PT2364734T - Sistemas de transporte biológico de múltiplos componentes - Google Patents

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PT2364734T
PT2364734T PT100131358T PT10013135T PT2364734T PT 2364734 T PT2364734 T PT 2364734T PT 100131358 T PT100131358 T PT 100131358T PT 10013135 T PT10013135 T PT 10013135T PT 2364734 T PT2364734 T PT 2364734T
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PT
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positively charged
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gly
backbone
Prior art date
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PT100131358T
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M Waugh Jacob
Dake Michael
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Revance Therapeutics Inc
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Description

DESCRIÇÃO "Sistemas de transporte biológico de múltiplos componentes"
ANTECEDENTES DO INVENTO
Os sistemas de entrega de genes, de um modo geral, podem ser classificados em dois grupos: virais e não virais. Os sistemas virais comportam riscos de toxicidade importantes e têm resultado em complicações graves e morte nos ensaios clínicos. Os sistemas não virais são muito menos eficientes do que as abordagens virais, mas oferecem a possibilidade de adaptar as aplicações de modo a melhorar a especificidade e, potencialmente, diminuir a toxicidade. As estratégias não virais podem ser classificadas, em geral, como estratégias de base lipídica ou de base não lipídica. A estratégia apresentada neste invento pode ser aplicada a qualquer uma das abordagens não virais existentes, de forma que todas serão aqui descritas. 0 sistema não virai mais simples é a entrega direta de ADN. Devido à carga negativa do ADN, apenas uma quantidade muito pequena do ADN entra efetivamente na célula e a maior parte é degradada. Não entra praticamente nenhum ADN no núcleo sem uma sequência de direcionamento nuclear na estratégia. Convencionalmente, recorre-se a outro fator para melhorar a eficiência da entrega do gene/produto (ADN, ARN ou, mais recentemente, agentes terapêuticos proteicos), seja por efeitos mecânicos como a eletroporação, os ultrassons, a "pistola de genes" e a microinjeção direta, ou por neutralização da carga e efeitos químicos com agentes como o fosfato de cálcio, a polilisina e as preparações lipossómicas. Nestas últimas estratégias, mostrou-se que a neutralização da carga aumenta várias vezes as eficiências não específicas em relação mesmo aos efeitos químicos/mecânicos das preparações lipossómicas sozinhas. Com base nestes resultados e resultados similares, muitos investigadores concluíram que o ADN e o ARN requerem uma neutralização da carga para que exista eficiência na assimilação celular, uma vez que a carga negativa do ADN basicamente impede o transporte exceto por endólise com subsequente fusão com o lisossoma (evitada com a adição de outros agentes) . A maior parte dos agentes de transfeção, de facto, utiliza um excesso de carga positiva em razões de 2-4x relativamente à carga final negativa do ADN. 0 hibrido positivo resultante liga-se ionicamente a proteoglicanos carregados negativamente presentes na superfície celular e aumenta drasticamente a assimilação subsequente. Alguns agentes de transfeção parecem possuir um tropismo celular, muito provavelmente devido a padrões estereoquimicos e de carga que visam mais eficazmente proteoglicanos particulares, os quais variam em padrões específicos dos tipos de células. Mesmo com os agentes apropriados (isto é, o tropismo correto), a neutralização da carga sozinha ou em combinação com lipossomas permanece extremamente ineficiente comparativamente com as estratégias virais. Assim, a comunidade identificou alguns péptidos e fragmentos peptidicos que facilitam a entrada eficiente de um complexo numa célula e ultrapassam qualquer fase endolisossómica. Vários destes fatores de transporte permitem mesmo uma entrada eficiente no núcleo. Num processo, o fator de transporte é ligado diretamente ao produto terapêutico de interesse (fármaco pequeno, gene, proteína, etc.). Esta abordagem requer que um novo fármaco ligado ao fator de transporte seja produzido, purificado e testado. Em muitos casos, estes híbridos constituirão efetivamente novos fármacos e exigirão ensaios completos. Um processo assim implica riscos e despesas adicionais significativos. Em alternativa, várias estratégias recorrem simplesmente à mistura não específica do agente (ou mesmo especifica à superfície) em preparações lipossómicas como transportadores para um fármaco/ADN/fator. Embora representem uma melhoria em relação às modalidades direta ou mais simples em termos de eficiências, estas abordagens permanecem ineficientes (comparativamente com os vírus) e consideravelmente mais tóxicas do que as estratégias não virais simples. Parte desta ineficiência deve-se à fraca translocação nuclear. Em consequência, as estratégias evoluíram para incluir sinais de translocação nuclear no complexo referido acima, seja como parte do fator terapêutico híbrido ou como parte da mistura lipossómica. Refinamentos adicionais incluíram esforços para reduzir a degradação do ADN/ARN/fator.
Talvez os refinamentos mais importantes nas estratégias básicas apresentadas acima incluíram ligandos específicos ou outros agentes de direcionamento juntamente com o fator terapêutico. Estas estratégias oferecem a possibilidade de uma toxicidade não específica grandemente reduzida e de melhorias substanciais na eficiência, particularmente quando combinadas com os agentes de eficiência descritos acima. Contudo, as estratégias atuais assentam em ligações covalentes a um único transportador e, por conseguinte, necessitam de uma síntese específica (para garantir que considerações estereoquímicas num nível do esquema de substituição não favorecem um único fator em relação aos outros - isto é, para assegurar que cada fator de eficiência e cada porção para imagiologia e cada porção de direcionamento está presente no esqueleto). Isto torna praticamente impossível algumas construções específicas (por exemplo, sialil-Lewis X e um fragmento Fab para um antigénio de superfície, uma vez que as limitações estereoquímicas impediriam a ligação eficiente de um ou do outro na maioria dos esquemas e, por sua vez, interfeririam com os fatores de eficiência). Embora promissoras como conceito, estas abordagens representam soluções caras, de rendimento muito baixo (em termos de síntese) e não demonstradas para este problema.
Como é certamente evidente, encontraram-se problemas em cada fase do desenvolvimento da entrega não virai de genes e fatores que, na fase seguinte, foram resolvidos com um grau de complexidade adicionado. Cada melhoria representou um passo incremental relativamente ao padrão anterior. Contudo, a complexidade adicionada comporta riscos de um ponto de vista dos cuidados ao doente e ineficiência e custos de um ponto de vista da produção. Estas barreiras conduziram a uma diminuição bastante grande do entusiasmo por estas potenciais terapias caso contrário promissoras. WO 96/11712 divulga uma composição para a entrega de genes compreendendo múltiplas moléculas poliméricas, que possuem uma carga final positiva ou uma carga final negativa e às quais estão ligadas, por exemplo, porções de direcionamento celular. WO 00/32764 divulga oligolisinas histidiladas e a sua utilização na entrega direcionada de genes. Péptidos básicos derivados do domínio de transdução proteica de TAT do VIH também foram usados para a entrega direcionada de genes (Schwartz et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2000, 2:162-167). São necessários novos métodos e composições aplicáveis amplamente a composições de diferentes agentes terapêuticos ou cosmecêuticos, que possam ser direcionadas ou visualizadas para maximizar a entrega num sítio particular. De forma surpreendente, a presente divulgação proporciona tais composições e métodos. O presente invento está definido nas reivindicações 1-6 anexas.
SUMÁRIO DO INVENTO
Num aspeto, a presente divulgação proporciona uma composição compreendendo um complexo de associação não covalente de: a) um esqueleto carregado positivamente e b) pelo menos dois elementos selecionados entre: i) um primeiro esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de porções para imagiologia ligadas; ii) um segundo esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes de direcionamento ligados; iii) pelo menos um elemento selecionado entre ARN, ADN, ribozimas, oligonucleótidos modificados e ADNc que codifica um transgene selecionado; iv) ADN que codifica pelo menos um fator de persistência; e v) um terceiro esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes biológicos ligados; em que o complexo de associação é portador de uma carga final positiva e pelo menos um dos dois elementos do grupo b) é selecionado entre os grupos i), iii) ou v).
Os agentes biológicos podem ser um agente terapêutico ou um agente cosmecêutico. Em alternativa, os agentes candidatos podem ser usados para determinar a eficácia in vivo nestes complexos de não covalente.
Noutro aspeto, a presente divulgação proporciona uma composição compreendendo um complexo de associação não covalente de um esqueleto carregado positivamente possuindo pelo menos um grupo de eficiência ligado e pelo menos um elemento de ácido nucleico selecionado entre o grupo constituído por ARN, ADN, ribozimas, oligonucleótidos modificados e ADNc que codifica um transgene selecionado.
Noutro aspeto, a presente divulgação proporciona um método para entrega de um agente biológico a uma superfície celular num sujeito, em que o referido método compreende a administração ao referido sujeito de uma composição tal como descrita acima.
Ainda noutro aspeto, a presente divulgação proporciona um método de preparação de uma composição farmacêutica ou cosmecêutica, em que o método compreende a combinação de um componente esqueleto carregado positivamente e de pelo menos dois elementos selecionados entre: i) um esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de porções para imagiologia ligados; ii) um esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes de direcionamento ligados; iii) pelo menos um elemento selecionado entre ARN, ADN, ribozimas, oligonucleótidos modificados e ADNc que codifica um transgene selecionado; iv) ADN que codifica pelo menos um fator de persistência; e v) um esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes terapêuticos ou cosmecêuticos ligados; com um transportador farmacêutica ou cosmeceuticamente aceitável, para formar um complexo de associação não covalente possuindo uma carga final positiva, com a condição de pelo menos um dos referidos dois elementos dos grupos i) a v) ser selecionado entre os grupos i), iii) ou v).
Noutro aspeto ainda, a presente divulgação proporciona um kit para formular uma composição de entrega farmacêutica ou cosmecêutica, em que o kit compreende um componente esqueleto carregado positivamente e pelo menos dois componentes selecionados entre os grupos i) a v) referidos acima, juntamente com instruções para preparar a composição de entrega.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 proporciona uma representação esquemática dos componentes utilizados no invento. A Figura 2 proporciona uma representação esquemática de várias concretizações do invento.
As Figuras 3-10 proporcionam fotografias que representam a entrega transdérmica de uma formulação terapêutica conforme descrito no Exemplo 4.
As Figuras 11-12 proporcionam fotografias que representam o direcionamento de uma formulação terapêutica como descrito no Exemplo 5.
