CN112794820B - 吲唑类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及吲唑类衍生物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。本发明提供了式Ⅰ所示的化合物。本发明还提供了所述化合物的制备方法和用途。生物学实验表明，这类化合物对FGFR等激酶的活性具有显著抑制作用，能有效抑制乳腺癌、肺癌、胃癌等多种癌细胞的增殖，具有广谱的抗癌作用。此外，对成纤维细胞和肝星状细胞的增殖也表现出抑制作用，且对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型具有良好的治疗效果，与临床上用于治疗肺纤维化的药物尼达尼布相当。本发明提供的一系列化合物具有较好的抗肿瘤、抗纤维化活性，为抗肿瘤、抗纤维化的药物开发和应用提供了新的选择。

Description

吲唑类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及吲唑类衍生物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。

背景技术

目前治疗肿瘤的传统方法有：手术、放疗、化疗，此类方法治疗效果却不尽如人意，容易出现复发、转移或毒副作用，且对患者生活质量有较大影响。于是，出现了PD1/PD-L1、CAR-T疗法等免疫疗法，小分子靶向药物，单克隆抗体和抗体偶联药物等靶向疗法。其中，小分子靶向治疗是以肿瘤细胞过表达的某些分子为靶点,选择特异性的抑制剂来有效干预这些分子调控的、并与肿瘤发生、发展密切相关的信号传导通路从而抑制肿瘤生长、浸润及转移。正是这种靶向药物具有特异性的优点，使其在癌症治疗中迅速发展。

受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases,RTKs)是一类具有内源性蛋白酪氨酸激酶活性的细胞表面跨膜蛋白受体,通常由一个可以与特定配体相结合的细胞外结构域、一个跨膜区及一个可以选择性地与底物结合并将其磷酸化的细胞内激酶域组成。将配体与RTKs的细胞外结构区域结合,引起其结构改变从而产生酶催化活性。其对肿瘤血管生成、肿瘤细胞存活、增殖、分化、迁移等发挥重要调控作用。现已发现有50多种不同的RTKs家族成员,其中主要包括成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptors,EGFRs)、血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowth factor receptors,PDGFRs)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptors,VEGFRs)和肝细胞生长因子受体(hepatocyte growthfactor receptors,HGFRs)等。

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)，与其受体(fibroblast growth factor receptors，FGFRs)特异性结合后,诱导FGFR自身磷酸化,进而二聚化,使得其结构域从非活性状态转变为活性状态。活化的FGFR又与胞内的激酶互相靠近,相互磷酸化而激活其底物PLCγ和信号衔接蛋白FRS2，其底物再激活下游的MEK/MAPK、PI3K/AKT、PKC、STATS等信号通路。最终刺激细胞的增殖、分化,抑制细胞凋亡。FGFR家族包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4四种受体，其高表达、突变等导致其信号通路异常激活，与多种疾病的发生发展密切相关。与肿瘤相关的疾病有肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、慢性粒细胞白血病、胆管癌、脑胶质母细胞瘤、软骨肉瘤、脂肪瘤病、膀胱癌等，也与非肿瘤疾病相关，如骨骼疾病(颅缝早闭综合征、Kallman综合征、骨质疏松发育不良、软骨发育不良)、性腺发育不全、儿童Blaschko线色素减退斑、关节炎。

近年研究表明FGFR与纤维化也有着密切的关系，例如，研究发现FGF在纤维化的肺组织、血清，肺泡灌注洗液中有高表达并与肺纤维化程度呈正相关。FGF-2来源于肺泡的巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，可以促进胶原的合成及积聚。但在特发性肺纤维化IPF患者中检测到FGF-2水平升高，在上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞/成纤维细胞样细胞中FGFR-1表达增加，在间质细胞中FGFR-2表达增加，并有研究表明，FGF-2在糖尿病引起的肾病中明显过表达，并刺激肾小球系膜细胞增殖；促进肾小管细胞再生导致细胞纤维化。靶向FGFR的抑制剂药物可以抑制FGF/FGFR信号通路的异常激活，具有治疗以上疾病的潜力，FGFR抑制剂药物成为近年来药物研究的热点之一。

