PT2086525E - Método de radiossensibilização de tumores utilizando um radiossensibilizador - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO DE RÁDIOSSENSIBILIZAÇÃO DE TUMORES UTILIZANDO UM RADIOSSENSIBILIZADOR"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método de tratamento de cancro utilizando inibidores de PARP como radiossensibilizadores de tumores. Especificamente, a presente invenção refere-se a um método de radiossensibilização de tumores utilizando um composto de Fórmula (I)

ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também se refere a composições farmacêuticas de inibidores de PARP para radiossensibilização de tumores.

Antecedentes da Invenção A radiação é uma modalidade de tratamento citotóxico que induz danos celulares através da criação de quebras na cadeia de ADN. A poli(ADP-ribose)polimerase 1 (PARP-1) é uma proteína de ligação a ADN de dedo de zinco nuclear que 2 é activada pela deterioração de ADN induzida por radiação e que está envolvida na sua reparação. A PARP liga-se às quebras de cadeia de ADN o que pode servir para as proteger do ataque de nucleases ou de recombinação. Uma vez que a PARP actua para ajudar na reparação do ADN, os inibidores têm o potencial de aumentar a quimio- e radiossensibilização de agentes citotóxicos (Curtin, 2005) . A causa mais significativa para o insucesso do tratamento e a mortalidade por cancro é a radio/quimio-resistência. Agentes que superem a resistência de células cancerosas aos agentes citotóxicos podem ser um factor chave numa terapia com sucesso do cancro. A aplicação potencial de inibidores de PARP na forma terapêutica como quimio- e radiossensibilizadores tem sido limitada, até há relativamente pouco tempo, pela potência, selectividade e propriedades farmacêuticas destes agentes (Griffin et al., 1998; Bowman, et al., 1998; Bowman et al., 2001, Chen & Pan, 1998; Delany et al., 2000; Griffin et al., 1995; Lui, et al., 1999). Recentemente foram desenvolvidos inibidores de PARP (benzimidazole-4-carboxamidas e quinazolin-4-[3H]-onas) mais potentes e selectivos que evidenciaram a capacidade de potenciar os efeitos da radiação e de agentes quimioterapêuticos como a camptotecina (CPT), topotecano, irinotecano, cisplatina, etoposido, bleomicina, BCNU e temozolomida (TMZ) in vitro e in vivo utilizando modelos humanos e murídeos de leucemia, metástase de linfomas para o sistema nervoso central, e carcinomas do cólon, pulmão e mama (Griffin et al., 1998; Bowman, et al., 1998; Bowman et al., 2001, Chen & Pan, 1998; Delany et al., 2000; Griffin et al., 195; Lui, et al., 1999, Tentori, et al., 2002). Um inibidor de PARP que seja capaz de sensibilizar células tumorais para as acções de classes diferentes de agentes 3 quimioterapêuticos e/ou de radiação poderia aumentar a taxa de sucesso de terapias de cancro estabelecidas. A PARP-1 é uma proteina de ligação a ADN de dedo de zinco nuclear de 116kD que utiliza o NAD+ como um substrato para transferir ADP-ribose para proteínas aceitadoras como as polimerases de histonas, ligases e a própria PARP (automodificação) (Griffin et al., 1998; Tentori, et al., 2002; Baldwin et al., 2002). A PARP-1 pertence a uma família de proteínas que presentemente inclui 18 membros, destes as PARP-1 e PARP-2 são as únicas enzimas activadas pela deterioração de ADN (Curtin, 2005; Tentori, et al., 2002). A activação de PARP-2 também pode induzir actividade pró-inflamatória (Jagtap e Szabo, 2005), indicando que a inibição de PARP-2 em células tumorais pode ter um beneficio terapêutico adicional. Embora o processo fisiopatológico e fisiológico modulado pelas várias isoformas de PARP seja objecto de estudo aprofundado (Ame et al., 2004), o membro melhor caracterizado desta familia, e o foco principal dos esforços de desenvolvimento farmacológico terapêutico direccionado em oncologia, é a PARP-1. A PARP é activa na regulação de muitos processos biológicos diferentes, incluindo na expressão de proteínas ao nível da transcrição, replicação e diferenciação, actividade telomerase e organização citoesquelética. No entanto, é o papel que a PARP desempenha na reparação de ADN e na conservação da integridade genómica que é interessante para a utilização de inibidores de PARP como agentes de quimio/radiossensibilização (Smith, 2001) . Este papel é ilustrado via utilização de células deficientes em PARP- 1 as quais evidenciam uma reparação por excisão de base 4 atrasada e uma frequência elevada de troca de cromatídeos irmãos após exposição a radiação ionizante ou tratamento com agentes alquilantes. Além disso, níveis elevados de radiação ionizante e agentes alquilantes desencadeiam uma maior mortalidade em ratos deficientes em PARP-1 por comparação com ratos de tipo selvagem (Smith, 2001; Virag & Szabo, 2002).

Entre os membros da família PARP, a PARP-1 (e PARP-2) é especificamente activada e está envolvida na reparação de quebras da cadeia de ADN provocadas directamente por radiação ionizante ou indirectamente após reparação enzimática de lesões de ADN devido a agentes de metilação, inibidores de topoisomerase I e outros agentes quimioterapêuticos como as cisplatina e bleomicina (Griffin et ai., 1998; Delany et al., 2000; Tentori et al., 2002; de Murcia et al., 1997). Existe um corpo substancial de evidência bioquímica e genética que demonstra que a PARP-1 desempenha um papel na sobrevivência e reparação celular após dano subletal maciço do ADN. Além do mais, como exemplificado por ratos com PARP-1 anulada, a função PARP-1 na ausência de dano de ADN não é crítica para a sobrevivência celular, o que torna a inibição de PARP-1 uma estratégia terapêutica potencialmente viável para ser utilizada com quimio- e/ou radioterapia (Delany et al., 2000; Burkle et al., 1993).

As gerações iniciais de inibidores de PARP-1 como a 3-aminobenzamida, nicotinamida e derivados relacionados, potenciavam as actividades citotóxicas in vitro e in vivo de radiação, bleomicina, CPT, cisplatina e TMZ em modelos de tumores humanos e murídeos in vitro e in vivo. As limitações inerentes quanto à potência, selectividade e 5 capacidade de administração destes compostos impossibilitavam a atribuição inequívoca da potenciação da eficácia antitumoral observada in vitro e in vivo a inibição de parp-1 especificamente relativamente às actividades não específicas destas moléculas (Griffin et al., 1998; Griffin et al., 1995; Masuntani et al., 2000; Kato et al., 1988). Estas questões tiveram influência no desenvolvimento de classes estruturais mais potentes e selectivas de inibidores de PARP-1, incluindo vários derivados de benzimidazole-4-carboxamidas e quinazolin-4-[3fí]-onas. Análises in vitro e in vivo revelaram que estes compostos eram capazes de potenciar a eficácia de agentes quimioterapêuticos utilizando modelos de tumores humanos e murídeos (Griffin et al., 1998; Bowman, et al., 1998; Bowman et al., 2001; Chen & Pan, 1998; Delany et al., 2000; Griffin et al., 1995; Liu, et al., 1999). A publicação PCT W02001085686, publicada em 15 de Novembro de 2001, descreve compostos de carbazole com actividade inibidora de PARP.

Existe uma necessidade de encontrar e desenvolver inibidores de PARP como radiossensibilizadores para o tratamento de cancro que possuam selectividade elevada para a PARP, potência elevada, melhor capacidade de administração e melhores perfis de tolerabilidade.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona um método de utilização de um 4-metoxi-carbazole para provocar radiossensibilização em tumores pela inibição in vivo de PARP-1. O método compreende um 4-metoxi-carbazole de Fórmula (Ia): 6

e seus pró-fármacos, preferencialmente um seu pró-fármaco de base de Mannich, para proporcionar solubilidade e estabilidade, e para auxiliar na administração in vivo do fármaco activo, 7-metoxi-l,2,3,ll-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona. A presente invenção proporciona ainda um método de tratamento de cancro por administração de um radiossensibilizador de Fórmula (I):

(I) ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável, em que, X é H ou uma unidade pró-fármaco, como aqui definida; a um mamífero que sofre de cancro e aplicando radiação ionizante ao tecido do referido mamífero.

Outro objecto da presente invenção é proporcionar composições farmacêuticas compreendendo os compostos da 7 presente invenção em que as composições compreendem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos compostos da presente invenção, ou uma sua forma de sal ou éster farmaceuticamente aceitável.

Outro objecto da presente invenção é proporcionar um composto de Fórmula (II):

(II) ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona a utilização de um composto de Fórmula (I) para o fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro.

Estes e outros objectos, caracteristicas e vantagens da invenção serão divulgados na descrição detalhada seguinte da divulgação da patente.

Breve Descrição dos Diagramas

Fig.l: Mostra o efeito do pró-fármaco de base de Mannich em associação com Radiação utilizando xenoenxertos de 8 glioblastoma U87MG radiorresistentes no atraso do crescimento dos tumores.

Fig.2: Grandeza do efeito com terapia de associação mais forte do que o conseguido com um regímen comparável de radioterapia ou de pró-fármaco sozinho.

Fig.3: Efeito de radiossensibilização do Exemplo 7 em Xenoenxertos de Glioblastoma Humano U87MG em Ratos Glabros (Plano Não Optimizado).

