PT2707359T - Derivados de indazol substituídos ativos como inibidores de quinase - Google Patents

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Lombardi Borgia Andrea
Nesi Marcella
Ciomei Marina
Donati Daniele
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Description

DESCRIÇÃO
DERIVADOS DE INDAZOL SUBSTITUÍDOS ATIVOS COMO INIBIDORES DE
QUINASE A presente invenção refere-se a certos compostos de indazol substituídos, que modulam a atividade de proteínas quinases. Os compostos desta invenção são, portanto, úteis no tratamento de doenças causadas pela atividade desregulada de proteínas quinases. A presente invenção também proporciona métodos para preparar estes compostos e composições farmacêuticas compreendendo estes compostos, e divulga métodos de tratamento de doenças que utilizam composições farmacêuticas compreendendo estes compostos. 0 mau funcionamento das proteínas quinases (PKs) é uma característica de numerosas doenças. Uma grande parte dos oncogenes e proto-oncogenes envolvidos em cancros humanos codificam PKs. 0 aumento da atividade de PKs também está implicado em muitas doenças não malignas, tais como hiperplasia benigna da próstata, adenomatose familiar, polipose, neurofibromatose, psoríase, proliferação de células lisas vasculares associadas a aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite, glomerulonefrite e estenose pós-cirúrgica e re-estenose.
As PK também estão implicadas em condições inflamatórias e na multiplicação de vírus e parasitas. As PKs também podem desempenhar um papel importante na patogénese e no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.
Para uma referência geral ao mau funcionamento ou desregulação das PK ver, por exemplo, Current Opinion in Chemical Biology (1999) 3, 459-465; Cell (2000) 100, 113-
127; Nature Rev. Drug Discov. (2002) 1, 309-315; E
Carcinogenesis (2008) 29, 1087-191.
Um subconjunto de PK é um grupo de receptores de membrana com atividade intrínseca de proteína-tirosina quinase (RPTK) . Por ligação dos fatores de crescimento, as RPTKs tornam-se ativadas e fosforilam-se a elas mesmas e a uma série de substratos no citoplasma. Através deste mecanismo, elas podem converter sinalizações intracelulares de proliferação, diferenciação ou outras alterações biológicas. Anormalidades estruturais, sobre-expressão e ativação de RTPKs são frequentemente observadas em tumores humanos, sugerindo que a ignição constitutiva da conversão do sinal que leva à proliferação celular pode resultar em transformação maligna. A tirosina quinase 3 do tipo FMS (FLT3) e o KIT são ambos membros da família PDGFR, tirosina quinases de receptor classe III, caracterizados por um domínio extracelular com 5 loops tipo imunoglobulina, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático contendo não só a quinase (dividido em duas regiões) mas também um domínio de juxtamembrana (JM) auto-inibitório que encaixa com o domínio quinase para estabilizar uma conformação cataliticamente inativa. Normalmente, a FLT3 tem um papel crucial na hematopoiese normal e a sua expressão é restrita às células estaminais/ progenitoras hematopoiéticas CD34+, cérebro, placenta e gônadas. A ativação da FLT3 por ligandos FLT3 promove o crescimento normal de células progenitoras precoces.
Na leucemia aguda, verificou-se que mutações do gene FLT3 são uma das lesões genéticas mais comuns adquiridas. As mutações da FLT3 podem ser detectadas em 30% dos pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) (Nakao M, et al., Leukemia, 1996 Dec, 10 (12): 1911-8) e também em 5-10% dos pacientes com síndrome mielodisplásica (Horiike S, et al., Leukemia, 1997 Sep, 11(9): 1442-6). Existem dois tipos frequentes de mutações genéticas somáticas da FLT3: duplicações internas em tandem (ITDs) no domínio JM e mutações pontuais no loop de ativação do domínio tirosina quinase (TKD). As mutações ITD são qualquer alongamento ou encurtamento do domínio JM do gene FLT3 devido a adições ou deleções de aminoácidos, que resultam na ativação constitutiva do FLT3. A presença de mutações FLT3/ITD está associada um mau prognóstico clínico tanto em pacientes pediátricos como adultos com LMA. As mutações pontuais no loop de ativação do domínio quinase (FLT3/TKD) envolvem o ácido aspártico, resíduo D835, o que conduz a uma configuração ativada e a uma transformação de células mielóides. As mutações D835 são mutações sem sentido que resultam na substituição da tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou asparagina pelo ácido aspártico no aminoácido 835 do FLT3. Estas mutações foram relatadas em 7% dos pacientes com LMA. As mutações TKD, ao contrário das mutações ITD, não demonstraram ter qualquer significado prognóstico em pacientes com LMA. Ambos os tipos de mutação FLT3 causam a ativação independente do ligando do receptor e a ativação das vias de sinalização a jusante. A FLT3 mutante proporciona vantagem de sobrevivência às células leucémicas porque provoca a ativação de três vias de sinalização intracelular principais: PI3K7AKT; RAS/RAF/MAPK e JAK/STAT (Masson K, Ronnstrand L. Cell Signal, 2009 Dec. 21(12) : 1717-26) .
Em conclusão, a interferência com a sinalização da FLT3 provavelmente representa uma maneira específica e eficaz para bloquear a proliferação de células tumorais na LMA e possivelmente noutras indicações. O KIT é normalmente ativado pelo factor de células estaminais. A sinalização por KIT desempenha um papel importante na eritropoiese, linfopoiese, desenvolvimento e função de mastócitos, megacariopoiese, gametogénese e melanogénese. As células estaminais hematopoiéticas, os progenitores multipotentes e os progenitores mieloides comuns, mas também os progenitores da linhagem T precoce e os timócitos expressam níveis elevados de KIT. Além disso, os mastócitos, os melanócitos da pele e as células intersticiais de Cajal do tubo digestivo expressam KIT (Pittoni P. et al., Oncogene 2011 Feb 17; 30(7): 757-69). A sobre-expressão ou mutações do KIT podem conduzir a cancro. As mutações neste gene estão frequentemente associadas com tumores do estroma gastrointestinal (GIST) (Antonescu CR, J Pathol., 2011; 223(2): 251-6). Cerca de 65-85% dos GISTs têm mutações KIT, divididas em duas categorias: mutações dos domínios reguladores do receptor (extracelular e justamembranar) e mutação no domínio enzimático. No diagnóstico, as mutações, deleções e mutações pontuais mais frequentes, afetam o domínio JM. As mutações do domínio extracelular são as segundas mutações mais comuns seguidas por mutações no domínio da quinase tirosina. A mutação do gene KIT também foi identificada em melanomas (Curtin JA, JCO, 2006, 24 (26): 4340-4346), na leucemia mielóide aguda (Malaise M, Steinbach D, Corbacioglu S, Curr Hematol Malig Rep.): 77-82), e no carcinoma adenoide cístico primário da glândula salivar (Vila L, Liu H, Al-Quran SZ, Coco DP, Dong HJ, Liu C, Mod Pathol. 2009; 22(10): 1296-302). A sobre-expressão também é descrita no carcinoma tímico (Strõbel P, Hohenberger P, Marx A, J. Thorac Oncol. 2010; 5 (10 Suppl 4): S286-90), no glioma (Morris PG, Abrey LE. Target Oncol. 2010; 5(3): 193-200), no seminoma testicular (Nikolaou M. et al., Anticancer Res. 2007; 27 (3B): 1685-8) e cancro das pequenas células do pulmão (SCLC) (Micke P, et al. Clin Cancer Res 2003: 9(1): 188-94). Os distúrbios adicionais estão ligados à ativação do KIT, como a doença dos mastócitos (Lim KH, Pardanani A, Tefferi A. Acta Haematol, 2008; 119(4): 194-8) ou o piebaldismo (Murakami T, et al. J. Dermatol Sei. 2004 Jun; 35 (1):29-33).
Com base na recolha de dados, a ativação da quinase KIT parece ser o fator que desencadeia um grupo importante de neoplasias malignas, tanto doenças hematológicas como doenças de cancros sólidos, sugerindo assim esta activação poderia representar um bom alvo terapêutico para o tratamento dessas patologias.
Foram descritos novos compostos eficazes para a profilaxia e tratamento de doenças, como doenças mediadas por HGF, no documento WO2005/073224 A2, em nome de Amgen Inc. Alguns derivados de indazol foram ai exemplificados entre vários compostos com estruturas diferentes. Estes compostos foram descritos como sendo úteis no tratamento de cancro e angiogénese.
Os derivados de indazol substituídos ativos como inibidores de quinase foram descritos no documento WO2010/69966 Al em nome de Nerviano Medicai Sciences Srl. Em particular, demonstrou-se que estes compostos inibem a atividade das proteínas quinases ALK, IGF-1R e JAK2.
Os derivados de amino-indazol ativos como inibidores de quinase foram descritos no documento WO2003/028720 Al em nome de Pharmacia Italia Spa. Vários compostos foram aí exemplificados, ainda que não tenham sido fornecidos dados de atividade para demonstrar a sua alegada atividade. Vários derivados de indazol, úteis no tratamento de várias doenças tais como cancros, neurodegeneração e aterosclerose também foram revelados nos documentos W02005085206 e WO2008003396, em nome de Hoffmann La Roche AG e Merck GMBH, respectivamente.
Apesar destes desenvolvimentos, há ainda necessidade de agentes mais eficazes.
Descobrimos agora que uma série de indazois são potentes inibidores de proteína quinase e são, deste modo, úteis na terapia anticancerígena.
De forma concordante, um primeiro objectivo da presente invenção é proporcionar um composto de indazol substituído representado pela fórmula (I),
(I) em que:
Ar é um grupo selecionado entre
Ar1 Ar2 em que:
Rl é A, NR6R7, 0R8, ou um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterociclilo, NR11R12 ou CORIO; R2, R3, R4 e R5 são, independentemente, hidrogénio, halogénio ou um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, em que: A é um alquilo C1-C6 linear ou ramificado substituído com um grupo NR11R12; R6 é um hidrogénio ou um alquilo C1-C6 linear ou ramificado opcionalmente substituído com NR11R12 ou um heterociclilo; R7 é um hidrogénio, alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo Ci-C6 linear ou ramificado ou R6 e R7, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, podem formar um grupo heterocíclico opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterociclilo ou CORIO; R8 é um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado; RIO é um 0R13;
Rll e R12 são independentemente hidrogénio, ou um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo, opcionalmente substituído com alquilo Ci-C6 linear ou ramificado ou heterociclilo, ou
Rll e R12, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, podem formar um grupo heterocíclico opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterociclilo ou CORIO; R13 é um alquilo C1-C6 linear ou ramificado; X é uma liqação ou um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterocíclico e arilo; Y é uma ligação, oxigénio ou um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado, um alcenilo C2-C6 linear ou ramificado, um alcinilo C2-C6 linear ou ramificado, um heterociclilo e um arilo; Z é uma ligação, oxigénio ou alquilo C1-C6 linear ou ramificado;
Ar' é um grupo selecionado entre um arilo e heteroarilo, opcionalmente substituído com halogénio, alquilo C1-C6 linear ou ramificado substituído ou 0R13; em que o termo "heterociclilo" refere-se a um anel carbocíclico saturado de 4 a 6 membros, em que um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos selecionados entre azoto e oxigénio; 0 termo "arilo" refere-se a um hidrocarboneto mono-carbocíclico, em que os anéis carbocíclicos são "aromáticos" e em que o termo "aromático" se refere a um sistema de ligação π-electrão completamente conjugado; 0 termo "heteroarilo" refere-se a anéis heterocíclicos aromáticos de 6 membros com um heteroátomo de N; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção também proporciona métodos de síntese dos derivados de indazol substituídos de fórmula (I), preparados através dum processo que consiste em transformações sintéticas padrão e isómeros, tautómeros, hidratos, solvatos, complexos, metabolitos, pró-drogas, veículos, N-óxidos. A presente invenção também proporciona um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento de doenças causadas por e/ou associadas com a atividade desregulada da proteína quinase, particularmente a atividade de ABL, ACK1, AKT1, ALK, AUR1, AUR2, BRK, BUB1, CDC7 / DBF4, CDK2 / CYCA, CHK1, CK2, EEF2K, EGFR1, EphA2, EphB4, ERK2, FAR, FGFR1, FLT3, GSK3beta, Haspin, IGFR1, IKK2, IR, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, LCK, LYN, MAPKAPK2, MELK, MET, MNK2, MPS1, MST4, NEK6, NIM1, P38alfa, PAK4, PDGFR, PDK1, PERK, PIM1, PIM2, PKAalfa, PKCbeta, PLK1, RET, R0S1, SULU1, Syk, TLK2, TRKA, TYK, VEGFR2, VEGFR3 ou ZAP70, mais especificamente a atividade de FLT3, PDGFR, VEGFR3, TRKA ou KIT e ainda mais especif icamente a atividade de FLT3 ou KIT, que compreende a administração duma quantidade eficaz dum composto de indazol substituído representado pela fórmula (I), como definido acima, a um mamífero com necessidade da mesma.
Uma forma de realização preferida da presente invenção consiste em proporcionar um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento duma doença causada por e/ou associada com a atividade desregulada da proteína quinase, selecionada entre o grupo constituído por cancro, distúrbios de proliferação celular e doenças e distúrbios associados com células de sistema imunitário.
