PT2056807E - Tratamento de doenças inflamatórias - Google Patents

Description

ΕΡ 2 056 807/ΡΤ DESCRIÇÃO "Tratamento de doenças inflamatórias"

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO A. Campo da invenção A presente invenção refere-se genericamente ao campo das doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico. Mais particularmente, refere-se a métodos para o tratamento de doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico por modulação da actividade de receptores de esfingosina-1-fosfato. B. Descrição da Técnica Relacionada O sistema nervoso periférico (SNP) é um alvo comum de ataque imunitário. A polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC) é por vezes referida como a contrapartida do SNP da esclerose múltipla (EM), que afecta o sistema nervoso central, devido a similaridades entre as duas doenças em termos de decurso da doença (recidivante vs. progressiva), presença de desmielinização focal e vários graus de perda axónica e patofisiologia imuno-mediada. Os infiltrados inflamatórios nos nervos na PDIC consistem principalmente em células T e macrófagos, sugerindo que a reacção mediada por células T em relação a antigénios de mielina é a causa provável dos danos nos tecidos na PDIC. As terapias disponíveis para PDIC, tais como gamaglobulina intravenosa, plasmaferese e esteróides, são eficazes em dois terços dos pacientes, mas estão associadas a complicações ou falha na indução de remissão duradoura (Ropper, 2003). Portanto, existe uma premente necessidade de desenvolvimento de novos métodos e agentes terapêuticos que possam ser utilizados sozinhos ou em combinação com modalidades de tratamento existentes. O pedido PCT WO2005/025553 divulga a utilização de derivados de FTY720, e.g. os agonistas de esfingosina-1-fosfato (S1P) FTY720, FTY720-P, AAL(R) e AFD(R), para o 2 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ tratamento de várias desordens neurológicas, incluindo polineuropatia recidivante crónica, que é um sinónimo de PDIC, mencionada numa longa lista de desordens do sistema nervoso. Contudo, embora o documento Dl contenha uma longa lista de doenças que podem potencialmente ser tratadas por FTY720, não proporciona nenhuns dados concretos de um efeito terapêutico conseguido com FTY720. Os resultados experimentais proporcionados por Dl apenas mostram os efeitos de FTY720 sobre a estimulação da neurogénese, como demonstrado pela proliferação de NSC crescida in vitro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato como definido nas reivindicações, para ser utilizado no tratamento de uma desordem do sistema nervoso periférico, seleccionada entre polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC). 0 modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser utilizado no tratamento de condições auto-imunes que afectam o músculo (e.g. miosite) ou a junção neuromuscular (e.g. miastenia).

Os sintomas de desordens inflamatórias ou auto-imunes do sistema nervoso periférico incluem, por exemplo, dormência ou entorpecimento (tipicamente começando nos dedos dos pés e das mãos), fraqueza dos braços, fraqueza das pernas, perda de reflexos dos tendões profundos (areflexia), fadiga e sensações anormais. Os sintomas de desordens inflamatórias ou auto-imunes do músculo incluem, por exemplo, fraqueza muscular, atrofia muscular, dor muscular, fadiga geral e disfagia (dificuldade em engolir). Os sintomas de desordens

inflamatórias ou auto-imunes da junção neuromuscular incluem, por exemplo, fraqueza muscular, ptose assimétrica (uma queda de uma ou de ambas as pálpebras), diplopia (visão dupla) devido a fraqueza dos músculos que controlam os movimentos oculares, marcha instável ou cambaleante, fraqueza nos braços, mãos, dedos, pernas e pescoço, uma alteração na expressão facial, disfagia (dificuldade em engolir), falta de ar e disartria (perturbação da fala). Um ou mais destes sintomas podem ser aliviados pela composição da presente invenção. A 3 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ frase "alívio de um sintoma de uma desordem inflamatória do sistema nervoso periférico" significa que o sintoma é tornado menos grave ou mais suportável. O modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato é FTY720, FTY720-P, AAL(R) ou AFD(R). Em alguns aspectos, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato é um infra-regulador de um receptor de esfingosina-l-fosfato. Em outros aspectos da invenção, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato é um agonista de um receptor de esfingosina-l-fosfato. O receptor de esfingosina-l-fosfato pode ser, por exemplo, um receptor S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, e/ou S1P5. 0 modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser administrado ao indivíduo antes do início dos sintomas da desordem auto-imune do sistema nervoso periférico, ou pode ser administrado ao indivíduo após o início dos sintomas da desordem auto-imune do sistema nervoso periférico. Em determinados aspectos da invenção, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato destina-se a ser administrado ao indivíduo durante a remissão dos sintomas da desordem auto-imune do sistema nervoso periférico. Em determinadas concretizações da invenção, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato destina-se a ser administrado ao indivíduo antes e após o início dos sintomas da desordem auto-imune. O modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser administrado por qualquer via conhecida das pessoas da especialidade. Em determinadas concretizações, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato é administrado oralmente ou por injecção. Para administração oral, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser proporcionado em qualquer composição farmacêutica adequada para administração oral, tal como sob a forma líquida, em cápsula ou comprimido. Para injecção, o modulador de receptores de esfingosina-1-fosfato pode ser proporcionado em qualquer composição farmacêutica adequada para injecção, tal como num líquido aplicável por seringa. A injecção pode ser, por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intramuscular ou subcutânea. 0 modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser administrado numa base diária, duas vezes por dia ou três 4 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ vezes por dia. O modulador de receptores de esfingosina-1-fosfato pode ser administrado com intervalos de cerca de 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas ou 72 horas. Em determinados aspectos da invenção, a dosagem diária do modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato administrada a um indivíduo humano está entre cerca de 0,1 mg e 2 0 mg, 0,5 mg e 10 mg, 0,5 mg e 5 mg, 1 mg e 5 mg, 1,2 5 mg e 5 mg, 1,5 mg e 3 mg, 0,1 mg e 1 mg, ou qualquer gama destas derivável. Em alguns aspectos da invenção, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser administrado dia sim, dia não, de três em três dias, de quatro em quatro dias, de cinco em cinco dias, semanalmente ou mensalmente. O médico responsável pela administração de uma composição da presente invenção será capaz de determinar a quantidade de dosagem, a via de administração e a frequência de administração apropriadas por avaliação de factores físicos e fisiológicos do indivíduo tais como o peso corporal, o género, a gravidade da condição e intervenções terapêuticas anteriores ou simultâneas.

