PT2342227E

PT2342227E - Tratamento da leucemia linfoblástica aguda

Info

Publication number: PT2342227E
Application number: PT97604839T
Authority: PT
Inventors: Gerhard Zugmaier; Evelyn Degenhard
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2015-11-13
Also published as: JP5647132B2; EP2982696A3; AU2017219083A1; US20130323247A1; EP2342227B1; JP5955921B2; MX2011002927A; US20190300609A1; RS54456B1; PT2982696T; PL2982696T3; KR101695327B1; ME03480B; HRP20151168T1; EP2342227A1; SI2982696T1; HUE028175T2; WO2010052014A1; LT2982696T; SI2342227T1

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA" A invenção presente diz respeito a uma construção de um anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 para utilização num método para o tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) num paciente adulto que dela necessite.

As leucemias são proliferações neoplásicas clonais de células hematopoiéticas imaturas que são caracterizadas por diferenciação aberrante ou parada. As células de leucemia acumulam-se na medula óssea, acabando por substituir a maior parte das células hematopoiéticas normais. Isto origina a falha da medula óssea e as suas consequências de anemia, hemorragia e infecção. As células de leucemia circulam no sangue e noutros tecidos por todo o corpo (DeVita, Hellmann, Rosenberg. Cancer: principles and practice of oncology. Oitava edição. Library of Congress Cataloging-in-Publication Data, ISBN 0-781-72387-6). As leucemias agudas, que se podem agrupar em termos gerais como quer linfoblásticas, quer mieloblásticas, podem ser identificadas fenotipicamente e geneticamente, e são caracterizadas por um decurso clinico rápido que necessita de tratamento imediato. As leucemias agudas são derivadas de células progenitoras hematopoiéticas precoces. Em contraste, as leucemias crónicas possuem o fenótipo e o carácter biológico de células mais maduras (DeVita et al., loc. cit.) . Distingue-se a leucemia linfoblástica aguda (ALL) dos linfomas porque estes últimos parecem-se com células linfoides mais maduras e tipicamente habitam nos nodos linfáticos, no baço ou noutros locais extramedulares antes de se espalharem pela medula óssea. Determinados linfomas tais como os linfomas linfoblásticos ou os linfomas de Burkitt mantêm caracteristicas tanto das leucemias como dos linfomas, mas são derivados de células progenitoras imaturas e necessitam de uma terapia semelhante à que se utiliza para a leucemia linfoblástica aguda (ALL). Outros linfomas podem no entanto espalhar-se largamente ao sangue e à medula óssea, e podem ser descritos nessa sua fase como linfomas leucémicos mas não são leucemias verdadeiras (De Vita et al., loc. cit.) . A leucemia linfoblástica aguda é uma doença maligna relativamente rara. A incidência total da leucemia linfoblástica aguda (ALL) é de 1,1/100.000 ao ano. A incidência apresenta o seu pico durante a infância, decrescendo continuamente à medida que aumenta a idade. A partir da idade de 35 anos a incidência volta a aumentar e observa-se um segundo pico a partir da idade de 80 anos (2,3/100.000 ao ano) (Hoelzer e Gõkbuget; Der Onkologe 12 (2006); 983-1002). Embora a etiologia da leucemia linfoblástica aguda (ALL) não seja clara, trata-se de um dos neoplasmas mais cuidadosamente estudados e mais bem caracterizados. Os subgrupos da leucemia linfoblástica aguda (ALL) são definidos sobretudo por imunofenotipagem, citogenética e genética molecular. A leucemia linfoblástica aguda (ALL) de linhagem B com 74 % dos casos inclui a maioria de todas as ALL. Setenta por cento de todas as ALL são ALL com precursores B e 4 % são ALL de células B maduras. As ALL de linhagem T corresponde a 26 % de todas as ALL (Hoelzer e Gõkbuget; Der Onkologe 12 (2006); 983- 1002) .

No início da década de 1980, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) em adultos era uma doença raramente curável com uma taxa global de sobrevivência inferior a 10 %. Depois de se utilizarem regimes adaptados administrados por grupos pediátricos, o resultado melhorou para 30-40 %. A um período de estagnação seguia-se melhoria apenas em subgrupos distintos. No entanto, nos últimos cinco anos, têm sido feito progressos nos diagnósticos moleculares da leucemia linfoblástica aguda (ALL). A transplantação de células estaminais (SCT) tem melhorado os resultados na leucemia linfoblástica aguda (ALL) e tem tornado o tratamento mais possível. Embora estejam em avaliação diversos fármacos alvejantes, ainda não estão disponíveis terapias eficazes alvejantes para a leucemia linfoblástica aguda (ALL). O diagnóstico rápido e a classificação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) é cada vez mais importante para identificar prognósticos e subconjuntos de genética molecular que serão o foco do tratamento alvejante (Hoelzer e Gõkbuget; Hematology (2006); 133-141). O cromossoma de Philadelphia (Ph), resultado e uma translocação reciproca fundindo o proto-oncogene abl do cromossoma 9 com as sequências da região aglomerada do ponto de quebra do cromossoma 22, foi a primeira translocação específica de um neoplasma que foi identificada. A translocação (9;22) é a aberração genética mais frequente na leucemia linfoblástica aguda (ALL) em adultos. Ela encontra-se em 20-30 % dos doentes. A incidência aumenta com a idade, aproximando-se de 50 % nos doentes com mais do que 50 anos de idade. Nos estudos clínicos anteriores, os doentes mais velhos encontravam-se pouco representados, devido à futilidade atribuída ao seu tratamento, mas esta convicção tem-se vindo a alterar com a disponibilidade de novas opções de tratamento. Nomeadamente, ela encontra-se quase exclusivamente na leucemia linfoblástica aguda CD10+ de células B precursoras (c-ALL e pre-B ALL); as raras menções acerca da sua presença em ALL de linhagem T podem representar leucemia mieloide crónica (CML) em crises de blastos linfoides e não verdadeira Ph+ ALL. Clinicamente, os doentes que apresentam além de uma contagem variável de células brancas (WBC), uma expressão à superfície de antigénios CD19, CD10 e CD34, e frequente co-expressão de marcadores mieloides, por exemplo, CD13 e CD33, denotam um maior risco de desenvolver leucemia meníngica. O prognóstico em doentes adultos com Ph+ ALL tratada apenas com quimioterapia é fraco, com uma probabilidade de sobrevivência a longo termo inferior a 10 %. Atentas as consequências desfavoráveis usando quimioterapia, considera-se hoje em dia a transplantação de células hematopoiéticas alogénicas (HSCT) como sendo o tratamento a escolher para a Ph+ ALL em adultos. Têm sido reportadas taxas de sobrevivência a longo termo de 12 % a 65 % para doentes submetidos a SCT na primeira remissão completa (CR), indicando que este procedimento é potencialmente curativo. No entanto, cerca de 30 % destes doentes sofrem recaídas (Ottmann e Wassmann; Hematology (2005), 118-122). A presença de células de leucemia em quantidades inferiores ao limite de detecção (5 % de células de leucemia) é definida como doença residual mínima (MRD) . Sem MRD detectável (<10-4, isto é < 1 célula leucémica por 104 células de medula óssea), atinge-se uma remissão molecular completa. Nos últimos anos, uma série de estudos de retrospectiva mostrou que a MRD na leucemia linfoblástica aguda de adultos é um factor prognóstico independente, tal como já se havia demonstrado para a leucemia infantil. As ferramentas de diagnóstico da MRD são a reacção de polimerase em cadeia (PCR) e/ou a citometria de fluxo. A análise por PCR consegue detectar transcritos de fusão tais como bcr/abl e transposições clonais individuais das imunoglobulinas (IgH) e/ou genes receptores de células T (TCR) . Cerca de 25 % dos doentes com doença residual mínima (MRD) definida por transposição incluem um grupo de alto risco com uma taxa de recaída de 94 % adentro de 3 anos. Em geral, a diminuição da MRD ocorre mais devagar nos adultos do que em crianças. A tomada de decisão acerca da intensificação do tratamento por transplantação de células estaminais de sangue periférico (PBSCT) ocorre portanto cedo demais após o tratamento de indução. No entanto, depois do início da consolidação, a doença residual mínima (MRD) em qualquer momento ao longo do tempo está associada a um risco de recaída elevado (Bruggemann et al., Blood 107 (2006), 1: 116-1123; Raff et al. , Blood 109 (2007), 910-915). O tratamento de doentes adultos com leucemia linfoblástica aguda (ALL) tem-se tornado cada vez mais complexo devido à introdução de diversos protocolos de tratamento para diferentes subtipos da doença, reflectindo a intenção de conceber terapias óptimas específicas para entidades de doença adaptadas ao risco.

Anderson et al. (Blood J. 80 (1992) : 2826-34)

descrevem um heteroconjugado biespecífico de um anticorpo anti-CD19 e um anti-CD3, que se afirma despoletar a lise das células de leucemia linfoblástica aguda. JEHA SIMA, SEMINARS IN HEMATOLOGY 2009, 46: 76-88, revê as terapias de ALL. Têm sido conseguidas melhorias recentes introduzindo novos princípios terapêuticos, tais como a introdução precoce do inibidor de tirosina quinase imatinib em ALL positiva para Ph (Ph+) (Lee et al., Blood 102 (2003), 3068-3070) ou a utilização do anticorpo anti-CD20 rituximab em casos de CD20+ de ALL com linhagem B (veja-se, por exemplo, Griffin et al., Pediatr. Blood Cancer 2008) . Conseguiram-se melhorias de diagnóstico avaliando o nível da doença residual mínima (MRD) , quer por métodos de genética molecular, quer por citometria de fluxo, que se demonstrou ter poder previsional para o resultado numa série de estudos em crianças (veja-se, por exemplo, Cave et al., N.

Engl. J. Med. 339 (1998), 591-598) e em adultos (veja-se, por exemplo, Briiggemann et al., Blood 107 (2006), 1116- 1123). As taxas de sobrevivência com os protocolos modernos de tratamento para a leucemia linfoblástica aguda (ALL) em doentes adultos atingiram um nível constante no qual os benefícios potenciais de regimes quimioterapêuticos mais agressivos é amiúde compensado por uma mortalidade em excesso devida a complicações, tornando deste modo ainda mais importantes os esforços para individualizar tratamentos. Enquanto os doentes em risco padrão sem factores de risco convencionais, que têm uma probabilidade superior a 50 % de sobrevivência a longo termo apenas com quimioterapia (Hoelzer et al., Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program 1 (2002), 162-192) são levados potencialmente a um risco desnecessário por terapia intensificada e prolongada, o resultado para doentes com recaídas de leucemia linfoblástica aguda (ALL) é extremamente fraco, mesmo quando se consegue uma segunda remissão. Num estudo recente, a monitorização da doença residual mínima (MRD) durante o primeiro ano de quimioterapia intensiva levou a uma estratificação do risco baseada em MRD (Bruggemann et al. (2006), loc. cit.). Esta classificação permitiu a identificação de um grupo com pequeno risco de MRD constituído por cerca de 10 % dos doentes que apresentam uma probabilidade mínima de recaída até aos 3 anos, um grupo de alto risco de MRD com cerca de 25 % dos doentes, com um risco de recaída de quase 100 %, e um grupo em risco intermédio de MRD. Neste último grupo, cerca de 30 % dos doentes recairão eventualmente apesar de se terem tornado negativos para MRD ou de atingirem níveis de MRD inferiores aos 10~4 no final do primeiro ano de terapia.

