PT2266665T

PT2266665T - Método para o melhoramento da sinalização de ilhéus na diabetes mellitus e para a sua prevenção

Info

Publication number: PT2266665T
Application number: PT101795151T
Authority: PT
Inventors: Demuth Hans-Ulrich; Glund Konrad
Original assignee: Royalty Pharma Collection Trust
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-04-02
Publication date: 2016-07-07
Also published as: AU2001254763A1; US6500804B2; AU2006202344A1; DK1283735T3; EP1283735A2; DK1283735T4; ES2320630T3; HK1130015A1; CN101690815A; EP2055302B1; HU229042B1; KR20080067009A; ES2320630T5; BR0109553A; CY1108872T1; US20050222221A1; HK1051007A1; WO2001072290A2; HUP0204459A3; DK2055302T3

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA O MELHORAMENTO DA SINALIZAÇÃO DE ILHÉUS NA DIABETES MELLITUS E PARA A SUA PREVENÇÃO"

ANTECEDENTES 0 pâncreas compreende dois tecidos glandulares, um é uma coleção de células que formam a função exócrina do pâncreas, em que estas células exócrinas sintetizam e libertam enzimas digestivas no intestino; o segundo tecido compreende a função endócrina do pâncreas que sintetiza e liberta hormonas na circulação. De importância primordial na função endócrina do pâncreas são as células β. Estas células sintetizam e segregam a hormona insulina. A hormona insulina desempenha um papel vital na manutenção dos niveis glicémicos fisiológicos normais. Estas são moléculas que são efectoras das células endócrinas do pâncreas. As incretinas são um exemplo de tais moléculas. As incretinas potenciam a secreção de insulina do pâncreas induzida por glicose.

Demonstrou-se que as incretinas, tal como a amida do péptido-1 semelhante a glucagom (7-36) ("GLP-1"; ou o análogo de lagarto Exendina-4) e o polipéptido inibidor gástrico ("GIP") são insulinotrópicos, i. e. , a sua presença ou estabilização podem manter controlo glicémico agudo pelos seus efeitos secretores de insulina (Demuth, H.U. et al., documento DE 19616486: 1-6, 1996; Pauly, R.P. et al., Regul. Pept. 64(1-3): 148, 1996, cujos ensinamentos são aqui integralmente incorporados por referência) . Além disso, foi demonstrado que o GLP-1 atua como uma hormona de crescimento de ilhéus por estimulação da proliferação das células β, aumento da massa celular e por promoção de células pancreáticas indiferenciadas a células especializadas de ilhéus de Langerhans. Essas células apresentam secreção melhorada de insulina e glucagom (Yaekura, K. et al. , IN: VIP, PACAP, and Related Peptides, W.G. Forssmann e S.I. Said (eds.) , Nova Iorque: New York Academy of Sciences, 1998, p. 445-450; Buteau, J. et al., Diabetologia 42(7): 856-864, 1999, cujos ensinamentos são aqui integralmente incorporados por referência).

Foi proposta anteriormente a aplicação do GLP-1 bioativo exógeno ou dos seus análogos, para estimular a regeneração das células dos ilhéus in vivo ou obter células pancreáticas de doentes com diabetes mellitus e tratar essas células ex vivo em cultura de tecidos utilizando GLP-1 bioativo. Foi considerado que este tratamento ex vivo facilitava a regeneração e/ou diferenciação das células dos ilhéus que podiam então sintetizar e segregar insulina ou glucagom (Zhou, J. et al., Diabetes, 48(12): 2358-2366, 1999; Xu, G. et al., Diabetes, 48(12): 2270-2276, 1999, cujos ensinamentos são aqui integralmente incorporados por referência).

Contudo, esse regime de tratamento requer a aplicação entérica ou parentérica de GLP-1 bioativo aos doentes, incluindo a possibilidade de cirurgia. Um aspeto é obviar a necessidade de tratamento cirúrgico, aplicações entéricas ou parentéricas de GLP-1 bioativo.

SUMÁRIO A presente invenção refere-se a uma nova utilização, na qual a redução de atividade da enzima Dipeptidil Peptidase (DP IV ou CD 26) ou de atividade enzimática semelhante a DP IV no sangue de mamíferos induzida por efetores da enzima conduz como consequência a uma degradação reduzida da Amida-1 7-36 polipeptídica gastrointestinal do péptido semelhante a glucagom (GLP-17_36) (ou análogos funcionais estruturalmente relacionados deste péptido, tal como GLP-17_37, ou fragmentos truncados mas biologicamente ativos de GLP-17_36) por DP IV e enzimas semelhantes a DP IV. Esse tratamento vai resultar numa redução ou atraso no decréscimo da concentração de hormonas peptídicas circulantes funcionalmente ativas a GLP-1 (incluindo derivados de GLP-1) ou os seus análogos.

Como consequência da estabilidade aumentada resultante dos péptidos circulantes de GLP-1 endógeno (incluindo derivados de GLP-1) causada pela inibição da atividade de DP IV, a atividade de GLP-1 é prolongada resultando em hormonas peptídicas circulantes funcionalmente ativas a GLP-1 (incluindo derivados de GLP-1) que facilitam a estimulação semelhante à de hormonas do crescimento de células pancreáticas de tal modo que estas células proliferam em células funcionalmente ativas dos ilhéus de Langerhans. Além disso, as células pancreáticas insensíveis ou as células pancreáticas deterioradas podem ser transformadas em células funcionalmente ativas dos ilhéus de Langerhans quando expostas a GLP-1.