Está também contemplado que o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato possa ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico. Por exemplo, o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato pode ser administrado em combinação com um imunossupressor (e.g., ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, ABT-281, ASM981, rapamicina, 40-0-(2-hidroxi)etil-rapamicina, corticosteróides. ciclofosfamida, azatioprina, metotrexato, leflunomida, mizoribina, micofenolato de mofetilo, ou 15-desoxi-espergualina) , um esteróide (e.g., prednisona ou hidrocortisona) , uma imunoglobulina, ou interferão do tipo 1. O modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato e o segundo agente podem ser administrados simultaneamente ou consecutivamente. Quando o modulador de receptores de esfingosina-l-fosfato e o segundo agente são administrados simultaneamente, podem ser formulados numa única composição ou em composições separadas. A utilização do termo "ou" nas reivindicações é utilizado para significar "e/ou" a menos que explicitamente indicado que se refere apenas a alternativas ou que as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere a apenas alternativas e "e/ou." 5 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ

Em todo este pedido, o termo "cerca de" é utilizado para indicar que um valor inclui o desvio padrão do erro para o dispositivo ou método que estão a ser empregues para determinar o valor.

Seguindo a legislação sobre patentes de longa data, as palavras "um" e "uma", quando utilizadas em conjunto com a palavra "compreendendo" nas reivindicações ou na descrição, denotam um ou mais, a menos que especificamente indicado.

Outros objectos, caracteristicas e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras que se seguem fazem parte do presente fascículo e são incluídas para adicionalmente demonstrar determinados aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida por referência a uma ou mais destas figuras em combinação com a descrição detalhada de concretizações específicas aqui apresentadas. FIG.l. Estruturas químicas de FTY720 e compostos relacionados. A FIG. 1 proporciona as estruturas químicas de esfingosina, esfingosina-l-fosfato, FTY720, FTY720-P, AAL(R), e AFD(R).

FIG. 2. Potenciais de acção muscular compostos (PAMC). A FIG. 2 proporciona exemplos de PAMC a partir da estimulação do nervo ciático em ratinhos NOD de tipo selvagem e B7-2_/~. FIG. 3. Preparações de fibras microdissectadas ("teased-fibers preparations") de nervos ciáticos. Preparações de fibras microdissectadas apresentaram desmielinização segmentar e internódulos encurtados com espessura irregular de bainhas de mielina em ratinhos NOD B7-2_/_ em comparação com ratinhos NOD de tipo selvagem. Os nódulos de Ranvier estão indicados com setas. 6 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ FIG.4. Acumulação de ceramida induzida por citoquinas em células de Schwann (SC). O TNF-α e o IFN-γ actuaram sinergicamente para diminuir a viabilidade celular através da indução de NOS e acumulação de ceramida em SC imortalizadas. A FIG. 4 mostra os níveis de ceramida como uma percentagem dos controlos em SC induzidas com TNF-a (100 g/ml) + IFN-γ (200 U/ml), L-NAME (inibidor de NOS) ou TNF-a (100 g/ml) + IFN-γ (200 U/ml) + L-NAME. A indução de citoquinas foi durante 24 horas. O asterisco (*) indica p<0,0001. FIG. 5A e 5B. Efeito de FTY720 nas pontuações clinicas e força de preensão de ratinhos NOD deficientes em B7-2. Os animais foram divididos em 3 grupos: (1) água (n = 11); (2) FTY720 a 0,3 mg/kg (n =5); e (3) FTY720 a 1,0 mg/kg (n = 10). 0 tratamento diário foi iniciado aos 7 meses de idade e continuou durante 4 semanas. A FIG. 5A mostra as pontuações clínicas para ratinhos NOD deficientes em B7-2 aos 7 meses (pré-tratamento) e aos 8 meses (pós-tratamento) para ratinhos a que foi administrado veículo (água), FTY720 a 0,3 mg/kg ou FTY720 a 1,0 mg/kg. O asterisco (*) indica p <0, 0007 . Em contraste, as pontuações clínicas de ratinhos tratados com FTY720 (1 mg/kg) não pioraram. No final das 4 semanas de tratamento, mediu-se a força de preensão dos membros anteriores e dos membros posteriores com um medidor da força de preensão (Columbus Instruments). A FIG. 5B mostra os resultados das medições da força de preensão dos membros anteriores e dos membros posteriores para ratinhos a que foi administrado veículo (água), FTY720 a 0,3 mg/kg, ou FTY720 a 1.0 mg/kg. O asterisco (*) indica p <0,01. As barras de erro representam o EPM. FIG. 6A e 6B. Efeito de FTY720 na latência distai, velocidade de condução e amplitude de potenciais de acção muscular compostos ciáticos em ratinhos NOD deficientes em B7-2. Realizaram-se estudos electrofisiológicos para avaliar a função do nervo ciático em ratinhos tratados com FTY720 a

1.0 mg/kg ou com veículo (água). Avaliaram-se a latência distai (LD), a velocidade de condução (VC) e os potenciais de acção muscular compostos (PAMC) ciáticos. Esta figura ilustra que os ratinhos tratados com FTY720 a 1,0 mg/kg demonstraram LD e VC melhorados em comparação com ratinhos tratados com veículo, mas não demonstram amplitude melhorada dos PAMC 7 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ ciáticos. A FIG. 6A mostra exemplos de PAMC ciáticos. A FIG. 6B mostra um sumário dos dados recolhidos de 12 nervos de ratinhos tratados com veiculo e 14 nervos de ratinhos tratados com FTY720 a 1,0 mg/kg. O asterisco (*) indica p <0,02; o asterisco duplo (**) indica p <0,01. FIG. 7. Efeito de FTY720 sobre a infiltração de células inflamatórias em secções de nervo ciático de ratinhos NOD deficientes em B7-2. Realizou-se a avaliação histológica em ratinhos NOD deficientes em B7-2 tratados com veiculo (água, n = 6) ou com FTY720 a 1,0 mg/kg (n = 7) . A infiltração de células inflamatórias foi medida através de um método quantitativo e através de um método semi-quantitativo. Esta figura demonstra que a infiltração de células inflamatórias foi diminuída em secções de nervo ciático de ratinhos tratados com FTY720 em comparação com as de ratinhos tratados com veiculo. O asterisco (*) indica p < 0,02. O asterisco duplo (**) indica p < 0,003. FIG. 8. Efeito de FTY720 sobre a desmielinização e perda de fibras mielinizadas em ratinhos NOD deficientes em B7-2.

