagens e nas concentrações empregues, e incluem tampões, tais como solução salina tamponada com fosfato e tampões semelhantes fisiologicamente aceitáveis, e mais genericamente, todos os transportadores, excipientes e estabilizantes adequados conhecidos na arte.

EXEMPLOS

Exemplo 1- Purificação e caracterização de pentapéptidos a partir de meio de cultura de tecidos

Materiais

Os ingredientes para a cultura de tecidos foram adquiridos de Biological Industries (Beit Haemek, Israel). As placas de cultura eram de Nunc (Roskilde, Denmark). A BSA, os inibidores de protease e a N-etilmaleimida (NEM) eram de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO; Cat No. A-7030). Os microconcentradores Centricon-3 foram adquiridos a Amicon, lnc.(Beverly, MA). A resina t-Boc-GlyOCH2-Pam, os derivados de aminoácidos protegidos com N-Box, a Ν,Ν-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), o 1 -hidroxibenzotriazolo (HOBt), a diisopropiletilamina (DIEA), o ácido trifluoroacético (TFA), a Ν,Ν-dimetilformamida (DMF) e o diclorometano (DCM) foram obtidos de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). O fluoreto de hidrogénio (HF) foi adquirido de Mathesohn (Secacus, NJ), o Boc-3-l-Tyr(BZ1 )-OH de Bachem (Torrance CA), o 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 9

p-Cresol de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wl) e o Sephadex G15F de Pharmacia (Uppsala, Suécia). A coluna C18 de fase inversa e o acetonitrilo eram de E. Merck, Darmstadt, Alemanha. A coluna C4 de fase inversa era de The Separation Group, Hesparia CA. Métodos

Medição da acumulação de irOGP em meios de cultura de tecidos

Mantiveram-se células osteoblásticas ROS 17/2.8 ou MC3T 3E1 ou fibroblastos NIH 3T3 em Meio Essencial Mínimo a suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FCS) e fizeram-se subculturas duas vezes por semana. As células para as experiências eram provenientes de culturas de manutenção em confluência. Para a experiência as células foram semeadas em frascos de cultura de tecidos de 25cm2 a 1 x 104 células/cm2. Incubaram-se as culturas a 37°C em C02 do ar. Durante as 46 h iniciais o meio foi suplementado com FCS a 10% e 0,2% de nucleósidos/ribonucleósidos seguindo-se um período adicional de 2h sem nutrientes sob condições de isenção de soro. Depois o meio isento de soro foi substituído por 8 ml de meio contendo BSA a 4%. Obtiveram-se alíquotas de meio mililitro de meio para a determinação do irOGP imediatamente após a adição do meio contendo BSA (ponto de tempo "0") e 12, 24, 36 e 48 h depois. Determinou-se o irOGP total e em estado estacionário nestas alíquotas tal como anteriormente [Bab et al. (1992) EMBO J. 11:18671.

Separação entre irOGP and OGPBP

A Fig. 2 é uma demonstração esquemática da separação entre o irOGP e a OGPBP. Uma amostra de 3,75 ml de meio recolhido 24 h depois do período de cultura das células sem nutrientes, foi diluída (1:1) com uma igual quantidade de solução salina tamponada com fosfato (PBS). O meio diluído foi centrifugado em múltiplos microconcentradores Centricon-3 durante 1,5 h a 5 000 x g. Os polipéptidos menores com peso molecular inferior a 3000 foram arrastados por lavagem do retentado através de três ciclos repetidos de diluição/centrifugação utilizando azida de sódio 1 mM em acetato de amónio 165 nM, pH 7.0 como diluente. O volume mínimo de retentado deixado em cada microconcentrador foi de 250 μΙ. Para libertar o irOGP do complexo de OGP-OGPBP, o retentado diluído de 1:1 foi incubado durante 30 min a 37°C com [Cys15(NEM)]OGP-NH2 450 nmol/ml em acetato de amónio 165 nM

85 469 ΕΞΡ Ο 687 270/ΡΤ 10 contendo Ε-64 50μΜ, Leupeptina 50 μΜ e PMSF 500 μΜ e novamente centrifugado.

