MX2009000966A - Metodos y composiciones para tratar una enfermedad. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar a un sujeto, que comprende destruir células enfermas en el sujeto. Los métodos comprenden obtener una población de células del sujeto y determinar la actividad de al menos un gen marcador de enfermedad dentro de la población de las células obtenidas. Se introduce entonces en las células una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido que es letal para las células, en donde la expresión del polipéptido letal se controla mediante el promotor de al menos uno de los genes marcadores de enfermedad previamente identificados. Después de la introducción del polinucleótido, las células se tratan con condiciones para inducir la expresión del polipéptido letal para destruir las células que se encuentran expresando el(los) gen(es) marcador(es) de enfermedad. Después de la destrucción de las células enfermas, las células vivas restantes, que no expresaron el polipéptido letal a un grado necesario para eliminar las células, se separan de las células muertas, y las células vivas se reintegran al sujeto.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA TRATAR UNA ENFERMEDAD ANTECEDENTES DE LA INVENCION Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar a un sujeto, que comprenden destruir las células enfermas en el sujeto al causar la expresión selectiva de un polipéptido letal en las células que expresan al menos un gen marcador de la enfermedad. Antecedentes de la invención El cáncer es un conjunto de enfermedades que resultan del crecimiento celular no controlado, lo cual ocasiona un dolor intratable y la muerte para más de 300,000 personas por año solo en los Estados Unidos. Los oncógenos son genes que, hablando generalmente, promueven el crecimiento de células cancerosas. Se cree que el desarrollo del cáncer depende de la activación de oncógenos y de la coincidente inactivación de los genes supresores del crecimiento (Park, M . , "Oncogenes" en The Genetic Basis of Human Cáncer (La base genética del cáncer humano) (B. Vogelstein et al., eds . ) pp. 205-228 (1998)). Los oncógenos son formas mutadas dominantes de los proto-oncógenos celulares que estimulan la proliferación celular, mientras que los genes supresores de tumor son recesivos y normalmente inhiben la proliferación celular.

El tratamiento . de pacientes de cáncer con agentes quimioterapéuticos sigue siendo el principal método para tratar una enfermedad sistémica y existe una asociación directa entre la intensidad de la dosis quimioterapéutica y la tasa de respuesta clínica. Sin embargo, las dosis incrementadas de quimioterapia tienen efectos secundarios significativos incluyendo la destrucción difundida de las células progenitoras hematopoyéticas de médula ósea con la concomitante destrucción de la celularidad mieloide periférica y linfoide. El transplante de células germinales se utiliza frecuentemente en conjunto con altas dosis de quimioterapia para facilitar la recuperación del sistema hematopoyético después de la quimioterapia. Se utiliza frecuentemente el transplante alogénico de células germinales, que es el transplante de células germinales de un donante diferente al paciente. Sin embargo, el protocolo del transplante alogénico tiene una alta tasa de mortalidad debido principalmente a la enfermedad de injerto contra huésped (GVD) , en donde las células transplantadas atacan los tejidos del propio paciente. El transplante autólogo de células germinales es un protocolo en donde las células germinales del paciente se aislan antes de la alta dosis de quimioterapia y subsecuentemente se reinfunden. El transplante autólogo evita las complicaciones asociadas con GVD, pero puede dar como resultado la reinfusión de células tumorales desde dentro del producto de células germinales. La reinfusión de células tumorales es importante debido a que los estudios de marcado de gen han demostrado que las. células tumorales reinfundidas pueden contribuir directamente a la recaída de la enfermedad y a un bajo resultado clínico. Por ejemplo, en los casos de linfoma, leucemia, cáncer de mama y neuroblastoma, al menos algunas de las células tumorales contaminantes en el protocolo de transplante de células germinales de sangre periférica, tienen la capacidad de crecer ¦ clonogénicamente in vitro (Ross, et al., Blood 82:2605-2610 (1993)) así como . en el paciente. Para evitar reinfundir las células cancerosas en el paciente que experimenta el transplante autólogo de células germinales, los médicos han intentado "purgar" las células de médula ósea de sus células tumorales contaminantes. Se han desarrollado varios procedimientos para la purga ex vivo de las células tumorales que contaminan las poblaciones de células germinales. Por ejemplo, el uso de anticuerpos monoclonales contra antígenos de membrana con fármacos citotóxicos, toxinas, fototerapia y modificadores biológicos o fármacos citotóxicos, puede reducir la contaminación tumoral por de 1 a 3 órdenes de magnitud (Seiden et al., J. Infusional Chemotherapy 6:17-22 (1996), incorporada mediante la referencia) . En otro protocolo, los anticuerpos que se dirigen hacia las células tumorales se conjugan a radioisótopos que se han utilizado en un intento por purgar las células tumorales. El uso de fármacos citotóxicos y/o radiactividad puede no ser especifico dado que las células tumorales y las células progenitoras frecuentemente despliegan un fenotipo similar de proteínas de superficie celular y el uso de tales técnicas puede retrasar el injerto. También se ha utilizado la selección de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ para reducir la reinfusión de células tumorales, aunque en una eficacia de purga mucho más baja. De nuevo, estos métodos de selección en base a CD34 pueden no ser suficientemente específicos dado que las células tumorales despliegan frecuentemente el antígeno CD34. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de nuevos métodos que retiren específicamente las células enfermas de una población de células objetivo para transplante autólogo. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar a un sujeto, que comprenden destruir las ¦ células enfermas en el sujeto. En una modalidad, los métodos comprenden obtener una población de células de un sujeto y determinar la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de la población de las células obtenidas. Una molécula de polinucleótidos que codifica para un marcador selecciónatele y un polipéptido letal se introduce entonces en las células, en donde la expresión del polipéptido letal se controla mediante el promotor de al menos uno de los genes marcadores de la enfermedad previamente identificados. Un péptido letal se define como un polipéptido que es en si mismo letal a las células o que produce un producto que es letal a las células. Después de la' introducción del polinucleótido, las células se exponen a condiciones de selección para obtener células que comprenden el polinucleótido y después las células se tratan con condiciones para inducir la expresión del polipéptido letal para destruir las células que expresan el (los) gen (es) marcador (es) de la enfermedad. Después de la destrucción de las células enfermas, las células vivas restantes, que no expresaron el polipéptido letal en un grado necesario para destruir las células, se separan de las células muertas y las células vivas se reintegran al sujeto. En una modalidad de la invención,, el polinucleótido introducido en las células se extrae antes de reintegrar las células al sujeto. En otra modalidad, el polinucleótido no se extrae de las células antes de reintegrar las células al sujeto. Esto permite la destrucción de las células restauradas in vivo en el advenimiento de una recurrencia de la enfermedad. Otra modalidad de la invención se refiere a métodos para individualizar el tratamiento de un . sujeto que necesita el tratamiento para una condición anormal, que comprenden obtener una población de células de un sujeto, determinar la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de la población de células, aislar al menos un promotor del gen marcador de la enfermedad y generar un polinucleótido terapéutico enlazando directa o indirectamente el promotor a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que es letal para dichas células y colocándolo en un vector que comprende además un marcador seleccionable . El polinucleótido terapéutico se introduce en las células y las células se exponen a condiciones de selección para obtener células que comprenden el polinucleótido y después se trata con condiciones para inducir la expresión del polipéptido letal, destruyendo asi las células que expresan el gen marcador de la enfermedad. Las células vivas .no enfermas restantes se restauran entonces al sujeto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa un diagrama de flujo de funcionamiento de un típico proceso de tratamiento utilizando los métodos de la presente invención. Los métodos representados en la Figura 1 comprenden la integración del genoma, la selección y la destrucción. Las estructuras pueden extraerse opcionalmente del genoma. La figura también lista variaciones no limitantes de los métodos que se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Cualquier método de integración del genoma (Gl, G2 o G3) puede combinarse con cualquier método de selección (SI, S2 o S3) y de destrucción celular (Kl, K2 K3 o K ) . A su vez, también puede elegirse cualquier método de excisión genómica (El, E2 o E3) , si los componentes que permitirían la excisión se encuentran presentes en el genoma. La Figura 2 representa una modalidad de los polinucleótidos terapéuticos de la presente invención. En la Figura 2, el programa genético PE3-1 es de un gen selector/informante de la integración del genoma. El programa genético PE3-2 es un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión del polipéptido letal, e.g., DTA. El programa genético PE3-3 es de un promotor inducible, e.g., TetO, que conduce la expresión de una recombinasa, e.g., Cre . El programa genético PE3-4 es un promotor constitutivo que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. Los programas genéticos PE3-ns son de genes selectores/informantes negativos que pueden utilizarse para mejorar la eficiencia de dirección. El símbolo de punta de flecha representa secuencias cis-reguladoras, e.g., loxP, que se reconocen mediante una enzima recombinasa, e.g., Cre. Los círculos representan regiones en la secuencia de polinucleótido que pueden comprender un dominio de modificación de cromatina (C D) . GIS-1 y GIS-2 son sitios de integración genómica. La Figura 3 representa otra modalidad de los polinucleótidos terapéuticos de la presente invención. En la Figura 3, él programa ' genético PE3-1 es de un gen selector/informante de integración del genoma. Los programas PE3-2 y PE3-3 son cada uno un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión de una o las dos mitades de un factor de transcripción Rheo. El programa genético PE3-4 es un promotor Rheo que conduce la expresión de un polipéptido letal, e.g., DTA. El promotor Rheo requiere la presencia del factor de transcripción Rheo, que se encuentra comprendido de dos subunidades que se enlazan entre si en presencia de un ligando. Cada una de las subunidades del factor de transcripción Rheo se expresa en los programas de gen PE3-2 y PE3-3, respectivamente. El programa genético PE3-5 es un promotor constitutivo que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. El programa genético PE3-6 es un promotor inducible, e.g., TetO, que conduce la expresión de una recombinasa, e.g., Cre. Los programas genéticos PE3-ns son de genes selectores/informantes negativos que pueden utilizarse para mejorar la eficiencia de dirección. El símbolo de punta de flecha representa secuencias cis-reguladoras, e.g., loxP, que se reconocen mediante una enzima recombinasa, e.g., Cre. Los círculos representan regiones en la secuencia de .polinucleótido que pueden comprender un dominio de modificación de cromatina (CMD) . GIS-1 y GIS-2 son sitios de integración genómica. La Figura 4 representa otra modalidad de los polinucleótidos terapéuticos de- la presente invención. En la Figura 4, el programa genético PE3-1 es de un gen selector/informante de integración del genoma. El programa genético PE3-2 es un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión del polipéptido letal, e.g., DTA. El programa genético PE3-3 es de un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión del polipéptido letal. El promotor y el polipéptido letal pueden ser idénticos a o diferentes del promotor y el polipéptido 'letal en el programa genético PE3-2. El programa genético PE3-4 es un promotor constitutivo que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. El programa genético PE3-5 es un promotor inducible, e.g., TetO, que conduce la expresión de una recombinasa, e.g., Cre. Los programas genéticos PE3-ns son de genes selectores/informantes negativos que pueden utilizarse para mejorar la eficiencia de dirección. El símbolo de punta de flecha representa secuencias cis-reguladoras, e.g., loxP, que se reconocen mediante una enzima recombinasa, e.g., Cre. Los círculos representan regiones en la secuencia de polinucleótido que pueden comprender un dominio de modificación de cromatina (CMD) . GIS-1 y GIS-2 son sitios de integración genómica.

