PT2552474T - Um conjugado de insulina utilizando um fragmento de imunoglobulina - Google Patents

Um conjugado de insulina utilizando um fragmento de imunoglobulina Download PDF

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Jin Park Young
Seong Im Dae
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Description

DESCRIÇÃO
"UM CONJUGADO DE INSULINA UTILIZANDO UM FRAGMENTO DE IMUNOGLOBULINA" [Campo Técnico] A presente revelação refere-se a um conjugado de insulina com duração e estabilidade in vivo melhoradas que é preparado ligando covalentemente insulina com uma região Fc da imunoglobulina através de um polímero não peptidilo, uma formulação de ação prolongada compreendendo o mesmo e um método de preparação do mesmo. A revelação proporciona método para tratar num sujeito com um distúrbio da deficiência da insulina, tal como diabetes. 0 conjugado de insulina da presente revelação mantém atividade in vivo do péptido a um nível relativamente elevado e aumenta notavelmente a meia-vida no soro do mesmo, melhorando, assim, grandemente a conformidade do fármaco no tratamento com insulina.
[Técnica anterior]
Insulina, um péptido segregado pelas células beta pancreáticas, desempenha um papel central no controlo dos níveis de glicose no sangue no corpo. Quando a insulina não é segregada de forma apropriada ou a insulina segregada não funciona no corpo, o nível de glicose no sangue não é regulado e, portanto, ocorre diabetes. Este diabetes é chamado de diabetes de tipo II. 0 diabetes de tipo I é causado quando o pâncreas não produz insulina suficiente para aumentar o nível de glicose no sangue. 0 diabetes de tipo II é tratado normalmente com agentes hipoglicémicos orais quimicamente sintetizados e, nalguns casos, os pacientes são tratados com insulina. Entretanto, o diabetes de tipo I requer tratamento com insulina.
Um método de tratamento com insulina atualmente utilizado é injeção da insulina antes/depois das refeições. Contudo, tal injeção da insulina deveria ser continuamente administrada três vezes por dia, o que causa dor ou desconforto aos pacientes. Tem havido várias tentativas para ultrapassar o problema. Uma delas é um método de entregar um fármaco peptídico através de inalação oral ou nasal melhorando a sua permeabilidade na membrana. Indesejavelmente, o método mostrou muito baixa eficiência de entrega comparado com as formulações injetáveis e, logo, existem ainda muitas dificuldades em manter a atividade in vivo do fármaco peptidico num nivel requerido.
Entretanto, havia um método de retardar a absorção do fármaco após uma injeção subcutânea de uma grande quantidade do fármaco para manter o nivel no sangue através de uma única injeção diária. Alguns dos fármacos desenvolvidos (Lantus, Sanofi-aventis) foram aprovados e são agora utilizados para os pacientes. Além disso, foram conduzidos estudos para prolongar a ação, conduzindo ao desenvolvimento de Levemir (Novo Nordisk) preparado pela modificação da insulina com ácido gordo, no qual a ação retardada ocorre através da auto-associação de moléculas de insulina no local de injeção e através de ligação reversível à albumina no sangue. Contudo, estes métodos geram dores no local de injeção e as injeções diárias também causam desconforto considerável ao paciente.
Foram feitos muitos esforços para melhorar a estabilidade no soro de fármacos peptídicos e manter os fármacos no sangue em níveis elevados durante um período de tempo prolongado, maximizando, assim, a eficácia farmacêutica dos fármacos. Estas formulações de ação prolongada de fármacos peptídicos precisam de aumentar a estabilidade dos fármacos peptídicos e manter os títulos em níveis suficientemente elevados sem causar respostas imunes em pacientes. Para a preparação das formulações de ação prolongada de fármacos peptídicos, foi utilizado convencionalmente um polímero com elevada solubilidade, tal como polietilenoglicol (PEG), para modificar quimicamente a superfície de um fármaco peptídico. PEG liga-se não especificamente a um local ou vários locais específicos de um péptido alvo para originar um efeito de aumentar a massa molecular de um péptido e, logo, inibir a perda pelo rim e prevenir a hidrólise, sem causar quaisquer efeitos secundários. Por exemplo, o documento WO 2006/076471 descreve que um péptido natriurético de tipo B (BNP) que se liga a NPR-A para ativar a produção de cGMP e conduz à redução na pressão arterial sanguínea e, como resultado, é utilizado como um agente terapêutico na insuficiência cardíaca congestiva, é ligado a PEG, sustendo, assim, a sua atividade fisiológica. A Patente U.S. N.° 6 924 264 descreve que PEG se liga ao resíduo da lisina de uma exendina-4 para aumentar o seu tempo de residência in vivo. Este método aumenta a massa molecular de PEG e, portanto, aumenta o tempo de residência in vivo do fármaco peptídico . Contudo, como a massa molecular é aumentada, o título do fármaco peptídico é notavelmente reduzido e a reatividade com o péptido também é reduzida. Em conformidade, o rendimento diminui de forma indesejável. O documento WO 02/46227 descreve uma proteína de fusão preparada acoplando GLP-1, uma exendina-4, ou um análogo da mesma, com albumina do soro humana ou um fragmento de imunoglobulina (Fc) utilizando uma tecnologia de recombinação genética. A Patente U.S. N.° 6 756 480 descreve uma proteína de fusão Fc preparada acoplando uma hormona paratiroide (PTH) e um análogo da mesma com a região Fc. Estes métodos podem resolver os problemas, tais como baixo rendimento de peguilação e não especificidade, mas ainda têm um problema, uma vez que o efeito de aumentar a meia-vida no sangue não é tão evidente quanto esperado e, nalguns casos, os títulos também são baixos. Para maximizar o efeito de aumentar a meia-vida no sangue, têm sido utilizados vários tipos de ligantes peptídicos, mas existe uma possibilidade de causar uma resposta imune. Além disso, se for utilizado um péptido com ligações dissulfito, tal como BNP, existe uma elevada probabilidade de desenovelamento e se for utilizado um péptido com resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, pode ser produzido por recombinação genética apenas com grande dificuldade.