DESCRIÇÃO DO INVENTO
Geral A presente divulgação proporciona um sistema baseado em componentes para a entrega seletiva e persistente de agentes para imagiologia, de genes ou de outros agentes terapêuticos. As características individuais para as composições podem ser selecionadas designando os componentes pretendidos em formulações preparadas à cabeceira do doente. Adicionalmente, as porções para imagiologia e de direcionamento específico são proporcionadas em esqueletos carregados negativamente separados que formarão uma associação iónica não covalente com um esqueleto positivo. Ao colocar estes componentes num esqueleto carregado negativamente, é contornada a necessidade de ligar componentes em localizações precisas num esqueleto positivo, como efetuado noutras estratégias (aumentando a complexidade e a despesa e diminuindo a eficiência para um nível em que nenhuma combinação bem-sucedida foi ainda comunicada devido a limitações estereoquímicas). Uma compreensão adicional da divulgação é proporcionada com referência à Figura 1. Nesta figura, os componentes são representados como (1) um esqueleto sólido ao qual estão ligados grupos carregados positivamente (também designados por grupos de eficiência; representados como círculos escuros ligados a uma barra escura), por exemplo, (Gly) ni- (Arg) n2 (em que o índice inferior nl é um número inteiro de 3 a cerca de 5 e o índice inferior n2 é um número inteiro ímpar de cerca de 7 a cerca de 17) ou domínios de TAT; (2) um esqueleto curto carregado negativamente ao qual estão ligadas porções para imagiologia (triângulos a branco ligados a uma barra clara); (3) um esqueleto curto carregado negativamente ao qual estão ligados agentes de direcionamento e/ou agentes terapêuticos (círculos a branco ligados a uma barra clara); (4) um oligonucleótido, ARN, ADN ou ADNc (barra sombreada clara); e (5) ADN que codifica fatores de persistência (barra sombreada escura). A Figura 2 ilustra vários exemplos de composições multicomponentes em que os grupos estão representados da forma apresenta na Figura 1. Por exemplo, na Figura 2, está ilustrada uma primeira composição multicomponentes em que um esqueleto carregado positivamente tem associado um componente para imagiologia, um componente de direcionamento, um oligonucleótido e um fator de persistência. Está ilustrada uma segunda composição multicomponentes que é concebida para imagiologia de diagnóstico/prognóstico. Nesta composição, o esqueleto carregado positivamente está complexado tanto com componentes para imagiologia como com componentes de direcionamento. Finalmente, está ilustrado um terceiro sistema multicomponentes que é útil para a entrega de genes. Neste sistema, forma-se um complexo de associação entre um esqueleto carregado positivamente, um componente de direcionamento, um gene de interesse e um ADN que codifica um fator de persistência. A presente divulgação, descrita em maior pormenor abaixo, fornece algumas composições adicionais que são uteis em programas terapêuticos e de diagnóstico.
Descrição das concretizações
Composições
Em vista do que foi dito acima, num aspeto, a presente divulgação proporciona uma composição compreendendo um complexo de associação não covalente de: a) um esqueleto carregado positivamente e b) pelo menos dois elementos selecionados entre: i) um primeiro esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de porções para imagiologia ligadas; ii) um segundo esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes de direcionamento ligados; iii) pelo menos um elemento selecionado entre ARN, ADN, ribozimas, oligonucleótidos modificados e ADNc que codifica um transgene selecionado; iv) ADN que codifica pelo menos um fator de persistência; e v) um terceiro esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes biológicos ligados; em que o complexo de associação é portador de uma carga final positiva e pelo menos um dos dois elementos do grupo b) é selecionado entre os grupos i), iii) ou v).
Num grupo de concretizações, a composição compreende pelo menos três elementos selecionados entre os grupos i) a v) . Noutro grupo de concretizações, a composição compreende pelo menos um elemento de cada um dos grupos i), ii), iii) e iv) . Ainda noutro grupo de concretizações, a composição compreende pelo menos um elemento de cada um dos grupos i) e ii) . E noutro grupo de concretizações, a composição compreende pelo menos um elemento de cada um dos grupos ii), iii) e iv).
De preferência, o esqueleto carregado positivamente tem um comprimento de cerca de 1 a 4 vezes os comprimentos combinados dos elementos do grupo b) . Em alternativa, o esqueleto carregado positivamente apresenta uma razão de cargas de cerca de 1 a 4 vezes a carga combinada dos membros do grupo b). Em algumas concretizações, a densidade de cargas é uniforme e as razões de comprimento e carga são aproximadamente iguais. As razões de tamanho (comprimento) podem ser determinadas com base em estudos moleculares dos componentes ou podem ser determinadas a partir das massas dos componentes.
Esqueleto carregado positivamente 0 esqueleto carregado positivamente do invento compreende um polipéptido linear carregado positivamente compreendendo polilisina. 0 esqueleto carregado positivamente como aqui descrito é tipicamente uma cadeia linear de átomos, com grupos na cadeia portadores de uma carga positiva a pH fisiológico ou com grupos portadores de uma carga positiva ligados às cadeias laterais que se prolongam desde o esqueleto. 0 esqueleto linear é um esqueleto de hidrocarboneto que é, em algumas concretizações, interrompido por heteroátomos selecionados entre azoto, oxigénio, enxofre, silício e fósforo. A maioria dos átomos que constituem a cadeia do esqueleto são geralmente carbono. Adicionalmente, o esqueleto será frequentemente um polímero de unidades de repetição (por exemplo, aminoácidos, poli(etilenoxi), poli(propilenamina) e similares). Num grupo de concretizações, o esqueleto carregado positivamente é uma polipropilenamina em que alguns dos átomos de azoto da amina estão presentes como grupos amónio (tetrassubstituídos), portadores de uma carga positiva. Noutro grupo de concretizações, o esqueleto tem ligada uma pluralidade de porções de cadeia lateral que incluem grupos carregados positivamente (por exemplo, grupos amónio, grupos piridinio, grupos fosfónio, grupos sulfónio, grupos guanidinio ou grupos amidinio). Os elementos de cadeia lateral, neste grupo de concretizações, podem ser dispostos ao longo do esqueleto a intervalos que são consistentes em termos das separações ou variáveis. Adicionalmente, o comprimento das cadeias laterais pode ser similar ou diferente. Por exemplo, num grupo de concretizações, as cadeias laterais podem ser cadeias de hidrocarboneto lineares ou ramificadas possuindo de um a vinte átomos de carbono que terminam na extremidade distai (afastada do esqueleto) num dos grupos carregados positivamente referidos acima.
Num grupo de concretizações, o esqueleto carregado positivamente é um polipéptido possuindo múltiplos grupos de cadeia lateral carregados positivamente (por exemplo, lisina, arginina, ornitina, homoarginina e similares). Um perito na especialidade compreenderá que quando são utilizados aminoácidos nesta porção do invento, as cadeias laterais podem ter a forma D ou a forma L (configuração R ou S) ao nível do centro de ligação.
Em alternativa, o esqueleto pode ser um análogo de um polipéptido tal como um peptoide. Ver, por exemplo, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992); e Simon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 89:9367 (1992). Resumidamente, um peptoide é uma poliglicina na qual a cadeia lateral está ligada aos átomos de azoto do esqueleto em vez de aos átomos de carbono a. Tal como acima, uma porção das cadeias laterais terminará tipicamente num grupo carregado positivamente para fornecer um componente esqueleto carregado positivamente. A síntese de peptoides está descrita, por exemplo, na Patente U.S. n.° 5, 877,278. Tal como o termo é aqui utilizado, os esqueletos carregados positivamente que têm uma construção de esqueleto peptoide são considerados "não-péptidos", uma vez que não são constituídos por aminoácidos com cadeias laterais que ocorrem naturalmente ao nível dos carbonos a. É possível utilizar uma variedade de outros esqueletos empregando, por exemplo, miméticos estereoquímicos ou eletrónicos de polipéptidos em que as ligações amida do péptido são substituídas por alternativas como ligações éster, tioamidas (-CSNH-), tioamida invertida (-NHCS-), grupos aminometileno (-NHCH2-) ou metilenoamino invertido (-CH2NH-), grupos ceto-metileno (-COCH2-) , éster fosfinato (-PO2RCH2-), fosfonamidato e fosfonamidato (-PO2RNH-), péptido invertido (-NHCO-), trans-alceno (-CR=CH-), fluoroalceno (-CF=CH-), dimetileno (-CH2CH2-), tioéter (-CH2S-) , hidroxietileno (-CH(OH) CH2-) , metilenoxi (-CH2O-) , tetrazole (CN4) , sulfonamido (-SO2NH-) , metilenossulfonamido (-CHRSO2NH-) , sulfonamida invertida (-NHSO2-) e esqueletos com subunidades malonato e/ou gem-diamino-alquilo, por exemplo, como revisto por Fletcher et al. ((1998) Chem. Rev. 98:763). Muitas das substituições anteriores resultam em esqueletos poliméricos aproximadamente isostéricos relativamente aos esqueletos formados a partir de α-aminoácidos.
Em cada um dos esqueletos proporcionados acima, é possível juntar grupos de cadeia lateral portadores de um grupo carregado positivamente. Por exemplo, os esqueletos com ligações sulfonamida (-SO2NH- e -NHSO2-) podem ter grupos de cadeia lateral ligados aos átomos de azoto. De modo idêntico, a ligação hidroxietileno (-CH(OH)CH2-) pode comportar um grupo de cadeia lateral ligado ao substituinte hidroxi. Utilizando métodos sintéticos padrão, um perito na especialidade pode adaptar facilmente as outras químicas de ligação para proporcionar grupos de cadeia lateral carregados positivamente.
No presente invento, o esqueleto carregado positivamente é um polipéptido compreendendo polilisina possuindo grupos de ramificação (também designados por grupos de eficiência) compreendendo - (gly) ni- (arg) n2 ou domínio (s) de TAT do VIH, em que o índice inferior nl é um número inteiro de 0 a 20, mais preferencialmente de 0 a 8, ainda mais preferencialmente de 2 a 5, e o índice inferior n2 é um número inteiro ímpar de cerca de 5 a cerca de 25, mais preferencialmente de cerca de 7 a cerca de 17, ainda mais preferencialmente de cerca de 7 a cerca de 13. Alternativamente, os grupos de eficiência compreendem um domínio peptídico de TAT do VIH carregado positivamente ou uma sequência de aminoácidos (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly) q ou (gly) P-YGRKKRRQRRR-(gly) q , onde cada um dos índices inferiores p e q é, de modo independente, um número inteiro de 0 a 20, e a sequência de aminoácidos está ligada ao esqueleto por via do terminal C ou do terminal N da sequência de aminoácidos. As sequência de aminoácidos preferidas são aquelas em que cada um dos indices inferiores p e q é, de modo independente, um número inteiro de 0 a 8, mais preferencialmente de 2 a 5.