La Figura 5 representa una modalidad de los polinucleótidos terapéuticos de la presente invención. En la Figura 5, el programa genético PE3-1 es de un gen selector/informante de integración del genoma. El programa genético PE3-2 es un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión del polipéptido letal, e.g., DTA. El programa genético PE3-3 es de un promotor constitutivo que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. El programa genético PE3-4 es un promotor inducible, e.g., Teto, que conduce la expresión de una recombinasa, e.g., Cre. El programa genético PE3-5 es un promotor constitutivo que conduce la expresión de factores que promueven la des-diferenciación de las células progenitoras . Los programas genéticos PE3-ns son de genes selectores/informantes negativos que pueden utilizarse para mejorar la eficiencia de dirección. El símbolo de punta de flecha representa secuencias cis-reguladoras , e.g., loxP, que se reconocen mediante una enzima recombinasa, e.g., Cre. Los círculos representan regiones en la secuencia de polinucleótido que pueden comprender un dominio de modificación de cromatina (CMD) . GIS-1 y GIS-2 son sitios de integración genómica. La Figura 6 representa una modalidad de los polinucleótidos terapéuticos de la presente invención. En la Figura 6, el programa genético PE3-1 es el gen neo selector bajo el control de un promotor constitutivo. El programa genético PE3-2 es el promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. El programa genético PE3-3 es de un promotor inducible, e.g., TetO, que conduce la expresión del polipéptido letal, e.g., DTA. Los circuios representan regiones en la secuencia de polinucleótido que puede incluir la presencia de un dominio de modificación de cromatina (C D) . La Figura 7 representa una modalidad de los polinucleotidos terapéuticos de la presente invención. En la Figura 7, el programa genético PE3-1 es un selector de integración del genoma, e.g., neo, conducido por un promotor especifico de la célula progenitora. El programa genético PE3-2 es un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. El programa genético PE3-3 es de un promotor inducible, e.g., TetO, que conduce la expresión del gen destructor, e.g., DTA. El programa genético PE3-4 es un promotor constitutivo que conduce la expresión del segundo ADNc inductor, e.g., RheoCept®. El programa genético PE3-5 es un promotor inducible, e.g., RheoSwitch®, que conduce la expresión de una recombinasa, e.g., Cre, para suprimir la estructura. Los símbolos de punta de flecha representan una secuencia cis-reguladora reconocida mediante una enzima recombinasa, e.g., el sitio LoxP. Los circuios representan una región en la secuencia de polinucleótido que puede incluir la presencia de un dominio de modificación de cromatina (C D) . La Figura 8 ' representa una modalidad de los polinucleótidos terapéuticos de la presente invención. En la Figura 8, El programa genético PE3-1 es de un gen selector de integración del genoma conducido por un promotor de la célula germinal. El programa genético PE3-2 es un promotor del gen marcador de la enfermedad que conduce la expresión de un ADNc inductor, e.g., rTTA. El programa genético PE3-3 es de un promotor inducible, e.g., TetO, que conduce un sustrato a base de enzimas para la conversión letal de un gen destrúctivo, e.g., timidina cinasa. Los programas genéticos PE3-ns son de genes selectores negativos, e.g., un promotor constitutivo que conduce la expresión de citosina deaminasa (CDA) o difteria (DTA) para mejorar la eficiencia de dirección. Los circuios representan una región en la secuencia de polinucleótido que puede incluir la presencia de un dominio de modificación de cromatina (CMD) . GIS-1 y GIS-2 son sitios de integración genómica. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar a . un sujeto, que comprenden destruir las células enfermas en el sujeto. Los métodos comprenden obtener una población de células de un sujeto y determinar la ' actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de la población de las células obtenidas. Una molécula de polinucleótidos que codifica para un polipéptido que es letal a las células se introduce entonces en las células, en donde la expresión del polipéptido letal se controla mediante el promotor de al menos uno de los genes marcadores de la enfermedad previamente identificados. Después de la introducción del polinucleótido, las células se tratan con condiciones para inducir la expresión del polipéptido letal para destruir las células que expresan el (los) gen (es) marcador (es) de la enfermedad. Después de la destrucción de las células enfermas, las células vivas restantes, que no expresaron el polipéptido letal en un grado necesario para destruir las células, se separan de las células muertas y las células vivas se reintegran al sujeto. En una modalidad de la invención, el polinucleótido introducido en las células se extrae antes de reintegrar las células al sujeto. En otra modalidad, el polinucleótido no se extrae de las células antes de reintegrar las células al sujeto. Esto permite la destrucción de las células reintroducidas in vivo en el advenimiento de una recurrencia de la enfermedad. Como se utiliza en la presente, una "célula enferma" se utiliza para definir una célula o células que son anormales ya sea en su metabolismo, histología, tasa de crecimiento, tasa mitótica o fenotipo. Como se utiliza en la presente, el término "fenotipo", en relación con las células, se utiliza para definir la colección de proteínas que normalmente expresa una célula a partir de un tejido u órgano particular. Por ejemplo, los fenotipos de células individuales aisladas pueden evaluarse o clasificarse en base a la presencia o ausencia de marcadores de superficie celular tales como las agrupaciones de diferenciación (factores CD) , que son antígenos de superficie celular. Aunque el fenotipo de las células se considera generalmente la colección de proteínas que la célula expresa o contiene, puede ser solamente necesario determinar la presencia o ausencia de una proteína única para clasificar adecuadamente una célula dentro de una población o subpoblación dada para evaluar su fenotipo. Por tanto, como se utiliza en la presente, el término "fenotipo" se utiliza para connotar una población o subpoblación particular a la cual pertenece una célula, en base a la presencia o ausencia de al menos una proteína o porción de la misma. Por ejemplo, las modalidades particulares de la presente invención comprenden aislar células CD34+ que se encuentran normalmente en sangre periférica y médula ósea. Continuando el ejemplo, el fenotipo de una población o subpoblación dada de células aisladas puede declararse simplemente como positivo a CD34 (CD34+) o negativo a CD34 (CDE34-) . Por supuesto, los métodos de la ¦ presente invención contemplan también determinar la presencia o ausencia de más de una proteina para clasificar una célula dentro de una población o subpoblación dada de células. Ejemplos de proteínas CD que pueden utilizarse para clasificar los fenotipos celulares incluyen, pero no se limitan a, CD3, CD38, CD59, CD49, CD54, CD61 (receptor de vitronectina) , CD71, CD73, ( SG3 ) , CD90, (Thy-1), CD105, (SH2), CD117, CD133, CD144 y CD166. También pueden utilizarse otras proteínas para determinar el fenotipo de una célula o población de células dada. Ejemplos de otras proteínas que pueden utilizarse para clasificar un fenotipo de célula incluyen, pero no se limitan a, factores de transcripción tales como 0CT4, cdx2 y Sox2, proteínas transportadoras tales como el transportador ABC de placenta (ABC-p) , y otros antígenos de superficie celular tales como los antígenos asociados con queratina sulfato, TRA-1-60, TRA-1-81, Thy-1 y los antígenos embriónicos específicos de etapa (SSEAs), e.g., SSEA-1, SSEA-2, SSEA-3 y SSEA-4. Aún más ejemplos de las proteínas que pueden utilizarse para clasificar un fenotipo de célula incluyen receptores del factor de crecimiento tales como los receptores para el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor alfa de crecimiento de transformación (TGFalfa) , el factor beta de crecimiento de transformación (TGFbeta) , activin lia, y la proteína morfogénica ósea (BMP) , así como las proteínas principales del complejo de histocompatibilidad (MHC) , i.e., proteínas MHC clase I y clase II. Aún más ejemplos de los marcadores que pueden utilizarse para identificar fenotipos de células son CK (citoqueratina) 9, CK19, pdx-1, nestin, Pax-6, Nkx2.2, neurofilamento, Tau, enolasa específica de neurona (NSE) , proteína de neurofilamento (NF) , proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2), MAP2 cinasa, proteína acídica fibrilar glial (GFAP) y fosfodiesterasa de nucleótido cíclica. Además, también puede ser posible detectar la presencia o ausencia de porciones o dominios de proteínas, y no de la proteína completa, para evaluar o clasificar un fenotipo de célula. Por ejemplo, algunas proteínas pueden contener un dominio de homología src (SH) , tal como SH1, SH2, SH3, SH4, etc., cuya presencia o ausencia puede ser suficiente para evaluar o clasificar adecuadamente un fenotipo de célula, e.g., SH2+ o SH2-. Como se trató anteriormente, el fenotipo de las células también puede evaluarse o clasificarse mediante la ausencia de proteínas particulares . Los métodos para identificar fenotipos de células incluyen, pero no se limitan a, técnicas estándar de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos al antígeno, tales como, por ejemplo, anticuerpos anti-CD34. Otros métodos para evaluar o clasificar el fenotipo de una célula incluyen, pero no se limitan a, técnicas estándar de inmunomanchado tales como inmunomanchado Western o inmunomanchado Northern, y técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) , tales como PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) . En efecto, debe ser aparente que pueden utilizarse métodos indirectos tales como análisis para medir o detectar el ARNm, e.g., RT-PCR, para evaluar o clasificar un fenotipo de célula. Aún otros métodos para evaluar- o clasificar fenotipos de las células incluyen técnicas de micro-disposición y técnicas- de citometria de flujo. Ejemplos de técnicas de citometria de flujo útiles para clasificar células en base a su fenotipo, se describen en Practical Flow Cytometry (Citometria de flujo práctica) , 3a edición, Wiley-Liss, Inc., (1995) que se incorpora en la presente mediante la referencia. Una célula enferma, por ejemplo, puede tener un fenotipo anormal en comparación con otras células tomadas de la misma fuente o tejido. Por ejemplo, las células germinales hematopoyéticas expresan normalmente CD34 y CDE59, pero no expresan CD4, el cual se expresa normalmente por timocitos, células T ayudantes, macrófagos, células Langerhans, células dendriticas o granulocitos . Cualquier célula germinales hematopoyética que expresa CD34, CD59 y CD4, para los propósitos de la presente invención, puede por tanto, considerarse que tiene un fenotipo anormal, i.e., la célula se encuentra enferma. Eh una modalidad, las células comprenden células germinales hematopoyéticas, en donde al menos una porción de las células germinales hematopoyéticas son células enfermas. Otros ejemplos de células germinales incluyen, pero no se limitan a, células germinales de hígado, células germinales mamarias, células germinales pancreáticas, células germinales neuronales, células germinales mesenquimales y células germinales embriónicas. Las células germinales pueden o no ser pluripotentes . Las "células pluripotentes" incluyen las células y su progenie, las cuales pueden ser capaces de diferenciarse en, o dar lugar a, células pluripotentes, multipotentes , oligopotentes y unipotentes. Las "células multipotentes" incluyen las células y su progenie, las cuales pueden ser capaces de diferenciarse en, o dar lugar a células progenitoras multipotentes, oligopotentes y unipotentes y/o uno o más tipos celulares maduros o parcialmente maduros, excepto que los tipos celulares maduros o