O documento WO 2005/047334 revela um fragmento Fc da IgG útil como um veiculo do fármaco, juntamente com um vetor recombinante que expressa o fragmento Fc da IgG, um transformante transformado com o vetor recombinante e um método de preparar um fragmento Fc da IgG que compreende cultivar o transformante. Quando conjugado com um determinado fármaco, o fragmento Fc da IgG melhora a duração in vivo da ação do fármaco e reduz a redução da atividade in vivo do fármaco. 0 documento WO 2006/107124 revela um fragmento Fc modificado por um polímero não peptídico, uma composição farmacêutica que compreende um fragmento Fc modificado pelo polímero não peptídico como um veículo, um complexo do fragmento Fc e um fármaco através de um ligante e uma composição farmacêutica que compreende tal complexo. 0 fragmento Fc modificado por um polímero não peptídico carece das funções de imunogenicidade e atividade efetora e mantém a atividade in vivo de um a fármaco conjugado ao mesmo. 0 documento WO 2008/082274 revela um conjugado peptídico insulinotrópico com duração in vivo melhorada de eficácia e estabilidade, compreendendo um péptido insulinotrópico, um polímero não peptídico e uma região Fc da imunoglobulina, que são ligados covalentemente uns aos outros e uma utilização dos mesmos. Um conjugado peptídico insulinotrópico da presente invenção tem uma meia-vida no sangue aumentada.
[Revelação] [Problema Técnico] A este respeito, conduzindo à presente revelação, tem sido realizada pesquisa intensiva e exaustiva sobre o desenvolvimento de um método capaz de maximizar simultaneamente a meia-vida no soro e a atividade in vivo da insulina, o que resultou na observação de que uma região Fc da imunoglobulina, um polímero não peptidilo e insulina estão ligados uns aos outros de forma seletiva pelo local por uma ligação covalente, aumentando, assim, notavelmente a meia-vida no soro, comparado com o conhecido método de fusão na mesma fase de leitura.
[Solução Técnica] É um objeto da presente revelação proporcionar um conjugado de insulina excelente que mantém atividade in vivo da insulina e prolonga, de forma notável, a meia-vida no soro do mesmo, uma formulação de ação prolongada que compreende do mesmo e um método de preparação do mesmo.
[Efeitos Vantajosos] 0 conjugado de insulina da presente revelação mantém atividade in vivo de péptido a um nivel relativamente elevado e aumenta, de forma notável, a meia-vida no soro do mesmo, melhorando, assim, substancialmente a conformidade em relação ao fármaco dos pacientes em necessidade de tratamento com insulina.
[Descrição dos Desenhos] A Figura 1 é o resultado da análise farmacocinética do conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina; A Figura 2 é o resultado de comprara as eficácias in vivo entre conjugados derivado de insulina-PEG-Fc da imunoglobulina; e A Figura 3 é o resultado de analisar 90% ou mais de peguilação na fenilalanina (BlF) da cadeia beta do conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina utilizando uma coluna de exclusão por tamanho.
As Figuras 4a a 4c são o resultado de analisar a ligação especifica à cadeia beta do conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina.
[Melhor Modo]
Num aspeto para conseguir os objetos anteriores, a presente revelação proporciona um conjugado de insulina que é preparado ligando a insulina com uma região Fc da imunoglobulina através de um polímero não peptidilo, na qual o polímero não peptidilo está ligado ao terminal amino da cadeia beta da insulina.
Na presente revelação, a insulina é um péptido que é segregado pelo pâncreas em resposta a níveis elevados de glicose no sangue para captar glicose no fígado, músculo ou tecido adiposo e convertê-la em glicogénio e para parar a utilização de gordura como uma fonte de energia e funciona, assim, para controlar o nível de glicose no sangue. Este péptido inclui agonistas, precursores, derivados, fragmentos e variantes do mesmo e, preferencialmente, insulina nativa, de efeito curto ou de ação prolongada.