Analisaram-se secções em Epon de ratinhos NOD deficientes em B7-2 tratados com veículo (água, n = 6) ou com FTY720 a 1,0 mg/kg (n = 7) . A perda de fibras mielinizadas foi medida através de um método quantitativo, e a desmielinização foi medida através de um método semi-quantitativo. Esta figura demonstra que a desmielinização e a perda de fibras mielinizadas foram atenuadas em ratinhos tratados com FTY720 em comparação com ratinhos tratados com veiculo. O asterisco (*) indica p < 0,015.

DESCRIÇÃO DE CONCRETIZAÇÕES ILUSTRATIVAS

A. PATOGÉNESE DE POLINEUROPATIA DESMIELINIZANTE INFLAMATÓRIA CRÓNICA A polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC) é uma doença inflamatória do sistema nervoso periférico (SNP). O decurso da doença pode ser recidivante ou progressivo, e é caracterizado pela presença de desmielinização focal, variado grau de perda axónica e patofisiologia imunomediada. Os infiltrados inflamatórios em 8 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ nervos na PDIC consistem principalmente em células T e macrófagos, sugerindo que a reacção mediada por células T em relação a antigénios de mielina é uma causa provável de danos em tecidos na PDIC. Contudo, o alvos antigénicos de respostas aberrantes de células T permanecem por identificar. Os actuais tratamentos para PDIC incluem corticosteróides tais como prednisona, que podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com fármacos imunossupressores; plasmaferese; e imunoglobulina intravenosa. A fisioterapia pode melhorar a força, a função e a mobilidade musculares, e minimizar a retracção de músculos e tendões e distorções das articulações. A activação completa de células T requer a sinalização através de moléculas co-estimulantes, B7-1 e B7-2, em adição à sinalização especifica de antigénios através de receptores de células T. A apresentação de antigénios na presença de B7-1 provoca a diferenciação de células T num fenótipo Thl com expressão de interleucina-2, IFN-γ e TNF-α, enquanto a apresentação em associação com B7-2 induz um fenótipo Th2 com expressão predominante de IL-4 (Karandikar et al., 1998; Kuchroo et al., 1995). Consistentemente com o conceito anterior, há uma supra-regulação preferencial de B7-1 em nervos na PDIC (Kiefer et al., 2000). Estudos em ratinhos knockout de CD28 revelam que o CD28 é necessário para o desenvolvimento de neurite alérgica experimental (NAE), um modelo animal para a síndrome de Guillain-Barré (SGB) (Zhu et al., 2001b). Em ratinhos NOD, a diabetes pode ser prevenida por tratamento com anticorpo anti-B7-2 ou por eliminação da expressão de B7-2, mas estas manipulações desencadeiam uma polineuropatia auto-imune espontânea (PAE), que imita uma PDIC clinicamente, histologicamente e electrofisiologicamente (Salomon et al., 2001). O decurso progressivo deste modelo é distinto daquele na NAE, que é usualmente monofásico com recuperação espontânea com apenas algumas excepções. Na NAE, os animais são imunizados com proteínas de mielina periférica ou de mielina purificada tais como P0, P2, PMP22 ou MAG (Constantinescu et al., 1996; Kim et al., 1994; Stoll et al., 1993; Zhu et al., 2001 b).

Os linfócitos activados migram através da barreira sangue-nervo (BSN), o que depende da interacção entre moléculas em linfócitos e moléculas de adesão em células 9 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ endoteliais. Uma vez que haja ampla infiltração mononuclear, pode ocorrer lesão dos nervos periféricos e desmielinização por múltiplos mecanismos. Para além de elaborar compostos citotóxicos e citoquinas como TNF-α, os macrófagos podem penetrar bainhas de mielina aparentemente intactas e retirar a mielina da superfície axónica (Prineas e McLeod, 1976). As citoquinas Thl tais como TNF-α e IFN-γ actuam sinergicamente para diminuir a viabilidade de células de Schwann (SC) através da indução de iNOS e acumulação de ceramida (Nagano et al., 2001). Outros verificaram que estas citoquinas inibem a proliferação de SC e infra-regulam a expressão de glicoproteina associada a mielina (Chandross et al., 1996;

Schneider-Schaulies et al., 1991).

As células de Schwann desempenham um papel multifuncional em neuropatias inflamatórias, actuando como células apresentadoras de antigénio, alvos de ataque imunitário, assim como uma fonte de factores neurotróficos. Estas células expressam receptores S1P2 e S1P3; este último é supra-regulado por uma forscolina activadora de adenilato-ciclase (Bermingham et ai., 2001; Weiner et ai., 2001). Os agentes que elevam o AMPc são protectores contra NAE e diminuem a susceptibilidade das SC à morte celular induzida por citoquinas (Kim et al., 1994; Nagano et al.,2001). O efeito protector do AMPc pode ser mediado em parte pela regulação da expressão de receptores de S1P nas SC, e a sinalização de esfingolipidos pode desempenhar um importante papel na sobrevivência e diferenciação das SC. Os factores que conduzem à terminação versus persistência da resposta imunitária não são completamente entendidos. Células de Schwann que expressam FasL podem contribuir para a eliminação de células T auto-reactivas (Wohlleben et al., 2000). A remissão está geralmente associada à produção aumentada de IL-4, IL-10 e TGF-β.