Separação entre irOGP e [Cys15(NEM)]OGP-NH2 O filtrado obtido através do passo de microconcentração foi parcialmente evaporado até um volume final de 600μΙ. O teor de irOGP do filtrado era de 0,31 nmoi. Dividiu-se o filtrado em três alíquotas iguais. Separou-se o irOGP em cada uma destas alíquotas do [Cys15(NEM)]OGP-NH2 por HPLC utilizando uma coluna C4 Vydac para proteínas de fase inversa empregando o seguinte gradiente de acetonitrilo a um caudal de 1 ml/min: 3 ml de acetonitrilo a 12%; e 30 ml acetonitrilo a 12-19%.

Separação entre dois picos de irOGP

Recuperaram-se fracções de meio mililitro compreendendo o pico principal de irOGP da coluna C4 e reuniram-se e evaporaram-se parcialmente até um volume final de 400 ul. O teor de irOGP deste pico era de 0,26 nmol. Dividiu-se o filtrado em duas alíquotas iguais. Submeteu-se o irOGP em cada uma destas alíquotas a HPLC numa coluna C18 de fase inversa empregando o seguinte gradiente de acetonitrilo a um caudal de 1 ml/min: 3 ml de acetonitrilo a 14% e 30 ml de acetonitrilo a 14-19%.

Determinação da sequência de aminoácidos A proteína nos dois picos de irOGP recuperados da coluna C18 foi submetida a análise de sequenciação de péptidos automática num sequenciador 470A da Applied Biosystems utilizando o programa e reagentes fornecidos pelo fabricante. Os derivados de aminoácidos libertados foram identificados com o auxílio de um sistema de HPLC em linha.

Resultados

A Fig. 1 mostra que em todos os três sistemas celulares estudados, o irOGP total atingiu um pico 24 h após o período sem nutrientes e a exposição ao meio quimicamente definido. Este período de tempo coincide com a confluência das culturas. Durante as 24 h seguintes houve uma diminuição de aproximadamente 50% no irOGP total. 0 irOGP em estado estacionário apresentou um crescimento mais ou menos linear durante todo o período de detecção. Estes resultados indicam que as células estromais produzem o irOGP

85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ e a OGPBP. A taxa de síntese do irOGP e/ou da OGPBP diminui quando as culturas atingem a confluência. O meio de cultura de 24 h das células MC3T3 E1 foi submetido a repetidos ciclos de diluição/centrifugação para remover o irOGP não ligado e outros péptidos com peso molecular menor que 3000 (Fig. 2). Apenas 0,96% do irOGP total pode sèr rejeitado desta maneira. O irOGP remanescente foi deixado na forma de complexo de OGP-OGPBP que estava contido no retentado devido ao seu elevado peso molecular. (Tabela A). A separação por HPLC de [Cys15(NEM)]OGP-NH2 resultou em três picos principais de absorção de luz. O maior destes picos eluiu com 19,5-23,5 min de tempo de retenção, uma posição semelhante à do [Cys15(NEM)]OGP-NH2 numa operação separada sob as mesmas condições. Este pico não apresenta imunorreactividade de OGP. Ambos ós outros picos apenas foram parcialmente separados um do outro e apresentaram um elevado teor de irOGP (Fig. IA), 11,5% do irOGP total presente no meio de cultura (Tabela A). É provável que a maioria desta diminuição no teor de irOGP resulte de actividade de peptidase durante a reacção de deslocamento, apesar da presença de inibidores de peptidase. Para aumentar a separação entre estes picos de irOGP reuniram-se as fracções correspondentes (tempo de retenção de 11-12,5 min) e submeteram-se a um segundo passo de HPLC que resultou em dois picos distintos de absorção de luz, ambos apresentando elevado teor de irOGP (Fig. 1B). Estes picos foram designados por B-1 e B-2.