发明内容

本发明的目的在于提供吲唑类衍生物及其制备方法和用途。

本发明提供了式Ⅰ所示的化合物：

n为0-3的整数；

R₁选自取代或未取代的5-8元杂芳基、取代或未取代的3-6元杂环烷基；

R₂选自氢、卤素、硝基、氰基、-SO₂R₈、C₁-C₆烷基、卤素取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₃烷氧基、卤素取代的C₁-C₃烷氧基；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分别独立的选自氢、卤素、硝基、氰基、羟基、C₁-C₆烷基、卤素取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₃烷氧基、卤素取代的C₁-C₃烷氧基；

R₈选自C₁-C₃烷基；

环A选自取代或未取代的5-8元芳基。

进一步的，R₁选自取代或未取代的5-8元杂芳基、取代或未取代的3-6元杂环烷基，所述杂芳基和杂环烷基含有1～3个杂原子，所述杂原子为氮、氧或硫。

优选的，R₁选自取代或未取代的5元杂芳基、取代或未取代的6元杂环烷基，所述杂芳基和杂环烷基含有1～2个杂原子，所述杂原子为氮、氧或硫。

进一步优选的，R₁选自取代或未取代的吡唑基、取代或未取代的吗啉基、取代或未取代的哌嗪基。

更优选的，R₁选自未取代的吡唑基、取代的吡唑基、未取代的吗啉基、取代的吗啉基、未取代的哌嗪基或取代的哌嗪基，所述取代的吡唑基、取代的吗啉基和取代的哌嗪基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、-SO₂R₈、-CH₂SO₂R₈、叔丁氧羰基、C₁-C₆烷基、羟基取代的C₁-C₆烷基。

最优选的，R₁选自

进一步的，环A选自取代或未取代的5-6元芳基。

优选的，环A选自取代或未取代的苯基。

更优选的，环A选自未取代的苯基、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、羟基、C₁-C₆烷基、卤素取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₃烷氧基。

最优选的，环A选自未取代的苯基、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、羟基、C₁-C₃烷基、三氟甲基、甲氧基。

进一步的，上述的化合物满足以下至少一项：

n为1或2；

R₂选自氢、卤素、-SO₂R₈、甲基、乙基、丙基；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分别独立的选自氢、卤素、硝基、氰基、羟基、C₁-C₃烷基、氟取代的C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、氟取代的C₁-C₃烷氧基；

优选的，R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分别独立的选自氢、卤素、羟基、甲氧基、甲基、乙基、三氟甲基、三氟甲氧基；

R₈选自甲基。

进一步的，所述化合物选自：

本发明还提供了上述化合物的立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、前药或晶体。本发明还提供了上述化合物、其立体异构体、其同位素体、其药学上可接受的盐、其前药或其晶体的制备方法，包括如下步骤：

S1、将化合物1，化合物2，钯催化剂和碱加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得中间体1；

S2、将中间体1溶于DMF中，加入碱和I₂进行反应，即得中间体2；

S3、将化合物3，化合物4和碱加入溶剂中进行反应，即得中间体3；

S4、将中间体3，化合物5和碱加入溶剂中进行反应，即得中间体4；

S5、将中间体4，化合物6，钯催化剂，碱和配体加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得中间体5；

S6、将中间体2，中间体5，钯催化剂和碱加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得式Ⅰ所示的化合物。