Esperava-se que a transformação de células pancreáticas insensíveis ou de células pancreáticas deterioradas em células funcionalmente ativas dos ilhéus de Langerhans resultasse numa secreção de insulina aumentada e num nível de insulina aumentado no plasma sanguíneo. Surpreendentemente, em estudos em voluntários humanos saudáveis e ratos Zucker diabéticos obesos, o nível de insulina diminuiu após o tratamento com o inibidor de DP IV hemifumarato de isoleucil tiazolidina (P32/98) (ver exemplos 1 e 2, respetivamente). Apesar disso, a regeneração resultante dos ilhéus de Langerhans não altera a eficácia de insulina endógena e outras hormonas dos ilhéus, tais como glucagom, de tal modo que é efetuada a estimulação do metabolismo dos hidratos de carbono de um mamífero tratado. Como resultado, o nível de glicose no sangue cai abaixo da concentração de glicose característica da hiperglicemia, como ilustrado nos exemplos 1 e 2. Não se conhece em pormenor o mecanismo que despoleta estes efeitos. Contudo, esta regeneração resultante das células dos ilhéus vai ainda afetar anomalias do metabolismo incluindo glucosúria, hiperlipidemia, bem como acidoses metabólicas graves e Diabetes mellitus, por prevenção ou alívio destas sequelas.

Em contraste com outros métodos propostos conhecidos na técnica, tais como o transplante de células ou tecido pancreáticos ou o tratamento ex vivo de células pancreáticas utilizando GLP-1 ou exendina-4 seguido por reimplantação das células tratadas, a presente invenção não causa ou requer cirurgia complicada e cara, e proporciona uma terapia disponível oralmente. A presente invenção representa uma nova abordagem para diminuição da concentração elevada da glicose no sangue. É comercialmente útil e adequada para utilização num regime terapêutico, especialmente para doenças em seres humanos, muitas das quais são causadas por níveis elevados prolongados de glicose no sangue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Pode ter-se um melhor entendimento da presente invenção por referência às figuras em que: a FIG. 1 é uma representação gráfica da dependência do tempo de GLP-1 bioativo circulante em humanos (n=36) dependendo da formulação P32/98 de inibidor de DP IV para aplicação oral; a FIG. 2 é um gráfico que representa a dependência da AUC de GLP-1 bioativo circulante em humanos (n=36) da formulação P32/98 de inibidor de DP IV para aplicação oral; a FIG. 3 é uma representação gráfica que mostra o melhoramento da glicose no sangue pela manhã (MBG) após aplicação de monoterapêutica subcrónica de 8,7 mg/kg de P32/98 a ratos fa/fa diabéticos obesos; a FIG. 4a é uma representação gráfica que mostra o controlo da glicose melhorado devido a tratamento com inibidor de DP IV após 16 dias de tratamento em ratos diabéticos obesos; a FIG. 4b é uma representação gráfica que mostra a secreção reduzida de insulina devida a tratamento com inibidor de DP IV após 16 dias de tratamento em ratos diabéticos obesos; a FIG. 5a é uma representação gráfica que mostra os níveis de glicose no sangue em função do tempo na manutenção de glicemia melhorada após 21 dias de tratamento subcrónico de ratos fa/fa diabéticos e obesos pelo inibidor de DP IV formulado P32/98; e a FIG. 5b é uma representação gráfica que mostra os níveis de insulina no plasma em função do tempo na manutenção de glicemia melhorada após 21 dias de tratamento subcrónico de ratos fa/fa diabéticos e obesos pelo inibidor de DP IV formulado P32/98.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção pertence a um inibidor da atividade da enzima dipeptidil peptidase IV para utilização na facilitação da estimulação semelhante a hormona de crescimento de células pancreáticas para células funcionalmente ativas dos Ilhéus de Langerhans para utilização num método de tratamento de diabetes mellitus. A secreção de insulina induzida por glicose é modulada por várias hormonas e neurotransmissores. São de interesse específico duas hormonas do intestino, o péptido 1 semelhante a glucagom (GLP-1) e o péptido inibidor gástrico (GIP), de que ambos são agentes insulinotrópicos. Os agentes insulinotrópicos podem estimular ou provocar a estimulação da síntese ou expressão da hormona insulina. 0 GLP-1 é um agente insulinotrópico intestinal potente que aumenta a secreção de insulina e baixa de forma aguda os níveis de glicose, incluindo os níveis observados em diabetes de Tipo I e Tipo II. 0 GLP-1 é formado por clivagens específicas de tecidos alternativos nas células L do intestino, as células α da pancrease endócrina e neurónios do cérebro. 0 GIP é sintetizado e libertado do duodeno e jejuno próximo pós-prandialmente. A sua libertação depende de vários fatores incluindo teor da refeição e do estado de saúde pré-existente. Foi inicialmente descoberto e designado pelas suas propriedades inibidoras do ácido gástrico. Contudo, à medida que progrediu a investigação sobre esta hormona, foram elucidados papéis fisiológicos mais relevantes. Especificamente o GIP é um agente insulinotrópico com um efeito estimulador sobre a síntese e libertação da insulina. A DP IV é uma enzima que é uma exopeptidase que cliva péptidos seletivamente a seguir aos penúltimos resíduos N-terminais de prolina e alanina. Os substratos endógenos desta enzima incluem as incretinas, tais como polipéptidos insulinotrópicos dependentes de glicose, como GIP e GLP-1. Na presença de DP IV, estas hormonas são reduzidas enzimaticamente a formas inativas. A forma inativa do GIP e GLP não pode induzir a secreção de insulina, por isso, os níveis de glicose no sangue são aumentados, especialmente no estado hiperglicémico. Os níveis elevados de glicose no sangue foram associados a muitas patologias diferentes, incluindo diabetes mellitus (Tipo 1 e 2) e as sequelas que acompanham a diabetes mellitus.

