PT2109449E - Medicamento para o tratamento da endometriose - Google Patents

Description

Descrição

MEDICAMENTO PARA 0 TRATAMENTO DA ENDOMETRIOSE A presente invenção relaciona-se com fármacos para o tratamento da endometriose. A endometriose é uma doença benigna, crónica e ginecológica. Pode ser definida como uma presença do tecido endometrial, que compreende epitélio glandular e estroma, fora da cavidade uterina. É uma doença ginecológica benigna, a qual, numa subpopulação dos pacientes femininos, pode desenvolver-se para uma doença agressiva. A endometriose é associada a vários sintomas dolorosos incluindo dismenorreia, dispareunia, dor pélvica e fertilidade reduzida. É sabido que a angiogénese (o processo através do qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de vasos pré-existentes) pode ser de importância no desenvolvimento de endometriose, e que o factor de permeabilidade vascular/factor de crescimento endotelial vascular (VP/VEGF) tem um papel na génese vascular, e na angiogénese fisiológica e patológica. A potencial eficácia da terapia anti-angiogénica para tratar endometriose foi avaliada através do estudo que usa tecidos endometriais humanos transplantados para ratos sem pêlo imunocomprometidos. Foram administrados quatro agentes anti-angiogénicos diferentes três semanas após os explantes endometriais terem sido transplantados (Nap et al, 2004) . Todos os quatro inibidores foram capazes de reduzir a dimensão dos explantes estabelecidos, e a formação de novos vasos sanguíneos foi parada. Contudo, os agentes anti-angiogénicos conhecidos são altamente tóxicos, e muito difíceis de introduzir num ambiente clínico humano. 1/20

Foi agora descoberto, de forma inesperada, que as composições que incluem um agonista da dopamina podem ser usadas para tratar a endometriose. A presente invenção providencia então o uso de um agonista da dopamina na produção do fármaco para o tratamento e/ou prevenção de endometriose em que o agonista da dopamina interage com um receptor da dopamina para imitar a acção da dopamina. A presente invenção também providencia um agonista da dopamina na produção do fármaco para o tratamento e/ou prevenção de endometriose em que o agonista da dopamina interage com um receptor da dopamina para imitar a acção da dopamina. Neste documento, o termo "tratamento de endometriose" inclui o tratamento para reduzir (ou remover) a porção de tecido endometrial que está presente fora da cavidade uterina (por exemplo, redução ou remoção de lesões endometrióticas) e/ou tratamento para reduzir e/ou aliviar um ou mais sintomas associados à endometriose (por exemplo, tratamento para aliviar e/ou reduzir os sintomas de dismenorreia; tratamento para aliviar e/ou aliviar os sintomas de dispareunia, e/ou tratamento para aliviar e/ou reduzir a dor pélvica). 0 termo "tratamento de endometriose" inclui o tratamento para reduzir o número de instâncias e/ou reduzir a dimensão das instâncias de tecidos endometriais que estão presentes fora da cavidade uterina (por exemplo, redução do número e/ou dimensão das lesões endometrióticas). 0 termo "tratamento de endometriose" inclui o tratamento para reduzir o número de glândulas endometriais. 0 termo "tratamento de endometriose" inclui o tratamento que resulta em um ou mais de: uma diminuição significativa na percentagem de lesões endometrióticas activas; uma perda significativa de celularidade e organização manifestando caracteristicas de tecido atrófico ou degenerativo em lesões endometrióticas; e uma diminuição significativa no número de novos vasos 2/20 sanguíneos em lesões endometrióticas. 0 termo "tratamento de endometriose" inclui o tratamento para reduzir o número e/ou dimensão das lesões endometrióticas em um ou mais ovários, o cul-de-sac uterino, os ligamentos uterossacros, as superfícies posteriores do útero, o ligamento largo, o restante peritoneu pélvico, o intestino, o trato urinário (incluindo, por exemplo, a bexiga e/ou ureteres). 0 termo endometriose inclui, por exemplo, endometriose peritoneal, endometriose ovária e endometriose profunda.

Neste documento, o termo agonista da dopamina significa um composto que actua como a dopamina, por exemplo, um fármaco que interage (por exemplo, une-se especificamente) com um receptor da dopamina para imitar a acção da dopamina. Não inclui compostos que são exclusivamente "substâncias dopaminérgicas", isto é, exclusivamente compostas que, através de diferentes mecanismos de acção, aumentam os níveis da dopamina. 0 termo agonista da dopamina não inclui as indenopirrolocarbazoles de ponte descritas na Patente Americana 6359130.