进一步的，上述的制备方法满足以下至少一项：

步骤S1中，所述碱选自DIEA、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种以上；

步骤S1中，钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

步骤S1中，溶剂选自1,4二氧六环、1,4二氧六环与水的混合溶剂、甲苯、DMF、正丁醇、异丙醇或仲丁醇；

优选地，所述混合溶剂中1,4二氧六环与水的体积比为4～8：1；

步骤S1中，所述惰性气氛为N₂；

步骤S1中，反应温度为90～110℃。

步骤S1中，反应时间为10～25h；

步骤S1中，化合物1：化合物2：碱的摩尔比为1：1.1～1.5：1.5～2.0；

步骤S2中，所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种以上；

步骤S2中，中间体1：碱：碘的摩尔比为1：1.5～3.0：1.1～1.8；

步骤S2中，反应温度为55～75℃；

步骤S2中，反应时间为1～6h；

步骤S3中，所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种以上；

步骤S3中，所述溶剂为二氯甲烷；

步骤S3中，化合物3：化合物4：碱的摩尔比为1：1.0～1.5：1.5～2.0；

步骤S3中，反应时间为1～6h；

步骤S4中，所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种以上；

步骤S4中，所述溶剂为DMF；

步骤S4中，中间体3：化合物5：碱的摩尔比为1：1.0～1.5：1.5～2.0；

步骤S4中，反应时间为20～30h；

步骤S5中，所述碱选自DIEA、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种以上；

步骤S5中，钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

步骤S5中，溶剂选自甲苯；

步骤S5中，反应温度为90～100℃；

步骤S5中，反应时间为5～10h；

步骤S5中，所述惰性气氛为N₂；

步骤S5中，中间体4：化合物6：碱的摩尔比为1.0：1.0～1.5：1.5～2.1；

步骤S6中，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种以上；

步骤S6中，钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；

步骤S6中，溶剂选自1,4二氧六环或1,4二氧六环与水的混合溶剂；

优选地，所述混合溶剂中1,4二氧六环与水的体积比为4～8：1；

步骤S6中，反应温度为90～110℃；

步骤S6中，反应时间为5～10h；

步骤S6中，所述惰性气氛为N₂；

步骤S6中，中间体2与中间体5的摩尔比为1.1:1.3～1.5。

本发明还提供了上述化合物、其立体异构体、其同位素体、其药学上可接受的盐、其前药或其晶体制备酪氨酸激酶抑制剂类药物中的用途。

优选的，所述酪氨酸激酶抑制剂为受体酪氨酸激酶抑制剂或非受体酪氨酸激酶抑制剂。

更优选的，所述受体酪氨酸激酶抑制剂为FGFR抑制剂、VEGFR抑制剂、PDGFR抑制剂或Flt抑制剂；所述非受体酪氨酸酶抑制剂为Src抑制剂。

最优选的，所述FGFR抑制剂为FGFR1抑制剂、FGFR2抑制剂、FGFR3抑制剂或FGFR4抑制剂；所述VEGFR抑制剂为Flt1/VEGFR1抑制剂、Flt4/VEGFR3抑制剂或KDR/VEGFR2；所述PDGFR抑制剂为PDGFRα抑制剂或PDGFRβ抑制剂；所述Flt抑制剂为Flt3抑制剂；所述Src抑制剂为Src(1-530)抑制剂。

本发明还提供了上述化合物、其立体异构体、其同位素体、其药学上可接受的盐、其前药或其晶体在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

优选的，所述癌症为乳腺癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、血液癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌或肝癌。

更优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。

本发明还提供了上述化合物、其立体异构体、其同位素体、其药学上可接受的盐、其前药或其晶体在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的用途。

优选地，所述器官纤维化为肺纤维化或肝纤维化。

本发明还提供了一种药物组合物，它是以上述化合物、其立体异构体、其同位素体、其药学上可接受的盐、其前药或其晶体为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

术语定义：

本发明提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。

术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C₁-C₆烷基的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、正丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、正戊基(C₅)、3-戊基(C₅)、戊基(C₅)、新戊基(C₅)、3-甲基-2-丁基(C₅)、叔戊基(C₅)和正己基(C₆)。