B. SINALIZAÇÃO DE ESFINGOLÍPIDOS EM LINFÓCITOS E CÉLULAS

GLIAIS

Em muitos tipos de células, mostrou-se que factores de crescimento e citoquinas modulam a actividade de enzimas envolvidas no controlo do denominado reóstato ceramida/SlP, um determinante critico do desenlace celular (Cuvillier et al., 1996; Spiegel e Milstien, 2003). Citoquinas pró-inflamatórias 10 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ tais como TNF-α e interleucina-1 activam a esfingomielinase, mas não a ceramidase, resultando a acumulação de ceramida, enquanto PDGF e FGF supra-regulam a ceramidase em adição à esfingomielinase, conduzindo a uma diminuição na ceramida e um aumento na esfingosina, que pode então ser convertida em esfingosina-l-fosfato (S 1 P) (Coroneos et al., 1995).

Sabe-se que mastócitos, monócitos e plaquetas activadas segregam S1P, resultando concentrações até μΜ no plasma (Murata et al., 2000; Spiegel e Milstien, 1995). Portanto, o S1P pode potencialmente funcionar quer como mensageiro intracelular quer como ligando extracelular para receptores acoplados a proteína G - S1P1-S1P5 (anteriormente denominados Edgl, Edg5, Edg3, Edg6 e Edg8, respectivamente). Os receptores de S1P estão acoplados a uma variedade de proteínas G. Por exemplo, o S1P1 acopla-se a Gi/o e outros membros da família Gi mas não a Gs, Gq, G12 ou G13. A activação de SlPl estimula a fosforilação de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK), inibe a adenilato-ciclase, e activa a fosfolipase C conduzindo a uma resposta proliferativa ou migratória (Windh et al., 1999; Zondag et al., 1998). Em células endoteliais, onde foram primeiro identificados os genes de SlPl e S1P3, o S1P estimula a síntese de ADN e a migração celular e promove a integridade da barreira endotelial (Liuet al., 2001; Schaphorst et al., 2003). Os receptores de S1P são expressos por muitos tipos de células, mas os subtipos de receptores predominantes diferem de um tipo de célula para outro apesar de alguma sobreposição.

Dos receptores de S1P expressos por linfócitos T, predominam os receptores S1P e S1P4, mas a sua expressão é suprimida por activação dependente de TCR. O S1P em baixas concentrações (^0,1 μΜ) elicia a quimiotaxia de células T, enquanto concentrações elevadas são inibidoras (Graeler et al., 2002). Estudos iniciais em transfectantes revelaram que o receptor SlPl é o transdutor de quimiotaxia induzida por S1P, mas estudos subsequentes revelaram que a sobre-expressão de S1P4 em células T Jurkat é suficiente para induzir mobilidade celular na ausência de S1P exógeno (Graler et al., 2003). Estudos in vltro revelam que o S1P inibe a proliferação de células T policlonais, mas não existe consenso relativamente ao seu efeito sobre a secreção de citoquinas. O 11 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ S1P aumenta a secreção de IL-2 e IFN-γ por células T humanas enquanto diminui a secreção de IFN-γ e IL-4 por células T CD4+ murinas sem afectar a IL-2 (Dorsam et al., 2003; Jin et al., 2003). Para além dos linfócitos, os macrófagos e as células dendriticas de ratinho também expressam receptores de S1P (S1P1, S1P2, S1P3 e S1P5). O tratamento de células dendriticas maduras com S1P está associado à emergência de uma resposta imunitária de Th2 (Idzko et al.,2002; Lee et al., 2002). Portanto o resultado liquido da acção de S1P sobre a polarização de uma resposta imunitária (Thl vs Th2) in vivo permanece por clarificar.

Os receptores de S1P são expressos em células gliais. Foi demonstrado que o S1P exógeno activa a cascata de ERK e modula os sinais de Ca2+ em oligodendrócitos (OLG) (Hida et al., 1998). O S1P induz a expressão de factores de crescimento tais como o factor neurotrófico derivado de linhas celulares gliais em astrócitos (Sato et al., 1999; Yamagata et al., 2003). As células da linhagem OLG expressam predominantemente S1P1, S1P5 e possivelmente S1P2, enquanto as células de Schwann expressam receptores S1P2 e S1P3 (Bermingham et al., 2001; Im et al., 2000; McGiffert e Chun; 2002; Terai et al., 2003; Weineret al., 2001). Mostrou-se que o ácido lisofosfatidico, que actua sobre outros receptores Edg, promove a sobrevivência e a diferenciação das SC assim como regula a sua morfologia e adesão (Li et al., 2003; Weiner et al., 2001) .

C. MODULADORES DE RECEPTORES DE ESFINGOSINA-1-FOSFATO

Os receptores de esfingosina-l-fosfato (S1P) estão implicados na regulação do tráfico de linfócitos. Os receptores de S1P são expressos em vários tipos de células envolvidas na patogénese de doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico tais como células gliais, macrófagos, células endoteliais e células de Schwann. A presente invenção proporciona métodos para o tratamento de doenças inflamatórias, tais como doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico, por modulação da actividade dos receptores de S1P em pacientes. 12 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ Ο FTY720 (2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]-1,3- propanodiol) é um agente imunomodulador que se mostrou ser eficaz em modelos de transplante. Actua por sequestro de linfócitos em órgãos linfóides com concomitante linfopenia do sangue periférico e uma diminuição na migração de células T para tecidos alvo (Chiba et al., 1998; Pinschewer et al., 2000; Xie et al., 2003). O FTY720 partilha similaridade estrutural com a esfingosina, o que sugere que actua através de receptores de S1P (Brinkmann et al., 2002; Suzuki et al., 1996). Embora o FTY720, ele próprio, não tenha actividade quimiotáctica para células T, a sua forma fosforilada (FTY720-P) é um potente agonista de receptores de S1P com a excepção de S1P2, como detectado pelo ensaio de ligação a [y35-S]GTPyS em células transfectadas que expressam receptores de S1P individuais (Brinkmann et al., 2002; Mandala et al., 2002). O FTY720 é convertido em FTY720-P extensamente in vivo (Brinkmann et al., 2002). A infra-regulação ou a inactivação da expressão de S1P1 por FTY720 ou pela sua forma fosforilada proporcionam uma explicação para o sequestro de linfócitos, similar ao observado em ratinhos S1P1 null (Matloubian et al., 2004).