Fig. 4 mostra um esquema sintético incluindo um composto no âmbito da presente invenção e precursores para este.

Fig.5: Efeito de Radiossensibilização do Exemplo 7 administrado por via oral em Xenoenxertos de Glioblastoma

Humano U87MG em Ratos Glabros.

Descrição Detalhada da Invenção

Numa primeira forma de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de cancro administrando um radiossensibilizador de Fórmula (I):

(I) 9 ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável, em que, X é H ou uma unidade pró-fármaco; a um mamífero que sofre de cancro e aplicando radiação ionizante ao tecido do referido mamífero.

Numa forma de realização preferida, o radiossensibilizador está presente dentro ou próximo do referido tecido aumentando a eficácia de conversão da referida radiação ionizante aplicada em efeitos terapêuticos localizados.

Numa forma de realização preferida, o radiossensibilizador está presente numa quantidade eficaz para radiossensibilizar células cancerosas.

Numa forma de realização preferida, a radiação ionizante do referido tecido é realizada com uma dose de radiação eficaz para destruir as referidas células.

Numa forma de realização preferida, a radiação ionizante é de protocolos clinicamente aceitáveis ou radioterapêuticos recomendados para um dado tipo de cancro.

Numa forma de realização preferida, o cancro é maligno.

Numa forma de realização preferida, o cancro é benigno.

Numa forma de realização preferida, a unidade pró-fármaco é seleccionada do grupo consistindo de -CH2NR1R2, -CH20C(=0)R3, -CH20P(=0) (OH) 2 e -C (=0) R4; em que; R1 é H ou alquilo Ci-4; R2 é H ou alquilo C1-4; 10 alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo C1-4; R3 é seleccionado do grupo consistindo de -alquil Ci_4-NR1R2, -alquil C1-4-OR5, piridinilo, -fenil (CH2NR1R2) e -CH(R6)NH2; R4 é seleccionado do grupo consistindo de -O-(alquil Ci_4)-NR4R2, -O-(alquil C1-4) -OR5 e -CH(R6)NH2; R5 é H ou alquilo Ci_4; e R6 é a cadeia lateral de um aminoácido natural.

Numa forma de realização preferida, a unidade pró-fármaco é -CH2NR4R2, R1 é H ou alquilo Ci_4; R2 é H ou alquilo Ci_4; e alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo Ci_4.

Numa forma de realização preferida a unidade pró-fármaco é uma base de Mannich.

Numa forma de realização preferida, a base de Mannich é seleccionada de 4-metil-piperazin-l-ilmetil-, morfolin-4-ilmetil- e 5-dietilaminometil-.

Numa forma de realização preferida, a base de Mannich é 4-metil-piperazin-l-ilmetilo. 11

Numa forma de realização preferida, a via de administração é intravenosa, subcutânea, oral ou intraperitoneal.

Numa forma de realização preferida a via de administração é intravenosa.

Numa forma de realização preferida, o cancro é seleccionado de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (olho, lábio, oral, faringe, laringe, nasal, carcinoma da língua e carcinoma esofágico), melanoma, carcinoma de células escamosas (epiderme), glioblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, oligoastrocitoma, meningioma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, sarcomas do tecido mole, osteossarcoma, malignidade hematológica no sítio do snc, carcinoma da mama (ductal e carcinoma in situ), carcinoma da tiróide (papilar e folicular), carcinoma do pulmão (carcinoma broncoalveolar, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma misto de células pequenas/células grandes, carcinoma de células pequenas combinado, carcinoma do pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma do pulmão), carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, carcinoma cervical, carcinoma do ovário, carcinoma da próstata, carcinoma testicular, carcinoma gástrico, carcinoma pancreático, colangiossarcoma, linfoma (tipos Hodgkins e não-Hodgkins com origem em células T e B), leucemia (leucemias aguda e crónica de origens mielóide e linfóide) e carcinoma da bexiga.

Numa forma de realização preferida, o cancro é seleccionado de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (olho, lábio, oral, faringe, laringe, nasal, carcinoma da língua e carcinoma esofágico), melanoma, carcinoma de 12 células escamosas (epiderme), glioblastoma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do pulmão, (carcinoma broncoalveolar, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma misto de células pequenas/células grandes, carcinoma de células pequenas combinado, carcinoma do pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma do pulmão), linfoma (tipos Hodgkins e não-Hodgkins com origem em células T e B) e leucemia (leucemias aguda e crónica de origens mielóide e linfóide).

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um método de tratamento de cancro administrando um radiossensibilizador de fórmula 7-metoxi-l,2,3,11-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um método de tratamento de cancro administrando um radiossensibilizador de fórmula 7-metoxi-l, 2,3,11-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona.

Numa segunda forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para radiossensibilização de células cancerosas compreendendo uma quantidade radiossensibilizadora de um composto de Fórmula (I):

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(D ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável, em que X é H ou uma unidade pró-fármaco; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização preferida, a unidade pró-fármaco é seleccionada do grupo consistindo de -CfbNR^2, -CH20C(=0)R3, -CH20P(=0) (OH) 2 e -C (=0) R4; R1 é H ou alquilo C4_4; R2 é H ou alquilo C4_4; alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo Ci_4; R3 é seleccionado do grupo consistindo de -alquil Ci_4-NR1R2, -alquil Ci-4-OR5, piridinilo, -fenil (CH2NR1R2) e -CH(R6)NH2; R4 é seleccionado do grupo consistindo de -0-(alquil Ci-4)-NR4R2, -0-(alquil Ci-4)-OR5 e -CH(R6)NH2; R5 é H ou alquilo C4_4; e R6 é a cadeia lateral de um aminoácido natural.

Numa forma de realização preferida, a unidade pró-fármaco é -ch2nr4r2, R1 é H ou alquilo Ci-4; R2 é H ou alquilo Ci_4; e alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o 14 referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo Ci_4.

Numa forma de realização preferida, o composto é

ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização preferida, o composto é

ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável.

Numa terceira forma de realização, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula (II): 15

ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável.

Numa quarta forma de realização, a presente invenção proporciona a utilização de um composto de Fórmula (I) para o fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona a utilização de um composto de Fórmula (II) para o fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro.

Entenda-se que determinadas características da invenção, que, por razões de clareza, são descritas no contexto de formas de realização separadas, também podem ser proporcionadas em associação numa única forma de realização. Reciprocamente, várias características da invenção que são, por razões de brevidade, descritas no contexto de uma única forma de realização, também podem ser proporcionadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

Os seguintes termos e expressões aqui contidos são definidos do seguinte modo: 16

Como aqui utilizado, o termo "cerca" refere-se a uma gama de valores de ± 10% de um valor especificado. Por exemplo, a frase "cerca de 50 mg" inclui ± 10% de 50, ou de 45 até 55 mg.

Como aqui utilizado, o termo "alquilo" refere-se a um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificado possuindo 1 até 4 átomos de carbono, como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo e terc-butilo. Uma designação como "alquilo C1-C4" refere-se a um radical alquilo contendo de 1 até 4 átomos de carbono.

Como aqui utilizado, o termo "aminoácido" significa uma molécula contendo um grupo amino e um grupo carboxilo. Este inclui um "α-aminoácido" o qual é bem conhecido do especialista na técnica como um ácido carboxilico que é portador de uma funcionalidade amino no carbono adjacente ao grupo carboxilo. Os aminoácidos podem ser naturais ou não naturais. Os "aminoácidos naturais" incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

Como aqui utilizado, o termo "heterociclilo" refere-se a um grupo ciclico de 5 ou 6 membros contendo átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo seleccionado de O, N ou S, em que o referido grupo heterociclilo pode ser saturado ou insaturado e em que o referido grupo heterociclilo pode estar substituído ou não substituído. Os heteroátomos de azoto e enxofre podem estar opcionalmente oxidados. Exemplos de grupos heterociclilo incluem pirrolilo, 17 pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo e metilpiperazinilo.

Como aqui utilizado, o termo "mamifero" refere-se a um animal de sangue quente como um rato, ratazana, gato, cão, macaco ou humano, preferencialmente um humano, ou uma criança humana, o qual está doente, ou tem o potencial de ficar doente com, uma ou mais doenças e condições aqui descritas.

Como aqui utilizado, um componente "farmaceuticamente aceitável" é um que é adequado para ser utilizado em humanos e/ou animais sem efeitos secundários adversos impróprios (como toxicidade, irritação e resposta alérgica) proporcionado com uma razão beneficio/risco razoável.

Como aqui utilizado, o termo "quantidade segura e eficaz" refere-se à quantidade de um componente que é suficiente para produzir uma resposta terapêutica desejada sem efeitos secundários adversos impróprios (como toxicidade, irritação ou resposta alérgica) proporcionada com uma razão beneficio/risco razoável quando utilizada da maneira desta invenção. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" pretende-se referir uma quantidade de um composto da presente invenção eficaz para produzir a resposta terapêutica desejada. Por exemplo, uma quantidade eficaz para retardar o crescimento ou a causa de um cancro, quer um sarcoma ou linfoma, ou para reduzir o cancro ou prevenir metástase. A quantidade segura e eficaz ou a quantidade terapeuticamente eficaz especifica variará com factores como a condição particular a ser tratada, o estado físico do doente, o tipo de mamífero ou animal a ser tratado, a duração do tratamento, a natureza de terapia simultânea (se 18 é que alguma), e as formulações específicas utilizadas e a estrutura dos compostos ou seus derivados.