术语“芳基”是指在芳族环系中包含或不包含杂原子的4n+2芳族环系的基团，其中，杂原子选自氮、氧和/或硫。

术语“环烷基”是指包含或不包含杂原子的饱和的环状烃基，其可以是单环结构，也可以是两个以上的环，其中，杂原子选自磷、硫、氧和/或氮。

术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明提供了一类结构新颖的吲唑类衍生物。生物学实验表明，这类化合物对FGFR等激酶的活性具有显著抑制作用，能有效抑制乳腺癌、肺癌、胃癌等多种癌细胞的增殖，具有广谱的抗癌作用。此外，对成纤维细胞和肝星状细胞的增殖也表现出抑制作用，且对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型具有良好的治疗效果，与临床上用于治疗肺纤维化的药物尼达尼布相当。本发明提供的一系列化合物具有较好的抗肿瘤、抗纤维化活性，为抗肿瘤、抗纤维化的药物开发和应用提供了新的选择。

附图说明

图1为本发明化合物7-1(YTH-60)逆转TGF-β1刺激A549细胞上皮间质转化蛋白表达；

图2为本发明化合物7-1(YTH-60)抑制TGF-β1刺激3T3细胞纤维化相关蛋白表达；

图3为本发明化合物7-1抑制肺组织中纤维化相关蛋白的表达；

图4为本发明化合物7-1(YTH-60)口服给药的血药浓度-时间曲线；

图5为本发明化合物7-1(YTH-60)静脉给药的血药浓度-时间曲线；

图6为本发明化合物7-1治疗博来霉素诱导的肺纤维化的HE染色图片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

将原料1(2g,10.2mmol)、化合物2(3.1g,11.7mmol)、Pd(dppf)Cl₂(5mmol％)，碳酸钾(2.8g,20.3mmol)，加入1,4-二氧六环与水(4:1)的混合溶剂50mL中，N₂置换后于100℃下反应20h，TLC监测反应。反应完全后将反应液减压浓缩，剩余物用乙酸乙酯溶解，经硅藻土过滤，滤液浓缩后，经柱层析(PE:EA＝2:1)得到中间体1-1(白色固体，47％)。MS m/z(ESI)：254.1[M+H]⁺。

将中间体1(1.2g,4.7mmol)溶于DMF(20mL)中，加入碳酸钾(1.3mg,9.4mmol)、I₂(1.8g,7.1mmol)，65℃反应6h后TLC监测。反应完毕后用保险粉的饱和水溶液淬灭反应，将反应液倒入水中，有浅黄色固体析出，将固体过滤后干燥，得中间体2(浅黄色固体，90％)，MS m/z(ESI)：381.0[M+H]⁺。

将中间体2(1.5g,3.9mmol)溶于DMF(20mL)中，加入NCS(1.3mg,5.9mmol)，90℃反应0.5h后TLC监测。反应完毕后用碳酸氢钠的饱和水溶液淬灭反应，将反应液倒入水中，有深黄色固体析出，将固体过滤后干燥，得中间体2-1(深黄色固体，90％)，MS m/z(ESI)：448.9[M+H]⁺。

将4-溴-N甲基苯胺(1.5g,8.1mmol)溶于二氯甲烷25mL中，加入碳酸钾(2.32g,16.1mmol)，室温下搅拌，再加入氯乙酰氯(0.8ml,9.7mmol)，室温反应6h后TLC监测。反应完毕后将反应液用二氯甲烷稀释，水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，得中间体3-1(白色固体，86％)，MS m/z(ESI)：262.0[M+H]⁺。

将中间体3-2(2.12g,8.1mmol)溶于DMF 25mL中，加入碳酸钾(2.32g,16.1mmol)，甲基哌嗪(967mg,9.7mmol)，室温反应24h后TLC监测。反应完毕后将倒入300ml水中，EA洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，得中间体3-2(黄色油状，90％)，MS m/z(ESI)：326.1[M+H]⁺。

将中间体3-2(2g,6.1mmol)、乙烯基硼酸频哪醇酯(1.2mL,7.4mmol)、DIEA(2.0mL,12.3mmol)加入干燥甲苯(80mL)中，再加入Pd₂(dba)₃(1mmol％)、三叔丁基膦四氟硼酸盐(1mmol％)，氮气保护下升温至95℃反应8h，TLC监测。反应完毕后减压浓缩溶剂，剩余物用乙酸乙酯溶解后经硅藻土过滤，滤液用饱和NaCl溶液洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析(PE:EA＝4:1)得中间体3-3(黄色固体，70％)，MS m/z(ESI)：340.3[M+H]⁺。