Outra forma de realização preferida da presente invenção consiste em proporcionar um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento de tipos específicos de cancro, selecionados entre grupo que consiste em, mas não está limitado a, carcinomas como o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão (incluindo cancro das células pequenas), glândula salivar, esófago, vesícula biliar, ovário, pâncreas, estômago, cérvix, tiroide, timo, próstata e pele, incluindo carcinomas de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma de células pilosas e linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crónicas, síndrome mielodisplásica e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo tumor do estroma gastrointestinal, fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; outros tumores, incluindo a doença dos mastócitos, melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteossarcoma, xeroderma pigmentoso, queratoxantoma, cancro folicular da tiroide, sarcoma e mesotelioma de Kaposi e outros.
Outra forma de realização preferida da presente invenção consiste em proporcionar um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento de desordens de proliferação celular específicas, como por exemplo, hiperplasia benigna da próstata, polipose adenomatose familiar, neurofibromatose, psoríase, proliferação de células lisas vasculares associada à aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite, glomerulonefrite e estenose pós-cirúrgica e re-estenose.
Outra forma de realização preferida da presente invenção consiste em proporcionar um composto de fórmula (I), como definido acima, para utilização no tratamento de doenças e perturbações associadas a células do sistema imunitário, como doenças inflamatórias e auto-imunes, por exemplo, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, doenças inflamatórias do intestino (IBD), doença de Crohn, síndroma do intestino irritável, pancreatite, colite ulcerativa, diverticulose, miastenia gravis, vasculite, psoríase, esclerodermia, asma, alergia, esclerose sistémica, vitiligo, artrite como a osteoartrite, a artrite reumatóide juvenil e a espondilite anquilosante.
Outra forma de realização preferida da presente invenção consiste em proporcionar um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento de cancros mutados do FLT3, como a leucemia mielóide aguda ou a síndrome mielodisplástica.
Outra forma de realização preferida da presente invenção consiste em proporcionar um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento de cancros mutados do KIT, como tumores do estroma gastrointestinal, melanoma, leucemia mielóide aguda, carcinoma adenoide cístico primário da glândula salivar, carcinoma tímico, glioma, seminoma testicular, cancro das pequenas células do pulmão, doença dos mastócitos ou piebaldismo.
Além disso, a forma de realização da presente invenção também proporciona um composto de fórmula (I), tal como definido acima, para utilização no tratamento de angiogénese tumoral e inibição de metástases.
Numa outra forma de realização preferida, o composto da presente invenção, para utilização no tratamento de qualquer uma das doenças acima mencionadas, é administrado por submissão do mamífero que dele necessite a um regime de terapia de radiação ou quimioterapia, em combinação com pelo menos um agente citostático ou citotóxico.
Além disso, a invenção proporciona um método in vitro para inibir a atividade da proteína quinase FLT3 ou KIT, que compreende o contacto da referida proteína com uma quantidade eficaz dum composto de fórmula (I). A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz dum composto de fórmula (I) ou dum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e, pelo menos um excipiente, veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula (I) em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos - por exemplo citostáticos, citotóxicos -, agente do tipo antibióticos, agentes alquilantes, agentes anti-metabólicos, agentes hormonais, agentes imunológicos, agentes do tipo interferão, inibidores da ciclooxigenase (por exemplo, inibidores da COX-2), inibidores da matriz metaloprotease, inibidores da telomerase, inibidores da tirosina quinase, agentes do receptor do factor anti-crescimento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogénese (por exemplo, inibidores da angiogénese), inibidores de farnesil transferase, inibidores da via de transdução de sinal ras-raf, inibidores do ciclo celular, outros inibidores de cdks, agentes de ligação da tubulina, inibidores de topoisomerase I, Inibidores da topoisomerase II, e outros semelhantes.
Adicionalmente, a invenção proporciona um produto que compreende um composto de fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tal como definido acima, e um ou mais agentes quimioterápicos, como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial em terapia anticancerígena.
Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um composto de fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tal como definido acima, para utilização como medicamento.
Além disso, a invenção proporciona um composto de fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tal como definido acima, para utilização num método de tratamento de cancro.
Os compostos de fórmula (I) podem ter um ou mais centros assimétricos e podem, portanto, existir como isómeros ópticos individuais ou misturas racémicas. De forma concordante, todos os isómeros possíveis dos compostos de fórmula (I) e suas misturas, estão dentro do âmbito da presente invenção.
Nos casos em que os compostos de fórmula (I) têm ligações duplas carbono-carbono insaturadas, ambos os isómeros cis (Z) e trans (E) estão dentro do âmbito desta invenção.
Os derivados dos compostos de fórmula (I) originados do metabolismo num mamífero e os bio-precursores farmaceuticamente aceitáveis (também designados como pró-drogas) dos compostos de fórmula (I), também estão dentro do âmbito da presente invenção.
Para além do acima referido, como é conhecido pelos peritos na arte, o azoto não substituído no anel de pirazol dos compostos de fórmula (I) equilibra-se rapidamente em solução para formar uma mistura de tautómeros, como ilustrado abaixo.
(I) (la)
Em que Ar, Ar', X, Y e Z são como definidos acima.
Deste modo, na presente invenção, quando apenas um tautómero está indicado para os compostos de fórmula (I), o outro tautómero (Ia) também está dentro do âmbito da presente invenção, a menos que especificamente indicado em contrário.
Além disso, também os seus hidratos, solvatos, complexos e N-óxidos estão dentro do âmbito da presente invenção se foram facilmente obtidos a partir dos compostos de fórmula (I), tal como definidos acima.
Os N-óxidos são compostos de fórmula (I) em que azoto e oxigénio são ligados através de uma ligação dativa.
Os termos gerais, tal como aqui utilizados, a não ser que se especifique de outro modo, têm o significado indicado abaixo. 0 termo "alquilo C1-C6 linear ou ramificado" refere-se a um radical hidrocarboneto alifático saturado, incluindo grupos de cadeia linear e cadeia ramificada de 1 a 6 átomos de carbono, por exemplo metilo, etilo, propilo, 2-propilo, n-butilo, iso-butilo, tertbutilo, pentilo e outros semelhantes. 0 grupo alquilo pode ser substituído ou não substituído; quando não especificado de outro modo, os grupos substituintes são de preferência um a três, independentemente selecionados entre o grupo constituído por halogénio, ciano, nitro, S0nR9, CORIO, NR11R12, 0R13, R11R12N-(Ci-Cõ)-alquilo, R130-(C1-C6) e ainda um grupo opcionalmente substituído selecionado entre alcenilo C2-C6, alcinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, heterociclilo, arilo e heteroarilo, em que R9, RIO, Rll, R12, R13 e n são como definidos acima. 0 termo "cicloalquilo C3-C6" refere-se a um anel monocíclico de carbono com 3 a 6 membros, que pode conter uma ou mais ligações duplas, mas não tem um sistema de n-electrões completamente conjugado. Exemplos de grupos cicloalquilo sem limitação são o ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclo-hexilo, ciclo-hexenilo e ciclo-hexadienilo. Um grupo cicloalquilo pode estar substituído ou não substituído; quando não especificado em contrário, os grupos substituintes são de preferência de um a três, independentemente selecionados entre um grupo que consiste em halogénio, ciano, nitro, S0nR9, CORIO, NR11R12, 0R13, R11R12N-(Ci-Cô)-alquilo, R130-(Ci-Cô) -alquilo e ainda um grupo alquilo C1-C6 linear ou ramificado opcionalmente substituído, alcenilo C2-C6, alcinilo C2-C6, heterociclilo, arilo e heteroarilo, em que R9, RIO, Rll, R12, R13 e n são como definidos acima. 0 termo "heterociclilo" refere-se a um anel carbociclico saturado ou parcialmente insaturado de 3 a 7 membros, em que um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos como o azoto, oxigénio e enxofre. Exemplos não limitantes de grupos heterociclilo são o oxiranilo, aziridinilo, oxetanilo, azetidinilo, tetra-hidrofuranilo, di-hidrofuranilo, tetra-hidrotiofenilo, di-hidrotiofenilo, pirrolidinilo, di-hidropirrolilo, piranilo, di-hidropiranilo, tetra-hidropiranilo, tetra-hidrotiopiranilo, piperidinilo, pirazolinilo, isoxazolidinilo, isoxazolinilo, tiazolidinilo, tiazolinilo, isotiazolinilo, dioxanilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, hexametileneiminilo, homopiperazinilo e outros semelhantes. Um grupo heterociclilo pode estar substituído ou não substituído; quando não especificado o contrário, os grupos subst ituintes são, de preferência, de um a três, independentemente selecionados entre um grupo constituído por halogénio, ciano, nitro, S0nR9, CORIO, NR11R12, 0R13, R11R12N-(C1-C6)-alquilo, R130-(Ci-Cõ) -alquilo e ainda um grupo alquilo C1-C6 linear ou ramificado opcionalmente substituído, alcenilo C2-C6, alcinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, heterociclilo, arilo e heteroarilo, em que R9, RIO, Rll, R12, R13 e n são como definidos acima. 0 termo "arilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto mono-, bi- ou poli-carbocí clico com 1 a 4 sistemas de anéis, opcionalmente ainda fundidos ou ligadas entre si por ligações simples, em que pelo menos um dos anéis carbocíclicos é "aromático" e em que o termo "aromático" refere-se a um sistema de ligação π-electrão completamente conjugado. Exemplos não limitantes de tais grupos arilo são os grupos fenilo, α ou β-naftilo ou bifenilo. 0 termo "heteroarilo" refere-se a anéis heterociclicos aromáticos, tipicamente heterociclos de 5 a 7 membros com 1 a 3 heteroátomos selecionados entre N, 0 e S; o anel heteroarilo pode ser ainda opcionalmente fundido ou ligado a anéis carbocíclicos e heterociclicos aromáticos e não aromáticos. Exemplos não limitantes de tais grupos heteroarilo são o piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, fenilpirrolilo, furilo, fenilfurilo, oxazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, tienilo, benzotienilo, isoindolinilo, benzoimidazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, 1,2,3-triazolilo, 1-fenil-l,2,3-triazolilo, 2,3-di-hidroindolilo, 2,3-di-hidrobenzofuranilo, 2,3-di-hidrobenzotiofenilo; Benzopiranilo, 2,3-di- hidrobenzoxazinilo, 2,3-di-hidroquinoxalinilo e outros semelhantes.
Os grupos arilo e heteroarilo podem ser substituídos ou não substituídos; Quando não especificado o contrário, os grupos substituintes são, preferencialmente, de um a três, selecionados independentemente entre um grupo constituído por halogénio, ciano, nitro, S0nR9, CORIO, NR11R12, 0R13, R11R12N-(C1-C6)-alquilo, R130-(Ci-Cõ)-alquilo e ainda um grupo alquilo Ci-Cô linear ou ramificado opcionalmente substituído, alcenilo C2-C6, alcinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, heterociclilo, arilo e heteroarilo, em que R9, RIO, Rll, R12, R13 e n são como definidos acima. 0 termo "halogéneo" indica flúor, cloro, bromo ou iodo. 0 termo "alcenilo C2-C6" indica uma cadeia hidrocarbonada alifática C2-C6 contendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e que pode ser linear ou ramificada. Exemplos representativos incluem, mas não estão limitados a etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1- ou 2-butenilo e outros semelhantes. 0 termo "alcinilo C2-C6" indica uma cadeia hidrocarbonada alifática C2-C6 contendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e que pode ser linear ou ramificada. Exemplos representativos incluem, mas não estão limitados a, etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 1- ou 2-butinilo e outros semelhantes.
Os grupos alcenilo e alcinilo podem ser substituídos ou não substituídos; quando não especificado o contrário, os grupos substituintes são, preferencialmente, de um a três, selecionados independentemente entre um grupo constituído por halogénio, ciano, nitro, S0nR9, CORIO, NR11R12, OR13, R11R12N-(C1-C6)-alquilo, R130-(Ci-Cô)-alquilo e ainda um grupo alquilo C1-C6 linear ou ramificado opcionalmente substituído, cicloalquilo C3-C6, heterociclilo, arilo e heteroarilo, em que R9, RIO, Rll, R12, R13 e n são como definidos acima. 0 termo "nitro" indica um grupo -NO2. 0 termo "ciano" indica um resíduo -CN. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" de compostos de fórmula (I) refere-se aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades do composto original. Os referidos sais incluem sais de adição de ácido com ácidos inorgânicos como o ácido clorídrico, bromídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, perclórico e outros semelhantes, ou com ácidos orgânicos como o ácido acético, trifluoroacético, propiónico, glicólico, láctico, (D) ou (L) málico, maleico, fumárico, metanossulfónico, etanossulfónico, benzóico, p-toluenossulfónico, salicílico, cinâmico, mandélico, tartárico, cítrico, succínico, malónico e outros semelhantes; sais formados quando um protão ácido presente num composto de fórmula (I) é substituído por um ião metálico, por exemplo um ião dum metal alcalino, como o sódio ou o potássio ou um ião alcalino-terroso, como o cálcio ou o magnésio, ou coordenado com uma base orgânica, como a etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N- metilglucamina e outras semelhantes.