Na presente invenção, o termo "radiação ionizante" significa radiação compreendendo partículas ou fotões que têm energia suficiente ou podem produzir energia suficiente via interacções nucleares para produzir ionização (ganho ou perda de electrões) . Uma radiação ionizante ilustrativa e preferida é uma radiação X. Os meios para administrar radiação X a um tecido ou célula alvo são bem conhecidos na técnica. A quantidade de radiação ionizante necessária numa dada célula depende geralmente da natureza dessa célula. Os meios para determinar uma quantidade eficaz de radiação são bem conhecidos na técnica. 0 termo aqui utilizado "uma dose eficaz" de radiação ionizante significa uma dose de radiação ionizante que produz um aumento na deterioração ou morte celular quando administrada em conjunto com os compostos da invenção.

As gamas de dosagem para raios X vão desde doses diárias de 50 até 200 roentgens durante períodos de tempo prolongados (3 até 4 semanas), até doses únicas de 2000 até 6000 roentgens. As gamas de dosagem para radioisótopos variam muito e dependem da semivida do isótopo, da potência e tipo de radiação emitida, e da captação pelas células neoplásicas.

Na presente invenção podem ser utilizados quaisquer meios adequados para administrar radiação a um tecido. Os meios correntes de administração de radiação a um tecido é através de uma fonte de radiação ionizante externa ao corpo a ser tratado. Os métodos alternativos para administrar radiação a um tecido incluem, por exemplo, em primeiro 19 lugar administrar in vivo um anticorpo marcado radioactivamente que reage imunologicamente com um antigénio do tumor, seguida da administração in vivo de uma quantidade eficaz do anticorpo marcado radioactivamente ao tumor. Além disso pode utilizar-se radioisótopos para administrar radiação ionizante a um tecido ou célula. Adicionalmente, a radiação pode ser administrada por meio de um agente radiomimético. Como aqui utilizado, um "agente radiomimético" é um agente quimioterapêutico, por exemplo melfalano, que provoca o mesmo tipo de dano celular que a terapia de radiação, mas sem a aplicação de radiação.

Como aqui utilizado o termo "unidade pró-fármaco" significa; o pró-fármaco pode ser convertido em condições fisiológicas no fármaco biologicamente activo por um número de mecanismos químicos e biológicos. Numa forma de realização, a conversão do pró-fármaco no fármaco biologicamente activo pode ser conseguida por hidrólise da unidade pró-fármaco desde que a unidade pró-fármaco seja química ou enzimaticamente hidrolisável com água. A reacção com água resulta tipicamente na remoção da unidade pró-fármaco e libertação do fármaco biologicamente activo. Ainda outro aspecto da invenção proporciona a conversão do pró-fármaco no fármaco biologicamente activo por redução da unidade pró-fármaco. Tipicamente, nesta forma de realização, a unidade pró-fármaco é redutível em condições fisiológicas na presença de um processo de redução enzimático. A redução resulta preferencialmente na remoção da unidade pró-fármaco e libertação do fármaco biologicamente activo. Noutra forma de realização, a conversão do pró-fármaco no fármaco biologicamente activo também pode ser conseguida por oxidação da unidade pró-fármaco. Tipicamente nesta forma de realização, a unidade 20 pró-fármaco é oxidável sob condições fisiológicas na presença de um processo enzimático oxidativo. A oxidação resulta preferencialmente na remoção da unidade pró-fármaco e libertação do fármaco biologicamente activo. Um outro aspecto da invenção abrange a conversão do pró-fármaco no fármaco biologicamente activo por eliminação da unidade pró-fármaco. Duma maneira geral, nesta forma de realização a unidade pró-fármaco é removida sob condições fisiológicas com uma reacção química ou biológica. A eliminação resulta na remoção da unidade pró-fármaco e libertação do fármaco biologicamente activo. Evidentemente, qualquer composto pró-fármaco da presente invenção pode sofrer qualquer associação dos mecanismos detalhados acima para converter o pró-fármaco no composto biologicamente activo. Por exemplo, um composto particular pode sofrer hidrólise, oxidação, eliminação e redução para converter o pró-fármaco no composto biologicamente activo. Do mesmo modo, um composto particular pode sofrer apenas um destes mecanismos para converter o pró-fármaco no composto biologicamente activo.

Como aqui utilizado, "cancro" refere-se a todos os tipos de cancro ou neoplasma ou tumores malignos ou benignos encontrados em mamíferos, incluindo carcinomas e sarcomas. Exemplos de cancros são cancro do cérebro, mama, pâncreas, cérvix, cólon, cabeça e pescoço, rim, pulmão, pulmão de células não-pequenas, melanoma, mesotelioma, ovário, sarcoma, estômago, útero e Meduloblastoma. O termo "leucemia" refere-se, de um modo lato, a doenças malignas progressivas de órgãos hematopoiéticos e caracteriza-se em geral por uma proliferação e desenvolvimento distorcidos de leucócitos e seus precursores no sangue e medula óssea. Duma maneira geral, a 21 leucemia é clinicamente classificada com base na (1) duração e carácter da doença - aguda ou crónica; (2) tipo de célula envolvida; mielóide (mielogénica), linfóide (linfogénica) ou monocítica; e (3) aumento ou não aumento do número de células anormais no sangue - leucémica ou aleucémica (subleucémica). 0 modelo de leucemia P388 é amplamente aceite como sendo preditivo da actividade antileucémica in vivo. Julga-se que os compostos que originem um resultado positivo no ensaio de P388 exibirão em geral algum nivel de actividade antileucémica in vivo independentemente do tipo de leucemia a ser tratada. Por conseguinte, a presente invenção inclui um método de tratamento de leucemia e, preferencialmente, um método de tratamento de leucemia não linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia granulocitica aguda, leucemia granulocitica crónica, leucemia promielocitica aguda, leucemia de células T dos adultos, leucemia aleucémica, uma leucemia leucocitémica, leucemia basófila, leucemia de blastócitos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionária, leucemia eosinofilica, leucemia de Gross, leucemia de células ciliadas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocitica, leucemia de células pluripotentes, leucemia monocitica aguda, leucemia leucopénica, leucemia lifática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocitica, leucemia linfogénica, leucemia linfóide, leucemia de células de linfossarcoma, leucemia de mastócitos, leucemia de megacariócitos, leucemia micromieloblástica, leucemia monocitica, leucemia de mieloblastos, leucemia mielocítica, leucemia granulocitica mielóide, leucemia mielomonocitica, leucemia de Naegeli, leucemia granulomatosa, leucemia plasmocitária, leucemia promielocitica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células 22 pluripotentes, leucemia subleucémica e leucemia de células não diferenciadas. 0 termo "sarcoma" refere-se em geral a um tumor que é feito de uma substância semelhante ao tecido conjuntivo embrionário e é geralmente constituído por células extremamente compactadas embutidas numa substância fibrosa ou homogénea. Os sarcomas que podem ser tratados com 4-metoxi-carbazole e radioterapia incluem um condrossarcoma, colangiossarcoma, fibrossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adipose, lipossarcoma, sarcoma alveolar da parte mole, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrióide, cloroleucemia, cório-carcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma do tumor de Wilms, sarcoma do endométrio, sarcoma do estroma, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocitico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma pigmentado hemorrágico idiopático múltiplo, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiossarcoma, leucossarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma periosteal, sarcoma de reticulócitos, sarcoma de Rous, sarcoma seroquistico, sarcoma dos tecidos moles, sarcoma sinovial e sarcoma telangiectásico. 0 termo "melanoma" significa um tumor que resulta do sistema melanocitico da pele e outros órgãos. Os melanomas que podem ser tratados com 4-metoxi-carbazole e radioterapia incluem, por exemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma benigno juvenil, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, 23 melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungal e melanoma de disseminação superficial. 0 termo "carcinoma" refere-se a um novo crescimento maligno constituído por células epiteliais que tem tendência para infiltrar os tecidos circundantes e dar origem a metástases. Os carcinomas ilustrativos que podem ser tratados com 4-metoxi-carbazole e radioterapia incluem, por exemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquistico, carcinoma adenoide quistico, carcinoma da mama, carcinoma adenomatoso, carcinoma do córtex supra-renal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de célula basais, carcinoma basocelular, carcinoma basalóide, carcinoma basal de células escamosas, carcinoma da bexiga, carcinoma broncoalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma colóide, carcinoma colorrectal, carcinoma cervical, comedocarcinoma, carcinoma do corpo, carcinoma cribriforme, carcinoma em couraça, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionário, carcinoma encefalóide, carcinoma epidermóide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gástrico, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma das células gigantes, carcinoma giganto-celular, carcinoma glandular, carcinoma das células granulosas, carcinoma da matriz do pêlo, carcinoma hemático, carcinoma hepatocelular, carcinoma das células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefróide, carcinoma infantil embrionário, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, 24 carcinoma das células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma do pulmão, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma da medula, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma mucoso, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma mucoso, carcinoma da mucosa, carcinoma mixomatoso, carcinoma nasofaringeo, carcinoma de células pequenas, carcinoma ossificante, carcinoma osteóide, carcinoma do ovário, carcinoma pancreático, carcinoma da próstata, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma das células espinhosas, carcinoma pultáceo, carcinoma das células renais do rim, carcinoma das células de reserva, carcinoma sarcomatoso, carcinoma Schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma escrotal, carcinoma das células em anel de sinete, carcinoma simples, carcinoma de células pequenas, carcinoma solenoide, carcinoma de células nodulares, carcinoma fusocelular, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma das cordas vocais, carcinoma telangiectásico, carcinoma associado a telangiectasia, carcinoma testicular, carcinoma de células de transição, carcinoma da tiróide, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso e carcinoma viloso.