将中间体2-1(500mg,1.1mmol)、化合物3-3(577g,1.4mmol)、Pd(dppf)Cl₂(5mmol％)，碳酸钾(310mg,1.8mmol)，加入1,4-二氧六环与水(4:1)的混合溶剂25mL中，N₂置换后于100℃下反应10h，TLC监测反应。反应完全后将反应液减压浓缩，剩余物用乙酸乙酯溶解，经硅藻土过滤，滤液浓缩后，经柱层析(PE:EA＝2:1)得到化合物7-1(黄色固体，47％)。MS m/z(ESI)：616.2[M+Na]⁺。

本发明其他化合物的制备方法与上述化合物7-1的制备方法类似。

表1为本发明化合物的氢谱和质谱数据。

表1

通过以下生物学实验证明本发明的有益效果。

一、实验仪器及材料

主要生物实验仪器和设备如下所述。超净工作台BHC-1000IIA/B3：苏净安泰生物技术公司；灭菌锅MLS-3780：SANYO公司；烘箱：Binder公司；超纯水仪Milli-Q Integral10：Millipore公司；恒温水浴箱PolyScience 9505：PolyScience公司；酶标仪MultiscanMK3、细胞培养箱、低速离心机Sorvall ST1：Thermofisher公司；Centrifuge 5415C超速离心机：德国Eppendorf公司；BCD-215YD型普通冰箱：中国Haier公司；SANYO(-80℃)超低温冰箱：日本三洋电器集团；NUAIRE NU-425-600E生物安全柜：美国Nuaire公司；Rocker 51702摇床：美国Cole Parmer公司；96孔细胞培养板：Costa Corning公司；普通光学显微镜：Olympus公司；移液枪：Thermo公司；PH计：Coring公司；高压灭菌锅：SANYO公司。

实验中采用的细胞系购自美国ATCC公司。培养细胞所用各种必需品购自GibcoBRL公司，包括DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)和胰酶。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。

二、实验方法

1、细胞培养

从液氮中取出冻存保种的肿瘤细胞，迅速置于37℃恒温水浴复温融化，在无菌条件下用培养基洗涤1次。然后用完全培养基接种于培养瓶内，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，第二天置换新鲜细胞培养液。悬浮生长细胞的传代：细胞培养2～3天后，从培养箱中取出培养瓶，收集细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，离心3min，倒去上清液，细胞沉淀用完全培养基重悬并吹打均匀，然后分至3～5瓶培养。一般3～4天传代1次；贴壁生长细胞的传代：细胞贴壁长满至瓶底的80％左右，从培养箱中取出培养瓶，吸去培养基，用0.25％胰酶洗涤1次，然后加入0.25％的胰酶消化液消化，观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集细胞悬液，1500rpm/min，离心3min，倒去上清液，细胞沉淀用完全培养基重悬并吹打均匀，然后分至3～5瓶瓶培养。一般3～4天传代1次。

2、激酶测试

用DMSO将化合物稀释至反应中最终所需最高抑制剂浓度的50倍。将100μL化合物稀释液转移到96孔板中。在同一96孔板的两个空白孔中加入100μL DMSO。该96孔板作为源板。将10μL化合物从源板转移到的96孔板中，作为中间板。向中间板的每个孔中加入90μLl1x激酶缓冲液。在振荡器上将中间板中的化合物混合10分钟。将96孔中间板的每孔取5μL转移至384孔板，设置副孔。在1x激酶碱缓冲液中加入激酶。在1x激酶碱缓冲液中加入FAM标记的肽和ATP。测定板中已含有5μL化合物10％DMSO溶液。向384孔测定板的每个孔中加入10μL l2.5x酶溶液。在室温下孵育10分钟。向384孔测定板的每个孔中加入10μL的2.5x肽溶液。在28℃下孵育特定时间后，加入25μL终止缓冲液以停止反应。在Caliper上收集数据，将数据进一步换算为IC₅₀。