Foi anteriormente descoberto que os agonistas da dopamina são úteis no tratamento ou prevenção da síndrome de hiper-estimulação dos ovários (OHSS) (WO 2006117608) . Esta é uma doença onde os capilares aumentam, significativamente, a permeabilidade vascular. Foi descoberto que os agonistas da dopamina conseguiam reverter este efeito. Contudo, a condição de endometriose e a eficácia potencial da terapia anti-angiogénica para tratar a endometriose não é aqui descrita. A patente RU2273481 descreve o tratamento de infertilidade.

Os agonistas da dopamina que interagem com o receptor da dopamina para imitar a acção da dopamina dentro dos termos da invenção incluem, mas não estão limitados a, amantadina, 3/20 bromocriptina, cabergolina, quinagolida, lisurida, pergolida, ropinirol e pramipexol. Um agonista da dopamina preferido para utilização na presente invenção é a cabergolina. Um agonista da dopamina preferido para utilização na presente invenção é a quinagolida. Os ditos "agonistas da dopamina parciais" (por exemplo, tergurida) podem também ser usados de acordo com a invenção. Contudo, o uso de agonistas da dopamina é preferido.

Preferencialmente, é utilizado um único agonista da dopamina. Os agonistas da dopamina podem ser administrados numa dose (por exemplo, uma dose oral para um paciente humano) de entre 25 microgramas por dia e 80 mg/dia, preferencialmente entre 50 microgramas por dia e 5 mg/dia, mais preferencialmente entre 300 microgramas por dia e 1 mg/dia; as doses adequadas dentro deste intervalo dependem do agonista da dopamina a ser utilizado, como é aparente àqueles com experiência na técnica.

Numa forma de realização preferida, os agonistas de dopamina são a cabergolina. Preferencialmente, a cabergolina é administrada numa dose (por exemplo, uma dose oral para um paciente humano) de entre 0,01 e 12,5 mg/semana, preferencialmente entre 0,1 e 10 mg/semana, mais preferencialmente entre 0,5 mg e 5 mg/semana, mais preferencialmente numa dose de entre 3,5 mg/semana a 4 mg/ semana. O agonista da dopamina pode ser administrado como, por exemplo, uma dose única diária (de, por exemplo, entre 0,1 mg/dia e 5 mg/dia, de 0,2 mg/dia a 1 mg/dia, por exemplo, 0,5 mg/dia); ou a dose diária pode ser dividida em duas ou mais sub-doses a serem administradas em diferentes alturas durante um período de 24 horas. Os agonistas da dopamina (cabergolina) podem ser administrados como uma dose diária aos níveis acima, ou como doses equivalentes, por exemplo, por semana, duas vezes por semana ou a cada dois dias. Num regime, o agonista da dopamina (por exemplo, cabergolina) é administrado numa dose 4/20 total entre 3,5 e 12,5 mg por semana (por exemplo, 4 mg por semana, 7 mg por semana, 10 mg/semana).

Numa outra forma de realização, o agonista da dopamina é quinagolida. Preferencialmente, a quinagolida é administrada numa dose (por exemplo, uma dose oral a um paciente humano) de entre 25 e 1000 microgramas/dia, preferencialmente entre 25 e 500 microgramas/dia, mais preferencialmente entre 25 e 300 microgramas/dia. 0 agonista da dopamina pode ser administrado como, por exemplo, uma dose única diária; ou a dose diária pode ser dividida em duas ou mais sub-doses a serem tomadas em diferentes alturas ao longo de um período de 24 horas. Os agonistas da dopamina (quinagolida) podem ser administrados como uma dose diária aos níveis acima, ou como doses equivalentes, por exemplo, por semana, duas vezes por semana ou a cada dois dias.

Numa outra forma de realização, o agonista da dopamina é bromocriptina. Preferencialmente, a bromocriptina é administrada numa dose (por exemplo, uma dose oral para um paciente humano) de entre 10 a 80 microgramas/dia, preferencialmente 10 a 40 mg/dia.

Numa forma de realização, o agonista da dopamina é usado como o único tratamento médico para a endometriose. Por outras palavras, o agonista da dopamina pode ser usado na ausência de outros tratamentos médicos ou cirúrgicos [por exemplo, na ausência de danazol] .