parcialmente maduros derivados de células multipotentes se limitan a células de un tejido, órgano o sistema de órganos particular. Como se utiliza en la presente, las "células parcialmente maduras" son células que exhiben al menos una característica del fenotipo, tal como la morfología o la expresión de proteínas, de una célula madura del mismo órgano o tejido. Por ejemplo, una célula progenitora hematopoyética multipotente y/o su progenie, poseen la capacidad para diferenciarse en, o dar lugar a, uno o más tipos de células oligopotentes, tales como las células progenitoras mieloides y las células progenitoras linfoides, y también de dar lugar a otros componentes celulares maduros encontrados normalmente en la sangre. Las "células oligopotentes" incluyen las células y su progenie cuya capacidad para diferenciarse en células maduras o parcialmente maduras se encuentra más restringida que para las células multipotentes . Sin embargo, las células oligopotentes pueden poseer aún la capacidad para diferenciarse en células oligopotentes y unipotentes y/o uno o más tipos celulares maduros o parcialmente maduros de un tejido, órgano o sistema de órganos dado. Un ejemplo de una célula oligopotente es una célula progenitora mieloide que puede finalmente dar lugar a eritrocitos, plaquetas, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y monocitos maduros o parcialmente maduros. Las "células unipotentes" incluyen las células y su progenie que poseen la capacidad para diferenciarse o dar lugar a otras células unipotentes y/o un tipo de tipos celulares maduros o parcialmente maduros. Como se utiliza en la presente, el término "célula progenitora" se utiliza para definir células y su progenie que pueden diferenciarse en células al menos parcialmente maduras, pero que carecen de la capacidad de una auto-renovación indefinida en cultivo. Las células progenitoras, como se utiliza en la presente, pueden ser pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o incluso unipotentes. Los métodos de la presente invención comprenden obtener una población de células de un sujeto que necesita tratamiento. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" se utiliza de manera intercambiable con el término "paciente", y se utiliza para definir un animal, en particular un mamífero, e incluso más particularmente un primate no humano o humano. Como se utiliza en la presente con referencia a las células, el término "obtener" pretende significar cualquier proceso1 para retirar células de un sujeto. No es necesario aislar o purificar las células cuando se obtienen de un sujeto. Las células pueden obtenerse de cualquier fluido corporal de un sujeto (e.g., sangre, suero, orina, saliva, fluido espinal cerebral) o de muestras de tejido de un sujeto (e.g., biopsias, aspirados de médula ósea). Una vez obtenidas, las células deseadas pueden entonces aislarse. Como se utiliza en la presente el término "aislado" o "aislar" o variantes de los mismos, al utilizarse con referencia a una célula o población de células, significa que la célula o población de células se han separado de la mayoría de las moléculas circundantes y/o de los materiales que rodean la célula o células cuando la célula o células se encontraban asociadas con un sistema biológico (e.g., médula ósea) . La concentración de materiales tales como agua, sales y amortiguador, no se consideran al determinar si una célula se ha "aislado". Por tanto, el. término "aislado" no pretende implicar o indicar una población de células purificada de un fenotipo particular, ni pretende significar una población de células completamente desprovista de polvo, células no viables o células de un fenotipo diferente. Los métodos para aislar las células no deben limitar el alcance de la invención descrita en la presente. Por ejemplo, las células pueden aislarse utilizando métodos muy conocidos, tales como citometria de flujo u otros métodos que explotan un fenotipo de célula. Los métodos adicionales para aislar las células incluyen el uso de selectores positivos o negativos que pueden contener las estructuras terapéuticas, de manera que las células pueden aislarse antes o después de introducir el polinucleótido terapéutico en las células. Por tanto, en una modalidad, la estructura puede comprender un selector positivo que puede utilizarse para "aislar" las células deseadas de otras células que se obtienen inicialmente . Como se utiliza en la presente, el término "purificada" cuando se utiliza con referencia a una célula o población de células, significa que la célula o células se han separado sustancialmente de todos los materiales que normalmente circundan la célula o células cuando la célula o células se encontraban asociadas con un sistema biológico. "Purificada" es, por tanto, un término relativo que se basa en un cambio en las condiciones en términos de células y/o materiales en cercana proximidad a las células aisladas que van a purificarse. Por tanto, se considera que las células hematopoyéticas aisladas se encuentran purificadas incluso si se retira al menos parte del polvo celular, células no viables células de un fenotipo diferente o células o moléculas tales como proteínas y/o carbohidratos, mediante el lavado o el procesamiento adicional después del aislamiento. El término purificada no se utiliza para definir que el total de materia que se pretende retirar se encuentra retirado de las células que se purifican. Por tanto, alguna cantidad de contaminantes puede encontrarse presente conjuntamente con las células purificadas. En una modalidad, la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad se determina después de obtener las células. En otra modalidad, la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad se determina antes de obtener las células. Por tanto, la actividad de uno o más genes marcadores de la enfermedad puede asumirse o inferirse si la enfermedad o condición anormal en el sujeto exhibe síntomas o marcadores de enfermedades o condiciones anormales típicas en donde se ha establecido la actividad de un conjunto de genes marcadores de la enfermedad. Como se utiliza en la presente, un gen marcador de la enfermedad pretende significar un gen cuyos niveles de expresión pueden utilizarse para evaluar, diagnosticar o auxiliar en el diagnóstico de una enfermedad o condición anormal. Los genes marcadores de enfermedad incluyen genes que se expresan solamente en células enfermas y genes que se expresan en células normales, pero que se expresan en niveles elevados en células enfermas. Los ejemplos más conocidos de ' genes marcadores de la enfermedad son los oncógenos, sin embargo los métodos de la presente invención no se limitan a oncógenos. Ejemplos de clases de oncógenos incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, receptores del factor de crecimiento, proteina cinasas, reguladores de muerte programada y factores de transcripción. Ejemplos específicos de oncógenos incluyen, pero no se limitan a, sis, erb B, erb B-2, ras, abl, myc y bcl-2 y TERT. Ejemplos de otros genes marcadores de enfermedad incluyen genes de antígeno asociados con tumor y otros genes que se encuentran sobreexpresados en células enfermas (e.g., MAGE-1, antígeno carcinoembriónico, tirosinasa, antígeno específico de próstata, antígeno de membrana específico de próstata, p53, MUC-1, UC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-1 , gplOO, GM2, Tn, sTn y antígeno Thompson-Friedenreich (TF) ) . Una vez determinados los genes marcadores de la enfermedad, los promotores de estos genes marcadores de la enfermedad se colocan dentro de un polinucleótido terapéutico. Como se utiliza en la presente, el término polinucleótido terapéutico se utiliza para definir un polinucleótido que se introduce en la población de células con el propósito de destruir las células enfermas. En una modalidad, el promotor se inserta en el polinucleótido de tal manera que se encuentra operablemente enlazado a una porción del polinucleótido que codifica para un polipéptido que es letal a las células. Los métodos, por consiguiente, explotan la actividad anormal de la célula enferma de tal manera que la célula enferma se auto-destruirá finalmente. Como se utiliza en la presente, el término "operablemente enlazado" significa un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor, o disposición de sitios de enlace del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia. En otra modalidad, el promotor se encuentra indirectamente enlazado a la expresión del polipéptido letal. Por ejemplo, el promotor marcador de la enfermedad puede encontrarse operablemente enlazado a un factor de transcripción que activa un segundo promotor que se encuentra operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el polipéptido letal. El término "promotor" se utiliza en la presente como se encuentra en la técnica. A saber, el término promotor se refiere a una región de ADN que permite el enlace de una ARN polimerasa para iniciar la transcripción de una secuencia genética. La secuencia de muchos genes marcadores de la enfermedad, incluyendo la región promotora, se conoce en la técnica y se encuentra disponible en bases de datos públicas, e.g., GenBank. Por tanto, una vez identificado un gen marcador de enfermedad en las células obtenidas o aisladas, la secuencia promotora puede identificarse y obtenerse fácilmente. Otro aspecto de la presente invención se dirige a identificar un gen marcador de la enfermedad cuyo promotor puede aislarse y colocarse en un polinucleótido terapéutico. La identidad del gen marcador de la enfermedad, en consecuencia, puede no ser critica para las modalidades especificas de la presente invención, siempre que el promotor pueda ser aislado y utilizado en subsecuentes instalaciones o ambientes. La presente invención incluye, por tanto, el uso de promotores de genes marcadores de la enfermedad que aún se van a identificar. Una vez identificados los nuevos genes marcadores de la enfermedad, puede ser cuestión de experiencia o experimentación de rutina la determinación de las secuencias genéticas necesarias para la función del promotor. De hecho, existen varios protocolos comerciales para auxiliar en la determinación de la región promotora de los genes de interés. A modo de ejemplo, Ding et al., elucidaron recientemente la secuencia promotora del nuevo gen Sprouty4 (Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 287:L52-L59 (2004), que se incorpora mediante la referencia) suprimiendo progresivamente la secuencia lateral 5' del gen Sprouty4 humano. Brevemente, una vez determinado el sitio de iniciación de transcripción, se generaron fragmentos de PCR utilizando iniciadores de PCR comunes para clonar los segmentos del segmento lateral 5' de una manera unidireccional. Los segmentos generados se clonaron en un vector informante de luciferasa y la actividad de luciferasa se midió para determinar la región promotora del gen Sprouty4 humano. Otro ejemplo de un protocolo para adquirir y validar los promotores del gen marcador de enfermedad incluye las siguientes etapas: (1) adquirir muestras de célula/tejido canceroso y no canceroso de un tipo de tejido similar/igual; (2) aislar el ARN o ARNm total de las muestras; (3) llevar a cabo análisis de microdisposición diferencial del ARN canceroso y no canceroso; (4) identificar- las transcripciones especificas de cáncer candidato; (5) identificar las secuencias genómicas asociadas con las transcripciones especificas de cáncer; (6) adquirir o sintetizar la secuencia de ADN aguas arriba y aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción predicho de la transcripción especifica de cáncer; (7) diseñar y producir vectores informantes promotores utilizando diferentes longitudes de ADN de la etapa 6; y (8) probar los vectores informantes en células/tejidos cancerosos y no cancerosos, asi como en células/tejidos no relacionados. La fuente del promotor que se inserta en el polinucleótido terapéutico puede ser natural o sintética, y la fuente del promotor no debe limitar el alcance de la invención descrita