Os compostos específicos (Cpd.) da invenção ou um sal dos mesmos são listados abaixo:
A presente invenção também proporciona um processo para a preparação dum composto de fórmula (I) como definido acima, utilizando as vias de reação e os esquemas sintéticos descritos abaixo, utilizando as técnicas disponíveis na arte e matérias-primas facilmente disponíveis. A preparação de certas formas de realização da presente invenção é descrita nos exemplos que se seguem, mas os peritos na arte reconhecerão que as preparações descritas podem ser facilmente adaptadas para preparar outras formas de realização da presente invenção. Por exemplo, a síntese de compostos não exemplificados de acordo com a invenção pode ser realizada por modificações evidentes para os peritos na arte, por exemplo, protegendo apropriadamente grupos interferentes, mudando para outros reagentes adequados conhecidos na arte ou fazendo modificações frequentes das condições de reação. Alternativamente, outras reações aqui referidas ou conhecidas na arte serão reconhecidas como tendo adaptabilidade para preparar outros compostos da invenção. 0 Esquema 1 e o Esquema 2 descritos mostram as preparações de um composto de fórmula (I).
Esquema 1
em que Ar é como definido na fórmula (I); W é um hidroxi, halogénio ou um grupo de saida adequado; X, Y, Z e Ar' são como definidos na fórmula (I); e L é um grupo de saida adequado, selecionado entre o grupo constituído por halogéneo, metanossulfoniloxi, trifluorometanossulfoniloxi e p-toluenossulfoniloxi.
Esquema 2
em que Ar é como definido na fórmula (I); W é um hidroxi, halogénio ou um grupo de saída adequado; X, Y, Z e Ar' são como definidos na fórmula (I); e L é um grupo de saída adequado, selecionado entre o grupo constituído por halogéneo, metanossulfoniloxi, trifluorometanossulfoniloxi e p-toluenossulfoniloxi.
Todos os peritos na arte compreenderão que qualquer transformação realizada de acordo com os referidos métodos pode requerer modificações normais tais como, por exemplo, proteção de grupos interferentes, mudança para outros reagentes adequados conhecidos na arte ou fazer modificações frequentes das condições de reação.
De forma concordante, um processo da presente invenção compreende as seguintes etapas: A) introdução do grupo tert-butoxi-carbonilo no composto de fórmula (II) (II)
5 B) clivagem do grupo ftalimido do composto resultante de fórmula (III)
(III) C) acilaçao do composto resultante de fórmula (IV)
(iv) por reação com um composto de fórmula (V)
(V) em que Ar é como definido na fórmula (I) e W é um hidroxi, halogénio ou um grupo de saída adequado; D) clivagem selectiva do éter tert-butildimetilsililo do composto resultante de fórmula (VI)
(VI) em que Ar é como definido na fórmula (I); E) acoplamento do composto resultante de fórmula (VII)
(VII)
Em que Ar é como definido na fórmula (I), alternativamente com:
Ea) um composto de fórmula (VIII)
(VIII)
Em que Ar', Z e Y são como definidos na fórmula (I) e X é um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo; ou
Eb) um composto de fórmula (IX)
(IX)
Em que Ar', Z e Y são como definidos na fórmula (I) e X é um arilo ou em que Ar' é como definido na fórmula (I) e X, Y e Z são uma ligação; ou
Ec) um composto de fórmula (X)
(X) em que Ar' é como definido na fórmula (I); X é um grupo selecionado entre um alquilo Ci-C-6- linear ou ramificado ou um heterociclilo e L é um grupo de saida adequado, selecionado entre o grupo constituído por halogéneo, metanossulfoniloxi, trifluorometanossulfoniloxi e p- toluenossulfoniloxi. F) clivagem do grupo tert-butoxi-carbonilo do composto resultante de fórmula (XI), obtido no passo Ea), Eb) ou Ec)
(XI)
Em que Ar, Ar', X, Y e Z são como definidos na fórmula (I), de modo a obter um composto de fórmula (I), como definido acima; separando opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) nos isómeros simples; opcionalmente, converter o composto resultante de fórmula (I) num composto diferente de fórmula (I), e/ou num sal farmaceuticamente aceitável se desejado.
Alternativamente, o composto intermediário de fórmula (XI), em que Ar, Ar', Y e Z são como definidos na fórmula (I) e X é um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo, pode ser obtido num processo compreendendo as seguintes etapas: G) clivagem selectiva do éter tert-butildimetilsililo do composto de fórmula (IV), como definido acima; H) acoplando o composto resultante de fórmula (XII)
(XII) alternativamente com:
Ha) um composto de fórmula (VIII), como definido acima; ou
Hb) um composto de fórmula (X), como definido acima; I) acilação do composto resultante de fórmula (XIII)
(XIII) em que Ar, Ar', Y e Z são como definidos na fórmula (I) e X é um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo, com um composto de fórmula (V) , como definido acima, de modo a obter um composto de fórmula (XI), em que Ar, Ar', Y e Z são como definidos na fórmula (I) e X é um grupo selecionado entre um alquilo Ci-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo.
Um outro objectivo da presente invenção é um processo para a preparação do composto de fórmula (I), tal como definido acima, compreendendo as seguintes etapas: J) acoplamento do composto de fórmula (XIV)
(XIV) alternativamente com:
Ja) um composto de fórmula (VIII), como definido acima; ou
Jb) um composto de fórmula (IX), como definido acima; ou
Jc) um composto de fórmula (X), como definido acima; K) conversão do composto resultante de fórmula (XV)
(xv) em que Ar', X, Y e Z são como definidos na fórmula (I); L) acilaçao do composto resultante de fórmula (XVI)
(XVI) em que Ar', X, Y e Z são como definidos na fórmula (I), com um composto de fórmula (V) , como definido acima, de modo a obter um composto de fórmula (I), como definido acima; separar opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) nos isómeros simples; converter opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) num composto diferente de fórmula (I), e/ou num sal farmaceuticamente aceitável se desejado.
Um outro objectivo da presente invenção é um processo para preparar um composto de fórmula (I), em que RI é NR6R7, em que R6 é como definido acima e R7 é um hidrogénio, alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou um heterociclilo opcionalmente substituído com um alquilo C1-C6 ramificado, e em que Ar, Ar', X, Y e Z são como definidos acima, compreendendo as seguintes etapas: M) acilação do composto de fórmula (XVI), como definido acima, com um composto de fórmula (XVII)
{XV!!} em que R2, R3, R4 e R5 são como definidos na fórmula (I) e W e L são como definidos acima; N) acoplamento do composto resultante de fórmula (XVIII)
(XVIII) em que Ar', X, Y, Z, R2, R3, R4 e R5 são como definidos na fórmula (I) e L é como definido acima, com um composto de fórmula (XIX)
(XIX)
Em que R6 é definido como na fórmula (I) e R7 é um hidrogénio, um alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou um heterociclilo opcionalmente substituído por um alquilo Ci-C6 linear ou ramificado, de modo a obter um composto de fórmula (I), em que RI É NR6R7, em que R6 é como definido na fórmula (I) e R7 é um hidrogénio, um alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou um heterociclilo opcionalmente substituído por um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e Ar, Ar', X, Y e Z São como definidos na fórmula (I); separar opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) nos isómeros simples; converter opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) num composto diferente de fórmula (I), e/ou num sal farmaceuticamente aceitável se desejado.
Como se disse acima, os compostos de fórmula (I) que são preparados de acordo com o processo da invenção, podem ser convenientemente convertidos em outros compostos de fórmula (I), operando de acordo com condições sintéticas bem conhecidas, sendo os seguintes exemplos de possíveis conversões: 3) reação dum composto de fórmula (I) em que o substituinte RI é NH2, com um aldeído ou cetona adequados na presença dum agente redutor, para obter o composto correspondente de fórmula (I) em que esse substituinte é um grupo NR6R7 e em que R7 é um hidrogénio e R6 é como definido na fórmula (I), excepto um hidrogénio; 7) oxidação dum composto de fórmula (I) em que RI é o 4-metil-piperazin-l-ilo para se obter o correspondente composto de fórmula (I), em que tal substituinte é o 4-metil-4-oxi-piperazin-l-ilo;
De acordo com a etapa A) , a transformação do composto de fórmula (II) no composto de fórmula (III) pode ser realizada de várias formas e em várias condições experimentais, que são amplamente conhecidas na arte para a introdução do tert-butoxi-carbonilo, por exemplo utilizando dicarbonato de di-tert-butilo. Preferencialmente, esta reação é levada a cabo num solvente adequado como, por exemplo, o tetrahidrofurano, o diclorometano, o tolueno, o 1,4-dioxano e na presença dum eliminador de protões, como por exemplo a piridina, a trietilamina e a N,N-diisopropiletilamina, a uma temperatura que varia desde a temperatura ambiente até à temperatura de refluxo, durante um intervalo de tempo de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa B), a clivagem do grupo ftalimido do composto de fórmula (III) para originar o composto de fórmula (IV) pode ser realizada de várias formas e sob várias condições experimentais, que são amplamente conhecidas na arte, por exemplo usando hidrazina. De preferência, esta reação é levada a cabo num solvente adequado, como por exemplo o tetrahidrofurano, o diclorometano, o tolueno e o 1,4-dioxano, a uma temperatura que varia desde a temperatura ambiente até à temperatura de refluxo, durante um período que varia de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa C), um composto de fórmula (VI) pode ser obtido fazendo reagir um composto de fórmula (IV) com um composto de fórmula (V) , de várias formas e sob várias condições experimentais, que são amplamente conhecidas na arte para as reações de acilação. Preferencialmente um composto de fórmula (V), em que W é um hidroxi, é convertido no seu cloreto de acilo correspondente e em que W é cloro na presença de cloreto de tionilo ou cloreto de oxalilo, num solvente adequado como o tolueno, diclorometano, clorofórmio, éter dietílico, tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, ou uma mistura dos mesmos, a uma temperatura que varia de cerca de -10°C até à temperatura de refluxo e durante um período de tempo que varia de cerca de 1 hora até cerca de 96 horas. O cloreto de acilo é isolado por evaporação do solvente e feito reagir adicionalmente com (IV), na presença duma base como a piridina, trietilamina ou N,N-diisopropiletilamina, a uma temperatura que varia de cerca de -40°C até à temperatura de refluxo e durante um período de tempo que varia de cerca de 1 hora a cerca de 96 horas. Também pode adicionar-se um solvente adequado como o tolueno, diclorometano, clorofórmio, éter dietílico, tetrahidrofurano ou 1,4- dioxano. Alternativamente faz-se reagir um composto de fórmula (IV) com um composto de fórmula (V) em que W é hidroxi na presença de um agente ativador como o hidroxibenzotriazol, carbodiimida de diciclohexil, carbodiimida de diisopropil, carbodiimida de l-etil-3-(3'-Dimetilamino), tetrafluoroborato de 0-(benzotriazol-l-il)-N,N, N',N'-tetrametilurónio. De preferência, esta reação é levada a cabo num solvente adequado, como por exemplo o tetrahidrofurano, diclorometano, tolueno, 1,4-dioxano, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida e na presença dum eliminador de protões, como por exemplo a piridina, a trietilamina e a N,N-diisopropiletilamina, a uma temperatura que varia desde a temperatura ambiente até à temperatura de refluxo, durante um intervalo de tempo de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa D) , a clivagem selectiva do éter tert-butildimetilsililo do composto de fórmula (VI) para originar o composto de fórmula (VII) pode ser realizada de várias maneiras, de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na literatura. De preferência, esta conversão é levada a cabo na presença de fluoreto de tetrabutilamónio num solvente adequado, como por exemplo o tetrahidrofurano, o diclorometano, o tolueno e o 1,4-dioxano, a uma temperatura que varia de -10°C até à temperatura de refluxo, durante um período de tempo que varia de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa Ea), o acoplamento dum composto de fórmula (VII) com um álcool de fórmula (VIII) para originar um composto de fórmula (XI) pode ser conseguido de várias formas e sob condições experimentais, que são amplamente Conhecidas na arte para a síntese de éteres arílicos sob condições semelhantes a Mitsunobu. De preferência, esta conversão é realizada na presença dum azodicarboxilato, como por exemplo, o azodicarboxilato de dietilo, o azodicarboxilato de di-isopropilo ou o azodicarboxilato de di-tertbutilo e uma fosfina, como por exemplo, a trifenilfosfina ou a trifenilfosfina ligada a um polímero, num solvente adequado, como por exemplo o tetra-hidrofurano, o diclorometano, o 1,4-dioxano, o tolueno ou o acetonitrilo a uma temperatura que varia de -20°C até à temperatura de refluxo, durante um período que varia entre cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa Eb) , o acoplamento dum composto de fórmula (VII) com um ácido borónico de fórmula (IX) para originar um composto de fórmula (XI) pode ser conseguido de várias maneiras e sob condições experimentais, que são amplamente conhecidas na arte para a síntese de éteres di-arílicos. De preferência, esta conversão é realizada na presença de diacetato de cobre e dum filtro molecular 4A ou de gel de sílica, num solvente adequado, como por exemplo o tetrahidrofurano, o diclorometano e o 1,4-dioxano e na presença dum eliminador de protões, como Por exemplo, a piridina, a trietilamina e a N,N-diisopropiletilamina, a uma temperatura que varia de -10°C até à temperatura de refluxo, durante um período que varia entre cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa Ec) , o acoplamento dum composto de fórmula (VII) com um composto de fórmula (X) para originar um composto de fórmula (XI) pode ser realizado de várias formas e sob várias condições experimentais que são amplamente conhecidas na arte para a alquilação de fenóis. De preferência, um composto de fórmula (VII) é tratado com um cloreto, brometo, iodeto, mesilato ou triflato de fórmula (X) , caso em que L representa um cloro, bromo, iodo, metanossulfoniloxi ou trifluorometanossulfoniloxi, respectivamente, na presença dum eliminador de protões, como por exemplo a trietilamina, a N,N-diisopropiletilamina ou o carbonato de sódio, de potássio ou de césio, num solvente adequado, como por exemplo, o tetrahidrofurano, o 1,4-dioxano, a N,N-dimetilformamida, a N,N-dimetilacetamida e o dimetoxietano, a uma temperatura que varia de -10°C até à temperatura de refluxo, durante um período que varia de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.-
De acordo com a etapa F) , a transformação dum composto de fórmula (XI) num composto de fórmula (I) pode ser realizada de várias maneiras, de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na literatura para a clivagem de um tertbutoxi-carbonilo. Como exemplo, esta reação pode ser realizada sob condições ácidas, por exemplo na presença dum ácido inorgânico ou orgânico como o ácido clorídrico, trifluoroacético ou metanossulfónico, num solvente adequado como o diclorometano, o 1,4-dioxano, um álcool inferior, como o metanol ou o etanol, água, ou uma mistura dos mesmos, a uma temperatura que varia desde a temperatura ambiente até à temperatura de refluxo e durante um período de tempo que varia entre cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa G), a transformação do composto de fórmula (IV) no composto de fórmula (XII) pode ser realizada dum modo análogo ao especificado acima em D).