Insulina nativa é uma hormona que é segregada pelo pâncreas para promover a absorção de glicose e inibir a decomposição de gorduras e funciona, assim, para controlar o nível de glicose no sangue. A insulina é formada a partir de um precursor sem função de regulação do nível de glicose no sangue, conhecido como proinsulina, através de processamento. As sequências de aminoácido da insulina são como se segue: Cadeia alfa: SEQ. ID N.°
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln -Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO. 1)
Cadeia beta: SEQ. ID N.°
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu -Tyr-Leu-Val-Cys-Gly- Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO. 2)
Um agonista de insulina significa um composto que se liga a um recetor de insulina para mostrar a atividade biológica igual à da insulina, o que é irrelevante para a estrutura da insulina.
Um derivado de insulina significa um péptido com pelo menos 80% de homologia de sequência de aminoácidos com a insulina nativa, que pode ter alguns grupos no resíduo aminoácido quimicamente substituídos (por exemplo, alfa-metilação, alfa-hidroxilação), apagados (por exemplo, deaminação) ou modificados (por exemplo, N-metilação) e tem uma função de regular o nível de glicose no sangue no corpo.
Um fragmento de insulina significa um fragmento com um ou mais aminoácidos adicionados ou apagados no N-terminal ou no C-terminal da insulina nativa, no gual podem ser adicionados aminoácidos gue não ocorrem naturalmente (por exemplo, aminoácidos de tipo D) e tem uma função de regular o nível de glicose no sangue no corpo.
Uma variante de insulina significa um péptido com uma ou mais seguências de aminoácidos diferentes da insulina nativa e com uma função de regular o nível de glicose no sangue no corpo.
Cada um dos métodos de preparação para os agonistas, derivados, fragmentos e variantes da insulina podem ser utilizados individualmente ou em combinação. Por exemplo, a presente revelação inclui um péptido gue tem um ou mais aminoácidos diferentes dos do péptido nativo e deaminação do resíduo aminoácido do N-terminal e tem uma função de regular o nível de glicose no sangue no corpo.
Numa modalidade específica, a insulina utilizada pode ser produzida por uma tecnologia de recombinação e também pode ser sintetizada utilizando um método de síntese de fase sólida.
Além disso, a insulina utilizada é caracterizada por um polímero não peptidilo estar ligado ao terminal amino da cadeia beta da insulina. Este polímero não peptidilo é utilizado como um ligante. A modificação na cadeia alfa da insulina conduz a uma redução na atividade e segurança. Logo, o polímero não peptidilo como um ligante está ligado ao terminal amino da cadeia beta da insulina, para manter a atividade da insulina e melhorar a segurança. 0 termo "atividade", conforme utilizado aqui, significa a capacidade da insulina de se ligar a um recetor de insulina e significa gue a insulina exibe a sua ação através da ligação ao recetor de insulina.
Tal ligação do polímero não peptidilo ao terminal amino da cadeia beta da insulina pode ser conseguida por controlo do pH e, preferencialmente, no intervalo de 4,5 a 7,5. O termo "N-terminal", conforme utilizado aqui, pode ser utilizado alternadamente com "região N-terminal".
Num Exemplo especifico, é preparado um conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina ligando PEG ao N- terminal de uma região Fc da imunoglobulina e acoplando seletivamente 0 N-terminal da cadeia beta da insulina ao mesmo. A meia-vida no soro de um conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina preparado foi aumentada de forma notável até aproximadamente 18 horas e mostrou um efeito hipoglicémico em modelos animais da doença. Logo, pode ser preparada uma nova formulação de insulina de ação prolongada que mantém atividade in vivo da insulina. A região Fc da imunoglobulina é segura para utilização como um veiculo do fármaco, porque é um polipeptídeo biodegradável que é metabolizado in vivo. Além disso, a região Fc da imunoglobulina tem uma massa molecular relativamente baixa quando comparado com as moléculas de imunoglobulina inteiras e, portanto, é vantajosa na preparação, purificação e produção do conjugado. A região Fc da imunoglobulina não contém um fragmento Fab que é altamente não homogéneo devido às diferentes sequências de aminoácidos de acordo com as subclasses de anticorpo e, portanto, pode-se esperar que a região Fc da imunoglobulina pode aumentar grandemente a homogeneidade de substâncias e ser menos antigénico. 0 termo "região Fc da imunoglobulina", conforme utilizado aqui, refere-se a uma proteína que contém a região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e a região constante da cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, a região constante da cadeia pesada 1 (CHI) e a região constante da cadeia leve 1 (CLl) da imunoglobulina. Pode ainda incluir uma região dobradiça na região constante da cadeia pesada. Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode conter uma parte ou toda a região Fc incluindo a região constante da cadeia pesada 1 (CHI) e/ou a região constante da cadeia leve 1 (CLl), exceto para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, desde que tenha uma função fisiológica substancialmente similar a, ou melhor do que, a proteína nativa. Além disso, pode ser um fragmento com uma deleção numa porção relativamente longa da sequência de aminoácidos de CH2 e/ou CH3. Ou seja, a região Fc da imunoglobulina pode compreender 1) um domínio CHI, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, 2) um domínio CHI e um domínio CH2, 3) um domínio CHI e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região dobradiça da imunoglobulina (ou uma porção da região dobradiça) e 6) um dímero de cada domínio das regiões constantes da cadeia pesada e da região constante da cadeia leve.