Outro modelo proposto é que FTY720 bloqueia a saída de linfócitos através da actividade agonista de S1P1 (Brinkmann et al., 2002; Mandala et al., 2002). Em concentrações >3 μΜ, o FTY720 elicia a apoptose de linfócitos (Matsuda et al., 1998; Oyama et al., 1998). Mostrou-se que FTY720 é eficaz na encefalomielite alérgica experimental (EAE) quando o tratamento é iniciado no dia da imunização com medula espinal bovina ou MBP (Brinkmann et al., 2002; Fujino et al., 2003). O FTY720 está presentemente a ser avaliado para o tratamento de esclerose múltipla (EM), uma desordem inflamatória e neurodegenerativa do sistema nervoso central (SNC) ("FTY720, uma nova medicação oral diária, mostra resultados promissores no tratamento de esclerose múltipla, "Novartls Media Release, [online] obtido da world wide web em novartispharma.at/download/presse/international/FTY720%20-%20ENGLISH%20-%20FINAL.pdf. Acedido em 28 de Junho, 2006) . Contudo, um desenlace bem-sucedido numa desordem do SNC nem sempre se traduz num resultado de sucesso numa desordem do SNP. Por exemplo, o interferão-β (IFN-β) é eficaz a diminuir a frequência de ataques de EM, mas o seu lugar no tratamento de 13 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ PDIC e outras neuropatias inflamatórias permanece controverso. Foi reportada melhoria de pacientes de PDIC que recebem IFN-β em 2 de 4 estudos (Choudhary et al., 1995; Vallat et al., 2003; Kuntzer et al., 1999; Hadden et al., 1999). O AAL(R) é um análogo metilico quiral de FTY720 e o AFD(R) é um éster de fosfato de AAL(R) (Kiuchi et al., 2000) . O AFD(R) actua como um agonista sobre quatro receptores de S1P (S1P1, S1P3, S1P4 e S1P5) (Brinkmann et al., 2002).

Recentemente, foi demonstrado que o AAL(R) induz uma rápida alteração fenotípica em timócitos medulares que resulta na infra-regulação de CD69 em 2 horas (Rosen et al., 2003). Estes resultados indicam que o FTY720 e compostos relacionados exercem acções pleiotrópicas sobre o sistema imunitário. As estruturas de esfingosina, esfingosina-l-fosfato, FTY720, FTY720-P, AAL(R) e AFD(R) são proporcionadas na FIG. 1.

A. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de um ou mais moduladores da actividade de receptores de S1P dissolvidos ou dispersos num transportador farmaceuticamente aceitável. As frases "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reacção adversa, alérgica ou outra reacção inconveniente quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um ser humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um modulador da actividade de receptores de S1P será conhecida dos peritos na especialidade à luz da presente divulgação, e conforme exemplificado por "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Edition, 2005, aqui incorporado por referência. Além disso, para administração humana, entender-se-á que as preparações deverão cumprir padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme requerido pelo Office of Biological Standards da FDA.

Como aqui se utiliza, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, antioxidantes, sais, revestimentos, tensioactivos, conservantes (e.g., p-hidroxibenzoato de metilo ou de propilo, 14 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ ácido sórbico, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de solução (e.g. parafina), absorventes (e.g. argila de caulino, argila de bentonite), estabilizantes de fármacos (e.g. laurilsulfato de sódio), géis, aglutinantes (e.g. xarope, goma-arábica, gelatina, sorbitol, goma adragante, polivinilpirrolidinona, carboximetilcelulose, alginatos), excipientes (e.g. lactose, açúcar lácteo, polietilenoglicol), agentes de desintegração (e.g. ágar-ágar, amido, lactose, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, ácido alginico, sorbitol, glicina), agentes molhantes (e.g. álcool cetílico, monoestearato de glicerol), lubrificantes, aceleradores da absorção (e.g. sais de amónio quaternário), óleos edíveis (e.g. óleo de amêndoa, óleo de coco, ésteres oleosos ou propilenoglicol), agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes corantes, enchimentos, (e.g. amido, lactose, sacarose, glucose, manitol, ácido silícico), lubrificantes de prensagem (e.g. estearato de magnésio, amido, glucose, lactose, flor de arroz, cré), transportadores para inalação (e.g. hidrocarbonetos propulsores), agentes tamponantes, ou materiais deste tipo e suas combinações, como será conhecido de uma pessoa competente na matéria (veja-se, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Edition, 2005). Excepto na medida em que qualquer transportador convencional seja incompatível com o ingrediente activo, a sua utilização nas composições terapêuticas ou farmacêuticas está contemplada.

Em qualquer caso, a composição pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Os exemplos de antioxidantes incluem ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, sulfito de sódio, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, palmitato de ascorbilo, hidroxitolueno butilado, hidroxianisole butilado, lecitina, gaiato de propilo e -tocoferol. Adicionalmente, a prevenção da acção de microorganismos pode ser conseguida com conservantes tais como vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, mas não se lhes limitando, parabenos (e.g., metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou suas combinações.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido, e.g., os que são formados com os grupos amino 15 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ livres de uma composição proteinácea ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos cloridrico, bromidrico ou fosfórico; ou ácidos orgânicos como os ácidos acético, oxálico, tartárico, benzóico, láctico, fosforifico, cítrico, maleaico, fumárico, succínico, napsílico, clavulânico, esteárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, magnésio ou férrico; ou bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína.

Em concretizações onde a composição está numa forma líquida, um transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão compreendendo, mas não se lhes limitando, água, etanol, poliol (e.g., glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido, etc.), lípidos (e.g., triglicéridos, óleos vegetais, lipossomas) e suas combinações. A fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, por utilização de um revestimento, tal como lecitina; pela manutenção de um tamanho de partícula requerido por dispersão em transportadores tais como, por exemplo, poliol ou lípidos líquidos; por utilização de tensioactivos tais como, por exemplo, hidroxipropilcelulose; ou por combinações destes métodos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, tais como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio ou suas combinações. A presente invenção pode ser administrada por qualquer método adequado conhecido de uma pessoa competente na matéria (veja-se, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Edition, 2005). As vias de administração da composição farmacêutica incluem, por exemplo, oral, intradérmica, subcutânea, tópica, por injecção, infusão, infusão contínua, perfusão localizada, banhando directamente células alvo, por via de um cateter, por via de uma lavagem ou através de uma combinação dos anteriores.

