PT2043662E - Métodos e composições para tratamento de doença - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DOENÇA

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se a métodos ex vivo de obtenção de composições compreendendo células não doentes vivas adequadas para tratar uma doença através da destruição de células doentes num sujeito causando a expressão seletiva de um polipéptido letal em células que expressam pelo menos um gene marcador de doença.

Antecedentes da Invenção 0 cancro é um conjunto de doenças resultantes do crescimento celular descontrolado, que causa dor intratável e morte a mais de 300.000 pessoas por ano somente nos Estados Unidos. Oncogenes são genes que, geralmente falando, promovem o crescimento de células cancerosas. Acredita-se que o desenvolvimento do cancro depende da ativação de oncogenes e da inativação coincidente de genes supressores do crescimento (Park, M., "Oncogenes" em The Genetic Basis of Human Cancer (B. Vogelstein et al., eds.) pp 205-228 (1998)). Os oncogenes são formas mutadas, dominantes de proto-oncogenes celulares que estimulam a proliferação celular, enquanto os genes de supressão tumoral são recessivos e normalmente inibem a proliferação celular. O tratamento de pacientes com cancro com agentes quimioterapêuticos permanece o método primário de tratamento de doença sistémica e existe uma associação direta entre a intensidade da dose quimioterapêutica e a taxa de resposta clinica. Doses crescentes de quimioterapia, no entanto, têm efeitos secundários significativos incluindo a destruição disseminada das células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea com destruição concomitante da celularidade mieloide e linfoide periférica. O transplante de células estaminais é frequentemente utilizado em conjunto com quimioterapia de dose elevada para facilitar a recuperação do sistema hematopoiético após a quimioterapia. 0 transplante de células estaminais alogénicas, que é o transplante de células estaminais a partir de um dador para além do paciente é frequentemente utilizado. 0 protocolo de transplante alogénico, no entanto, implica uma elevada taxa de mortalidade primariamente devido a doença de enxerto versus hospedeiro (GVD), em que as células transplantadas atacam os próprios tecidos do paciente. 0 transplante de células estaminais autólogas é um protocolo em que as células estaminais de paciente são isoladas anteriormente à quimioterapia de dose elevada e subsequentemente reinfundidas. 0 transplante autólogo evita complicações associadas com GVD, mas pode resultar na reinfusão de células tumorais a partir do produto das células estaminais. A reinfusão de células tumorais é importante já que os estudos de marcação génica demonstraram que células tumorais reinfundidas podem contribuir diretamente ao relapso da doença e a um mau resultado clinico. Por exemplo, nos casos de linfoma, leucemia, cancro da mama e neuroblastoma, pelo menos algumas das células tumorais contaminantes num protocolo de transplante de células estaminais de sangue periférico têm a capacidade de crescer clonogenicamente in vitro (Ross, et ai., Blood 82:2605-2610 (1993)) bem como no paciente.

Para evitar a reinfusão de células cancerosas no paciente que está a ser submetido a transplante de células estaminais autólogas, os profissionais médicos tentaram "purgar" células de medula óssea das suas células tumorais contaminantes. Foram desenvolvidas várias abordagens para a purga ex vivo de células tumorais que contaminam populações de células estaminais. Por exemplo, a utilização de anticorpos monoclonais contra antigénios de membrana com fármacos citotóxicos, toxinas, fototerapia e modificadores biológicos ou fármacos citotóxicos pode reduzir a contaminação tumoral em 1 a 3 ordens de magnitude (Seiden, et al., J. Infusional Chemotherapy 6:17-22 (1996)). Noutro protocolo, anticorpos que são orientados em direção às células tumorais são conjugados com radioisótopos e foram utilizados numa tentativa de purgar as células tumorais. A utilização de fármacos citotóxicos e/ou radioatividade podem não ser específicos já que as células tumorais e as células progenitoras exibem frequentemente um fenótipo semelhante de proteínas de superfície celular e a utilização de tais técnicas pode atrasar o enxerto. A seleção de células progenitoras hematopoiéticas CD34+ foi também utilizada para reduzir a reinfusão de células tumorais, embora com uma eficácia de purga muito menor. Novamente, estes métodos de seleção à base de CD34 podem não ser suficientemente específicos já que as células tumorais podem frequentemente exibir o antigénio CD34.

Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de novos métodos que removam especificamente células doentes a partir de uma população de células que é direcionada para transplante autólogo.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a métodos ex vivo de obter células não doentes vivas, as ditas células sendo adequadas para tratar uma doença através da destruição de células doentes num sujeito. Numa forma de realização, os métodos compreendem determinar a atividade de pelo menos um gene marcador de doença dentro de uma população de células obtidas a partir de um sujeito. Uma molécula de polinucleótido que codifica um marcador selecionável e um polipéptido leal é então introduzida nas células, onde a expressão do polipéptido letal é controlada por parte do promotor de pelo menos um dos genes marcadores de doença previamente identificados. Um péptido letal é definido como um polipéptido que é em si mesmo letal para as células. Após a introdução do polinucleótido, as células são expostas a condições de seleção para obter células compreendendo o polinucleótido e, posteriormente, as células são tratadas com condições para induzir a expressão do polipéptido letal para destruir as células que estejam a expressar o(s) gene(s) marcador(es) de doença. Após a destruição das células doentes, as células vivas restantes, que não expressaram o polipéptido letal até um ponto necessário para matar as células, são separadas das células mortas. As células vivas são adequadas para restauro ao sujeito.

Numa forma de realização da invenção, o polinucleótido introduzido nas células é excisado anteriormente ao restauro das células ao sujeito. Noutra forma de realização, o polinucleótido não é excisado a partir das células anteriormente ao restauro das células ao sujeito. Isto permite a destruição das células restauradas in vivo no evento de uma recorrência da doença.

Outra forma de realização da invenção refere-se a métodos de individualização do tratamento de um sujeito com necessidade de tratamento para uma condição anormal, compreendendo determinar a atividade de pelo menos um gene marcador de doença dentro de uma população de células obtidas a partir de um sujeito, isolar pelo menos um promotor do gene marcador de doença e gerar um polinucleótido terapêutico através da ligação direta ou indireta do promotor a um polinucleótido que codifica um polipéptido que é letal para as ditas células e colocá-lo num vetor compreendendo adicionalmente um marcador selecionável. 0 polinucleótido terapêutico é introduzido nas células e as células são expostas a condições de seleção para obter células compreendendo o polinucleótido e posteriormente tratadas com condições para induzir a expressão do polipéptido letal, destruindo como tal células que expressam o gene marcador de doença. As restantes células não doentes vivas são então adequadas para restauro e restauradas ao sujeito. Breve Descrição dos Desenhos A FIGURA 1 ilustra um diagrama de fluxo de trabalho de um processo de tratamento típico utilizando os métodos da presente invenção. Os métodos ilustrados na Figura 1 compreendem a integração, seleção e morte genómicas. As construções podem opcionalmente ser excisadas a partir do genoma. A figura também lista variações não limitantes dos métodos que se encontram dentro do âmbito da presente invenção. Qualquer método de integração genómica (Gl, G2 ou G3) pode ser combinado com qualquer método de seleção (Sl, S2 ou S3) e morte celular (Kl, K2, K3 ou K4). Por sua vez, qualquer método de excisão genómica (El, E2 ou E3) pode também ser eleito, se os componentes que permitiriam a excisão se encontram presentes no genoma. A FIGURA 2 ilustra uma forma de realização dos

polinucleótidos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 2, o programa génico PE3-1 é um gene selecionador/repórter de integração genómica. 0 programa génico PE3-2 é um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão do polipéptido letal, por exemplo, DTA. 0 programa génico PE3-3 é um promotor induzivel, por exemplo, TetO, conduzindo a expressão de uma recombinase, por exemplo, Cre. 0 programa génico PE3-4 é um promotor constitutivo conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. Os programas génicos PE3-ns são genes selecionadores/repórteres negativos que podem ser utilizados para melhorar a eficiência do direcionamento. 0 símbolo de ponta de seta represente sequências reguladoras cis, por exemplo, loxP, que são reconhecidas por parte de uma enzima recombinase, por exemplo, Cre. Os círculos representam regiões na sequência de polinucleótidos que podem compreender um domínio de modificação da cromatina (CMD). GIS-1 e GIS-2 são sítios de integração genómica.

A FIGURA 3 ilustra outra forma de realização dos polinucleótidos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 3, o programa génico PE3-1 é um gene selecionador/repórter de integração genómica. Os programas génicos PE3-2 e PE3-3 são cada um um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão de uma de duas metades de um fator de transcrição Rheo. 0 programa génico PE3-4 é um promotor de Rheo conduzindo a expressão de um polipéptido letal, por exemplo, DTA. 0 promotor de Rheo requer a presença do fator de transcrição Rheo, que é composto por duas subunidades que ligam entre si em presença de ligando. Cada uma das subunidades do fator de transcrição Rheo é expressa nos programas génicos PE3-2 e PE3-3 respetivamente. 0 programa génico PE3-5 é um promotor constitutivo conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. 0 programa génico PE3-6 é um promotor induzível, por exemplo, TetO, conduzindo a expressão de uma recombinase, por exemplo, Cre. Os programas génicos PE3-ns são genes selecionadores/repórteres negativos que podem ser utilizados para melhorar a eficiência do direcionamento. 0 símbolo de ponta de seta represente sequências reguladoras cis, por exemplo, loxP, que são reconhecidas por parte de uma enzima recombinase, por exemplo, Cre. Os círculos representam regiões na sequência de polinucleótidos que podem compreender um domínio de modificação da cromatina (CMD) . GIS-1 e GIS-2 são sítios de integração genómica. A FIGURA 4 ilustra outra forma de realização dos polinucleót idos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 4, o programa génico PE3-1 é um gene selecionador/repórter de integração genómica. 0 programa génico PE3-2 é um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão do polipéptido letal, por exemplo, DTA. 0 programa génico PE3-3 é um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão do polipéptido letal. 0 promotor e o polipéptido letal podem ser idênticos a ou diferentes do promotor e do polipéptido letal do programa génico PE3-2 . 0 programa génico PE3-4 é um promotor constitutivo conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. 0 programa génico PE3-5 é um promotor induzível, por exemplo, TetO, conduzindo a expressão de uma recombinase, por exemplo, Cre. Os programas génicos PE3-ns são genes selecionadores/repórteres negativos que podem ser utilizados para melhorar a eficiência do direcionamento. 0 símbolo de ponta de seta represente sequências reguladoras cis, por exemplo, loxP, que são reconhecidas por parte de uma enzima recombinase, por exemplo, Cre. Os círculos representam regiões na sequência de polinucleótidos que podem compreender um domínio de modificação da cromatina (CMD). GIS-1 e GIS-2 são sítios de integração genómica.