Além disso, a região Fc da imunoglobulina inclui um derivado de sequência (mutante) da mesma, bem como uma sequência de aminoácidos nativa. Um derivado da sequência de aminoácidos tem uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativa devido a uma deleção, uma inserção, uma substituição conservadora ou não conservadora ou combinações das mesmas de um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, numa Fc de IgG, podem ser utilizados resíduos de aminoácidos conhecidos como sendo importantes na ligação, nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, como um alvo adequado para modificação. Além disso, são possíveis outros vários derivados incluindo derivados com uma deleção de uma região capaz de formar uma ligação dissulfito, uma deleção de vários resíduos de aminoácidos no N-terminal de uma forma de Fc nativa ou uma adição de resíduo de metionina ao N-terminal de uma forma de Fc nativa. Além disso, para remover as funções efetoras, pode ocorrer uma deleção num local de ligação ao complemento, tal como um local de ligação Clq e um local ADCC. Técnicas de preparar tais derivados de sequência da região Fc da imunoglobulina são reveladas nos documentos WO 97/34631 e WO 96/32478.
Trocas de aminoácidos em proteínas e péptidos que não alteram em geral a atividade das moléculas são conhecidas na técnica (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 1979) . As trocas que ocorrem mais vulgarmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas direções. A região Fc, se desejado, pode ser modificada por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e afins.
Os derivados de Fc mencionados anteriormente são derivados que têm uma atividade biológica idêntica à da região Fc da presente revelação ou estabilidade estrutura melhorada, por exemplo, contra calor, pH ou afins.
Além disso, estas regiões Fc podem ser obtidas a partir de formas nativas isoladas de humanos e outros animais incluindo vacas, cabras, porcos, ratinhos, coelhos, hamsters, ratazanas e cobaias ou podem ser recombinantes ou derivadas das mesmas, obtidas de células ou microrganismos animais transformados. Aqui, podem ser obtidas a partir de uma imunoglobulina nativa isolando imunoglobulinas inteiras de organismos humanos ou animais e tratando-os com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa em regiões Fab e Fc e o tratamento com pepsina resulta na produção de fragmentos pF'c e F(ab)2. Estes fragmentos podem ser sujeitos, por exemplo, a cromatografia por exclusão de tamanho para isolar Fc ou pF'c.
Preferencialmente, uma região Fc derivada de humano é ma região Fc da imunoglobulina recombinante que é obtida a partir de um microrganismo.
Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode estar na forma de ter cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas comparado com a forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas comparado com a forma nativa ou podem estar numa forma desglicosilada. 0 aumento, diminuição ou remoção das cadeias de açúcar da Fc da imunoglobulina pode ser conseguido por métodos comuns na técnica, tal como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética que utiliza um microrganismo. A remoção de cadeias de açúcar de uma região Fc resulta numa diminuição acentuada na afinidade de ligação ao complemento (clq) e uma diminuição ou perda na citotoxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo ou citotoxicidade dependente do complemento, não induzindo, assim, respostas imunes in vivo desnecessárias. A este respeito, uma região Fc da imunoglobulina numa forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada como um veículo de fármaco. 0 termo "desglicosilação", conforme utilizado aqui, significa remover enzimaticamente frações de açúcar de uma região Fc e o termo "aglicosilação" significa que uma região Fc é produzida numa forma não glicosilada por um procarionte, preferencialmente E. coli.
Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode ser uma região Fc que é derivada de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM ou que é feita por combinações das mesmas ou híbridos das mesmas. Preferencialmente, é derivada de IgG ou IgM, que estão entre as proteínas mais abundantes no sangue humano e mais preferencialmente de IgG, que é conhecida por potenciar a meia-vida das proteínas de ligação ao ligando. 0 termo "combinação", conforme utilizado aqui, significa que polipeptídeos que codificam regiões Fc da imunoglobulina de cadeia simples da mesma origem estão ligadas a um polipeptídeo de cadeia simples de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Isto é, um dímero ou multímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados do grupo que consiste em fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD e Fc de IgE. 0 termo "híbrido", conforme utilizado aqui, significa que as sequências que codificam duas ou mais regiões Fc da imunoglobulina de origem diferente estão presentes numa região
Fc da imunoglobulina de cadeia simples. Vários tipos de híbridos são possíveis. Isto é, híbridos de domínio podem ser compostos por um a quatro domínios selecionados do grupo que consiste em CHI, CH2, CH3 e CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE e Fc de IgD e podem incluir a região dobradiça.
Por outro lado, IgG está dividida nas subclasses IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4 e a presente revelação inclui combinações de híbridos das mesmas. São preferidas as subclasses IgG2 e IgG4 e mais preferida é a região Fc de IgG4 raramente com funções efetoras, tais como CDC (citotoxicidade dependente de complemento).