Noutra concretização particularmente preferida, a porção de esqueleto é uma polilisina e os grupos de ramificação carregados positivamente estão ligados aos grupos amino da cadeia lateral das lisinas. A polilisina usada nesta concretização particularmente preferida pode ser qualquer uma das polilisinas disponíveis comercialmente (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, E.U.A.) tais como, por exemplo, uma polilisina possuindo um PM > 70 000, uma polilisina possuindo um PM entre 70 000 e 150 000, uma polilisina possuindo um PM entre 150 000 e 300 000 e uma polilisina possuindo um PM > 300 000. A seleção apropriada de uma polilisina dependerá dos restantes componentes da composição e será suficiente para proporcionar uma carga final global positiva a composição e proporcionar um comprimento que é preferencialmente uma a quatro vezes o comprimento combinado dos componentes carregados negativamente. Os grupos de ramificação ou grupos de eficiência carregados positivamente preferidos incluem, por exemplo, -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-GlysArg?) ou um domínio peptídico de TAT do VIH carregado positivamente.
Outros componentes
Além do componente esqueleto carregado positivamente, as composições da presente divulgação compreendem pelo menos dois componentes de entre os seguintes: i) um esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de porções para imagiologia ligadas; ii) um esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de porções de direcionamento ligadas; e iii) pelo menos um ARN, ADN, ribozima, oligonucleótido modificado ou um ADNc que codifica um transgene de interesse; iv) ADN que codifica pelo menos um fator de persistência; e v) um esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes terapêuticos ligados.
Os esqueletos carregados negativamente utilizados como portadores das porções para imagiologia, das porções de direcionamento e dos agentes terapêuticos podem ser uma variedade de esqueletos (idênticos aos descritos acima) possuindo múltiplos grupos portadores de uma carga negativa a pH fisiológico. Os grupos carregados negativamente adequados são ácidos carboxílicos, ácidos fosfínicos, fosfónicos ou fosfóricos, ácidos sulfinicos ou sulfónicos, e similares. Em algumas concretizações, o esqueleto carregado negativamente será um ácido nucleico oligomérico. Noutras concretizações, o esqueleto carregado negativamente é um oligossacárido (por exemplo, dextrano). Ainda noutras concretizações, o esqueleto carregado negativamente é um polipéptido (por exemplo, poli (ácido glutâmico), poli(ácido aspártico) ou um polipéptido em que os resíduos de ácido glutâmico ou ácido aspártico estão interrompidos por aminoácidos não carregados). As porções descritas em maior detalhe abaixo (porções para imagiologia, agentes de direcionamento e agentes terapêuticos) podem ser ligados a um esqueleto possuindo estes grupos pendentes, tipicamente por via de ligações éster. Em alternativa, os aminoácidos que interrompem os aminoácidos carregados negativamente ou que estão apensos ao terminal do esqueleto carregado negativamente podem ser usados para ligar porções para imagiologia e porções de direcionamento por via de, por exemplo, ligações dissulfureto (através de um residuo de cisteína), ligações amida, ligações éter (através dos grupos hidroxilo de serina ou treonina) e similares.
Porções para imagiologia Vários porções para diagnóstico ou imagiologia são úteis na presente divulgação e estão presentes numa quantidade eficaz que dependerá da condição que está a ser diagnosticada ou visualizada, da via de administração, da sensibilidade do agente e do dispositivo utilizados para a deteção do agente e similares.
Os exemplos de agentes para imagiologia ou agentes de diagnóstico adequados incluem os agentes de contraste radiopacos, os agentes de contraste paramagnéticos, os agentes de contraste superparamagnéticos, os agentes de contraste para TC e outros agentes de contraste. Por exemplo, os agentes de contraste radiopacos (para imagiologia por raios X) incluirão compostos de iodo inorgânicos e orgânicos (por exemplo, diatrizoato) , metais radiopacos e respetivos sais (por exemplo, prata, ouro, platina e similares) e outros compostos radiopacos (por exemplo, sais de cálcio, sais de bário como o sulfato de bário, tântalo e óxido de tântalo). Os agentes de contraste paramagnéticos apropriados (para imagiologia por RM) incluem o ácido dietilenotriaminopenta-acético complexado com gadolinio (Gd-DTPA) e seus derivados e outros complexos de gadolinio, manganês, ferro, disprósio, cobre, európio, érbio, crómio, niquel e cobalto, incluindo os complexos com ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N",N "'-tetra-acético (DOTA), ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N"-triacético (D03A), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano-N,N',N",N'"-tetra-acético (TETA), ácido hidroxibenziletilenodiaminodiacético (HBED) e similares. Os agentes de contraste superparamagnéticos adequados (para imagiologia por RM) incluem magnetites, óxidos de ferro superparamagnéticos e óxidos de ferro monocristalinos, particularmente as formas complexadas de cada um destes agentes que podem ser ligadas a um esqueleto carregado negativamente. Ainda outros agentes para imagiologia adequados são os agentes de contraste para TC, incluindo os agentes de contraste para TC iodados e não iodados e iónicos e não iónicos, bem como agentes de contraste como spin labels (marcadores de spin) ou outros agentes eficazes ao nivel do diagnóstico.
Outros exemplos de agentes de diagnóstico incluem genes marcadores que codificam proteínas facilmente detetáveis quando são expressas numa célula, incluindo, embora não exclusivamente, a β-galactosidase, a proteína verde fluorescente, a proteína azul fluorescente, a luciferase e similares. É possível utilizar uma grande variedade de marcas, tais como radionuclidos, flúores, enzimas, substratos de enzimas, cofatores de enzimas, inibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos) e similares. Outras substâncias também úteis são aquelas marcadas com espécies ou componentes radioativos, tais como gluco-heptonato-"mTc.
Agentes de dírecionamento Vários agentes de dírecionamento são úteis nas composições aqui descritas. Tipicamente, os agentes de dírecionamento são ligados a um esqueleto carregado negativamente tal como descrito acima relativamente às porções para imagiologia. Os agentes de dírecionamento podem ser qualquer elemento que possibilite orientar a transferência de um ácido nucleico, um agente terapêutico ou outro componente da composição para um sítio particular. 0 agente de direcionamento pode ser um agente de direcionamento extracelular que permite, por exemplo, que a transferência de um ácido nucleico seja direcionada para determinados tipos de células ou de determinados tecidos desejados (células de tumores, células hepáticas, células hematopoiéticas e similares). Este agente também pode ser um agente de direcionamento intracelular, permitindo que um agente terapêutico seja direcionado para compartimentos celulares particulares (por exemplo, mitocôndria, núcleo e similares). 0 agente ou os agentes de direcionamento são preferencialmente ligados, de modo covalente ou não covalente, a um esqueleto carregado negativamente de acordo com a divulgação. De acordo com um modo preferido, o agente de direcionamento é ligado covalentemente a um oligonucleótido que serve como componente esqueleto carregado negativamente, preferencialmente por via de um grupo de ligação. Os métodos de ligação de agentes de direcionamento (assim como de outros agentes biológicos) a ácidos nucleicos são bem conhecidos pelos peritos na especialidade usando, por exemplo, grupos de ligação heterobifuncionais (ver o catálogo de Pierce Chemical). Num grupo de concretizações, o agente de direcionamento é um péptido fusogénico para promover a transfeção celular, isto é, para favorecer a passagem da composição ou dos seus vários elementos através de membranas ou para ajudar na saida de endossomas ou para atravessar a membrana nuclear. 0 agente de direcionamento também pode ser um ligando de recetor celular para um recetor que esteja presente na superfície do tipo celular, como, por exemplo, um açúcar, transferrina, insulina ou proteína asialo-orosomucoide. Este ligando também pode ser do tipo intracelular, tal como uma sequência de sinal de localização nuclear (nls) que promove a acumulação do ADN transfetado no interior do núcleo.
Outros agentes de direcionamento úteis no contexto da divulgação incluem açúcares, péptidos, hormonas, vitaminas, citocinas, oligonucleótidos, lípidos ou sequências ou frações derivadas destes elementos, e que permitem uma ligação específica aos recetores correspondentes. De preferência, os agentes de direcionamento são açúcares e/ou péptidos como anticorpos ou fragmentos de anticorpos, ligandos de recetores celulares ou seus fragmentos, recetores ou fragmentos de recetores e similares. Mais preferencialmente, os agentes de direcionamento são ligandos de recetores de fatores de crescimento, ligandos de recetores de citocinas ou ligandos de recetores lectinas celulares ou ligandos de recetores de proteínas de adesão. 0 agente de direcionamento também pode ser um açúcar que possibilita visar lectinas, como os recetores de asialoglicoproteína, ou em alternativa um fragmento Fab de anticorpo que possibilita visar o recetor do fragmento Fc de imunoglobulinas. Ácidos nucleicos
Nas composições da presente divulgação, o ácido nucleico pode ser um ácido desoxirribonucleico ou um ácido ribonucleico e pode compreender sequências de origem natural ou artificial. Mais particularmente, os ácidos nucleicos aqui utilizados podem incluir ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, sequências híbridas ou sequências sintéticas ou semissintéticas. Estes ácidos nucleicos podem ser de origem humana, animal, vegetal, bacteriana, virai, etc.. Adicionalmente, os ácidos nucleicos podem ser obtidos por meio de qualquer técnica conhecida pelos peritos na especialidade e, em particular, por rastreio de bancos, por síntese química ou por métodos mistos que incluem a modificação química ou enzimática de sequências obtidas através do rastreio de bancos. Adicionalmente ainda, os ácidos nucleicos podem ser incorporados em vetores, tais como vetores plasmídicos.
Os ácidos desoxirribonucleicos usados na presente divulgação podem ser de cadeia simples ou cadeia dupla. Estes ácidos desoxirribonucleicos podem também codificar genes terapêuticos, sequências para regular a transcrição ou a replicação, sequências antissentido, regiões para ligação a outros componentes celulares, etc.. Os genes terapêuticos apropriados são essencialmente qualquer gene que codifica um produto proteínico possuindo um efeito terapêutico. 0 produto proteínico assim codificado poderá ser uma proteína, um polipéptido, um péptido ou similar. 0 produto proteínico pode, em alguns casos, ser homólogo relativamente à célula-alvo (isto é, um produto que é normalmente expresso na célula-alvo quando esta última não apresenta qualquer patologia). Deste modo, a utilização de ácidos nucleicos adequados pode aumentar a expressão de uma proteína, possibilitando, por exemplo, ultrapassar uma expressão insuficiente na célula. Em alternativa, a presente divulgação proporciona composições e métodos para a expressão de uma proteína que é inativa ou fracamente ativa devido a uma modificação, ou alternativamente sobreexpressar a proteína. 0 gene terapêutico poderá, assim, codificar um mutante de uma proteína celular que possui maior estabilidade, uma atividade modificada, etc.. 0 produto proteínico também poderá ser heterólogo relativamente à célula-alvo. Neste caso, uma proteína expressa poderá, por exemplo, compensar ou proporcionar uma atividade que é deficiente na célula, permitindo-lhe combater uma patologia ou estimular uma resposta imunitária.