Numa outra forma de realização, a administração de agonistas da dopamina pode ser combinada com outros tratamentos médicos ou cirúrgicos para a endometriose [por exemplo NSAID e/ou tratamento hormonal (danazol, OC, acetato de medroxiprogesterona, outras progestinas, agonistas de GnRH e antagonistas, inibidores de aromatase)]. Noutra forma de 5/20 realização, o tratamento cirúrgico ou tratamento médico pode ser usado antes, durante ou depois do tratamento com agonistas da dopamina. Estas formas de realização são descritas com mais pormenor nos exemplos em baixo.

Foi também descoberto que a administração de agonistas da dopamina a um paciente com necessidade do mesmo pode providenciar benefícios clínicos substanciais tais como, por exemplo: uma diminuição significativa na percentagem de lesões endometrióticas activas: perdas significativas de celularidade e organização que manifesta características de tecido atrófico ou degenerativo em lesões endometrióticas; e diminuição significativa no número de vasos sanguíneos em lesões endometrióticas.

Os medicamentos baseados em agonistas da dopamina também têm a vantagem de uma tolerância a dose alta, com registos de uso clínico seguro e bem documentado.

Além disso, foi descoberto que o agonista da dopamina (por exemplo, cabergolina) pode ser administrado durante longos períodos de tempo (por exemplo, 1 a 3 semanas, por exemplo, 1 a 21 dias, por exemplo 1 a 14 dias), de 1 dia a 3 meses, 1 dia a seis meses, 1 dia a 12 meses, ou 1 dia a 2 anos, ou mais) com efeito terapeuticamente benéfico, e baixo risco de efeitos secundários. A administração pode ser contínua a, por exemplo, dose diária ou semanal, ou pode ser interrompida por uma ou mais interrupções de, por exemplo, um número (por exemplo, 1 a 3) de semanas ou num número de (por exemplo, 1 a 3) meses. 0 agonista da dopamina pode ser administrado enquanto a dor (ou outro sintoma) continuar. 0 agonista de dopamina (por exemplo, cabergolina, quinagolida) pode ser administrado a uma participante grávida. 6/20 0 tratamento ou prevenção da endometriose pode ser associado a uma diminuição na quantidade de glândulas endometriais.

Num exemplo da invenção, o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) pode ser alvo do agonista da dopamina, como o factor no desenvolvimento da endometriose. Os isoformas VEGF121 e VEGFies parecem estar principalmente envolvidos no processo de angiogénese (Watkins, R. H . , et al. , Am. J. Physiol. 1999, vol. 276, pp. 858-67). Foram identificados dois receptores de membrana celular endotelial específicos para o VEGF, receptor-1 VEGF (VEGFR-1; Flt-1) e VEGFR-2 (Flk-l/KDR). 0 VEGFR-2 aparece estar, principalmente, envolvido na regulação de angiogénese e vasculogenése. 0 VEGFR-2 (KDR) pode então ser visado pelo agonista da dopamina, como um factor no desenvolvimento da endometriose. 0 Notch-4 (KDR) pode então ser visado pelo agonista da dopamina, como um factor no desenvolvimento da endometriose. 0 VEGF, VEGFR-2 e Notch-4 podem então ser visados pelo agonista da dopamina, como um factor no desenvolvimento da endometriose. Outros mecanismos de acção do agonista da dopamina estão dentro do âmbito da invenção. 0 agonista da dopamina é administrado como uma preparação farmaceuticamente aplicável. As preparações podem ser administradas de acordo com a invenção em composições farmaceuticamente aceitáveis que podem, opcionalmente, compreender sais farmaceuticamente aceitáveis, agentes tampão, conservantes e excipientes. As preparações farmacêuticas que incluem agonista(s) da dopamina como agente (s) activo(s) são bem conhecidas na técnica e estão comercialmente activas. Por exemplo, a cabergolina está disponível sob as marcas registadas Cabaser e Sogilen/Dostinex. A utilização de tais preparações de 7/20 agonistas da dopamina comercialmente disponíveis no tratamento da endometriose é de acordo com a invenção. 0 modo da administração seleccionada irá depender da gravidade e severidade das condições a serem tratadas, e a dosagem necessária. Qualquer modo de administração que produza o efeito terapêutico desejado sem efeitos secundários inaceitáveis é relevante na realização da invenção. Tais modos de administração podem incluir oral, rectal, tópico, transdérmico, sublingual, intramuscular, parenteral, intravenoso, intracavidade, vaginal e matriz adesiva, a serem usados durante a cirurgia. São descritas várias abordagens para formular composições para utilização, de acordo com a invenção, no Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association, USA and Pharma-ceutical Press UK (2000), e Pharmaceutics - The Science of Dosage Form Design, Churchill Livingston (1988).