Como o veículo do fármaco da presente revelação, a região Fc da imunoglobulina mais preferida é uma região Fc não glicosilada derivada da IgG4 humana. A região Fc derivada humana é mais preferível do que uma região Fc derivada não humana que pode atuar como um antígeno no corpo humano e causar respostas imunes indesejáveis, tais como a produção de um novo anticorpo contra o antígeno. 0 termo "polímero não peptidilo", conforme utilizado aqui, refere-se a um polímero biocompatível incluindo duas ou mais unidades de repetição ligadas uma à outra por qualquer ligação covalente excluindo uma ligação peptídica. 0 polímero não peptidilo é polietilenoglicol. 0 ligante peptídico que é utilizado na proteína de fusão obtido por um método de fusão na mesma fase de leitura convencional tem desvantagens, uma vez que é facilmente clivado in vivo por uma enzima proteolítica e, assim, não pode ser obtido conforme esperado efeito suficiente de aumentar a meia-vida no soro do fármaco ativo por um veículo. Contudo, na presente revelação, o polímero com resistência à enzima proteolítica pode ser utilizado para manter a meia-vida no soro do péptido sendo similar à do veículo. Assim, qualquer polímero não peptidilo pode ser utilizado sem qualquer limitação, desde que seja um polímero com a função mencionada anteriormente, isto é, um polímero com resistência à enzima proteolítica in vivo. 0 polímero não peptidilo tem uma massa molecular 11 no intervalo de 1 a 100 kDa e preferencialmente de 1 a 20 kDa. O polímero não peptidilo, ligado à região Fc da imunoglobulina, pode ser um polímero ou uma combinação de diferentes tipos de polímeros. O polímero não peptidilo utilizado tem um grupo reativo capaz de ligar à região Fc da imunoglobulina e fármaco proteico. O polímero não peptidilo tem um grupo reativo em ambas extremidades, que é preferencialmente selecionado do grupo que consiste num grupo aldeído reativo, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado da succinimida. O derivado da succinimida pode ser propionato de succinimidilo, hidroxisuccinimidilo, carboximetilo de succinimidilo ou carbonato de succinimidilo. Em particular, quando o polímero não peptidilo tem um grupo aldeído reativo em ambas extremidades do mesmo, é eficaz em ligar em ambas extremidades com um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina com reações não específicas mínimas. Um produto final gerado por alquilação redutora por uma ligação aldeído é muito mais estável do que ligado por uma ligação amida. O grupo reativo aldeído liga seletivamente a um N-terminal com um pH baixo e liga-se a um resíduo de lisina para formar uma ligação covalente a pH elevado, tal como pH 9,0.
Os grupos reativos em ambas extremidades do polímero não peptidilo podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptídico pode possuir um grupo maleimida numa extremidade e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Quando um polietilenoglicol tem um grupo hidroxi reativo em ambas extremidades do mesmo é utilizado como o polímero não peptidilo, podendo o grupo hidroxi ser ativado para vários grupos reativos por reações químicas conhecidas ou pode ser utilizado um polietilenoglicol com um grupo reativo modificado comercialmente disponível para preparar o conjugado proteico.
Noutro aspeto, a presente revelação proporciona uma formulação de insulina de ação prolongada que compreende o conjugado de insulina da presente revelação. 0 termo "administração", conforme utilizado aqui, significa introdução de uma quantidade pré-determinada de uma substância num paciente por um determinado método adequado. 0 conjugado pode ser administrado através de quaisquer das vias comuns, desde que seja capaz de atingir um tecido desejado. É contemplada uma variedade de modos de administração, incluindo por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmicas, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intra-retal, mas a presente revelação não está limitada a estes modos de administração exemplificados. Contudo, uma vez que os péptidos são digeridos no momento da administração oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração oral deveriam ser revestidos ou formulados para proteção contra degradação no estômago. Preferencialmente, o conjugado pode ser administrado numa forma injetável. Além disso, a formulação de ação prolongada pode ser administrada utilizando um determinado aparelho capaz de transportar os ingredientes ativos para uma célula alvo. A formulação de ação prolongada que compreende um conjugado da presente revelação pode incluir veículos farmaceuticamente aceitáveis. Para administração oral, o veiculo farmaceuticamente aceitável pode incluir um ligante, um lubrificante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizante, um agente dispersante, um estabilizador, um agente de suspensão, um agente de coloração e um perfume. Para preparações injetáveis, o veiculo farmaceuticamente aceitável pode incluir um agente tamponante, um agente conservante, um analgésico, um solubilizador, um agente isotónico e um estabilizador. Para preparações para administração tópica, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir uma base, um excipiente, um lubrificante e um agente conservante. A formulação de ação prolongada da presente revelação pode ser formulada numa variedade de formas de dosagem em combinação com os veículos farmaceuticamente aceitáveis anteriormente mencionados. Por exemplo, para administração oral, a formulação de ação prolongada pode ser formulada em comprimidos, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou wafers. Para preparações injetáveis, a formulação de ação prolongada pode ser formulada em ampolas de dose única ou recipientes multidose. A formulação de ação prolongada também pode ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, pastilhas, cápsulas e preparações de libertação prolongada.