Mais particularmente, os ácidos nucleicos úteis na presente divulgação são aqueles que codificam enzimas, derivados sanguíneos, hormonas, linfocinas, interleucinas, interferões, TNF, fatores de crescimento, neurotransmissores ou seus percursores ou enzimas sintéticas, fatores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina; as proteínas envolvidas no metabolismo dos lípidos, de tipos de apolipoproteínas selecionadas entre as apolipoproteinas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J e apo(a), enzimas metabólicas como, por exemplo, lipoproteína-lipase, lipase hepática, lecitina-colesterol-aciltransferase, colesterol-7-a-hidroxilase, fosfatidato-fosfatase, proteínas de transferência de lípidos como a proteína de transferência de ésteres de colesterol e a proteína de transferência de fosfolípidos, uma proteína para ligar HDL ou um recetor selecionado, por exemplo, entre recetores de LDL, recetores de quilomícrones remanescentes e recetores sequestradores (scavenger), distrofina ou minidistrofina, proteína GAX, proteína CFTR associada à mucoviscidose, genes supressores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev; fatores proteínicos envolvidos na coagulação: fatores VII, VIII, IX; ou os ácidos nucleicos podem ser aqueles genes envolvidos na reparação do ADN, genes suicidas (timidina-cinase, citosina-desaminase), genes que codificam trombomodulina, αΐ-antitripsina, ativador do plasminogénio tecidual, superóxido-dismutase, elastase, metaloproteinase de matriz e similares.
Os genes terapêuticos úteis na presente divulgação também podem ser uma sequência antissentido ou um gene cuja expressão na célula-alvo permite controlar a expressão de genes ou a transcrição do ARNm celular. Tais sequências podem, por exemplo, ser transcritas na célula-alvo em ARN complementar do ARNm celular e, deste modo, bloquear a sua tradução na proteína, de acordo com a técnica descrita na patente EP 140 308. As sequências antissentido também compreendem as sequências que codificam ribozimas que são capazes de destruir seletivamente o ARN-alvo (ver EP 321 201).
Tal como indicado acima, o ácido nucleico também poderá conter um ou mais genes que codificam um péptido antigénico capaz de gerar uma resposta imunitária em seres humanos ou animais. Nesta concretização particular, a divulgação possibilita assim a produção de vacinas ou de tratamentos imunoterapêuticos aplicados a seres humanos ou a animais, em particular contra microrganismos, vírus ou cancros. Em particular, estes poderão ser péptidos antigénicos específicos para o vírus de Epstein-Barr, o VIH, o vírus da hepatite B (ver EP 185 573) , o vírus da pseudorraiva ou, em alternativa, específicos para tumores (ver EP 259 212).
Preferencialmente, o ácido nucleico também compreende sequências que permitem a expressão do gene terapêutico e/ou do qene que codifica o péptido antiqénico na célula ou órqão desejados. Estas podem ser sequências que são naturalmente responsáveis pela expressão do gene considerado quando as sequências são capazes de funcionar na célula infetada. Os ácidos nucleicos também podem ser sequências de origem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas ou até de proteínas sintéticas). Em particular, os ácidos nucleicos podem conter sequências promotoras de genes eucarióticos ou virais. Por exemplo, as sequências promotoras podem ser sequências derivadas do genoma da célula que se pretende infetar. De modo idêntico, as sequências promotoras podem ser derivadas do genoma de um vírus, por exemplo, os promotores de genes EIA, MLP, de CMV, RSV, etc.
Adicionalmente, estas sequências de expressão poderão ser modificadas por adição de sequências de ativação, sequências de regulação, etc..
Além disso, o ácido nucleico também poderá conter, em particular a montante do gene terapêutico, uma sequência de sinal que orienta o produto terapêutico sintetizado para as vias de secreção da célula-alvo. Esta sequência de sinal poderá ser a sequência de sinal natural do produto terapêutico, mas também poderá ser qualquer outra sequência de sinal funcional ou uma sequência de sinal artificial. ADN que codifica pelo menos um fator de persistência
Em algumas concretizações, a composição também compreenderá ADN que codifica pelo menos um fator de persistência. Um exemplo desse ADN é o ADN que codifica a proteína pré-terminal 1 adenoviral (ver Lieber et al. Nature Biotechnology 15(13):1383-1387 (1997).
Agentes biológicos Vários agentes biológicos, incluindo agentes terapêuticos e cosmecêuticos, são úteis na presente divulgação e estão presentes numa quantidade eficaz que dependerá da condição que está a ser tratada, profilaticamente ou de outro modo, da via de administração, da eficácia do agente e do tamanho e suscetibilidade do doente ao regime de tratamento.
Os agentes terapêuticos adequados que podem ser ligados a um esqueleto carregado negativamente podem ser encontrados em praticamente qualquer classe de agentes, incluindo, por exemplo, os agentes analgésicos, os agentes antiasmáticos, os antibióticos, os agentes antidepressivos, os agentes antidiabéticos, os agentes antifúngicos, os antieméticos, os anti-hipertensores, os agentes anti-impotência, os agentes anti-inflamatórios, os agentes antineoplásicos, os agentes anti-VIH, os agentes antivirais, os agentes ansiolíticos, os agentes contracetivos, os agentes de fertilidade, os agentes antitrombóticos, os agentes protrombóticos, as hormonas, as vacinas, os agentes imunossupressores, as vitaminas e similares.
Os agentes cosmecêuticos adequados incluem, por exemplo, o fator de crescimento epidérmico (EGF), assim como a hormona de crescimento humana, antioxidantes e BOTOX.
Mais particularmente, os agentes terapêuticos úteis na presente divulgação incluem analgésicos como lidocaina, novocaina, bupivacaina, procaína, tetracaína, benzocaina, cocaina, mepivacaina, etidocaina, proparacaína, ropivacaína, prilocaina e similares; agentes antiasmáticos como azelastina, cetotifeno, traxanox, corticosteroides, cromolina, nedocromil, albuterol, mesilato de bitolterol, pirbuterol, salmeterol, terbutalina, teofilina e similares; antibióticos como neomicina, estreptomicina, cloranfenicol, norfloxacina, ciprofloxacina, trimetoprim, sulfametoxazol, os antibióticos β-lactâmicos, tetraciclina e similares; agentes antidepressivos como nefopam, oxipertina, imipramina, trazodona e similares; agentes antidiabéticos como biguanidinas, sulfonilureias e similares; antieméticos e antipsicóticos como cloropromazina, flufenazina, perfenazina, proclorperazina, prometazina, tietilperazina, triflupromazina, haloperidol, escopolamina, difenidol, trimetobenzamida e similares; agentes neuromusculares como atracúrio, mivacúrio, rocurónio, succinilcolina, doxacúrio, tubocurarina e toxina botulínica (BOTOX); agentes antifúngicos como anfotericina B, nistatina, candicidina, itraconazol, cetoconazol, miconazol, clotrimazol, fluconazol, ciclopirox, econazol, naftifina, terbinafina, griseofulvina e similares; agentes anti-hipertensores como propanolol, propafenona, oxprenolol, nifedipina, reserpina e similares; agentes anti-impotência como dadores de óxido nitrico e similares; agentes anti-inflamatórios incluindo anti-inflamatórios esteroides como cortisona, hidrocortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, fluazacorte e similares, assim como anti-inflamatórios não esteroides como indometacina, ibuprofeno, ramifenizona, piroxicam e similares; agentes antineoplásicos como adriamicina, ciclofosfamida, actinomicina, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, mitomicina, rapamicina, metotrexato, fluorouracilo, carboplatina, carmustina (BCNU), cisplatina, etoposido, interferões, fenesterina, taxol (incluindo análogos e derivados), camptotecina e seus derivados, vinblastina, vincristina e similares; agentes anti-VIH (por exemplo, antiproteoliticos); agentes antivirais como amantadina, metisazona, idoxuridina, citarabina, aciclovir, fanciclovir, ganciclovir, foscarnet, sorivudina, trifluridina, valaciclovir, cidofovir, didanosina, estavudina, zalcitabina, zidovudina, ribavirina, rimantadina e similares; agentes ansioliticos como dantroleno, diazepam e similares; inibidores de COX-2; agentes contracetivos como progestogénio e similares; agentes antitrombóticos como inibidores das GP Ilb/IIIa, ativadores do plasminogénio tecidual, estreptocinase, urocinase, heparina e similares; agentes protrombóticos como trombina, fatores V, VII, VIII e similares; hormonas como insulina, hormona de crescimento, prolactina, EGF (fator de crescimento epidérmico) e similares; agentes imunossupressores como ciclosporina, azatioprina, mizoribina, FK506, prednisona e similares; agentes angiogénicos como VEGF (fator de crescimento endotelial vascular); vitaminas como A, D, E, K e similares; e outros agentes terapêutica ou medicinalmente ativos. Ver, por exemplo, GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ninth Ed. Hardman et al., eds. McGraw-Hill, (1996).
Nas concretizações mais preferidas, o agente biológico é selecionado entre a insulina, a toxina botulinica (BOTOX), o VEGF, o EGF, anticorpos para o VEGF e o TGF-βΙ.
Esgueletos carregados negativamente possuindo porções para imagiologia, agentes de direcionamento ou agentes terapêuticos ligados
Para três dos grupos de componentes referidos acima (porções para imagiologia, agentes de direcionamento e agentes terapêuticos), os compostos individuais são ligados a um esqueleto carregado negativamente. Tipicamente, a ligação efetua-se por via de um grupo de ligação usado para ligar de modo covalente o agente particular ao esqueleto através de grupos funcionais presentes no agente bem como no esqueleto. Vários grupos de ligação são úteis neste aspeto do invento. Ver, por exemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996); Wong, S.S., Ed., Chemistry of Protein Conj ugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991); Senter et al., J. Org. Chem. 55:2975-78 (1990); e Koneko et al., Bioconjugate Chem. 2:133-141 (1991) .
Em algumas concretizações, os agentes terapêuticos, de diagnóstico ou de direcionamento não terão um grupo funcional disponível para ligação a um grupo de ligação e podem ser primeiro modificados para incorporar, por exemplo, um substituinte hidroxi, amino ou tiol. De preferência, o substituinte é proporcionado numa porção não interferente do agente, e pode ser usado para ligar um grupo de ligação, e não afetará negativamente a função do agente.