Numa forma de realização preferida, a administração é oral. As composições adequadas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, xaropes, elixires ou pastilhas. A presente invenção será agora ilustrada com referência aos Exemplos e desenhos anexos, nos quais: A FIGURA 1 mostra a percentagem de lesões activas após o animal do estudo debatido em baixo, para o grupo de controlo, e os grupos tratados com doses baixas (0,05 mg/kg/dia) e doses altas (0,1 mg/kg/dia) de cabergolina; a FIGURA la mostra o rácio de glândulas/estroma nos três grupos estabelecidos [doses baixas e altas de cabergolina ("Cb2") tinham mais estroma e menos glândulas do que os controlos (*p<0,05)]; A FIGURA 2 mostra os vasos sanguíneos (mm3) para o controlo e grupos de dose baixa e alta; 8/20 A FIGURA 3 mostra a percentagem dos vasos sanguíneos "maturos"e "recém-formados" nos animais do controlo, grupos de dose alta e baixa; A FIGURA 4 mostra o índice de Proliferação para o controlo e grupos de dose baixa e alta; A FIGURA 5 mostra a expressão relativa de VEGF, VEGFR-2 (KDR), Notch-4, Ang 1 e Wnt-1 para grupos de controlo, dose baixa e alta; A FIGURA 6a mostra a presença do receptor da dopamina 2 (Dp-R2) e VEGF em implantes endometriais dos animais em três grupos estabelecidos (grupos de controlo, dose alta e baixa); e A FIGURA 6b mostra a expressão relativa de VEGF, VEGFR-2 (KDR) e D2R em lesões endometrióticas (coluna do lado esquerdo) e no endométrio (coluna do lado direito).

Exemplo 1

Um modelo de endometriose animal experimental foi desenvolvido em ratos sem pêlo ao inserir fragmentos do endométrio humano. Ratos fêmea (Hsd: Athimic Nude-nu, Harlan Ibérica S.L, Barcelona, Spain) foram individualmente colocados em jaulas autoclavadas e cama de palha, em câmaras de fluxo laminar filtrado. A sala dos animais foi mantida a 26 °C com um ciclo de 12h de luz e 12h de escuro, e os ratos foram alimentados ad libitum com comida de roedores autoclavada de laboratório e água acidificada. Toda a manipulação foi realizada em câmaras de fluxo laminar filtrado. Uma mistura de cetamina/medetomidina (75 (pg/g de cetamina e 1 pg/g de medetomidina) (Ketolar®, Parke-Davis, Espana; Domtor®, Pfizer, Spain) i.p injectado, foi utilizada para anestesiar os ratos antes de procedimentos invasivos e atipamezol (Antisedan®, SmithKline Beecham, Spain) 1 pg/g i.p injectado, 9/20 para reverter os efeitos da anestesia, foi usado após procedimentos invasivos, usando instrumentos esterilizados. À idade de 5 semanas, foram colocadas sc no pescoço de cada animal cápsulas de libertação de 60-d esterilizadas contendo 18 mg de 17 β-estradiol (Innovative Research of America, Sarasota, FL). De acordo com a informação do fabricante, as cápsulas providenciam libertação continua da hormona em concentrações de soro de 150-250 pmol/litro, no leque de niveis fisiológicos nos ratos durante o ciclo estral. Este nível fisiológico estável de estrogénio promove o crescimento do endométrio humano transplantado e evita as diferenças inter-rato relacionadas com vários níveis do ciclo estral.

Quatro dias após a inserção do comprimido de estrogénio, foi criada uma entrada na cavidade peritoneal na linha média no abdómen interior para inserir endométrio recente humano a partir de óvulos de doadores. Estes fragmentos foram colados com cola (Vetabond®, 3M Animal Care products, USA) no peritoneu. Este protocolo permitiu imitar a situação patológica de menstruação retrógrada que ocorre em mulheres com endometriose.

Três semanas após a implantação, os animais foram divididos em três grupos. O primeiro foi um grupo de controlo; o segundo foi um grupo de dose baixa, tratado com 0,05 mg/kg/dia oral de cabergolina; e um grupo de dose alta, tratado como uma dose oral de 0,1 mg/kg/dia de cabergolina. Duas semanas após o tratamento os animais foram sacrificados e as lesões endometrióticas amostradas e analisadas como definido em baixo. Os resultados são mostrados nas Figs. 1, la e 2 a 6b.