Também se constatou que a DP IV desempenha um papel nas respostas imunes mediadas por células T, por exemplo, em transplantações. Foi demonstrado que a inibição da DP IV prolonga os homoenxertos cardíacos. Além disso, a inibição da DP IV contribuiu para a supressão de artrite reumatoide. À DP IV também foi atribuído um papel na penetração do VIH em células T (células T auxiliares).

Foram desenvolvidos agentes, tais como N-(N'-glicil substituído)-2-cianopirrolidinas, L-treo-isoleucil-tiazolidina (P32/98), L-alo-isoleucil-tiazolidina, L-treo-isoleucil-pirrolidina e L-alo-isoleucil-pirrolidina que inibem a atividade enzimática da DP IV e estão descritos nos documentos US 6001155, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501 e WO 99/46272, cujos ensinamentos são aqui integralmente incorporados por referência. O objetivo destes agentes é inibir a DP IV e, ao fazê-lo, baixar os níveis de glicose no sangue, tratando deste modo eficazmente a hiperglicemia e doenças que a acompanham associadas a níveis elevados de glicose no sangue. A requerente constatou surpreendentemente que esses agentes podem ser empregues vantajosamente para um fim terapêutico inteiramente diferente dos previamente conhecidos pelos especialistas na técnica.

As doenças que caracteristicamente demonstram hiperglicemia incluem doenças, tal como diabetes mellitus, de Tipo I e II. A diabetes pode ser caracterizada genericamente como uma produção de hormona insuficiente pelas células β pancreáticas. Normalmente, estas células sintetizam e segregam a hormona insulina. Na diabetes de Tipo I, esta insuficiência é devida à destruição das células beta por um processo autoimune. A diabetes de tipo II é principalmente devida a uma combinação de deficiência de células beta e resistência a insulina periférica. No doente diabético, o número de células beta está reduzido, por isso não só existe uma preocupação no que refere à aptidão das células beta para sintetizar e libertar insulina fisiológica, mas existe também uma preocupação em torno da massa crítica destas células pancreáticas produtoras de insulina. Sabe-se que ocorre a perda de células beta com a presença de diabetes. Com a perda destas células produtoras de insulina, existe uma tensão sobre a função endócrina do pâncreas para produzir, por exemplo, insulina. Com a perda da produção de insulina, os processos patológicos devidos à hiperglicemia podem tornar-se exacerbados. 0 GLP-1 atua como uma hormona do crescimento dos ilhéus por estimulação da proliferação de células β, aumento da massa celular e por promoção de células pancreáticas indiferenciadas a células especializadas dos ilhéus de Langerhans. Essas células pancreáticas expostas a GLP-1 apresentam secreção melhorada de insulina e glucagom (Yaekura, K. et al. , IN: VIP, PACAP, and Related Peptides, W.G. Forssmann e S.I. Said (eds.), Nova Iorque: New York Academy of Sciences, 1998, p. 445-450; Buteau, J. et al. , Diabetologia 42(7): 856-864, 1999). A requerente constatou que é desejável aumentar a semi-vida do GLP-1 para assim facilitar a reconstituição das células beta pancreáticas. A requerente constatou um método em que o catabolismo do GLP-1 pode ser atenuado de modo a melhorar a reconstituição das células pancreáticas. A utilização da presente invenção para o tratamento de diabetes mellitus num mamifero, incluindo mas não limitado a humanos, compreende a potenciação da presença de GLP-1 por inibição de DP IV ou atividades enzimáticas relacionadas, utilizando um inibidor da enzima. A administração oral de um inibidor de DP IV pode ser preferida na maioria das circunstâncias. Contudo, na presente invenção estão consideradas outras vias de administração. Por inibição da atividade enzimática de DP IV, a semi-vida da forma ativa de GLP-1 vai ser apreciavelmente prolongada e mantida em condições fisiológicas. A presença prolongada de GLP-1 ativa, em particular no tecido pancreático, vai facilitar a diferenciação das células epiteliais pancreáticas em células efectoras pancreáticas, como células β produtoras de insulina. Mostrou-se também que o prolongamento da presença fisiologicamente ativa de GLP-1 em tecido pancreático vai facilitar a regeneração dessas células β que já estão presentes mas necessitadas de reparação. Surpreendentemente, este efeito só é observável após dosagem repetida (ver exemplo 2). Uma vez que após a remoção da medicação é restaurado o estado metabólico antes do tratamento, é necessário manter a dosagem subcrónica ou crónica do inibidor de DP IV para manter a glicemia melhorada conseguida. Estas células produtoras de insulina reparadas podem assim contribuir eficazmente para a correção e manutenção de níveis glicémicos fisiológicos normais.

Na presente invenção o GLP-1 endógeno é sintetizado e libertado nas vias fisiológicas normais. A ingestão de uma refeição pode estimular a libertação de GLP-1. Alternativamente, a glicose ou o seu análogo podem ser administrados oralmente na forma de um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, uma "pílula de açúcar") de modo a estimular a libertação de GLP-1 endógeno. Essa glicose pode ser tomada antes, ao mesmo tempo ou depois da administração dos inibidores de DP IV.

Esta invenção também proporciona composições farmacêuticas. Essas composições compreendem uma quantidade terapeuticamente (ou profilaticamente) eficaz do inibidor (e/ou uma pílula de açúcar para acompanhar a administração de um inibidor de DP IV) e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 veículo e a composição são produzidos em condições de boas práticas de laboratório e são estéreis. A formulação é idealmente selecionada para ser adequada ao modo de administração, de acordo com a prática convencional.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem mas não estão limitados a água, soluções de sais (por exemplo, NaCl) , álcoois, goma-arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietilenoglicóis, gelatina, hidratos de carbono, tais como lactose, amilose ou amido, estearato de magnésio, talco, parafina viscosa, óleo de perfume, ésteres de ácidos gordos, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona, etc. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e se desejado misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, substâncias corantes, aromatizantes e/ou aromáticas e semelhantes, que não reagem de forma nociva com os compostos ativos, mas que melhoram a estabilidade, manufaturabilidade e/ou atração estética.