A FIGURA 5 ilustra uma forma de realização dos polinucleótidos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 5, o programa génico PE3-1 é um gene selecionador/repórter de integração genómica. 0 programa génico PE3-2 é um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão do polipéptido letal, por exemplo, DTA. 0 programa génico PE3-3 é um promotor constitutivo conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. 0 programa génico PE3-4 é um promotor induzível, por exemplo, TetO, conduzindo a expressão de uma recombinase, por exemplo, Cre. 0 programa génico PE3-5 é um promotor constitutivo conduzindo a expressão de fatores que promovem a desdiferenciação de células progenitoras. Os programas génicos PE3-ns são genes selecionadores/repórteres negativos que podem ser utilizados para melhorar a eficiência do direcionamento. 0 símbolo de ponta de seta represente sequências reguladoras cis, por exemplo, loxP, que são reconhecidas por parte de uma enzima recombinase, por exemplo, Cre. Os círculos representam regiões na sequência de polinucleótidos que podem compreender um domínio de modificação da cromatina (CMD). GIS-1 e GIS-2 são sítios de integração genómica.

A FIGURA 6 ilustra uma forma de realização dos polinucleótidos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 6, o programa génico PE3-1 é o gene selecionador neo sob o controlo de um promotor constitutivo. 0 programa génico PE3-2 é o promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. 0 programa génico PE3-3 é um promotor induzível, por exemplo, TetO, conduzindo a expressão do polipéptido letal, por exemplo, DTA. Os círculos representam regiões na sequência de polinucleótidos que podem incluir a presença de um Domínio de Modificação da Cromatina (CMD).

A FIGURA 7 ilustra uma forma de realização dos polinucleótidos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 7, o programa génico PE3-1 é um gene selecionador de integração genómica, por exemplo neo, conduzido por parte de um promotor específico de células progenitoras. 0 programa génico PE3-2 é um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. 0 programa génico PE3-3 é um promotor induzível, por exemplo, TetO, conduzindo a expressão do gene destrutivo, por exemplo, DTA. 0 programa génico PE3-4 é um promotor constitutivo conduzindo a expressão de um segundo ADNc indutor, por exemplo, RheoCept®. 0 programa génico PE3-5 é um promotor induzível, por exemplo, RheoSwitch®, conduzindo a expressão de uma recombinase, por exemplo, Cre, para eliminar a construção. Os símbolos de ponta de seta representam uma sequência de regulação cis reconhecida por parte de uma enzima recombinase, por exemplo, sítio loxP. Os círculos representam uma região na sequência de polinucleótidos que podem incluir a presença de um Domínio de Modificação da Cromatina (CMD).

A FIGURA 8 ilustra uma forma de realização dos polinucleótidos terapêuticos da presente invenção. Na FIGURA 8, o programa génico PE3-1 é um gene selecionador de integração genómica conduzido por parte de um promotor de células estaminais. 0 programa génico PE3-2 é um promotor de gene marcador de doença conduzindo a expressão de um ADNc indutor, por exemplo, rTTA. 0 programa génico PE3-3 é um promotor induzível, por exemplo, TetO, conduzindo um substrato à base de enzima à conversão letal de um gene destrutivo, por exemplo, timidina quinase. Os programas génicos PE3-ns são genes selecionadores negativos, por exemplo, um promotor constitutivo conduzindo a expressão da citosina desaminase (CDA) ou difteria (DTA) para melhorar a eficácia do direcionamento. Os círculos representam uma região na sequência de polinucleótidos que podem incluir a presença de um Domínio de Modificação da Cromatina (CMD). GIS-1 e GIS-2 são sítios de integração genómica.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a métodos ex vivo de obtenção de células não doentes vivas adequadas para tratar uma doença através da destruição de células doentes num sujeito. Os métodos compreendem determinar a atividade de pelo menos um gene marcador de doença numa população de células obtidas a partir de um sujeito. Uma molécula de polinucleótido que codifica um polipéptido que é letal para as células é então introduzida nas células, onde a expressão do polipéptido letal é controlada por parte do promotor de pelo menos um dos genes marcadores de doença previamente identificados. Após a introdução do polinucleótido, as células são tratadas com condições para induzir a expressão do polipéptido letal para destruir as células que estejam a expressar o(s) gene(s) marcador (es) de doença. Após a destruição das células doentes, as células vivas restantes, que não expressaram o polipéptido letal até um ponto necessário para matar as células, são separadas das células mortas. As células vivas são então adequadas para restauro ao sujeito.

Numa forma de realização da invenção, o polinucleótido introduzido nas células é excisado anteriormente ao restauro das células ao sujeito. Noutra forma de realização, o polinucleótido não é excisado a partir das células anteriormente ao restauro das células ao sujeito. Isto permite a destruição das células reintroduzidas in vivo no evento de uma recorrência da doença.

Conforme utilizado no presente documento, uma "célula doente" é utilizado para significar uma célula ou células que são anormais tanto no seu metabolismo, como histologia, taxa de crescimento, taxa de mitose ou fenótipo. Conforme utilizado no presente documento, o termo "fenótipo" relativamente a células é utilizado para significar a coleção de proteínas que uma célula de um tecido ou órgão particular expressa normalmente. Por exemplo, os fenótipos de células isoladas individuais pode ser avaliado ou classificado com base na presença ou ausência de marcadores de superfície celular tais como agrupamentos de diferenciação (fatores CD) , que são antigénios de superfície celular. Enquanto o fenótipo de células é geralmente considerado como sendo a coleção de proteínas que a célula expressa ou contém, pode somente ser necessário determinar a presença ou ausência de uma única proteína para classificar adequadamente uma célula numa população ou subpopulação determinada ou avaliar o seu fenótipo. Consequentemente, conforme é utilizado no presente documento, o termo "fenótipo" é utilizado para conotar uma população ou subpopulação particular ao qual pertence uma célula, com base na presença ou ausência de pelo menos uma proteína ou porção da mesma. Por exemplo, formas de realização particulares da presente invenção compreendem isolar células CD34+ que são normalmente encontradas em sangue periférico e medula óssea. Continuando o exemplo, o fenótipo de uma determinada população ou subpopulação de células isoladas podem simplesmente ser estabelecido como CD34 positivo (CD34+) ou CD34 negativo (CD34~) . Naturalmente, os métodos da presente invenção contemplam também determinar a presença ou ausência de mais de uma proteína para classificar uma célula numa população ou subpopulação de células determinada. Exemplos de proteínas CD que podem ser utilizadas para classificar fenótipos celulares incluem, mas não estão limitados a, CD3, CD38, CD59, CD49, CD54, CD61 (recetor de vitronectina), CD71, CD73 (SH3), CD90 (Thy-1), CD105 (SH2), CD117, CD133, CD144 e CD166. Outras proteínas podem também ser utilizadas para determinar o fenótipo de uma determinada célula ou população de células. Exemplos de outras proteínas que podem ser utilizadas para classificar o fenótipo de uma célula incluem, mas não estão limitados a, fatores de transcrição tais como 0CT4, cdx2, e Sox2, proteínas transportadoras tais como transportador ABC placentário (ABC-p), e outros antigénios de superfície celular tais como antigénios associados com sulfato de queratina, TRA-1-60, TRA-1-81, Thy-1 e os antigénios embrionários específicos de estádio (SSEAs), por exemplo, SSEA- 1, SSEA-2, SSEA-3 e SSEA-4. Ainda mais exemplos de proteínas que podem ser utilizadas para classificar o fenótipo de uma célula incluem recetores de fatores de crescimento tais como os recetores para o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento transformante alfa (TGFaa), fator de crescimento transformante beta (TGFbb), activina lia, e proteína morfogénica óssea (BMP), bem como proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), isto é, proteínas do MHC de classe I e classe II. Ainda mais exemplos de marcadores que podem ser utilizados para identificar fenótipos celulares são CK (citoqueratina) 9, CK19, pdx- 1, nestina, Pax-6, Nkx2.2, neurofilamento, Tau, enolase específica de neurónio (NSE), proteína de neurofilamento (NF) , proteína associada a microtúbulo 2 (MAP2), MAP2 quinase, proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e fosfodiesterase nucleotídica cíclica. Adicionalmente, pode também ser possível detetar a presença ou ausência de porções ou domínios de proteínas, e não da proteína inteira, para avaliar ou classificar o fenótipo de uma célula. Por exemplo, algumas proteínas podem conter um domínio de homologia src (SH), tal como SHI, SH2, SH3, SH4, etc., a presença ou ausência do qual pode ser suficiente para avaliar ou classificar adequadamente o fenótipo de uma célula, por exemplo, SH2+ ou SH2~. Conforme divulgado acima, o fenótipo das células pode também ser avaliado ou classificado através da ausência de proteínas particulares . Métodos de identificação de fenótipos celulares incluem, mas não estão limitados a, técnicas de imunohistoquímica padrão utilizando anticorpos específicos de antigénio, tal como, por exemplo, anticorpos anti-CD34. Outros métodos de avaliação ou classificação do fenótipo de uma célula incluem, mas não estão limitados a, técnicas de transferência padrão tais como Western blotting e Northern blotting, e técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) , tais como PCR de transcriptase reversa (RT-PCR). Com efeito, deve ser aparente que métodos indiretos, tais como ensaios medindo ou detetando ARNm, por exemplo, RT-PCR, podem ser utilizados para avaliar ou classificar o fenótipo de uma célula. Ainda outros métodos de avaliação ou classificação de fenótipos das células incluem técnicas de microarranjo e técnicas de citometria de fluxo. Exemplos de técnicas de citometria de fluxo úteis para triar células com base no seu fenótipo são divulgadas em Practical Flow Cytometry, 3a edição, Wiley-Liss, Inc. (1995) .