Os efeitos anti-angiogénicos dos agonistas da dopamina avaliados por imunofluorescência, os anticorpos usados em microscopia confocal contra o factor Von Willebrand (vWF monoclonal lgGl, DAKO Corp., Denmark) presente em células 10/20 endoteliais e células da musculatura lisa vascular (monoclonal lgG2 α-SMA-FITC conjugado de Sigma, St Louis, USA). Os vasos sanguíneos que não são novas formações, são rodeados por uma camada de musculatura lisa que lhes confere maturidade. A identificação de células endoteliais foi realizada usando vWF, e os vasos maturos foram identificados por marcação positiva α-SMA. Assim, os vasos sanguíneos vWF+/ aSMA- foram considerados novos ou imaturos, enquanto vasos vWF+ / ocSMA+ foram classificados como vasos sanguíneos velhos ou maturos. 0 estudo morfométrico foi realizado para medir a área dos implantes e densidade celular. Foi realizada imunocitoquímica com anticorpo Ki-67 (monoclonal lgGl DAKO Corp., Denmark) de modo a avaliar a actividade proliferativa dos implantes. As alterações ultraestruturais histopatológicas e subcelulares foram detectadas usando um microscópio óptico (OM) , microscópio de transmissão electrónica (TEM) e marcação histoquímica. Foi efectuada microscopia óptica (OM) , microscopia por transmissão de electrões (TEM) e morfometria para avaliar a presença de glândulas e estroma endometrial e estudar alterações ultraestruturais subcelulares, área dos implantes e densidade celular.

Foram usados os métodos PCR em Tempo Real (TaqMan) e 2-&&ct para analisar os perfis de expressão de gene de três marcadores diferentes que promovem a angiogénese (VEGF, VEGFR-2, Notch-4; Angiopoietina-1 (Ang-1), um marcador de anti-angiogénese o qual promove o aumento dos vasos existentes e resistência a fugas; e Wnt-1. A demonstração da presença do VEGF e expressão do receptor de dopamina tipo 2 (Dp-r2) em implantes experimentais, lesões endometrióticas peritoneais humanas e endométrio, foi demonstrada usando o método PCR em Tempo Real (TaqMan) e 2~AACt (Fig. 6a, 6b) . Similarmente, este método foi usado para demonstrar a presença de expressão de VEGFR-2 em 11/20 lesões endometrióticas peritoneais humanas e endométrio (Fig. 6b) . A análise estatística foi realizada usando GraphPad Instat V3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). 0 estudo foi concebido para detectar diferenças nos diferentes marcadores analisados entre grupos de tratamento e controlo. A informação categórica foi expressa como número e percentagem, e a data numérica como média ± erro padrão da média (SEM) excepto quando especificado. A significância foi definida como P<0,05. Foi usada análise unidireccional da variância para análise estatística.

Toxicidade

Nenhuns ratos de estudo morreram após a administração da cabergolina. A cabergolina não pareceu modificar a saúde geral dos ratos, porque o peso corporal dos ratos nos diferentes grupos de tratamento não foi significativamente diferente (resultados não mostrados).

Resultados A Figura 1 mostra a percentagem de lesões activas após o estudo animal debatido acima, para o grupo de controlo e os grupos tratados com dose baixa (0,05 mg/kg/dia) e dose alta (0,1 mg/kg/dia) de cabergolina. Os animais tratados com doses baixas (58,6±9,7%) e altas (60,4±8,4%), tiveram uma diminuição significativa (p=0,0169) nas lesões activas quando comparado com controlos (89,6±5,7%) . Os animais tratados com cabergolina (grupos de doses baixas e altas) têm, significativamente, menos lesões activas quanto comparado com o grupo de controlo. Por outras palavras, o tratamento com cabergolina parece reduzir o número de lesões endometrióticas activas neste modelo. Os estudos OM e TEM mostraram que no grupo de controlo 12/20 as lesões endometrióticas apresentaram um alto estroma celular e um aspecto histológico de reorganização e estrutura completa, como pode ser visto em lesão de endometriose atípica do humano. Contudo, em lesões tratadas (dose alta e baixa de cabergolina) é observado um estroma laxo, com perda de celularidade e organização; isto é uma característica de tecido atrófico ou degenerativo. 0 estroma endometrial humano que rodeia as áreas glandulares foi facilmente diferenciado do tecido muscular-conjuntivo de murino.