en la presente. En otras palabras, el promotor puede clonarse directamente a partir de las células obtenidas o aisladas, o el promotor puede haberse clonado previamente a partir de una fuente diferente, o el promotor puede haberse sintetizado. En una modalidad, el promotor se encuentra operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que, cuando se expresa, es letal a la célula que expresa el polipéptido, ya sea debido a que el polipéptido en si es letal o a que el polipéptido produce un compuesto que es letal. Como se utiliza en la presente, un polipéptido que es letal a las células incluye también polipéptidos que inducen la muerte celular de cualquier manera, incluyendo, pero sin limitarse a necrosis, apoptosis y citotoxicidad. Ejemplos de polipéptidos que pueden ser letales a las células incluyen, pero no se limitan a, genes supresores de tumor que inducen apoptosis tales como, pero sin limitarse a, p53, Rb y BRCA-1, toxinas tales como la toxina de difteria (DTA) , neurotoxina shigella, toxina de botulismo, toxina de tétanos, toxina de cólera, CSE-V2 y otras variantes de toxinas de proteina de escorpión para nombrar algunas, genes suicidas tales como citosina deaminasa y timidina cinasa y genes citotóxicos, e.g., el factor de necrosis de tumor, interferón-alfa . La presente invención no se limita por la identidad de la proteina letal, siempre que la proteina sea capaz de ser letal a la célula en la cual se expresa . En otra modalidad, el promotor de gen marcador de la enfermedad se encuentra directamente enlazado a la expresión del polipéptido letal. En una modalidad, el promotor del gen marcador de la enfermedad se encuentra operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica para un factor de transcripción y el polinucleótido que codifica para el polipéptido letal se encuentra operablemente enlazado a un promotor que se activa mediante el factor de transcripción. El factor de transcripción puede ser un factor de transcripción dependiente del ligando que activa la transcripción solamente en presencia del ligando, e.g., miembros de ña superfamilia del receptor de esteroides activados por medio de sus ligandos respectivos (e.g., glucocorticoides , estrógeno, progestina, retinoide, ecdisona y análogos y miméticos de los mismos) o rTTa activado por tetraciclina . El factor de transcripción puede ser un polipéptido de origen natural o un polipéptido quimérico que comprende dominios de dos o más factores de transcripción diferentes. Por ejemplo, el dominio de enlace de ligando, el dominio de transactivación, y el dominio de enlace a ADN pueden obtenerse cada uno a partir de dos o tres factores de transcripción diferentes. En una modalidad, el factor de transcripción es uno que se encuentra estrechamente regulado por el nivel de ligando que se encuentra presente. En otra modalidad, los dominios del factor de transcripción pueden expresarse en polipéptidos separados de tal manera que la activación de transcripción se presenta solamente cuando los dos polipéptidos se dimerizan en conjunto (y el ligando se encuentra presente). Un ejemplo de tal sistema son los sistemas del receptor de ecdisona quimérico descritos en la Patente de E.U. No. 7,091,038, las Solicitudes de Patente de E.U. publicadas Nos. 2002/0110861, 2002/0119521, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457 y 2006/0100416, y las Solicitudes Internacionales Publicadas Nos O 01/70816, O 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO 02/29075 y WO 2005/108617 , k cada una de las cuales se incorpora mediante la referencia en su totalidad. Un ejemplo de un sistema no esferoidal regulado por agonista de ecdisona es el RheoSwitch® Mammalian Inducible Expression System (New England Biolabs, Ipswich, A) . Para introducir el polinucleótido terapéutico en las células, puede utilizarse un vector que comprende el promotor seleccionado y el polinucleótido que codifica para el polipéptido letal. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de plásmido, un vector de fago de cadena única o doble, o un vector viral de ARN o ADN de cadena única o doble. Tales vectores pueden introducirse a las células mediante técnicas muy conocidas para introducir ADN y ARN en las células. Los vectores virales pueden ser competentes para replicación o defectuosos para replicación. En el último caso, la propagación viral se presentará generalmente solamente en células huésped de complemento. Como se utiliza en la presente, el término "célula huésped" o "huésped" se utiliza para definir una célula de la presente invención que alberga uno o más polinucleótidos terapéuticos. Por tanto, como mínimo, los vectores deben incluir un promotor de un gen marcador de la enfermedad y un polinucleótido que codifica para un polipéptido letal. Otros componentes del vector pueden, incluir, pero no se limitan a,' marcadores seleccionables , dominios de modificación de cromatina, promotores adicionales que conducen la expresión de otros polipéptidos que también pueden encontrarse presentes en el vector, sitios de integración genómica, sitios de recombinación, y pivotes de inserción molecular. Los vectores pueden comprender cualquier número de estos elementos adicionales de tal manera que la estructura puede diseñarse para los objetivos específicos de los métodos de tratamiento deseados. En una modalidad de la presente invención, los vectores que se introducen en las células comprenden además un "gen marcador seleccionable" que, cuando se expresa, indica que la estructura terapéutica de la presente invención se ha integrado en el genoma de la célula huésped. De esta manera, el gen selector puede ser un marcador positivo para la integración del genoma. Aunque no son críticos los métodos de la presente invención, la presencia de un gen marcador seleccionable permite al médico seleccionar una población de células vivas en donde se ha integrado la estructura del vector en el genoma de las células. Por tanto, ciertas modalidades de la presente invención comprenden seleccionar células en donde el vector se ha integrado con éxito. Como se utiliza en la presente, el término "seleccionar" o variaciones del mismo, cuando se utiliza en conjunto con células, pretende significar métodos estándar muy conocidos para seleccionar células con una formación o fenotipo genético específico. Los métodos típicos incluyen, pero no se limitan a, cultivar las células en presencia de antibióticos, tales como G418, neomicina y ampicilina. Otros ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, genes que confieren resistencia a dihidrofolato reductasa, higromicina o ácido micofenólico . Otros métodos de selección incluyen, pero no se limitan a, un gen marcador seleccionable que permite el uso de timidina cinasa, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa y fosforibosiltransferasa como agentes de selección. Las células que comprenden una estructura de vector que comprende un gen o genes de resistencia al antibiótico serian capaces entonces de tolerar el antibiótico en cultivo. De manera similar, las células que no comprenden una estructura de vector que comprende un gen o genes de resistencia al antibiótico no serian capaces de tolerar el antibiótico en cultivo. Como se utiliza en la presente, un "dominio de modificación de cromatina" (C D) se refiere a secuencias de nucleótido que interactúan con una variedad de proteínas asociadas con el mantenimiento y/o alteración de la estructura de cromatina, tales como, pero sin limitarse a, aisladores de ADN. Ver Ciavatta, D. , et al., Proc. Nati. Acad, Sci., E.U.A. 103 (26) : 9958-9963 (2006), que se incorpora mediante la referencia en la presente. Ejemplos de CMDs incluyen, pero no se limitan a, el aislador de beta-globulina de pollo y el sitio 4 hipersensitivo de pollo (cHS4) . El uso de diferentes secuencias de CMD entre uno o más programas de gen, por ejemplo, puede facilitar el uso de las secuencias diferenciales de ADN de CMD como "armas de mini homología" en combinación con varios microorganismos o tecnologías recombinantes in vitro para "permutar" los programas de gen entre los vectores de lanzadera multigénicos y monogénicos existentes. Otros ejemplos de dominios de modificación de cromatina son conocidos en la técnica o pueden identificarse fácilmente. Los vectores particulares para su uso con la presente invención, son vectores de expresión que codifican para las proteínas o porciones de las mismas. Generalmente, tales vectores comprenden regiones de control que actúan en cis efectivas para la expresión en un huésped operativamente enlazado ,al polinucleótido que va a expresarse. Los factores que actúan en trans apropiados se suministran por el huésped, suministrados mediante un vector de complemento o suministrados mediante el vector en sí a su introducción en el huésped. Puede utilizarse una gran variedad de vectores de expresión para expresar las proteínas. Tales vectores incluyen vectores cromosomales, episomales y derivados de virus, e.g., vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levadura, de elementos cromosomales de levadura, de virus tales como los virus adeno asociados, lentivirus, bacilovirus, virus de papova tales como SV40, virus de vacunas, adenovirus, virus de viruela, virus de pseudorrabia y retrovirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmido y bacteriófagos tales como cósmidos y fagémidos. Todos pueden utilizarse para la expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Generalmente puede utilizarse cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos o proteínas en un huésped para la expresión en este aspecto. La secuencia de ADN en el vector de expresión se encuentra operativamente enlazada a la(s) secuencia (s) de control de expresión apropiada (s) incluyendo, por ejemplo, un promotor para dirigir la transcripción de ARNm. Los representantes de promotores adicionales incluyen, pero no se limitan a, promotores constitutivos y promotores específicos del tejido o inducibles. Ejemplos de promotores eucarióticos constitutivos incluyen, pero no se limitan a, el promotor del gen I de metalotioneína de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); el promotor TK del virus de herpes (McKnight, Cell 31:355-365 (1982)); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature (Londres) 290:304-310 (1981)); y el promotor de virus de vacuna. Todas las referencias antes listadas se incorporan mediante la referencia en la presente. Ejemplos adicionales de los promotores que podrían utilizarse para conducir la expresión de una proteína incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos del tejido y otros promotores endógenos para proteínas específicas, tales como el promotor de albúmina (hepatocitos) , un promotor de proinsulina (células beta pancreáticas) y lo similar. En general, las estructuras de expresión contendrán sitios para la transcripción, iniciación y terminación y, en la región transcrita, un sitio de enlace de ribosoma para la translación. La porción de codificación de las transcripciones maduras expresada mediante las estructuras puede incluir una AUG de iniciación de translación al inicio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) apropiadamente colocado al final del polipéptido que va a trasladarse. Además, las estructuras pueden contener regiones de control que regulan, asi como engendran, la expresión. Generalmente, tales regiones operarán controlando la transcripción, tal como los sitios de enlace del represor y los mejoradores, entre otros. El vector que contiene una secuencia de nucleótidos apropiada, asi. como un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, pueden introducirse en una célula de la presente invención utilizando una variedad de técnicas muy conocidas que son adecuadas para la expresión de un polipéptido deseado. Ejemplos de vectores eucarióticos incluyen, pero no se limitan a, pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Amersham Pharmacia Biotech; y pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP disponibles de Clontech.