Uma célula doente pode, por exemplo, ter um fenótipo anormal conforme comparada com outras células tomadas a partir da mesma fonte ou tecido. Por exemplo, as células estaminais hematopoiéticas expressam normalmente CD34 e CD59, mas não expressam CD4, que é expresso normalmente por parte de timócitos, células T-helper macrófagos, células de Langerhans células dendríticas ou granulócitos. Qualquer célula estaminal hematopoiética que expresse CD34, CD59 e CD4 pode, para os propósitos da presente invenção, ser consequentemente considerada como tendo um fenótipo anormal, isto é, a célula é doente. Numa forma de realização, as células compreendem células estaminais hematopoiéticas, onde pelo menos uma porção das células estaminais hematopoiéticas são células doentes.

Outros exemplos de células estaminais incluem, mas não estão limitados a, células estaminais hepáticas, células estaminais mamárias, células estaminais pancreáticas, células estaminais neuronais, células estaminais mesenquimáticas e células estaminais embrionárias não humanas. As células estaminais podem ou não ser pluripotentes. "Células pluripotentes" incluem células e a sua descendência, que podem ser capazes de diferenciar-se em, ou dar origem a, células pluripotentes, multipotentes, oligopotentes e unipotentes. "Células multipotentes" incluem células e a sua descendência, que podem ser capazes de diferenciar-se em, ou dar origem a células progenitoras multipotentes, oligopotentes e unipotentes, e/ou um ou mais tipos de células maduras ou parcialmente maduras, exceto que os tipos de células maduras ou parcialmente maduras derivados a partir de células multipotentes estão limitados e células de um tecido, órgão ou sistema de órgãos particular. Conforme utilizado no presente documento, "células parcialmente maduras" são células que exibem pelo menos uma característica do fenótipo, tal como morfologia ou expressão proteica, de uma célula madura do mesmo órgão ou tecido. Por exemplo, uma célula progenitora hematopoiética multipotente e/ou a sua descendência possuem a capacidade de diferenciar-se em ou dar origem a um ou mais tipos de células oligopotentes, tais como células progenitoras mieloides e células progenitoras linfoides, e também dar origem a outros componentes celulares maduros encontrados normalmente no sangue. "Células oligopotentes" incluem células e a sua descendência cuja capacidade de diferenciar-se em células maduras ou parcialmente maduras se encontra mais restringida que as células multipotentes. As células oligopotentes podem, no entanto, possuir ainda a capacidade de diferenciar-se em células oligopotentes e unipotentes, e/ou um ou mais tipos de células maduras ou parcialmente maduras de um tecido, órgão ou sistema de órgãos determinado. Um exemplo de uma célula oligopotente é uma célula progenitora mieloide, que pode finalmente dar origem a eritrócitos, plaquetas, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e monócitos maduros ou parcialmente maduros. "Células unipotentes" incluem células e a sua descendência que possuem a capacidade de se diferenciar ou dar origem a outras células unipotentes e/ou um tipo de células maduras ou parcialmente maduras. Conforme utilizado no presente documento, o termo "célula progenitora" é utilizado para significar células e a sua descendência que podem diferenciar-se em pelo menos células parcialmente maduras, mas carecem da capacidade de autorrenovação indefinida em cultura. As células progenitoras, conforme utilizado no presente documento, podem ser pluripotentes, multipotentes, oligopotentes ou inclusive unipotentes.

Os métodos da presente invenção são levados a cabo numa população de células obtidas a partir de um sujeito com necessidade de tratamento. Conforme utilizado no presente documento, o termo "sujeito" é utilizado indistintamente com o termo "paciente", e é utilizado para significar um animal, em particular um mamífero, e ainda mais em particular um primata não humano ou humano.

Conforme utilizado no presente documento, quando utilizado relativamente a células, o termo "obter" pretende significa qualquer processo de remoção de células a partir de um sujeito. As células não necessitam ser isoladas ou purificadas ao ser obtidas a partir de um sujeito. As células podem ser obtidas a partir de qualquer fluido corporal de um sujeito (por exemplo, sangue, soro, urina, saliva, fluido espinal cerebral) ou a partir de amostras de tecido de um sujeito (por exemplo, biópsias, aspirados de medula óssea) . Uma vez obtidas, as células desejadas podem então ser isoladas.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "isolado" ou "isolar" ou variantes do mesmo, quando utilizado relativamente a uma célula ou população de células significa que a célula ou população de células foram separadas a partir da maioria das moléculas e/ou materiais circundantes presentes que rodeiam a célula ou células quando a célula ou células estavam associadas com um sistema biológico (por exemplo, medula óssea). A concentração de materiais tais como água, sais, e tampão não são considerados ao determinar se uma célula foi "isolada". Consequentemente, o termo "isolado" não pretende implicar ou indicar uma população purificada de células de um fenótipo particular, nem pretende significar uma população de células totalmente isentas de detritos, células não viáveis ou células de um fenótipo diferente. Os métodos de isolamento das células não devem limitar o âmbito da invenção descrita no presente documento. Por exemplo, as células podem ser isoladas utilizando métodos bem conhecidos, tais como citometria de fluxo ou outros métodos que exploram o fenótipo de uma célula. Métodos adicionais de isolamento de células incluem a utilização de selecionadores positivos ou negativos que as construções terapêuticas podem conter, de tal forma que as células podem ser isoladas anteriormente ou após a introdução do polinucleótido terapêutico nas células. Consequentemente, numa forma de realização, a construção pode compreender um selecionador positivo que pode ser utilizado para "isolar" as células desejadas a partir de outras células que são inicialmente obtidas. Conforme utilizado no presente documento, o termo "purificado", quando utilizado relativamente a uma célula ou população de células significa que a célula ou população de células foram separadas a partir de substancialmente todos os materiais que normalmente rodeiam a célula ou células quando a célula ou células estavam associadas com um sistema biológico. "Purificado" é consequentemente um termo relativo que é baseado numa alteração das condições em termos de células e/ou materiais em proximidade estreita com as células isoladas a ser purificadas. Consequentemente, as células hematopoiéticas isoladas são consideradas como estando purificadas inclusive se pelo menos alguns detritos celulares, células não viáveis, células de um fenótipo diferente ou células ou moléculas tais como proteínas e/ou hidratos de carbono são removidos através de lavagem ou processamento adicional, após o isolamento. 0 termo "purificado" não é utilizado para significar que toda a matéria destinada a ser removida é removida a partir das células a ser purificadas. Consequentemente, alguma quantidade de contaminantes pode estar presente juntamente com as células purificadas.

Numa forma de realização, a atividade de pelo menos um gene marcador de doença é determinada após a obtenção das células. Noutra forma de realização, a atividade de pelo menos um gene marcador de doença é determinada anteriormente à obtenção das células. Consequentemente, a atividade de um ou mais genes marcadores de doença pode ser assumida ou inferida se a doença ou condição anormal no sujeito exibe sintomas típicos ou marcadores de doenças ou condições anormais onde a atividade de um conjunto de genes marcadores de doença tenha sido estabelecida. Conforme utilizado no presente documento, um gene marcador de doença pretende significar um gene cujos níveis de expressão podem ser utilizados para avaliar, diagnosticar ou auxiliar no diagnóstico de uma doença ou condição anormal. Genes marcadores de doença incluem genes que são expressos somente em células doentes e genes que são expressos em células normais mas são expressos em níveis elevados em células doentes. Os exemplos mais bem conhecidos de genes marcadores de doença são os oncogenes, mas os métodos da presente invenção, no entanto, não estão limitados aos oncogenes. Exemplos de tipos de oncogenes incluem, mas não estão limitados a, fatores de crescimento, recetores de fatores de crescimento, proteína quinases, reguladores de morte celular programada e fatores de transcrição. Exemplos específicos de oncogenes incluem, mas não estão limitados a, sis, erb B, erb B-2, ras, abl, myc e bcl-2 e TERT. Exemplos de outros genes marcadores de doença incluem genes de antigénio associado a tumor e outros genes que são sobre expressos em células doentes (por exemplo, MAGE-1, antigénio carcinoembriogénico, tirosinase, antigénio especifico da próstata, antigénio de membrana específico da próstata, p53, MUC-1, MUC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-1, gplOO, GM2, Tn, sTn e antigénio de Thompson-Friedenreich (TF)) .