TABELA A

RECUPERAÇÃO DE OGP IMUNORREACTIVO A PARTIR DE PASSOS DE

PURIFICAÇÃO INDIVIDUAIS

Passo de purificação de irOGP (total em nmol na preparação) Percentagem de recuperação 24 h após meio sem nutrientes 270,0 100 Ultrafiltração inicial 2,6 0,96 Ultrafiltração após deslocamento 31,0 11,5 HPLC de fase inversa 12,6 4,7

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As fracções correspondentes que eluíram com tempos de retenção de 23,5-24 min e 25-25,5 min foram reunidas. Alíquotas das fracções reunidas foram acondicionadas para ensaio ao seu efeito proliferativo no ensaio com células MC3T 3E1. A sequenciação de aminoácidos revelou que o pico B-1 continha um pentapéptido idêntico à região C-terminal (resíduos 10-14) de OGP. O pico B-2 continha um pentapéptido semelhante em que Gly13 do OGP estava substituída por His (Tabela B).

TABELA B

SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PENTAPÉPTIDOS

Pico B-1 * Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly

Pico B-2* Tyr-Gly-Phe-His-Gly *Definidos na Figura 3. A actividade proliferativa de cada pico no ensaio com células MC3T 3E1 foi idêntica à dos controlos positivos de sOGP com um pico a 10'13 M (Fig. 4).

Exemplo 2- Actividade de pentapéptidos sintéticos Síntese de péptidos

Prepararam-se péptidos sintéticos de acordo com a presente invenção através do método em fase sólida de Merrifield [Merrifield, (1969) Adv. Enzymoi 32: 221] utilizando um Sintetizador de péptidos automático Modelo 430A da Applied Biosystems (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). No caso do ácido livre de péptido a síntese foi realizada em 0,5 mmol de resina t-Boc-Gly-PAM (1% reticulada, 0,61 meq/g). Utilizou-se resina t-Boc-Gly-MBHA (1% reticulada, 0,66 meq/g) para o tetrapéptido amidado. Os derivados de aminoácidos foram protegidos na função α-amino com grupos t-butiloxicarbonilo (Boc). A protecção da cadeia lateral da tirosina foi efectuada com Z. Os derivados de aminoácidos foram acoplados através do método do anidrido simétrico pré-formado mediado por DCC de Hagemaier, H. e Frank, H. [Hoppe-Seyler's Z. (1972) Physiol. Chem. 353:1 973], O acoplamento de cada resíduo de aminoácido foi repetido duas vezes. A desprotecção do terminal amino bloqueado foi efectuada por tratamento com TFA a 25% em DCM. Desprotegeram-se as cadeias laterais e clivou-se o péptido da resina utilizando o procedimento com HF no qual se utilizou uma mistura de 4 ml de anisolo e 13 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 36 ml de HF líquido durante 75 min a 0°C. Purificaram-se os péptidos sintéticos em bruto num aparelho de HPLC Merck-Hitachi 655A-11 equipado com uma coluna C18 de Waters μ BondPark™ (1,9x15,0 cm). Bombeou-se o cartucho com gradientes lineares de acetonitrilo contendo TFA (Tabela C) com um caudal de 6,0 ml/min.

Preparou-se o BH-OGP(1 1-14) (BH = Bolton-Hunter) através de reacção de éster de N-hidroxissuccinimidilo de ácido 3-(3-iodo-4-hidroxifenil)propiónico com OGP(11-14) purificado utilizando o método de Michelot et a/ [Michelot R. efa/(1980) Biochem. Biophys. Res. Comm. 95:491-498],

TABELA C

GRADIENTES LINEARES DE ACETONITRILO UTILIZADOS PARA PURIFICAÇÃO POR HPLC DE Dl-, TRI-, TETRA-, ΡΕΝΤΑ- E HEXA- PÉPTIDOS OGP