De acordo com a etapa Ha) , o acoplamento entre o composto de fórmula (XII) e um álcool de fórmula (VIII) pode ser realizado dum modo análogo ao especificado acima em Ea).
De acordo com a etapa Hb) , o acoplamento entre o composto de fórmula (XII) e um composto de fórmula (X) pode ser realizado dum modo análogo ao especificado acima em Ec).
De acordo com a etapa I), a acilação do composto de fórmula (XIII) com um composto de fórmula (V) pode ser realizada de um modo análogo ao especificado acima em C).
De acordo com a etapa Ja), o acoplamento entre o composto de fórmula (XIV) e um álcool de fórmula (VIII) pode ser realizado dum modo análogo ao especificado acima em Ea).
De acordo com a etapa Jb) , o acoplamento entre o composto de fórmula (XIV) e um ácido borónico de fórmula (IX) pode ser realizado dum modo análogo ao especificado acima em Eb) .
De acordo com a etapa Jc), o acoplamento entre o composto de fórmula (XIV) e um composto de fórmula (X) pode ser realizado dum modo análogo ao especificado acima em Ec).
De acordo com a etapa K), um composto de fórmula (XV) pode ser transformado num composto de fórmula (XVI) de várias formas e sob várias condições experimentais. De preferência, esta reação é levada a cabo na presença de hidrazina ou hidrazina mono-hidratada num solvente adequado, como por exemplo o tolueno, o tetrahidrofurano, o 1,4-dioxano, o dimetilsulfóxido, o acetonitrilo, o metanol, o etanol ou o n-butanol, a um temperatura que varia entre 0°C e a temperatura de refluxo e durante um período de tempo que variade cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.
De acordo com a etapa L), a acilação do composto de fórmula (XVI) com um composto de fórmula (V) pode ser realizada dum modo análogo ao especificado acima em C).
De acordo com a etapa M), a acilação do composto de fórmula (XVI) com um composto de fórmula (XVII) pode ser realizada dum modo análogo ao especificado acima em C).
De acordo com a etapa N), o acoplamento dum composto de fórmula (XVIII) com uma amina de fórmula (XIX) pode ser realizado de várias maneiras, de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na literatura para aminações de Buchwald-Hartwig. De preferência, faz-se reagir um composto de fórmula (XVIII) em que L é um cloro, um bromo, um iodo ou um trifluorometanossulfoniloxi, com um composto de fórmula (XIX), num solvente adequado, como por exemplo o tetrahidrofurano, o 1,4-dioxano, a N,N-dimetilformamida, a N,N-dimetilacetamida, o dimetoxietano, o acetonitrilo, e o tolueno, na presença de quantidades catalíticas dum derivado de paládio, como por exemplo o tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0 ) , o diacetato de paládio, e um ligando de fosfina, como por exemplo, o 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo, o 4,5-bis (difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno, o 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo, o 2-diciclo-hexilfosfino-2(N,N-dimetilamino) bifenilo, na presença duma base, como por exemplo o bis(trimetilsilil) amida de sódio ou lítio, o tert-butóxido de sódio ou potássio, o carbonato de sódio, potássio ou césio, a uma temperatura que varia e 0°C até à temperatura de refluxo e durante um período de tempo que varia de cerca de 15 minutos a cerca de 96 horas. De acordo com a conversão 3), a reação dum composto de fórmula (I), em que o substituinte RI é NH2, com um aldeído ou cetona adequado, para se obter um composto de fórmula (I) em que esse substituinte é um grupo NR6R7, pode ser conduzida de várias formas, de acordo com métodos convencionais para a realização de alquilações redutoras. De preferência, esta reação é levada a cabo num solvente adequado, como por exemplo o metanol, a N,N-dimetilformamida, o diclorometano, o tetrahidrofurano, ou uma mistura dos mesmos, na presença dum agente redutor adequado, como por exemplo o boro-hidreto de sódio, o boro-hidreto de tetra-alquilamónio, o boro-hidreto de sódio ciano, o triacetoxiboro-hidreto de sódio, o triacetoxiboro-hidreto de tetrametilamónio e na presença dum catalisador ácido, como por exemplo, o ácido acético ou o ácido trifluoroacético, a uma temperatura que varia de 0°C à temperatura de refluxo e durante um tempo que varia de cerca de 1 hora a cerca de 96 horas.
De acordo com a conversão 7) , a oxidação dum composto de fórmula (I), em que RI é o 4-metil-piperazin-l-ilo, para obter um composto de fórmula (I) em que o referido substituinte é o 4-metil-4-oxi-piperazin-l-ilo, pode ser realizada de várias formas, de acordo com métodos convencionais para a N-oxidação de aminas terciárias. De preferência, esta conversão é realizada na presença dum agente oxidante, como por exemplo, o ácido 3- cloroperbenzóico, o peróxido de hidrogénio e o dimetildioxirano, num solvente adequado, como por exemplo o diclorometano, o metanol, o etanol, a água, a acetona ou uma mistura dos mesmos, a uma temperatura que varia de -10°C até à temperatura de refluxo, durante um período que varia entre cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas. E conhecido pelo perito na arte que, quando um composto de fórmula (V), fórmula (XVII), fórmula (XX) ou fórmula (XXI) transporta grupos funcionais que podem interferir em reações de acilação, tais grupos têm de ser protegidos antes da realização da reação. Em particular, quando um composto de fórmula (V), fórmula (XVII), fórmula (XX) ou fórmula (XXI) é substituído por resíduos de fórmula geral NR6R7, NR11R12, 0R8 ou 0R13, em que R8 ou R13, ou pelo menos um entre o R6 e o R7, ou pelo menos um entre o Rll e o R12, representam hidrogénio, tais grupos podem ser protegidos como é conhecido na arte. Também é conhecido pelo perito que tal grupo de proteção pode ser removido imediatamente após a reação ou numa fase posterior no processo sintético. A desproteção dum composto de fórmula (I) em que um dos substituintes é um grupo amino protegido, pode ser feita de várias formas de acordo com métodos convencionais para desproteger grupos amino. Dependendo do grupo protetor amino, esta reação pode ser conduzida de diferentes modos. Num aspecto, tal reação pode ser realizada por tratamento com um ácido inorgânico, como o ácido clorídrico, sulfúrico ou perclórico, ou um ácido orgânico, como o ácido trifluoroacético ou metanossulfónico, num solvente adequado, como a água, o metanol, o etanol, o 1,4-dioxano, o tetra-hidrofurano, o éter dietílico, o éter diisopropílico, o acetonitrilo, a N, N-dimetilformamida, o diclorometano ou misturas dos mesmo, a uma temperatura que varia de -20°C a 80°C e durante um período de tempo que varia de 30 minutos a 48 horas. Num outro aspecto, tal reação pode ser realizada por tratamento com uma base inorgânica, como o hidróxido de lítio, sódio ou potássio, ou carbonato de sódio, potássio ou césio, ou com uma base orgânica, como a trietilamina ou a N,N-diisopropiletilamina, ou com hidrazina anidra ou hidrato de hidrazina num solvente adequado como a água, o metanol, o etanol, o 1,4-dioxano, o tetrahidrofurano, o éter dietílico, o éter diisopropílico, o acetonitrilo, a N,N-dimetilformamida, o diclorometano ou misturas dos mesmos, a uma temperatura que varia de -20°C a 80°C, e durante um período de tempo que varia de 30 minutos a 72 horas. E conhecido pelo perito na arte que a transformação duma função quimica em outra pode exiqir que um ou mais centros reativos do composto contendo esta função sejam protegidos, de modo a evitar reações secundárias indesejadas. A proteção de tais centros reativos e subsequente desproteção no final das transformações sintéticas pode ser conseguida seguindo procedimentos padrão descritos, por exemplo, em: Green, Theodora W. e Wuts, Peter G.M. - Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons Inc., New York (NY), 1999.
Nos casos em que um composto de fórmula (I) contém urn ou mais centros assimétricos, o referido composto pode ser separado nos isómeros individuais por procedimentos conhecidos pelos peritos na técnica. Tais procedimentos compreendem técnicas cromatográficas padrão, incluindo cromatografia utilizando uma fase estacionária quiral, ou cristalização. Os métodos gerais para a separação de compostos contendo um ou mais centros assimétricos são descritos, por exemplo, em Jacques, Jean; Collet, André; Wilen, Samuel H., Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley & Sons Inc., New York (NY), 1981.
Um composto de fórmula (I) também pode ser transformado num sal farmaceuticamente aceitável de acordo com procedimentos padrão que são conhecidos pelos peritos na arte. Alternativamente, um composto de fórmula (I) que é obtido na forma dum sal pode ser transformado na base livre ou no ácido livre de acordo com procedimentos padrão conhecidos pelos peritos.
De acordo com qualquer variante do processo para a preparação dos compostos de fórmula (I), as matérias-primas e qualquer outro reagente, isto é, compostos de fórmula (II), (V), (VIII), (IX), (X), (XIV), (XVII), (XIX), (XX), (XXI) e (XXII) são comercialmente disponíveis, conhecidos ou facilmente preparados de acordo com métodos bem conhecidos descritos, por exemplo, em: BMTrost e I. Fleming, Comprehensive Organic Synthesis, 1991, Pergamon Press; A.R. Katritzky, 0. Meth-Cohn e C.W. Rees, Comprehensive Organic Functional Group Transformations, 1995, Elsevier Pergamon; A.R. Katritzky e R.J.K. Taylor, Comprehensive Organic Functional Group Transformations II, 2005, Elsevier Pergamon. Em particular, o composto de fórmula (II) pode ser preparado como descrito no documento W02003028720 e o composto de fórmula (XIV) está comercialmente disponível.
Os compostos da presente invenção podem ser administrados quer como agentes individuais quer, alternativamente, em combinação com tratamentos anti-cancerígenos conhecidos, como terapia de radiação ou protocolos de quimioterapia em combinação com agentes citostáticos ou citotóxicos, agentes tipo antibiótico, agentes alquilantes, agentes antimetabolitos, agentes hormonais, agentes imunológicos, agentes de tipo interferão, inibidores de ciclooxigenase (por exemplo, inibidores de COX-2), inibidores de matriz metaloprotease, inibidores de telomerase, inibidores de tirosina quinase, agentes receptores de anti-factor de crescimento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogénese (por exemplo, inibidores da angiogénese), inibidores da farnesil transferase, inibidores da via de transdução de sinal ras-raf, inibidores do ciclo celular, outros inibidores de cdks, agentes de ligação da tubulina, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II e outros semelhantes.
Se formulados com uma dose fixa, tais produtos de combinação usam os compostos desta invenção dentro do intervalo de dosagem descrito abaixo e o outro agente farmaceuticamente ativo dentro do intervalo de dosagem aprovado.
Os compostos de fórmula (I) podem ser utilizados sequencialmente com agentes anticancerigenos conhecidos quando uma formulação de combinação é inadequada.
Os compostos de fórmula (I) da presente invenção, adequados para serem administrados a mamíferos, por exemplo, a seres humanos, podem ser administrados pelas vias habituais e o nível de administração depende da idade, peso e condições do doente e da via de administração.