Estes resultados histológicos foram confirmados por análise morfométrica (Fig. la). Apesar de não haver diferença estatística entre os grupos em termos de densidade celular, houve uma diferença significativa (p=0,0093) no rácio glândulas/estroma, como visto na Figura la; ambas as doses de cabergolina, alta e baixa, tinham mais estroma e menos glândulas do que os controlos (*p<0,05). Isto indica que o tratamento com cabergolina pode ser associado a uma diminuição ou redução na quantidade de glândulas endometriais. A Figura 2 mostra os vasos sanguíneos (mm3) para os grupos de controlo, de dose baixa e alta, divididos entre vasos sanguíneos "maturos" e vasos sanguíneos "recém-formados". 0 grupo de controlo tem uma maior proporção de vasos sanguíneos recém-formados (indicador de uma angiogénese significativa), enquanto os grupos de dose alta e baixa têm uma proporção significativamente maior de vasos sanguíneos maturos, sugestivo de uma angiogénese, significativamente, reduzida. Isto foi também demonstrado através de histologia (resultados não mostrados). Estes resultados indicam que a cabergolina reduziu, significativamente, a formação de novos vasos sanguíneos (angiogénese), neste modelo. A Figura 3 mostra a percentagem de vasos sanguíneos nos grupos de controlo e de dose alta e baixa. 0 grupo de controlo tem, 13/20 aproximadamente, 74% do total dos vasos sanguíneos como vasos sanguíneos recém-formados, indicando angiogénese significativa. Os grupos de dose alta e baixa, por outro lado, têm aproximadamente 85 a 89% do total como vasos sanguíneos maturos, indicando que a angiogénese não é significativa. Estes resultados indicam que a cabergolina reduziu, significativamente, a formação de novos vasos sanguíneos (angiogénese), neste modelo. A Figura 4 mostra os resultados de um estudo de proliferação. Foi usado um estudo de imunocitoquímica usando o anticorpo Ki-67 (isto é, analisando o grau de proliferação celular utilizando anticorpos contra Ki-67) para avaliar a actividade proliferativa dos implantes usando métodos conhecidos na técnica. Foi usado software de contagem de imagem para contar as células positivas Ki-67 e, a partir daí, calcular o índice de proliferação em cada grupo. Foi observada uma diminuição significativa (p<0,001) em proliferação, em lesões em animais tratados com cabergolina (em grupos de dose alta e baixa) comparado com o grupo de controlo. 0 estado angiogénico das lesões foi inicialmente analisado usando imunofluorescência utilizando anticorpos para identificar vasos novos (vWF+/ aSMA-) e velhos (vWF+/ aSMA+) e microscopia confocal (Leica Confocal Software) . A imunofluorescência, utilizando anticorpos contra o factor Von Willebrand (vWF) presente em células endoteliais e células da musculatura lisa vascular (α-SMA) pode ser usada para testar a acção Cb2 antiangiogénica. Os vasos sanguíneos que não são novas formações, são rodeados por uma camada de musculatura lisa que lhes confere maturidade. A identificação de células endoteliais foi realizada usando vWF, e os vasos maturos foram identificados por marcação positiva α-SMA. Assim, os vasos sanguíneos vWF+/ aSMA- foram considerados novos ou imaturos, 14/20 enquanto os vasos vWF+ / aSMA+ foram classificados como vasos sanguíneos velhos ou maturos.

Os implantes apresentados com estroma celular mais elevado e o aspecto histológico da completa estrutura e reorganização são, normalmente, vistos em lesões de endometriose no grupo de controlo, por outro lado, os implantes em ratos incluídos nos grupos de dose alta e baixa mostraram um estroma laxo com celularidade e organização soltas, que é característica do tecido atrófico/degenerativo. A morfometria não mostrou diferença em densidade celular e áreas de estroma/glândulas entre grupos.