As composições, se desejado, também podem conter quantidades minoritárias de agentes molhantes ou agentes emulsionantes ou agentes de tamponamento do pH. Além disso, a composição pode ser uma solução, suspensão ou emulsão líquida, comprimido, pílula, cápsula, formulação de libertação controlada ou pó. Além disso, a composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, tal como triglicéridos. As formulações orais podem incluir veículos convencionais, tais como qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.

Além disso, as composições podem ser formuladas de acordo com métodos que são bem conhecidos na técnica da composição farmacêutica, adaptados para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções aquosas tamponadas isotónicas estéreis. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local para aliviar a dor no sítio da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água num recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de composto ativo. Quando a composição se destina a ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água de qualidade farmacêutica, soro fisiológico ou dextrose/água estéreis. Quando a composição é administrada por injeção, pode ser fornecida uma ampola de água para injeção ou soro fisiológico estéreis de modo que os ingredientes possam ser misturados imediatamente antes da administração.

Finalmente, as composições da invenção podem ser formuladas como formas neutras ou de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com grupos amino livres tais como os derivados do ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e os derivados de hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, ferro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e outras formas de sal que são bem conhecidas na técnica. A quantidade da composição de invenção que vai ser eficaz no tratamento de um distúrbio ou estado específico vai depender da natureza da doença ou estado e pode ser determinada por técnicas clínicas correntes. Além disso, podem ser empregues opcionalmente ensaios in vitro e/ou in vivo para ajudar a identificar as gamas de dosagem ótimas. A dose exata a ser empregue na formulação vai também depender da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio. A dose deve ser decidida de acordo com a avaliação do médico assistente tomando em consideração as circunstâncias de cada doente.

Será facilmente entendido pelo especialista que podem ser feitas numerosas alterações aos exemplos e instruções aqui fornecidos incluindo a produção de diferentes inibidores de DP IV e composições terapêuticas alternativas sem se afastado do espirito ou âmbito da presente invenção. Os seguintes exemplos como descritos não pretendem ser entendidos como limitativos do âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 0 inibidor de DP IV P32/98 é transportado ativamente através do transportador péptido intestinal PepTl. 0 transporte rápido e ativo de P32/98 através da mucosa intestinal é responsável pelo seu começo rápido. 0 tmax é um pré-requisito para o direccionamento eficiente da dipeptidil peptidase IV (DP IV) . A administração oral de P32/98 resulta numa inibição alvo máxima de 15 a 20 min e 30 a 40 min após ingestão em ratos e homens, respetivamente. Portanto, o inibidor de DP IV deve ser administrado 10-20 min antes da ingestão de glicose ou de uma refeição.

No primeiro estudo em humanos com P32/98, parâmetros farmacodinâmicos como a concentração de insulina e a concentração de GLP-1 no plasma e de glicose no sangue foram investigados em 36 voluntários saudáveis do sexo masculino. A dosagem oral de P32/98 foi nas seguintes concentrações: 7,5 mg, 15 mg, 30 mg, 60 mg, 120 mg e 240 mg. Os resultados dos parâmetros farmacodinâmicos acima estão resumidos abaixo na Tabela 1.

Os 36 indivíduos saudáveis do sexo masculino foram divididos em 3 grupos individuais com cada grupo contendo 12 indivíduos. Em cada grupo individual 9 indivíduos receberam fármaco ativo P32/98 e 3 receberam placebo. Os indivíduos que receberam fármaco ativo foram doseados por duas vezes, em períodos diferentes e em concentrações diferentes. As concentrações de P32/98 recebidas dentro dos grupos foram como se segue: o grupo I recebeu 7,5 mg e 60 mg; o grupo II recebeu 15 mg e 120 mg; e o grupo III recebeu 30 mg e 240 mg. Aos indivíduos de todos os grupos que receberam placebo, foi administrado placebo em ambos os intervalos de dosagem.

Foi realizado um exame pré-estudo dos indivíduos antes do estudo dentro de 3-14 dias antes da sua participação no estudo. Uma segunda parte do estudo compreendeu uma fase experimental e implicou seis tratamentos com doses individuais de concentrações crescentes de P32/98, (períodos 1 a 6; Tabela 2) que concluiu com um exame de acompanhamento. Cada indivíduo participou no estudo prévio e fase experimental, que foram separados por uma fase de eliminação de, pelo menos, 5 dias. O exame de acompanhamento foi feito, pelo menos, 7 dias após a última dose do fármaco em estudo. Os processos de estudo dos seis períodos foram idênticos, exceto quanto à dose em investigação. Métodos

Ensaio de tolerância a glicose oral ("OGTT"): Era necessário que os indivíduos estivessem em jejum há, pelo menos, 12 horas e cumprissem uma dieta rica em hidratos de carbono 3 dias antes de cada OGTT. Em cada teste de tolerância à glicose, os indivíduos ingeriram 300 mL de uma solução de mono/dissacáridos equivalentes a 75 g de glicose (Dextro®0.G.-T, Boehringer Mannheim, Alemanha). Foram recolhidas amostras de sangue (1,2 mL em tubos de fluoreto de sódio) imediatamente antes da ingestão de glicose e depois aos 30, 60, 90 e 120 min. Qualquer concentração de glicose acima de 126 mg/dL (7,0 mmol/L) aos 0 min e 120 min foi considerada como estando num estado patológico de tolerância à glicose.