Por exemplo, uma dosagem adequada adoptada para administração oral dum composto de fórmula (I) pode variar de cerca de 10 a cerca de 1000 mg por dose, de 1 a 5 vezes por dia. Os compostos da invenção podem ser administrados numa variedade de formas, por exemplo, por via oral, sob a forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos revestidos com açúcar ou com película, soluções ou suspensões líquidas; por via retal na forma de supositórios; por via parentérica, por exemplo por via intramuscular, ou por injeção ou infusão intravenosa e/ou intratecal e/ou intraspinal. A presente invenção também inclui composições farmacêuticas compreendendo um composto de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em associação com um excipiente farmaceuticamente aceitável, que pode ser um veículo ou um diluente.
As composições farmacêuticas contendo os compostos da invenção são normalmente preparadas seguindo métodos convencionais e são administradas numa forma farmacêutica adequada. Por exemplo, as formas orais sólidas podem conter, juntamente com o composto ativo, diluentes, por exemplo, lactose, dextrose sacarose, sacarose, celulose, amido de milho ou amido de batata; lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio ou de cálcio, e/ou polietileno glicóis; agentes ligantes, por exemplo, amidos, goma arábica, metilcelulose de gelatina, carboximetilcelulose ou polivinilpirrolidona; agentes desintegrantes, por exemplo, amido, ácido algínico, alginatos ou glicolato de amido sódico; misturas efervescentes; corantes; edulcorantes; agentes molhantes como a lecitina, polissorbatos, laurilsulfatos; e, em geral, substâncias não tóxicas e farmacologicamente inativas utilizadas em formulações farmacêuticas. Estas preparações farmacêuticas podem ser fabricadas de forma conhecida, por exemplo, por meio de processos de mistura, granulação, compressão, revestimento com açúcar ou revestimento com película.
As dispersões líquidas para administração oral podem ser, por exemplo, xaropes, emulsões e suspensões. Como exemplo, os xaropes podem conter como veículo, sacarose ou sacarose com glicerina e/ou manitol e sorbitol.
As suspensões e as emulsões podem conter, como exemplos de veículos, goma natural, agár, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico. As suspensões ou soluções para injeções intramusculares podem conter, em conjunto com o composto ativo, um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água estéril, azeite, oleato de etilo, glicóis, por exemplo, propilenoglicol e, se desejado, uma quantidade adequada de cloridrato de lidocaína. As soluções para injeções ou infusões intravenosas podem conter, como veículo, água estéril ou, de preferência, podem estar na forma de soluções salinas estéreis, aquosas, isotónicas ou podem conter propilenoglicol como veiculo.
Os supositórios podem conter, juntamente com o composto ativo, um veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, manteiga de cacau, polietilenoglicol, um surfatante ou lecitina de éster de ácido gordo de polioxietileno sorbitano.
Com o objectivo de melhor ilustrar a presente invenção, sem impor qualquer limitação à mesma, são agora dados os seguintes exemplos.
SECÇÃO EXPERIMENTAL
Para uma referência a qualquer composto de fórmula (I) especifico da invenção, opcionalmente na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, ver a secção experimental e as reivindicações. Com referência aos exemplos que se seguem, os compostos da presente invenção foram sintetizados utilizando os métodos aqui descritos, ou outros métodos, que são bem conhecidos na arte.
Nos exemplos abaixo, as abreviaturas aqui utilizadas têm o seguinte significado.
(continuação) _
Com o objectivo de melhor ilustrar a presente invenção, sem impor qualquer limitação à mesma, são agora dados os seguintes exemplos.
Tal como aqui utilizado, os símbolos e convenções utilizados nos processos, esquemas e exemplos são consistentes com os utilizados na literatura científica contemporânea, por exemplo, o Journal of American Chemical Society ou o Journal of Biological Chemistry.
Salvo indicação em contrário, todos os materiais foram obtidos a partir de fornecedores comerciais, da melhor qualidade e utilizados sem purificação adicional. Os solventes anidros como o DMF, THF, DCM e tolueno foram obtidos a partir da Aldrich Chemical Company. Todas as reações envolvendo compostos sensíveis ao ar ou à humidade foram realizadas sob uma atmosfera de azoto ou árgon.
Purificação geral e métodos analíticos A cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada em placas pré-revestidas com gel de silica 60 F254 da Merck. A cromatografia em coluna foi realizada sob pressão média sobre sílica (gel de sílica da Merck 40-63 mm) ou realizada utilizando um sistema Biotage SP1 Flash Purification com cartuchos pré-embalados de gel de sílica (Biotage ou Varian) .
Os espectros iH-NMR foram registados em DMSO-d6 ou CDCI3 a uma temperatura constante de 28 °C num espectrómetro Varian INOVA 400 operando a 400.50 MHz e equipado com uma sonda de detecção indireta PFG de 5 mm no eixo Z (iH{15N-31P}) e num espectrómetro Varian Inova 500 operando a 499,75 MHz. O sinal de solvente residual foi utilizado como referência (δ = 2,50 ou 7,27 ppm). Os desvios químicos (δ) são descritos em partes por milhão (ppm) e constantes de acoplamento (J) em Hz. As seguintes abreviaturas são utilizadas com vários fins: s = singuleto; bs = sinal amplo; d = dupleto; t = tripleto; m = multipleto; dd = dupleto de dupletos.
Os espectros de massa por electropulverização (ESI) foram obtidos numa armadilha de iões Finnigan LCQ. Salvo especificação em contrário, todos os compostos finais eram homogéneos (pureza não inferior a 95%), como determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). As análises de HPLC-UV-MS, usadas para avaliar a pureza do composto, foram levadas a cabo combinando o instrumento MS da armadilha de iões com o sistema HPLC SSP4000 (Thermo Separation Products) equipado com um LC Pal de autoamostragem (CTC Analytics) e um detector de matriz de diodo UV6000LP (detecção de UV de 215-400 nm) . O controlo de instrumentos, a aquisição e o processamento de dados foram realizados com o software Xcalibur 1.2 (Finnigan). A cromatografia de HPLC foi realizada à r.t., e com uma taxa de fluxo de 1 ml/min, utilizando uma coluna Waters X Terra RP 18 (4,6 x 50 mm; 3,5 μιη) . A fase móvel A foi tamponada com acetato de amónio 5 mM (pH 5,5 com ácido acético): acetonitrilo 90:10, e fase móvel B foi tamponada com acetato de amónio 5 mM (pH 5,5 com ácido acético): acetonitrilo 10:90; o gradiente foi de 0 a 100% de B em 7 minutos e em seguida manteve-se a 100% de B durante 2 minutos antes de ser novamente equilibrado.
Os espectros de massa de alta resolução ESI ( + ) (HRMS) foram obtidos numa Waters Q-Tof Ultima diretamente ligada com a micro HPLC 1100 Agilent, como anteriormente descrito (Colombo, M., Riccardi-Sirtori, F., Rizzo, V.; um método completamente automatizado para a determinação precisa da massa, usando cromatografia liquida de alta resolução com um espectrómetro de massa de tempo de voo de aceleração quadrupolo/ortogonal., 2004, 18, 511-517).
Preparação 1
Esquema 1, Etapa A)
Uma solução de 2-[6-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-1H-indazol-3-il]-isoindole-1,3-diona (786 mg, 2 mmol) em THF seco (10 ml) E DIPEA (1,4 ml, 8 mmol), sob uma atmosfera de árgon, foi tratada com bicarbonato de di-tert-butilo (495 mg, 2,2 mmol) e agitada à r.t. durante a noite. Evaporou-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se o residuo bruto por cromatografia flash sobre gel de sílica eluído com hexano/EtOAc 7:3, obtendo-se 884 mg (rendimento: 89%) do composto do título, sob a forma dum sólido branco.
Preparação 2
Esquema 1, Etapa B)
Uma solução de éster tert-butílico de ácido 6-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-3-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-indazol- 1-carboxílico (1,17 g, 2,37 mmol) em THF seco (20 ml), sob uma atmosfera de árgon, com 3,56 ml de hidrazina 1M em THF (3,56 mmol) . A mistura foi agitada em refluxo durante lh e, posteriormente foi adicionado mais 1M de hidrazina em THF (8 ml). Depois de se agitar durante 2h adicionais em refluxo, arrefeceu-se a mistura de reação até à r.t. e o sólido precipitado foi filtrado e lavado com THF. O filtrado foi evaporado até à secura e o resíduo foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica eluído com DCM/acetona 7:3, originando 785 mg (rendimento: 91%) do composto do título, na forma dum sólido amarelado. iH-NMR (400 MHz), δ (ppm, DMSO-ch) : 7.71 (d, J=8.90 Hz, 1 H), 7.37 (bs, 1H), 6.81 (dd, J=2.07, 8.54 Hz, 1H) , 6.21 (bs, 2H), 1.59 (s, 9H), 0.99 (s, 9H) , 0.23 (s, 6H)
Preparação 3
Esquema 1, Etapa C) A uma suspensão de ácido 4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzóico (1,64 g, 7,48 mmol) em THF seco (50 ml), sob uma atmosfera de árgon, à r.t., foram adicionados cloreto de tionilo (1,37 ml, 18,9 mmol) e 3 gotas de DMF seca. Aqueceu-se a mistura da reação até os 50 °C e agitou-se durante 5 horas, depois removeu-se os voláteis sob pressão reduzida. O resíduo foi recolhido em tolueno seco (50 ml), novamente evaporado e o resíduo sólido seco sob vácuo elevado. O hidrocloreto de 4-(4-metilpiperazin-l-il)-benzoílo-cloreto resultante foi suspenso em 20 ml de THF seco e tratado gota a gota à r.t. sob uma atmosfera de árgon, com uma solução de éster tert-butilico de ácido 3-amino-6-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-indazol-1-carboxílico (1,81 g, 4,98 mmol) em 20 ml de THF seco e 2,56 ml de DIPEA (14,96 mmol). A mistura da reação foi aquecida a 50°C e agitada durante 22 h. Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida; o resíduo foi diluído com DCM (100 ml) e lavado com uma solução saturada de NaHC03 (75 ml) . A camada orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia rápida sobre gel de sílica eluído com DCM/MeOH/3 0% NH3 95:5:0.5, originando 1,88 g (rendimento: 67%) do composto do título. iH-NMR (400 MHz), δ (ppm, DMSO-de): 10.95 (s, 1H) , 8.03 -7.96 (m, 2H), 7.73 (d, J=9.15 Hz, 1 H), 7.51 (d, J=2.07 Hz, 1 H), 7.06 - 7.01 (m, 2H), 6.90 (dd, J=2.19, 8.78 Hz, 1 H) , 3.34 - 3.32 (m, 4H), 2.53 - 2.50 (m, 4H), 2.27 (s, 3H) , 1.65 (s, 9H), 1.00 (s, 9H), 0.27 (s, 6H)
Preparação 4 Éster tert-butilico do ácido 6-hidroxi-3-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzoilamino]-indazol-1-carboxílico
Esquema 1, Etapa D)
Uma solução do éster tert-butílico de ácido 6-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-3-[4-(4-metil-piperazin-l-il) -benzoilamino]-indazol-l-carboxílico 1,88 g (3,33 mmol) em THF seco (20 ml) foi tratada com TBAF 1M em THF (4 ml, 4 mmol) e agitada à r.t. durante 30 min. Foi então adicionada água (20 ml) e a mistura foi extraída com EtOAc (100 ml). A camada orgânica separada foi seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica eluído com DCM/MeOH/3 0%NH3 92 : 8 : 0, 8, originando, após trituração com
Et2<3, 1,5 g (rendimento: 100%) do composto do título.
Preparação 5
Esquema 1, Etapa Ea)
Uma solução de trifenilfosfina (209 mg, 0,798 mmol) e azodicarboxilato de diisopropilo (0,152 ml, 0,732 mmol) em DCM seco (2 ml) foi agitada sob uma atmosfera de árgon a 4°C durante 15 min. A mistura resultante foi então adicionada a uma solução agitada de éster tert-butilico de ácido 6-hidroxi-3-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzoilamino] -indazol-l-carboxílico (100 mg, 0,222 Mmol) e (3-fenoxi-fenil)-metanol (149 mg, 0, 732 mmol) em 2 ml de DCM seco, à r.t., sob uma atmosfera de árgon. Após agitação à r.t. durante a noite, a mistura da reação foi adsorvida sobre gel de silica, seca, carregada numa coluna cromatográfica de gel de silica e eluída com DCM/MeOH/ 30% NH3 95:5:0.5, originando 87 mg (rendimento: 62%) do composto do titulo. ESI (+) MS m/z 634 (MH+)
Operando de forma análoga, foram obtidos os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 566 (MH +)
ESI (+) MS m/z 625 (MH +)
ESI (+) MS m/z 572 (MH +)
ESI (+) MS m/z 625 (MH +)
ESI (+) MS m/z 625 (MH +)
Preparação 6
Esquema 1, Etapa Eb)
Uma mistura de éster tert-butílico do ácido 6-hidroxi-3-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzoilamino]-indazol-1-carboxílico (110 mg, 0,244 mmol), ácido fenilborónico (92 mg, 0,732 mmol), diacetato de cobre (45 mg, 0,244 mmol) e filtros moleculares 4A (200 mg) em 5 ml de DCM foi tratada com TEA (0,339 ml, 2,44 mmol). Após agitação à r.t. durante 2 dias o solvente foi removido sob pressão reduzida, o resíduo foi tratado com DCM/MeOH/30% NH3 95:5:0.5 e filtrado; o filtrado foi carregado numa coluna cromatográfica de gel de sílica e eluído com DCM/MeOH/30% NH3 95:5:0.5, obtendo-se 88 mg (rendimento: 68%) do composto do título. ESI (+) MS m/z 528 (MH+)
Operando de forma análoga, obtiveram-se os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 546 (MH+)
ESI (+) MS m/z 634 (MH+)
ESI (+) MS m/z 620 (MH+)
ESI (+) MS m/z 634 (MH+)
Preparação 7
Esquema 1, Etapa G)
Uma solução de éster tert-butílico do ácido 3-amino-6-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-indazol-l-carboxílico 672 mg (1,85 mmol) em THF seco (10 ml) foi tratada com TBAF 1M em THF (1,85 ml, 1,85 mmol) e agitada à r.t. durante 30 min. Adicionou-se então água (20 ml) e extraiu-se a mistura com EtOAc (3 x 50 ml). As camadas orgânicas separadas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas até à secura. 0 resíduo foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica eluído com DCM/EtOAc 6:4, originando 429 mg (rendimento: 93%) do composto do título.