Foram usados os métodos PCR em Tempo Real (TaqMan)e 2-AACt para analisar os perfis de expressão de gene de três marcadores diferentes que promovem a angiogénese (VEGF, VEGFR-2, Notch-4; Angiopoietina-1 (Ang-1), um marcador de anti-angiogénese, o qual promove o aumento dos vasos existentes e resistência a fugas; e Wnt-1. 0 gene de manutenção 18S rRNA foi usado para normalizar os valores do gene Ct. 0 valor Ct em cada grupo foi expresso relativamente aos valores Ct do grupo de controlo (calibrador), para calcular a expressão relativa pelo método 2-iict. o cDNA obtido de 180 células tumorais de sarcoma (S-180) e células endoteliais de veias umbilicais humanas (HUVEC), foi usado como controlo negativo e positivo, respectivamente, para a expressão do gene VEGF e VEGFR-2. O baço foi usado como controlo positivo para Ang-1 e Wnt-1, e o pulmão foi usado como controlo positivo Notch-4. A Tabela 1 mostra que os perfis de expressão de gene dos marcadores pró-angiogénicos (VEGF, VEGFR-2 e Notch-4) foram regulados de forma descendente nos implantes tratados com dose baixa e alta de cabergolina ("Cb2") comparado com os controlos. Ang-1 e Wnt-1 são considerados ser marcadores anti-angiogénicos; os seus perfis de expressões foram 15/20 regulados de forma ascendente nos implantes de ratos tratados com dose baixa e alta de Cb2 comparado com controlos, mostrando que o tratamento de cabergolina está associado à inibição de angiogénese. Os dados de expressão relativa da tabela são mostrados graficamente na Figura 5.

Tabela 1 Perfis de expressão de gene angiogénico

Marcador Angiogenése Gene Controlo ± Veículo Dose baixa (0,05mg/kg /dia) Dose alta (0,lmg/ kg/dia) Valor p Expressão + VEGF HUVEC 1,2±0,3 0,5±0,2 0,4±0,1 <0,05 Regulados de forma descendente Nos grupos tratados com Cb2 + VEGFR-2 (KDR) HUVEC 1,0±0,1 0,4±0,1 0,3±0,1 <0,05 Regulados de forma descendente Nos grupos tratados com Cb2 + Notch-4 PULMÃO 1,0±0,1 0,5±0,1 0,4±0,1 <0, 05 Regulados de forma descendente Nos grupos tratados com Cb2 Ang-1 BAÇO 1,1 ±0,2 3,2±0,6 3,7±0,6 <0,05 Regulados de forma ascendente Nos grupos tratados com Cb2 Wnt-1 BAÇO 1,0±0,1 3,4±0,2 3,3±0,6 =0, 07 Regulados de forma ascendente Nos grupos tratados com Cb2 Dados expressos como Média ± desvio padrão A presença de receptores de dopamina do tipo 2 no tecido endometrial humano e implantes endometrióticos nas mulheres 16/20 que são sujeitas a cirurgias (laparoscopia), foi investigada. Os métodos PCR em Tempo Real (TaqMan) e 2-AACt foram usados para determinar a presença de receptor2 de dopamina ("Dp-r2", "D2R") e VEGF no tecido endometrial humano, não apenas nos implantes (Fig 6a) , mas também nas lesões endometrióticas peritoneais obtidas a partir de 10 mulheres em laparoscopia (Fig 6b - que também inclui dados para VEGFR-2) . Os controlos positivos e negativos para Dp-r2 foram HUVEC e células S-180 cDNA, respectivamente. Nos ratos, os valores Ct de controlo foram usados como um calibrador, e nas lesões peritoneais humanas os valores Ct HUVEC foram empregues como calibrador para calcular a expressão relativa por método 2-&&ct. A figura 6a mostra a presença de VEGF e Dp-r2 nos implantes endometriais dos animais nos três grupos definidos. Existiu uma tendência para a expressão Dp-r2 aumentada à medida que os animais foram tratados com doses crescentes de cabergolina. Existiu uma tendência para a expressão VEGF diminuída à medida que os animais foram tratados com doses crescentes de cabergolina. A figura 6b mostra (coluna do lado esquerdo) a expressão relativa de VEGF, VEGFR-2 (KDR) e D2R ("Dp-r2") nos diferentes tipos de lesões endometrióticas; vermelho, branco e preto. Existe uma clara diferença na expressão VEGF, VEGFR-2 e Dp-r2, de acordo com o tipo de lesão. A figura 6b também mostra (coluna do lado direito) a expressão relativa de VEGF, VEGFR-2 (KDR) e D2R ("Dp-r2") no endométrio. A expressão relativa de VEGF e VEGFR-2 no endométrio de sujeitos com endometriose é mais alta do que aqueles sem endometriose; a expressão relativa de Dp-r2 no endométrio de sujeitos com endometriose é mais baixa do que aqueles sem a mesma.

