PT1874807E

PT1874807E - Proteínas de fusão compreendendo uma protease não citotóxica, uma unidade de direccionamento, um local de clivagem de protease e um domínio de translocação

Info

Publication number: PT1874807E
Application number: PT58183526T
Authority: PT
Inventors: Keith Foster; John Chaddock; Philip Marks; Patrick Stancombe; Lyndsey Durose
Original assignee: Syntaxin Ltd
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2005-12-01
Publication date: 2013-10-09
Also published as: GB0426397D0; ES2431841T3; EP1874807A2; WO2006059113A3; US8372615B2; AU2005311106B2; US20090004174A1; SI1874807T1; PL1874807T3; CY1114839T1; JP2008521428A; AU2005311106A1; US20080064092A1; US20130115682A1; CN101098885B; BRPI0515760A; WO2006059113A2; CA2593707C; US8956847B2; EP1874807B1

Description

DESCRIÇÃO

"PROTEÍNAS DE FUSÃO COMPREENDENDO UMA PROTEASE NÃO CITOTÓXICA, UMA UNIDADE DE DIRECCIONAMENTO, UM LOCAL DE CLIVAGEM DE PROTEASE E UM DOMÍNIO DE TRANSLOCAÇÃO"

Esta invenção refere-se a proteínas de fusão não citotóxicas e à sua aplicação terapêutica.

As toxinas podem ser divididas geralmente em dois grupos de acordo com o tipo de efeito que têm numa célula alvo. Em mais detalhe, o primeiro grupo de toxinas mata as suas células alvo naturais e são assim conhecidas como moléculas de toxina citotóxica. Este grupo de toxinas é exemplificado, inter alia, por toxinas de plantas, tais como ricina e abrina, e toxinas bacterianas, tais como a toxina da difteria e a exotoxina A de Pseudomonas. As toxinas citotóxicas têm atraído muito interesse na concepção de "balas mágicas" (e. g., imunoconjugados que compreendem um componente citotóxico de toxina e um anticorpo que se liga a um marcador específico numa célula alvo) para o tratamento de distúrbios celulares e estados, tal como o cancro. As toxinas citotóxicas matam tipicamente as suas células alvo por inibição do processo celular de síntese proteica. 0 segundo grupo de toxinas, o qual é conhecido como toxinas não citotóxicas, não mata as suas células alvo naturais (como o seu nome confirma). As toxinas não citotóxicas atraíram muito menos interesse comercial do que as suas correspondentes citotóxicas e exercem os seus efeitos numa célula alvo por inibição de outros processos celulares que não a síntese 1 proteica. As toxinas não citotóxicas são produzidas por uma variedade de plantas e por uma variedade de microrganismos, tais como Clostridium sp. e Neisseria sp.

As neurotoxinas clostridiais são proteínas que têm tipicamente uma massa molecular na ordem de 150 kDa. São produzidas por várias espécies de bactérias, especialmente do género Clostridium, com muita importância C. tetani e várias estirpes de C. botulinum, C. butyricum e C. argentinense. Existem presentemente oito diferentes classes da neurotoxina clostridial, nomeadamente: a toxina do tétano e a neurotoxina botulínica nos seus serotipos A, BI Cl, D, E, F e G, e todas elas partilham de estruturas e modos de acção semelhantes. As neurotoxinas clostridiais representam um importante grupo de moléculas de toxina não citotóxica e são sintetizadas pela bactéria hospedeira como polipéptidos simples que são modificados pós-tradução através de um evento de clivagem proteolítica para formar duas cadeias polipeptídicas ligadas em conjunto, por uma ligação persulfureto. As duas cadeias são denominadas a cadeia pesada (cadeia H) que têm uma massa molecular de, aproximadamente, 100 kDa e a cadeia leve (cadeia L), que tem uma massa molecular de aproximadamente 50 kDa.