Exemplos do veículo, do excipiente e do diluente adequados para as formulações incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, esterato de magnésio e óleos minerais. Além disso, as formulações podem ainda incluir preenchedores, agentes anti-coagulantes, lubrificantes, humidificantes, perfumes e antisséticos. A formulação de ação prolongada da presente revelação pode ser determinada por vários fatores relacionados incluindo os tipos de doenças a serem tratadas, vias de administração, a idade, sexo, peso do paciente, e severidade da doença, bem como pelos tipos do fármaco como um componente ativo. Uma vez que a composição farmacêutica tem duração e título in vivo excelentes, pode reduzir de forma notável a frequência de administração e dose dos fármacos farmacêuticos. A formulação de ação prolongada mantém a duração e estabilidade in vivo da insulina num nível muito elevado e, logo, é utilizada eficazmente para o tratamento do diabetes dependente da insulina.
Ainda noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método de preparar um conjugado de insulina, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptidilo com um grupo reativo de aldeído, maleimida ou derivados da succinimida em cada extremidade do mesmo, com um grupo amina ou grupo tiol da região Fc da imunoglobulina; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), na gual o conjugado compreende a região Fc da imunoglobulina ligada covalentemente com o polímero não peptidilo; e (3) ligar covalentemente insulina à outra extremidade do polímero não peptidilo do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina, que estão ligadas a cada extremidade do polímero não peptidilo.
Preferencialmente, o polímero não peptidilo da etapa (1) tem um derivado aldeído reativo na extremidade do mesmo e, mais preferencialmente, três grupos aldeído reativos.
Ainda noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método de preparar um conjugado de insulina, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptidilo com um grupo reativo aldeído em cada extremidade do mesmo ao N-terminal da Fc da imunoglobulina a pH 6,0; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), no qual o conjugado compreende a região Fc da imunoglobulina ligada covalentemente com o polímero não peptidilo no seu N-terminal; e (3) ligar covalentemente insulina à outra extremidade do polímero não peptidilo do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina, que estão ligadas a cada extremidade do polímero não peptidilo.
Ainda noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método de preparar um conjugado de insulina, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptidilo com um grupo reativo de aldeído, maleimida ou derivados da succinimida em cada extremidade do mesmo, com um grupo amina ou grupo tiol da insulina; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), no qual o conjugado compreende insulina ligada covalentemente com o polímero não peptidilo; e (3) ligar covalentemente uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptidilo do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina, que estão ligadas a cada extremidade do polímero não peptidilo.
Ainda noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método de preparar um conjugado de insulina, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptidilo com um grupo reativo aldeído em cada extremidade do mesmo com um grupo amina da insulina; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), no qual o conjugado compreende insulina ligada covalentemente com o polímero não peptidilo; e (3) ligar covalentemente uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptidilo do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina, que estão ligadas a cada extremidade do polímero não peptidilo.
Ainda noutro aspeto, a presente revelação proporciona um método para tratar um sujeito com um distúrbio da deficiência da insulina, compreendendo o método administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da formulação de ação prolongada. Preferencialmente, um distúrbio da deficiência da insulina é diabetes.
Conforme utilizado aqui, um sujeito pode ser um mamífero, por exemplo, humano, um primata não humano, um cavalo, uma ovelha, um gato, um cão, uma vaca ou um porco.
[Modo]
Doravante, um melhor entendimento da presente revelação pode ser obtido através dos Exemplos seguintes que são apresentados para ilustrar, mas não devem ser interpretados como o limite da presente invenção.
Exemplo 1. Purificação da região Fc da imunoglobulina peguilada
Para peguilação da Fc da imunoglobulina no seu_N-terminal, foi utilizado 5K PropionALD (3) PEG (PEG com três grupos propilaldeidos, NOF, Japão) para realizar peguilação reagindo a Fc da imunoglobulina e PEG a 4°C durante 4,5 horas e a uma razão molar de 1:2, com uma contração da Fc da imunoglobulina de 10 mg/ml. Neste momento, a reação foi realizada numa solução tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6,0 e 20 mM SCB (NaCNBH3) como um agente redutor foi adicionado à mesma. Uma Fc da imunoglobulina mono-PEGuilada foi purificada a partir da solução da reação utilizando uma coluna Source 15Q (GE Healthcare).
Exemplo 2. Preparação do conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina
Para preparar um conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina com 90% ou mais de peguilação na fenilalanina (BlF) da cadeia beta da insulina, a Fc da imunoglobulina mono-PEGuilada obtida no Exemplo 1 e insulina foram reagidas a uma razão molar de 4:1 e a 4°C durante 20 horas, com uma concentração de proteína total de 20 mg/ml. Neste momento, a reação foi realizada numa solução tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6, 0 e 20 mM SCB como um agente redutor foi adicionado à mesma. Depois da reação ter terminado, a solução da reação foi sujeita a purificação primária utilizando uma coluna Source 15Q. Depois disso, foi realizada purificação secundária utilizando uma coluna Source 15ISO para obter um conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina. Uma coluna de exclusão por tamanho foi utilizada para analisar 90% ou mais da peguilação de BlF do conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina obtido e os resultados são mostrados na Figura 3.