Estes dados mostram que a leucemia lintoblástica aguda (ALL) continua a ser para a maioria dos doentes uma doença fulminante e incurável. Nestas condições, existe uma necessidade urgente de melhores terapias da ALL. A invenção presente proporciona uma construção de um anticorpo de cadeia singela, biespecífico CD19xCD3, para utilização num método para o tratamento, melhoria ou eliminação da ALL num doente adulto que dele necessite. Numa concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) é uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) com linhagem B, preferivelmente uma leucemia linfoblástica aguda de precursor B. A leucemia linfoblástica aguda (ALL) de linhagem B inclui a maioria de todas as ALL, com 74 % dos casos. Setenta por cento de todas as ALL são ALL de precursor B e 4 % são ALL de células B maduras. Uma vez que o anticorpo de cadeia singela, biespecífico CD19xCD3 descrito neste documento é dirigido contra o marcador CD19 associado a células B, o anticorpo referido é especialmente adequado como agente terapêutico para a leucemia linfoblástica aguda de linhagem B, preferivelmente para as ALL com precursor B que se podem ainda subdividir em ALL pro-B, ALL pre-B e ALL comum (cALL). A administração do anticorpo CD19xCD3 biespecífico de cadeia singela (também denominado blinatumomab ou MT103) descrito em mais pormenor adiante, proporciona pela primeira vez uma via terapêutica que permite o tratamento da doença residual minima em doentes com leucemia linfoblástica aguda (ALL). Tal como se ilustra no exemplos que se seguem e na Figura 1, o anticorpo CD19xCD3 biespecifico de cadeia singela (cuja sequência de ácido nucleico e cuja sequência de aminoácidos estão representadas respectivamente nas SEQ ID N0S. 2 e 1) foi concebido de modo a se ligar a células T expressando CD19 como células alvo, originando uma resposta citotóxica e não restringida de células Tea activação de células T. Recentemente, demonstrou-se num estudo de fase I uma actividade clinica significativa do anticorpo CD19xCD3 biespecifico de cadeia singela para recaídas de linfoma não Hodgkin a células B (NHL) (Bargou et al., Science 321 (2008) : 974-7) . Com base nestes resultados, foi concebido um estudo de fase II em colaboração como Grupo Alemão de Estudo Multicêntrico sobre a Leucemia Linfoblástica Aguda em Adultos (GMALL), para investigar a eficácia, a segurança, e a tolerabilidade do anticorpo CD19xCD3 biespecifico de cadeia singela em doentes com leucemia linfoblástica aguda (ALL) que haviam conseguido uma remissão hematológica completa, mas ainda eram portadores de doença residual mínima (MRD). A MRD é um factor independente de prognóstico que reflecte a resistência primária ao fármaco e que está associado a um elevado risco de recaída depois do início da consolidação. Avaliou-se a MRD com métodos padrão, quer por detecção quantitativa de transposições individuais de imunoglobulinas ou de receptores de células T (TCR), translocações t(4;ll), ou por transcritos de fusão bcr/abl (veja-se por exemplo Van der Velden et al. , Leukemia 18 (2004), 1971-80). A população em estudo inclui doentes adultos com leucemia linfoblástica aguda (ALL) com precursor B, que denotam um sinal bcr/abl de t(4;ll) acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição com uma sensibilidade de >10~4. O ponto final primário do estudo de fase II em curso é a taxa de conversão a um estado negativo para a doença residual minima (MRD), tal como definido por um sinal de bcr/abl ou de t(4;ll) inferior ao limite de detecção, e/ou por detecção de transposições individuais de imunoglobulinas ou de genes de receptores de células T (TCR) inferior a 1CT4. Um ciclo de tratamento com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela é uma infusão endovenosa continua de 4 semanas, à qual se pode seguir uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas, após o primeiro ciclo, ou ciclos repetidos após um intervalo de 2 semanas isento de tratamento. A dosagem do anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela é de 15 micrograma/m2/24 h, sendo permitido um aumento de dose em determinados doentes até 30 micrograma/m2/24 h. Controla-se o estado face à doença residual minima (MRD) após cada ciclo de tratamento. Os doentes que atingem negatividade da MRD podem receber ciclos de tratamento adicionais.

Até à data foram tratados dezassete doentes adultos com ALL, ou estão ainda em tratamento, com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela. Destes, 14 doentes receberam o nível de dose de 15 micrograma/m2/24 h do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela, enquanto para três doentes se escalou a dose de 15 para 30 micrograma/m2/24 h após o primeiro ciclo de tratamento ou de ciclos adicionais. Todos estes doentes com ALL apresentavam doença residual mínima (MRD): Onze deles manifestavam MRD por transposições em imunoglobulinas ou por TCR, dois doentes apresentavam translocações t(4;ll) e quatro doentes apresentavam transcritos de fusão bcr/abl.

Em resultado, a resposta de MRD era avaliável em 16 dos 17 doentes. 13 dos 16 doentes tornaram-se negativos face a MRD, o que corresponde a uma taxa de resposta molecular completa extraordinária de 81 %. Mais especificamente, em nove de entre onze doentes com transposições em imunoglobulinas ou TCR, em um de dois doentes com translocações t(4;ll) e em três de quatro doentes com transcritos bcr/abl, conseguiu atingir-se negatividade de MRD. A duração mais longa da negatividade para MRD observada até à data num doente que não recebeu nenhuma transplantação após o tratamento com o anticorpo é de 41 semanas. Outro doente tratado com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela e atingindo negatividade de MRD entre 23.06.2008 e 27.10.2008, tendo recebido com sucesso um transplante de células estaminais alogénicas permanece isento de recaída até à data.

De uma forma notável, os doentes bcr/abl que podiam ser tratados com sucesso com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela eram refractários ou intolerantes aos inibidores de tirosina quinase imatinib e/ou a dasatinib num regime anterior de tratamento de ALL. Por exemplo, um dos indivíduos com resposta bcr/abl ao tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela apresentava uma mutação a T315I que era refractária à terapia com inibidores de tirosina quinase. Deste modo, a administração do anticorpo biespecífico CDl9xCD3 de cadeia singela proporciona agora pela primeira vez uma terapia para doentes com ALL refractários a imatinib e/ou dasatinib com transcritos bcr/abl. Só três de um total de 17 doentes não atingiram negatividade para MRD. No entanto, em dois deles conseguiu atingir-se uma doença estável. Um doente apenas apresentou uma recaída testicular seguida por uma recaída hematológica, passadas 19 semanas de negatividade face a MRD. Um doente não foi avaliável devido a um acontecimento adverso sério (SAE) no dia 2 do estudo.

Em resumo, conseguiu atingir-se uma taxa de resposta molecular completa absolutamente excepcional de 81 % em doentes adultos com ALL de precursor B ao tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela. Foi possível observar a actividade do anticorpo mencionado em todos os subconjuntos de doentes com ALL que se trataram, incluindo doentes bcr/abl refractários a tirosina quinase (T315I) e doentes com translocações t(4;ll). Estes subconjuntos de doentes com ALL são em geral considerados incuráveis recorrendo à terapia padrão convencional de ALL, excepto através da opção de HSCT alogénica. Além disto, o tratamento com anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela denota um perfil de toxicidade favorável, em contraste com as terapias convencionais de ALL, tais como a quimioterapia. À luz destes factos, a administração do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela descrita neste documento proporciona uma opção de tratamento nova e vantajosa para a leucemia linfoblástica aguda (ALL) em adultos, em especial para os casos em que a ALL é refractária à terapia convencional para ALL, tal como quimioterapia e/ou HSCT alogénica. Além disto, a administração do adulto proporciona agora pela primeira vez uma terapia para ALL positiva para MRD. 0 método da invenção presente proporciona as seguintes vantagens principais: 1. Menos efeitos adversos do que as terapias convencionais de leucemia linfoblástica aguda (ALL), incluindo a quimioterapia ou a HSCT alogénica. As terapias convencionais de ALL estão associadas a riscos de saúde consideráveis para os doentes; veja-se, por exemplo, Schmoll, Hõffken, Possinger: Kompendium Internistische Onkologie, pág. 2660 e segs.; 4. Auflage, Springer Medizin Verlag Heidelberg). 2. Embora a HSCT alogénica seja hoje em dia considerada o tratamento de escolha para a ALL Ph+ dos adultos, cerca de um terço dos doentes tratados recai. Os doentes com ALL Ph+ denotam o risco mais elevado de recaída, de entre todos os doentes adentro dos subtipos de ALL. Tal como se ilustra nos exemplos que se seguem, a administração do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela é especialmente apropriada para doentes adultos com ALL com doença residual mínima (MRD). Estes incluem a doença residual mínima (MRD) definida pela translocação do cromossoma Philadelphia bem como a MRD definida por transposições em imunoglobulinas ou TCR, ou t(4;ll) . Os doentes adultos com ALL, não elegíveis para transplantação de medula óssea, portadores de t(4;ll) ou os doentes com ALL Ph+ refractários têm até à data sido considerados como incuráveis. Os métodos farmacêuticos da invenção proporcionam portanto uma via terapêutica para o tratamento, a melhoria ou a eliminação da MRD em ALL de adultos, diminuindo deste modo ou mesmo abolindo, o risco de uma recaída do doente. Vale a pena anotar-se que o tratamento curativo dos doentes com ALL positiva para MRD ainda não se encontrava disponível, até agora. 3. Em especial, pode utilizar-se o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela para terapia da leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para MRD, refractária para a terapia convencional da ALL, tal como quimioterapia, administração de inibidores de tirosina quinase, e/ou HSCT. 4. Não só o anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela substituir as terapias convencionais para a leucemia linfoblástica aguda (ALL) em doentes não elegíveis para a HSCT alogénica, como também se pode utilizar para transformar doentes com ALL elegíveis para a referida transplantação a um estado negativo para MRD, uma vez que os doentes negativos para MRD apresentam um menor risco de recaída após transplantação do que os doentes positivos para MRD. 5. A elevada actividade citotóxica do anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela permite a eliminação das células leucémicas na medula óssea. A leucemia linfoblástica aguda (ALL), incluindo a leucemia linfoblástica aguda de precursor B e outros tipos de ALL com linhagem B (célula) , bem como os tratamentos para eles, foram revistos por exemplo em Pui e Evans, N. Engl. J. Med. 354 (2006), 166-178; Hoelzer e Gõkbuget; Hematology (2006); 133-141; ou Apostolidou et al. , Drugs 67 (2007), 2153-2171. Também se pode obter informação acerca de ALL por exemplo em http://www.cancer.gov, http://www.wikipedia.org ou em http://www. leukemia- lymphoma . org. 0 termo "anticorpo biespecifico de cadeia singela" ou "anticorpo de cadeia singela biespecifico", ou os termos relacionados consoante a invenção presente, significam construções de anticorpo resultantes da ligação entre pelo menos duas regiões variáveis numa única cadeia polipeptidica isenta de porção constante e/ou da porção Fc presentes em imunoglobulinas completas. Um "agente de ligação", tal como se utiliza neste documento, liga domínios V com a mesma especificidade, enquanto um "espaçador", tal como se utiliza neste documento, liga domínios V com especificidades diferentes. Por exemplo, um anticorpo biespecifico de cadeia singela pode ser uma construção com no total duas regiões variáveis de anticorpo, por exemplo duas regiões VH, cada uma delas capaz de se ligar especificamente a um antigénio diferente, e ligadas uma à outra através de um polipéptido curto (geralmente menos do que 10 aminoácidos) sintético, um espaçador de tal modo que as duas regiões variáveis de anticorpo com o espaçador interposto existam sob a forma de uma única cadeia polipeptidica contígua. Outro exemplo de um anticorpo biespecifico de cadeia singela pode ser uma única cadeia polipeptídica com três regiões variáveis de anticorpo. Neste caso, duas das regiões variáveis de anticorpo, por exemplo uma VH e uma VL, podem constituir uma scFv, em que as duas regiões variáveis de anticorpo se ligam uma à outra por um polipéptido espaçador sintético, sendo este último amiúde geneticamente transformado de modo a ser minimamente imunogénico enquanto mantém uma resistência máxima à proteólise. Esta scFv é capaz de se ligar especificamente a um determinado antigénio, e está ligada a mais uma região variável de anticorpo, por exemplo uma região VH, capaz de se ligar a um antigénio diferente daquele a que se liga a scFv. Outro exemplo ainda de um anticorpo biespecífico de cadeia singela pode ser uma única cadeia polipeptídica com quatro regiões variáveis de anticorpo. Neste caso, as duas primeiras regiões variáveis de anticorpo, por exemplo uma região VH e uma região VL, podem formar uma scFv capaz de se ligar a um antigénio, enquanto a segunda região VH e a segunda região VL podem formar uma segunda scFv capaz de se ligar a outro antigénio. Adentro de uma única cadeia contígua polipeptídica, as regiões variáveis de anticorpos individuais com uma determinada especificidade podem vantajosamente estar separadas por um agente de ligação polipeptídico sintético tal como se descreveu acima, enquanto as scFv respectivas podem vantajosamente estar separadas por espaçadores polipeptídicos curtos tal como se descreveu acima. São ilustrados exemplos não limitativos de anticorpos biespecíficos de cadeia singela bem como de métodos para os produzir em WO 99/54.440, WO 2004/106.381, WO 2007/068.354, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 396,5-70; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-5; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-7; Lõffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-103; Brúhl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426.