Muchos otros vectores son muy conocidos y se encuentran comercialmente disponibles. Los vectores particularmente útiles que comprenden pivotes de inserción molecular para la rápida inserción y retiro de los elementos de los programas de gen, se describen en la Solicitud de Patente Publicada de los E.U. No. 2004/0185556, Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/233,246 y Solicitudes Internacionales Publicadas Nos. WO 2005/040336 y WO 2005/116231, todas las cuales se incorporan mediante la referencia. Un ejemplo de tales vectores es el UltraVector™ Production System (Intrexon Corp., Blacksburg, VA) . Como se utiliza en la presente, un "programa de gen" es una combinación de elementos genéticos que comprenden un promotor (P), una secuencia de expresión (E) y una secuencia reguladora 3' (3), de tal modo que "PE3" como se representa en las figuras es un programa de gen. los elementos dentro del programa de gen pueden permutarse fácilmente entre los pivotes moleculares que colindan con cada uno de los elementos del programa de gen. un pivote molecular, como se utiliza en la presente, se define como un polinucleótido que comprende al menos dos sitios de restricción raros o no comunes no variables dispuestos de manera lineal. En una modalidad, el pivote molecular comprende al menos tres sitios de restricción raros o no comunes no variables dispuestos de manera lineal. Típicamente cualquiera de los pivotes moleculares no incluiría un sitio de restricción raro o no común de cualquiera otro de los pivotes moleculares dentro del mismo programa de gen. Las secuencias cognado de más de 6 nucleótidos sobre las cuales actúa una enzima de restricción dada, se refieren como sitios de restricción "raros". Sin embargo, existen sitios de restricción de 6 bp que se presentan más infrecuentemente de lo que se predeciría estadísticamente, y estos sitios y las endonucleasas que los desdoblan, se refieren como sitios de restricción "no comunes". Ejemplos de enzimas de restricción ya sea raras o no comunes incluyen, pero no se limitan a, AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Ase I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, Bsi I, Sfo I, Sgr AI, AflIII, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, y Sse8781 I. El vector también puede comprender sitios de restricción para una segunda clase de enzimas de restricción llamadas enzimas de endonucleasa mensajeras (HE) . Las enzimas HE tienen grandes sitios de restricción asimétricos (12-40 pares base) y sus sitios de restricción son infrecuentes en naturaleza. Por ejemplo, la HE conocida como I-Scel tiene un sitio de restricción de 18 bp (5' TAGGGATAACAGGGTAAT3' (SEQ ID NO: 1)), predicho para ocurrir solamente una vez en cada 7 x 1010 pares base de la secuencia aleatoria. Esta proporción de ocurrencia es equivalente solamente a un sitio en un genoma que es 20 veces - el tamaño de un genoma de mamífero. La rara naturaleza de los sitios de HE incrementa en gran medida la probabilidad de que el ingeniero genético pueda cortar un programa de gen sin fracturar la integridad del programa de gen si los sitios de HE se incluyeran en ubicaciones apropiadas en un plásmido del vector de clonación. La selección de vectores y promotores apropiados para la expresión en una célula huésped es un procedimiento muy conocido, y las técnicas requeridas para la construcción del vector y para la introducción en el huésped, así como para su expresión en el huésped son experimentos de rutina en la técnica. La introducción de la estructura en las células puede ser una transfección transitoria, una transfección estable o puede ser una inserción específica en el sitio del vector. La transfección transitoria y estable de los vectores en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextran, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Métodos básicos en biología molecular) (1986) ; Keown et al., 1990, Methods Enzymol., 185:527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Clonación - - molecular, un manual de laboratorio) , tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., que se incorporan en la presente mediante la referencia. Estos métodos de transfección estable dan como resultado la inserción aleatoria del vector en el genoma de la célula. Además, el número de copias y la orientación de los vectores son también, hablando generalmente, aleatorios. En una modalidad de la invención, el vector se inserta en un sitio bio neutral en el genoma. Un sitio bio neutral es un sitio en el genoma en donde la inserción de la estructura- interfiere muy poco, si acaso, con la función normal de la célula.' Los sitios bio neutrales pueden analizarse utilizando bioinformática disponible. Muchos sitios bio neutrales se conocen en la técnica, e.g., el sitio ROSA equivalente. Otros sitios bio neutrales pueden identificarse utilizando técnicas de rutina muy conocidas en la técnica. La caracterización de el (los) sitio (s) de inserción genómica se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. Para controlar la ubicación, el número de copias y/o la orientación de la estructura al introducir el vector en las células, pueden utilizarse métodos de inserción especifica al sitio. Los métodos para inserción especifica al sitio son muy conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, recombinación homologa e inserción del genoma mediada por recombinasa. Por supuesto, si van a utilizarse los métodos de inserción especifica al sitio en los métodos de la presente invención, los vectores pueden comprender elementos que ayudan en esta inserción especifica al sitio, tales como, pero sin limitarse a, recombinación homologa. Por ejemplo, los vectores pueden comprender uno, dos, tres, cuatro o más sitios de integración genómica (GISs) . Como se utiliza en la presente, un "sitio de integración genómica" se define como una porción de la secuencia de vector cuya secuencia de nucleótidos es idéntica o casi idéntica a las porciones del genoma dentro de las células, que permite la inserción del vector en el genoma. En particular, el vector puede comprender dos sitios de inserción genómica que colindan al menos con el promotor del gen marcador de la enfermedad y el polinucleótido que codifica para el polipéptido letal. Por supuesto, los GISs pueden colindar con los elementos adicionales o incluso con todos los elementos presentes en el vector. En otra modalidad, la inserción especifica al sitio puede llevarse a cabo mediante inserción del gen especifica al sitio de recombinasa. Brevemente, las enzimas de recombinasa bacteriana, tales como, pero sin limitarse a, PhiC31 integrasa, pueden actuar en sitios de "pseudo" recombinación dentro del genoma humano. Estos sitios de pseudo recombinación pueden ser objetivos para la inserción especifica al sitio utilizando las recombinasas . La - - inserción del gen especifico al sitio de recombinasa se describe en Thyagarajan B. et al., Molí. Cell Biol., 21 (12) : 3926-34 (2001), que se incorpora en la presente mediante la referencia. Otros ejemplos de recombinasas y sus sitios respectivos, que pueden utilizarse para la inserción del gen especifico al sitio de recombinasa incluyen, pero no se limitan a, serina recombinasas tales como RE4 y TP901-1. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el genotipado de las células. El término genotipado se utiliza en la presente como se encuentra en la técnica. Específicamente, las modalidades particulares de los métodos de la presente invención proporcionan el genotipado de las células, ya sea antes o después de inducir la destrucción de · las células enfermas. Además, los métodos contemplan el genotipado de las células una o más veces para propósitos de asegurar la calidad. El genotipado puede llevarse a cabo de cualquier manera que proporcione la información de la secuencia genética acerca de todo o una porción del genoma de las células. Por ejemplo, el genotipado puede llevarse a cabo aislando el ADN y subsecuentemente secuenciando o puede llevarse a cabo mediante métodos de PCR o análisis de restricción, o cualquier combinación de los mismos. El genotipado de las células de un sujeto puede llevarse a cabo para determinar el perfil genómico de un sujeto. Esta información puede utilizarse para determinar si un sujeto se encuentra predispuesto a eventos de mutación que harían al sujeto más susceptible a la recurrencia de la enfermedad en generaciones subsecuentes de las células no enfermas que se restauraron al sujeto. Una predisposición a eventos de mutación, en general puede identificarse mediante la detección de alteraciones o mutaciones en los genes que codifican para la síntesis del ADN y reparación de genes o en otros genes relacionados con eventos de mutación en el sujeto. Una predisposición a un tipo de enfermedad específico puede identificarse mediante la detección de alteraciones o mutaciones en los genes asociados con esa enfermedad. El conocimiento del genotipo de un sujeto puede utilizarse para diseñar los polinucleótidos terapéuticos apropiados para cada sujeto. Por ejemplo, si un sujeto se encuentra predispuesto a una enfermedad particular, puede ser más adecuado un promotor o un polipéptido letal particular específico dé la enfermedad. Si el sujeto se encuentra predispuesto a la recurrencia de una enfermedad, sería preferible no extraer el polinucleótido terapéutico de manera que las células enfermas puedan purgarse in vivo en el último momento, si es necesario. En otro ejemplo, el genotipo de un sujeto puede utilizarse para determinar un sitio de inserción particular en el genoma más o menos adecuado. El diseño de un polinucleótido terapéutico individualizado en base al perfil genómico del sujeto puede basarse en las selecciones para cada parámetro del polinucleótido como se muestra en la Figura 1. Un sistema de vector en el cual las partes son fácilmente intercambiables, como se describió anteriormente, es idealmente adecuado para ensamblar polinucleótidos terapéuticos específicos al sujeto en base al genotipo del suj eto . Además, las modalidades particulares de los métodos de la presente invención comprenden la excisión del polinucleótido terapéutico. En general, los métodos de la presente invención darán como resultado la introducción de los polinucleótidos terapéuticos en todas o la mayoría de las células, sin importar el estado de enfermedad de las células. Por tanto, puede ser deseable retirar el (los) polinucleótido (s) terapéutico (s) de las células no enfermas. Para auxiliar en su propia excisión, la estructura puede comprender, en consecuencia, elementos adicionales tales como los sitios de recombinasa . Un ejemplo de un sitio de recombinasa incluye, pero no se limita a, el sitio loxP en el cre-lox muy conocido o los sitios de recombinasa asociados con la Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 resolvasa, C31, TndX, XerC, y XerD recombinasas . Pueden utilizarse otros sitios de recombinasa, siempre que una enzima recombinasa apropiada pueda actuar sobre el sitio de recombinasa. La estructura también puede contener genes que codifican para una o más recombinasas . La expresión de las recombinasas puede encontrarse bajo el control de promotores inducibles de tal manera que pueda inducirse la excisión en el momento deseado. En una modalidad de la invención, el polinucleótido terapéutico puede extraerse de células supervivientes después de haber destruido las células enfermas y antes de reintegrar las células supervivientes al sujeto. En otra modalidad, las células supervivientes pueden restaurarse al sujeto sin extraer el polinucleótido terapéutico. En esta modalidad, la expresión del polipéptido letal puede inducirse in vivo en' cualquier momento después de reintegrar las células al sujeto. Esta modalidad puede utilizarse si existe una recurrencia de la enfermedad en el sujeto. Una recurrencia puede ocurrir por una razón, incluyendo la predisposición del sujeto a eventos de mutación que conducen a la recurrencia de la enfermedad en generaciones subsecuentes de las células no enfermas que se restauraron al sujeto. La recurrencia también puede ocurrir debido a la purga incompleta de todas las células enfermas antes de la restauración de las células al sujeto. La capacidad para destruir las células enfermas in vivo (e.g., teniendo el polipéptido letal bajo el control de un promotor inducible y