Estes resultados são mostrados na Tabela 2, em baixo. 17/20

Gene ENDOMÉTRIO LESÕES ENDOMETRIÓTICAS SEM ENDOMETRIOSE MODERADO GRAVE Valor P VERMELHO BRANCO PRETO Valor P VEGF 1,0±0,1 2,2±0,7 2,1 ± 0, 4 NS 17,8±5,8 10,1 ±4,8 11,1 ±3,9 NS KDR 1,0±0,1 2,1 ±0,6 1,9± 0,3 NS 47,4+15,0 26,9±12,2 23,6±7,2 NS D2R 1,0±0,1 0,3±0,1 0,2± 0, 1 =0,07 0,2±0,1 0,3±0,2 0,6±0,3 NS

Os resultados indicam que a cabergolina de agonista da dopamina, administrada numa dose de 0,05 e 0,1 mg/kg/dia, foi capaz de: (a) Diminuir significativamente o número de lesões endometrióticas activas; (b) Provocar perda de celularidade e organização que apresenta caracteristicas no tecido atrófico ou degenerativo nos implantes endometrióticos; (c) Diminuir significativamente o número de novos vasos sanguíneos nos implantes endometrióticos; (d) Diminuir significativamente a expressão de marcadores de angiogénese, e proliferação celular; e (e) Aumentar a degeneração de tecido e reduzir os implantes endometrióticos.

Existe uma alta homologia entre os sistemas VEGF humano e de roedores que oferece uma indicação de que a actividade mostrada no modelo de roedor acima é aplicável nos modelos humanos. Os resultados indicam que a administração de agonistas de dopamina tem um efeito significativo em endometriose, possivelmente ligado à acção na angiogénese. Os resultados podem estar relacionados com a presença de receptores de dopamina no tecido endometrial eutópico e ectópico. 18/20

Exemplo 2 A formulação como comprimido para administração oral é de 0,5 mg de cabergolina (comercialmente disponível como Dostinex®, Pfizer, Espanha).

Outros Exemplos

Exemplo A: Um paciente submete-se a uma laparoscopia de diagnóstico após sofrer de dor pélvica crónica e é diagnosticado com endometriose do tipo III. Na mesma laparoscopia, o paciente submete-se a uma cirurgia tal como ressecção de lesões presentes e é iniciada a administração de cabergolina.

Exemplo B: O paciente diagnosticado previamente com endometriose, apresenta sintomas de dor pélvica e dismenorreia. A administração de cabergolina é iniciada sem cirurgia.

Exemplo C: O paciente diagnosticado com endometriose recebe um tratamento com agonistas GnRH (ou inibidores de danazol ou aromatase) e a administração de cabergolina é iniciada (com uso contínuo de agonista GnRH) durante um período. Após um período de 3 ou 6 meses sem terapia, o paciente retoma a cabergolina durante um período adicional.

Lisboa, 18 de Outubro de 2011 19/20

Claims (5)

1. Reivindicações 1. 0 uso de um agonista da dopamina na produção do fármaco para o tratamento e/ou prevenção de endometriose em que o agonista da dopamina interage com um receptor da dopamina para imitar a acção da dopamina. 2 . 0 agonista da dopamina para uso no tratamento ou prevenção da endometriose em que o agonista da dopamina interage com um receptor da dopamina para imitar a acção da dopamina. 3. 0 uso de acordo com a reivindicação 1 ou o agonista para o uso de acordo com a reivindicação 2, em que o dito agonista da dopamina é um de amantadina, bromocriptina, cabergolina, quinagolida, lisurida, pergolida, ropinirol e pramipexol. 4. 0 uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o agonista da dopamina é cabergolina administrada numa dose entre 0,01 e 12,5 mg/semana.
2. 5. O uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o agonista da dopamina é quinagolida administrada numa dose entre 25 e 1000 mg/dia. 6 . 0 uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o agonista da dopamina é bromocriptina administrada numa dose entre 10 e 80 mg/dia.
3. 7. O uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o agonista da dopamina é administrado durante um período entre 1 dia e 2 anos. 1/2 8. 0 uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o agonista da dopamina é administrado em combinação com outro tratamento medicinal ou cirúrgico para a endometriose. 9. 0 uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o(s) agonista(s) da dopamina é(são) utilizado(s) para o tratamento ou prevenção da endometriose numa paciente grávida.
4. 10. O uso ou o agonista para o uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, no qual o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é visado.
5. 11. O uso ou o agonista para uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a administração é oral e na forma de composições como cápsulas, comprimidos, xaropes, elixires ou pastilhas. Lisboa, 18 de Outubro de 2011 2/2