Tal como se utiliza neste documento, "CD3" denota um antigénio que está expresso em células T, preferivelmente células T humanas, fazendo parte do complexo receptor multimolecular de células T, sendo a CD3 constituída por cinco cadeias diferentes: CD3-epsilon, CD3-gama, CD3-delta, CD3-eta e CD3 zeta. A aglomeração da CD3 nas células T, por exemplo por anticorpos anti-CD3, leva a uma activação das células T semelhante à da ligação a um antigénio mas independente da especificidade clonal do subconjunto de células T. Deste modo, o termo "anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela", tal como se utiliza neste documento, diz respeito a uma construção específica para CD3, capaz de se ligar ao complexo humano de CD3 expresso nas células T humanas e capaz de induzir a eliminação/lise de células alvo, em que as referidas células alvo possuam/apresentem um antigénio que seja ligado à outra porção do anticorpo biespecífico de cadeia singela que não se liga a CD3. A ligação ao complexo de CD3 por agentes que se liguem especificamente a CD3 (por exemplo um anticorpo biespecífico de cadeia singela tal como se administra consoante os métodos farmacêuticos da invenção) leva a uma activação das células T tal como é conhecida na técnica; vejam-se, por exemplo, WO 99/54.440 ou WO 2007/068.354. Portanto, uma construção apropriada para os métodos farmacêuticos da invenção é vantajosamente capaz de eliminar/lisar células alvo in vivo e/ou in vitro. As células alvo correspondentes incluem as que expressam um antigénio tumoral, tal como CD19, que seja reconhecido pela segunda especificidade (isto é, pela porção que não se liga a CD3 do anticorpo biespecífico de cadeia singela) da construção mencionada. Preferivelmente, a segunda especificidade referida é para a CD19 humana que já foi descrita em WO 99/54.440, WO 2004/106.381 ou em WO 2007/068.354. De acordo com esta concretização, cada porção especifica para um antigénio do anticorpo biespecífico de cadeia singela inclui uma região VH de anticorpo e uma região VL de anticorpo. Uma variante vantajosa deste anticorpo biespecífico de cadeia singela é, do terminal N para o terminal C: VL (CD19)— VH (CD19)—VH(CD3)—VL(CD3) (SEQ ID NO.: 1).

Adentro do significado da invenção, o termo "ligando-se especificamente" ou os termos relacionados tais como "especificidade" é/são para serem entendidos como sendo caracterizados sobretudo por dois parâmetros: um parâmetro qualitativo (o epítopo a que se ligam, ou aonde se liga um anticorpo) e um parâmetro quantitativo (a afinidade de ligação, ou com que força se liga este anticorpo aonde se vai ligar). Qual o epítopo a que se liga um anticorpo pode ser vantajosamente determinado por exemplo por metodologia FACS, ELISA, mapeamento de epítopos com pontos de péptidos, ou espectrometria de massa. A força com que um anticorpo se liga a um determinado epítopo pode ser vantajosamente determinada por exemplo por metodologias conhecidas Biacore e/ou ELISA. Uma combinação de tais técnicas permite calcular a razão sinal:ruído como medida representativa da especificidade de ligação. Nessa razão sinal:ruído, o sinal representa a força de ligação do anticorpo ao epítopo de interesse, enquanto o ruído representa a força com que o anticorpo se liga a outros epítopos não relacionados que difiram do epítopo de interesse. Uma razão sinal:ruído de, por exemplo, pelo menos 50, mas preferivelmente de cerca de 80 para um epítopo respectivo com interesse tal como determinado por exemplo por Biacore, ELISA ou FACS, pode ser tomada como uma indicação de que o anticorpo em avaliação se liga ao epítopo de interesse de um modo específico, isto é, é um "agente de ligação específico". O termo "ligando-se a/interactuando com" também pode relacionar-se com um epítopo conformacional, um epítopo estrutural ou um epítopo descontínuo constituído por duas ou ainda mais regiões das moléculas alvo humanas ou suas partes. Um epítopo conformacional é definido por duas ou mais sequências de aminoácidos discretas separadas da sequência primária, que estão em conjunto à superfície da molécula quando o polipéptido se dobra à proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553-6). O termo "epítopo descontínuo" significa epítopos não lineares que são montados a partir de resíduos provenientes de regiões distantes da cadeia polipeptídica. Estes resíduos juntam-se à superfície da molécula quando a cadeia polipeptídica se dobra a uma estrutura tridimensional para constituir um epítopo conformacional/estrutural. O termo "tratamento", tal como utilizada neste documento, significa no sentido mais alargado procedimentos medicinais ou aplicações que se destinam a aliviar uma doença. No caso presente, a administração do anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela (preparado para administração a um doente adulto com ALL) tal como descrita neste documento destina-se ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença ALL em doentes adultos. 0 termo "doente", tal como se utiliza neste documento, refere-se um doente humano adulto. Os termos "adulto com ALL" ou "doente adulto com ALL" ou "doente adulto", tal como referidos neste documento, denotam adultos com mais do que 18 anos de idade, isto é doentes com idades de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, ou 50 anos ou mais. Mesmo os doentes com 70, 75, 80, 85, 90, 100 anos ou mais velhos podem ser tratados pelos métodos da invenção. A idade indicada deve ser entendida como a idade do adulto na data de diagnóstico da doença ALL. O termo "melhoria", tal como utilizado neste documento, é sinónimo com melhora. Quando o estado de um doente adulto com ALL melhora, o doente estará claramente melhor - existe alguma melhoria do seu estado. Por exemplo, pode ocorrer uma melhoria do estado do doente com ALL, caso se consiga uma estabilização da doença ALL (que também se denomina doença estável), isto é, a doença ALL já não será progressiva. Ainda mais, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para MRD é transformada a um estado negativo para MRD. 0 termo "eliminação", tal como é utilizado neste documento, significa a remoção de células leucémicas do corpo de um doente adulto com ALL. Tal como se mostra no exemplo que se segue, a administração do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela é capaz de transformar leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para MRD na doença negativa para MRD em diversos de ALL. 0 termo "administração", tal como se utiliza neste documento, significa a administração de uma dose eficaz do ponto de vista terapêutico do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela mencionado acima a um indivíduo, isto é, a um doente humano. 0 doente com ALL referido neste documento é um doente adulto, tal como se define neste documento.

Por "quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico" pretende significar-se uma dose que produza os efeitos para os quais é administrada, preferivelmente a transformação de um estado de leucemia linfoblástica aguda (ALL) positivo para doença residual mínima (MRD) para um estado de ALL negativo para MRD. A dose exacta dependerá do objectivo do tratamento, e será determinável por um entendido na técnica recorrendo a metodologias conhecidas. Tal como se sabe na técnica e se descreveu acima, podem ser necessários ajustamentos para uma administração sistémica em relação a uma localizada, para a idade, massa corporal, estado geral de saúde, sexo, dieta, altura da administração, interacções com outros fármacos e para a severidade do estado, os quais poderão ser avaliáveis através de experimentação rotineira pelos especialistas da técnica. 0 médico assistente e os factores clínicos determinarão o regime de dosagem. Tal como se sabe muito bem em medicina, as dosagens para um determinado doente dependem de muitos factores, incluindo as dimensões do doente, a área superficial do seu corpo, a idade, o composto específico que se pretenda administrar, o sexo, a altura e a via de administração, o estado geral de saúde, e outros fármacos que se estejam também a administrar ao doente.

Uma dose típica pode ser, por exemplo, adentro das gamas descritas nas concretizações da invenção e nos exemplos apensos; no entanto, encaram-se doses menores ou maiores do que as desta gama exemplificativa, em particular levando em conta os factores mencionados acima. 0 termo "infusão contínua" refere-se a uma infusão que se deixa prosseguir permanentemente ao longo de um período de tempo, isto é, sem interrupção. "Infusão contínua" refere-se a uma infusão administrada permanentemente. Portanto, no contexto da invenção, os termos "permanente" e "contínuo" são utilizados como sinónimos. Adentro dos significados utilizados na invenção, por exemplo o termo "infusão contínua de 4 semanas" denota uma situação na qual o anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela utilizado nos meios e métodos farmacêuticos consoante a invenção é administrado continuamente ao corpo de um doente adulto ao longo de um período de 4 semanas de um modo sustentado, constante, ao longo de toda a duração que os métodos farmacêuticos da invenção preconizam. Os esquemas de administração contínua do anticorpo biespecifico CDl9xCD3 de cadeia singela são descritos em mais pormenor no WO 2007/068.354. Uma interrupção da introdução do anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela é evitada, o que significa que não ocorre, ou não ocorre significativamente ao longo de toda a duração da administração preconizada pelos métodos farmacêuticos da invenção, excepto para refazer a reserva de anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela que se está a administrar ou em consequência de intervenções médicas e outras semelhantes, uma transição entre um estado em que se está a administrar este anticorpo ao corpo do doente a um estado em que não se está a administrar este anticorpo ao corpo do doente. Na medida em que é necessário refazer as reservas do anticorpo a administrar e que isso leve a uma interrupção temporária da introdução do anticorpo administrado, deve entender-se uma tal administração como sendo à mesma "ininterrupta" ou "permanente", no sentido dos métodos farmacêuticos consoante a invenção. Na maior parte dos casos, o período de tempo necessário para refazer as reservas será tão curto que o período de tempo durante o qual o anticorpo não está a ser introduzido no corpo do doente será diminuto em comparação com o período de tempo planeado para o regime da sua administração global, consoante os métodos farmacêuticos recomendados pela invenção. De acordo com a invenção, deve entender-se um ciclo de tratamento como uma infusão contínua durante 4 semanas, do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela no doente adulto com ALL, seguida por um intervalo de 2 semanas isento de tratamento. Pode acontecer que a seguir à determinação do estado da MRD dos doentes tratados ao fim de uma administração contínua durante 4 semanas, ou um ciclo de tratamento, se consiga diagnosticar uma resposta mínima ou parcial ao tratamento com o anticorpo biespecífico com cadeia singela. Neste caso, pode suplementar-se a administração contínua através de mais um, dois, três, quatro, cinco ou mesmo até dez ciclos de tratamento, para se conseguir um melhor resultado terapêutico, por exemplo uma doença estável ou mesmo uma resposta completa. Preferivelmente, a referida resposta completa é atingir o estado negativo para MRD. Numa concretização alternativa, o tratamento do doente adulto com ALL durante 4 semanas por infusão contínua do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela pode ser seguido por HSCT alogénica. Também se encara que um doente tratado com um, dois, três, quatro ou ainda mais ciclos de tratamento tal como se descreveram acima, possa receber em seguida uma transplantação HSCT alogénica em seguida.