Os cancros preferidos que podem ser tratados com os compostos de acordo com a invenção incluem, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (olho, lábio, oral, faringe, latinge, nasal, carcinoma da lingua e carcinoma esofágico), melanoma, carcinoma de células escamosas (epiderme), glioblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, oligoastrocitoma, meningioma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, sarcomas do tecido mole, osteossarcoma, 25 malignidade hematológica no sítio do snc, carcinoma da mama (ductal e carcinoma in situ), carcinoma da tiróide (papilar e folicular), carcinoma do pulmão (carcinoma broncoalveolar, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma misto de células pequenas/células grandes, carcinoma de células pequenas combinado, carcinoma do pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma do pulmão), carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, carcinoma cervical, carcinoma do ovário, carcinoma da próstata, carcinoma testicular, carcinoma gástrico, carcinoma pancreático, colangiossarcoma, linfoma (tipos Hodgkins e não-Hodgkins com origem em células T e B), leucemia (leucemias aguda e crónica de origens mielóide e linfóide) e carcinoma da bexiga.

Os cancros mais preferidos que podem ser tratados com compostos de acordo com a invenção incluem, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (olho, lábio, oral, faringe, laringe, nasal, carcinoma da língua e carcinoma esofágico), melanoma, carcinoma de células escamosas (epiderme), glioblastoma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do pulmão, (carcinoma broncoalveolar, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma misto de células pequenas/células grandes, carcinoma de células pequenas combinado, carcinoma do pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma do pulmão), linfoma (tipos Hodgkins e não-Hodgkins com origem em células T e B) e leucemia (leucemias aguda e crónica de origens mielóide e linfóide). 26 26 termo "4-metoxi-carbazole"

Como aqui utilizado, o utilizado para significar os fórmula: é compostos químicos com a

ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável, em que, X é H ou uma unidade pró-fármaco. 0 composto da presente invenção pode conter uma unidade pró-fármaco. Exemplos de uma unidade pró-fármaco contemplada pela invenção podem ser seleccionados de ésteres de fosfato, ésteres de aminoácido, amidas de aminoácido, carbamatos de aminoalquilo, carbamatos de alcoxialquilo, carbamatos de hidroxialquilo, ésteres de alcoxialquilo, ésteres de hidroxialquilo, ésteres de ácido benzóico, ésteres nicotínicos, acetatos de piperazina, acetatos de morfolina e bases de Mannich. Exemplos de uma unidade pró-fármaco contemplada pela invenção podem ser seleccionados de: v^0~P(=0)(GH}2

0 R6 R6 NH„ 5 27

Uma unidade pró-fármaco preferida é uma base de Mannich. As bases de Mannich preferidas incluem, mas não se restringem a, 4-metil-piperazin-l-ilmetil-, morfolin-4-ilmetil- e dietilaminometil-.

Os compostos da presente invenção também podem tomar a forma de um sal, hidrato, solvato ou metabolito farmacologicamente aceitável. Sais farmacologicamente aceitáveis incluem sais básicos de ácidos inorgânicos e orgânicos, incluindo mas não se limitando a ácido 28 clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido málico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido salicílico, ácido benzóico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido ascórbico, ácido glucónico e semelhantes. Quando os compostos da invenção incluem uma função ácida, como um grupo carboxilo, então os pares de catião farmaceuticamente aceitável adequados para o grupo carboxilo são bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem catiões alcalinos, alcalino-terrosos, de amónio, de amónio quaternário e semelhantes. É contemplado pela invenção que quando os compostos da presente invenção tomam a forma de um sal farmacologicamente aceitável, a referida forma de sal pode ser gerada in sítu ou como um sólido isolado.

Os compostos da presente invenção, em particular na forma dos sais acabados de descrever, podem ser combinados com vários excipientes e/ou adjuvantes bem conhecidos nesta técnica os quais servem de veículos farmaceuticamente aceitáveis para permitir a administração do fármaco na forma de, por exemplo, injecções, suspensões, emulsões, comprimidos, cápsulas e pomadas. Estas composições farmacêuticas, contendo uma quantidade radiossensibilizadora dos compostos descritos, podem ser administradas por quaisquer meios aceitáveis que resultem na radiossensibilização de células tumorais hipóxicas. Para animais de sangue quente e, em particular, para humanos submetidos a tratamento de radioterapia, a administração pode ser oral, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. A fim de destruir as células tumorais hipóxicas, a composição farmacêutica contendo o radiossensibilizador é 29 administrada numa quantidade eficaz para radiossensibilizar as células tumorais hipóxicas. A dosagem especifica administrada dependerá de factores como o estado físico e de saúde geral do doente bem como da sua idade e peso, da fase da condição patológica do doente e da existência de quaisquer tratamentos simultâneos. 0 método de administração de uma quantidade eficaz também varia em função do distúrbio ou doença a ser tratada. Julga-se que o tratamento por aplicação intravenosa do 4-metoxi-carbazole, formulado com um veiculo, um composto ou compostos de inibição de cancro adicionais ou diluente apropriado para facilitar a aplicação, seja o método preferido para administração dos compostos a animais de sangue quente.

Os compostos aqui descritos podem ser administrados na forma pura, combinados com outros ingredientes activos ou combinados com excipientes ou veículos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. As composições orais incluirão geralmente um veículo diluente inerte ou um veículo comestível. Como parte da composição podem ser incluídos aglutinantes e/ou adjuvantes farmaceuticamente compatíveis. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos ingredientes seguintes, ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante como celulose microcristalina, goma de tragacanta ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um dispersante como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um edulcorante como sacarose ou sacarina; ou um aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de 30 laranja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além do material do tipo acima, um veículo líquido como um óleo gordo. Além disso, as formas unitárias de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma-laca ou agentes entéricos. Além disso, um xarope pode conter, além dos compostos activos, sacarose como um edulcorante e determinados conservantes, corantes, agentes de coloração e aromas. A quantidade de composto administrada ao doente é suficiente para radiossensibilizar o neoplasma maligno a ser tratado mas inferior àquela que poderia desencadear efeitos tóxicos. Esta quantidade dependerá do tipo de tumor, da espécie do doente a ser tratado, da dosagem pretendida e do peso ou superfície corporal do doente. A radiação pode ser administrada a humanos numa variedade de regimes de fraccionamento diferentes, isto é, a dose de radiação total é dada em porções ao longo de um período de vários dias até várias semanas. É muito provável que estas variem desde doses diárias (isto é, cinco vezes por semana) durante até seis semanas, até doses semanais durante quatro até seis semanas. A quantidade do composto de radiossensibilização administrado ao doente pode ser dada antes do tratamento de radiação, durante o tratamento de radiação ou após o tratamento de radiação. No entanto, prefere- -se que os compostos da invenção sejam administrados antes do tratamento de radiação. 31

Após administração da composição de radiossensibilização às células tumorais hipóxicas e decorrido um intervalo de tempo suficiente para aumentar a radiossensibilização das células tumorais hipóxicas, as células tumorais hipóxicas são irradiadas com uma dose de radiação eficaz para destruir as células tumorais hipóxicas. Duma maneira geral, o doente receberá uma dose de radiação de cerca de 2 Gy por dia durante cinco dias. Duma maneira geral, o doente receberá uma dose de radiação total de cerca de 70 até cerca de 80 Gy ao longo de sete até oito semanas, sendo cada dose de radiação individual administrada em menos de aproximadamente 1 até 4 h após administração do radiossensibilizador. Tais sequências de tratamentos de radiossensibilização e irradiação são repetidas consoante necessário para enfraquecer e, numa situação óptima, reduzir ou eliminar, a disseminação da malignidade. No entanto, é entendido pelo especialista na técnica que a dose de radiação diária e a dose de radiação total variarão em função do tipo de tumor do doente, protocolo de tratamento e estado fisico. Por exemplo, a dose diária dos actuais compostos não está especificamente restringida mas pode variar com a idade do doente, cancro, massa corporal e protocolo de tratamento corrente e/ou medicações. Além disso, os actuais compostos são úteis como radiossensibilizadores e podem ser administrados em uma ou mais doses, isto é uma a várias doses, antes da exposição à radiação.