RELACIONADOS

Gradiente

Péptido (% de Acetonitrilo) Tempo (min) % de TFA OGP (13-14) 0% isocrático 30 0,1 OGP (11-12) 0% isocrático 30 0,1 OGP (12-14) 0% isocrático 30 0,1 OGP (11-13) 0% isocrático 30 0,1 OGP (10-12) 0-25 120 . 0,1 OGP (11-14) 0-30 120 0,1 BH1-OGP(1 1-14) 0-25 90 0,1 0GP(11 -14)NH2 0-5 90 0,05 OGP(10-13) 0-25 120 0,1 OGP(10-14) 0-20 100 0,1 0GP(10-14)His13 0-20 100 0,1 Ac-Met°[0GP(10-14)] 0-20 150 0,1 1 BH = Reagente de Bolton-Hunter A Tabela D demonstra a conversão entre a nomenclatura aqui utilizada e a sequência de aminoácidos dos péptidos. 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 14

TABELA D

COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS DE Dl-, TRI-, TETRA-, ΡΕΝΤΑ- E HEXA-PÉPTIDOS OGP SINTÉTICOS RELACIONADOS OGP (13-14) OGP (11-12) OGP (12-14) OGP (11-13) OGP (10-12) OGP (11-14) BH*-OGP(11-14) OGP (11-14) NH2 OGP (10-13) OGP (10-14) OGP (10-14) His Ac-Met°[OGP(1 0-1 4)] *BH = Reagente de Bolton-Hunter

Gly-Gly

Gly-Phe

Phe-Gly-Gly

Gly-Phe-Gly

Tyr-Gly-Phe

Gly-Phe-Gly-Gly 0H -^Zy(CH2)2-CO-Gly-Phe-Gly-Gly

Gly-Phe-Gly-Gly-NH2

Tyr-Gly-Phe-Gly

Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly

Tyr-Gly-Phe-His-Gly

Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly

Resultados O efeito proliferativo de cada pentapéptido (OGP(10-14) (fórmula (e)) ou OGP(10-14)His13 (fórmula (a))) nos ensaios com células MC 3T3E1 e NIH 3T3 foi semelhante ao dos controlos positivos de sOGP. Os picos de actividade respectivos foram a concentrações de péptido de 10 13 e 10'11-10'10 M (Fig. 5).

Exemplo 3 - Efeito proliferativo do hexapéptido O hexapéptido de Ac-Met°[OGP(10-14)] foi preparado para testar a exequibilidade de utilizar Ac-[35S]Met(OGP(10-14)] para estudos metabólicos e de ligação.

Resultados O Ac-Met°[OGP](10-14)] estimulou o número de células MC 3T3E1 e NIH 3T3 de uma maneira estreitamente semelhante aos controlos positivos de sOGP com picos a concentrações de péptido de 10'13 e 10'11 M, respectivamente (Fig. 6).

I 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ % 15

Exemplo 4 - Efeito proliferativo de tetra-, tri- e di-péptidos BH-OGP(11-14)

Todos os cinco tetrapéptidos tinham um efeito de resposta à dose sobre o número de células MC 3T3E1 e NIH 3T3 com picos a concentrações de péptido de 10'13 e 10 11 M, respectivamente. A grandeza do efeito do pico de BH-OGP(11-14) em cada um dos sistemas celulares foi superior e semelhante ao do controlo positivo de sOGP. O pico de actividade de 0GP(11-14), OGP(10-13) e OGP (10-12) apresentou valores intermédios. O OGP (11-14)NH2 apresentou o menor efeito de pico. O OGP (12-14), o OGP (11-13), o OGP(13-14) e o OGP (11-12) não afectaram o número de células MC3T3 E1 e NIH 3T3 (Tabela E).

TABELA E

ACTIVIDADE PROLIFERATIVA DE Dl-, TRI- E TETRA-PÉPTIDOS OGP SINTÉTICOS RELACIONADOS {Percentagem da actividade do Péptido [OGP( 1 -14)] de comprimento completo}

Lisboa, 2:4. í Jâ 2000 MC3T3 E1 No. da NIH 3T3 No. da Péotido Média Gama Exper. Média Gama Exper. BH*-OGP(11-14) 113 70-137 3 80 63-112 3 OGP(11-14) 66 34-100 8 68 34-100 4 OGP(10-1 3) 58 42-74 2 89 89 1 OGP(10-12) 41 41 1 57 57 1 OGP(11 -14)NH2 25 19-31 2 33 31-35 2 OGP(1 2-14) 0 0 3 0 0 3 OGP(11 -13) 0 0 3 0 0 3 OGP(1 3-14) O 0 3 0 0 3 OGP(11-1 2) 0 0 3 0 0 3 *BH- Reagente de Bolton-Hunter.