Foi realizado um OGTT prolongado no Dia 1 de cada período de dosagem. Os indivíduos ingeriram 300 mL de uma solução de mono/dissacáridos equivalentes a 75 g de glicose. Foram recolhidas amostras de sangue (1,2 mL) aos seguintes intervalos: 1) 5 minutos antes da ingestão de glicose; 2) aos 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 e 180 min após a ingestão de glicose; 3) 4, 12, e 24 e 48 horas após a ingestão de glicose. Além disso, foram feitas outras avaliações farmacodinâmicas que são bem conhecidas na técnica.

Insulina: Recolheu-se 4,7 mL de sangue em tubos com 4,9 mL de EDTA. As amostras foram centrifugadas (1500 g, 10 min) e armazenadas congeladas a -70 2C até à análise laboratorial.

Glicose: Recolheu-se 1,2 mL de sangue em tubos com 1,2 mL de fluoreto de sódio. As amostras de plasma foram centrifugadas a 1500 g durante 10 min e armazenadas a -70 2C até à análise laboratorial. GLP-1 : Recolheu-se 2,7 mL de sangue em tubos com EDTA e colocou-se em gelo ou refrigerou-se, aos quais se adicionou um inibidor de dipeptidil peptidase IV. O inibidor foi preparado com antecedência por investigadores. O sangue foi recolhido em tubos e centrifugado imediatamente a 1000 g durante 10 min numa centrífuga refrigerada ou o sangue foi colocado em gelo e centrifugado dentro de 1 hora e dividido em aliquotas iguais. 0 sangue foi armazenado em aliquotas apropriadas a -70 2C (para evitar múltiplos ciclos de congelação/descongelação) até à análise laboratorial.

Resultados

Concentrações de GLP-1 ativo. Verificou-se um efeito dependente da dose de P32/98 em comparação com o placebo. As concentrações individuais globais variaram entre 2-68 pmol/L. As médias dos grupos pré-administração estavam entre 3,77 ± 2,62 pmol/L e 6,67 ± 9,43 pmol/L e aumentaram de até 4,22 e 7,66 pmol/L após a utilização de um placebo, mas de 11,6 pmol/L (15 mg) e 15,99 pmol/L (240 mg de P32/98) após a utilização do inibidor. Se o aumento médio relativo for calculado a partir das concentrações absolutas, as concentrações de GLP-1 ativo aumentaram aproximadamente 200-300% após o tratamento com placebo, mas aproximadamente 300-400% após o tratamento com P32/98. O aumento absoluto em medianas após 15-240 mg de P32/98 foi 2-3 vezes maior em comparação com o placebo e a dose de 7,5 mg (ver Tabela 1) e indicou grosso modo uma relação dose-resposta. Um aumento acima dos valores pré-administração estava presente até aproximadamente 3-4 horas em relação à dose de P32/98 dose.

As concentrações de insulina apresentaram uma gama de valores individuais global entre 3,40 e 155,1 pUI/mL. A média (+DP) de concentrações pré-administração variou entre 7,96 ± 1,92 pUI/mL (30 mg) e 11,93 ± 2,91 pUI/mL (60 mg de P32/98). Após a ingestão de 75 g de glicose aos 10 min pós-administração de P32/98/placebo, as concentrações médias de insulina aumentaram em 30,12 pUI/mL (120 mg de P32/98) a 56, 92 pUI/mL (grupo dos 30 mg) dentro de 40-55 min. Não houve diferença evidente entre o placebo e os grupos de tratamento com P32/98 e, mais uma vez, não houve provas de um efeito de dependente da dose de P32/98. É que o aumento absoluto da concentração de insulina era mais baixo nos dois grupos de dosagem mais alta de P32/98 (ver Tabela 1) . As concentrações de insulina estiveram aumentadas durante 3-4 horas em todos os grupos de estudo incluindo o do placebo.

As concentrações de glicose mostraram uma gama global entre 2,47 a 11,7 mmol/L no estado de jejum, durante o OGGT ou após refeições em todos os indivíduos do estudo. As concentrações médias de pré-administração entre 4,55 ± 0,41 (15 mg) e 4,83 ± 0,30 mmol/L (7,5 mg de P32/98) apresentaram estreita correspondência uma à outra e mostraram pouca variação. As concentrações médias máximas foram atingidas dentro de 40-55 min pós-administração, i. e., dentro de 30-45 min após a dose de 75 g de glicose. As concentrações médias absolutas eram mais altas nos dois grupos do placebo e dos 7,5 mg de P32/98. As médias absolutas mais baixas foram obtidas nos grupos com as doses de 15 mg, 60 mg e d-240 mg. As correspondentes alterações médias variaram entre 3,44 a 4,21 mmol/L e 1,71 a 3,41 mmol/L, respetivamente, e correspondiam estreitamente às medianas proporcionadas na Tabela 1. Embora não se observasse uma perfeita dependência da dose, estes resultados indicam um aumento mais baixo das concentrações de glicose com doses crescentes de 15-240 mg de P32/98 em comparação com o placebo.