Tal como se mostra no exemplo que se segue, 13 de entre 16 doentes adultos com ALL tornaram-se negativos para MRD por tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela, o que corresponde a uma taxa de resposta molecular completa extraordinária de 81 %. Mais especificamente, em nove de entre onze doentes com transposições em imunoglobulinas ou TCR, em um de dois doentes com translocações t(4;ll) e em três de entre quatro doentes com transcritos bcr/abl, foi possível assegurar negatividade em relação à MRD. Preferivelmente, o objectivo terapêutico principal da administração do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela, quer por si só, quer em combinação com uma HSCT alogénica, a um doente adulto com ALL, é a sua transformação de um estado positivo para MRD a um estado negativo para MRD, tal como se define neste documento. A administração contínua ininterrompida do anticorpo biespecífico de cadeia singela tal como se preconiza nos métodos farmacêuticos consoante a invenção durante períodos de tempo mais longo, permite a activação vantajosa de células T mencionada nos exemplos, para exercerem o seu efeito durante períodos de tempo suficientemente longos para vantajosamente eliminarem todas as células doentes do corpo. Uma vez que a taxa de anticorpo biespecífico de cadeia singela administrado ininterruptamente permanece baixa, pode continuar-se a aplicação do agente terapêutico durante mais tempo sem risco de efeitos colaterais lesivos para o doente. 0 anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela tal como se utiliza neste documento assume vantajosamente a forma de uma composição farmacêutica para administração a um doente humano a que se diagnosticou leucemia linfoblástica aguda (ALL). 0 doente humano é um adulto tal como se define adiante neste documento. Enquanto o anticorpo biespecifico com cadeia singela tal como utiliza neste documento pode ser administrado por si só, prefere-se a administração num veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. São bem conhecidos na técnica exemplos de veículos farmacêuticos adequados e neles se incluem soluções de soro salino tamponizado com fosfato, água, lipossomas, diversos tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Podem formular-se composições incluindo estes veículos por métodos convencionais bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito a uma dose adequada. 0 regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por factores clínicos. Tal como se sabe nas técnicas medicinais, as dosagens para um determinado doente dependem de muitos factores, incluindo o tamanho do doente, a sua área corporal, a idade, o composto específico a administrar, o seu sexo, a altura e a via de administração, o seu estado geral de saúde, e os outros fármacos que lhe estejam a ser administrados. Incluem-se nas preparações para administração parenteral as soluções estéreis aquosas ou não aquosas, ou suspensões. São exemplos de solventes não aquosos o propilenoglicol, o polietilenoglicol, e os ésteres orgânicos injectáveis tais como o oleato de etilo. Incluem-se nos veículos aquosos a água, as soluções aquosas, ou suspensões, incluindo em soro salino e meios tamponizados. Incluem-se nos veículos parenterais solução de cloreto de sódio, de dextrose de Ringer, de dextrose e de cloreto de sódio, ou de Ringer lactada. Incluem-se nos veículos endovenosos recargas de fluidos e de nutrientes, recargas de electrólitos (tais como os baseados em dextrose de Ringer), e outras semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes, e outros semelhantes. Além disto, a composição pode incluir veículos proteínicos, tais como por exemplo, albumina de soro ou imunoglobulina, preferivelmente com origem humana. Caso tal se encare, a composição pode incluir, para além do anticorpo biespecífico de cadeia singela proteínico, outros agentes biologicamente activos, dependendo a utilização pretendida para a composição farmacêutica. Estes agentes podem ser agentes actuando como citoestáticos, agentes evitando a hiperuriquemia, agentes inibindo reacções imunológicas (por exemplo, corticosteroides, FK506), fármacos actuando sobre o sistema circulatório e/ou agentes tais como moléculas co-estimuladoras das células T ou citoquinas conhecidas na técnica.

Preferivelmente, o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela tal como se define neste documento é formulado num tampão, com um estabilizador e um tensioactivo. 0 tampão pode ser um tampão fosfato, citrato, sucinato ou acetato. 0 estabilizador pode ser um ou mais aminoácidos e/ou um açúcar. Os tensioactivos podem ser detergentes, diversos PEG, ou outros semelhantes. Mais preferivelmente, o anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela tal como se define neste documento é formulado em citrato, lisina, trehalose e Tween 80. Como diluente para a composição farmacêutica da invenção, prefere-se soro salino isotónico e Tween 80.

Preferivelmente, nas utilizações e métodos da invenção, a composição farmacêutica é para ser administrada a um doente adulto humano a que se diagnosticou leucemia linfoblástica aguda (ALL). O sucesso da terapia com anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela pode ser monitorizado por métodos padrão estabelecidos para as entidades das doenças respectivas: Para terapia de ALL de células B, podem utilizar-se Classificação de Células Activada por Fluorescência (FACS), aspiração de medula óssea e diversos parâmetros clínicos específicos para a leucemia bem como outros métodos padrão estabelecidos. Os métodos e os meios para a determinação do estado face à doença residual mínima (MRD) foram descritos acima.

Pode detectar-se a citotoxicidade por métodos conhecidos na técnica e por métodos tais como os ilustrados, por exemplo, em WO 99/54.440, WO 2004/106.381, e em WO 2007/068.354.

Numa concretização preferida, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) dos doentes adultos é refractária à quimioterapia, preferivelmente refractária à quimioterapia a respeito da MRD (isto é, a MRD destes doentes com ALL é resistente à quimioterapia) . De um modo ainda mais preferido, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) é refractária à quimioterapia em doentes não elegíveis para HSCT alogénica. 0 termo "quimioterapia", tal como utilizado neste documento, denota quimioterapia utilizada para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL). A quimioterapia é o tratamento inicial seleccionado para a ALL. A maior parte dos doentes com ALL acaba por receber uma combinação de diferentes tratamentos. No tratamento da ALL, não existem opções cirúrgicas, devido à distribuição das células malignas por todo o corpo. Em general, a terapia citotóxica de ALL combina múltiplos fármacos anti-leucémicos em diversas combinações. A quimioterapia de ALL consiste em três fases: terapia de indução da remissão, de intensificação, e de manutenção. A quimioterapia também está indicada para proteger o sistema nervoso central da leucemia. 0 objectivo da indução da remissão é matar rapidamente a maior parte das células tumorais levando o doente a uma remissão. Isto define-se como a presença de menos do que 5 % de blastos leucémicos na medula óssea (tal como determinados por microscopia luminosa), células sanguíneas normais e ausência de células tumorais do sangue, e ausência de outros sinais e sintomas da doença.

Por exemplo uma combinação de Prednisolone ou dexametasona (em crianças), vincristina, asparaginase, e daunorrubicina (utilizada na ALL de adultos) é utilizada para induzir a remissão. A intensificação recorre a doses elevadas de quimioterapia endovenosa com múltiplos fármacos para diminuir inda mais a carga tumoral. Os protocolos de intensificação típicos recorrem a vincristina, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, etoposido, tioguanina ou mercaptopurina administradas como blocos em diferentes combinações. Uma vez que as células de ALL por vezes penetram no Sistema Nervoso Central (SNC), a maior parte dos protocolos incluem a entrega da quimioterapia até ao fluido do SNC (denominada terapia intratecal) . Alguns centros entregam o fármaco através do reservatório Ommaya (um dispositivo colocado cirurgicamente sob o escalpe e utilizado para transportar fármacos para o fluido do SNC e para extrair fluido do SNC para diversos testes). Outros centros levam a cabo diversas punções lombares quando são necessárias para testar e para transportar os medicamentos até ao SNC. Geralmente utiliza-se para este propósito o metotrexato ou a citarabina intratecais. 0 objectivo da terapia de manutenção é matar qualquer célula residual que não tenha sido morta pelos mecanismos de indução da remissão, e de intensificação. Embora estas células sejam poucas, elas provocarão recaídas caso não sejam eliminadas. Para este propósito, utilizam-se habitualmente mercaptopurina oral diária, metotrexato oral semanal, um conjunto de 5 dias uma vez ao mês de vincristina endovenosa e corticosteroides por via oral. A terapia é mantida em geral durante 3 anos para rapazes, e durante 2 anos para raparigas e para adultos. Tratam-se recaídas a nível do sistema nervoso central por administração intratecal de hidrocortisona, metotrexato, e citarabina (Hoffbrand et al., Essential Hematology, Blackwell, 5a edição, 2006) . Uma vez que os regimes de quimioterapia podem ser intensivos e demorados (amiúde cerca de 2 anos no caso dos protocolos GMALL, UKALL, HyperCVAD ou CALGB; cerca de 3 anos para indivíduos do sexo masculino seguindo protocolos COG) , insere-se a muitos doentes um cateter endovenoso numa veia de grande dimensão (denominado um cateter venoso central ou uma linha de Hickman), ou um Portacath (um terminal em forma de cone com um nariz em silicone que se implanta cirurgicamente sob a pele, geralmente na vizinhança de uma clavícula). A quimioterapia da ALL tem sido descrita por exemplo em Schmoll, Hõffken, Possinger (loc. cit.) . À luz de quanto antecede, o termo "refractário à quimioterapia", tal como se utiliza neste documento, denota resistência das células de leucemia linfoblástica aguda à quimioterapia.

Os doentes podem sofrer uma recaída da ALL depois da terapia inicial e/ou tornar-se refractários à quimioterapia a seguir ao tratamento. Os doentes com ALL que são refractários à quimioterapia têm um prognóstico marcadamente desfavorável. Em especial, o prognóstico para doentes adultos com ALL Ph+ tratados apenas por quimioterapia é desfavorável, com uma probabilidade de sobrevivência a longo termo inferior a 10 %. Uma vez que os métodos farmacêuticos da invenção são capazes de tornar negativos para MRD os doentes adultos com ALL, eles são especialmente úteis para o tratamento dos doentes com ALL refractários à quimioterapia. O termo "transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas", tal como se utiliza neste documento, significa transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas (HSCT) ou transplantação de medula óssea (BMT) que é um procedimento medicinal no domínio da hematologia e da oncologia que envolve a transplantação de células estaminais hematopoiéticas (HSC). Ele é levado a cabo na maior parte das vezes em doentes com doenças nos nodos linfáticos, no sangue ou na medula óssea, tais como ALL. A HSCT alogénica é um processo no qual uma pessoa recebe células estaminais formadoras de sangue (células das quais se desenvolvem todas células do sangue) a partir de um doador geneticamente semelhante, mas não idêntica. Trata-se amiúde de um parente próximo, tal como uma mãe, um pai, uma irmã ou um irmão, mas também poderia ser de um doador não familiarmente relacionado. A maior parte dos destinatários das HSCT são doentes com leucemia (por exemplo com ALL), que beneficiariam de tratamentos com doses elevadas de quimioterapia ou de irradiação de corpo inteiro. No entanto a HSCT alogénica continua a ser um tratamento arriscado e tóxico. 0 termo "não elegível para HSCT", tal como se utiliza neste documento, significa os doentes adultos para os quais uma HSCT alogénica não é o tratamento de ALL a escolher, por exemplo, devido a razões medicinais. Por exemplo, pode tratar-se do caso em que não se encontre disponível nenhum doador apropriado, ou o doente excedeu o limite superior de idade. Tal como se mostra no exemplo que se segue, todos os doentes foram refractários a quimioterapia, ou no caso da ALL Ph+ também refractários ou intolerantes à tirosina quinase, antes da sua inclusão no estudo. Oito doentes tratados com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela tinham sido não elegíveis para HSCT alogénica, tais como por exemplo os doentes 111-003, 108-002, 109-006 ou 109-007.