As cadeias L possuem uma função de protease (actividade endopeptidase dependente de zinco) e apresentam uma elevada especificidade de substrato para proteínas vesiculares e/ou associadas à membrana plasmática, envolvidas no processo exocítico. As cadeias L de diferentes espécies ou serotipos clostridiais podem hidrolisar ligações peptídicas diferentes, mas específicas, em uma de três proteínas de substrato, nomeadamente sinaptobrevina, sintaxina ou SNAP-25. Estes substratos são componentes importantes da maquinaria neurossecretora. 2 A Neisseria sp., de uma forma muito relevante, a espécie N. gonorrhoeae, produz proteases não citotóxicas funcionalmente semelhantes. Um exemplo de tal protease é a protease IgA (ver documento W099/58571).

Está bem documentado na técnica que as moléculas de toxina podem ser redireccionadas para uma célula que não é a célula alvo natural da toxina. Quando é assim redireccionada, a toxina modificada é capaz de se ligar a uma célula alvo desejada e, após translocação subsequente no citosol, é capaz de exercer o seu efeito na célula alvo. 0 referido redireccionamento é realizado substituindo a Unidade de Direccionamento (TM) natural de toxina com uma TM diferente. Quanto a isto, a TM é seleccionada de modo a que se ligue a uma célula alvo desejada e permita a passagem subsequente da toxina modificada para um endossoma dentro da célula alvo. A toxina modificada compreende também um domínio de translocação para permitir a entrada da protease não citotóxica no citosol da célula. 0 domínio de translocação pode ser o domínio de translocação natural da toxina ou pode ser um domínio de translocação diferente, obtido de uma proteína microbiana com actividade de translocação. Por exemplo, o documento WO94/21300 descreve moléculas modificadas de neurotoxina clostridial que são capazes de regular a densidade da Proteína Membranar Integral (IMP), presente na superfície celular da célula alvo. As moléculas de neurotoxina modificada são assim capazes de controlar a actividade celular (e. g., incorporação de glucose) da célula alvo. Os documentos W096/33273 e WO99/17806 descrevem moléculas modificadas de neurotoxina clostridial que se direccionam para aferentes sensoriais periféricos. As moléculas de neurotoxina modificada são assim capazes de demonstrar um efeito analgésico. 0 documento WO00/10598 descreve a preparação de moléculas 3 modificadas de neurotoxina clostridial que se direccionam para células hipersegregadoras de muco (ou para células neuronais que controlam as referidas células hipersegregadoras de muco), em que as neurotoxinas modificadas são capazes de inibir a hipersecreção das referidas células. 0 documento WOOl/21213 descreve moléculas modificadas de neurotoxina clostridial que se direccionam para uma vasta gama de diferentes tipos de células alvo não neuronais. As moléculas modificadas são assim capazes de prevenirem a secreção a partir das células alvo. Publicações adicionais no campo técnico de moléculas de toxina redireccionadas incluem: - documento WOOO/62814; WO00/04926; US5773586; W093/15766; WOOO/61192; e W099/58571. A substituição de TM mencionada acima pode ser efectuada por técnicas convencionais de conjugação química que são bem conhecidas dos especialistas. Quanto a isto, é feita referência a Hermanson, GT. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press e a Wong, S. S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press. A conjugação química é, contudo, frequentemente imprecisa. Por exemplo, após conjugação, uma TM pode ficar ligada ao remanescente do conjugado em mais de um local de ligação. A conjugação química é também difícil de controlar. Por exemplo, uma TM pode ficar ligada ao remanescente da toxina modificada num local de ligação no componente de protease e/ou no componente de translocação. Isto é problemático quando é desejada ligação a apenas um dos referidos componentes (de um modo preferido, num único local) para eficácia terapêutica.