Uma vez determinados os genes marcadores de doença, os promotores destes genes marcadores de doença são colocados num polinucleótido terapêutico. Conforme utilizado no presente documento, o termo "polinucleótido terapêutico" é utilizado para significar um polinucleótido que é introduzido na população de células para o propósito de destruir as células doentes. Numa forma de realização, o promotor é inserido no polinucleótido de forma a estar operativamente ligado a uma porção do polinucleótido que codifica para um polipéptido que é letal para as células. Desta forma os métodos exploram a atividade anormal da célula doente de tal forma que a célula doente finalmente se destrói a si mesma. Conforme utilizado no presente documento, o termo "operativamente ligado" significa uma ligação funcional entre uma sequência de controlo da expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, ou arranjo de sítios de ligação a fatores de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controlo da expressão dirige a transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência. Noutra forma de realização, o promotor encontra-se indiretamente ligado à expressão do polipéptido letal. Por exemplo, o promotor de marcador de doença pode estar operativamente ligado a um fator de transcrição que ativa um segundo promotor que se encontra operativamente ligado ao polinucleótido codificando o polipéptido letal. 0 termo "promotor" é utilizado no presente documento conforme na técnica. Nomeadamente, o termo "promotor" refere-se a uma região de ADN que permite a ligação de uma ARN polimerase para iniciar a transcrição de uma sequência genética. A sequência de vários marcadores de doença, incluindo a região promotora, é conhecida na técnica e encontra-se disponível em bases de dados públicas, por exemplo, GenBank. Consequentemente, após ser identificado um marcador de doença nas células obtidas ou isoladas, a sequência promotora pode ser prontamente identificada e obtida. Outro aspeto da presente invenção é orientado à identificação de um gene marcador de doença cujo promotor pode ser isolado e colocado num polinucleótido terapêutico. Como tal a identidade do gene marcador de doença, pode não ser crítica para formas de realização específica da presente invenção, contanto que o promotor possa ser isolado e utilizando em configurações ou ambientes subsequentes. A presente invenção inclui consequentemente a utilização de promotores a partir de genes marcadores de doença que ainda não foram identificados. Após ser identificados novos genes marcadores de doença, pode ser uma questão de perícia ou experimentação de rotina determinar as sequências genéticas necessárias para a função de promotor. Com efeito, existem vários protocolos comerciais para auxiliar na determinação da região promotora de genes de interesse. Por meio de exemplo, Ding et al. elucidaram recentemente a sequência de promotor do gene inovador Sprouty4 (Am. J Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 287: L52-L59 (2004); através da eliminação progressiva da sequência flanqueante de 5 ' do gene Sprouty4 humano. De forma breve, após ser determinado o sítio de iniciação da transcrição, foram gerados fragmentos de PCR utilizando iniciadores de PCR padrão para clonar segmentos do segmento flanqueante de 5' de maneira unidirecional. Os segmentos gerados foram clonados num vetor repórter de luciferase e foi medida a atividade luciferase para determinar a região promotora do gene Sprouty4 humano.

Outro exemplo de um protocolo para a aquisição e validação de promotores de genes marcadores de doença inclui as seguintes etapas: (1) adquirir amostras de células/tecidos cancerosos/não cancerosos de tipo tecidual igual/semelhante; (2) isolar ARN ou ARNm total a partir das amostras; (3) levar a cabo análise através de microarranjo diferencial de ARN canceroso e não canceroso; (4) identificar transcritos específicos de cancro candidatos; (5) identificar sequências genómicas associadas com os transcritos específicos de cancro; (6) adquirir ou sintetizar a sequência de ADN a montante e a jusante do sítio de iniciação da transcrição previsto do transcrito específico de cancro; (7) desenhar e produzir vetores repórter de promotor utilizando diferentes comprimentos de ADN a partir da etapa 6; e (8) testar os vetores repórter de promotor em células/tecidos cancerosos/não cancerosos, bem como em células/tecidos não relacionados. A fonte do promotor que é inserido no polinucleótido terapêutico pode ser natural ou sintética, e a fonte do promotor não deve limitar o âmbito da invenção descrita no presente documento. Noutras palavras o promotor pode ser diretamente clonado a partir das células obtidas ou isoladas, ou o promotor pode ter sido previamente clonado a partir de uma fonte diferente, ou o promotor pode ter sido sintetizado.

Numa forma de realização, o promotor encontra-se ligado operativamente a um polinucleótido que codifica para um polipéptido que, quando expresso, é letal para a célula que expressa o polipéptido, devido a que o polipéptido em si mesmo é letal. Conforme utilizado no presente documento, um polipéptido que é letal para células inclui também polipéptidos que induzem a morte celular de qualquer forma, incluindo mas não limitada a necrose, apoptose e citotoxicidade. Exemplos de polipéptidos que podem ser letais para células incluem mas não estão limitados a, genes supressores de tumores indutores de apoptose tais como, mas não limitados a p53, Rb e BRCA-1, toxinas tais como a toxina da difteria (DTA), neurotoxina da Shigella, toxina do botulismo, toxina do tétano, toxina da cólera, CSE-V2 e outras variantes de toxinas proteicas de escorpião para nomear algumas, genes suicidas tais como citosina desaminase e timidina quinase, e genes citotóxicos, por exemplo, fator de necrose tumoral, interferão alfa. A presente invenção não é limitada por parte da identidade da proteína letal, contanto que a proteína seja capaz de ser letal para a célula na qual é expressa.

Noutra forma de realização, o promotor do gene marcador de doença encontra-se indiretamente ligado à expressão do polipéptido letal. Numa forma de realização, o promotor do gene marcador de doença encontra-se ligado operativamente a um polinucleótido que codifica para um fator de transcrição e o polinucleótido codificando para o polipéptido letal encontra-se ligado operativamente a um promotor que é ativado por parte do fator de transcrição. 0 fator de transcrição pode ser um fator de transcrição dependente de ligando que ativa a transcrição somente em presença do ligando, por exemplo, membros da superfamília de recetores de esteroides ativados por parte dos seus respetivos ligando (por exemplo, glucocorticoide, estrogénio, progestina, retinoide, ecdisona, e análogos e miméticos dos mesmos) ou rTTA ativado por tetraciclina. 0 fator de transcrição pode ser um polipéptido de ocorrência natural ou um polipéptido quimérico compreendendo domínios a partir de dois ou mais fatores de transcrição diferentes. Por exemplo, o domínio de ligação ao ligando, domínio de transativação, e domínio de ligação a ADN podem cada um ser obtidos a partir de dois ou três fatores de transcrição diferentes. Numa forma de realização, o fator de transcrição é um que se encontra estritamente regulado por parte do nível de ligando que está presente. Noutra forma de realização, os domínios do fator de transcrição podem ser expressos em polipéptidos separados de tal forma que a ativação da transcrição ocorre somente quando os dois polipéptidos formam dímeros conjuntamente (e o ligando está presente). Um exemplo de um tal sistema são os sistemas de recetor de ecdisona quiméricos descritos no Documento de Patente U.S. N.° 7.091.038, Pedidos de Patente U.S. Publicados N.°s 2002/0110861, 2002/0119521, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457, e 2006/0100416, e Pedidos de Patente Internacionais Publicados N.°s WO 01/70816, WO 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO 02/29075, e WO 2005/108617. Um exemplo de um sistema regulado por agonista de ecdisona não esteroide é o RheoSwitch® Mammalian Inducible Expression System (New England Biolabs, Ipswich, MA).

Para introduzir o polinucleótido terapêutico nas células, pode ser utilizado um vetor, compreendendo o promotor eleito e o polinucleótido codificando o polipéptido letal. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor plasmídico, um vetor de fago de cadeia simples ou dupla, ou um vetor virai de ARN ou ADN de cadeia simples ou dupla. Tais vetores podem ser introduzidos nas células através de técnicas bem conhecidas de introdução de ADN e ARN nas células. Vetores virais podem ser de replicação competente ou de replicação defeituosa. No último caso, a propagação virai geralmente ocorrerá somente em células hospedeiras complementares. Conforme utilizado no presente documento, o termo "célula hospedeira" ou "hospedeiro" é utilizando para significar uma célula da presente invenção que alberga um ou mais polinucleótidos terapêuticos.

Consequentemente, no mínimo, os vetores devem incluir um promotor a partir de um gene marcador de doença e um polinucleótido codificando um polipéptido letal. Outros componentes do vetor podem incluir, mas não estão limitados a, marcadores selecionáveis, domínios de modificação de cromatina, promotores adicionais conduzindo a expressão de outros polipéptidos que podem também estar presentes no vetor, sítios de integração genómica, sítios de recombinação, e eixos de inserção molecular. Os vetores podem compreender qualquer número destes elementos adicionais de tal forma que a construção possa ser ajustada aos objetivos específicos dos métodos de tratamento desejados.

Numa forma de realização da presente invenção, os vetores que são introduzidos nas células compreendem adicionalmente um "gene marcador selecionável" que, quando expresso, indica que a construção terapêutica da presente invenção foi integrada no genoma da célula hospedeira. Desta forma, o gene selecionador pode ser um marcador positivo para a integração genómica. Embora não sendo crítica para formas de realização específica da presente invenção, a presença de um gene marcador selecionável permite que o profissional médico eleja uma população de células vivas onde a construção de vetor tenha sido integrada no genoma das células. Consequentemente, determinadas formas de realização da presente invenção compreendem selecionar células onde o vetor tenha sido integrado com êxito. Conforme utilizado no presente documento, o termo "selecionar" ou variações do mesmo, quando utilizado conjuntamente com células, pretende significar métodos padrão, bem conhecidos de eleição de células com uma constituição ou fenótipo específicos. Métodos típicos incluem, mas não estão limitados a cultura de células em presença de antibióticos, tal como G418, neomicina e ampicilina. Outros exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, genes que conferem resistência a diidrofolato redutase, higromicina, ou ácido micofenólico. Outros métodos de seleção incluem, mas não estão limitados a, um gene marcador selecionável que permite a utilização de timidina quinase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase como agentes de seleção. Células compreendendo uma construção de vetor compreendendo um gene ou genes de resistência a antibiótico seriam então capazes de tolerar o antibiótico em cultura. Igualmente, Células não compreendendo uma construção de vetor compreendendo um gene ou genes de resistência a antibiótico não seriam capazes de tolerar o antibiótico em cultura.