Até à data, a ALL significava uma sentença de morte para os doentes refractários à quimioterapia e não elegíveis para HSCT alogénica. Os métodos farmacêuticos da invenção proporcionam pela primeira vez uma terapia para esta população de doentes na medida em que eliminam a doença residual mínima (MRD) que doutra forma provocaria uma recaída matando os doentes referidos.

Numa concretização alternativa dos métodos farmacêuticos da invenção, segue-se ao método referido uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas, ou o método referido substitui transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas em doentes adultos elegíveis para HSCT alogénica. 0 termo "elegível para uma HSCT alogénica", tal como se utiliza neste documento, significa que uma HSCT alogénica é a terapia necessária para o doente adulto com ALL. Nos casos em que o doente com ALL é elegível para HSCT alogénica, podem encarar-se os seguintes dois cenários. Em primeiro lugar, numa concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, a administração do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela (por si só ou preferivelmente sob a forma de uma composição

farmacêutica) , pode ser utilizada para substituir uma HSCT alogénica utilizada como terapia convencional para dentes adultos com ALL elegíveis para transplantação. Portanto os métodos farmacêuticos da invenção podem evitar os riscos de saúde para os doentes com ALL, que estão associados à transplantação de células estaminais hematopoiéticas. Além disto, 30 % dos doentes com ALL transplantados recaem habitualmente depois da transplantação. Portanto os métodos e os meios farmacêuticos da invenção podem ser utilizados para tratar estes doentes. Numa concretização alternativa, a infusão contínua do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela ao doente adulto com ALL pode ser seguida por uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas. Nesta concretização, a administração de uma composição farmacêutica contendo uma construção de anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela pode ser utilizada para transformar doentes com ALL elegíveis para a transplantação a um estado negativo para MRD antes de eles receberem a transplantação. Deste modo, os métodos farmacêuticos da invenção podem ser utilizados para eliminar MRD, o que leva a um menor risco de recaída do que no tratamento de transplantação em doentes positivos para MRD. 0 exemplo apresenta um doente que foi primeiro transformado a um estado negativo para MRD por tratamento com o anticorpo biespecífico CDl9xCD3 de cadeia singela, seguindo-se uma transplantação alogénica. Até à data, este doente permanece negativo para MRD, tendo este estado negativo para MRD durado já 47 semanas, até à data.

Também se encontra adentro do âmbito dos métodos farmacêuticos da invenção, que a construção do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela seja administrada a doentes adultos com ALL que hajam recebido uma HSCT alogénica e tenham recaído em seguida.

Noutra concretização preferida, os métodos farmacêuticos da invenção destinam-se ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença residual mínima (MRD) num doente adulto com leucemia linfoblástica aguda (ALL). 0 termo "doença residual mínima (MRD)", tal como se define neste documento, denota um estado de doença após o tratamento por exemplo com quimioterapêuticos, em que não se conseguem encontrar nenhumas células leucémicas na medula óssea utilizando métodos de microscopia luminosa. É necessário utilizar testes mais sensíveis tais como citometria de fluxo (métodos baseados em FACS) ou reacção de polimerase em cadeia (PCR) para se encontrarem dados acerca da existência de células leucémicas remanescentes na medula óssea do doente com ALL. Mais especificamente, define-se a presença de células leucémicas para lá limite de detecção citológica (5 % de células leucémicas) como sendo uma doença residual mínima (MRD). Caso não se detecte MRD (<10-4, isto é, sendo detectável menos do que 1 célula de leucemia por 104 células de medula óssea), atinge-se uma remisssão molecular completa. Um "estado positivo para MRD", tal como se define neste documento, significa um sinal bcr/abl ou um sinal t(4;ll) acima do limite de detecção e/ou transposições individuais em genes de imunoglobulinas ou de receptores de células T (TCR), maior do que 1CT4. Um "estado negativo para MRD", tal como se define neste documento, significa um sinal bcr/abl ou um sinal de translocação t(4;ll) inferior ao limite de detecção ou transposições individuais nos genes de imunoglobulinas ou de receptores de células T (TCR) inferior a 1CT4. Pode determinar-se o estado face a MRD por análise por PCR ou por FACS em que se detectam quantitativamente as transposições individuais em genes de imunoglobulinas ou de receptores de células T (TCR), ou transcritos de fusão bcr/abl, ou t(4;ll). Por exemplo, uma análise por PCR pode detectar transcritos de fusão tais como bcr/abl, ou translocações t(4;ll) e transposições clonais individuais de genes de imunoglobulinas (IgH) e/ou de receptores de células T (TCR).

As anormalidades cromossómicas recorrentes nas células malignas dos doentes com leucemia linfoblástica aguda são cunhos marcantes da doença (Harrison e Foroni, Rev. Clin. Exp. Hematol. 6 (2002), 91-113). As aberrações específicas que são frequentemente indicativas de lesões moleculares subjacentes consistentes podendo ajudar no diagnóstico ou mesmo estabelecê-lo e determinar a terapia óptima. Na ALL infantil, têm sido identificados numerosos subgrupos citogenéticos bons e de alto risco que são utilizados regularmente para estratificar os doentes destinados a terapias específicas (Pui e Evans, N. Engl. J. Med. 354 (2006), 166-178). No entanto, na ALL de adultos o

papel da citogenética na gestão de doentes tem sido largamente centrado na presença do cromossoma de Philadelphia (Ph) que em geral provém de t(9;22)(q34;qll.2) e origina a fusão BCR-ABL (bcr/abl) (Faderl et al. , Blood 91 (1998), 3995-4019). Embora a incidência global da ALL

Ph+ em adultos seja de cerca de 25 %, ela está correlacionada com a idade e aumenta para mais de 50 % nos doentes com mais do que 55 anos de idade (Appelbaum, American Society of Clinical Oncology 2005 education book. Alexandria: ASCO, 2005: 528-532). Outras translocações citogenéticas associadas a anormalidade genéticas moleculares bem determinadas na leucemia linfoblástica aguda (ALL) estão listadas na Tabela 1.

Tabela 1:

A citogenética tem sido cada vez mais reconhecida como um instrumento de previsão importante para as consequências de ALL (Moormann et al. , Blood 109 (2007), 3189-97).

Alguns subtipos citogenéticos têm um prognóstico mais severo do que outros. Estes incluem, por exemplo: (i) Uma translocação entre os cromossomas 9 e 22, o cromossoma Philadelphia (Ph+), ocorre em cerca de 20 % dos casos de ALL em adultos e em 5 % nos casos pediátricos de ALL. (ii) Uma translocação entre os cromossomas 4 e 11 ocorre em cerca de 4 % dos casos e é mais comum em crianças com menos de 12 meses de idade.

As transposições em genes de imunoglobulinas ou de receptores de células T (TCR) e o seu papel na ALL foram descritas na técnica (veja-se por exemplo Szczepanski et al., Leukemia 12 (1998), 1081-1088).

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o doente adulto referido é positivo para MRD mas em remissão hematológica completa. O termo "remissão" ou "remissão hematológica", tal como se utiliza neste documento, deve ser entendido como não restando quaisquer dados de doença após o tratamento, por exemplo depois de uma quimioterapia ou de uma transplantação. Isto significa que a medula óssea possui menos do que 5 % de células blastos, tal como se

determina por microscopia luminosa, que as contagens de células sanguíneas estão dentro dos limites normais, e que não existem sinais nem sintomas da doença ALL. Uma remissão molecular completa significa que não existem quaisquer dados acerca de células leucémicas na medula óssea, mesmo quando se utilizam testes muito sensíveis tais como PCR. Por outras palavras: Quando não é detectável qualquer MRD (<1CT4, isto é < 1 célula de leucemia por 104 células de medula óssea), atingiu-se uma remissão molecular completa.

Depois de uma remissão completa das lesões da leucemia num doente humano adulto com ALL por tratamento quimioterapêutico ou por transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas, pode dar-se o caso de nem todas as células da leucemia terem sido eliminadas do corpo. No entanto, estas células tumorais remanescentes podem dar origem a uma recaída da leucemia. Os métodos farmacêuticos da invenção podem ser utilizados para matar estas células tumorais remanescentes de modo a evitar a recaída da leucemia (proveniente das células leucémicas ocultas remanescentes no corpo após a terapia primária). Deste modo, os métodos farmacêuticos ajudam a evitar a recaída da doença nos doentes adultos com ALL.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a administração da referida composição farmacêutica transforma a leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para MRD, levando a um estado negativo para MRD.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, quantifica-se a MRD por detecção quantitativa das transposições individuais nos genes de imunoglobulina ou de receptores de células T (TCR) , ou de transcritos de fusão bcr/abl, ou de t(4;ll), utilizando análise por PCR ou por FACS.

Tal como se mostra nos exemplos seguintes, a administração de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela é particularmente apropriada para dentes adultos com doença residual mínima (MRD). Esta inclui a doença residual mínima (MRD) definida pela translocação do cromossoma Philadelphia ou t(4;ll) bem como a MRD definida por transposições de imunoglobulina ou TCR. Os métodos farmacêuticos da invenção proporcionam portanto uma via terapêutica para o tratamento, melhoria ou eliminação da MRD, diminuindo deste modo ou mesmo abolindo o risco de recaída para o doente adulto. Notavelmente, ainda não estava disponível até à data nenhum tratamento curativo da MRD em doentes com ALL.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o doente referido exibe um sinal bcr/abl ou um sinal t(4;ll) acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição com uma sensibilidade >1CT4. 0 termo "sinal bcr/abl ou de translocação (4;11) acima do limite de detecção", tal como se utiliza neste documento, significa que uma análise por PCR ou por FACS leva a um sinal detectável bcr/abl ou a um sinal t(4;ll) .

Tal como se descreve neste documento, nos métodos farmacêuticos da invenção, o período de tempo até à recaída molecular (detectável pelos ensaios descritos acima) é mais longo do que 4 meses. 0 termo "recaída molecular", tal como se utiliza neste documento, significa que o doente a que diga respeito denota um sinal de bcr/abl ou de uma translocação t(4;ll) acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição com uma sensibilidade >1CT4. 0 termo "com uma sensibilidade >1CT4", tal como se utiliza neste documento, significa que se consegue detectar uma ou mais células de leucemia em 10.000 células, em especial células de medula óssea.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, as regiões correspondentes a cadeia variável pesada (VH) e as regiões correspondentes a cadeia variável leve (VL) na referida construção de anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela estão dispostas, a partir do terminal N em direcção ao terminal C, pela ordem VL (CD19) —VH (CD19) —VH (CD3) —VL (CD3) .