Os moduladores da actividade de receptores de S1P quando administrados oralmente podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, saquetas, frascos, pós, grânulos, pastilhas, pós reconstituíveis, ou de preparações líquidas. As soluções 16 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ estéreis injectáveis são preparadas incorporando os compostos activos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes acima enumerados, conforme requerido, seguindo-se esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes activos esterilizados num veiculo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções, suspensões ou emulsões estéreis injectáveis, os métodos de preparação preferidos são as técnicas de secagem em vácuo ou criodessecagem que originam um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um seu meio liquido previamente esterilizado por filtração. O meio liquido deverá ser adequadamente tamponado, se necessário, e o diluente liquido deverá ser primeiro tornado isotónico antes da injecção com suficiente solução salina ou glucose. A preparação de composições altamente concentradas para injecção directa está também contemplada, onde a utilização de DMSO como solvente é considerada para resultar uma penetração extremamente rápida, entregando elevadas concentrações dos agentes activos numa área pequena. A real quantidade de dosagem de uma composição da presente invenção administrada a um paciente pode ser determinada por factores físicos e fisiológicos tais como peso corporal, género, gravidade da condição, o tipo de doença que se está a tratar, intervenções terapêuticas prévias ou simultâneas, idiopatia do paciente, tempo da administração, taxa de excreção do composto particular, e pela via de administração. O médico responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a concentração de ingrediente(s) activo(s) numa composição e a(s) dose(s) apropriada(s) para cada indivíduo.

Em concretizações particulares, a absorção prolongada de uma composição injectável pode ser conseguida por utilização nas composições de agentes retardadores da absorção, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou suas combinações. 17 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ

Ε. EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar as concretizações preferidas da invenção. Os peritos na especialidade deverão entender que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas que o inventor descobriu que funcionam bem na prática da invenção, e podem assim ser consideradas como constituindo modos preferidos para a sua prática. EXEMPLO 1

Polineuropatia auto-imune espontânea (PAE) em ratinho NOD deficiente em B7.2

No decurso de um esforço para examinar o papel de sinais co-estimuladores no ratinho NOD, verificou-se que a eliminação da expressão de B7-2 prevenia o desenvolvimento de hiperglicemia nestes ratinhos. Contudo, estes ratinhos desenvolveram paresia simétrica dos membros posteriores começando às 24 semanas de idade (Salomon et al., 2001) .

Estudos de condução nervosa realizados em nervos ciáticos in vivo revelaram um prolongamento das latências distais, marcado retardamento de velocidades de condução, e dispersão de potenciais de acção muscular compostos (PAMC), como mostrado na FIG. 2. A latência motora distai foi de 1,1 ± 0,1 ms (n=8) em ratinhos NOD wt e de 2,7 ± 0,4 ms em ratinhos NOD B7.2_/~ (p <0,005). A velocidade de condução foi de 50,5 ±3,8 m/s em ratinhos NOD wt, e de 17,9 ± 3,2 m/s em ratinhos NOD B7.2_/~ (p <0,00001). A amplitude do PAMC foi de 10,8 ± 1,5 mV em ratinhos NOD wt e de 3,0 ± 0,6 mV em ratinhos NOD B7.2_/~ (p <0,005). Um bloqueio parcial de condução, definido como 30% de declínio na amplitude com estimulação proximal versus distai, foi observado em alguns, mas não em todos os animais, provavelmente relacionado com o número limitado de nervos estudados. Estes achados electrofisiológicos são clássicos para um processo desmielinizante com perda axónica sobreposta. A avaliação histológica revelou a presença de infiltrados inflamatórios nos gânglios da raiz dorsal (GRD) e nervos ciáticos, mas não no SNC de ratinhos NOD B7-2_/“. Houve uma perda significativa de axónios de grande diâmetro e evidência 18 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ de afinamento de fibras mielinizadas em secções do nervo ciático. A preparação de fibras microssectadas mostrou desmielinização segmentar e encurtamento de internódulos com espessura irregular de bainhas de mielina consistente com reparação de mielina decorrente (FIG. 3). A ocorrência de alguma remielinização aponta para a potencial reversibilidade do processo. A polineuropatia auto-imune espontânea (PAE) foi induzida em ratinhos NOD-SCID por células T CD4+ isoladas de animais afectados, mas não em estudos de transferência passiva utilizando soros de animais afectados. Estes estudos demonstram que o ratinho NOD deficiente em B7-2 constitui o primeiro modelo de uma neuropatia auto-imune espontânea que se assemelha à doença PDIC humana; e que os indivíduos propensos a desordens auto-imunes possuem uma disfunção imunitária que se pode manifestar na forma de entidades de doença distintas dependendo do meio co-estimulador. EXEMPLO 2

Efeito sinérgico de citoquinas pro-inflamatórias sobre co-culturas de SC e gânglios da raiz dorsal (GRD)-SC O TNF-α e o IFN—γ (indicados como citoquinas) actuaram sinergicamente para diminuir a viabilidade celular por via de indução de NOS e acumulação de ceramida em SC imortalizadas (FIG. 4) (Nagano et al., 2001). Nenhuma citoquina sozinha induziu morte celular. Estas citoquinas também exerceram uma acção inibidora sinérgica sobre a mielinização em co-culturas de GRD-SC neonatais, que é evidente após 3 dias de tratamento. Não foi observado nenhum efeito sobre a mielinização com IFN-γ a 50-300 U/ml ou baixas concentrações de TNF-a (10 ng/ml), embora se observasse uma acção inibidora modesta a 100 ng/ml de TNF-α. Observou-se morte celular induzida por citoquinas que afecta as SC e os neurónios em co-culturas tratadas durante 7 dias. EXEMPLO 3

Efeito de FTY720 sobre a gravidade de PAE em ratinhos NOD deficientes em B7-2 19 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ

Mostrou-se que ο FTY720 inibe a emigração de linfócitos a partir de órgãos linfóides, e mostrou-se que a sua forma fosforilada é um potente agonista em quatro receptores de S1P (Brinkmann et al., 2002; Graler e Goetzl, 2004; Matloubian et al., 2004). Estudos recentes sugerem que o efeito destes fármacos in vivo pode ser devido a infra-regulação de receptores de S1P por FTY720 ou pela sua forma fosforilada (Brinkmann et al., 2002; Grater e Goetzl, 2004; Matloubian et al., 2004). A principal consequência destes agentes é o sequestro de linfócitos em órgãos linfóides secundários, embora fosse observada apoptose nas concentrações mais elevadas (Brinkmann et al., 2002; Mandala et al., 2002; Nagahara et al., 2000). A administração oral de FTY720 previne a EAE quando dada no momento da imunização (Brinkmann et al., 2002; Fujino et al., 2003). Contudo, não era anteriormente claro se o FTY720 ou o seu análogo quiral AAL(R) seriam eficazes quando administrados após o inicio da doença.