Ainda noutro aspeto, a presente divulgação proporciona composições compreendendo um complexo de associação não covalente de um esqueleto carregado positivamente possuindo pelo menos um grupo de eficiência ligado e pelo menos um elemento de ácido nucleico selecionado entre o grupo constituído por ARN, ADN, ribozimas, oligonucleótidos modificados e ADNc que codifica um transgene selecionado. Neste aspeto da divulgação, o esqueleto carregado positivamente pode ser essencialmente qualquer um dos esqueletos carregados positivamente descritos acima e também compreenderá (como acontece com esqueletos selecionados referidos acima) pelo menos um grupo de eficiência ligado. Os grupos de eficiência adequados incluem, por exemplo, (Gly)ni-(Arg)n2 (em que o indice inferior nl é um número inteiro de 3 a cerca de 5 e o indice inferior n2 é um número inteiro impar de cerca de 7 a cerca de 17) ou dominios de TAT. Adicionalmente, os ácidos nucleicos úteis neste aspeto são os mesmos que foram descritos acima. Métodos de preparação das composições
Noutro aspeto, a presente divulgação proporciona um método de preparação de uma composição farmacêutica, em que o método compreende a combinação de um componente esqueleto carregado positivamente e de pelo menos dois elementos selecionados entre: i) um primeiro esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de porções para imagiologia ligadas; ii) um segundo esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes de direcionamento ligados; iii) pelo menos um elemento selecionado entre o grupo constituído por ARN, ADN, ribozimas, oligonucleótidos modificados e ADNc que codifica um transgene selecionado; iv) ADN que codifica pelo menos um fator de persistência; e v) um terceiro esqueleto carregado negativamente possuindo uma pluralidade de agentes terapêuticos ligados; com um transportador farmaceuticamente aceitável, para formar um complexo de associação não covalente possuindo uma carga final positiva, com a condição de pelo menos um dos dois elementos dos grupos i) a v) ser selecionado entre os grupos i) , iii) ou v) . A vasta aplicabilidade da presente divulgação é ilustrada pela facilidade com que podem ser formuladas uma variedade de composições farmacêuticas. Tipicamente, as composições são preparadas por mistura do componente esqueleto carregado positivamente com os componentes de interesse pretendidos (por exemplo, componentes ADN, de direcionamento, para imagiologia ou terapêuticos), em razões e numa sequência para obter composições que possuem uma carga final positiva variável. Em muitas concretizações, as composições podem ser preparadas, por exemplo, à cabeceira do doente, utilizando transportadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis para administração da composição. Em alternativa, as composições podem ser preparadas por mistura apropriada dos componentes, seguida de liofilização e armazenamento (tipicamente à temperatura ambiente ou abaixo dela) até serem usadas ou formuladas num veiculo de entrega adequado.
As composições podem ser formuladas para proporcionar misturas adequadas para administração tópica, cutânea, oral, retal, vaginal, parentérica, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraocular, transdérmica, etc.. As composições farmacêuticas contêm de preferência um veiculo que é farmaceuticamente aceitável para uma formulação injetável, em particular para injeção direta no órgão desejado, ou para administração tópica (na pele e/ou numa membrana mucosa). Em particular, elas poderão ser soluções estéreis isotónicas ou composições secas, particularmente composições criodessecadas, que, por adição, consoante o caso, de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de soluções injetáveis. Por exemplo, as doses de ácido nucleico usadas para a injeção e o número de administrações poderão ser adaptados de acordo com vários parâmetros e, em particular, de acordo com o modo de administração usado, a patologia em questão, o gene que será expresso ou, em alternativa, a duração pretendida do tratamento. Métodos de utilização das composições Métodos de entrega
As composições da presente divulgação podem ser entregues a um sujeito, célula ou sitio-alvo, in vivo ou ex vivo, utilizando uma variedade de métodos. De facto, é possível utilizar qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma composição em contacto essencial com o tecido que se pretende tratar. De preferência, as composições serão administradas com transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estão disponíveis e são bem conhecidos pelos peritos na especialidade métodos apropriados de administração desses compostos e, embora se possa usar mais de uma via para administrar uma composição particular, uma via particular pode muitas vezes proporcionar uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular que se pretende administrar, assim como pelo método particular usado para administrar a composição. Por conseguinte, existe uma ampla variedade de formulações de composições farmacêuticas do presente invento que são adequadas (ver, por exemplo, Remington ’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985). A administração pode ser, por exemplo, intravenosa, tópica, intraperitoneal, subdérmica, subcutânea, transcutânea, intramuscular, oral, intra-articular, parentérica, intranasal ou por inalação. Os locais de administração adequados incluem assim, embora não estejam limitados a estes, a pele, os brônquios, o trato gastrointestinal, o olho e o ouvido. As composições incluem tipicamente um transportador ou excipiente farmacêuticos convencionais e podem incluir adicionalmente outros agentes medicinais, transportadores, adjuvantes e similares. Preferencialmente, a formulação será cerca de 5% a 75% em peso de uma composição do invento, consistindo a restante percentagem em excipientes farmacêuticos adequados. Os excipientes apropriados podem ser adaptados à composição e via de administração particulares por métodos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).
As formulações podem adotar a forma de formas farmacêuticas sólidas, semissólidas, líquidas ou pós liofilizados tais como, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, soluções, suspensões, emulsões, supositórios, enemas de retenção, cremes, unguentos, loções, aerossóis ou similares. Em concretizações em que a composição farmacêutica adota a forma de uma pílula, comprimido ou cápsula, a formulação pode conter, juntamente com a composição biologicamente ativa, quaisquer dos seguintes: um diluente como lactose, sacarose, fosfato dicálcico e similares; um desintegrante como amido ou seus derivados; um lubrificante como estearato de magnésio e similares; e um aglutinante como amido, goma-arábica, polivinilpirrolidona, gelatina, celulose e seus derivados. As composições podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multidose, tais como ampolas ou frascos de vidro. As doses administradas a um doente deverão ser suficientes para promover uma resposta terapêutica benéfica no doente ao longo do tempo.
Em algumas concretizações, uma formulação de libertação sustentada pode ser administrada a um organismo ou a células em cultura e pode ser portadora das composições desejadas. A composição de libertação sustentada pode ser administrada ao tecido de um organismo, por exemplo, por injeção. 0 termo "libertação sustentada" significa que a composição, preferencialmente uma composição que codifica um transgene de interesse ou um agente terapêutico, é disponibilizada para assimilação pelo tecido circundante ou pelas células em cultura durante um periodo de tempo mais longo do que aquele que seria conseguido com a administração da composição num meio menos viscoso, por exemplo, uma solução de soro fisiológico.
As composições, sozinhas ou em combinação com outros componentes apropriados, podem ser preparadas em formulações aerossolizadas (isto é, podem ser "nebulizadas") para serem administradas por inalação. As formulações aerossolizadas podem ser colocadas em propulsores aceitáveis pressurizados, como diclorodifluorometano, propano, azoto e similares. No caso de entrega por inalação, as composições também podem ser entregues como um pó seco (por exemplo, Inhale Therapeutics).
As formulações adequadas para administração parentérica, por exemplo, pelas vias intravenosa, intramuscular, intradérmica e subcutânea, incluem soluções estéreis isotónicas para injeção, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do destinatário previsto, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, agentes de solubilização, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes.
Outros métodos de administração incluem, embora não exclusivamente, a administração utilizando balões para angioplastia, cateteres e formações de gel. Os métodos para entrega por balão para angioplastia, cateteres e formação de gel são bem conhecidos na técnica. Métodos de imagiologia
Um perito na especialidade compreenderá que as composições da presente divulgação podem ser adaptadas para uma variedade de utilizações em imagiologia. Numa concretização, é possivel realizar uma colonoscopia virtual usando o sistema à base de componentes para a obtenção de imagens. Atualmente, a colonoscopia virtual envolve essencialmente a infusão de contraste num cólon e a visualização das imagens em TC, reconstruindo depois uma imagem 3D. Técnicas similares podiam ser empregues para a RM. Contudo, as fezes, o muco e o ar atuam todos como barreiras ao contraste e podem originar uma superfície artificial na reconstrução da parede do cólon. A adição de um contraste que visasse as células ajudaria a ultrapassar estas barreiras para proporcionar uma verdadeira reconstrução da parede e ajudar a evitar tanto falsos positivos como falsos negativos. 0 sistema à base de componentes podia ser aqui aplicado de várias maneiras. Na forma mais simples, o esqueleto de eficiência catiónico podia ser aplicado com um único agente de contraste (TC ou RM) . Deste modo, a camada da superfície celular podia ser visualizada, e quaisquer irregularidades ou obstruções detalhadas na reconstrução da imagem. Contudo, o sistema à base de componentes oferece a opção adicional de adicionar um segundo agente específico. Este agente poderia consistir num esqueleto de eficiência catiónico, uma porção para imagiologia diferente e componentes de direcionamento (por exemplo, visando dois antigénios característicos do cancro do cólon). As porções para imagiologia (desde as simples até às de diagnóstico) podiam ser selecionadas de modo que uma fosse o contraste para TC e a outra o contraste para RM, ou de modo que ambas fossem o contraste para RM sendo uma delas um agente T2 e a outra um agente TI. Desta forma, a superfície podia ser reconstruída como anteriormente, e quaisquer regiões específicas para um antigénio tumoral podiam ser visualizadas e sobrepostas na reconstrução original. Adicionalmente, podiam incorporar-se também agentes terapêuticos no sistema de diagnóstico direcionado. Estratégias idênticas podiam ser aplicadas à enterite regional e à colite ulcerosa (e mais uma vez combinadas com terapia). EXEMPLOS Exemplo 1
Este exemplo ilustra a preparação e avaliação de uma composição possuindo um esqueleto carregado positivamente, um esqueleto carregado negativamente ao qual estão ligadas porções para imagiologia e um ADNc que codifica um transgene. A avaliação realiza-se in vitro.
Preparam-se os seguintes componentes: 1. um esqueleto carregado positivamente constituído por polilisina com Gly3Arg7 ligados por via do terminal amino da cadeia lateral das Lys ao terminal carboxi de Gly3Arg7, com um grau de saturação de 20%. Prepara-se uma solução da porção de esqueleto numa concentração de 1,5 mg/ml em tampão fosfato salino (PBS). 2. prepara-se um ADNc que expressa a proteína azul fluorescente sob o controlo de um promotor de citomegalovírus (CMV), que é usado numa concentração de 0,5 mg/ml em PBS. 3. utiliza-se um complexo de dextrano-DOTA-gadolínio (ver
Casali et al., Acad. Radiol. 5:S214-S218 (1998)) numa diluição de 1:2 em PBS.
Prepara-se a mistura (a) seguinte em triplicado: misturam-se 100 μΐ de "2" acima com 60 μΐ de "3" acima, dilui-se com 140 μΐ de PBS e coloca-se num agitador de vórtex durante 45 segundos.