proporcionando el agente de inducción al sujeto) permite que el sujeto evite un ciclo adicional de transplante ex vivo y los riesgos asociados con el ciclo (e.g., la irradiación/quimioterapia requerida para eliminar la médula ósea previo al transplante) . Esta modalidad también permite al médico controlar el inicio in vivo, el nivel y la duración del polipéptido letal. En una modalidad adicional, el polinucleótido terapéutico puede comprender un gen de quimio resistencia, e.g., el gen de resistencia a fármacos múltiples mdrl. El gen de quimio resistencia puede encontrarse bajo el control de un promotor constitutivo (e.g., CMV) o inducible (e.g., RheoSwitch®) . En esta modalidad, si existe una recurrencia de la enfermedad en el sujeto, el médico puede aplicar una dosis más fuerte de un agente quimioterapéutico para destruir las células enfermas mientras que las células restauradas se protegerían del agente. Al colocar el gen de quimio resistencia bajo un promotor inducible, puede evitarse la innecesaria expresión . del gen de quimio resistencia, y aún encontrarse disponible en caso de recurrencia de la enfermedad. Si las células restauradas en sí se enferman, podrían aún destruirse induciendo la expresión del polipéptido letal como se describió anteriormente. Aún más modalidades contemplan analizar y/o expandir la población de células supervivientes antes de reintroducir las células en el sujeto. Por ejemplo, las células supervivientes pueden genotiparse y/o fenotiparse, utilizando cualquiera de los métodos o protocolos descritos o mencionados en la presente, antes dé reintegrar las células en el sujeto. En otro aspecto, la invención proporciona equipos que pueden utilizarse en conjunto con los métodos de la invención. Los equipos, de acuerdo con este aspecto de la invención, pueden comprender uno o más recipientes, que pueden contener uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste de una o más moléculas de ácido nucleico, enzimas de restricción y una o más células que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Los equipos de la invención pueden comprender además uno o más recipientes que contienen el medio de cultivo celular adecuado para cultivar las células de la invención, uno o más recipientes que contienen antibióticos adecuados para su uso en el cultivo de las células de la invención, uno o más recipientes que contienen amortiguadores, uno o más recipientes que contienen reactivos de transfección y/o uno o más contenedores que contienen sustratos para reacciones enzimáticas. Los equipos de la invención pueden contener una amplia variedad de moléculas de ácido nucleico que pueden utilizarse con la invención. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico que pueden suministrarse en los equipos de la invención incluyen aquellos que contienen promotores, secuencias que codifican polipéptidos letales, mejoradores, represores, marcadores de selección, señales de transcripción, señales de translación, sitios de hibridación de iniciador (e.g., para secuenciado o PCR) , sitios de recombinación, sitios de restricción y polienlazadores, sitios que suprimen la terminación- de la translación en presencia de un ARNt supresor, secuencias de codificación de ARNt supresor, secuencias que codifican para dominios y/o regiones, orígenes de replicación, telómeros, centrómeros y lo similar. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden comprender cualquiera o más de estas características además de una secuencia reguladora transcripcional, como se describió anteriormente. Los equipos de la invención pueden comprender recipientes que contienen una o más proteínas de recombinación. Las proteínas de recombinación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 resolvasa, C31, TndX, XerC y XerD. Otros sitios y proteínas de recombinación adecuados son aquellos asociados con la Gateway™ Cloning Technology disponible de Invitrogen Corp., Carlsbad, CA y descritos en la literatura de productos de la Gateway™ Cloning Technology, cuyas descripciones completas se incorporan en la presente mediante la referencia. En uso, una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más promotores del gen marcador de la enfermedad (0) proporcionada en un equipo de la invención, puede combinarse con un polinucleótido de expresión para un polipéptido letal (E) y una secuencia reguladora 3' (3) para preparar un programa de gen PE3. La molécula de ácido nucleico que comprende una o más secuencias reguladoras 3' puede proporcionarse, por ejemplo, con un pivote molecular en los extremos 5' y 3' de la secuencia reguladora 3' . Los equipos de la invención también pueden suministrarse con iniciadores. Estos iniciadores se diseñarán generalmente para hibridarse a moléculas que tienen secuencias de nucleótido especificas. Por ejemplo, estos iniciadores pueden diseñarse para su uso en PCR para amplificar una molécula de ácido nucleico particular. Los iniciadores de secuenciado también pueden suministrarse con el equipo. Uno o más amortiguadores (e.g., uno, dos, tres, cuatro, cinco, ocho, diez, quince) pueden suministrarse en los equipos de la invención. Estos amortiguadores pueden suministrarse en concentraciones de funcionamiento o pueden suministrarse en forma concentrada y después diluirse a las concentraciones de funcionamiento. Estos amortiguadores frecuentemente contendrán sal, iones de metal, co-factores, agentes quelantes de ion de metal, etc., para mejorar las actividades o la estabilización ya sea del amortiguador en si o de las moléculas en el amortiguador. Además, estos amortiguadores pueden suministrarse en formas secas o acuosas. Cuando los amortiguadores se suministran en una forma seca, generalmente se disolverán en agua antes de su uso . Los equipos de la invención pueden contener virtualmente cualquier combinación de los componentes expuestos anteriormente o descritos en cualquier parte en la presente. Como lo reconocerá el experto en la técnica, los componentes suministrados con los equipos de la invención variarán con el uso destinado para los equipos. Por tanto, los equipos pueden diseñarse para llevar a cabo varias funciones expuestas en esta solicitud y los componentes de tales equipos variarán en consecuencia. La presente invención se refiere además a instrucciones para llevar a cabo uno ó más de los métodos de la invención. Tales instrucciones pueden instruir al usuario de las condiciones adecuadas para llevar a cabo los métodos de la invención. Las instrucciones de la invención pueden encontrarse en forma tangible, por ejemplo, instrucciones escritas (e.g., impresas en papel) o pueden encontrarse en forma intangible, por ejemplo, accesibles mediante un disco de computadora o en la Internet. Se reconocerá que no es necesario proporcionar un texto completo de instrucciones para llevar a cabo un método de la invención o, cuando las instrucciones se incluyen en un equipo, para utilizar el equipo. Un ejemplo de una situación - - en la cual un equipo' de la invención, por ejemplo, no contendería tales instrucciones de longitud total, es cuando las instrucciones proporcionadas informan al usuario de los equipos dónde obtener las instrucciones para practicar los métodos para los cuales puede utilizarse el equipo. Por tanto, las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención pueden obtenerse de páginas web de internet, venderse por separado o distribuyendo manuales u otra literatura del producto, etc. La invención incluye, por tanto, equipos que dirigen al usuario del equipo a una o más ubicaciones en donde pueden encontrarse las instrucciones no directamente empacadas y/o distribuidas con los equipos. Tales instrucciones pueden encontrarse en cualquier forma incluyendo, pero sin limitarse a, formas electrónicas o impresas. Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes de los métodos de la presente invención. Otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de la variedad de condiciones y parámetros normalmente encontrados en el tratamiento médico y en sistemas de expresión del gen y que son obvios para los expertos en la técnica, se encuentran dentro del espíritu y alcance de la invención. Ejemplos Ejemplo 1 Se obtienen células CD34+ y se aislan de la sangre - - de un paciente con leucemia mieloide. Las células aisladas se tratan ex vivo con una estructura de polinucleótido terapéutico de la presente invención que comprende un gen de selección de neomicina (neo) bajo el control del promotor constitutivo de citomegalovirus ubicuo (CMV) , y el transactivador inducible rTTA bajo el control del promotor TERT. Una secuencia de codificación de la toxina de difteria (DTA) se encuentra bajo el control del promotor TetO inducible. La transformación celular se lleva a cabo . entonces bajo condiciones que promueven la integración aleatoria de la estructura terapéutica en el genoma. Se seleccionan transformadores estables mediante la adición de G418. Las colonias supervivientes se tratan entonces con tetraciclina o doxiciclina para activar la expresión del producto del gen letal de DTA en' aquellas células en donde el promotor de TERT conduce la expresión del producto de proteina de rTTA. La adición de tetraciclina o doxiciclina y la expresión de rTTA conducen a la destrucción de las células enfermas en donde el promotor TERT es activo. El vector mostrado en la Figura 6 es un ejemplo de un diseño de vector que puede ser útil para los métodos del presente ejemplo. La caracterización de el (los) sitio (s) de inserción genómica se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. en una modalidad, las células en donde se habían insertado las estructuras en un sitio bio - - neutral, se cultivan y se expanden bajo condiciones que proporcionan presión selectiva en las células que comprenden las estructuras. Estas colonias expandidas se fenotipan para indicar la presencia o ausencia de genes marcadores de la enfermedad. El fenotipo también puede evaluarse para determinar la capacidad de las células para mantener la plasticidad de una célula progenitora evaluada mediante biomarcadores progenitores conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, biomarcadores CD34+. Las poblaciones celulares que pasan este análisis final fenotipico se transplantarán entonces en el paciente donante. Previo al transplante, los pacientes pueden tener extraídas sus células sanguíneas/médulas óseas mediante metodologías químicas o radiactivas. Ejemplo 2 Se obtienen células de sangre periférica y se aislan de la sangre de un paciente con cáncer de origen de célula sanguínea. Las células aisladas se tratan ex vivo con una estructura de polinucleótido terapéutico de la presente invención que comprende un gen de selección de neomicina (neo) bajo el control del promotor de aldehido dehidrogenasa y el trans-activador inducible rTTA bajo el control del promotor TERT. Una secuencia de codificación de la toxina de difteria (DTA) se encuentra bajo el control del promotor TetO inducible y un promotor constitutivo de CMV controla la expresión del trans-activador RheoCept®. A su vez el promotor inducible RheoSwitch® controla la expresión de la recombinasa Cre. Los sitios loxP colindan con cada uno de los programas de gen de la estructura en los extremos 5' y 3' de la estructura. La transformación celular se lleva a cabo bajo condiciones que promueven la integración aleatoria del ADN heterólogo en el genoma . Se agrega G418 al cultivo celular para seleccionar transformadores estables que despliegan un fenotipo de célula progenitora, debido a que el promotor de aldehido dehidrogenasa se expresa en altos niveles en células progenitoras que comprenden la estructura. Las colonias supervivientes se tratan entonces con tetraciclina o doxiciclina para activar la expresión del producto del gen letal de DTA en aquellas células en donde el promotor de TERT conduce la expresión del producto de proteina de rTTA. El vector mostrado en la Figura 7 es un ejemplo de un diseño de vector que puede ser útil para los métodos del presente ejemplo. La caracterización de el (los) sitio (s) de inserción genómica se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. En una modalidad, las células en donde se hablan insertado las estructuras en un sitio bio neutral, se cultivan y se expanden bajo condiciones que proporcionan presión selectiva en las células que comprenden las estructuras.