Preparação 8
Esquema 1, Etapa Hb)
Uma mistura de éster tert-butílico do ácido 3-amino-6-hidroxi-indazol-l-carboxílico (249 mg, 1 mmol), K2CO3 (152 mg, 1,1 mmol) e éter 2-bromoetilico de benzilo (0,179 ml, 1,1 mmol) em DMF seca (5 ml) foi agitada a 50°C durante 12h. Foi adicionado mais éter 2-bromoetilico de benzilo (30 μΐ) e a mistura foi agitada a 50°C durante 4h adicionais. A mistura da reação foi vertida em água (50 ml) e extraída com EtOAc (50 ml). Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se até à secura. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica eluído com DCM/EtOAc 7:3, originando 274 mg (rendimento: 72%) do composto do título.
ESI (+) MS m/z 384 (MH+)
Preparação 9
Esquema 1, Etapa I)
Uma mistura de hidrocloreto de 4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzoílo-cloreto, preparado a partir de 248 mg (1,13 mmol) de ácido 4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzóico, como descrito acima na preparação 3, e DIPEA (0,386 ml, 2,25 mmol) em THF seco (10 ml), foi tratada gota a gota à r.t. sob uma atmosfera de árgon, com uma solução de éster tert-butilico de ácido 3-amino-6-(2-benziloxi-etoxi)-indazol-1- carboxílico (143 mg, 0,374 mmol) em 10 ml de THF seco. A mistura da reação foi aquecida até os 50 °C e agitada durante 12 h. Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida, o resíduo foi recolhido em DCM (100 ml) e lavado com uma solução saturada de NaHCCb (75 ml) . A camada orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura; o resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida sobre gel de sílica eluído com DCM/MeOH 98:2 e, posteriormente com 90:10, originando 124 mg (rendimento: 57%) do composto do título, na forma dum sólido branco.
Exemplo 1
Esquema 1, Etapa F)
Uma solução de éster tert-butílico do ácido 3-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzoilamino]-6-(3-fenoxi-benziloxi)-indazol-l-carboxílico (87 mg, 0,137 mmol) em DCM/TFA 8:2 (5 ml) foi agitada à r.t. por 2h. Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica eluído com DCM/MeOH/30% NH3 90:10:1, originando 71 mg (rendimento: 97%) do composto do titulo, na forma dum sólido branco.
Operando de forma análoga, obtiveram-se os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 442 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C26H27N5O2 + H+: 442.2238; encontrado 442.2237
ESI (+) MS m/z 466 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C28H27N5O2 + H+: 466.2237; encontrado 466.2255
ESI (+) MS m/z 525 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C31H36N6O2 + H+: 525.2972; encontrado 525.2988
ESI ( + ) H RMS calculado para C27N5O3H29 + H+: 472.2343; encontrado 472.2357
ESI (+) MS m/z 525 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C31N6O2H36 + H+: 525.2972; encontrado 525.2975
ESI (+) MS m/z 534 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C32N5O3H31 + H+: 534.2500; encontrado 534.2498
ESI (+) MS m/z 520 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C31N5O3H29 + H+: 520.2343; encontrado 520.2346
H) ESI (+) MS m/z 486 (MH+)
Preparação 10
Esquema 2, Etapa Jc)
Uma mistura de 2-fluoro-4-hidroxi-benzonitrilo (4,57 g, 33,3 mmol) , K2CO3 (13,8 g, 99,9 mmol) e éter 2-bromoetílico de benzílo (5,79 ml, 36,6 mmol) em DMF seca (15 ml) Foi agitada a 70°C durante 6h. A mistura da reação foi arrefecida até à r.t., vertida sobre 300 ml de água e extraída com EtOAc (2 x 100 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas até à secura. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia (Biotage SPl Flash Purification system) num cartucho de gel de sílica (Biotage SNAP 100 g) eluído com um gradiente de hexano/EtOAc 100:0 a 60:40 durante 20 CV, originando 8,79 g (rendimento: 97%) do composto do título, na forma dum óleo incolor.
ESI (+) MS m/z 272 (MH+)
Operando de forma análoga, foram obtidos os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 340 (MH+)
ESI ( + ) H RMS calculado para C16H13F2NO2+ Na+: 312.0806; encontrado 312.0812
ESI (+) MS m/z 340 (MH+) ESI (+) HRMS calculado para C17H13F4N02+ H+: 340.0955; encontrado 340.0948
ESI (+) MS m/z 290 (MH+)
ESI (+) MS m/z 302 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C17H16FNO3+ Nad 324.1006; encontrado 324.1008
ESI (+) MS m/z 273 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C15H13FN2O2+ H+: 273.1034; encontrado 273.1031
ESI (+) MS m/z 254 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C16H12FNO+ Na+: 276.0795; encontrado 276.0795
Preparação 11
Esquema 2, etapa K)
Uma mistura de 4-(2-benziloxi-etoxi)-2-fluoro-benzonitrilo (8,79 g, 32,4 mmol) e monohidrato de hidrazina (4,72 ml, 97,2 mmol) em n-butanol (15 ml) foi agitada a 120°C durante 8h. A mistura da reação foi arrefecida até à r.t., tratada com 250 ml de água e agitada durante 30 min. O sólido precipitado foi filtrado, lavado com água e seco no forno a 50°C sob alto vácuo, originando 9.0 g do composto do titulo na forma de cristais brancos (rendimento: 98%).
ESI (+) MS m/z 284 (MH+)
Operando de forma análoga, obtiveram-se os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 352 (MH+)
ESI (+) MS m/z 302 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para Ci6Hi6FN302+ H+: 302.1300; encontrado 302.1306
ESI (+) MS m/z 352 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C17H16F3N3O2+ H+: 352.1268; encontrado 352.1274
ESI (+) MS m/z 302 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C16H16FN3O2+ H+: 302.1300; encontrado 302.1302
ESI (+) MS m/z 314 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C17H19N3O3+ H+: 314.1499; encontrado 314.1502
ESI (+) MS m/z 285 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C15H16N4O2+ H+: 285.1346; encontrado 285.1339
ESI (+) MS m/z 266 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para Ci6Hi5n3o+ h+: 266.1288; encontrado 266.1286
Exemplo 2
Esquema 2, Etapa L)
Uma suspensão agitada de hidrocloreto de 4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzollo-cloreto, preparada a partir de 4,55 g (20,7 mmol) de ácido 4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzóico, como descrito acima na preparação 3, em piridina seca (50 ml), foi tratada gota a gota, a 0°C, sob uma atmosfera de árgon, com uma solução de 6-(2-benziloxi-etoxi)-lH-indazol-3-ilamina (5,31 g, 18,8 mmol) em 80 ml de piridina seca. Deixou-se a mistura de reação aquecer até à r.t. durante a noite, sob agitação, depois foi concentrada até aos 30 ml por evaporação rotativa, vertida em 500 ml de solução saturada de NaHCCb e extraída com 300 + 100 ml de DCM. As camadas orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas até à secura. 0 resíduo em bruto foi tratado com 200 ml de EtOAc e agitado até ao refluxo durante 2h. Após arrefecimento até à r.t. o sólido foi filtrado, lavado com EtOAc e seco no forno a 50°C sob vácuo elevado para originar 5,23 g (rendimento: 57%) do composto do título, na forma dum sólido branco.
ESI ( + ) HRMS calculado para C28N5O3H31 + H+: 486.2500; encontrado 486.2501
Operando de forma análoga, foram obtidos os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 445 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C26N4O3H28 + H+: 445.2234; encontrado 445.2224
ESI (+) MS m/z 501 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C29N4O4H32 + H+: 501.2497; encontrado 501.2482
ESI (+) MS m/z 486 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C28H31N5O3 + H+: 486.2500; encontrado 486.2514
ESI (+) MS m/z 504 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C28H30FN5O3+ H+: 504.2406; encontrado 504.2383
ESI (+) MS m/z 554 (MH+)
ESI ( + ) H RMS calculado para C28H30FN5O3+ H+: 504.2406; encontrado 504.2414
ESI (+) MS m/z 554 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C29H30F3N5O3+ H+: 554.2374; encontrado 554.2371
ESI (+) MS m/z 504 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado C28H30FN5O3+ H+: 504.2406; encontrado 504.2409
ESI (+) MS m/z 516 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C29H33N5O4+ H+: 516.2606; encontrado 516.2617 (Composto 43)
ESI (+) MS m/z 584 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculada para C33H41N7O3+ H+: 584.3344; encontrada 584.3340
(Composto 35)
ESI (+) MS m/z 487 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C27H30N6O3+ H+: 487.2452; encontrado 487.2450 (Composto 39)
ESI (+) MS m/z 468 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C28H29N5O2+ H+: 468.2394; encontrado 468.2394
Preparação 12
Esquema 2, Etapa Μ) A uma solução agitada de 6-(2-benziloxi-etoxi)-lH-indazol-3-ilamina (3,0 g, 10,6 mmol) em 30 ml de piridina seca, a 0°C, sob uma atmosfera de árgon, adicionou-se em porções cloreto de 4-bromo-benzoílo (2,32 g, 10,6 mmol). Deixou-se a mistura da reação aquecer até à r.t. durante a noite sob agitação e, depois foi evaporada até à secura. Tratou-se o resíduo com 50 ml de MeOH e 25 ml de NaOH 2N e agitou-se à r.t. durante lh. A mistura foi concentrada até os 10 ml por evaporação rotativa, diluída com 200 ml de água, agitada durante 15 min à r.t. e o sólido suspenso foi filtrado e lavado com água. Após secagem sob vácuo, o sólido em bruto foi purificado por cromatografia (Biotage SP1 Flash
Purification system) num cartucho de gel de sílica (Biotage SNAP 100 g) utilizando DCM como eluente A e DCM/MeOH 9:1 como eluente B. A eluição com um gradiente De A/B 100:0 a 70:30 sob 25 CV originou um sólido cor-de-rosa que foi triturado com EtOAc (50 ml), filtrado, lavado com EtOAc e seco, originando 3,01 g (rendimento: 61%) do composto do título, na forma dum Sólido esbranquiçado.
ESI (+) MS m/z 467 (MH+)
Preparação 13 2-(4-trifluorometil-benziloxi)-etanol
Sob atmosfera de árgon, à r.t., hidreto de sódio (dispersão a 60% em óleo mineral, 1,92 g, 48 mmol) foi agitado com n-hexano (cerca de 10 ml) . A solução de hexano/óleo mineral foi removida e rejeitada e o hidreto de sódio restante foi tratado com 20 ml de THF seco. O etilenoglicol (17,8 ml, 320 mmol) foi então lentamente diluído à r.t. (aviso: evolução do hidrogénio) e a mistura foi agitada à r.t. durante 1.5 horas. Após o aquecimento até ao refluxo (banho de óleo a 80°C) adicionou-se uma solução de l-bromometil-4-trif luorometil-benzeno (7.6 g, 32 mmol) em 20 ml de THF seco e a mistura de reação foi agitada ao refluxo durante 2,5 horas. Após arrefecimento à r.t., foram adicionados 100 ml de solução saturada de cloreto de amónio. A camada orgânica foi separada, lavada com 50 ml de água, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura. Purificou-se o resíduo em bruto por cromatografia flash (Biotage SP1 Flash Purification System) num cartucho de gel de sílica (Varian SF40-120g) utilizando n-hexano como eluente A e EtOAc como eluente B. A eluição com um gradiente de A/B 75:25 a 70:30 sobre 2 CV, depois de 70:30 a 0:100 sobre 2 CV e depois 100% de B, originou 5,9 g (rendimento: 84%) do composto do título, na forma dum óleo amarelo (rendimento: 93%).