3、MTT法检测部分化合物对细胞增殖的影响

收集对数生长期的三种细胞，以每孔2.5×10³～1×10⁴个的数量接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜24小时，采用DMEM培养基稀释待测药物并加入到96孔板中，每种药物6个梯度，每个梯度含5个复孔。加药组中，按梯度(0μg/m L、0.625、1.25μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)或相应的其他浓度，于37℃、5％CO₂培养箱分别培养24，48，72h后，每孔中加入5mg/mL的MTT储存液20μL放入培养箱培养2-4h，待甲瓒形成后，终止培养，轻轻吸走细胞上清液，每孔加入150μL的DMSO，放置在水平摇床上150r/min摇晃5min，用酶标仪在570nm波长下检测每孔细胞吸光度(OD₅₇₀)，取其平均值记录结果。实验重复三次，整理数据，根据吸光度值得出生长抑制率，计算出IC50。

细胞增殖抑制率＝1-加药组OD₅₇₀/对照组OD₅₇₀×100％。最后，使用GraphpadPrism软件拟合半数抑制浓度。

4、检测化合物7-1对TGF-β₁刺激后胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)的形态变化的影响

取对数生长的A549细胞，消化后收集细胞，弃去上清液，加入新鲜培养基后吹打混匀，测定细胞密度并均匀的接种于6孔板，每孔2m L细胞悬液，密度为接种48h后对照孔能长满为宜。接种24h后，用无血清的培养基饥饿6h，然后用含有5ng/m L的TGF-β₁的完全新鲜培养基刺激，1h后加入5μM的化合物7-1继续培养。24h后，取出6孔板，用倒置显微镜白光观察细胞形态变化。

5、检测化合物7-1对TGF-β₁刺激后胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的EMT转化蛋白和纤维化相关蛋白表达的影响

取对数生长期的细胞，进行细胞传代，传代的细胞密度以对照组48h后长到80％-90％为宜，分为6皿。24h后，用无血清的培养基饥饿6h，加入含有5ng/mL TGF-β₁的完全新鲜

培养基刺激，1h后加入5μM的化合物7-1，然后继续放入培养箱培养。干预24h后，取出培养皿，置于冰上10min，弃去上清液，用预冷的PBS轻轻洗两遍，然后每皿加入1mL PBS，用细胞刮收集皿中的细胞。4℃，3000rpm/min离心3min，沉淀再用预冷的PBS洗涤2次，然后充分将上清液吸干，加入适量的RIPA裂解液，用移液枪吹打混匀，使裂解液与细胞充分接触，裂解细胞，每隔15min涡旋一次，裂解60min。然后超声辅助裂解使得蛋白裂解液澄清透明。然后4℃，13500rpm/min离心15min，取上清液，用Bradford法进行蛋白定量，加入5×SDS上样缓冲液，100℃加热5-10min使蛋白变性，放入-20℃保存。按照目的蛋白的大小，根据SDS-PAGE凝胶试剂盒的步骤，配制相应的凝胶。每孔上样量为50μg，80V，400m A跑上层胶，100V，400mA跑下层胶，当样品跑到下层分离胶底部时可停止电泳。电泳结束后，将与分离胶大小相当的PVDF膜放入甲醇活化45s左右，然后放入转膜缓冲液中，将凝胶和PVDF膜按照(白面)海绵→3张滤纸→PVDF膜→凝胶→3张滤纸→海绵(黑面)的顺序制成转膜“三明治”结构，排除各层之间的气泡，并迅速插入转膜夹中，电压100V进行转膜，转膜时间由目的蛋白分子量大小决定。转膜结束后，将膜放入封闭缓冲液中，室温封闭1h。封闭过后的膜用TBST洗膜液洗3～5min，然后根据抗体说明书用一抗稀释液将一抗稀释至合适的浓度，把膜放入稀释过后的一抗中，4℃孵育过夜。之后将膜取出置于水平摇床上，用TBST洗膜液洗5次，每次10min，用封闭液稀释二抗，37℃孵育膜1h。取出膜，TBST中洗3-4次，每次10min，将PVDF膜浸湿在显影液中数秒，在曝光仪中曝光。