Assim, a conjugação química resulta numa população mista de moléculas de toxina modificadas, o que é indesejável. 4

Como uma alternativa à conjugação química, a substituição de TM pode ser realizada por preparação recombinante de uma proteína de fusão de polipéptido simples (ver documento WO98/07864). Esta técnica é baseada no mecanismo bacteriano in vivo através do qual é preparada a neurotoxina clostridial nativa (i. e., holotoxina) e resulta numa proteína de fusão que tem o seguinte arranjo estrutural:

NH2-[componente de protease]-[componente de translocação]-[TM]-COOH

De acordo com o documento WO98/07864, a TM é colocada próximo da extremidade C-terminal da proteína de fusão. A proteína de fusão é depois activada por tratamento com uma protease que cliva num local entre o componente de protease e o componente de translocação. Uma proteína de cadeia dupla é assim produzida, compreendendo o componente de protease como uma cadeia polipeptídica simples covalentemente ligada (através de uma ponte persulfureto) a outra cadeia polipeptídica simples contendo o componente de translocação mais a TM. Enquanto a metodologia do documento WO 98/07864 segue (em termos de arranjo estrutural da proteína de fusão) o sistema de expressão natural da holotoxina clostridial, a presente requerente verificou que este sistema pode resultar na produção de determinadas proteínas de fusão que têm uma capacidade de ligação substancialmente reduzida para a célula alvo pretendida.

Existe assim uma necessidade para um sistema alternativo ou melhorado para construir uma proteína de fusão não citotóxica. A presente invenção aborda um ou mais dos problemas mencionados acima ao proporcionar uma proteína de fusão 5 polipeptídica de cadeia simples como definida nas reivindicações. 0 sistema do documento WO98/07864 funciona bem para a preparação de conjugados tendo uma TM que requeira um dominio exterminai para a interaeção com um Local de Ligação numa célula alvo. Quanto a isto, o documento WO98/07864 proporciona proteínas de fusão tendo um domínio C-terminal que é "livre" para interagir com um Local de Ligação numa célula alvo. A presente requerente verificou que esta organização estrutural não é adequada para todas as TM. Em mais detalhe, a presente requerente verificou que o sistema de proteína de fusão do documento WO 98/07864 não é óptimo para TM que requerem um domínio N-terminal para interaeção com um local de ligação numa célula alvo. Este problema é particularmente grave com TM que requerem um resíduo de aminoácido no N-terminal específico ou uma sequência específica de resíduos de aminoácido incluindo o resíduo de aminoácido N-terminal para interaeção com um local de ligação numa célula alvo.

Contrariamente ao documento WO98/07864, a presente invenção proporciona um sistema para preparar conjugados não citotóxicos, em que o componente de TM do conjugado tem um domínio N-terminal (ou uma sequência intra-domínio) que é capaz de se ligar a um Local de Ligação numa célula alvo. 0 componente de protease não citotóxica da presente invenção é uma protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar diferentes ligações peptídicas, mas específicas, em uma de três proteínas de substrato, nomeadamente sinaptobrevina, sintaxina ou SNAP-25, do aparelho de fusão exocítica. Estes substratos são componentes importantes da maquinaria neurossecretora. O componente de 6 protease não citotóxica da presente invenção é, de um modo preferido, uma protease IgA neisserial ou um seu fragmento, ou uma cadeia L de neurotoxina clostridial ou um seu fragmento. Um componente de protease não citotóxica particularmente preferido é uma cadeia L de neurotoxina botulinica (BoNT) ou um seu fragmento. 0 componente de translocação da presente invenção permite a translocação da protease não citotóxica (ou um seu fragmento) para a célula alvo de modo que a expressão funcional da actividade de protease ocorra dentro do citosol da célula alvo. 0 componente de translocação é, de um modo preferido, capaz de formar poros permeáveis a iões em membranas lipidicas sob condições de pH baixo. Verificou-se que é preferida a utilização de apenas aquelas porções da molécula proteica capaz da formação de poro dentro da membrana endossomal. 0 componente de translocação pode ser obtido de uma fonte de proteína microbiana, em particular, de uma fonte de proteína bacteriana ou proteína virai. Assim, numa forma de realização, o componente de translocação é um domínio de translocação de uma enzima, tais como uma toxina bacteriana ou uma proteína virai. 0 componente de translocação da presente invenção é, de um modo preferido, uma cadeia H de neurotoxina clostridial ou um seu fragmento. De um modo muito preferido, é o domínio HN (ou um seu componente funcional), em que HN significa uma porção ou um fragmento da cadeia H de uma neurotoxina clostridial, aproximadamente, equivalente à metade amino-terminal da cadeia H ou o domínio correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. 0 componente de TM da presente invenção é responsável pela ligação do conjugado da presente invenção a um Local de Ligação numa célula alvo. Assim, o componente de TM é simplesmente um 7 ligando através do qual um conjugado da presente invenção se liga a uma célula alvo seleccionada.