Dada a sua semelhança com a PDIC, o ratinho NOD deficiente em B7-2 oferece uma oportunidade única para estudar agentes que possam parar a progressão da doença ou melhorar a recuperação em neuropatias auto-imunes. Neste modelo de neuropatia auto-imune espontânea, o inicio dos sintomas ocorreu entre 24 e 28 semanas. Deixados sem tratamento, os ratinhos irão deteriorar-se até ao ponto da tetraparesia em 32 semanas.

Utilizaram-se ratinhos NOD deficientes em B7-2 fêmeas pois estas são mais propensas ao desenvolvimento de PAE do que as suas contrapartidas masculinas (Salomon et al., supra). Os ratinhos tinham 7 meses de idade no início do estudo. Deram-se aos animais FTY720 (solução aquosa) em doses de 0,3 mg/kg ou 1 mg/kg ou veículo sozinho por gavagem oral uma vez por dia durante 1 mês. As concentrações foram escolhidas com base em estudos de resposta à dose em relação à depleção de linfócitos periféricos, e dados de estudos de EAE em ratos (Brinkmann et al., 2002; Fujino et al., 2003).

Para determinar o efeito de FTY720 sobre as pontuações clínicas e a força de preensão de ratinhos NOD deficientes em B7-2, realizou-se a avaliação qualitativa e quantitativa com ocultação para o pessoal do laboratório. Para a avaliação 20 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ qualitativa utilizou-se uma escala nominal (com 0 para normal e 5 para morto) descrita por outros investigadores (Zhu et al., 2001 a) . Para a avaliação quantitativa mediu-se a força dos membros posteriores e dos membros anteriores com um medidor da força de preensão (Columbus Instruments). Os animais tratados durante 1 mês com 1 mg/kg de FTY720 (n=10) exibiram menos fraqueza qualitativamente e quantitativamente maior força de preensão, quando comparados com animais tratados com veiculo (n=ll) ou animais tratados apenas com 0,3 mg/kg de FTY720 (n=5) (FIG. 5A e 5B) . A diferença na pontuação clinica entre ratinhos tratados com água aos 7 meses e aos 8 meses foi estatisticamente significativa, com um valor p inferior a 0,0007 (FIG. 5a). Do mesmo modo, a diferença na pontuação clinica entre ratinhos tratados com 0,3 mg/kg de FTY720 aos 7 meses e aos 8 meses foi estatisticamente significativa, com um valor p inferior a 0,03. Em contraste com os ratinhos tratados com veiculo e com os ratinhos tratados com 0,3 mg/kg de FTY720, as pontuações clínicas de ratinhos tratados com 1,0 mg/kg de FTY720 não aumentaram entre o mês 7 e o mês 8. Foram observados resultados similares quando a força dos membros anteriores e dos membros posteriores foi avaliada quantitativamente. Os ratinhos tratados com 1,0 mg/kg de FTY720 exibiram força de preensão aumentada em comparação com ratinhos tratados com veículo ou com 0,3 mg/kg de FTY720 (FIG. 5B). Estes resultados indicam que o FTY720 pode ser benéfico mesmo quando dado após o início de sintomas. A eficácia de FTY720 foi também monitorada pela indução de linfopenia do sangue periférico. A contagem de linfócitos do sangue periférico foi diminuída para 50-60% dos tratados com veículo, pelo FTY720 (0,3 mg/kg) (n=4) e para 25-30% pelo FTY720 (1 mg/kg) (n=3).

Foram realizados estudos electrofisiológicos para avaliar o efeito de FTY720 sobre a função do nervo ciático in vivo num subconjunto dos animais do estudo. Os ratinhos tratados com 1,0 mg/kg de FTY720 demonstraram latência distai (LD) e velocidade de condução (VC) melhoradas em comparação com ratinhos de controlo tratados com água, mas não demonstraram amplitude melhorada dos potenciais de acção muscular compostos (PAMC) ciáticos (Tabela 1) . A Figura 6 do mesmo modo ilustra 21 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ que ο tratamento com FTY720 melhora a LD e a VC (FIG. 6B, que mostra um sumário dos resultados de experiências realizadas com 12 nervos de 6 ratinhos tratados com água e 14 nervos de 7 ratinhos tratados com FTY720) mas não a amplitude dos PAMC ciáticos (FIG. 6A).

Tabela 1

Veículo FTY720 (1 mg/kg) (* p<0,02; **p<0,01) Latência distai (ms) 2,59 ± 0,3 1,58 ± 0,3* Velocidade de condução (m/s) 14,7 ± 3,0 22,8 ± 3,2** Amplitude (mV) 3,75 ± 1,8 3,8 ± 0,7