6.化合物7-1要到动力学研究：静脉注射和口服对SD大鼠给药后的药代动力学研究

准确称取适量的供试品，加入终体积5％DMSO、40％PEG400、55％生理盐水，涡旋或超声使充分混匀，分别得到0.4、2mg/mL的澄清给药溶液，用于静脉给药和口服灌胃给药。

种属：SD大鼠，SPF级。来源：动物转移自实验机构动物储备库(999M-017)。上海西普尔-必凯实验动物有限公司。数量：转移，7只。实需，6只。动物挑选：不进行随机分组。

给药方式：给药前称重，根据体重，计算给药量。通过静脉或灌胃口服给药。

采血时间点：IV：给药前，给药后0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h。

PO：给药前，给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h。

样品采集和处置：经颈静脉或其它合适方式采血，每个样品采集约0.20mL，肝素钠抗凝，血液样本采集后放置于冰上，并于2小时内离心分离血浆(离心条件：离心力6800g，6分钟，2-8℃)。采集的血浆样本在分析前存放于-80℃冰箱内，分析后剩余血浆样本继续存放于-80℃冰箱暂存，保存期限为一个月。

生物分析和数据处理：检测化合物7-1血药浓度，进行血浆药物浓度-时间曲线绘制时，BLQ均记为0。进行药代参数计算时，给药前的浓度按照0计算；Cmax之前的BLQ(包括“No peak”)按照0计算；Cmax之后出现的BLQ(包括“No peak”)一律不参与计算。通过不同时间点的血药浓度数据，运用WinNonlin计算药代动力学参数，如AUC(0-t)，T1/2，Cmax，Tmax和MRT等。

7.化合物7-1治疗博来霉素诱导的肺纤维化的动物实验

实验步骤及注意事项：

1、腹腔注射麻醉小鼠成功后，用无菌器械剪开其颈部皮肤，暴露出支气管，注意不能破坏小鼠血管等其他重要组织。

2、找到其支气管后，用注射器注入2mg/kg/3ml博来霉素，注意不要漏出，缓慢注射所有博来霉素后再缓慢拔出针尖，然后双手提起小鼠前肢，上下左右均匀摇晃，使博来霉素均匀分布在其肺部。

3、然后用手术缝合线将剪开的颈部皮肤缝合，并喷以碘伏消毒。

4、造模完成后，将小鼠平放于干净笼具内复苏，注意保暖，观察小鼠心跳、呼吸情况，防止窒息。

5、应用博来霉素模型对抗肺纤维化药物进行评估

1)给药途径：腹腔注射给药，溶剂组为建模后给予同等剂量的溶剂，对照组小鼠以同等体积的生理盐水造模，给予同等剂量的溶剂。

2)给药时间：造模24h后开始腹腔给药，化合物7-1，15mg/kg/天，30mg/kg/天，连续给药14天。

3)评价指标：在给药14天后，观察小鼠状态，称重并处死后，取肺组织浸泡于福尔马林中后将肺组织石蜡包埋并，切片。提取动物肺部组织蛋白以评估药物治疗效果。用HE染色来评价小鼠的组织病理结构；

三、实验结果

1、下表2列举了本发明合成的部分化合物对FGFR1激酶的抑制情况。字母A代表IC50为50nM以下，字母B代表IC50为50nM至100nM，字母C代表IC50为100nM至500nM，字母D代表IC50为500nM以上。

表2本发明部分化合物抑制FGFR1激酶的IC50值

2、表3化合物7-1对各种激酶抑制活性(IC₅₀为nM)