ESI (+) MS m/z 221 (MH+) [0199] ESI ( + ) HRMS calculado para C10H11F3O2 + Na+: 243.0603; encontrado 243.0594
Operando de modo análogo, obtiveram-se os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 171 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C9H11FO2+ Na+: 193.0635; encontrado 193.0635
ESI (+) MS m/z 221 (MH+) 2-(2-Fluoro-benziloxi)-etanol
ESI (+) MS m/z 171 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C9H11FO2+ Nad 193.0635; encontrado 193.0635
ESI (+) MS m/z 183 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C10H14O3+ Na+: 205.0835; encontrado 205.0835
ESI (+) MS m/z 154 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C8HiiN02+ H+: 154.0863; encontrado 154.0857
Preparação 14 Éster de ácido 2-(4-trifluorometil-benziloxi)-etil metanossulfónico A uma solução de 2-(4-trifluorometil-benziloxi)-etanol (1,0 g, 4,5 mmol) em DCM seco (20 ml) e DIPEA (2,36 ml, 13,5 mmol), a 0°C, sob uma atmosfera de árgon , foi adicionado cloreto de metanossulfonilo (421 μΐ, 5,4 mmol). A mistura da reação foi agitada a 0°C durante 10 minutos, em seguida o banho de gelo foi removido e a agitação continuou durante 2 horas à r.t.. A mistura foi então diluída com 70 ml de DCM e lavada com 50 ml de solução saturada de NaHCCb, 100 ml de água, 100 ml de HC1 2N e 100 ml de água; foi seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura, obtendo-se 1.35 g (rendimento: quantitativo) de éster de ácido 2—(4— trifluorometil-benziloxi)-etil metanossulfónico na forma dum óleo castanho, que foi utilizado como tal para a etapa seguinte, sem purificação adicional.
ESI (+) MS m/z 299 (MH+) ESI ( + ) H RMS calculado para C11H13F3O4S+ Na+: 321.0379; encontrado 321.0380
Operando de forma análoga, obtiveram-se os seguintes compostos:
ESI (+) MS m/z 249 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C11H13F3O4S+ Na+: 271.0411; encontrado 271.0412
ESI (+) MS m/z 299 (MH+) Éster de ácido 2-(2-fluoro-benziloxi)-etíl metanossulfónico
ESI (+) MS m/z 249 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C11H13F3O4S+ Na+: 271.0411; encontrado 271.0411 Éster de ácido 2-(4-metoxi-benziloxi)-etil metanossulfónico
ESI (+) MS m/z 261 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C11H16O5S+ Na+: 283.0610; encontrado 283.0614 Éster de ácido 2-(piridin-4-ilmetoxi)-etil metanossulfónico
ESI (+) MS m/z 232 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C9H13NO4S+ H+: 232.0638; encontrado 232.0636
Exemplo 3
(Composto 15)
Esquema 2, Etapa N)
Uma solução de N-[6-(2-benziloxi-etoxi)-lH-indazol-3-il]-4-bromo-benzamida (1,3 g, 2,79 mmol) e 4-dimetilamino-piperidina (1,18 ml, 8,37 mmol) em THF seco (20 ml) foi desgaseifiçada por três ciclos de atmosfera de vácuo-árgon e tratada à r.t. sob uma atmosfera de árgon, com Pd2(dba)3 (50 mg), 2-diciclohexilfosfino-2'-(N,N-dimetilamino) bifenilo (50 mg) e LiHMDS 1M em THF (22,3 ml, 22,3 mmol). A mistura da reação foi aquecida até ao refluxo e agitada durante 15 min; posteriormente foi arrefecida até à r.t., vertida em 200 ml de água e extraída com 200 ml de EtOAc. A camada orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia (Biotage SP1 Flash Purification system) num cartucho de gel de sílica (Varian SF40-120g) utilizando D CM como eluente A e DCM/NH3 7N em MeOH 10:1 como eluente B. A eluição com um gradiente de A/B de 100:0 a 0:100 sobre 10 CV, seguida por uma eluição isocrática com eluente B (5 CV), originou um sólido amarelo que foi triturado com EtOAc (15 ml), filtrado, lavado com EtOAc e seco para originar 1,04 g (Rendimento: 73%) do composto do título, na forma dum sólido branco.
ESI (+) MS m/z 514 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C30N5O3H35 + h+: 514.2813; encontrado 514.2817
Operando de modo análogo, obtiveram-se Qs seguintes compostos:
(Composto 16)
ESI ( + ) HRMS calculado para C28N5O3H33 + H+: 488.2656; encontrado 488.2654
(Composto 17)
(Composto 18)
(Composto 19)
ESI ( + ) H RMS calculado para C29N5O3H33 + H+: 500.2656; encontrado 500.2648
(Composto 23)
ESI (+) MS m/z 514 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C30N5O3H35 + H+: 514.2813; encontrado 514.2792 (Composto 24)
ESI (+) MS m/z 473 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C27N4O4H28 + H+: 473.2184; encontrado 473.2169
(Composto 25)
ESI (+) MS m/z 516 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C29N5O4H33 + H+: 516.2606; encontrado 516.2584 (Composto 26)
ESI (+) MS m/z 487 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C28N4O4H30 + H+: 487.2340; encontrado 487.2340
(Composto 27)
ESI (+) MS m/z 514 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C30N5O3H35 + H+: 514.2813; encontrado 514.2797
(Composto 28)
ESI (+) MS m/z 512 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C30N5O3H33 + H+: 512.2656; encontrado 512.2650
Exemplo 4 (Composto 14) Conversão 7
Uma solução de N-[6-(2-benziloxi-etoxi)-lH-indazol-3-il]-4-(4-metil-piperazin-l-il)-benzamida (300 mg, 0,62 mmol) em DCM (5 ml) e MeOH (5 ml) foi tratada à r.t. com ácido 3-cloroperbenzóico (107 mg, 0,62 mmol). Após agitação durante 2 h à r.t. o sólido precipitado foi filtrado, lavado com alguns ml de DCM/MeOH 1:1 e com MeOH e seco sob vácuo, originando 125 mg do composto do titulo (rendimento: 40%) na forma dum sólido branco.
ESI (+) MS m/z 502 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C28N5O4H31 + H+: 502.2449; encontrado 502.2443 O composto do título (120 mg) foi então suspenso em 10 ml de etanol, tratado com HC1 2N (0,5 ml) e agitado até se obter uma solução límpida. A evaporação do solvente, a trituração com éter dietílico e a secagem in vácuo originaram 127 mg do sal hidrocloreto do composto do título na forma dum sólido branco.
ESI (+) MS m/z 502 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado C28N5O4H31 + H+: 502.2449; encontrado 502.2438
Operando de forma análoga, obtiveram-se os seguintes compostos:
(Composto 41)
ESI (+) MS m/z 530 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C30H35N5O4+ H+: 530.2762; encontrado 530.2769 (Composto 42)
ESI (+) MS m/z 570 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C29H30F3N5O4+ H+: 570.2323; encontrado 570.2330
Exemplo 5 (Composto 20)
Conversão 8
Uma solução de éster tert-butílico do ácido 4—{4—[6—(2— benziloxi-etoxi)-lH-indazol-3-ilcarbamoil]-fenil}-piperazina-l-carboxílico (180 mg, 0,31 mmol) em 1,4-dioxano (10 ml) e MeOH (5 ml) foi tratada com ácido clorídrico 4M em 1,4-dioxano (6 ml, 24 mmol). Após agitação durante 2h à r.t. a mistura da reação foi evaporada até à secura, diluída com água (50 ml) e levada a pH básico por adição duma solução saturada de NaHCCb. O sólido precipitado foi filtrado, lavado com água, seco e purificado por cromatografia (Biotage SP1 Flash Purification system) num cartucho de gel de sílica (Biotage SNAP 25g) utilizando DCM como eluente A e DCM/NH3 7N em MeOH 10:1 como eluente B. A eluição com um gradiente de A/B de 100:0 a 0:100 sobre 15 CV, seguida por uma eluição isocrática com eluente B (5 CV) , originou um sólido amarelo que foi triturado com éter dietílico (15 ml) originando 111 mg (rendimento: 75%) do composto do título na forma dum sólido branco.
ESI (+) MS m/z 472 (MH+) ESI ( + ) HRMS calculado para C27N5O3H29 + H+: 472.2343; encontrado 472.2327
FARMACOLOGIA
As abreviaturas aqui utilizadas têm o seguinte significado:
Ensaios
Os compostos da presente invenção foram testados em ensaios bioquímicos, como descrito abaixo.
Preparação de domínios citoplasmáticos de FLT3 e KIT quinase para utilização em ensaio bioquímico
Clonagem, expressão e purificação
0 domínio citoplasmático FLT3 (uma extremidade 564-993 da sequência de comprimento completo de 993 aminoácidos, número de acesso P36888 da base de dados UniProtKB/Swiss-Prot.) foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA de testículo e depois foi clonado em vector pVL para expressão em células de insecto, através do sistema de baculovírus. 0 domínio citoplasmático GST-FLT3 foi expresso em células Sf21 infectadas durante 72 horas a 27°C. A proteína recombinante foi purificada por afinidade em GSH-sefarose e eluída com glutationa. Foi realizada uma etapa de purificação adicional em heparina-sefarose. 0 rendimento final foi de 0,5 mg/bilhão de células e a proteína resultou >90% pura, por coloração coomassie. O domínio citoplasmático KIT (uma extremidade 544-976 da sequência de comprimento completo de 976 aminoácidos, número de acesso P10721 da base de dados UniProtKB/Swiss-Prot) foi clonado no vector pVL para expressão em células de insecto, através do sistema de baculovírus. O domínio citoplasmático GST-KIT foi expresso em células Sf21 infectadas durante 66 horas a 27°C. A proteína recombinante foi purificada por afinidade em GSH-sefarose e eluída com glutationa. 0 rendimento final foi de 9 mg/bilião de células e a proteína resultou >80% pura por coloração coomassie.
As proteínas purificadas foram armazenadas a -80°C antes da sua utilização em ensaios bioquímicos.
Ensaios bioquimicos i. Princípio Geral - Um substrato peptídico específico foi trans-fosforilado pela quinase na presença de ATP rastreado com 33Py-ATP. No final da reação de fosforilação, o ATP que não reagiu, frio e radioativo, foi capturado por um excesso de resina de permuta iónica dowex, que eventualmente assentou por gravidade no fundo da placa de reação. O sobrenadante foi subsequentemente retirado e transferido para uma placa de contagem que foi depois avaliada por contagem β. ii. Preparação da resina Dowex - Foram pesadas 500 g de resina húmida (SIGMA, resina DOWEX preparada sob encomenda malha de 1x8 200-400, 2,5 Kg) e diluídas em formiato de sódio 150 mM para perfazer 2L, pH 3,00. Deixou-se a resina sedimentar durante a noite e depois o sobrenadante foi descartado. Depois de três lavagens, como acima, durante um par de dias, a resina foi deixada sedimentar e foram adicionados dois volumes (em relação ao volume de resina) de tampão de formiato de sódio 150 mM.
Ensaio bioquímico para inibidores da atividade da quinase FLT3 i. Enzima - 0 ensaio foi realizado utilizando o produto do domínio citoplasmático FLT3 e purificado a nível interno como a proteína fundida com GST. A proteína FLT3 (1 microM) foi pré-ativada com ATP 800 microM durante 1 hora a 28°C para se obter uma cinética linear. ii. O tampão de quinase FLT3 (KB) - O tampão de quinase foi constituído por HEPES 50 mM pH 7,9 contendo MgCl2 4 mM, DTT 1 mM, Na3V04 10 microM e BSA 0,2 mg/ml. iii. Condições do ensaio - O ensaio da quinase FLT3 foi executado com uma concentração final de enzima pré-ativada de 2 nM, na presença de ATP 254 microM (o ATP residual da etapa de pré-ativação de KIT é insignificante), 33Ρ-γ-ΑΤΡ 8 nM e 55 microM de Substrato BioDB n*24 (Sequência de aminoácidos: GGKKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR- SEQ ID NO: 1). O péptido foi adquirido na American Peptide Company (Sunnyvale, CA).
Ensaio bioquímico para inibidores da atividade da quinase do KIT I. Enzima - 0 ensaio foi realizado utilizando o produto de domínio citoplasmático KIT e purificado a nível interno como a proteína fundida GST. A proteína KIT (4,5 microM) foi pré-ativada com 300 microM de ATP durante 1 hora a 28°C para se obter uma cinética linear. ii. Tampão de quinase KIT (KB) - O tampão de quinase foi composto por 50 mM HEPES pH 7,9 contendo MgCl2 5 mM, MnCl2 1 mM, DTT 10 mM, Na2V04 3 microM e 0,2 mg/ml de BSA. iii. Condições de ensaio - 0 ensaio da quinase do kit foi executado com uma concentração final de enzima pré-ativada de 4 nM, na presença de 4,4 microM de ATP (o ATP residual da etapa de pré-ativação do KIT é insignificante), 3,9 nM de 33Ρ-γ-ΑΤΡ e 2,5 microM de Substrato BioDB n*138 (sequência de aminoácidos: KVVEEINGNNYVYIDPTQLPYDHKWEFPRNR-SEQ ID NO: 2). 0 péptido foi adquirido na American Peptide Company (Sunnyvale, CA).