Exemplo 3. Preparação do conjugado insulina lispro (Humalog)-PEG-Fc da imunoglobulina A Fc da imunoglobulina mono-PEGuilada obtida no Exemplo 1 e insulina lispro foram reagidos a uma razão molar de 4:1 e a 4°C durante 20 horas, com uma concentração de proteína total de 20 mg/ml. Neste momento, a reação foi realizada numa solução tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6, 0 e 20 mM SCB como um agente redutor foi adicionado à mesma. Depois da reação ter terminado, foi realizada purificação da mesma forma gue no Exemplo 2.
Exemplo 4. Preparação do conjugado insulina glargina (Lantus)-PEG-Fc da imunoglobulina A Fc da imunoglobulina mono-PEGuilada obtida no Exemplo 1 e insulina glargina foram reagidos a uma razão molar de 4:1 e a 4°C durante 20 horas, com uma concentração de proteína total de 20 mg/ml. Neste momento, a reação foi realizada numa solução tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6, 0 e 20 mM SCB como um agente redutor foi adicionado à mesma. Depois da reação ter terminado, foi realizada purificação da mesma forma que no Exemplo 2.
Exemplo 5. Preparação do conjugado insulina detemir (Levemir)-PEG-Fc da imunoglobulina A Fc da imunoglobulina mono-PEGuilada obtida no Exemplo 1 e insulina detemir foram reagidos a uma razão molar de 4:1 e a 4°C durante 20 horas, com uma concentração de proteína total de 20 mg/ml. Neste momento, a reação foi realizada numa solução tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 6, 0 e 20 mM SCB como um agente redutor foi adicionado à mesma. Depois da reação ter terminado, foi realizada purificação da mesma forma que no Exemplo 2.
Exemplo 6. Medição da meia-vida de eliminação in vivo de conjugado de insulina de ação prolongada
Para analisar a duração in vivo do conjugado de insulina de ação prolongada, foram utilizadas ratazanas SD macho normais para realizar análise farmacocinética. As ratazanas SD macho normais foram injetadas por via subcutânea com insulina nativa e o conjugado de insulina de ação prolongada a uma dose de 100 yg/kg (baseado na insulina) uma vez e depois as alterações dependentes do tempo time no nivel do soro foram medidas utilizando um kit ELISA e foram calculados parâmetros farmacocinéticos a partir dos valores medidos utilizando o programa Winnolin 5.2. A meia-vida de eliminação in vivo do conjugado de insulina de ação prolongada foi 17,67 horas, gue é cerca de 30 vezes mais longa do que a insulina nativa de 0,58 horas (Figura 1).
Exemplo 7. Teste de eficácia in vivo no Conjugado da insulina derivada
Para comparar a eficácia in vivo entre os conjugados de derivados da insulina, foram utilizadas ratazanas com diabetes induzidos por estreptozotocina para analisar os seus efeitos hipoglicémicos. Ratazanas normais foram mantidas em jejum durante 16 horas e injetadas por via intraperitoneal com estreptozotocina em solução tampão de ácido cítrico 10 mM (pH 4,5) a uma dose de 60 mg/kg para induzir diabetes. Quando o nível de glicose no sangue das ratazanas atingiu 500 mg/dL ou superior, as ratazanas foram injetadas por via subcutânea com o conjugado de insulina, um conjugado de insulina detemir ou um conjugado de insulina lispro a uma dose de 0,5 mg/kg uma vez e depois os seus efeitos hipoglicémicos foram comparados. Os efeitos hipoglicémicos do conjugado de insulina e um conjugado de insulina lispro mantidos durante cerca de 4 dias após a injeção e 5 dias após a injeção, o nível de glicose no sangue aumentou. Um conjugado de insulina detemir também mostrou os efeitos hipoglicémicos, mas os efeitos foram inferiores aos do conjugado de insulina ou conjugado de insulina lispro a uma dose igual (Figura 2).
Exemplo 8. Identificação do local de ligação do conjugado insulina-5 K PEG-Fc da imunoglobulina
Para identificar o local de ligação da insulina a 5 K PEG-Fc da imunoglobulina, foi realizado mapeamento de Glu-C. 20 yg de endoproteinase Glu-C (1 mg/ml) foi adicionado a 100 mg da insulina-5 K PEG-Fc da Imunoglobulina (1 mg/ml) . A solução da reação foi 50 mM HEPES a pH 7,5 e a mistura foi reagida a 25°C durante 8 horas. Subsequentemente, 10 μΐ de 1 N HCL foi adicionado para terminar a reação. O mapeamento foi realizado por cromatografia HPLC reversa. Os resultados mostraram a alteração do pico no N-terminal da cadeia beta da insulina, indicando que o 5 K PEG-Fc da imunoglobulina se liga ao N-terminal da cadeia beta da insulina (Figuras 4a-c). Coluna: Jupiter C18 4,6x250mm, 5 ym (Phenomenex)
Fase móvel A: 20% 0,1 M NaS04 (pH 2,0), 10% CAN Fase móvel B: 20% 0,1 M NaS04 (pH 2,0), 40% CAN Gradiente 0%B em 10 min > 0-10%B em 5 min > 10-70%B em 60 min <110> HANMI HOLDINGS CO., LTD. <120> Um conjugado de insulina utilizando um fragmento de imunoglobulina
<130> PA110256/KR <150> KR10-2010-0030575 <151> 2010-04-02 <160> 2 <170> Kopatentln 1.71
<210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20
<210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 2006076471 A [0007] • US 6924264 B [0007] • WO 0246227 A [0008] • US 6756480 B [0008] • WO 2005047334 A [0009] • WO 2006107124 A [0010] • WO 2008082274 A [0011] • WO 9734631 A [0032] • WO 9632478 A [0032] • KR 1020100030575 [0072]
Documentos de não patente citados na descrição • H.NEURATH ; R.L.HILL. The Proteins. Academic Press, vol. 197, 9 [0033]

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES
1. Um conjugado de insulina preparado ligando a insulina com uma região Fc da imunoglobulina através de um polietilenoglicol no qual o polietilenoglicol é ligado ao terminal amino da cadeia beta da insulina.
2. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que a insulina é insulina nativa, insulina lispro, insulina detemir ou insulina glargina.
3. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que uma extremidade do polietilenoglicol é ligada ao grupo amina do terminal amino da cadeia beta da insulina e a outra extremidade do polietilenoglicol é ligada a um grupo amina ou grupo tiol da região Fc da imunoglobulina.
4. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc da imunoglobulina é aglicosilada.
5. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc da imunoglobulina é composta de um a quatro domínios selecionados do grupo que consiste em domínios CHI, CH2, CH3 e CH4.
6. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 5, em que a região Fc da imunoglobulina compreende ainda uma região dobradiça.
7. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc da imunoglobulina é uma região Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.
8. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 7, em que cada domínio da região Fc da imunoglobulina é um domínio híbrido de uma origem diferente derivado de uma imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
9. 0 conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 7, em que a região Fc da imunoglobulina é um dimero ou um multimero composto de imunoglobulina de cadeia única com a mesma origem.
10. O conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 7, em que a região Fc da imunoglobulina é uma região Fc da IgG4.
11. O conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 10, em que a região Fc da imunoglobulina é uma região Fc da IgG4 aglicosilada humana.
12. O conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo reativo do polietilenoglicol é selecionado do grupo que consiste num grupo aldeído, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado da succinimida.
13. O conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 12, em que o derivado da succinimida é propionato de succinimidilo, carboximetilo de succinimidilo, hidroxisuccinimidilo ou carbonato de succinimidilo.
14. O conjugado de insulina de acordo com a reivindicação 12, em que o polietilenoglicol tem um grupo aldeído reativo em ambas as extremidades.
15. Uma formulação de insulina de ação prolongada com duração e estabilidade in vivo melhoradas, compreendendo o conjugado de insulina de qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Um método de preparar o conjugado de insulina da reivindicação 1, compreendendo as etapas de: (1)ligar covalentemente um polietilenoglicol com um grupo reativo de aldeído, maleimida ou derivados da succinimida em cada extremidade do mesmo, com um grupo amina ou grupo tiol de uma região Fc da imunoglobulina; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), em que o conjugado compreende a região Fc da imunoglobulina ligada covalentemente com o polietilenoglicol; ande (3) ligar covalentemente insulina à outra extremidade do polietilenoglicol do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina que estão ligadas a cada extremidade do polietilenoglicol.
17. 0 método de acordo com a reivindicação 16, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polietilenoglicol com um grupo reativo aldeído em cada extremidade do mesmo ao terminal N de uma Fc da imunoglobulina a pH 6,0; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), em que o conjugado compreende a região Fc da imunoglobulina ligada covalentemente com o polietilenoglicol no seu terminal N; e (3) ligar covalentemente insulina à outra extremidade do polietilenoglicol do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina que estão ligadas a cada extremidade do polietilenoglicol.
18. Um método de preparar o conjugado de insulina da reivindicação 1, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polietilenoglicol com um grupo reativo de aldeído, maleimida ou derivados da succinimida em cada extremidade do mesmo, com um grupo amina ou grupo tiol da insulina; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), em que o conjugado compreende insulina ligada covalentemente com o polietilenoglicol; e (3) ligar covalentemente uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polietilenoglicol do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina que estão ligadas a cada extremidade do polietilenoglicol.
19. 0 método de acordo com a reivindicação 18, compreendendo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polietilenoglicol com um grupo reativo aldeído em cada extremidade do mesmo com um grupo amina da insulina; (2) isolar um conjugado da mistura da reação de (1), em que o conjugado compreende insulina ligada covalentemente com o polietilenoglicol; e (3) ligar covalentemente uma Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polietilenoglicol do conjugado isolado para produzir um conjugado peptídico que compreende a região Fc da imunoglobulina e insulina que estão ligadas a cada extremidade do polietilenoglicol.
20. Um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou a formulação da reivindicação 15 para utilização num método de tratamento médico.
21. Um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou a formulação da reivindicação 15 para utilização num método de tratar um sujeito com um distúrbio da deficiência da insulina.
22. O conjugado ou formulação para utilização de acordo com a reivindicação 21 em que o distúrbio da deficiência da insulina é diabetes.
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