Tabela 1: Alterações Máximas de Parâmetros Farmacodinâmicos (0-12 h, medianas)

Tabela 2: Cmax Corrigida e AUC das Concentrações de Glicose 0-3 h após OGTT

1 Resultados de comparação ANOVA versus placebo * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001

As concentrações médias do pico (Cmax) de glicose corrigidas quanto à linha de base excederam 4,0 mmol/L só nos dois grupos de placebo e 7,5 mg de P32/98. Estes valores também estavam abaixo de 3,0 mmol/L nos grupos de tratamento com 15 mg e de 240 mg de P32/98 . A diferença comparada com o tratamento com placebo era estatisticamente significativa para os grupos que receberam 15 mg, 60 mg, 120 mg e 240 mg de P32/98, mas não para os grupos que receberam doses de 7,5 mg e 30 mg. Os valores médios da AUC corrigidos quanto à linha de base eram > 200 mmol*min/L após o placebo e 7,5 mg de P32/98, mas claramente abaixo de 200 mmol*min/L após as doses de 15 mg e 240 mg de P32/98. A redução da exposição sistémica a glicose do OGTT era estatisticamente significativa para os grupos tratados com as doses de 15 mg, 60 mg, 120 mg e 240 mg de P32/98, mas não para os grupos tratados com a dose de 7,5 mg e 30 mg (ver Tabela 2) . A avaliação dos valores corrigidos quanto à linha de base era muito semelhante à obtida dos dados não corrigidos. Assim, os dados indicaram uma exposição a glicose claramente mais baixa após o OGTT em indivíduos saudáveis tratados com P32/98, que era uma indicação dependente da dose aproximada, mas não perfeita.

Conclusões

Os resultados deste estudo permitem as seguintes conclusões farmacodinâmicas: O GLP-1 ativo aumentou aproximadamente 300-400% após o tratamento com P32/98 10 min antes do OGTT, mas não foi observado efeito discernível do tratamento com placebo para o nível de dose de 7,5 mg (ver figuras 1 e 2). As concentrações de insulina pareceram estar diminuídas para as doses de 120-240 mg após estimulação com 75 g de glicose. Durante o OGTT em indivíduos saudáveis as concentrações de glicose evidenciaram um aumento significativamente mais baixo após o tratamento com P32/98 (15-240 mg) em comparação com o placebo, que estava relacionado com a dose de P32/98.

Exemplo 2

No rato Zucker obeso, ο P32/98 dependente do nutriente suporta a secreção inicial de insulina. Contudo, durante um tratamento subcrónico, ο P32/98 reduz a secreção de insulina diária total. Em comparação com uma glibenclamida de controlo, que aumentou a produção de insulina em 27%, ο P32/98 causa uma economia de insulina poupando 45% em comparação com o controlo.

Foram realizados ensaios para determinar se ο P32/98 é um candidato principal a influenciar a tolerância à glicose in vivo por aumento das semi-vidas circulantes das incretinas GIP e GLP-1. Foram realizados estudos comparativos com glibenclamida (Maninil®, Berlin-Chemie, Berlim, Alemanha) como substância de referência. A glibenclamida é um dos fármacos mais eficazes para reduzir a glicose no sangue em doentes diabéticos de Tipo 2 e uma das sulfonilureias mais frequentemente receitadas.

Ratos fa/fa machos Zucker, que apresentavam anomalias no metabolismo da glicose e são um modelo animal bem estabelecido da diabetes de Tipo 2, foram investigados do modo seguinte: P32/98 e glibenclamida foram administrados uma vez por dia antes da ingestão de alimentos durante um período de 21 dias. Os parâmetros monitorizados foram a glicose no sangue pela manhã e os níveis plasmáticos de insulina. Num perfil dia-noite, a glicémia e a insulinemia foram monitorizadas do dia 16 para o dia 17. Foi realizado um OGTT finalmente no dia 21 para monitorizar a cinética da glicose do sangue e da insulina plasmática para avaliar alterações da tolerância à glicose. A glibenclamida (DAB 1996; RO 11150/33372) foi oferta da

Berlin-Chemie (Berlim, Alemanha). Os ratos (fa/fa) Zucker machos da classe de peso corporal de 300 g foram comprados a Charles River (Sulzfeld, Alemanha). Métodos

Condições de alojamento: Os animais foram mantidos em gaiolas individuais em condições convencionais com temperatura controlada (22±2 2C) num ciclo de 12/12 horas de luz/escuridão (luz às 06.00 a.m.). Foram permitidos ração em granulado (ssni ff®, Soest, Alemanha) e água da torneira acidificada com HC1 ad libitum.

Cateterização da artéria carótida: Após uma semana de adaptação foram implantados cateteres nas carótidas dos ratos sob anestesia geral (injeção de 0,25 mL/kg i.p. de Rompun® [2%], Bayer, Alemanha) e 0,5 mL/kg i.p. de Velonarkon® (Arzneimittelwerk Dresden, Alemanha). Deixou-se que os animais recuperassem durante uma semana. O cateter foi lavado com heparina-solução salina (100 UI/mL) três vezes por semana.

Dosagem repetida: 30 ratos Wistar machos não diabéticos e 30 ratos Zucker machos diabéticos foram aleatorizados pelos

grupos RP (Produto de Referência: glibenclamida) , TP (Produto de Teste: P32/98) e CO (Controlo) (N=10 por grupo). Em seguida, os ratos Wistar não diabéticos foram tratados oralmente uma vez por dia com RP (5 mg/kg de peso corporal) ou TP (21,61 mg/kg de peso corporal) e os ratos Zucker diabéticos foram tratados oralmente uma vez por dia com RP (1 mg/kg de peso corporal) ou TP (21,61 mg/kg de peso corporal) durante 21 dias às 05.00 p.m. (antes da ingestão regular de alimentos na fase de escuridão). Aos controlos foi administrada oralmente solução de celulose a 1% (5 mL/kg). As amostras de sangue foram recolhidas todas as

manhãs às 07.30 a.m. das veias da cauda para medição da glicose no sangue e insulina no plasma. As últimas amostras de sangue desta parte do programa foram recolhidas às 7.30 h a.m. no 152 dia para medir a glicose no sangue e a insulina no plasma. A terapia oral com fármaco foi continuada durante uma semana. O registo do perfil dia-noite sob a terapia descrita acima da glicose no sangue (At = 3 h) e insulina no plasma (At = 3-6 h) foi monitorizado desde o dia 16 (inicio às 05.00 p.m.) até ao dia 17 (final às 02.00 p.m.). OGTT: Realizou-se um OGTT final no dia 21 com amostragem de sangue da veia da cauda. As amostras de sangue da veia da cauda foram recolhidas às -12 h (na noite antes do dia 21), aos 0 min (imediatamente antes do inicio do OGTT), aos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 e 120 min. As amostras de sangue foram recolhidas em capilares de vidro de 20 pL para determinações de glicose no sangue em tubos Eppendorf (100 pL) . Estes últimos foram imediatamente centrifugados e as frações de plasma foram armazenadas a -20 2C para análise de insulina.