Estudos Iniciais de Radiossensibilização Utilizando Xenoenxertos Radiorresistentes U87MG em Ratos Glabros (Plano de Dosagem Não Optimizado) 32 A irradiação de células induz a paragem do ponto de verificação, o que permite que as células reparem os danos no ADN, facilitando a PARP activada essa reparação de danos no adn. Hipoteticamente, a administração de um inibidor de PARP em associação com radiação numa única dose ou em doses fraccionadas reduzirá a capacidade das células irradiadas para reparar os danos no ADN e aumentar a morte celular. Portanto, um inibidor de PARP deveria funcionar em sinergia com radiação fraccionada para aumentar o atraso no crescimento do tumor. 0 teste inicial desta hipótese com o Exemplo 7/Exemplo 6 foi realizado em xenoenxertos radiorresistentes de glioblastoma humano U87MG em ratos glabros. Como se mostra na Figura 3 foi efectuada a administração do Exemplo 7 sozinho, radiação sozinha e Exemplo 7 em associação com radiação (100 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6, s.c. qd dois dias antes da radiação e em associação com 7,5 Gy de radiação durante 3 dias) em ratos portadores de tumores estabelecidos. O Exemplo 7 administrado como um agente único não teve qualquer efeito no crescimento do tumor. Os tumores tratados com veiculo ou Exemplo 7 atingiram um volume tumoral de 2000 mm3 em 10,0 dias ou 9,6 dias (p = 0,798, vs. controlo), respectivamente. A administração de radiação sozinha aumentou o tempo para atingir 2000 mm3 para 16,1 dias, um aumento no atraso no crescimento do tumor (TGD) de 6,1 dias (p=0,033, vs. controlo). Por sua vez, a administração do Exemplo 7 com terapia de radiação aumentou o tempo para os tumores atingirem 2000 mm3 para 24,8 dias, correspondendo a um TGD de 14,8 dias. A grandeza do efeito com a terapia de associação foi mais forte do que a observada para um regímen comparável de Exemplo 7 sozinho (p=0,001) ou radiação sozinha (p=0,006) indicando que o Exemplo 7 exibe o perfil de um verdadeiro 33 radiossensibilizador. Os níveis no plasma do Exemplo 6 à Cmax associada à eficácia (a 100 mg/kg de Exemplo 7) foram de 23 μΜ, comparáveis aos obtidos a esta dose em estudos de quimiossensibilização.

Estudos de Radiossensibilização com Exemplo 7 e um Plano de Administração de Radioterapia Fraccionada Cllnlcamente Relevante Utilizando Xenoenxertos Radiorresistentes U87MG em Ratos glabros O estudo subsequente de radiossensibilização consistiu em avaliar o Exemplo 7 (30 e 100 mg/kg, s.c.) em associação com um plano de radioterapia fraccionada clinicamente relevante (2 Gy x 5dias). O Exemplo 7 foi administrado 0,5 h após radiação durante 5 dias e a administração do Exemplo 7 foi prosseguida durante 16 dias depois do regímen de radiação ter sido concluído. A fundamentação lógica para este plano de administração baseou-se no facto de a reparação dos danos provocados pela radiação no adn ocorrer 10-12 dias após radiação, pelo que a administração contínua do Exemplo 7 e a modulação da actividade da PARP cobre o tempo de paragem do ciclo celular e reparação do ADN o que deveria actuar sinergicamente com a radiação fraccionada para aumentar a radiossensibilidade e o atraso no crescimento do tumor. Como se mostra nas Figuras 1 e 2, a administração de radiação sozinha (2 Gy x 5dias) resultou num TGD de 2,5 dias por comparação com os tumores tratados com veículo. A administração do Exemplo 7 (CEP 30; 30 mg/kg s.c.) aumentou o TGD para 15 dias, um aumento de 4 vezes em comparação com a radiação sozinha (p<0,05); e 26 dias, um aumento de 6 vezes em comparação com o Exemplo 7 sozinho (p<0,001). Os níveis no plasma do Exemplo 6 à Cmax 34 associada à eficácia de radiossensibilização foram de 5,5 μΜ. A administração do Exemplo 7 (100 mg/kg, s.c.) com radioterapia fraccionada resultou em eficácia antitumoral significativa, mas 80% de mortalidade no dia 11. Os niveis no plasma à Cmax à dose de 100 mg/kg, s.c. foram de 21 μΜ, em concordância com os niveis de exposição alcançados a esta dose em estudos de quimiossensibilização e os estudos iniciais de radiossensibilização descritos acima.

Estes dados demonstram que foi observado um aumento maior no TGD a uma concentração mais baixa de Exemplo 7 (CEP 30; 30 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 s.c. qd x 21 dias) utilizando um plano de administração fraccionada clinicamente relevante. Além disso, o Exemplo 7 (CEP 30; 30 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 s.c. qd x 21 dias) sozinho não teve qualquer efeito na inibição do crescimento do tumor demonstrando que o Exemplo 7 actua como um "verdadeiro" radiossensibilizador. A fim de avaliar o ganho terapêutico, o Exemplo 7 (30 e 100 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 sc) com 2 Gy de radiação x 5 dias foi avaliado em ensaios de medula óssea e cripta jejunal para determinar se o Exemplo 7 potenciava a toxicidade no tecido normal (NT) induzida por radiação. A avaliação da medula óssea e mucosa intestinal revelaram que o Exemplo 7 (30 e 100 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 sc) não potenciava a toxicidade da radiação nestes tecidos. Estudos indicam que o CEP-9722 exerce efeitos de radiossensibilização quando administrado por via oral. Estes dados combinados indicam que o Exemplo 7 actua como um radiossensibilizador aumentando a eficácia de radioterapia fraccionada num modelo de glioma 35 radiorresistente de uma maneira superior à aditiva e não potência a toxicidade em NT induzida por radiação.

Exemplos

Os compostos da presente invenção podem ser preparados por um número de métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo, mas não se limitando aos descritos abaixo, ou através de modificações destes métodos aplicando técnicas correntes conhecidas dos especialistas na técnica de síntese orgânica. Todos os processos divulgados em associação com a presente invenção são considerados como sendo praticados a qualquer escala, incluindo miligrama, grama, multigrama, quilograma, multiquilograma ou escala industrial. A presente invenção apresenta métodos de preparação dos compostos multicíclicos aqui descritos os quais são úteis como inibidores de PARP. 0 método consiste de uma síntese de múltiplos passos começando com 4-metoxiindole. Especificamente, o 4-metoxiindole A, é sucessivamente tratado, por exemplo, com butil-lítio, dióxido de carbono, t-butil-lítio e uma cetona B para proporcionar um álcool terciário de 4-metoxiindole substituído na posição 2 C. Este álcool terciário é eliminado, por exemplo, em condições ácidas utilizando ácido clorídrico ou ácido toluenossulfónico, para proporcionar um 2-vinilindole substituído, D. A cicloadição de Diels-Alder de D com um dienófilo como, mas não se restringindo a, maleimida (E) proporciona o intermediário de cicloadição F. A aromatização do intermediário de cicloadição, por exemplo, com oxigénio na presença de um catalisador como paládio ou 36 platina ou com um oxidante como DDQ ou tetracloroquinona, produz o carbazole G. 0 tratamento adicional de G com um reagente de alquilação ou acilação dá os derivados de carbazole N-substituidos com índole da presente invenção. Os procedimentos convencionais para a selecção e preparação de derivados pró-fármacos adequados são descritos, por exemplo, em Prodrugs, Sloane, K. B., Ed.; Mareei Dekker: New York, 1992.

Os compostos da presente invenção são inibidores de PARP. A potência do inibidor pode ser avaliada medindo a actividade PARP in vitro ou in vivo. Um ensaio preferido monitoriza a transferência de unidades de ADP-ribose marcadas radioactivamente de [33P]NAD+ para um aceitador proteico como a histona ou a própria PARP. Os ensaios de rotina para a PARP são divulgados em Purnell e Whish, Biochem. J. 1980, 185, 775.

Exemplo 1

Linhagem de Células Células de glioblastoma humano U87MG foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo (MEM) comercialmente disponível com 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, aminoácidos não essenciais 0,1 nM, piruvato de sódio 0,1 nM com 10% de Soro Fetal

Bovino (FBS).

Exemplo 2 implantação e Crescimento de Células Tumorais 37 Células em crescimento exponencial foram colhidas e injectadas ((2 xlO6) células/rato) no flanco direito de ratos glabros NCR NUM atímicos comercialmente disponíveis. Os animais portadores de tumores de 200-400mm3 foram distribuídos aleatoriamente de acordo com o tamanho em grupos de tratamento apropriados (n=10). Os tumores foram medidos cada 3-4 dias utilizando um compasso de nónio. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula seguinte: V(mm3) = 0,5236 x comprimento (mm) x largura (mm) [comprimento (mm) + largura (mm)/2].

Exemplo 3 Métodos: Células de glioblastoma humano U87MG foram injectadas por via subcutânea (s.c.) no membro posterior direito de ratos NCR NUM atímicos e deixadas crescer até um volume médio de tumor de 200mm3. Os ratos que receberam radioterapia foram anestesiados antes da irradiação com 100 mg/kg de Cetamina + 10 mg/kg de xilezina ou 37,5 mg/kg de Cetamina + 0,2 mg/kg de acepromazina, s.c. para proporcionar 25-30 min de sedação. Os ratos anestesiados foram posicionados numa protecção de chumbo maleável de acordo com o tamanho e forma do corpo do animal sem pressão excessiva. O corpo foi protegido com chumbo. A perna portadora de tumor ou o tumor exposto foi irradiado com a dose apropriada. Depois dos tumores terem sido irradiados, os ratos foram recolocados nas caixas sobre almofadas de aquecimento até recuperarem dos anestésicos. O Exemplo 7 foi administrado tão cedo quanto possível (em menos de 30 min) após radiação (RT) . Figura 3: Os ratos foram distribuídos aleatoriamente pelos seguintes grupos de 38 tratamento (n=10): 1) veículo, 2) radiação sozinha (7,5 Gy durante 3 dias), 3) Exemplo 7 sozinho (100 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6, s.c, QD durante 5 dias), e 4) Exemplo 7 com radiação. Foi administrado s.c. o Exemplo 7 ou veículo nos dias 1-5 e 30 minutos após radiação nos dias 2, 3 e 4. A análise de dados foi realizada utilizando regressão de efeitos mistos para modelar o logaritmo de base 10 do volume do tumor como uma função do tempo e tratamento. As análises foram realizadas em SAS 8.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Figures 1&2: Os ratos foram distribuídos aleatoriamente pelos seguintes grupos de tratamento e administrados com: 1) veículo, 2) RT (5x2 Gy), 3) RT mais Exemplo 7 (30 ou 100 mg/kg s.c. de equivalentes de dose de Exemplo 6, qd x 21d) ou 4) Exemplo 7 (30 ou 100 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 s.c, qd x 21d) sozinho. O Exemplo 7 foi administrado nos dias 1-21 e a RT foi administrada nos dias 1-5. Todos os animais foram medidos no mesmo dia. As medições individuais do volume do tumor foram modeladas num modelo linear transformado logaritmicamente e foi determinado o melhor tempo ajustado para os tumores atingirem aproximadamente 2000 mm3. Utilizou-se a ANOVA unifactorial e a análise post hoc para determinar a significância. Um valor de P <0,05 foi considerado significativo.