Preparam-se três tubos diferentes com o seguinte conteúdo: (b) 400 μΐ de "1" acima, (c) 200 μΐ de "1" acima diluídos com 200 μΐ de PBS e (d) 100 μΐ de "1" acima diluídos com 300 μΐ de PBS.
Os três tubos são todos colocados no agitador de vórtex durante 45 segundos. Combina-se um tubo de "a" com cada um dos tubos "b", "c" e "d" e coloca-se no agitador de vórtex durante 90 segundos. Coloca-se uma porção de 200 μΐ de cada uma destas misturas combinadas num poço separado (em triplicado) de uma placa para cultura celular de 6 poços contendo células HA-VSMC (ATCC, Rockville, MD). Cada poço é previamente lavado uma vez com meio M-199 sem soro e sem corante, antes da transfeção. As misturas de células/agente de transfeção são incubadas a 37 °C numa camara humidificada com 10% de CO2 durante 4,5 horas, lavadas com meio M-199 e depois incubadas com 10% de FBS (soro bovino fetal). Visualize imediatamente por espectroscopia de RM para obter a distribuição inicial. Após 24 horas, repita a espectroscopia, depois remova as células da placa e utilize-as para análise de FACS baseada na proteína azul fluorescente para determinar a eficiência da transfeção.
Exemplo 2
Este exemplo ilustra a preparação de uma composição que é um complexo específico para um tumor visualizado portador de um gene citotóxico.
Preparam-se os seguintes componentes: 1. um esqueleto carregado positivamente constituído por polilisina com Gly3Arg7 ligados por via do terminal amino da cadeia lateral das Lys ao terminal carboxi de Gly3Arg7, com um grau de saturação de 20%. Prepara-se uma solução da porção de esqueleto numa concentração de 1,5 mg/ml em tampão fosfato salino (PBS). 2. um ADNc que expressa o gene da timidina-cinase do vírus Herpes simplex sob o controlo de um promotor de citomegalovírus (CMV) é usado numa concentração de 0,5 mg/ml em PBS. 3. o complexo de dextrano-DOTA-gadolínio é usado numa diluição de 1:2 em PBS. 4. conjugue um fragmento Fab específico para o antigénio tumoral desejado, numa taxa de saturação de 5%, com dextrano de gama de tamanho e concentração em PBS selecionadas para produzir uma razão de cargas negativas de 1:2 em relação ao componente "2" acima.
Prepare a mistura (a) seguinte em triplicado: 100 μΐ de "2" acima misturados com 60 μΐ de "3" acima e 100 μΐ de "4" acima, diluídos com 40 μΐ de PBS e colocados num agitador de vórtex durante 45 segundos. Prepare três tubos diferentes: (b) 400 μΐ de "1" acima, (c) 200 μΐ de "1" acima diluídos com 200 μΐ de PBS e (d) 100 μΐ de "1" acima diluídos com 300 μΐ de PBS. Coloque todos os três tubos no agitador de vórtex durante 45 segundos. Combine um tubo de "a" com "b" e coloque no agitador de vórtex durante 90 segundos para formar a mistura B. Combine um tubo de "a" com "c" e coloque no agitador de vórtex durante 90 segundos para formar a mistura C. Combine um tubo de "a" com "d" e coloque no agitador de vórtex durante 90 segundos para formar a mistura D. Utilize 200 μΐ de cada mistura juntamente com 200 μΐ de Pluronic F-127 (BASF) a 30% frio. Injete a solução combinada no espaço potencial criado pela biopsia de excisão do tumor putativo in vivo. Visualize por RM após o implante, após 1 dia e após 3 dias. Imediatamente após o implante, inicie a administração sistémica de ganciclovir de acordo com as diretrizes da FDA. Este sistema compósito proporciona a imagiologia de diagnóstico das células tumorais pretendidas, assim como uma terapia citotóxica para estas mesmas células. A distribuição do gel (Pluronic) é visualizada no tempo zero. Após 24 horas, o gel é degradado e o sinal do contraste concentra-se nos locais de microinvasão tumoral residual, assim como em locais "semeados" ao longo das vias de drenagem. A imagiologia do tumor residual é assim produzida. A atividade do ganciclovir estará concentrada nas áreas de assimilação da HSV-TK, pelo que também é produzida neste sistema uma terapia direcionada. A monitorização da resposta à terapia é igualmente produzida de forma idêntica por imagiologia.
Exemplo 3
Este exemplo ilustra o uso da estratégia multicomponentes para a transfeção em cultura de células.
Neste exemplo, utilizou-se uma placa de 6 poços para avaliar uma iteração da estratégia baseada em componentes. 0 esqueleto carregado positivamente foi montado conjugando -Gly3Arg7 com polilisina 150 000, por via do carboxilo da glicina terminal com a amina livre da cadeia lateral das Usinas, com um grau de saturação de 18% (isto é, 18 em cada 100 residuos de lisina são conjugados com um -GlysArg?) . O esqueleto resultante foi designado por NUNU-01.
Prepararam-se as seguintes misturas: 1) polilisina (150 000) numa razão de cargas de 4:1 com uma solução de 0,5 mg/ml de um plasmideo que expressa a proteina azul fluorescente sob o controlo de um promotor de CMV. 2) NUNU-01 numa razão de 15:1 com uma solução de 0,5 mg/ml de um plasmideo que expressa a proteina azul fluorescente sob o controlo de um promotor de CMV. 3) NUNU-01 numa razão de 10:1 com uma solução de 0,5 mg/ml de um plasmideo que expressa a proteina azul fluorescente sob o controlo de um promotor de CMV. 4) NUNU-01 numa razão de 4:1 com uma solução de 0,5 mg/ml de um plasmideo que expressa a proteina azul fluorescente sob o controlo de um promotor de CMV. 5) NUNU-01 numa razão de 1,25:1 com uma solução de 0,5 mg/ml de um plasmideo que expressa a proteina azul fluorescente sob o controlo de um promotor de CMV. 6) Superfect (Qiagen) de acordo com a recomendação do fabricante numa razão de cargas de 5:1 com uma solução de 0,5 mg/ml de um plasmideo que expressa a proteína azul fluorescente sob o controlo de um promotor de CMV.
Adicionou-se cerca de 1,0 ml de cada solução a células primárias do músculo liso da aorta humana HA-VSMC com 70% de confluência (passagem 21; ATCC, Rockville, MD), numa placa de 6 poços, e cresceu-se em meio M-199 com 10% de soro durante 48 horas. Obtiveram-se fotografias com baixa ampliação (lOx total) a 60 graus, 180 graus e 200 graus desde o topo de cada poço, utilizando um microscópio de epifluorescência Nikon E600 com um filtro para a proteína azul fluorescente e lentes planapocromáticas. Usou-se o pacote de software de análise de imagens Image Pro Plus 3.0 para determinar a percentagem da área celular total que era positiva e registou-se como eficiência da entrega génica. Os poços foram subsequentemente avaliados num ensaio de exclusão do corante (as células viáveis excluem o corante, ao passo que as não viáveis não conseguem fazê-lo), seguido de solubilização em SDS a 0,4% em tampão fosfato salino. As amostras foram avaliadas num espectrofotómetro UV/VIS Genesys 5 da Spectronic, a um comprimento de onda de 595 nm (azul), para quantificar as células não viáveis como uma medida direta da toxicidade do agente de transfeção.
Os resultados para as eficiências são os seguintes (média ± erro padrão): 1) 0,163 ± 0,106% 2) 10,642 ± 2,195% 3) 8,797 ± 3,839% 4) 15,035 ± 1,098% 5) 17,574 ± 6,807% 6) 1,199 ± 0,573%
Os ciclos n.° 4 e n.° 5 apresentam uma melhoria estatisticamente significativa (P<0,05 por ANOVA de medições repetidas a um fator, com teste post hoc de Fisher PLSD e TUKEY-A) da eficiência da entrega génica relativamente à polilisina sozinha e ao Superfect. Os dados de toxicidade média são os seguintes:
Solução salina - 0,057 A; 1) 3,460 A; 2) 0,251 A; 3) 0,291 A; 4) 0,243 A; 5) 0,297 A e 6) 0,337 A
Por conseguinte, é possível obter uma entrega génica mais eficiente e menos tóxica com uma razão de 1,25 a 4,0 entre NUNU-01 e ADN.
Exemplo 4
Este exemplo ilustra a entrega transdérmica de agentes terapêuticos usando composições da presente divulgação.
Biotinilação de K e KNR:
Esqueletos de polilisina (K) e polilisina à qual estão ligados grupos de eficiência (KNR) foram biotinilados com ésteres sulfo-NHS de biotina.
Materiais: Utilizaram-se as proteínas K e KNR, possuindo um PM = 112 000 aproximado, com Sulfo-NHS-LC-Biotina, PM = 556 (Pierce Scientific, Rockford, IL). Métodos: Utilizaram-se os mesmos cálculos e método para K e KNR, uma vez que ambas têm pesos moleculares similares. O método para KNR está especificado abaixo. 1. Preparou-se uma solução-mãe de KNR com uma concentração de 1 mg/ml (8,9 x IO-6 mmol/ml) em tampão fosfato salino. 2. Preparou-se uma solução-mãe de Sulfo-NHS-LC-Biotina com uma concentração de 10 mg/ml em água desionizada, imediatamente antes da utilização. A quantidade de reagente de biotina a adicionar para gerar um excesso molar de 40 vezes do reagente de biotina foi calculada para uma solução de proteina de 1 mg/ml. Cálculo: • moles de proteina x excesso molar 40x = mmol de Sulfo-NHS-LC-Biotina 8,9 x IO-6 mmol de dextrano x 40x = 3,57 x 10-4 mmol de reagente Sulfo-NHS-LC-Biotina a adicionar => 3,57 x IO-4 mmol de Sulf o-NHS-LC-Biotina x 556 (PM de Sulfo-NHS-LC-Biotina) = 1,98 mg de reagente Sulfo-NHS-LC-Biotina a adicionar
Deste modo, adicionaram-se 200 ml da solução-mãe de Sulfo-NHS-LC-Biotina (total de 2,0 mg) a 1,0 ml da solução-mãe de KNR. 3. Incubou-se o tubo de ensaio contendo a proteína e o reagente de biotina à temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Adicionou-se a mistura de reação a um microdialisador (limite de exclusão de peso molecular de 30 KD, Pierce, Scientific, Rockford, IL) e centrifugou-se a 4000xg para remover a biotina que não reagiu. Lavou-se e dialisou-se novamente com 2,0 volumes de PBS. Rotulou-se o produto "KNR-B".
Biotinilação da insulina: A insulina também foi biotinilada com ésteres sulfo-NHS de biotina.