Glicose no sangue: Os níveis de glicose foram determinados utilizando o processo da glicose oxidase (Super G Glukose- mePgerãt; Dr. Muller Gerãtebau, Freital, Alemanha).

Insulina no plasma: As concentrações de insulina foram determinadas pelo método RIA de anticorpos (LINCO Research, Inc. St. Charles, Mo., EUA).

Resultados

Perfil dia-noite de glicemia (ver figura 4A): A concentração média de glicose no sangue no grupo CO no dia 16 era 7,78 ± 0,83 mmol/L antes da aplicação do fármaco às 05.00 p.m. Após a ingestão oral do placebo e da ingestão de alimentos na fase noturna a glicemia aumentou para valores máximos de 12,18 ± 1,34 mmol/L às 11.00 p.m. Depois disso, a glicemia baixou muito lentamente até aos valores mais baixos de 7,27 ± 0,61 mmol/L às 11. a.m., seguido por um aumento até 8,90 ± 0,92 mmol/L às 02.00 p.m. do dia seguinte. No grupo RP, observou-se uma situação semelhante. Contudo, a partir de um valor médio comparável de 7,96 ± 1,13 mmol/L às 05.00 p.m. em relação aos animais de controlo houve um aumento mais forte para 14,80 ± 1,46 mmol/L (11.00 p.m.) e, depois disso, um decréscimo para 7,66 ± 1,22 mmol/L (11.00 a.m.) e mais uma ligeira redução para 7,34 ± 0,77 mmol/L às 02.00 p.m. do dia seguinte, respetivamente. No grupo TP os ratos Zucker tinham um valor médio da glicose no sangue normal de 5,25 ± 0,16 mmol/L às 05.00 p.m. e os valores individuais estavam na gama de 4,34 a 6,07 mmol/L. A glicemia evidenciou um aumento de cerca de 3 mmol/L a 8,34 ± 0,47 mmol/L às 11.00 p.m. Este foi seguido por um decréscimo permanente até valores basais que foram atingidos às 08.00 a.m. (5,64 ± 0,23) e que foram mantidos às 11.00 a.m. (5,33 ± 0,14 mmol/L) e 02.00 p.m. do dia seguinte (5,51 ± 0,19 mmol/L), respetivamente.

Perfil dia-noite de insulinemia (ver figura 4B) : Os ratos Zucker de CO e RP eram fortemente hiperinsulinémicos. A insulina apresentou uma variabilidade de valores médios às 05.00 p.m. no grupo CO (47,0 ± 8,7 ng/mL) , 08.00 p.m. (45,5 ± 7,7 ng/mL) , 05.00 a.m. (54,2 ± 5,7 ng/mL) e 02.00 p.m. do dia seguinte (61,0 ± 10,2 ng/mL; NS) que não mostraram ter relação com as excursões da glicose no sangue. No grupo RP na fase escura desde as 06.00 p.m. até às 06.00 a.m. houve um aumento significativo dos valores da insulina no plasma com um máximo às 5.00 a.m. Este parâmetro aumentou desde valores fortemente hiperinsulinémicos de 50,0 ± 8,2 ng/mL (05.00 p.m.) via 57,3 ± 8,2 ng/mL (08.00 p.m.) até 76,3 ± 8,6 ng/mL (05,00 a.m.; p < 0,01 vs. valor inicial), que foi seguido por um decréscimo para 58,3 ± 7,3 ng/mL (02.00 p.m. do dia seguinte) . Neste grupo RP a insulina estava fortemente desfasada em relação às excursões da glicose no sangue. No grupo TP, os ratos Zucker também eram hiperinsulinémicos. A insulina plasmática às

05.00 p.m. era significativamente inferior à do grupo RP (p < 0,05 vs. RP) . Paralelamente aos aumentos da glicose no sangue (Fig. IV/3A) houve um aumento da insulina plasmática às 08, 00 p.m. (41,9 ± 8,5 ng/mL) . O valor máximo da insulina foi determinado às 05.00 a.m. (57,1 ± 8,6 ng/mL; p < 0,01 vs. valores iniciais) . A concentração de insulina plasmática foi diminuída atingindo a concentração basal (24,3 ± 3,7 ng/mL) a ca. 2.00 p.m. do dia seguinte que era significativamente mais baixa do que nos grupos CO ou RP (p < 0,01 vs. CO ou TP). OGTT após 21 dias de tratamento, curvas de glicose no sangue (Ver Figura 5A): A última aplicação do fármaco às 05.00 p.m. e o período de jejum de um dia para o outro no dia 21 foram seguidos por um decréscimo significativo da glicemia no grupo CO de 8,68 ± 1,26 mmol/L (05.00 p.m.) para 5,08 ± 0,24 mmol/L (p < 0,05), no grupo RP de 8,81 ± 1,21 mmol/L para 4,91 ± 0,37 mmol/L (p < 0,01) e no grupo TP de 5,75 ± 0,23 mmol/L para 4,88 ± 0,13 mmol/L (p < 0,01). Por esta razão foram efetuadas cargas de glicose oral a partir de um nível de concentração de glicose basal comparável em todos os três grupos experimentais encontrado pela manhã (07.30 a.m.).