Resultados: Todos os grupos começaram o tratamento com tumores de tamanho semelhante de 200mm3 (P=0,83 comparando os grupos no dia 0). Como se mostra na Figura 3, a administração do Exemplo 7 sozinho, radiação sozinha e Exemplo 7 em associação com radiação (100 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6, s.c. qd dois dias antes da radiação e em associação com 7,5 Gy de radiação durante 39 3 dias) foi efectuada em ratos portadores de tumores estabelecidos. 0 Exemplo 7 administrado como um agente único não teve qualquer efeito no crescimento do tumor. Os tumores tratados com veiculo ou Exemplo 7 sozinho atingiram um volume de tumor de 2000 mm3 em 10,0 dias ou 9,6 dias (P = 0,798, vs. controlo), respectivamente. A administração de radiação sozinha aumentou o tempo para atingir 2000 mm3 para 16,1 dias, um aumento no atraso no crescimento do tumor (TGD) de 6,1 dias (P=0, 033, vs. controlo). A terapia de associação do Exemplo 7 com terapia de radiação aumentou o tempo para os tumores atingirem 2000 mm3 para 24,8 dias, correspondendo a um TGD de 14,8 dias. A grandeza do efeito com a terapia de associação foi mais forte do que a observada num regímen comparável do Exemplo 7 sozinho (P=0,001) ou de radiação sozinha (P=0,006) indicando que o Exemplo 7 exibe o perfil de um verdadeiro radiossensibilizador. Como se mostra nas Figures 1&2, a administração do Exemplo 7 (CEP 30; 30 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 s.c.) em associação com RT aumentou o TGD para 15 dias, um aumento de 4 vezes em comparação com a radiação sozinha (P<0,05); e 26 dias, um aumento de 6 vezes em comparação com o Exemplo 7 sozinho (P<0,001). A administração do Exemplo 7 (100 mg/kg, s.c.) com radioterapia fraccionada resultou numa eficácia antitumoral significativa, mas com 80% de mortalidade no dia 11. Estes dados demonstram que foi observado um aumento maior no TGD a uma concentração menor de Exemplo 7 (CEP 30; 30 mg/kg) utilizando um plano de administração fraccionado clinicamente relevante. Além disso, a administração do Exemplo 7 sozinho não teve qualquer efeito na inibição do crescimento do tumor, demonstrando que o Exemplo 7 actua como um "verdadeiro" radiossensibilizador. 40

Exemplo 4

Avaliação dos Danos no ADN

Anticorpos: Podem ser utilizados anticorpos primários contra fosfo histona H2AX (Sinalização Celular, #2577, 1: 1000) e GAPDH (Abeam, #9484, 1:5000). Os anticorpos secundários podem ser Anti-rato de cabra lRDye800 (Rockland, #610-132-121) e Anti-coelho de cabra Alexa fluor 700 (Molecular Probes, #A21038). Células U87MG podem ser irradiadas com 3Gy ou 5Gy de radiação, seguidas de tratamento com o Exemplo 6 (300 nM e 1 μΜ) 0,5 h após irradiação. Podem ser depois recolhidas amostras às 0,5, 1 e 4 horas após a adição do Exemplo 6. As células podem ser depois submetidas a lise em gelo em tampão RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris 50 mM, pH 8,0) e cocktail inibidor (Protease Inhibitor Cocktail Set III, Calbiochem), e Na3V04 1 mM pode ser então quantificado utilizando o estojo de doseamento de proteína BCA (Pierce #23225). As amostras podem ser resolvidas por electroforese (15 μρ de proteína) utilizando um gel de bis tris a 4-12% (Novex #NP0336) com tampão MES SDS (Novex, #NP0002) a 140 volt, e em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Biorad, #162-0145) por transferência semi-seca (18 volt durante 35 minutos) utilizando tampão de transferência 2x (Novex, #NP0006). As membranas podem ser depois bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente em Tampão de Bloqueio Odyssey (Licor # 927-40000) diluído a 1:1 com TBS lx e em seguida incubadas dum dia para o outro a 4 °C com ambos os anticorpos primários em Tampão de Bloqueio Odyssey diluído 41 a 1:1 com TBS-T lx a 0,05%. No dia seguinte, as membranas podem ser lavadas quatro vezes com TBS-T lx a 0,2% durante 10 minutos em cada lavagem e em seguida incubadas com ambos os anticorpos secundários a 1:10.000 (em Tampão de Bloqueio Odyssey diluído a 1:1 com TBS-T lx a 0,05%) durante 1,5 horas à temperatura ambiente protegidas da luz. As transferências podem ser lavadas quatro vezes com TBS-T lx a 0,2% durante 10 minutos em cada lavagem (protegidas da luz) e em seguida lidas no Visualizador de Infravermelhos Odyssey. A GAPDH pode ser visualizada utilizando o sinal a 800nm e a fosfo-H2AX detectada em seguida a 700nm. O tamanho esperado para a fosfo histona H2AX é de 15kDa e para a GAPDH é de 36kDa.

Exemplo 5

Análise do Ciclo Celular Células U87MG podem ser irradiadas a 3Gy ou 5Gy de radiação e em seguida tratadas com o Exemplo 6 (300 nM e 1 μΜ) 0,5 horas após irradiação. Podem ser depois colhidas amostras 8, 24 e 48 horas (ou quaisquer outros tempos determinados por um especialista na técnica) após a adição do Exemplo 6. As células podem ser fixadas em etanol a 100% dum dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, as células podem ser incubadas com reagente de ciclo celular (Guava Technologies #4500-0220) durante 1 hora à temperatura ambiente, protegidas da luz. Os núcleos revelados são analisáveis por citometria de fluxo (Guava EasyCyte; utilizando ajustes conhecidos do especialista na técnica, por exemplo 427 x8; dados de aquisição 5.000 eventos/amostra). A percentagem de células em cada fase do ciclo celular pode ser determinada 42 utilizando software de análise do Ciclo Celular (Guava Technologies).

Exemplo 6 7-Metoxi-l, 2,3,ll-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona

6

Passo 1: A uma solução arrefecida (-78 °C) de 4-metoxiindole (2,0 g, 13,1 mmol) em THF seco (20 mL) foi adicionado lentamente nBuLi em hexanos (2,5 M, 5,2 mL, 13,1 mmol). A mistura foi agitada a -78 °C durante mais 30 min, e foi então borbulhado C02 gasoso na mistura reaccional durante 15 min, seguido de agitação adicional de 15 min. O excesso de C02 e metade do volume de THF foram removidos a pressão reduzida. Foi adicionado mais THF seco (10 mL) à mistura reaccional que foi novamente arrefecida até -78 °C. Foi lentamente adicionado t-BuLi 1,7 M (7,7 mL, 13,1 mmol) à mistura reaccional ao longo de 30 min. A agitação foi prosseguida durante 2 h a - 78 °C, seguida da adição lenta de uma solução de ciclopentanona (1,7 g, 20,4 mmol) em THF seco (5 mL). Após uma agitação adicional de 1 h a -78 °C, a mistura reaccional foi desactivada pela adição gota a gota de água (5 mL) seguida de solução saturada de NH4C1 (20 mL) . Foi adicionado éter etílico (50 mL) e a mistura foi agitada durante 10 min à temperatura ambiente. A camada 43 orgânica foi separada, seca (MgS04) e concentrada para dar uma mistura de álcool (1-(4-metoxi-lH-indol-2-il)- ciclopentanol) e dieno (2-ciclopent-l-enil-4-metoxi-lH- indole). À mistura em acetona (15 mL) foi adicionado HC1 2 N (5 mL). A mistura foi agitada durante mais 10 min, foi adicionada água (50 mL) e o produto dieno 2-ciclopent-l-enil-4-metoxi-lH-indole recolhido e seco sob vácuo. O produto foi purificado por cromatografia sobre silica gel (AcOEt/hexanos 9:1). RMN de (DMSO-d6) δ 1,9-2,1 (m, 3H), 2,6-2,75 (m, 3H) , 3,9 (s, 3H) , 6,1 (s, 1H), 6,3 (s, 1H) , 6,4 (m, 1H), 6,9-7,0 (m, 2H), 11,1 (s, 1H) . Este produto foi utilizado directamente no passo seguinte.