Mostram-se as regiões correspondentes a cadeia variável pesada (VH) e as regiões correspondentes a cadeia variável leve (VL) nos domínios de ligação a CD3 e a CD19 do anticorpo biespecifico com cadeia singela CD19xCD3 nas SEQ ID NOs. 3 a 10, respectivamente. As regiões das CDR correspondentes às respectivas regiões VH e VL do mencionado anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela estão registadas nas SEQ ID NOs. 11 a 22.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a construção referida do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela inclui uma sequência de aminoácidos tal como se apresenta na SEQ ID NO. 1, ou uma sequência de aminoácidos idêntica em pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 95 %, à SEQ ID NO. 1. A invenção descreve uma molécula de anticorpo biespecifico de cadeia singela incluindo uma sequência de aminoácidos tal como a representada na SEQ ID NO. 1, bem como uma sequência de aminoácidos idêntica em pelo menos 90 % ou preferivelmente idêntica em pelo menos 95 %, mais preferivelmente idêntica em pelo menos 96, 97, 98, ou 99 % à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.l. A invenção descreve também a correspondente sequência de ácido nucleico tal como representada na SEQ ID NO. 2 bem como uma sequência de ácido nucleico idêntica em pelo menos 90 %, preferivelmente idêntica em 95 %, de preferência idêntica em pelo menos 96, 97, 98, ou 99 % à sequência de ácido nucleico ilustrada na SEQ ID NO. 2. Deve entender-se que a identidade entre sequências é determinada para a totalidade da sequência de nucleótidos ou de aminoácidos. Além disto, deve entender-se que uma molécula de anticorpo biespecifico com cadeia singela incluindo uma sequência de aminoácidos pelo menos idêntica em 90 % ou preferivelmente idêntica em 95 %, de preferência idêntica em pelo menos 96, 97, 98, ou 99 % à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1 contém todas as sequências de CDR ilustradas nas SEQ ID NOs. 11 a 22. Para os alinhamentos de sequências podem utilizar-se, por exemplo, os programas Gap ou BestFit (Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; Smith e Waterman,

Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489), contidos no dispositivo de programas GCG (Genetics Computer Group, 575 Science

Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991). É um método de rotina para os especialistas da técnica determinar e identificar uma sequência de nucleótidos ou de ácidos nucleicos apresentando por exemplo 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com as sequências de nucleótidos ou de aminoácidos do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela que se descreve neste documento. Por exemplo, de acordo com a hipótese Wobble de Crick, a base 5' no anti-códão não está tão confinada espacialmente como as duas outras bases, e poderia portanto apresentar emparelhamento de bases diferente do padrão. Por outras palavras: a terceira posição num tripleto de códão pode varia de tal modo que dois tripletos que difiram nesta terceira posição podem codificar para o mesmo resíduo de aminoácido. A hipótese referida é bem conhecida dos especialistas da técnica (vejam-se por exemplo http : //en . wlkíped.ía . org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol. Biol. 19 (1966): 548-55).

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, um ciclo de tratamento é uma infusão continua durante 4 semanas, seguido por ciclos repetidos após um intervalo de 2 semanas isento de tratamento ou por uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o ciclo de tratamento é repetido pelo menos três vezes, preferivelmente quatro, cinco, seis, sete ou mesmo até dez vezes depois de se haver determinado um estado negativo para MRD (consolidação).

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a construção de anticorpo biespecifico de cadeia singela será administrada a uma dose diária de entre 10 pg e 100 pg por metro quadrado da área superficial do corpo do doente.

Tal como se utiliza neste documento, uma gama de doses definida como "X a Y" é idêntica a uma gama de doses definida como "entre X e Y" . A gama indica o limite superior e também o limite inferior. Isto significa que por exemplo uma dose diária de 10 pg a 100 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente inclui "10 pg" e "100 pg".

Numa concretização ainda mais preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a construção doo anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela deve ser administrada a uma dose diária de 15 pg, 30 pg, 60 pg ou 90 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente. É ainda mais preferido que o anticorpo referido seja administrado a uma dose diária de 15 a 30 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente, de preferência a uma dose diária de 15 ou de 30 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.

Calcula-se a este efeito a área superficial média do corpo de um doente no contexto do método farmacêutico ou da utilização consoante a invenção, como estando adentro da gama de 1,7 a 2,2 m2.

De forma vantajosa, a composição farmacêutica contendo o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela tal como descrito neste documento contém também, opcionalmente (a) um ou mais tampões reaccionais, uma ou mais soluções para armazenagem e/ou reagentes ou materiais adicionais necessários para o método ou utilização recitados. Além disto, as componentes referidas podem ser embaladas individualmente em frascos ou garrafas, ou estarem em combinações adentro de contentores ou de unidades com múltiplos contentores.

Para se avaliar a segurança e a tolerabilidade do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela tal como descrito neste documento, o composto destina-se a ser administrado por infusão contínua a longo termo.

Verificou-se que os efeitos beneficiais e inesperados dos métodos farmacêuticos da invenção podem ser obtidos administrando o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela a uma dose diária de 10 micrograma a 100 micrograma por metro quadrado de área superficial do corpo. Pode manter-se a dose diária constante ao longo do período de administração. No entanto, também adentro do âmbito desta concretização pode administrar-se durante o ou os dias iniciais do período de infusão uma dose menor do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela ("dose inicial") antes da contemplada nos métodos farmacêuticos descritos neste documento, enquanto durante o período restante da infusão se pode aplicar uma dose maior ("dose de manutenção") . Por exemplo, pode administrar-se 5 microgramas de anticorpo biespecífico de cadeia singela por metro quadrado de área superficial do corpo durante o ou os primeiros dias do período de infusão, seguindo-se a administração de 15 microgramas por metro quadrado de superfície corporal durante o período remanescente do tratamento. Ou podem administrar-se 15 microgramas de anticorpo biespecífico de cadeia singela por metro quadrado de área superficial do corpo durante o ou os primeiros dias do período de infusão, seguindo-se a administração de 30 ou de 45 microgramas por metro quadrado de superfície corporal a título de dose diária durante o período de tratamento remanescente. A dose inicial pode ser administrada durante um, dois ou mais dias ou mesmo durante uma semana (sete dias). Também se encara poderem-se administrar 5 microgramas de anticorpo biespecífico de cadeia singela por metro quadrado de área superficial do corpo no ou nos primeiros dias do período de infusão, seguindo-se a administração de 15 microgramas de anticorpo biespecífico de cadeia singela por metro quadrado de área superficial do corpo no ou nos dias seguintes do período de infusão, seguindo-se a administração de 45 microgramas por metro quadrado de superfície do corpo como dose diária (de manutenção) durante o período remanescente do tratamento.

Calcula-se a área superficial média do corpo de um doente adulto no contexto do método farmacêutico ou utilização consoante a invenção como sendo de 1,7 a 2,2 m2.

Noutra concretização dos métodos e utilizações da invenção, escala-se a dose depois do primeiro ciclo de tratamento ou de outros ciclos de tratamento, por exemplo de 15 para 30 ou 60 ou mesmo 90 microgramas/m2/24 h. A administração ininterrupta do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela pode ser endovenosa, parenteral, subcutânea, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular ou pulmonar. O modo de administração endovenoso será o modo de administração seleccionado na maior parte dos casos para se administrar ininterruptamente o anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela e, tal como poderá ser o caso, para a co-administração de um agente farmacêutico como parte de um regime de co-terapia. A administração endovenosa é particularmente preferida. Neste caso, pode seleccionar-se vantajosamente um dispositivo adequado de medição tal co mo o dispositivo de bomba de infusão multi-terapia modelo 6060 fabricado pela Baxter. Qualquer que seja o dispositivo de medição seleccionado, ele deve ter uma concepção e uma construção tais que seja minimizada, ou mesmo, evitada, uma interrupção da administração do agente terapêutico mesmo durante a substituição de cartuchos e/ou de células de potência, ou a sua recarga. Isto pode ser conseguido, por exemplo seleccionando um dispositivo com um reservatório secundário de solução de anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela exterior ao cartucho que se necessitará de substituir, de modo a assegurar uma infusão continua a partir deste reservatório secundário mesmo enquanto o cartucho vazio ou quase vazio é removido e substituído por um fresco.

Um modo de administração endovenosa e, no caso da co-administração como parte de um regime de co-terapia, envolve a implantação de uma bomba no corpo do doente para se medir a administração referida. Um indivíduo com conhecimentos médios na técnica conhece estas bombas medidoras, por exemplo do modelo 6060 fabricado pela Baxter tal como se mencionou acima. A título de um exemplo não limitativo, pode acontecer que a administração ininterrupta, isto é, contínua, seja levada a cabo por um pequeno sistema de bombagem utilizado pelo ou implantado no doente para medir o caudal de entrada do agente terapêutico no corpo do doente. Estes sistemas de bombagem são em geral conhecidos na técnica, e habitualmente baseiam-se na permuta periódica de cartuchos contendo o agente terapêutico que se infunde. Quando se permuta o cartucho num tal sistema de bombagem, pode acontecer uma interrupção temporária do caudal de outra forma ininterrupto de agente terapêutico no corpo do doente. Num tal caso, a fase de administração anterior à substituição do cartucho e a fase de administração após a substituição do cartucho ainda seriam consideradas como estando adentro do significado dos métodos terapêuticos da invenção para constituírem em conjunto uma "administração ininterrupta" de um tal agente terapêutico. 0 mesmo aplicar-se-ia a administrações muito longas nas quais o cartucho necessite de ser substituído mais do que uma vez, ou nos quais as células de potência que comandam a bomba necessitem de substituição, levando a uma paragem temporária do caudal da solução terapêutica para dentro do corpo do doente.

Devem também ser tomadas medidas adequadas para minimizar o perigo de infecção no local de perfuração para administração ao corpo do doente, uma vez que as feridas de longa duração deste tipo são particularmente susceptíveis de infecção. Isto também se aplica à administração intramuscular através de um sistema de administração semelhante. A administração contínua pode ser transdérmica através de um pacho utilizado sobre a pele e substituído, a intervalos de tempo. Um especialista da técnica sabe que existem sistemas de pachos para administração de fármacos que são adequados para este efeito. Deve anotar-se que por administração transdérmica é particularmente exequível fazer-se uma administração ininterrupta, uma vez que a substituição de um primeiro pacho exaurido se pode fazer vantajosamente em simultâneo com a colocação de um novo, segundo pacho, por exemplo sobre a superfície de pele imediatamente adjacente àquela aonde se encontra o primeiro pacho exaurido e imediatamente antes da remoção deste primeiro pacho exaurido. Não existem portanto problemas de interrupção de caudal nem de falhas de potência das células.

Numa concretização preferida adicional, consegue-se a administração continua por uma via pulmonar, por exemplo através de um tubo utilizado numa ou em ambas as narinas do nariz, o qual se liga a um tanque sob pressão, e cujo conteúdo é medido com precisão.

Além disto, a invenção diz respeito a uma construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela para utilização num método de tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) num doente adulto. A invenção também se relaciona com a utilização de uma construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) de adultos. Preferivelmente, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) é uma leucemia linfoblástica aguda com linhagem B, mais preferivelmente leucemia linfoblástica aguda com precursor B. Numa concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) é refractária à quimioterapia em doentes não elegíveis para HSCT alogénica.

Numa concretização alternativa das utilizações medicinais mencionadas, a administração da construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela é seguida por uma HSCT alogénica, ou a utilização referida substitui a HSCT alogénica em doentes elegíveis para a HSCT alogénica.

Noutra concretização preferida das referidas utilizações medicinais, a construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela destina-se ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença residual mínima (MRD) num doente adulto com leucemia linfoblástica aguda (ALL). Preferivelmente, o doente referido é positivo para MRD em remissão hematológica completa.

Numa concretização preferida adicional das referidas utilizações medicinais, a administração do referido anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela CD19xCD3 origina uma doença estável ou transforma a leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para MRD a um estado negativo para MRD. Preferivelmente mede-se a MRD por detecção quantitativa das transposições individuais de genes de imunoglobulinas ou de receptor de células T (TCR), ou por transcritos de fusão bcr/abl, ou t(4;ll), utilizando análise por PCR ou por FACS. É ainda mais preferido que o doente com ALL denote um sinal bcr/abl ou um sinal t(4;ll) acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição com uma sensibilidade >1CT4. Noutra concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, o período de tempo até à recaída molecular detectável pelos métodos de detecção indicados é maior do que 4 meses.