- - Estas colonias expandidas se fenotipan para indicar la presencia o ausencia de genes marcadores de la enfermedad. El fenotipo también puede evaluarse para determinar la capacidad de las células para mantener la plasticidad de una célula progenitora evaluada mediante biomarcadores progenitores conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, CD34+ y aldehido dehidrogenasa . Las poblaciones celulares que pasan este análisis final fenotipico se transplantarán entonces en el paciente donante. Previo al transplante, los pacientes pueden tener extraídas sus células sanguíneas/médulas óseas mediante metodologías químicas o radiactivas. La excisión del vector puede inducirse en cualquier momento exponiendo las células a un agonista del receptor de ecdisona para inducir la expresión de la recombinasa Cre. Ejemplo 3 Para evitar la metástasis y reducir las células cancerosas circulantes, e.g., células de cáncer de mama, en un paciente de cáncer post-quirúrgico, se obtienen células de sangre periférica y se aislan de un paciente que tiene o tuvo cáncer de mama. Estas células aisladas se tratan ex vivo con una estructura terapéutica que comprende el gen de citodina deaminasa (CDA) bajo el control del promotor de- fosfo glicerato cinasa ubicuo constitutivamente expresado (PGK) , y una porción del ADN que es homólogo al sitio bio neutral ROSA - - equivalente. En la estructura, el gen de' selección neo se encuentra bajo el control del promotor de aldehido dehidrogenasa, y el trans-activador inducible rTTA se encuentra bajo el control del promotor de TERT. Además la secuencia de codificación de timidina cinasa (TK) del virus de herpes simple (HSV) se encuentra bajo el control del promotor inducible TetO, y una región adicional del ADN homólogo al sitio bio neutral ROSA equivalente que reside en 3' de la primera región de ADN. También, el gen de la toxina de difteria (DTA) se encuentra bajo el control del promotor de C V constitutivamente expresado. La transformación celular se lleva a cabo bajo condiciones que promueven la inserción especifica al sitio mediante recombinación homologa. Se seleccionan transformadores estables que despliegan un fenotipo de célula progenitora mediante la adición de G418, debido a que el promotor de aldehido dehidrogenasa se encuentra expresado a altos niveles en las células progenitoras . El vector mostrado en la Figura 8 es un ejemplo de un diseño de vector que puede ser útil para los métodos del presente ejemplo. Específicamente, la estructura se inserta en el genoma en el sitio bio neutral ROSA equivalente. El sitio del selector de DTA de la estructura indica que la recombinación homologa tuvo éxito. El tratamiento con 5-fluorocitosina sirve como un selector negativo para la pérdida del gen selector de CDA. La caracterización del sitio de inserción genómica se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. Se seleccionan y se expanden las colonias en donde las porciones de la estructura internas a las regiones de recombinación homologa que se han integrado en el genoma en el sitio bio neutral ROSA' equivalente. Estas células expandidas se tratan entonces con tetraciclina o doxiciclina además de ganciclovir. El tratamiento con tetraciclina o doxiciclina conducirá a la activación del promotor Teto en células que expresan el gen marcador de la enfermedad seleccionado que, a su vez, activará la expresión del producto del gen de TK. El tratamiento con ganciclovir destruye selectivamente las células que expresan timidina cinasa en altos niveles de expresión. Estas colonias expandidas se fenotipan para indicar la presencia o ausencia de genes marcadores de la enfermedad. El fenotipo también puede evaluarse para determinar la capacidad de las células para mantener la plasticidad de una célula progenitora evaluada mediante biomarcadores progenitores conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, CD34+ y aldehido dehidrogenasa . Las poblaciones celulares que pasan este análisis final fenotipico se transplantarán entonces en el paciente donante. Previo al transplante, el paciente puede tener extraídas sus células sanguíneas/médulas óseas mediante metodologías químicas o radiactivas. Ejemplo 4 Se obtienen células de sangre periférica y se aislan de la sangre de un paciente con cáncer de origen de célula sanguínea. Las células aisladas se tratan ex vivo con una estructura de polinucleótido terapéutico de la presente invención que comprende un gen de selección de neomicina (neo) bajo el control del promotor de aldehido dehidrogenasa y la secuencia de. codificación de la toxina de difteria (DTA) bajo el control del promotor TERT. La transformación celular se lleva a cabo bajo condiciones que promueven la integración aleatoria del ADN heterólogo en el genoma.. Se agrega G418 al cultivo celular para seleccionar transformadores estables que despliegan un fenotipo de célula progenitora, debido a que el promotor de aldehido dehidrogenasa se expresa en altos niveles en células progenitoras que comprenden la estructura. La caracterización de el (los) sitio (s) de inserción genómica se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. En una modalidad, las células en donde se han insertado las estructuras en un sitio bio neutral se cultivan y se expanden bajo condiciones que proporcionan presión selectiva en las células que comprenden las estructuras. Estas colonias expandidas se fenotipan para indicar la presencia o ausencia de genes marcadores de la enfermedad. El fenotipo también puede evaluarse para determinar la capacidad de las células para mantener la plasticidad de una célula progenitora evaluada mediante biomarcadores progenitores conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, CD34+ y aldehido dehidrogenasa. Las poblaciones celulares que pasan este análisis final fenotipico se transplantarán entonces en el paciente donante sin la excisión del polinucleótido terapéutico. Previo al transplante, los pacientes pueden tener extraídas sus células sanguíneas/médulas óseas mediante metodologías químicas o radiactivas . A la recurrencia del cáncer de célula sanguínea en el paciente, se activará la expresión de DTA del promotor TERT en las células transplantadas y estas células se destruirán. Ejemplo 5 Se obtienen células de sangre periférica y se aislan de la sangre de un paciente con cáncer de origen de célula sanguínea. Las células aisladas se tratan ex vivo con una estructura de polinucleótido terapéutico de la presente invención que comprende un gen de selección de neomicina (neo) bajo el control del promotor de aldehido dehidrogenasa y el trans-activador inducible RheoCept® bajo el control del promotor TERT. A su vez el promotor inducible RheoSwitch® controla la expresión de DTA. La transformación celular se lleva a cabo bajo condiciones que promueven la integración aleatoria del ADN heterólogo en el genoma. Se agrega G418 al cultivo celular para seleccionar transformadores estables que despliegan un fenotipo de célula progenitora, debido a que el promotor de aldehido dehidrogenasa se expresa en altos niveles en células progenitoras que comprenden la estructura. Las colonias supervivientes se tratan entonces con un agonista RheoCept® para activar la expresión del producto del gen letal de DTA en aquellas células en donde el promotor de TERT conduce la expresión del producto de proteina de RheoCept®. La caracterización de el (los) sitio (s) de inserción genómica se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. En una modalidad, las células en donde se han insertado las estructuras en un sitio bio neutral se cultivan y se expanden bajo condiciones que proporcionan presión selectiva en las células que comprenden las estructuras. Estas colonias expandidas se fenotipan para indicar la presencia o ausencia de genes marcadores de la enfermedad. El fenotipo también puede evaluarse para determinar la capacidad de las células para mantener la plasticidad de una célula progenitora evaluada mediante biomarcadores progenitores conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, CD34+ y aldehido dehidrogenasa. Las poblaciones celulares que pasan este análisis final fenotipico se transplantarán entonces en el paciente donante sin la excisión del polinucleótido terapéutico. . Previo al transplante, los pacientes pueden tener extraídas sus células sanguíneas/médulas óseas mediante metodologías químicas o radiactivas . A la recurrencia del cáncer de célula sanguínea en el paciente, se administra el agonista RheoCept® al paciente, induciendo así la expresión del producto de gen de DTA en las células transplantadas o su progenie en donde el promotor de TERT conduce la expresión del producto de proteína RheoCept®. Habiendo descrito ahora completamente la invención, se entenderá por los de experiencia ordinaria en la técnica que la misma puede llevarse a cabo dentro de un rango amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar el alcance de la invención o cualquier modalidad de la misma. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas en la presente se incorporan completamente mediante la referencia en la presente en su totalidad.

Claims (55)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar una enfermedad mediante la destrucción de las células enfermas en un sujeto, comprendiendo dicho método: (a) obtener una población de células de dicho sujeto; (b) determinar la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de dicha población de dichas células; (c) introducir en dichas células un polinucleótido que codifica para un marcador seleccionable y un polipéptido que es letal para dichas células en donde la expresión de dicho polipéptido letal se controla directa o indirectamente mediante . el promotor de dicho al menos un gen marcador de la enfermedad; (d) exponer dichas células a condiciones de selección para obtener células que comprenden dicho polinucleótido; (e) tratar dichas células con condiciones para inducir la expresión de dicho polipéptido letal, en donde dicha expresión de dicho polipéptido letal destruye dichas células que expresan dicho al menos . un gen marcador de la enfermedad; (f) separar dichas células destruidas de las células vivas no enfermas restantes, en donde dichas células vivas no expresan dicho polipéptido letal a un grado suficiente para destruir dichas células no enfermas; y (g) reintegrar dichas células vivas no enfermas a dicho sujeto.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho promotor se encuentra operablemente enlazado a dicho polinucleótido que codifica ' para dicho polipéptido letal.
3. 3. El método de la reivindicación 1, que comprende además aislar dichas células después de la etapa (a) .
4. 4. El método de la reivindicación 1,· en donde dichas células se seleccionan del grupo que consiste de células germinales hematopoyéticas, células germinales de hígado, células germinales mamarias, células germinales pancreáticas y células germinales neuronales.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde dichas células son células germinales hematopoyéticas.