Por YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEBREW UNIVERSITY OF JERUSALEM - O AGENTE QEÍ Ά

Ag. Of. Pr. Ind.

Ruo das Flores, 74 - 4.· ieoo LISBOA

Claims

85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Oligopéptido bioquimicamente puro possuindo actividade estimulante sobre células osteoblásticas e/ou fibroblásticas, um peso molecular de 200 a 1 000 e uma fórmula seleccionada de entre (a) Tyr-Gly-Phe-His-Gly; (b) Tyr-Gly-Phe-Gly; (c) Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly e (d) Gly-Phe-Gly-Gly-NH2.
2. Método de isolamento de um oligopéptido bioquimicamente puro de acordo com a reivindicação 1, parte (a), ou para isolamento de um oligopéptido bioquimicamente puro possuindo actividade estimulante sobre células osteoblásticas ou fibroblásticas e com a fórmula (e) Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, a partir de uma amostra biológica, processo que compreende os passos de: (a) rejeição, a partir da referida amostra biológica, de péptidos com um peso molecular inferior a 3000; deixando um meio; (b) incubação do meio obtido no passo (a) com um polipéptido que se liga a uma proteína/s de ligação ao polipéptido de crescimento osteogénico e não se liga a um anticorpo dirigido contra o polipéptido de crescimento osteogénico na presença de inibidores de protease para competir com o referido polipéptido de crescimento osteogénico na libertação a partir do seu complexo com a referida proteína/s de ligação ao polipéptido de crescimento osteogénico; e (c) separação do péptido de crescimento osteogénico imunorreactivo do meio reaccional obtido no passo (b) por métodos cromatográficos.
3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que, no passo (a), os péptidos com pesos moleculares inferiores a 3 000 são rejeitados por ultrafiltração com um peso molecular de exclusão nominal de 3000.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 3 em que os referidos inibidores de protease são E-64, Leupeptina ou PMSF ou suas misturas.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 em que, no passo (c), o péptido de crescimento osteogénico imunorreactivo é separado por HPLC. 85 469 ΕΡ Ο 687 270/ΡΤ 2/2
6. Composição farmacêutica compreendendo um oligopéptido de acordo com a reivindicação 1, ou possuindo a fórmula (f) Gly-Phe-Gly-Gly; e um transportador farmaceuticamente aceitável.
7. Método de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo a formulação de um oligopéptido ou oligopéptido modificado tal como definidos na reivindicação 6, com um transportador farmaceuticamente aceitável.
8. Oligopéptido de acordo com a reivindicação 1, ou possuindo a fórmula (f) Gly-Phe-Gly-Gly para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia ou em diagnóstico.
9. Oligopéptido de acordo com a reivindicação 8 em que o método de tratamento é para estimulação de formação de células osteoblásticas ou fibroblásticas, formação óssea aumentada em condições patológicas osteopénicas, reparação de fracturas, cicatrização de ferimentos, implantes intra-ósseos e suplementação de ossos, e outras condições que requeiram formação óssea aumentada.
10 - Utilização de um oligopéptido de acordo com a reivindicação 1, ou possuindo a fórmula (e) Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, ou (f) Gly-Phe-Gly-Gly, no fabrico de um medicamento para a estimulação de células osteoblásticas ou fibroblásticas, formação óssea aumentada em condições patológicas osteopénicas, reparação de fracturas, cicatrização de ferimentos, implantes intra-ósseos e suplementação de ossos, e outras condições que requeiram formação óssea aumentada.

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ENG.' ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ág. Of. Pr. Ind. Sus des Flores, 74 - 4.® 1ΕΘΟ LISBOA