No contexto da presente invenção, a célula alvo pode ser qualquer célula alvo, embora com a condição da célula alvo não seja um aferente sensorial nociceptivo, tal como um aferente sensorial primário. Assim, a TM pode-se ligar a células não neuronais e/ou a células neuronais. É habitual confirmar que uma TM se liga a uma determinada célula alvo. Por exemplo, pode ser utilizada uma simples experiência de deslocamento radioactivo em que tecido ou células representantes da célula alvo são expostas ao ligando marcado (e. g., tritiado) na presença de um excesso de ligando não marcado. Nessa experiência, as proporções relativas de ligação não específica e específica podem ser avaliadas, permitindo assim a confirmação de que o ligando se liga à célula alvo. Opcionalmente, o ensaio pode incluir um ou mais antagonistas de ligação e o ensaio pode ainda compreender observar uma perda de ligação do ligando. Os exemplos deste tipo de experiência podem ser encontrados em Hulme, E. C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, em Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E. C. Hulme, Oxford University Press.

As proteínas de fusão da presente invenção demonstram geralmente uma afinidade de ligação reduzida (numa região até 100 vezes) para células alvo, quando comparada com a TM "livre" correspondente. Contudo, apesar desta observação, as proteínas de fusão da presente invenção demonstram surpreendentemente boa eficácia. Isto pode ser atribuído a duas características principais. Primeiro, o componente de protease não citotóxica é catalítico - assim, o efeito terapêutico de algumas dessas moléculas é rapidamente amplificado. Segundo, os receptores 8 presentes nas células alvo apenas necessitam actuar como uma passagem para a entrada do agente terapêutico e não necessitam necessariamente, de ser estimulados a um nivel requerido de modo a atingir uma resposta farmacológica mediada por ligando-receptor. Desta forma, as proteínas de fusão da presente invenção podem ser administradas numa dosagem gue é menor gue aguela gue seria utilizada para outros tipos de moléculas terapêuticas, as guais são administradas tipicamente em guantidades de muitas microgramas até miligramas (até mesmo centenas de miligramas). Pelo contrário, as proteínas de fusão da presente invenção podem ser administradas em dosagens muito menores, tipicamente, pelo menos, 10 vezes menores e, mais tipicamente, 100 vezes menores. A TM compreende, de um modo preferido, um máximo de 50 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, um máximo de 40 resíduos de aminoácidos, de um modo particularmente preferido, um máximo de 30 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, um máximo de 20 resíduos de aminoácidos.

Os ligandos de receptores activados por proteinase representam um grupo preferido de TM da presente invenção, em particular PARI. Os PAR representam um subtipo único de receptores acoplados a proteína G de receptor transmembranar 7 que são modificados proteoliticamente para expor um novo N-terminal extracelular, o qual actua como um ligando activador agarrado. Foram identificados agonistas de PARI (tal como TFLLR) que activam o seu receptor aparentado. A hormona paratiróide (PTH) também representa uma TM preferida da presente invenção. A PTH é libertada pela glândula paratiróide e liga-se ao receptor PTH-1. Este receptor tem uma 9 distribuição difundida, mas é particularmente abundante em tecidos alvo de PTH, predominantemente o rim e osso.