Materiais: Insulina, PM = 5733,5 (Sigma Chemical,
St Louis, MO) e Sulfo-NHS-LC-Biotina, PM = 556 (Pierce Scientific, Rockford, IL). Métodos: 1. Preparou-se uma solução-mãe de insulina com uma concentração de 10 mg/ml (1,74 x IO-3 mmol/ml de insulina) em tampão fosfato salino. 2. Preparou-se uma solução-mãe de Sulfo-NHS-LC-Biotina com uma concentração de 10 mg/ml em água desionizada, imediatamente antes da utilização. Calculou-se a quantidade de reagente de biotina a adicionar para gerar um excesso molar de 12 vezes do reagente de biotina relativamente a uma solução de proteína de 1 mg/ml. Cálculo: • Calcularam-se as mmol de reagente de biotina a adicionar: moles de proteína x excesso molar 12x = mmol de reagente I, 74 x 10-3 mmol de insulina x 12x = 2,09 x IO-2 mmol de reagente Sulfo-NHS-LC-Biotina a adicionar => 2,09 x IO-2 mmol x 556 (PM de Sulf o-NHS-LC-Biotina) = II, 64 mg de reagente Sulfo-NHS-LC-Biotina a adicionar
Deste modo, adicionaram-se 1,164 ml da solução-mãe de Sulfo-NHS-LC-Biotina (total de 11,64 mg) a 1,0 ml da solução-mãe de insulina. 3. Incubou-se o tubo de ensaio contendo a insulina e o reagente de biotina à temperatura ambiente durante 30 minutos. Rotulou-se o produto "insulina-B".
Colheita de pele: A pele do dorso de um ratinho C57BL fêmea com 8 semanas de idade foi colhida para ser utilizada no tratamento transdérmico, de modo a verificar se o esqueleto e/ou a insulina biotinilados atravessam a pele. Método: 1. Após eutanasiar um ratinho C57 BL6 numa câmara de CO2, colheram-se aproximadamente 6 cm2 de pele dorsal do ratinho utilizando uma tesoura cirúrgica. 2. A pele foi dividida em seis pedaços uniformes e cada um deles foi colocado num poço de uma placa de 6 poços. 3. Adicionou-se meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) a cada poço da placa. 4. Preparou-se uma placa de 24 poços para fixar a pele colhida. Colocaram-se pequenos pedaços de esponja em cada poço. 5. Cortaram-se as amostras de pele colhida em cinco secções mais pequenas e colocou-se cada secção em cima da esponja. 6. Prenderam-se as bordas da pele colhida com quatro alfinetes. 7. Adicionou-se DMEM a cada poço, mas com cuidado para não submergir a pele colhida no meio. 8. Incubou-se a placa em gelo até os tratamentos estarem prontos para ser aplicados.
Preparação dos tratamentos transdérmicos: 1. Prepararam-se os seis tratamentos seguintes em 2 ml de loção Cetaphil (Galderma):
2. Para os tubos A a D, adicionaram-se 200 pg de KNR ou K em 2 ml de loção Cetphil a cada tubo e misturou-se uniformemente. Adicionou-se 1 ml de poli-L-lisina (K) sem biotina a cada tubo e misturou-se uniformemente. 3. Para o tubo E, adicionaram-se 200 pg de KNR em 2 ml de loção Cetaphil e misturou-se uniformemente. 4. Efetuou-se uma diluição de 200x da insulina biotinilada adicionando 5,11 pl a cerca de 995 pl de PBS.
Calculou-se a proteína dissolvida em PBS: KNR = 8,9 x 10“9 mol/ml K = 8,9 x 10"9 mol/ml Insulina = 1,74 x IO-6 mol/ml
Calculou-se a proteína nos tubos: KNR = 8,9 x 10_1° mol/ml K = 8,9 x 10_1° mol/ml 5. Para os tubos E e F, adicionaram-se 33 pl da solução de insulina biotinilada diluída e 70 pl de PBS e misturou-se uniformemente. 6. Para os tubos A e C, adicionaram-se 100 pl de insulina normal e misturou-se uniformemente. 7. Para os tubos B e D, adicionaram-se 33 pl de insulina normal e 70 pl de PBS e misturou-se uniformemente.
Pontos temporais dos tratamentos: 1. Retirou-se a placa contendo a pele colhida da incubação em gelo. 2. Aplicou-se cada tubo à coluna apropriada de amostras de pele fixada. 3. Transferiu-se a pele colhida para um congelador a -35°C no final de cada um dos pontos temporais de 15, 30, 60 minutos e 17 horas. Manteve-se a pele colhida congelada durante a noite. 4. Retiraram-se as amostras de pele congeladas e colocaram-se em incubação em gelo. 5. Cortaram-se as amostras de pele colhida que haviam sido congeladas aos pontos temporais indicados em três secções mais pequenas. 6. Transferiu-se uma secção para um tubo com formaldeido. 7. Transferiu-se uma segunda secção para um tubo vazio e colocou-se no congelador para armazenamento. 8. Congelou-se a terceira secção em composto O.C.T. (temperatura ótima de corte) em solução de acetona liquida e gelo seco. Colocaram-se as amostras congeladas no congelador para obter secções congeladas.
Material: NeutraAvidin™ conjugada com fosfatase alcalina (Pierce Scientific, Rockford, IL); tampão Tris-HCl, pH= 7,2 (Pierce Scientific, Rockford, IL); solução de NBT/BCIP (Pierce Scientific, Rockford, IL). Método: 1. Adicionaram-se 50 μΐ de NeutraAvidin™ e perfez-se o volume para 50 ml com tampão Tris-HCl. 2. Adicionou-se 1 ml da solução de NeutraAvidin™ e tampão a cada tubo com as amostras de pele colhida. 3. Processaram-se os tubos com as amostras de pele durante 1 hora na solução de NeutraAvidin™ e tampão. 4. Adicionou-se um 1 ml de NBT/BCIP a tubos vazios novos e rotulou-se cada tubo. 5. Retirou-se a pele da solução de NeutraAvidin™ e tampão. Lavou-se a pele com PBS quatro vezes e colocou-se nos tubos apropriados contendo NBT/BCIP. 6. Processaram-se os tubos com as amostras de pele durante 1 hora na solução de NBT/BCIP. 7. Lavou-se novamente a pele com 1 ml de PBS frio. 8. Armazenaram-se as amostras de pele colhida nos tubos rotulados. 9. Efetuou-se a bissecção das amostras de pele e fotografou-se a superfície bissetada.
Resultados:
As Figuras 3-10 ilustram fotomicrografias representativas dos resultados obtidos após 15 minutos (Figuras 3, 5, 7, 9) e 17 horas (Figuras 4, 6, 8, 10) de entrega da formulação A (Figuras 3 e 4), formulação C (Figuras 5 e 6) , formulação E (Figuras 7 e 8) e formulação F (Figuras 9 e 10). Os grupos de controlo que receberam complexos com K como esqueleto carregado positivamente apresentam uma transferência passiva de baixo nivel do esqueleto essencialmente para os foliculos (Figuras 5 e 6) , mas virtualmente nenhuma entrega de agente terapêutico (Figuras 7 e 8) . Em contrapartida, os grupos tratados com complexos contendo KNR apresentam um nivel elevado de entrega tanto do esqueleto (Figures 3 e 4) como do agente terapêutico (Figuras 9 e 10) a todos os niveis da epiderme e da derme. Assim, a formulação proporcionada neste exemplo permite a entrega transdérmica eficiente de um agente terapêutico.
Exemplo 5
Este exemplo ilustra a entrega direcionada de uma composição utilizando fragmentos F(ab)2 ligados.
Geral:
Clivou-se um anticorpo IgG para gerar um fragmento F(ab)2, purificando-se depois para remover o fragmento Fc e a IgG intacta. O fragmento F(ab)2 foi, em seguida, condensado com um dextrano ativado (oxidado) com grupos aldeido. Os grupos aldeido em excesso foram inativados com Tris, e os grupos hidroxilo livres foram fosforilados para gerar um dextrano-fosfato com uma carga muito negativa contendo fragmentos F(ab)2 ligados covalentemente (designado coletivamente por "componente de direcionamento"). Formou-se depois um complexo capaz de automontagem entre este componente de direcionamento, insulina e o esqueleto carregado positivamente possuindo um componente de eficiência ("KNR"). Em seguida, avaliou-se a capacidade do complexo automontado para melhorar a entrega do complexo a células portadoras do antigénio alvo.
Clivagem de F(ab)2:
Geraram-se fragmentos F(ab)2 que reconhecem células do músculo liso através da digestão com pepsina imobilizada (Pierce Chemical, Rockford, IL) de uma IgG dirigida contra a a-actina do músculo liso (clone 1A9, DAKO, Carpinteria, CA). Método: 1. Dialisou-se o clone 1A9, numa concentração de 1 mg/ml, contra um tampão acetato de sódio 20 mM a pH 4,5. 2. A pepsina imobilizada foi fornecida como uma suspensão aquosa a 50% (v/v) contendo 50% de glicerol em acetato de sódio 0,1 M (pH 4,5) mais 0,05% de azida de sódio. Misturou-se a suspensão de gel de pepsina-glicerol-água por inversão. 3. Adicionaram-se 0,25 ml da suspensão de pepsina imobilizada a 50% a um tubo de ensaio de vidro (0,125 ml de gel de pepsina imobilizada). 4. Adicionaram-se 4,0 ml de acetato de sódio 20 mM (pH 4,0) em água desionizada ("tampão de digestão"). Misturou-se bem por inversão. Separou-se o gel do tampão utilizando um separador de soro ou centrifugação a aproximadamente lOOOxg durante cinco minutos. Eliminou-se o tampão e repetiu-se este procedimento de lavagem com outros 4,0 ml de tampão. 5. Ressuspendeu-se a pepsina imobilizada em 0,5 ml de tampão de digestão. 6. Geração de fragmentos: Adicionou-se 1,0 ml da IgG 1A9 dialisada ao tubo contendo a pepsina imobilizada. Incubou-se o tubo num banho de água com agitação, a 37°C e velocidade elevada, durante quatro horas. Manteve-se uma mistura constante do gel durante a incubação. 7. Adicionaram-se 1,5 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 ao tubo de ensaio. Separaram-se os fragmentos F(ab')2 e Fc solubilizados e a IgG não digerida do gel de pepsina imobilizada, utilizando um tubo separador de soro. Centrifugou-se a lOOOxg durante cinco minutos e removeu-se o sobrenadante contendo os fragmentos.
Purificação de F(ab)2: A separação dos fragmentos F(ab)2 da IgG não digerida e dos fragmentos Fc foi efetuada utilizando uma coluna de proteína A imobilizada.