Conforme utilizado no presente documento, um "domínio de modificação de cromatina" (CMD) refere-se a sequências de nucleótidos que interatuam com uma variedade de proteínas associadas com a manutenção e/ou alteração da estrutura da cromatina, tal como, mas não são limitados a, isoladores de ADN. Veja-se Ciavatta, D., et al., Proc. Nat'1 Acad. Sci. E.U.A., 103(26) :9958-9963 (2006) . Exemplos de CMDs incluem, mas não estão limitados a, o isolador de globulina p de galinha e o sitio hipersensível 4 de galinha (cHS4) . A utilização de sequências de CMD diferentes entre um ou mais programas génicos, por exemplo, pode facilitar a utilização das sequências de ADN de CMD diferenciais como "mini braços de homologia" em combinação com várias tecnologias de recombinação por microrganismos ou in vitro para "permutar" programas génicos entre vetores transportadores multigénicos e monogénicos existentes. Outros exemplos de domínios modificadores de cromatina são conhecidos na técnica ou podem ser prontamente identificados.

Vetores particulares para utilização dentro da presente invenção são vetores de expressão que codificam para proteínas ou porções das mesmas. Geralmente, tais vetores compreendem regiões de controlo de atuação em cis eficazes para expressão num hospedeiro ligadas operativamente ao polinucleótido a ser expresso. Fatores de atuação em trans adequados são proporcionados por parte do hospedeiro, proporcionados por parte de um vetor complementar ou proporcionados por parte do próprio vetor após introdução no hospedeiro.

Uma grande variedade de vetores de expressão pode ser utilizada para expressar proteínas. Tais vetores incluem vetores cromossómicos, epissómicos e derivados a partir de vírus, por exemplo, vetores derivados a partir de plasmídeos bacterianos, a partir de bacteriófagos, a partir de epissomas de leveduras, a partir de elementos cromossómicos de leveduras, a partir de vírus tais como vírus adeno-associados, lentivírus, baculovírus, papovavírus, tal como SV40, vírus vaccinia, adenovirus, virus da variola aviária, virus da pseudorraiva e retrovirus, e vetores derivados a partir de combinações dos mesmos, tais como aqueles derivados a partir de elementos genéticos de plasmídeos e bacteriófagos, tais como cosmídeos e fagemídeos. Todos podem ser utilizados para expressão de acordo com este aspeto da presente invenção. Geralmente, qualquer vetor adequado para manter, propagar ou expressar polinucleót idos ou proteínas num hospedeiro pode ser utilizado para expressão a este respeito. A sequência de ADN no vetor de expressão encontra-se ligada operativamente a sequência(s) de controlo da expressão adequada(s) incluindo, por exemplo, um promotor para dirigir a transcrição de ARNm. Representantes de promotores adicionais incluem, mas não estão limitados a, promotores constitutivos e promotores específicos de tecidos ou induzíveis. Exemplos de promotores eucarióticos constitutivos incluem, mas não estão limitados a, promotor do gene da metalotioneína I de ratinho (Hamer et al. , J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)), promotor TK do virus do Herpes (McKnight, Cell 31:355-365 (1982)); promotor precoce de SV40 (Benoist, et al., Nature (London) 290:304-310 (1981)); e promotor do virus vaccinia. Exemplos adicionais dos promotores que podem ser utilizados para conduzir a expressão de uma proteína incluem, mas não estão limitados a, promotores específicos de tecido e outros promotores endógenos para proteínas especificas, tais como o promotor de albumina (hepatócitos), um promotor de pro-insulina (célula beta pancreáticas) e semelhantes. Em geral, as construções de expressão conterão sítios para a transcrição, iniciação e terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação a ribossoma para tradução. A porção codificante dos transcritos maduros expressos por parte das construções pode incluir um AUG de iniciação da tradução ao inicio e um codão de terminação (UAA, UGA or UAG) posicionado adequadamente ao final do polipéptido a ser traduzido.

Adicionalmente, as construções podem conter regiões de controlo que regulam, bem como engendram a expressão. Geralmente, tais regiões operarão através do controlo da transcrição, tais como sítios de ligação repressores e potenciadores, entre outros. O vetor contendo uma sequência de nucleótidos adequada, bem como um promotor adequado, e outras sequências de controlo adequadas, pode ser introduzido numa célula da presente invenção utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas que são adequadas para a expressão de um polipéptido desejado.

Exemplos de vetores eucarióticos incluem, mas não estão limitados a, pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponíveis da Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis da Amersham Pharmacia Biotech; e pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP disponíveis da Clontech. Muitos outros vetores são bem conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

Vetores particularmente úteis, que compreendem eixos de inserção molecular para inserção rápida e remoção de elementos de programas génicos, são descritos no Pedido de Patente Publicado dos Estados Unidos N.° 2004/0185556, Pedido de

Patente dos Estados Unidos N.° 11/233.246 e Pedidos de Patente Internacionais Publicados N. °s WO 2005/040336 e WO 2005/116231. Um exemplo de tais vetores é o UltraVector™ Production System (Intrexon Corp., Blacksburg, VA) . Conforme utilizado no presente documento, um "programa génico" é uma combinação de elementos genéticos compreendendo um promotor (P) , uma sequência de expressão (E) e uma sequência de regulação em 3' (3), de tal forma que "PE3" conforme representado nas figuras é um programa génico. Os elementos dentro do programa génico podem ser facilmente permutados entre eixos moleculares que flanqueiam cada um dos elementos do programa génico . Um eixo molecular, conforme utilizado no presente documento é definido como um polinucleótido compreendendo pelo menos dois sítios de restrição não variáveis raros ou pouco comuns dispostos de forma linear. Numa forma de realização, o eixo molecular compreende pelo menos três sítios de restrição não variáveis raros ou pouco comuns dispostos de forma linear. Tipicamente qualquer eixo molecular não incluiria um sítio de restrição raro ou pouco comum de qualquer outro eixo molecular dentro do mesmo programa génico. Sequências cognatas de mais de 6 nucleótidos sobre as quais atua uma determinada enzima de restrição são referidas como sítios de restrição "raros". Estes são, no entanto, sítios de restrição de 6 pb que ocorrem menos frequentemente do que seria estatisticamente previsto, e estes sítios e as endonucleases que os clivam são referidos como sítios de restrição "pouco comuns" Exemplos de enzimas de restrição tanto raras como pouco comuns incluem, mas não estão limitados a, AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, AflIII, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, e Sse8781 I. O vetor pode também compreender sítios de restrição para um segundo tipo de enzimas de restrição chamadas enzimas de endonuclease de migração dirigida (HE) . As enzimas HE têm sítios de restrição grandes e assimétricos (12-40 pares de bases), e os seus sítios de restrição são de natureza pouco frequente. Por exemplo, a HE conhecida como I-Scel tem um sítio de restrição de 18 pb (5TAGGGATAACAGGGTAAT3' (SEQ ID NO:1)), previsto como ocorrendo somente uma vez por cada 7xl010 pares de bases de sequência aleatória. Esta taxa de ocorrência é equivalente a somente um sitio num genoma que tem 20 vezes o tamanho de um genoma de mamífero. A natureza rara dos sítios de HE aumenta grandemente a probabilidade de que um engenheiro genético pudesse cortar um programa génico sem perturbar a integridade do programa génico se os sítios de HE estivessem incluídos em localizações adequadas num plasmídeo de vetor de clonagem. A seleção de vetores e promotores adequados para expressão numa célula hospedeira é um procedimento bem conhecido, e as técnicas requeridas para a construção de vetores e introdução no hospedeiro, bem como a sua expressão no hospedeiro são competências de rotina na técnica. A introdução da construção nas células pode ser uma transfeção transiente, transfeção estável ou pode ser uma inserção específica de locus do vetor. A transfeção transiente e estável dos vetores na célula hospedeira pode ser realizada através de transfeção por fosfato de cálcio, transfeção mediada por DEAE-dextrano, transfeção mediada por lípidos catiónicos, eletroporação, transdução, infeção ou outros métodos. Tais métodos são descritos em vários manuais de laboratório padrão, tais como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Estas métodos de transfeção estável resultam na inserção aleatória do vetor no genoma da célula. Além disso, o número de cópias e a orientação dos vetores são também, geralmente falando, aleatórios.

Numa forma de realização da invenção, o vetor é inserido num sítio bio-neutro do genoma. Um sítio bio-neutro é um sítio do genoma onde a inserção da construção interfere muito pouco, se alguma, com o funcionamento normal da célula. Os sítios bio-neutros podem ser analisados utilizando bioinformática disponível. Vários sítios bio-neutros são conhecidos na técnica, por exemplo, o locus equivalente a ROSA. Outros sítios bio-neutros podem ser identificados utilizando técnicas de rotina bem conhecidas na técnica. A caracterização do(s) sítio (s) de inserção genómica é levada a cabo utilizando métodos conhecidos na técnica. Para controlar a localização, o número de cópias e/ou a orientação da construção ao introduzir o vetor nas células, podem ser utilizados métodos de inserção específica de locus. Os métodos de inserção específica de locus são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a recombinação homóloga e inserção genómica mediada por recombinase. Naturalmente, se se destinam a ser utilizados métodos de inserção específica de locus nos métodos da presente invenção, os vetores podem compreender elementos que auxiliam nesta inserção específica de locus, tal como, mas não são limitados a, recombinação homóloga. Por exemplo, os vetores podem compreender um, dois, três, quatro ou mais sítios de integração genómica (GISs). Conforme utilizado no presente documento, um "sítio de inserção genómica" é definido como uma porção da sequência do vetor cuja sequência de nucleótidos é idêntica ou quase idêntica a porções do genoma no interior das células que permitem a inserção do vetor no genoma. Em particular, o vetor pode compreender dois sítios de inserção genómica que flanqueiam pelo menos o promotor do gene marcador de doença e o polinucleótido codificando o polipéptido letal. Naturalmente, os GISs podem flanquear elementos adicionais, ou inclusive todos os elementos presentes no vetor.