Passo 2: Uma mistura de 2-ciclopent-l-enil-4-metoxi-lH-indole (0,1 g, 0,47 mmol) e maleimida (0,0,9 g, 0,91 mmol) em acético ácido (5 mL) foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. Foi adicionada água e o produto extraído com AcOEt, o qual foi lavado com solução de Na2C03 2 N, água e solução saturada de NaCl e seco (MgS04) . O agente de secagem foi removido por centrifugação e o solvente concentrado para dar 0,13 g MS: m/z 309 (Μ - H).

Passo 3: O produto do passo 2 (0,123 g, 0,4 mmol) em tolueno (2 mL) e acético ácido (3 mL) foi adicionado 2,3-dicloro-5,6-diciano-l,4-benzoquinona (DDQ, 185 mg, 0,8 mmol) . Depois de agitar 30 min a 0 °C, a mistura foi concentrada e tratada com AcOEt e ácido ascórbico. Após 30 min a mistura foi tornada básica com Na2C03 2 N. A camada de AcOEt foi lavada com água, solução saturada de NaCl, seca (MgS04) e concentrada para dar o produto 0,095 mg; MS: m/z 305 (M - H)+. RMN de ΧΗ (DMSO-d6) δ 2,26-2,31 (m, 2H), 3,1-3,2 (m, 2H), 3,3-3,4 (m, 2H), 3,9 (s, 3H), 6,7 (m, 1H), 44 7,1 (m 1H), 6,4 (m, 1H), 7,4 (m, 1H), 10,6 (s, 1H), 11,9 (s, 1H).

Exemplo 7 7-Metoxi-5-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-1,2,3,11-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona

A uma pasta do Exemplo 6 (10,0 g, 30 mmol) e N-metilpiperazina (12,4 g, 124 mmol) em etanol (950 mL) foi adicionado paraformaldeido (5,60 g, 62,4 mmol) em 0,5 h e agitada durante 24 h. A pasta foi evaporada à secura. Ao resíduo foi adicionado hexano (500 mL), submetido a ultra-sons durante 15 min., agitado 1,5 h e arrefecido a O °C durante 15 min. Foi recolhido um sólido amarelo e lavado com hexano frio. Este produto foi dissolvido em tetra-hidrofurano quente (THF) (250 mL) e filtrado. O filtrado foi adicionado gota a gota a hexano (3 L), agitado 15 min. e o Exemplo 7 recolhido do precipitado e lavado com hexano (12,0 g, 96% de rendimento). RMN de XH (DMSO-d6) 2,12 (s,3H), 2,35 (m,8H), 2,53 (m,4H), 3,18 (m,2H), 4,44 (s,3H), 6,70 (d,1H), 7,10 (d,1H), 7,40 (t,lH), 11,96 (s,lH). MS m/z 419 (Μ + H).

Exemplo 8 45 7-Metoxi-5-(dietilaminometil)-1,2,3,ll-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona (Ex. 8a) 7-Metoxi-5,11-(bis-dietilaminometil)-1,2,3,11-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona (Ex. 8b)

A uma pasta do Exemplo 6 (50 mg, 0,16 mmol) em DMF (5 mL) foi adicionado paraformaldeído (73 mg, 0,81 mmol), dietilamina (84 pL, 0,81 mmol) e agitada à temperatura ambiente durante 1 dia. A reacção foi evaporada e o resíduo triturado com hexano e evaporado para dar dois produtos como um óleo, (proporção 6-1, 16b:16c). RMN de 1H (DMSO-d6) 0,98 (t,3H), 1,11 (t,3H), 2,27 (m,2H), 2,53 (m,8H), 2,57 (m,15H), 3,17 (t,2H), 3,50 (m,lH), 3,97 (s,3H), 4,14 (d, 2H), 4,71 (d,2H), 6,82 (t,2H), 6,75 (d,2H), 7,13 (d,2H), 7,33 (m,lH), 7,46 (t,3H),7,52 (m,1H), 11,95 (s,lH). 16b: MS m/z 392. 16c MS m/z 476.

Exemplo 9 7-Metoxi-5,11-(bis-morfolin-4-ilmetil)-1,2,3, ll-tetra-hidro-5, 11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona 4 6 ί

.Ν.

A uma pasta do Exemplo 6 (15 mg, 0,049 mmol) em DMF (1 mL) foi adicionado paraformaldeido (42 mg, 0,05 μί), morfolina (160 mg, 1,9 mmol) e aquecida a 70 °C durante 18 h. A mistura foi evaporada. O resíduo foi triturado com hexano, em seguida dissolvido CH2CI2, filtrado e evaporado. O resíduo foi triturado com Et20 e o Exemplo 9 recolhido como um sólido amarelo (5 mg, 20%), RMN de ΧΗ (DMSO-dg) 7,52 (t, 1H), 7,39 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 5,0 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,56 (s, 6H) , 3,49 (s, 4H) , 2,50 (s, 6H) , 2,49 (s, 4H), 2,45 (m, 2H); MS m/z 505 (Μ + H).

Exemplo 10 7-Metoxi-5-(morfolin-4-ilmetil)-1,2,3,ll-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona r

H 10 47 A uma pasta do Exemplo 6 (50 mg, 0,16 mmol) em etanol (10 mL) foi adicionado paraformaldeido (72 mg, 0,8 mmol), morfolina (100 g, 1,1 mol) e aquecida a 50 °C durante 5 h. A reacção foi evaporada, adicionada água (15 mL) e recolhido um sólido amarelo (59 mg) . RMN de 2H (DMSO-de) 11,98 (s, 1H), 7,45 (t, 1H), 7,13 (d, 1H) , 6,75 (d, 1H) , 4,44 (s, 2H),3,97 (s, 3H), 3,56 (s, 4h),3,18 (t, 2h), 2,29 (t, 2h). MS m/z 406 (Μ + H) .

Exemplo 11

Medição da Actividade Enzimática parp. A actividade PARP foi monitorizada por transferência de unidades ADP-ribose marcadas radioactivamente de [32P]NAD+ para um aceitador proteico como a histona ou a própria PARP. As misturas de ensaio continham Tris 100 mM (pH 8,0), DTT 2 mM, MgCl2 10 mM, 20 ug/mL de ADN (com entalhe por ultra-sons), 20 mg/mL de histona Hl, 5 ng de PARP humana recombinante e inibidor ou DMSO (< 2,5% (v/v)) num volume final de 100 uL. As reacções foram iniciadas pela adição de NAD+ 100 μΜ suplementado com 2 uCi [32P]NAD+/mL e mantidas à temperatura ambiente durante 12 minutos. Os doseamentos foram terminados pela adição de 100 μΜ de TCA a 50% e o precipitado marcado radioactivamente foi recolhido numa placa de filtração de 96 poços (Millipore, MADP NOB 50), lavado com TCA a 25%. A quantidade de radioactividade insolúvel em ácido, correspondendo à proteína poliADP-ribosilada, foi quantificada num contador de cintilação Wallac MicroBeta.

Determinação de IC50 para os Inibidores. 48

Os dados de inibição de um ponto foram calculados comparando a actividade de PARP, VEGFR2 ou MLK3 na presença de inibidor relativamente à actividade na presença de DMSO sozinho. As curvas de inibição para os compostos foram geradas representando graficamente a percentagem de inibição contra o logio da concentração de composto. Os valores de IC50 foram calculados por regressão não linear utilizando a equação dose-resposta sigmóide (declive variável) no GraphPad Prism do seguinte modo: y = fundo + (cimo - fundo)/(1 + io(1°5 IC50-x)*decllve) em que y é a % de actividade a uma dada concentração de composto, x é o logaritmo da concentração de composto, fundo é a % de inibição à concentração mais baixa de composto testada e cimo é a % de inibição à concentração mais alta de composto examinada. Os valores para fundo e cimo foram fixados a 0 e 100, respectivamente. Os valores de IC50 são relatados como a média de pelo menos três determinações separadas.

Utilizando Os ensaios aqui divulgados o Quadro 2 seguinte demonstra a utilidade dos compostos da invenção para inibição da PARP. Os compostos da presente invenção são considerados activos se os seus valores de IC50 forem inferiores a 50 uM. No Quadro seguinte, para a inibição de PARP, os compostos da presente invenção com um "+" são inferiores a 10000 nM; os compostos da presente invenção com "++"são inferiores a 1000 nM; e os compostos da presente invenção com "+++"são inferiores a 100 nM em termos de IC50 para a inibição de PARP. Onde não estiver representado o valor de IC50, o dado ainda tem de ser determinado. 49

Quadro 2

Exemplo N2 PARP ICso (nM) 6 6 + + + 7 7 + + + 8 8a/8b + + + 9 9 + + + 10 10 + + +

Exemplo 12

Foi realizado um estudo preliminar para determinar a capacidade de radiossensibilização do Exemplo 7 administrado por via oral.