Noutra concretização das utilizações medicinais mencionadas, as regiões variáveis da cadeia pesada correspondentes (VH) e as regiões variáveis da cadeia leve correspondentes (VL) da referida construção de anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela estão dispostas, do terminal N para o terminal C, pela ordem VL (CD19)-VH (CD19) -Vh(CD3)-Vl (CD3) .

Preferivelmente a referida construção do anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela inclui a sequência de aminoácidos tal como descrita na SEQ ID NO. 1, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, preferivelmente 95 %, idêntica à SEQ ID NO. 1.

Numa concretização preferida adicional das utilizações medicinais mencionadas, um ciclo de tratamento é uma infusão contínua durante 4 semanas, seguida por ciclos repetidos após um intervalo de 2 semanas isento de tratamento.

Preferivelmente, repete-se o ciclo de tratamento pelo menos três vezes, depois de se determinado um estado negativo para MRD (consolidação).

Noutra concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, administra-se a construção de anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela a uma dose diária de 10 pg a 100 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.

Preferivelmente, administra-se a construção de anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela a uma dose diária de 15 pg a 30pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.

As definições e explicações proporcionadas a respeito dos métodos farmacêuticos da invenção aplicam-se mutatis mutandis às utilizações medicinais da administra-se da construção de anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela descrito neste documento.

As Figuras mostram: A Figura 1: modo de acção do anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela. O anticorpo biespecifico CD19xCD3 de cadeia singela (blinatumomab ou MT103) altera a direcção de células T citotóxicas positivas para CD3 de modo a eliminarem células de leucemia linfoblástica aguda humana portadoras do antigénio CD19. A Figura 2: Exemplo de decurso da doença residual mínima (MRD). Medição baseada em PCR de transposição TCR (MRD) no doente 109-002 com leucemia linfoblástica aguda comum (cALL) mostra positividade em relação a MRD antes do tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela e uma negatividade para MRD ainda decorrente com início depois do l2 ciclo de anticorpo biespecífico CD19xCD3 de cadeia singela. A Figura 3: Cinética de células T para células T CD4 e CD8 do doente 109-002 durante o ciclo 1 de tratamento. Um exemplo representativo de farmacodinâmica, mostrando uma rápida redistribuição de células T e um aumento, sobretudo das células T citotóxicas CD8. A Figura 4: Cinética de células T para subconjuntos de células T do doente 109-002 durante o ciclo 1 de tratamento. Exemplo representativo de farmacodinâmica, mostrando uma redistribuição rápida de células Tea expansão de células T efectivadoras de memória (TEM). As células T néscias não se expandem. A Figura 5: Os quatro primeiros doentes que entraram para o estudo de fase II. Todos os doentes haviam anteriormente sido submetidos a regimes de quimioterapia padrão contra ALL, seguindo os protocolos GMALL, incluindo pelo menos um tratamento de consolidação. A Figura 6: Respostas de doença residual minima (MRD) nos doentes com ALL indicados (isto é, os primeiros quatro doentes que entraram para o estudo de fase II) depois do primeiro ciclo de tratamento com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela. A Figura 7: Actualização das respostas de doença residual minima (MRD) . Em nove dos onze doentes denotando transposições de imunoglobulinas ou TCR, em um de dois doentes com translocações t(4;ll) e em três de entre quatro doentes com transcritos bcr/abl, foi possível alcançar negatividade para MRD. No total, 13 de 16 doentes avaliáveis (81 %) tornaram-se negativos para MRD. A Figura 8: Duração da negatividade para a doença residual mínima (MRD) (estado em 25.05.2009). A duração ais longa de negatividade para MRD observada até à data foi no doente 108-001 que não recebeu uma transplantação depois do tratamento com anticorpo é de 41 semanas. O doente 111-001 com negatividade para MRD entre 23.06.2008 e 27.10.2008 depois de um tratamento com anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela e havendo recebido uma transplantação bem-sucedida de células estaminais hematopoiéticas alogénicas em seguida, está isento de recaídas até à data. A cabeça de seta significa que a resposta é ainda corrente (estado a 25 de Maio de 2009). O doente 109-002 (*) teve uma recaída testicular seguida por uma recaída hematológica após 19 semanas de negatividade para MRD. A invenção é mais ilustrada pelo seguinte exemplo:

Exemplo: 1. A geração, expressão e actividade citotóxica do anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela foram descritas no WO 99/54.440. As sequências de aminoácidos e de ácido nucleico do anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela estão listadas respectivamente nas SEQ ID NOs. 1 e 2. As regiões VH e VL do domínio de ligação CD3 do anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela estão listadas respectivamente nas SEQ ID NOs. 7 a 10, enquanto as regiões VH e VL do domínio de ligação a CD19 do anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela se encontram listadas, respectivamente,

nas SEQ ID N0S. 3 a 6. As regiões das CDR correspondentes estão listadas nas SEQ ID N0S. 11 a 22. 2. Um ensaio de fase 1 em curso em doentes com recaídas de B-NHL mostra uma taxa de resposta elevada a 60 pg/m2/dia do anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela. As respostas têm uma duração de até mais do que 12 meses (em curso em diversos doentes). A remoção de células B-NHL que se infiltram na medula óssea foi iniciada a 15 pg/m2/dia (Bargou et al., Science 2008) . 3. Com base nestes resultados, concebeu-se um ensaio de fase II escalando a dose em colaboração com O Grupo de Estudo Multicêntrico Alemão da Leucemia Linfoblástica Aguda em

Adultos (GMALL) para investigar a eficácia, a segurança, e a tolerabilidade do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela em doentes adultos (não transplantados) com leucemia linfoblástica aguda (ALL) que haviam conseguido uma remissão hematológica completa, mas permaneciam positivos para a doença residual minima (MRD) . A MRD é um factor de prognóstico independente que reflecte a resistência a fármacos primários e está associada a um risco elevado de recaida depois do inicio da consolidação. Isto aplica-se a ALL positiva e negativa para Ph+/BCR-ABL. Quantificou-se a MRD com métodos padrão quer por detecção quantitativa de transposições individuais de imunoglobulina ou de receptor de células T (TCR), ou por transcritos de fusão bcr/abl ou r translocações t(4;ll) . A população no estudo inclui doentes adultos com leucemia linfoblástica aguda (ALL) de percursor B que denotam um sinal bcr/abl ou de translocação t(4;ll) acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador para transposições, com uma sensibilidade >1CT4. Mais especificamente, os critérios principais de inclusão incluíram: o Doentes com ALL de precursor B em remissão hematológica completa com falha molecular ou recaída molecular iniciada em qualquer momento após a consolidação 1 de uma terapia d alinha da frente, adentro dos protocolos padrão. o Os doentes têm que ser portadores e um marcador molecular para avaliação da doença residual mínima, que seja ou bcr/abl ou uma translocação t(4;ll) a qualquer nível de detecção, ou transposições individuais de genes de imunoglobulinas ou TCR, medidos por um ensaio com uma sensibilidade de, no mínimo, 10 4 e uma gama quantitativa até 10 4 para pelo menos um marcador. O ponto final primário do estudo de fase II (em curso) é a taxa de transformação a estado Negativo para doença residual minima (MRD), tal como se define por um sinal de bcr/abl ou de translocação t(4;ll) menor que o limite de detecção e/ou por detecção de transposições individuais de genes de imunoglobulina ou de receptor de células T (TCR) menores que 10~4. Os pontos finais secundários são o período de tempo até à recaída hematológica, o período de tempo até à progressão da MRD, e o período de tempo até à recaída molecular. Um ciclo de tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela é uma infusão endovenosa contínua durante 4 semanas, ao qual se pode seguir uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas a seguir ao primeiro ciclo ou a ciclos ulteriores, ou seguido por diversos ciclos após um intervalo de 2 semanas isento de tratamento. O estado da doença residual mínima (MRD) é controlado a seguir a cada ciclo de tratamento. O teor de dose inicial é de 15 microgramas/m2/24 h, que se pode aumentar para 30 microgramas/m2/24 e para teores de dose superiores (60 microgramas/m2/24 h ou 90 microgramas/m2/24 h) com base na actividade clínica e em dados de segurança. Para a concepção estatística, está a ser utilizada a concepção MinMax em dois passos (14 a 21 doentes) de Simon.

Em quanto se segue, os dados relativos aos primeiros quatro doentes recrutados para o estudo são apresentados em mais pormenor a título exemplificativo. Estes quatro doentes com idades de 31, 57, 62, e 65 anos receberam o teor de dose inicial de 15 microgramas/m2/24 h. Tal como se ilustra na Figura 5, aos doentes nos. 111001, 109002 e 110002 foi diagnosticada c-ALL, enquanto o doente n°. 108001 é um doente com ALL de precursor B. Os quatro doentes haviam recebido anteriormente regimes de quimioterapia padrão para ALL consoante os protocolos GMALL, incluindo pelo menos um tratamento de consolidação. Todos eles haviam sido refractários a quimioterapia no tocante à doença residual mínima (MRD). Mais especificamente todos os doentes foram positivos para MRD em remissão hematológica completa. Os doentes nos. 110002, 108001 e 109002 têm sido não elegíveis para transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas, enquanto o doente n°. 111001 tem sido elegível para a referida transplantação.

Tal como se ilustra na Figura 6, três dos primeiros quatro doentes recrutados para o estudo apresentava, doença residual mínima (MRD) por transposições de imunoglobulinas ou TCR aos níveis de 10~4 (doente n°. 111001), 10~3 (doente n°. 108001) e 10~4 (doente n°. 109002), e um doente (doente n°. 110002) apresentava MRD por transcritos de fusão bcr/abl a um nível de 10~4. Três dos 3 doentes, isto é os doentes nos. 111001, 108001 e 109002 com transposições de imunoglobulinas ou TCR tornaram-se negativos para MRD a seguir ao primeiro ciclo de tratamento, independentemente do teor da positividade para MRD na linha de base. 0 doente n°. 111001, único de entre os quatro doentes que era elegível para uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas, recebeu uma transplantação depois de se ter transformado em negativo para MRD por tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela. A Figura 2 proporciona um exemplo do decurso da doença residual mínima (MRD) no doente 109002. Uma quantificação baseada em PCR de transposições TCR (MRD) no doente 109002 com leucemia linfoblástica aguda comum (cALL) mostra positividade para MRD antes do tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela (Blinatumomab) e a negatividade para MRD iniciada após o l2 ciclo de tratamento com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela e durante até à semana 19. Em seguida, o doente teve uma recaída testicular, seguida por uma recaída hematológica. O outro doente, com o n°. 110002 apresentava um nível estável de bcr/abl sem sinais de recaída hematológica a seguir ao ciclo de tratamento inicial; veja-se a Figura 6. O tratamento dos doentes com o anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela foi bem tolerado: Excepto no que toca a febre nos primeiros 3 dias do tratamento, não se registaram toxicidades clinicamente significativas.

Entretanto, já foram tratados ou ainda estão em tratamento dezassete doentes adultos, com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela, até à data. Todos os doentes tinham sido refractários às terapias convencionais de ALL, incluindo quimioterapia, antes do tratamento com o anticorpo. Nenhum deles recebera uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas antes do tratamento com anticorpo. A idade mediana dos doentes era de 48 anos, variando entre 20 e 77 anos. Dez dos doentes eram do sexo feminino e sete eram doentes do sexo masculino. Foi administrado a 14 doentes o teor de dose de 15 microgramas/m2/24 h do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela, enquanto em três doentes se aumentou a dose de 15 para 30 microgramas/m2/24 h a seguir ao primeiro ciclo de tratamento ou a ciclos ulteriores: no doente 109-004 o aumento de dose foi levado a cabo a seguir ao segundo ciclo de tratamento (de um total de três ciclos de tratamento, a que se seguiu uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas), no doente 109-003 ocorreu após o terceiro ciclo de tratamento (para um total de quatro ciclos de tratamento), e no doente 110-002 após o sexto ciclo de tratamento (de um total de sete ciclos de tratamento). Onze destes doentes apresentavam doença residual minima (MRD) por transposições em imunoglobulinas ou TCR, dois doentes tinham translocações t(4;ll) e quatro doentes tinham transcritos de fusão bcr/abl.