6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde dicha introducción de dicho polinucleótido comprende la transfección transitoria de dicho polinucleótido en dichas células .
7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde dicha introducción de dicho polinucleótido comprende la transfección estable de dicho polinucleótido en dichas células.
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido comprende al menos dos programas genéticos .
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho promotor de dicho gen marcador de la enfermedad se encuentra ligado entre un primero y un segundo pivote de inserción molecular .
10. 10. El método de la reivindicación 8, en donde dicho polinucleótido que codifica para dicho polipéptido letal se encuentra ligado entre un segundo y un tercer pivote de inserción molecular.
11. 11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde dichos pivotes de inserción molecular se encuentran comprendidos de tres o cuatro sitios de restricción raros o no comunés en una disposición contigua, siendo seleccionados dichos sitios de restricción raros o no comunes del grupo que consiste de los sitios de restricción correlacionados con las enzimas de restricción AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Ase I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BsiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, y. Sse878 I.
12. 12. El método de la reivindicación 8, en donde el polinucleótido comprende además al menos un dominio de modificación de cromatina.
13. 13. El método de la reivindicación 1, en donde dicha introducción de dicho polinucleótido comprende la inserción especifica al sitio de dicho polinucleótido.
14. 14. El método de la reivindicación 13, en donde dicha inserción especifica al sitio se selecciona del grupo que consiste de recombinación homologa e inserción del genoma mediada por recombinasa.
15. 15. El método de la reivindicación 13, en donde dicho polinucleótido comprende al menos dos sitios de integración del genoma.
16. 16. El método de la reivindicación 14, en donde dicho polinucleótido comprende al menos dos sitios de integración del genoma.
17. 17. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de determinar si el polinucleótido se insertó en un sitio bio neutral en el genoma.
18. 18. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de extraer dicho polinucleótido del genoma de dichas células antes de reintegrar dichas células a dicho sujeto.
19. 19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha excisión comprende la actividad de recombinasa especifica al sitio.
20. 20. El método de la reivindicación 19, en donde dicho polinucleótido comprende además al menos dos sitios de recombinasa.
21. 21. El método de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido no se extrae de dichas células vivas no enfermas restantes antes de reintegrarlas en dicho sujeto.
22. 22. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de inducir la expresión de dicho polipéptido letal después de haber restaurado dichas células en dicho sujeto.
23. 23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha etapa adicional se lleva a cabo después de la recurrencia de dicha enfermedad en dicho sujeto.
24. 24. - Un método para individualizar el tratamiento de un sujeto que necesita el tratamiento para una enfermedad, comprendiendo dicho método: (a) obtener una población de células de dicho sujeto; (b) determinar la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de dicha población de dichas células ; (c) aislar al menos un promotor de dicho al menos un gen marcador de la enfermedad; (d) enlazar directa o indirectamente dicho promotor a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que es letal para dichas células; (e) colocar dicho polinucleótido enlazado en un vector que comprende un marcador seleccionable; (f) introducir dicho polinucleótido en dichas células; (g) exponer dichas células a condiciones de selección para obtener células que comprenden dicho polinucleótido; (h) tratar dichas células con condiciones para inducir la expresión de dicho polipéptido letal, en donde dicha expresión de dicho polipéptido letal destruye dichas células que expresan dicho al menos un gen marcador de la enfermedad; (i) separar dichas células destruidas de las células vivas no enfermas restantes, en donde dichas células vivas no expresan dicho polipéptido letal a un grado suficiente para destruir dichas células no enfermas; y (j) reintegrar dichas células vivas no enfermas a dicho sujeto.
25. 25. El método de la reivindicación 24, en donde dicho promotor se encuentra operablemente enlazado a dicho polinucleótido que codifica para dicho polipéptido letal.
26. 26. El método de la reivindicación 24, que comprende además aislar dichas células después de la etapa (a) .
27. 27. El método de la reivindicación 24, en donde dichas células se seleccionan del grupo que consiste de células germinales hematopoyéticas, células germinales de hígado, células germinales mamarias, células germinales pancreáticas y células germinales neuronales.
28. 28. El método de la reivindicación 27, en donde dichas células son células germinales hematopoyéticas .
29. 29. El método de la reivindicación 24, que comprende además la etapa de determinar si el polinucleótido se insertó en un sitio bio neutral en el genoma .
30. 30. El método de la reivindicación 25, en donde dicho promotor se encuentra operablemente enlazado a dicho polinucleótido que codifica para dicho polipéptido letal ligando dicho promotor entre un primero y un segundo pivote de inserción molecular, estando ubicado dicho segundo pivote de inserción molecular en la terminal 3' de dicho promotor.
31. 31. El método de la reivindicación 30, en donde dichos pivotes de inserción molecular se encuentran comprendidos de tres .o cuatro sitios de restricción raros o no comunes en una disposición contigua, siendo seleccionados dichos sitios de restricción raros o no comunes del grupo que consiste de los sitios de restricción correlacionados con las enzimas de restricción AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Ase I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BsiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, y Sse878 I.
32. 32. Un método para tratar una enfermedad mediante la destrucción de las células enfermas en un sujeto, comprendiendo dicho método: (a) obtener una población de células de dicho sujeto; (b) determinar la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de dicha población de dichas células; (c) introducir en dichas células una molécula de polinucleotido que codifica para un polipéptido que es letal para dichas células en donde la expresión de dicho polipéptido letal se controla mediante el promotor de dicho al menos un gen marcador de la enfermedad y en donde dicho promotor se encuentra operablemente enlazado a dicho polinucleotido que codifica para dicho polipéptido letal; (d) tratar dichas células con condiciones para inducir la expresión de dicho polipéptido letal, en donde dicha expresión de dicho polipéptido letal destruye dichas células que expresan dicho al menos un gen marcador de la enfermedad; (e) separar dichas células destruidas de las células vivas no enfermas restantes, en donde dichas células vivas no expresan dicho polipéptido letal a un grado suficiente para destruir dichas células no enfermas; (f) reintegrar dichas células vivas no enfermas a dicho sujeto.
33. 33. El método de la reivindicación 32, que comprende además aislar dichas células.
34. 34. El método de la reivindicación 32, en donde dichas células se seleccionan del grupo que consiste de células germinales hematopoyéticas, células germinales de hígado, células germinales mamarias, células germinales pancreáticas y células germinales neuronales.
35. 35. El método de la reivindicación 34, en donde dichas células son células germinales hematopoyéticas.
36. 36. El método de la reivindicación 34, en donde dicha introducción de dicho polinucleótido comprende la transfección transitoria de dicho polinucleótido en dichas células.
37. 37. El método de la reivindicación 34, en donde dicha introducción de dicho polinucleótido comprende la transfección estable ¦ de dicho polinucleótido en dichas células .
38. 38. El método de la reivindicación 34, en donde dicho polinucleótido comprende al ' menos dos programas genéticos.
39. 39. El método de la reivindicación 38, en donde dicho promotor de dicho gen marcador de la enfermedad se encuentra ligado entre el primero y el segundo de dichos pivotes de inserción molecular.
40. 40. El método de la reivindicación 39, en donde dicho polinucleótido que codifica para dicho polipéptido letal se encuentra ligado entre los segundos pivotes de inserción molecular y los terceros pivotes de inserción molecular .
41. 41. El método de la reivindicación 40, en donde dicho polinucleótido comprende además al menos un marcador seleccionable .
42. 42. El método de la reivindicación 41, en donde el polinucleótido comprende además al menos un dominio de modificación de cromatina.
43. 43. El método de la ' reivindicación 42, en donde dicha introducción de dicho polinucleótido comprende la inserción especifica al sitio de dicho polinucleótido.
44. 44. El método de la reivindicación 43, en donde dicha inserción especifica al sitio se selecciona de los grupos que consisten de recombinación homologa e inserción del genoma mediada por recombinasa.
45. 45. El método de la reivindicación 44, en donde dicho polinucleótido comprende al menos dos sitios de integración del genoma.
46. 46. El método de la reivindicación 45, en donde-dicho polinucleótido comprende al menos dos sitios de integración del genoma.
47. 47. El método de la reivindicación 46, que comprende además la excisión de dicho polinucleótido del genoma de dichas células antes de reintegrar dichas células a dicho sujeto.
48. 48. El método de la reivindicación 47, en donde dicha excisión comprende actividad de recombinasa especifica al sitio.
49. 49. El método de la reivindicación 48, en donde dicho polinucleótido comprende además al menos dos sitios de recombinasa .
50. 50. Un método para individualizar el tratamiento de un sujeto que necesita el tratamiento para una condición anormal,' comprendiendo dicho método: (a) obtener una población de células de dicho sujeto; (b) determinar la actividad de al menos un gen marcador de la enfermedad dentro de dicha población de dichas células; (c) aislar al menos un promotor de dicho al menos un gen marcador de la enfermedad; (d) generar un polinucleótido terapéutico enlazando operablemente dicho promotor a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que es letal para dichas células; (e) introducir dicho polinucleótido terapéutico en dichas células; (f) tratar dichas células con condiciones para inducir la expresión de dicho polipéptido letal, en donde dicha expresión de dicho polipéptido letal destruye dichas células que expresan dicho al menos un gen marcador de la enfermedad; (g) separar dichas células destruidas de las células vivas no enfermas restantes, en donde dichas células vivas no expresan dicho polipéptido letal a un grado suficiente para destruir dichas células no enfermas; (h) reintegrar dichas células vivas no enfermas a dicho sujeto.
51. 51. El método de la reivindicación 50, que comprende además aislar dichas células.
52. 52. El método de la reivindicación 51, en donde dichas células se seleccionan del grupo que consiste de células germinales hematopoyéticas, células germinales de hígado, células germinales mamarias, células germinales pancreáticas y células germinales neuronales.
53. 53. El método de la reivindicación 52, en donde dichas células, son células germinales hematopoyéticas.
54. 54. El método de la reivindicación 53, en donde dicho enlace operable de dicho promotor a dicho polinucleótido que codifica para dicho polipéptido letal comprende ligar dicho promotor entre un primero y un segundo pivote de inserción molecular, estando ubicado dicho segundo pivote de inserción molecular en la terminal 3' de dicho promotor .
55. 55. El método de la reivindicación 54, en donde dichos pivotes de inserción molecular se encuentran comprendidos de tres o cuatro sitios de restricción raros o no comunes en una disposición contigua, siendo seleccionados dichos sitios de restricción raros o no comunes del grupo que consiste de los sitios de restricción correlacionados con las enzimas de restricción AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Ase I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, Bsi I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, y Sse878 I.