No grupo CO a glicemia aumentou após a aplicação oral de glicose para valores de pico de 14,64 ± 1,42 mmol/L dentro de 40 min. Mais tarde houve um ligeiro decréscimo significativo para 9,75 ± 0,46 mmol/L no final do teste (120 min) . No grupo RP, houve um aumento acentuado para valores mais altos de glicose no sangue de 16,33 ± 0,98 e 16,24 ± 1,09 mmol/L aos

50 min e 80 min, respetivamente. As concentrações elevadas de glicose foram mantidas até ao final do estudo aos 120 min (100 min: 15,13 ± 0,76 mmol/L, 120 min: 14,81 ± 0,66 mmol/L; NS dos valores de pico anteriores) . No grupo TP, foram encontradas propriedades semelhantes às do grupo CO para a curva da glicose média no sangue. A glicemia aumentou para 14,54 ± 0,65 mmol/L aos 50 min e diminuiu significativamente para um valor de 10,67 ± 0,62 mmol/L (120 min; NS de CO). A área sob a curva para a glicose (G-AUC0-120 min) nos grupos CO e TP era 823 ± 41 e 895 ± 50 mmol-min/L, respetivamente (NS) . No grupo RP este parâmetro foi determinado como 1096 ± 76 mmol-min/L e esse valor era significativamente maior do que nos grupos CO (p < 0,01) ou TP (p < 0,05). OGTT após 21 dias de tratamento, insulina plasmática (Ver Figura 5B) : 0 jejum de um dia para o outro nos ratos Zucker levou a concentrações de insulina plasmática reduzidas nos animais CO (14,6 ±3,7 ng/mL), no grupo RP para 11,8 ± 1,5 ng/mL e no grupo TP para 9,3 ± 1,5 ng/mL, respetivamente. As diferenças entre os grupos experimentais não eram significativas. Após um estimulo com glicose, a insulina plasmática permaneceu praticamente inalterada nos grupos CO, RP e TP. Valores ligeiramente mais elevados foram encontrados aos 120 min só no grupo CO, atingindo 21,3 ±3,0 ng/mL, que era significativamente mais elevado do que no grupo TP (p < 0,05) . O I-AUCo-120 min era genericamente baixo. No grupo TP este parâmetro era mais baixo do que nos grupos CO ou RP (NS).

Resumo

Glicose no sangue pela manhã: Os controlos tratados com placebo eram hiperglicémicos (cerca de 7,5 mmol/L). A concentração média esteve inalterada durante o estudo. A terapia RP aumentou a glicose no sangue em cerca de 1,5 mmol/L dentro de dois dias. A glicemia permaneceu na gama alta. A medicação TP reduziu a glicose no sangue para um valor normal em 5 dias. A glicose no sangue permaneceu na gama normal até ao final do estudo.

Insulina plasmática: Os ratos Zucker de controlo eram hiperinsulinémicos e apresentaram mais algum aumento de insulina durante os 14 dias de observação. Os ratos Zucker tratados com RP apresentaram um aumento da insulina para concentrações significativamente mais altas do que as de animais de controlo. A aplicação de TP diminuiu ligeiramente a concentração de insulina durante 14 dias em comparação com os animais de controlo.

OGTT após 21 dias de tratamento, glicose no sangue: 0 jejum de um dia para o outro reduziu a glicose no sangue para valores normais nos grupos experimentais. Os animais tratados com placebo apresentaram um aumento da glicose no sangue de cerca de 9 mmol/L dentro de 40 min após a carga de glicose e uma leve redução depois disso. Os ratos Zucker tratados com RP apresentaram um aumento da glicose no sangue de cerca de 11 mmol/L após a carga de glicose sem diminuição durante o ensaio. A curva da glicose média no sangue dos animais tratados com TP não era diferente da dos controlos. O tratamento com RP aumentou a G-AUC, a medicação com TP não aumentou a G-AUC em comparação com a aplicação do placebo. OGTT após 21 dias de tratamento, insulina plasmática: Os ratos Zucker de controlo tinham a insulina em jejum mais elevada dos três grupos experimentais com cerca de 15 ng/mL. Após a carga de glicose, a insulina aumentou significativamente só no final do ensaio (120 min). Os ratos tratados com RP tinham insulina em jejum um tanto mais baixa de cerca de -12,5 ng/mL no início do OGTT e um aumento mais cedo aos 40 min sem redução no final do ensaio. Os ratos tratados com RT tinham a insulina em jejum mais baixa de cerca de -9 ng/mL no início do OGTT, um aumento modesto mais cedo aos 20 min em relação às concentrações crescentes e reduzidas de glicose no sangue entre 40 min e 100 min. A I-AUC era ligeiramente menor nos ratos tratados com TP.

Conclusão 0 inibidor de DP IV P32/98 (TP) , administrado uma vez por dia, normalizou a glicose no sangue pela manhã, reduziu a hiperinsulinemia, manteve a glicose no sangue no perfil de dia-noite abaixo do valor critico (para doentes diabéticos) de 8,3 mmol/L. A vantagem metabólica foi retida durante um período limitado após a cessação da medicação com P32/98.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Inibidor da atividade da enzima dipeptidil peptidase IV para utilização na facilitação da estimulação semelhante a hormona de crescimento de células pancreáticas para células funcionalmente ativas dos Ilhéus de Langerhans para utilização num método de tratamento de diabetes mellitus.