Noutra forma de realização, a inserção específica de locus pode ser levada a cabo através de inserção génica específica de sítio de recombinase. De forma breve, enzimas de recombinase bacteriana, tais como, mas não limitadas a, PhiC31 integrase podem atuar em sítios de "pseudo" recombinação dentro do genoma humano. Estes sítios de pseudo recombinação podem ser alvos para inserção específica de locus utilizando as recombinases. A inserção génica específica de sítio de recombinase é descrita em Thyagarajan, B. et al. Mol. Cell Biol. 21(12) :3926-34 (2001) . Outros exemplos de recombinases e dos seus sítios respetivos que podem ser utilizados para inserção génica específica de sítio de recombinase incluem, mas não estão limitados a, serina recombinases tais como R4 e TP901-1.

Formas de realização adicionais da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, genotipificar as células. O termo "genotipificar" é utilizado aqui conforme na técnica. Especificamente, formas de realização particulares dos métodos da presente invenção proporcionam genotipagem das células ou antes ou após a indução da morte das células doentes. Além disso, os métodos contemplam genotipificar as células uma ou mais vezes para propósitos de garantia da qualidade. A genotipagem pode ser levada a cabo em qualquer forma que proporcione informação de sequência genética sobre todo ou uma porção do genoma da célula. Por exemplo, a genotipagem pode ser levada a cabo através do isolamento de ADN e subsequente sequenciação, ou pode ser levada a cabo através de métodos de PCR ou análise por restrição ou qualquer combinação dos mesmos. A genotipagem das células de um sujeito pode ser levada a cabo para determinar o perfil genómico de um sujeito. Esta informação pode ser utilizada para determinar se um sujeito tem predisposição a eventos de mutação que tornariam o sujeito mais suscetível à recorrência da doença em gerações subsequentes das células não doentes que foram restauradas ao sujeito. Uma predisposição a eventos de mutação em geral pode ser identificada através da deteção de alterações ou mutações nos genes codificando a síntese de ADN e genes de reparação ou noutros genes relacionados com eventos de mutação no sujeito.

Uma predisposição a um tipo especifico de doença pode ser identificada através da deteção de alterações ou mutações em genes associados com essa doença. 0 conhecimento do genótipo de um sujeito pode ser utilizado para desenhar polinucleótidos terapêuticos adequados para cada sujeito. Por exemplo, se um sujeito tem predisposição a uma doença particular, um promotor especifico da doença particular ou polipéptido letal pode ser mais adequado. Se o sujeito tem predisposição à recorrência de uma doença, será preferível não excisar o polinucleótido terapêutico para que as células doentes possam ser purgadas in vivo num momento posterior se necessário. Noutro exemplo, o genótipo de um sujeito pode ser utilizado para determinar se um sítio de inserção particular no genoma é mais ou menos adequado. 0 desenho de um polinucleótido terapêutico individualizado com base no perfil genómico de um sujeito pode ser baseado em eleições para cada parâmetro do polinucleótido conforme mostrado na Figura 1. Um sistema de vetor no qual as partes são prontamente intercambiáveis, conforme descritos anteriormente, é idealmente adequado para montagem de polinucleótidos terapêuticos específicos de sujeito com base no genótipo do sujeito.

Adicionalmente, formas de realização particulares dos métodos da presente invenção compreendem a excisão do polinucleótido terapêutico. Em geral, os métodos da presente invenção resultarão na introdução dos polinucleótidos terapêuticos em todas ou na maioria das células, independentemente do estado de doença das células. Consequentemente, pode ser desejável remover o(s) polinucleótido(s) terapêutico(s) a partir das células não doentes. Para auxiliar na sua própria excisão a construção pode como tal compreender elementos adicionais tais como sítios de recombinase. Um exemplo de um sítio de recombinase inclui, mas não está limitada a, ao sítio loxP na bem conhecida cre-lox ou os sítios de recombinase associados com as recombinases Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 resolvase, ®C31, TndX,

XerC, e XerD. Outros sítios de recombinase podem ser utilizados, contanto que uma enzima recombinase adequada possa atuar sobre o sítio se recombinase. A construção pode também conter genes codificando para uma ou mais recombinases. A expressão de recombinases pode dar-se sob o controlo de promotores induzíveis de tal forma que a excisão pode ser induzida no momento desejado. 0 polinucleótido terapêutico pode ser excisado a partir das células sobreviventes após as células doentes terem sido destruídas e antes de as células sobreviventes terem sido restauradas ao sujeito. Alternativamente, as células sobreviventes podem ser utilizadas para tratar o sujeito sem excisar o polinucleótido terapêutico. Nesta situação, a expressão do polipéptido letal pode ser induzida in vivo em qualquer momento após as células terem sido restauradas ao sujeito. Isto pode ser utilizado se existir uma recorrência da doença no sujeito. Uma recorrência pode ocorrer por qualquer razão, incluindo predisposição por parte do sujeito a eventos de mutação que levam à recorrência da doença em gerações subsequentes das células não doentes que foram restauradas ao sujeito. A recorrência também pode ocorrer devido à purga incompleta de todas as células doentes anteriormente ao restauro das células ao sujeito. A capacidade de destruir as células doentes in vivo (por exemplo, mantendo o polipéptido letal sob o controlo de um promotor induzível e proporcionando o agente indutor ao sujeito) permite ao sujeito evitar um ciclo de transplante ex vivo adicional e os riscos associados com o ciclo (por exemplo, a irradiação/quimioterapia requerida para eliminar a medula óssea anteriormente ao transplante). Esta forma de realização permite também ao clínico controlar o início, nível, e duração in vivo do polipéptido letal.

Numa forma de realização adicional, o polinucleótido terapêutico pode compreender um gene de quimiorresistência, por exemplo, o gene de resistência multifármaco mdrl. 0 gene de quimiorresistência pode estar sob o controlo de um promotor constitutivo (por exemplo, CMV) ou induzível (por exemplo, RheoSwitch®). Nesta forma de realização, se existir uma recorrência da doença no sujeito, um clinico pode aplicar uma dose mais forte de um agente quimioterapêutico para destruir células doentes enquanto as células restauradas estariam protegidas conta o agente. AO colocar o gene de quimiorresistência sob um promotor induzível, a expressão desnecessária do gene de quimiorresistência pode ser evitada, no entanto continuará disponível em caso de recorrência da doença. Se as próprias células restauradas se tornarem doentes, podem ainda ser destruídas através da indução da expressão do polipéptido letal conforme descrito acima.

Ainda mais formas de realização contemplam a análise e/ou expansão da população de células sobreviventes anteriormente à utilização das células para tratar o sujeito. Por exemplo, as células sobreviventes podem ser genotipifiçadas e/ou fenotipifiçadas, utilizando qualquer dos métodos ou protocolos descritos ou mencionados no presente documento, anteriormente à utilização das células no tratamento do sujeito. A divulgação também descreve kits que podem ser utilizados em conjunto com métodos da invenção. Os kits podem compreender um ou mais recipientes, que podem conter um ou mais componentes selecionados a partir do grupo consistindo em uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos, enzimas de restrição e uma ou mais células compreendendo tais moléculas de ácidos nucleicos. Os kits podem adicionalmente compreender um ou mais recipientes contendo meios de cultura celular adequados para cultivar células da invenção, um ou mais recipientes contendo antibióticos adequados para utilização na cultura de células da invenção, um ou mais recipientes contendo tampões, um ou mais recipientes contendo reagentes de transfeção, e/ou um ou mais recipientes contendo substratos para reações enzimáticas.

Os kits podem conter uma ampla variedade de moléculas de ácido nucleico que podem ser utilizadas com a invenção.

Exemplos de moléculas de ácidos nucleicos que podem ser proporcionadas em kits incluem aquelas que contêm promotores, sequências codificando polipéptidos letais, potenciadores, repressores, marcadores de seleção, sinais de transcrição, sinais de tradução, sítios de hibridação de iniciadores (por exemplo, para sequenciação ou PCR), sítios de recombinação, sítios de restrição e poliligantes, sítios que suprimem a terminação da tradução em presença de um RNAt supressor, sequências codificantes de RNAt supressor, sequências que codificam domínios e/ou regiões, origens de replicação, telómeros, centrómeros, e semelhantes. Moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem compreender qualquer um ou mais destas características adicionalmente a uma sequência de regulação transcripcional conforme descrito acima.

Os kits podem compreender recipientes contendo uma ou mais proteínas de recombinação. Proteínas de recombinação adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 resolvase, ®C31, TndX, XerC, e XerD. Outros sítios de recombinação e proteínas adequados são aqueles associados com a GATEWAY™ Cloning Technology disponível da Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, e descritos na literatura de produto da GATEWAY™ Cloning Technology.

Na utilização, uma molécula de ácido nucleico compreendendo um ou mais promotores de genes marcadores de doença (P) proporcionada num kit da invenção pode ser combinada com um polinucleótido de expressão para um polipéptido letal (E) e uma sequência de regulação em 3' (3) para preparar um programa génico PE3. A molécula de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de regulação em 3o pode ser proporcionada, por exemplo, com um eixo molecular nas terminações 5' e 3' da sequência de regulação em 3'.