Em resultado, foi possível avaliar a resposta de MRD em 16 dos 17 doentes. Tal como se ilustra na Figura 7, 13 dos 16 doentes avaliáveis tornaram-se negativos para MRD, o que corresponde a uma taxa de resposta molecular extraordinariamente completa de 81 %. Mais especificamente, em nove dos onze doentes com transposições de imunoglobulinas ou TCR, em um dos doeis doentes com translocações t(4;ll) e em três dos quatro doentes com transcritos bcr/abl conseguiu atingir-se negatividade para MRD. Tal co mo se ilustra na Figura 8, a duração mais longa da negatividade para MRD no doente 108-001 que não recebeu uma transplantação após o tratamento com anticorpo que se observou até à data, é de 41 semanas. Outro doente negativo para MRD entre 23.06.2008 e 27.10.2008 e que recebeu uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas bem-sucedida depois do tratamento com anticorpo, permanece isento de recaídas até à data; veja-se o doente 111-001 na Figura 8. De uma forma notável, os doentes bcr/abl que se conseguiram tratar com sucesso com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela eram refractários ou intolerantes aos inibidores de tirosina quinase imatinib e/ou dasatinib em regimes de tratamento da ALL anteriores. Em especial, um dos portadores de bcr/abl respondendo ao tratamento com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela possuía uma mutação T315I que é refractária à terapia por inibidores de tirosina quinase.

Deste modo, a administração do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela proporciona agora pela primeira vez uma terapia para doentes com ALL refractários a dasatinib, e com transcritos bcr/abl. Só três do total de 17 doentes não se tornaram negativos para MRD. No entanto, em dois deles conseguiu atingir-se doença estável. Só um doente que apresentava inicialmente doença estável sofreu uma recaída hematológica no terceiro ciclo de tratamento. Um doente não foi avaliável devido a um SAE no dia 2 do estudo.

Em resumo, conseguiu atingir-se uma taxa absolutamente excepcional de resposta molecular completa de 81 % em doentes com uma ALL de precursor B, por tratamento com anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela. A actividade do anticorpo citado podia ser observada em todos os subconjuntos de doentes tratados, incluindo doentes bcr/abl refractários a inibidores de tirosina quinase (T315I) e doentes com translocações t(4;ll) . Além disto, o tratamento com anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela denota um perfil toxicológico favorável, em contraste com as terapias convencionais de ALL, tais como a quimioterapia. Nestas condições, a administração do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela descrito neste documento proporciona uma opção de tratamento nova e vantajosa para a leucemia linfoblástica aguda (ALL), em especial para casos nos quais a ALL seja refractária à terapia convencional de ALL, tal como a quimioterapia. Além dito, a administração do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela proporciona agora pela primeira vez uma terapia para ALL positiva para MRD.

Estes resultados actualizados indicam que o tratamento de doentes com leucemia linfoblástica aguda (ALL) com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela é capaz de transformar a leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para doença residual minima (MRD) a um estado negativo para MRD (tal como se exemplifica através dos doentes com ALL com transposições de imunoglobulinas ou TCR, transcritos bcr/abl ou translocações t(4;ll)), e que este tratamento é bem tolerado. Nestas condições, a administração do anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela descrita neste documento proporciona um tratamento opcional alternativo, em particular para doentes adultos com leucemia linfoblástica aguda (ALL), em especial ALL refractária às terapias convencionais para ALL, tais como a quimioterapia e/ou a HSCT. 0 tratamento com o anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela é particularmente vantajoso no tratamento de ALL positiva para MRD.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Micromet AG <120> Novo tratamento da leucemia linfoblástica aguda <130> P3255 PCT S3 <150> 61/112.323 <151> 2008-11-07 <150> 61/183.291 <151> 2009-06-02 <160> 22 <170> Patente na versão 3.3

<210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição da sequência artificial: anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela" <4 0 0> 1

Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp; 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin He Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly He Pro Pro 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn He His 65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Gly 100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Val 115 120 125

Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 140

Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie GlyGin 165 170 175 lie Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 180 185 190

Lys Ala Thr Leu .Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin 195 200 , 205

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glii Asp Ser Ala Val .Tyr Phe Cys Ala Arg 210 215 220

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp . 225 230 235 240

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser ASp 245 .250 ' 255 lie Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 260 ' 265 270 .

Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 275 . 280 285

Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly 290 295 300

Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 305 310 315 320

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 325 330 335

Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 355 360 365

Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro 385 390 395 400

Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg 405 410 415

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly 420 425 430

Thr Ser Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Sèr Lys Val Ala Ser Gly 435 440 445

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 450 455 460

Thr He Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin

465 470 475 48C

Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala.Gly Thr Lys Leu Glu 485 490 495

Leu Lys

<210> 2 <211> 1494 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição da sequência artificial: anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela" <400> 2 gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60, atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggCg atagttattt gaactggtac 120 caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct. 180 gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 360 tccggtggtg gtggttctca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct 420 gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag ctactggatg 480 aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat ttggcctgga 540 gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac tgcagacgaa 600 tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc tgcggtctat 660 ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat ggactactgg 720 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggtggtg gatccgatat caaactgcag 780 cagtcagggg ctgaactggc aagacctggg gcctcagtga agatgtcctg caagacttct 840 ggctacacct ttactaggta cacgatgcac tgggtaaaac agaggcctgg acagggtctg 900 gaatggattg gatacattaa tcctagccgt ggttatacta attacaatca gaagttcaag 960 gacaaggcca cattgactac agacaaatcc tccagcacag cctacatgca actgagcagc 1020 ctgacatctg aggactctgc agtctattac tgtgcaagat attatgatga tcattactgc 1080 cttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagtcgaagg tggaagtgga 1140 ggttctggtg gaagtggagg ttcaggtgga gtcgacgaca ttcagctgac ccagtctcca 1200 gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagagc cagttcaagt 1260 gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat 1320 gacacatcca aagtggcttc tggagtccct tatcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1380 tçatactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa 1440 cagtggagta gtaacccgct cacgttcggC gctgggacca agctggagct gaaa 1494

<210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD19" <400> 3

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Gin lie Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Alà Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 .105 110

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 4 <211> 372 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD19" <4Ο0> 4 caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtectc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180 aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccàg cácagcctac 240 atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag 300 actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cc 372

<210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VL anti CD19" <400> 5

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Sér Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 :, 5 10 15

Gin Árg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin lie Pro Gly Gin Pro Pro 35 -40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly lie Pro Pro 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His 65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 . 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110

<210> 6 <211> 333 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

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<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD3" <400> 7

Asp lie Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Gys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr.Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly TOO 105 , 110.

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 357 <213> Sequência Artificial <22 0>

<212> ADN <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD3" <400> 8 gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta taccaattac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 9 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VL anti CD3" <400> 9

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr CysArg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

Asn Tip Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trplle Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Tie Ser Ser Met Glu Ala Glu cc η n nc <*» λ . ' v-/ / v / u oy

Asp Alá Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Alá Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys TOO 105

<210> 10 <211> 318 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VL anti CD3" <4 0 0> 10 gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 átgacctgca gagccagttc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaagtgg cttctggágt cccttatcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcatac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaa 318 <213> Sequência Artificial <22 0> <210> 11 <211> 15

<212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD19 LI" <4 0 0> 11

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 15

<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD19 L2" <4 0 0> 12

Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 1 5 <210> 13 <211> 9

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD19 L3" <4 0 0> 13

Gin Gin Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 15

<210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD19 HI" <4 0 0> 14

Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 15 <213> Sequência Artificial <22 0> <211> 17

<212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD19 H2" <4 0 0> 15

Gin He Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD19 H3" <4 0 0> 16

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 1C 15 <210> 17 <211> 5

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD 3 HI" <4 0 0> 17

Arg Tyr Thr Met His 1 5

<210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD 3 H2" <4 0 0> 18

Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys ASp 15 10 15 <210> 19 <211> 10 <213> Sequência Artificial <22 0>

<212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD 3 H3" <4 0 0> 19

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Led Asp Tyr 1 5 10

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti-CD 3 LI" <400> 20

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10

<210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de uma sequência artificial: anti-CD3 L2" <400> 21

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 1 5

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de uma sequência artificial: anti-CD3 L3" <400> 22

Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5

Lisboa, 28 de Outubro de 2015.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para utilização num método de tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) num doente adulto.
2. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 1, em que a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) seja leucemia linfoblástica aguda de linhagem B, preferivelmente leucemia linfoblástica aguda de precursor B.
3. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 1 ou da 2, em que a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) seja refractária à quimioterapia em doentes não elegíveis para transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas.
4. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para utilização da reivindicação 1 ou da 2, seguida por uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas, ou em que o referido método substitua a transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas em doentes elegíveis para a transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas.
5. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o método seja para o tratamento, melhoria ou eliminação da doença residual mínima (MRD) num doente com leucemia linfoblástica aguda (ALL).
6. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 5, em que o doente referido seja positivo para MRD em remissão hematológica completa.
7. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 5 ou da 6, em que a administração da referida composição farmacêutica origine uma doença estável ou transforme a leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva para MRD a um estado negativo para MRD.
8. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a MRD seja medida por detecção quantitativa de transposições individuais de genes de imunoglobulinas ou de receptor de células T (TCR) , ou por transcritos de fusão bcr/abl, ou por translocações t(4;ll), utilizando análise por PCR ou FACS.
9. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que as regiões variáveis da cadeia pesada correspondentes (VH) e as regiões variáveis da cadeia pesada correspondentes (VL) na referida construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela estejam dispostas, a partir do terminal N e até ao terminal C, pela ordem VL (CD19)-VH (CD19)-VH(CD3)-VL(CD3) .
10. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 9, em que a referida construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela inclua uma sequência de aminoácidos tal como listada na SEQ ID NO. 1, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, preferivelmente 95 % idêntica à SEQ ID NO. 1.
11. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que um ciclo de tratamento seja uma infusão contínua de 4 semanas, seguida por ciclos repetidos após um intervalo de 2 semanas isento de tratamento.
12. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 11, em que o ciclo de tratamento seja repetido pelo menos três vezes, depois de se haver determinado um estado negativo para MRD (consolidação).
13. A construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela para utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela seja administrada a uma dose diária de 10 pg a 100 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.
14. A construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 13, em que a construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela seja administrada a uma dose diária de 15 pg a 30 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.
15. A construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela seja administrada a uma dose diária de 15 pg, 30 pg, 60 pg, ou 90 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.
16. A construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a construção de um anticorpo biespecifico CD19xCD3 com cadeia singela seja administrada a uma dose de 5 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente no u nos primeiros dias do período de infusão, seguindo-se a administração de 15 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente nos dias seguintes do período de infusão, e seguindo-se a administração de 45 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente a título de dose diária durante o período de tratamento remanescente.
17. A construção de um anticorpo biespecífico CD19xCD3 com cadeia singela para a utilização da reivindicação 16, em que a dose inicial seja administrada durante um, dois ou mais dias, ou durante sete dias. Lisboa, 28 de Outubro de 2015.