Para adicionalmente avaliar o efeito de FTY720 sobre ratinhos NOD deficientes em B7-2, realizou-se a avaliação histológica para determinar a infiltração de células inflamatórias. Utilizando quer o método quantitativo quer o semi-quantitativo, os ratinhos tratados com 1,0 mg/kg de FTY720 (n=7) exibiram infiltração de células inflamatórias diminuída em comparação com ratinhos tratados com água (n=6) (FIG. 7). Estas diferenças observadas foram estatisticamente significativas com um valor p inferior a 0,02 quando comparando ratinhos tratados com água com ratinhos tratados com FTY720 utilizando o método quantitativo e um valor p inferior a 0,003 quando fazendo a comparação utilizando o método semi-quantitativo. Para o método quantitativo, mediram-se as áreas dos tecidos por análise de imagens e contou-se o número de células inflamatórias a uma ampliação de 20x. Calcularam-se as médias dos resultados e expressaram-se como células por mm2 de secção de tecido. Para o método semi-quantitativo, a inflamação foi classificada como: 1, algumas células inflamatórias mononucleares dispersas frequentemente subperineuriais; 2, infiltrado perivenular (cuffing) com células inflamatórias mononucleares (um ou dois foci); 3, infiltrado perivenular (cuffing) multifocal extenso e inflamação endoneurial disseminada. O tratamento com FTY720 também preveniu a desmielinização e a perda de fibras mielinizadas. Secções em Epon foram preparadas a partir de ratinhos tratados com veiculo (n=6) e 22 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ ratinhos tratados com 1,0 mg/kg de FTY720 (n=7). Os ratinhos tratados com FTY720 exibiram uma diminuição na percentagem de perda de fibras mielinizadas e um aumento na desmielinização (FIG. 8). Estas diferenças foram estatisticamente diferentes com um valor p inferior a 0,015. A percentagem de perda de fibras mielinizadas em secções em Epon foi avaliada por um observador em ocultação utilizando uma grelha. A desmielinização foi classificada como se segue: 1, axónios desmielinizados isolados perivasculares ou dispersos; 2, muitos foci de desmielinização perivascular; 3, extensa desmielinização, perivascular e confluente. EXEMPLO 4

Investigação do efeito de FTY720 sobre a permeabilidade da barreira sangue-nervo

Experiências adicionais irão determinar se o FTY720 e compostos relacionados, tais como o agonista de S1P1, SEW2871, podem atenuar a ruptura da barreira sangue-nervo (BSN) quando dados após o inicio da doença. Para investigar o efeito de FTY720 sobre a permeabilidade da BSN, injecta-se azul de Evans (EBA) intravenosamente em ratinhos NOD deficientes em B7-2, 1 hora antes do sacrifício. Os ratinhos tratados com veículo são comparados com ratinhos no dia 1 de tratamento com FTY720 e no dia 3 de tratamento com FTY720. São obtidas imagens confocais de EBA com imagiologia DIC de secções longitudinais do nervo ciático, utilizando condições similares (e.g., mesma lente, potência de laser, dimensão do orifício, etc.). Se a fuga de EBA em tecidos nervosos é atenuada pelo FTY720, este resultado indicará que o efeito terapêutico de FTY720 é mediado pelo menos em parte pelo alívio da ruptura da BSN. Resultados negativos (i.e. ausência de efeito sobre a capacidade de EBA atravessar a BSN) implicarão que a capacidade de FTY720 para diminuir a infiltração inflamatória em secções de nervo ciático em ratinhos com PAE resulta de uma diminuição na migração de linfócitos para os órgãos alvo e não de uma acção predominante sobre os receptores S1P1 e /ou S1P3 expressos por células endoteliais.

Experiências adicionais irão também determinar se, neste modelo de ratinho, a imunorreactividade de esplenócitos 23 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ relativamente a antigénios putativos é alterada pelo FTY720 e compostos relacionados. Os esplenócitos serão isolados de ratinhos com PAE tratados com veiculo, FTY720 ou compostos relacionados com FTY720. A proliferação de esplenócitos é monitorada pela incorporação de timidina (e.g. ensaio de 3H-timidina). A produção de citoquinas em resposta ao péptido da proteina PO (180-199) (10-20 pg/ml), péptido da proteina P2 (57-81) (10-20 yg/ml), mielina do SNP purificada (100 yg/ml), e lisado de SC (100 pg/ml) será também avaliada. Uma diminuição na proliferação de esplenócitos e na produção de citoquinas indicaria que a activação de células T é diminuída em resposta a FTY720 e compostos relacionados. Este resultado indicaria que estes compostos podem actuar em ambas as fases, precoce (sensibilização) e tardia (efectora) da doença. EXEMPLO 5

Investigação do papel de receptores de S1P em células de Schwann (SC)

As SC purificadas de nervos ciáticos de ratos neonatais são tratadas com TNF-a (100 ng/ml) + IFN-γ (200 U/ml) durante 48 a 72 h em condições isentas de soro com ou sem FTY720-P (0,01-1 μΜ). As dosagens de TNF-α e de IFN-γ estabelecidas são baseadas em estudos prévios (Nagano et al., 2001). Para determinar se o FTY720-P pode diminuir a morte de SC, o nível de apoptose celular é ensaiado após coloração nuclear com iodeto de propídio e pelo ensaio com azul de tripano. Se o FTY720-P diminui a morte de SC, utilizam-se métodos de siRNA para determinar que subtipo de receptor de S1P medeia este efeito. Esta abordagem pode também ser empregue para determinar se agonistas de S1P outros que não o FTY720-P, tais como S1P ou SEW2871, podem inibir a morte de SC.

No caso de o FTY720-P ou outros agonistas de receptores de S1P inibirem a morte de SC, são realizadas experiências adicionais para examinar o efeito de FTY720-P e outros agonistas de receptores de S1P sobre a fosforilação de ERK1/2 e Akt, que são moléculas de sinalização ligadas à sobrevivência e proliferação celulares. Se não for observado efeito em ensaios de sobrevivência, proliferação e fosforilação, este resultado implicaria que os receptores de 24 ΕΡ 2 056 807/ΡΤ S1P não são críticos para a sobrevivência, a diferenciação ou a mielinização das SC. Resultados positivos dos estudos anteriores indicariam que os receptores de S1P podem servir como potenciais alvos para agentes glioprotectores.

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Lisboa, 2012-12-06

Claims (6)

1. ΕΡ 2 056 807/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo FTY720, FTY720-P, AAL(R) ou AFD(R) para utilização no tratamento de polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC) num individuo.
2. 2. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a composição se destina a administração ao individuo antes ou após o inicio de sintomas da polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC).
3. 3. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição é adaptada para administração oral.
4. 4. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a composição se destina a administração em combinação com uma quantidade eficaz de um imunossupressor, de um corticosteróide ou de uma imunoglobulina.
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo FTY720, FTY720-P, AAL(R) ou AFD(R) para utilização no alívio de um sintoma de polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC) num indivíduo.
6. 6. Composição farmacêutica compreendendo FTY720, FTY720-P, AAL(R) ou AFD(R) para utilização no prolongamento do tempo até à recidiva de polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC) num indivíduo. Lisboa, 2012-12-06