Os kits podem também ser proporcionados com iniciadores. Estes iniciadores serão geralmente desenhados para hibridizar com moléculas tendo sequências de nucleótidos específicas. Por exemplo, estes iniciadores podem ser desenhados para utilização em PCR para amplificar uma molécula de ácidos nucleicos particular. Podem também ser proporcionados iniciadores de sequenciação com o kit.

Um ou mais tampões (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, oito, dez, quinze) podem ser proporcionados em kits. Estes tampões podem ser proporcionados a concentrações de trabalho ou podem ser proporcionados em forma concentrada e posteriormente diluídos até às concentrações de trabalho. Estes tampões conterão frequentemente sal, iões metálicos, cofatores, agentes quelantes de iões metálicos, etc. para a potenciação de atividades ou a estabilização ou do próprio tampão ou de moléculas no tampão. Além disso, estes tampões podem ser proporcionados em formas secas ou aquosas. Quando são proporcionados tampões em forma seca, serão geralmente dissolvidos em água anteriormente à utilização.

Os kits podem conter praticamente qualquer combinação dos componentes estabelecidos acima ou descritos noutro ponto do presente documento. Como um perito na especialidade reconheceria, os componentes proporcionados com kits da invenção variarão com a utilização pretendida para os kits. Consequentemente, os kits podem ser desenhados para desempenhar várias funções estabelecidas no presente pedido e os componentes de tais kits variarão en conformidade. A divulgação também se refere a instruções para levar a cabo um ou mais métodos da invenção. Tais instruções podem instruir um utilizador sobre condições adequadas para levar a cabo métodos da invenção. As instruções podem estar em forma tangível, por exemplo, instruções escritas (por exemplo, redigidas em papel), ou podem estar em forma intangível, por exemplo, acessíveis por meio de um disco de computador ou através da internet.

Será reconhecido que um texto completo de instruções para levar a cabo um método da invenção ou, onde as instruções são incluídas com um kit, para utilizar o kit, não necessitam ser proporcionadas. Um exemplo de uma situação na qual um kit da invenção, por exemplo, não conteria tais instruções de comprimento completo é onde as direções proporcionadas informam um utilizador dos kits onde obter instruções para pôr em prática métodos para os quais o kit pode ser utilizado. Consequentemente, as instruções para levar a cabo métodos da invenção podem ser obtidas a partir de páginas web da internet, manuais vendidos ou distribuídos separadamente ou outra literatura de produto, etc. Por exemplo os kits podem dirigir um utilizador de um kit a uma ou mais localizações onde podem ser encontradas instruções não diretamente embaladas e/ou distribuídas com os kits. Tais instruções podem encontrar-se em qualquer forma incluindo, mas não limitada a, formas eletrónicas ou impressas.

Os seguintes exemplos são meramente ilustrativos, mas não limitantes, dos métodos da presente invenção. Outras modificações e adaptações adequadas da variedade de condições e parâmetros normalmente encontrados em sistemas de tratamento médico e expressão génica e que são óbvios para os peritos na especialidade encontram-se dentro do âmbito da invenção. Exemplos Exemplo 1 São obtidas células CD34+ e isoladas a partir do sangue de um paciente com leucemia mieloide. As células isoladas são tratadas ex vivo com uma construção de polinucleótido terapêutico da presente invenção compreendendo um gene de seleção de neomicina (neo) sob o controlo do promotor constitutivo ubíquo de citomegalovirus (CMV), e o transativador induzivel rTTA sob o controlo do promotor TERT. Uma sequência codificadores da toxina da difteria (DTA) encontra-se sob o controlo do promotor induzivel TetO. É então realizada transformação celular sob condições que promovem a integração aleatória da construção terapêutica no genoma. São selecionados transformantes estáveis através da adição de G418. As colónias sobreviventes são então tratadas com tetraciclina ou doxiciclina para ativar a expressão do produto do gene letal de DTA naquelas células em que o promotor TERT conduz a expressão do produto proteico de rTTA. A adição de tetraciclina ou doxiciclina e a expressão de rTTA leva à morte das células doentes em que o promotor TERT se encontra ativo. 0 vetor mostrado na FIGURA 6 é um exemplo de um desenho de vetor que pode ser útil para os métodos do presente exemplo. A caracterização do(s) sítio (s) de inserção genómica é levada a cabo utilizando métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização, as células onde as construções foram inseridas num sítio bio-neutro são cultivadas e expandidas sob condições que proporcionam pressão seletiva nas células compreendendo as construções .

Estas colónias expandidas são fenotipifiçadas para indicar a presença ou ausência de genes marcadores de doença. 0 fenótipo pode também ser avaliado para determinar a capacidade das células de manter a plasticidade de uma célula progenitora conforme avaliado através de biomarcadores de progenitor conhecidos, incluindo mas não limitados a biomarcadores CD34+. As populações celulares que passam esta análise fenotípica final serão então transplantadas ao paciente dador. Anteriormente ao transplante, os pacientes podem ser submetidos à ablação das suas células sanguíneas/medula óssea por meio de metodologias químicas ou radioativas.

Exemplo 2 São obtidas células sanguíneas periféricas e isoladas a partir do sangue de um paciente com cancro de origem celular sanguínea. As células isoladas são tratadas ex vivo com uma construção de polinucleótido terapêutico da presente invenção compreendendo um gene de seleção de neomicina (neo) sob o controlo do promotor da aldeído desidrogenase, e o transativador induzível rTTA sob o controlo do promotor TERT. Uma sequência codificadores da toxina da difteria (DTA) encontra-se sob o controlo do promotor induzível TetO, e um promotor constitutivo de CMV controla a expressão do transativador RheoCept®. Por sua vez, o promotor induzivel RheoSwitch® controla a expressão da recombinase Cre. Sítios loxP flanqueiam cada um dos programas génicos da construção nas terminações 5' e 3' da construção. A transformação celular é realizada sob condições que promovem a integração aleatória do ADN heterólogo no genoma. É adicionado G418 à cultura celular para selecionar transformantes estáveis exibindo um fenótipo celular de progenitor, devido a que o promotor da aldeído desidrogenase é expresso a níveis elevados nas células progenitoras compreendendo a construção. As colónias sobreviventes são então tratadas com tetraciclina ou doxiciclina para ativar a expressão do produto do gene letal de DTA em células em que o promotor TERT conduz a expressão do produto proteico de rTTA. 0 vetor mostrado na FIGURA 7 é um exemplo de um desenho de vetor que pode ser útil para os métodos do presente exemplo. A caracterização do(s) sitio (s) de inserção genómica é levada a cabo utilizando métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização, as células onde as construções foram inseridas num sitio bio-neutro são cultivadas e expandidas sob condições que proporcionam pressão seletiva nas células compreendendo as construções.

Estas colónias expandidas são fenotipifiçadas para indicar a presença ou ausência de genes marcadores de doença. 0 fenótipo pode também ser avaliado para determinar a capacidade das células de manter a plasticidade de uma célula progenitora conforme avaliado através de biomarcadores de progenitor conhecidos, incluindo mas não limitados a CD34+ e aldeído desidrogenase. As populações celulares que passam esta análise fenotípica final serão então transplantadas ao paciente dador. Anteriormente ao transplante, os pacientes podem ser submetidos à ablação das suas células sanguíneas/medula óssea por meio de metodologias químicas ou radioativas. A excisão do vetor pode ser induzida em qualquer momento através da exposição das células a um agonista de recetor de ecdisona para induzir a expressão da recombinase Cre.

Exemplo 3

Para prevenir metástases e reduzir as células cancerosas circulantes, por exemplo, são obtidas células de cancro da mama, num paciente de cancro após cirurgia, células sanguíneas periféricas e isoladas a partir de um paciente que tem ou teve cancro da mama. Estas células isoladas são tratadas ex vivo com uma construção terapêutica compreendendo o gene da citosina desaminase (CDA) sob controlo do promotor da fosfoglicerato quinase (PGK) ubíquo, expresso constitutivamente, e uma porção de ADN que é homóloga ao locus equivalente a ROSA bio-neutro. Na construção, o gene de seleção neo encontra-se sob o controlo do promotor da aldeído desidrogenase, e o transativador induzível rTTA encontra-se sob o controlo do promotor TERT. Adicionalmente, a sequência codificante da timidina quinase (TK) do vírus do herpes simplex (HSV) encontra-se sob o controlo do promotor induzível TetO, e de uma região adicional de ADN homólogo ao locus equivalente a ROSA bio-neutro que se encontra a 3' da primeira região de ADN. Igualmente, o gene da toxina da difteria (DTA) encontra-se sob o controlo do promotor de CMV expresso constitutivamente. A transformação celular é realizada sob condições que promovem inserção específica de locus por meio de recombinação homóloga. São selecionados transformantes estáveis exibindo um fenótipo celular de progenitor através da adição de G418 devido a que o promotor da aldeído desidrogenase é expresso a níveis elevados em células progenitoras.

0 vetor mostrado na FIGURA 8 é um exemplo de um desenho de vetor que pode ser útil para os métodos do presente exemplo. Especificamente, a construção é inserida no genoma no locus equivalente a ROSA bio-neutro. A perda do selecionador de DTA da construção indica que a recombinação homóloga foi exitosa. 0 tratamento com 5-fluorocitosina serve como selecionador negativo para a perda do gene selecionador de CDA. A caracterização do sítio de inserção genómica é levada a cabo utilizando métodos conhecidos na técnica. São selecionadas e expandidas colónias em que as porções da construção internas para as regiões de recombinação homóloga que foram integradas no genoma no locus equivalente a ROSA bio-neutro. Estas células expandidas são então tratadas com tetraciclina ou doxiciclina adicionalmente a ganciclovir. 0 tratamento com tetraciclina ou doxiciclina levará à ativação do promotor TetO em células expressando o gene marcador de doença de eleição, que por sua vez ativará a expressão do produto génico de TK. 0 tratamento com ganciclovir mata seletivamente células expressando timidina quinase a níveis de expressão elevados.