Materiais: Amostra de proteína constituída por pepsina + Tris-HCl; tampão A (NaH2P04 0,2 M (2,4 g utilizados), NaCl 0. 15.M (8,8 g utilizados), volume ajustado para 1 litro com H2O desionizada e pH ajustado para 8,0); tampão B (Na2HPC>4 0,2 M (0, 676 g) , ácido cítrico 0,1 M (22,5 ml), H2O desionizada (46,3 ml), pH ajustado para 4,5). Método: (Nota: utilização do tampão A). 1. Compactou-se a micropipeta com algodão tão uniformemente quanto possível. 2. Preparou-se uma suspensão 1:1 de resina em tampão A. (Adicionaram-se 1000 μΐ de tampão A à resina. Verteu-se 1 ml da suspensão na coluna. Permitiu-se que a coluna fluísse à medida que assentava. Uma vez assente, lavou-se a coluna com 10 ml de tampão A. 3. Adicionou-se lentamente a amostra de proteína à coluna. 4. Eluíu-se o fragmento F(ab)2 com 12 ml de tampão A. O volume total do eluato contendo F(ab)2 (incluindo carga da coluna) foi pois de 14,4 ml. 5. Eliminaram-se os fragmentos Fc e a IgG que não reagiu da coluna com 1,5 ml de tampão B. 6. Mediu-se e registou-se a absorvância utilizando um espectrofotómetro (Genesys 5 da Spectronic) para confirmar a presença da proteína nos eluatos. Os valores espectroscópicos registados foram os seguintes:
Concentração de F(ab)2: 0 eluato de F(ab)2 foi purificado e concentrado recorrendo à precipitação de proteinas por ácido tricloroacético (TCA). Método: 1. Adicionou-se um volume igual de TCA a 20% (p/v, em água desionizada, Sigma Chemical, St Louis, MO) ao eluato da coluna contendo F(ab)2. 2. Incubou-se a amostra durante 30 minutos em gelo. 3. Centrifugou-se a amostra numa microcentrifuga a 4000xg durante 15 minutos a 4°C. 4. Removeu-se cuidadosamente todo o sobrenadante. 5. Adicionaram-se 300 μΐ de acetona fria a cada tubo e centrifugou-se novamente a 4000xg durante 5 minutos a 4°C. 6. Removeu-se o sobrenadante e permitiu-se que o fragmento F(ab)2 secasse. 7. Suspendeu-se o depósito da proteína F(ab)2 em 1,0 ml de tampão fosfato salino.
Acoplamento de F(ab)2 a dextrano ativado com grupos aldeído:
Materials: Kit de acoplamento de dextrano ativado com grupos aldeído (Pierce, Rockford, IL) . [Nota: o dextrano ativado com grupos aldeído também pode ser gerado através de tratamento de dextrano com periodato.] Métodos: 1. Permitiu-se que o kit de acoplamento de dextrano ativado com grupos aldeído atingisse a temperatura ambiente. 2. Prepararam-se 0,5 ml de uma solução-mãe de cianoboro-hidreto de sódio com uma concentração de 64 mg/ml em tampão fosfato salino (32 mg em 0,5 ml). 3. Preparou-se 1,0 ml de uma solução-mãe de dextrano ativado com grupos aldeído com uma concentração de 5 mg/ml em tampão fosfato salino. 4. Adicionou-se 1,0 ml do fragmento F(ab)2 concentrado e purificado obtido acima a 1,0 ml da solução-mãe de dextrano ativado com grupos aldeído. 5. Adicionaram-se 0,2 ml da solução-mãe de cianoboro-hidreto de sódio à mistura de F(ab)2-aldeído. Misturou-se num agitador de vórtex e incubou-se durante a noite, na escuridão, à temperatura ambiente. 6. Após a incubação durante a noite, bloquearam-se quaisquer grupos aldeído remanescentes por adição de 0,5 ml de Tris-HCl 1,0 M (pH 7,2) à mistura reacional. Incubou-se a solução à temperatura ambiente durante 1 hora. 7. O produto foi rotulado "F (ab)2(aact)-d-t" com um volume total de 2,7 ml. 8. Efetuou-se um procedimento idêntico utilizando 1,0 ml de água desionizada em vez da mistura de F(ab)2. O produto foi rotulado "d-t" e representa um controlo que não visa um antigénio específico.
Fosforilação de F (ab) 2 (aact) -d-t: 1. Preparou-se uma solução-mãe de ácido polifosfórico (Acros Organics, Pittsburgh, PA) com uma concentração de 50 mg/ml em água desionizada. 2. Adicionaram-se 100 μΐ da solução-mãe de ácido polifosfórico a 1,0 ml de F(ab)2(aact)-d-t e incubou-se durante 60 minutos à temperatura ambiente. 3. Adicionou-se a mistura reacional a um microdialisador (limite de exclusão de peso molecular de 30 KD, Pierce, Scientific, Rockford, IL) e centrifugou-se a 4000xg para remover o ácido polifosfórico que não reagiu. Lavou-se e dialisou-se novamente com 2,0 volumes de PBS, pH 7,4. 0 produto foi rotulado "F(ab)2(aact)-d-t-p" e representa um polímero carregado negativamente com um fragmento F(ab)2 ligado para produzir o direcionamento. 4. Realizou-se um procedimento idêntico usando 1,0 ml de d-t em vez de F(ab)2(aact)-d-t. O produto foi rotulado "d-t-p" e representa um controlo de polímero carregado negativamente que não visa um antigénio específico.
Direcionamento da entrega de um complexo terapêutico a células portadoras de um antigénio particular (α-actina nas células do músculo liso): 1. Os coelhos Nova Zelândia brancos machos (3,0 - 3,5 kg) foram utilizados de acordo com as diretrizes institucionais e do NIH (n = 3 animais) . Sob anestesia geral (indução com cetamina/xilazina e manutenção com halotano), isolou-se a artéria femoral comum direita e expôs-se a circunferência da túnica adventícia. Introduziu-se um balão para angioplastia SAVVY 2 mm x 2 cm (Cordis, Miami, FL) via arteriotomia na artéria femoral superficial e avançou-se para o interior da artéria femoral comum. O balão foi insuflado para 6 atm em dois ciclos de 1 minuto e depois foi retirado. 2. 28 dias após a dilatação mecânica, as artérias foram submetidas a perfusão para fixação e colhidas. As artérias colhidas (cerca de 1,5 cm de comprimento) foram pós-fixadas em formalina neutra tamponada a 10% durante 12-16 horas e divididas em três segmentos iguais, antes da inclusão em parafina. Obtiveram-se cortes transversais seriados (5 pm) a partir da superfície proximal (cranial) de cada segmento. 3. Desparafinaram-se e reidrataram-se os cortes (n = 9 por grupo). Bloquearam-se os sítios de ligação não específicos com BLOTTO (Pierce Scientific, Rockford, IL) e lavou-se com tampão fosfato salino. 4. Rotularam-se os tratamentos como "IP" e "2P" para corresponder às seguintes composições de tratamento [Nota: "KNR-B" foi preparado como acima]:
Misturaram-se 180 μΐ de tampão fosfato salino, 5 μΐ de proteina terapêutica e 5 μΐ de agente de direcionamento (ambos com carga superficial final negativa) num tubo de microcentrifuga e agitou-se num agitador de vórtex durante 15 segundos. Adicionaram-se 10 μΐ de agente de direcionamento (carregado positivamente) e agitou-se imediatamente no agitador de vórtex durante 60 segundos. Utilizando métodos de lacuna capilar, incubaram-se os 9 cortes com IP ou 2P à temperatura ambiente durante a noite. 5. Enxaguaram-se as lâminas e incubaram-se durante a noite com uma diluição 1:100 de neutravidina conjugada com fosfatase alcalina (Pierce Scientific, Rockford, IL). 6. Enxaguaram-se as lâminas e incubaram-se em NBT/BCIP (Pierce Scientific, Rockford, IL; substrato para a fosfatase alcalina) durante 15 minutos. Enxaguaram-se com solução salina e fotografaram-se.
Como ilustrado na Figura 11, os cortes dos tratamentos IP revelam um aumento da coloração positiva (azul-violeta) na membrana média dos cortes transversais (composta essencialmente por células do músculo liso portadoras de niveis elevados de α-actina) em relação aos cortes tratados com 2P, que mostram uma coloração mais intensa na túnica adventícia e não revelam nenhuma melhoria em termos do direcionamento especifico para as células do músculo liso, como representado na Figura 12. Assim, os complexos portadores de F (ab) 2(aact)-d-t-p exibem aumentos relativos da entrega especifica às células do músculo liso, e a entrega de agentes terapêuticos pode, pois, ter melhorias direcionadas nas eficiências para células portadoras de antigénios particulares.
Lisboa, 2017-09-22

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Esqueleto carregado positivamente compreendendo: (a) um polipéptido linear carregado positivamente compreendendo polilisina; e (b) uma pluralidade de grupos de eficiência ligados de forma covalente ao referido polipéptido linear carregado positivamente; em que os referidos grupos de eficiência compreendem: (i) - (gly) ni~ (arg) n2, em que nl é um número inteiro de 0 a 20 e n2 é um número inteiro impar de 5 a 25; ou (ii) um domínio peptídico de TAT do VIH carregado positivamente, ou uma sequência de aminoácidos (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly) q ou (gly) p-YGRKKRRQRRR-(gly) q, em que p e q são, de modo independente, um número inteiro de 0 a 20, ligada ao esqueleto carregado positivamente por via do terminal C ou do terminal N da sequência de aminoácidos.
  2. 2. Esqueleto carregado positivamente de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos dos grupos de eficiência é (gly) P-RGRKKRRQRRR-(gly) q, e em que cada um dos indices inferiores p e q é, de modo independente, um número inteiro de 0 a 20.
  3. 3. Esqueleto carregado positivamente de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos dos grupos de eficiência é (gly) p-YGRKKRRQRRR-(gly) q, e em que cada um dos índices inferiores p e q é, de modo independente, um número inteiro de 0 a 20.
  4. 4. Esqueleto carregado positivamente de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos dos grupos de eficiência é - (gly) ni- (arg) n2, e em que (a) o índice inferior nl é um número inteiro na gama de 0 a 8, e o índice inferior n2 é um número inteiro ímpar na gama de 7 a 17; ou (b) o índice inferior nl é um número inteiro de 2 a 5, e o índice inferior n2 é um número inteiro ímpar na gama de 7 a 13.
  5. 5. Esqueleto carregado positivamente de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que a sequência de aminoácidos dos grupos de eficiência é -Gly3Arg7.
  6. 6. Esqueleto carregado positivamente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, em que cada um de p e q é, de modo independente, um número inteiro numa gama selecionada do grupo que consiste em (i) uma gama de 0 a 8; e (ii) uma gama de 2 a 5. Lisboa, 2017-09-22
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