Implantação e Crescimento de Células Tumorais Células em crescimento exponencial foram colhidas e injectadas (2xl06 células/rato) no flanco direito de ratos glabros NCR nu/nu atimicos comercialmente disponíveis. Os animais portadores de tumores de 200-400mm3 foram distribuídos aleatoriamente pelo tamanho em grupos de tratamento apropriados (n=4). Os tumores foram medidos cada 3-4 dias utilizando um compasso de nónio. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula seguinte: V=a2b/2, em que a e b são as dimensões curta e comprida, respectivamente. Métodos: Células de glioblastoma humano U87MG foram injectadas por via subcutânea (s.c.) no membro posterior direito de ratos glabros NCR nu/nu atimicos e deixadas 50 crescer até um volume de tumor médio de 200mm3. Os ratos que receberam radioterapia foram anestesiados antes da irradiação com 100 mg/kg de Cetamina + 10 mg/kg de xilezina ou 37,5 mg/kg de Cetamina +0,2 mg/kg de acepromazina, s.c. para proporcionar 25-30 min de sedação. Os ratos anestesiados foram colocados em protecções de chumbo maleável de acordo com o tamanho e forma do corpo do animal sem pressão excessiva. O corpo foi protegido com chumbo. A perna portadora de tumor ou o tumor exposto foi irradiado com a dose apropriada. Depois dos tumores terem sido irradiados, os ratos foram recolocados nas caixas sobre almofadas de aquecimento até recuperarem dos anestésicos. O Exemplo 7 foi administrado tão cedo quanto possível (em menos de 30 min) após radiação (RT). Os ratos foram distribuídos aleatoriamente pelos seguintes grupos de tratamento e administrados com: 1) veículo, 2) RT (2 Gy x 5d), 3) RT e Exemplo 7 (200 ou 300 mg/kg p.o. de equivalentes de dose de Exemplo 6, qd x 21d) ou 4) Exemplo 7 (200 ou 300 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 p.o., qd x 21d) sozinho. O Exemplo 7 foi administrado nos dias 1-21 e a RT foi administrada nos dias 1-5. Todos os animais foram medidos no mesmo dia. As medições individuais do volume do tumor foram moldadas num modelo linear transformado logaritmicamente e foi determinado o tempo do melhor ajuste para os tumores atingirem aproximadamente 2000 mm3.

Resultados: Como se mostra na Figura 5, a administração do Exemplo 7 (Cep 300; 300 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 p.o. qd x 21 d) e RT (2 Gy x 5d) resultaram na estase do crescimento do tumor a partir do dia 8 e prosseguindo ao longo do estudo (dia 31), enquanto a 51 administração do Exemplo 7 (Cep 200; 200 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 p.o. qd x 21 d) e RT (2 Gy x 5d) e Exemplo 7 sozinho (200 e 300 mg/kg de equivalentes de dose de Exemplo 6 p.o. qd x 21 d) não tiveram qualquer efeito no crescimento do tumor por comparação com a RT sozinha. Os dados obtidos indicam que a administração do Exemplo 7 sozinho não tem qualquer efeito no crescimento do tumor, o que confirma os dados obtidos na administração s.c..

Os especialistas na técnica compreenderão que pode ser feito um grande número de alterações e modificações às formas de realização preferidas da invenção e que essas alterações e modificações podem ser feitas sem que se saia do espirito da invenção. Tem-se, por isso, a intenção que as reivindicações apensas cubram todas essas variações equivalentes já que caem dentro do espirito e âmbitos verdadeiros da invenção. 52

REFERÊNCIAS

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Lisboa, 30 de Novembro de 2010

Claims (24)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica para radiossensibilizar células cancerosas compreendendo uma quantidade radiossensibilizadora de um composto de Fórmula (I):

0 (I) ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável, em que X é H ou uma unidade pró-fármaco; e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

2 R3 é seleccionado do grupo consistindo de -alquil Ci_4-NRXR2, -alquil C1-4-OR5, piridinilo, -fenil (CH2NR1R2) e -CH(R6)NH2; R4 é seleccionado do grupo consistindo de -0-(alquil C1-4) -NRXR2, -0-(alquil Ci_4)-OR5 e -CH(R6)NH2; R5 é H ou alquilo Ci_4; e R6 é a cadeia lateral de um aminoácido natural.

3. Composição farmacêutica da Reivindicação 1 em que a unidade pró-fármaco é -CH2NR1R2, R1 é H ou alquilo Ci_4; R2 é H ou alquilo C1-4; e alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo C1-4.

4. Composição farmacêutica como explicitada na Reivindicação 1 em que o composto é

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 3 3 na

5. Composição farmacêutica como explicitada Reivindicação 1 em que o composto é

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

6. Composto de Fórmula (II)

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

7. Radiossensibilizador de Fórmula (I): 4

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que X é H ou uma unidade pró-fármaco; para utilização no tratamento de cancro num mamífero através da administração do referido radiossensibilizador e da aplicação de radiação ionizante ao tecido do referido mamífero.

8. Radiossensibilizador da Reivindicação 7 em que o referido radiossensibilizador está presente no ou próximo do referido tecido aumentando a eficiência de conversão da referida radiação ionizante aplicada em efeitos terapêuticos localizados.

9. Radiossensibilizador da Reivindicação 8 em que o referido radiossensibilizador está presente numa quantidade eficaz para radiossensibilizar células cancerosas.

10. Radiossensibilizador da Reivindicação 9 em que a radiação ionizante do referido tecido é realizada com uma dose de radiação eficaz para destruir as referidas células. 5

11. Radiossensibilizador da Reivindicação 10 em que a referida radiação ionizante é de protocolos clinicamente aceites ou radioterapêuticos recomendados para um dado tipo de cancro.

12. Radiossensibilizador da Reivindicação 10 em que o referido cancro é maligno.

13. Radiossensibilizador da Reivindicação 10 em que o referido cancro é benigno.

14. Radiossensibilizador da Reivindicação 7 em que a unidade pró-fármaco é seleccionada do grupo consistindo de -CH2NR1R2, -CH2OC (=0) R3, -CH20P (=0) (OH) 2 e -C(=0)R4; R1 é H ou alquilo C4_4; R2 é H ou alquilo Ci_4; alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo C1-4; R3 é seleccionado do grupo consistindo de -alquil C4_4-NR1R2, -alquil Ci_4-OR5, piridinilo, -fenil (CH2NR1R2) e -CH (R6)NH2; R4 é seleccionado do grupo consistindo de -0-(alquil C1-4) -NR4R2, -0-(alquil C4_4)-OR5 e -CH(R6)NH2; R5 é H ou alquilo C4_4; e R6 é a cadeia lateral de um aminoácido natural. 6

15. Radiossensibilizador da Reivindicação 7 em que a unidade pró-fármaco é -CH2NR1R2, R1 é H ou alquilo Ci_4; R2 é H ou alquilo C1-4; e alternativamente, R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual eles estão ligados, formam um grupo heterociclilo seleccionado de pirrolilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo e piperazinilo, em que o referido grupo heterociclilo está opcionalmente substituído com alquilo C1-4.

16. Radiossensibilizador da Reivindicação 7 em que a unidade pró-fármaco é uma base de Mannich.

17. Radiossensibilizador da Reivindicação 14 em que a base de Mannich é seleccionada de 4-metil-piperazin-l-ilmetil-, morfolin-4-ilmetil- e 5-dietilaminometil-.

18. Radiossensibilizador da Reivindicação 14 em que a base de Mannich é 4-metil-piperazin-l-ilmetilo.

19. Radiossensibilizador da Reivindicação 7 em que a via de administração é intravenosa, subcutânea, oral ou intraperitoneal.

20. Radiossensibilizador da Reivindicação 7 em que a via de administração é intravenosa.

21. Radiossensibilizador de acordo com a Reivindicação 7 em que o referido cancro é seleccionado de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (olho, lábio, 7 oral, faringe, laringe, nasal, carcinoma da língua e carcinoma esofágico), melanoma, carcinoma de células escamosas (epiderme), glioblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, oligoastrocitoma, meningioma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, sarcomas do tecido mole, osteossarcoma, malignidade hematológica no sítio do snc, carcinoma da mama (ductal e carcinoma in situ), carcinoma da tiróide (papilar e folicular), carcinoma do pulmão (carcinoma broncoalveolar, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma misto de células pequenas/células grandes, carcinoma de células pequenas combinado, carcinoma do pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma do pulmão), carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, carcinoma cervical, carcinoma do ovário, carcinoma da próstata, carcinoma testicular, carcinoma gástrico, carcinoma pancreático, colangiossarcoma, linfoma (tipos Hodgkins e não Hodgkins com origem em células T e B), leucemia (leucemias aguda e crónica de origens mielóide e linfóide) e carcinoma da bexiga.

22. Radiossensibilizador de acordo com a Reivindicação 7 em que o referido cancro é seleccionado de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (olho, lábio, oral, faringe, laringe, nasal, carcinoma da língua e carcinoma esofágico), melanoma, carcinoma de células escamosas (epiderme), glioblastoma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do pulmão, (carcinoma broncoalveolar, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma misto de células pequenas/células grandes, carcinoma de células pequenas combinado, carcinoma do pulmão de células não-pequenas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma do pulmão), linfoma (tipos Hodgkins e não-Hodgkins com origem em células T e B) e leucemia (leucemias aguda e crónica de origens mielóide e linfóide).

23. Radiossensibilizador de acordo com a Reivindicação 7 de fórmula 7-metoxi-l, 2, 3,ll-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona, ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável.

24. Radiossensibilizador de acordo com a Reivindicação 15 de fórmula 7-metoxi-5-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-1,2,3,ll-tetra-hidro-5,11-diaza-benzo[a]trindeno-4,6-diona, ou uma sua forma de sal farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 30 de Novembro de 2010