Estas colónias expandidas são fenotipifiçadas para indicar a presença ou ausência de genes marcadores de doença. 0 fenótipo pode também ser avaliado para determinar a capacidade das células de manter a plasticidade de uma célula progenitora conforme avaliado através de biomarcadores de progenitor conhecidos, incluindo mas não limitados a CD34+ e aldeído desidrogenase. As populações celulares que passam esta análise fenotípica final serão então transplantadas ao paciente dador. Anteriormente ao transplante, o paciente pode ser submetido à ablação das suas células sanguíneas/medula óssea por meio de metodologias químicas ou radioativas. Exemplo 4 São obtidas células sanguíneas periféricas e isoladas a partir do sangue de um paciente com cancro de origem celular sanguínea. As células isoladas são tratadas ex vivo com uma construção de polinucleótido terapêutico da presente invenção compreendendo um gene de seleção de neomicina (neo) sob o controlo do promotor da aldeído desidrogenase, e a sequência codificadores da toxina da difteria (DTA) sob o controlo do promotor TERT, A transformação celular é realizada sob condições que promovem a integração aleatória do ADN heterólogo no genoma. É adicionado G418 à cultura celular para selecionar transformantes estáveis exibindo um fenótipo celular de progenitor, devido a que o promotor da aldeído desidrogenase é expresso a níveis elevados nas células progenitoras compreendendo a construção. A caracterização do(s) sítio (s) de inserção genómica é levada a cabo utilizando métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização, as células onde as construções foram inseridas num sítio bio-neutro são cultivadas e expandidas sob condições que proporcionam pressão seletiva nas células compreendendo as construções.

Estas colónias expandidas são fenotipifiçadas para indicar a presença ou ausência de genes marcadores de doença. 0 fenótipo pode também ser avaliado para determinar a capacidade das células de manter a plasticidade de uma célula progenitora conforme avaliado através de biomarcadores de progenitor conhecidos, incluindo mas não limitados a CD34+ e aldeído desidrogenase. As populações celulares que passam esta análise fenotípica final serão então transplantadas ao paciente dador sem excisão do polinucleótido terapêutico. Anteriormente ao transplante, os pacientes podem ser submetidos à ablação das suas células sanguíneas/medula óssea por meio de metodologias químicas ou radioativas.

Após recorrência do cancro celular sanguíneo no paciente, a expressão de DTA a partir do promotor TER será ativada nas células transplantadas e estas células serão destruídas. Exemplo 5 São obtidas células sanguíneas periféricas e isoladas a partir do sangue de um paciente com cancro de origem celular sanguínea. As células isoladas são tratadas ex vivo com uma construção de polinucleótido terapêutico da presente invenção compreendendo um gene de seleção de neomicina (neo) sob o controlo do promotor da aldeído desidrogenase, e o transativador induzível RheoCept® sob o controlo do promotor TERT. Por sua vez, o promotor induzível RheoSwitch® controla a expressão de DTA. A transformação celular é realizada sob condições que promovem a integração aleatória do ADN heterólogo no genoma. É adicionado G418 à cultura celular para selecionar transformantes estáveis exibindo um fenótipo celular de progenitor, devido a que o promotor da aldeído desidrogenase é expresso a níveis elevados nas células progenitoras compreendendo a construção. As colónias sobreviventes são então tratadas com um agonista de RheoCept® para ativar a expressão do produto do gene letal de DTA em células em que o promotor TERT conduz a expressão do produto proteico de RheoCept®. A caracterização do(s) sítio (s) de inserção genómica é levada a cabo utilizando métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização, as células onde as construções foram inseridas num sítio bio-neutro são cultivadas e expandidas sob condições que proporcionam pressão seletiva nas células compreendendo as construções.

Estas colónias expandidas são fenotipifiçadas para indicar a presença ou ausência de genes marcadores de doença. 0 fenótipo pode também ser avaliado para determinar a capacidade das células de manter a plasticidade de uma célula progenitora conforme avaliado através de biomarcadores de progenitor conhecidos, incluindo mas não limitados a CD34+ e aldeído desidrogenase. As populações celulares que passam esta análise fenotípica final serão então transplantadas ao paciente dador sem excisão do polinucleótido terapêutico. Anteriormente ao transplante, os pacientes podem ser submetidos à ablação das suas células sanguíneas/medula óssea por meio de metodologias químicas ou radioativas.

Após recorrência do cancro celular sanguíneo no paciente, é administrado ao paciente um agonista de RheoCept®, induzindo desta forma a expressão do produto génico de DTA em células transplantadas ou na sua descendência em que o promotor TERT conduza a expressão do produto proteico de RheoCept®.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 7091038 B [0027] • US 20020110861 A [0027] • US 20020119521 A [0027] • US 20040033600 A [0027] • US 20040096942 A [0027] • US 20050266457 A [0027] • US 20060100416 A [0027] • WO 0170816 A [0027] • WO 02066612 A [0027] • WO 02066613 A [0027] • WO 02066614 A [0027] • WO 02066615 A [0027] • WO 0229075 A [0027] • WO 2005108617 A [0027] • US 20040185556 A [0038] • US 11233246 B [0038] • WO 2005040336 A [0038] • WO 2005116231 A [0038]

Documentos de não patente citados na descrição • Oncogenes. PARK, M. et al. The Genetic Basis of Human Cancer. 1998, 205-228 [0002] • ROSS et al. Blood, 1993, vol. 82, 2605-2610 [0005] • SEIDEN et al. J. Infusional Chemotherapy, 1996, vol. 6, 17-22 [0006] • Practical Flow Cytometry. Wiley-Liss, Inc, 1995 [0015] • Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 2004, vol. 287, L52-L59 [0023] • CIAVATTA, D. et al. Proc. Nat'1 Acad. Sci. U.S.A., 2006, vol. 103 (26), 9958-9963 [0031] • HAMER et al. J. Mol. Appl. Gen, 1982, vol. 1, 273-288 [0034] • MCKNIGHT. Cell, 1982, vol. 31, 355-365 [0034] • BENOIST et al. Nature (London), 1981, vol. 290, 304-310 [0034] • DAVIS et al. Basic Methods In Molecular Biology, 198 6 [0041] • KEOWN et al. Methods Enzymol., 1990, vol. 185, 527-37 [0041] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0041] • THYAGARAJAN, B. et al. Mol. Cell Biol., 2001, vol. 21 (12), 3926-34 [0043]

Lisboa, 12 de Novembro de 2015

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método ex vivo de obtenção de células não doentes vivas, as ditas células sendo adequadas para tratar uma doença através da destruição de células doentes num sujeito, em que as ditas células são obtidas através de um método compreendendo (a) determinar a atividade de pelo menos um gene marcador de doença dentro de uma população de células obtidas a partir do dito sujeito; (b) introduzir nas ditas células um polinucleótido que codifica um marcador selecionável e um polipéptido que é em si mesmo letal para as ditas células, em que a expressão do dito polipéptido letal é direta ou indiretamente controlada por parte do promotor do dito pelo menos um gene marcador de doença; (c) expor as ditas células a condições de seleção para obter células compreendendo o dito polinucleótido; (d) tratar as ditas células com condições para induzir a expressão do dito polipéptido letal, em que a dita expressão do dito polipéptido letal mata as ditas células que expressam o dito pelo menos um gene marcador de doença; e (e) separar as ditas células mortas a partir das restantes células não doentes vivas, em que as ditas células vivas não expressam o dito polipéptido letal até um ponto suficiente para matar as ditas células não doentes.
2. 2. 0 método da reivindicação 1, em que o dito promotor se encontra operativamente ligado ao dito polinucleótido que codifica o dito polipéptido letal.
3. 3. 0 método da reivindicação 1, em que as ditas células são selecionadas a partir do grupo que consiste em células estaminais hematopoiéticas, células estaminais hepáticas, células estaminais mamárias, células estaminais pancreáticas e células estaminais neuronais.
4. 4. 0 método da reivindicação 3, em que as ditas células são células estaminais hematopoiéticas.
5. 5. 0 método da reivindicação 1, em que a dita introdução do dito polinucleótido compreende a transfeção transiente do dito polinucleótido nas ditas células.
6. 6. 0 método da reivindicação 1, em que a dita introdução do dito polinucleótido compreende a transfeção estável do dito polinucleótido nas ditas células.
7. 7. 0 método da reivindicação 1, em que o dito polinucleót ido compreende pelo menos dois programas génicos.
8. 8. 0 método da reivindicação 1, em que o dito promotor do dito gene marcador de doença se encontra ligado entre um primeiro e um segundo eixo de inserção molecular.
9. 9. 0 método da reivindicação 7, em que o dito polinucleót ido que codifica o dito polipéptido letal se encontra ligado entre um segundo e um terceiro eixo de inserção molecular.
10. 10. O método da reivindicação 8 ou 9, em que os ditos eixos de inserção molecular estão compostos por três ou quatro sítios de restrição raros ou pouco comuns numa disposição contígua, os ditos sítios de restrição raros ou pouco comuns sendo selecionados a partir do grupo que consiste nos sítios de restrição correlacionados com as enzimas de restrição AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, MIu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, FIp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I e Sse878 I.
11. 11. O método da reivindicação 7, em que o polinucleót ido compreende adicionalmente pelo menos um domínio de modificação de cromatina.
12. 12. 0 método da reivindicação 1, em que a dita introdução do dito polinucleótido compreende inserção especifica de locus do dito polinucleótido.
13. 13. 0 método da reivindicação 1, em que o dito polinucleót ido se encontra contido num vetor.
14. 14. 0 método da reivindicação 1, em que o dito vetor é um vetor virai. Lisboa, 12 de Novembro de 2015