表3化合物7-1对各种激酶抑制活性数据

	FGFR1(h)	FGFR2(h)	FGFR3(h)	FGFR4(h)	Flt1(h)/VEGR1	Flt3(h)
							7-1	2.5	7	9	424	123	297
	Flt4(h)/VEGFR3	KDR(h)/VEGFR2	PDGFRα(h)	PDGFRβ(h)	Src(1-530)(h)
							7-1	64	61	921	>3,000	633

3、表4为部分化合物对不同细胞生长的影响(结果示为IC₅₀值，单位为μM，或10μM下的抑制率)

表4本发明化合物对不同细胞生长的影响数据

化合物	NIH3T3	HPF	A549	LX<sub>2</sub>	4T1
						7-1	1.08	1.52	<10	55.37％	<0.5
尼达尼布	2.87	3.41	<10	40.67％	-
						7-2	3.12	2.58	<10	38.13％	<1
7-3	8.34	7.97	<10	-	<1
						7-6	3.45	8.34	-	-	<0.5
7-9	3.81	6.13	-	-	<1
						7-17	2.34	1.89	<10	46.17％	<0.5

注：4T1是鼠源乳腺癌细胞，A549是人非小细胞肺癌细胞，NIH-3T3为鼠源胚胎成纤维细胞，HPF为人肺成纤维细胞，LX2为人肝星形细胞。

4、从图1可以看出，TGF-β₁刺激A549细胞上皮间质转化相关蛋白表达变化，上调α-SMA、Vimentin的表达，抑制E-cadherin的表达，而化合物7-1(YTH-60)可以改善这种变化。尼达尼布为阳性对照。

5、从图2可以看出，TGF-β₁刺激使得小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)纤维化相关蛋白表达变化，上调α-SMA、Collagen的表达，抑制E-cadherin的表达，而化合物7-1(YTH-60)可以改善这种变化。尼达尼布为阳性对照。

6、如图3所示，蛋白印迹法结果显示，化合物7-1(YTH-60)可以抑制肺组织中纤维化相关蛋白MMP-9、α-SMA和Vimentin的表达。尼达尼布为阳性对照。

7、静脉注射和口服给药后，研究了化合物7-1在大鼠体内的药代动力学和生物利用度。静脉注射后，平均半衰期为4.92小时。平均AUC(0-t)为772.62h*ng/mL。口服给药后，基于AUC(0-t)估算的平均生物利用度为17.86％。平均半衰期为8.03小时。平均AUC(0-t)为1379.73h*ng/mL。图4口服给药后化合物的血药浓度-时间曲线，图5静脉输注后化合物的血药浓度-时间曲线。

8、如图6HE染色结果显示：注射生理盐水的假手术组小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡腔透亮，腔内未见明显渗出，无炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生。对照溶剂组小鼠肺泡结构破坏，肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，肺纤维化形成。图6显示了化合物7-1给药组与溶剂对照组比较情况好转，病变范围明显减少，肺实质结构破坏较少，且优于阳性对照药尼达尼布。

Claims (9)

1.式Ⅰ所示的化合物：

n为1或2；

R₁选自

R₂选自氢、甲基、乙基、丙基；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分别独立的选自氢、卤素、羟基、C₁-C₃烷基、氟取代的C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、氟取代的C₁-C₃烷氧基；

环A选自未取代的苯基、取代的苯基，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：C₁-C₃烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分别独立的选自氢、卤素、羟基、甲氧基、甲基、乙基、三氟甲基、三氟甲氧基。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：

4.权利要求1～3任一项所述化合物的药学上可接受的盐。

5.权利要求1～3任一项所述化合物、其药学上可接受的盐在制备FGFR抑制剂类药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述FGFR抑制剂为FGFR1抑制剂、FGFR2抑制剂、FGFR3抑制剂或FGFR4抑制剂。

7.权利要求1～3任一项所述化合物、其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；所述癌症为乳腺癌、非小细胞肺癌。

8.权利要求1～3任一项所述化合物、其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的用途；所述器官纤维化为肺纤维化或肝纤维化。

9.药物组合物，其特征是：它是以权利要求1～3任一项所述化合物、其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

Images