Testes dos compostos i. Diluição do composto - Para a determinação da ICso, os compostos do teste foram recebidos como uma solução 1 mM em DMSO a 100%, distribuídos em placas de 96 poços: os compostos foram então colocados na primeira coluna duma placa de microtitulação (AI a Gl), 100 microL/poço. Utilizou-se uma estação automatizada para diluições em série (Biomek FX, Beckman) para produzir diluições 1:3 em DMSO a 100%, da linha AI à A10 e para todos os compostos na coluna. Além disso, foram preparadas 4-5 cópias das placas filhas reformatando 5 microL deste primeiro conjunto de placas de diluição de DMSO a 100% em 384 placas de poços profundas: uma destas placas com as diluições em série dos compostos de teste foi descongelada no dia das experiências, reconstituída numa concentração 3X com água e utilizada nos ensaios de determinação da IC50. Numa experiência padrão, a concentração mais elevada (3X) de todos os compostos foi de 30 microM, enquanto a mais baixa foi de 1,5 nM. Cada placa de 384 poços continha pelo menos uma curva do inibidor padrão estaurosporina e poços de referência (atividade enzimática total vs. atividade enzimática) para o Z' e sinal para a avaliação anterior.
Ii. Esquema do ensaio - Foram preparadas placas de 384 poços de fundo em V (placas de teste) com 5 microL da diluição do composto (3X) e, posteriormnete colocadas numa estação robotizada PlateTrak 12 (Perkin Elmer, o robot tinha uma cabeça de pipetagem com 384 pontas para iniciar o ensaio, mais uma cabeça de 96 pontas para distribuir a resina) juntamente com um reservatório para a mistura da Enzima (3X) e um para a mistura de ATP (3X) . No inicio da execução, o robot aspirou 5 ml da mistura de ATP, criou um intervalo de ar dentro das pontas (3 microL) e aspirou 5 microL da mistura enzimática. A seguinte distribuição nas placas, mais os 3 ciclos de mistura, feitos pelo próprio robot, iniciaram a reação da quinase. Neste ponto, as concentrações corretas foram restauradas em todos os reagentes. 0 robot incubou as placas durante 60 minutos à r.t., e depois parou a reação pipetando 60 microL de suspensão de resina dowex para a mistura da reação. A fim de evitar a obstrução da ponta, utilizaram-se pontas de orifício largo para dispensar a suspensão de resina. Foram feitos três ciclos de mistura imediatamente após a adição da resina. Outro ciclo de mistura foi realizado depois de todas as placas terem sido paradas, desta vez utilizando pontas normais: as placas foram então deixadas repousar durante cerca de uma hora para permitir a sedimentação da resina. Neste ponto, foram transferidos 27 microL do sobrenadante para 384-Optiplates (Perkin-Elmer), com 50 microL de Microscint 40 (Perkin-Elmer) ; após 5 min de agitação orbital as placas foram lidas num contador de radioatividade Perkin-Elmer Top Count. iii. Ajuste dos dados - Os dados foram analisados por uma versão internamente personalizada do pacote SW "Assay Explorer" que proporcionou o ajuste sigmoidal das curvas de dez diluições para a determinação da IC50 nas rotinas de confirmação dos ensaios /hits secundários.
Ensaios baseados em células para inibidores da atividade da quinase de FLT3
Ensaio de proliferação celular in vitro para inibidores da atividade da quinase de FLT3
As células MOLM-13 e MV-4-11 da leucemia aguda humana, com uma mutação FLT3-ITD, foram semeadas (5000 células/poço) em placas brancas de 384 poços, em meio completo (RPMI 1640 mais 10% de Soro fetal bovino) e tratadas com compostos dissolvidos em DMSO a 0,1%, 24h após a sementeira. As células foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 e após 72h as placas foram processadas utilizando o ensaio CellTiter-Glo (Promega) , seguindo as instruções do fabricante. O CellTiter-Glo é um método homogéneo baseado na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas. O ATP foi quantificado utilizando um sistema baseado em luciferase e D-luciferina, resultando na geração de luz. 0 sinal luminescente foi proporcional ao número de células presentes na cultura.
Resumidamente, foram adicionados 25 microL/solução de reagente de poço a cada poço e, após 5 minutos de agitação, as microplacas foram lidas pelo luminómetro Envision (PerkinElmer). A atividade inibitória foi avaliada comparando os dados tratados versus os dados de controlo, utilizando o programa Symyx Assay Explorer (Symyx
Technologies Inc.). A IC50 foi calculada utilizando a curva de interpolação sigmoidal. Os compostos de fórmula (I) testados, como descrito acima, possuem uma notável atividade inibidora de FLT3 e KIT, assim como uma boa potência na inibição da proliferação de células MOLM-13 E MV-4-11.
Ver, a título de exemplo, a Tabela I seguinte, descrevendo os dados experimentais de alguns compostos representativos da invenção, a serem testados em ensaios bioquímicos como inibidores da quinase de FLT3 e de KIT (IC50 microM) e a Tabela II, relatando os dados experimentais de alguns compostos representativos da invenção a serem testados em ensaios de proliferação celular como inibidores de MOLM-13 e de MV-4-11 (IC50 microM), em comparação com o composto mais próximo da técnica anterior (composto de referência), descrito no documento W003/028720, Página 77, Tabela XI, entrada 226, composto A02-M2-B05, com a seguinte estrutura:
composto de referência
Em ensaios bioquímicos, os valores de IC50 são tipicamente inferiores a 2 microM no FLT3 e inferiores a 3 microM no KIT.
Em ensaios de proliferação celular, os valores de IC50 são tipicamente inferiores a 3 microM, existindo 26 compostos com valores de IC50 inferiores a 0,1 microM em ambas as linhas celulares.
Tiftela 1
(continuação)
ÍEt^Olst: XI
{contintiãção)
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Um composto de fórmula (I):
    (l) Ar é um grupo selecionado entre
    Ar1 Ar2 em que: Rl é A, NR6R7, 0R8, ou um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterociclilo, NR11R12 ou CORIO; R2, R3, R4 e R5 são, independentemente, hidrogénio, halogénio ou um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo Ci-Ce linear ou ramificado, em que: A é um alquilo C1-C6 linear ou ramificado substituído com um grupo NR11R12; R6 é um hidrogénio ou um alquilo C1-C6 linear ou ramificado opcionalmente substituído com NR11R12 ou um heterociclilo; R7 é um hidrogénio, alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou R6 e R7, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, podem formar um grupo heterocíclico opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterociclilo ou CORIO; R8 é um heterociclilo opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado; RIO é um 0R13; Rll e R12 sao independentemente hidrogénio, ou um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo, opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado ou heterociclilo, ou Rll e R12, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, podem formar um grupo heterocíclico opcionalmente substituído com alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterociclilo ou CORIO; RI 3 é um alquilo C1-C6 linear ou ramificado; X é uma ligação ou um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado, heterocíclico e arilo; Y é uma ligação, oxigénio ou um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado, um alcenilo C2-C6 linear ou ramificado, um alcinilo C2-C6 linear ou ramificado, um heterociclilo e um arilo; Z é uma ligação, oxigénio ou alquilo C1-C6 linear ou ramificado; Ar' é um grupo selecionado entre um arilo e heteroarilo, opcionalmente substituído com halogénio, alquilo C1-C6 linear ou ramificado substituído ou 0R13; em que o termo "heterociclilo" refere-se a um anel carbocíclico saturado de 4 a 6 membros, em que um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos selecionados entre azoto e oxigénio; o termo "arilo" refere-se a um hidrocarboneto mono-carbocíclico, em que os anéis carbocíclicos são "aromáticos" e em que o termo "aromático" se refere a um sistema de ligação π-electrão completamente conjugado; o termo "heteroarilo" refere-se a anéis heterociclicos aromáticos de 6 membros com um heteroátomo de N; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  2. 2. Um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido na reivindicação 1, o qual é selecionado entre o grupo constituído por:
  3. 3. Um processo para a preparação dum composto de fórmula (I), como definido na reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo facto do processo compreender as seguintes etapas:
    F) clivagem do grupo tert-butoxi-carbonilo do composto de fórmula (XI) (XI) Em que Ar, Ar', X, Y e Z são como definidos na reivindicação 1, de modo a obter um composto de fórmula (I), como definido acima; ou, em alternativa L) acilação do composto resultante de fórmula (XVI)
    (XVI) em que Ar', X, Y e Z são como definidos na reivindicação 1, com um composto de fórmula (V),
    (V) em que Ar é como definido na reivindicação 1 e W é um hidroxi, halogénio ou um grupo de saída adequado; de modo a obter um composto de fórmula (I), como definido acima; ou em alternativa M) acilação do composto de fórmula (XVI), como definido acima, com um composto de fórmula (XVII)
    (XVII) em que R2, R3, R4 e R5 são como definidos na reivindicação 1, W é como definido acima e L é um grupo de saída adequado, selecionado entre um grupo constituído por halogéneo, metanossulfoniloxi, trifluorometanossulfoniloxi e p- toluenossulfoniloxi; N) acoplamento do composto resultante de fórmula (XVIII)
    (XVIII) em que Ar', X, Y, Z, R2, R3, R4 e R5 são como definidos na reivindicação 1 e L é como definido acima, com um composto de fórmula (XIX)
    (XIX) Em que R6 e R7 são como definidos na reivindicação 1, de modo a obter um composto de fórmula (I), em que RI é NR6R7, Em que R6, R7, Ar, Ar', X, Y, Z são como definidos na reivindicação 1; separar opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) nos isómeros simples; converter opcionalmente o composto resultante de fórmula (I) num composto diferente de fórmula (I), e/ou num sal farmaceuticamente aceitável.
  4. 4. Um processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto do composto de fórmula (XI), como definido na reivindicação 3, ser preparado de acordo com as seguintes etapas: A) introdução do grupo tert-butoxi-carbonilo no composto de fórmula (II)
    (II) B) clivagem do grupo ftalimido do composto resultante de fórmula (III)
    (III) C) acilação do composto resultante de fórmula (IV)
    (iv) por reação com um composto de fórmula (V)
    (V) em que Ar é como definido na reivindicação 1 e W é um hidroxi, halogénio ou um grupo de saída adequado; D) clivagem seletiva do éter tert-butildimetilsililo do composto resultante de fórmula (VI)
    (VI) em que Ar é como definido acima; E) acoplamento do composto resultante de fórmula (VII)
    (VII) em que Ar é como definido na reivindicação 1, alternativamente com: Ea) um composto de fórmula (VIII)
    (VIII) Em que Ar', Z e Y são como definidos na reivindicação 1 e X é um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo; ou Eb) um composto de fórmula (IX)
    (IX) em que Ar', Z e Y são como definidos na reivindicação 1 e X é um arilo ou em que Ar' é como definido na reivindicação 1 e X, Y e Z são uma ligação; ou Ec) um composto de fórmula (X)
    (X) em que Ar', Z e Y são como definidos na na reivindicação 1, X é um grupo selecionado entre um alquilo Ci-C-6- linear ou ramificado ou um heterociclilo e L é um grupo de saida adequado, selecionado entre o grupo constituído por halogéneo, metanossulfoniloxi, trifluorometanossulfoniloxi e p-toluenossulfoniloxi; de forma a obter um composto de fórmula (XI), como definido na reivindicação 3.
  5. 5. Um processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto do composto de fórmula (XI), como definido na reivindicação 3, ser preparado de acordo com as seguintes etapas: G) clivagem selectiva do éter tert-butildimetilsililo do composto de fórmula (IV), como definido na reivindicação 4; H) acoplamento do composto resultante de fórmula (XII)
    (XII) alternativamente com: Ha) um composto de fórmula (VIII), como definido na reivindicação 4; ou Hb) um composto de fórmula (X) , como definido na reivindicação 4; I) acilação do composto resultante de fórmula (XIII)
    (XIII) em que Ar, Ar', Y e Z são como definidos na reivindicação 1 e X é um grupo selecionado entre um alquilo C1-C6 linear ou ramificado e um heterociclilo, com um composto de fórmula (V) , como definido na reivindicação 4, de modo a obter um composto de fórmula (XI), em que Ar, Ar', Y e Z são como definidos na reivindicação 1 e X é um grupo selecionado entre um alquilo Ci-Cô linear ou ramificado e um heterociclilo.
  6. 6. Um processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto do composto de fórmula (XVI), como definido na reivindicação 3, ser preparado de acordo com as seguintes etapas: J) acoplamento do composto de fórmula (XIV)
    (XIV) alternativamente com: Ja) um composto de fórmula (VIII), como definido na reivindicação 4; ou Jb) um composto de fórmula (IX), como definido na reivindicação 4; ou Jc) um composto de fórmula (X), como definido na reivindicação 4; K) conversão do composto resultante de fórmula (XV)
    (XV) em que Ar', X, Y e Z são como definidos na reivindicação 1; de forma a obter um composto de fórmula (XVI), como definido na reivindicação 3.
  7. 7. Um método in vitro para inibição da atividade da proteina quinase FLT3 ou KIT que compreende o contacto da referida proteina com uma quantidade eficaz dum composto de fórmula (I), como definido na reivindicação 1.
  8. 8. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz dum composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido na reivindicação 1, e pelo menos um excipiente, veiculo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, que compreende ainda um ou mais agentes quimioterápicos.
  10. 10. Um produto que compreende um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tal como definido na reivindicação 1, e um ou mais agentes quimioterápicos, como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial, na terapia anticancerígena.
  11. 11. Um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido na reivindicação 1, para utilização como medicamento.
  12. 12. Um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido na reivindicação 1, para utilização num método de tratamento do cancro.
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