Assim, as TM mais preferidas da presente invenção são:- LIGANDO REFERÊNCIA Ligando de Receptor C. K. Derian, B. E. Maryanoff, P. Activado por Protease Andrade-Gordon e H-C Zhang, DRUG (PARI) DEVELOPMENT RESEARCH, 59:355 (2003) PTH Shimizu M., et ai. 2000, J. Biol. Chem., 21 Jul; 275(29):21836-43

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, a TM liga-se a uma célula secretora de muco ou a uma célula neuronal que controla ou dirige a secreção de muco. Mais especificamente, a TM liga-se a (a) células que segregam mucinas, tais como as células caliciformes epiteliais e células secretoras de muco da glândula submucosal, (b) células que segregam componentes aquosos do muco, tais como células Clara e células serosas ou (c) células que controlam ou dirigem a secreção do muco, tais como fibras C "eferentes-sensoriais" ou fibras do sistema neuronal NANC. Quanto a isto, é feita particular menção às TM:- VIP; agonistas do adrenorreceptor beta2; péptido libertador de gastrina; e péptido relacionado com o gene da calcitonina. Assim, de acordo com esta forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica no tratamento da hipersecreção de muco, asma e/ou doença pulmonar obstrutiva crónica.

Noutra forma de realização, a TM liga-se a uma célula endócrina. É feita aqui menção particular à hormona estimuladora da tiróide (TSH); insulina, factor de crescimento de tipo 10 insulina; hormona libertadora de TSH (protierelina); hormona libertadora de FSH/LH (gonadorrelina); hormona libertadora de corticotrofina (CRH); e ACTH. Assim, de acordo com esta forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica no tratamento de neoplasia endócrina incluindo MEN, tirotoxicose e outras doenças dependentes de hipersecreções da tiróide; acromegalia, hiperprolactinemia, doença de Cushings e outras doenças dependentes da hipersecreção da pituitária anterior; hiperandrogenismo, anovulação crónica e outras doenças associadas com sindrome do ovário policístico.

Noutra forma de realização, a TM liga-se a uma célula inflamatória. É aqui feita menção particular a ligandos (i) para mastócitos, tal como o domínio C4 de Fc de IgE; (ii) para eosinófilos, tais como ligandos para o receptor do complemento de C3a/C4a-R, antigénios reactivos para o receptor do complemento de CR4; (iii) para macrófagos e monócitos, tal como o factor estimulador de macrófago, (iv) para neutrófilos, tais como um antigénio associado com o complemento do receptor de iC3b ou IL8. Assim, de acordo com esta forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica para tratar alergias (rinite alérgica sazonal (febre dos fenos), conjuntivite alérgica, rinite vasomotora e alergia alimentar) , eosinofilia, asma, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, colite ulcerosa, doença de Crohn, hemorroidas, prurido, glomerulonefrite, hepatite, pancreatite, gastrite, vasculite, miocardite, psoríase, eczema, fibrose crónica induzida por radiação, cicatrização pulmonar e outros distúrbios fibróticos.

Noutra forma de realização, a TM liga-se a uma célula exócrina. É feita aqui menção particular ao péptido activador da adenilo ciclase pituitária (PACAP-38) . Assim, de acordo com esta 11 forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica para tratamento da hipersecreção de muco a partir de células secretoras de muco localizadas no tracto alimentar, em particular, localizadas no cólon.

Numa forma de realização adicional, a TM liga-se a uma célula imunológica. É feita aqui menção aos ligandos:-caracteristica de fragmento/superficie do virus Epstein Barr. Assim, de acordo com esta forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica para tratamento da miastenia grave, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, transplante de órgãos, transplante de tecidos, transplante de fluidos, doença de Graves, tirotoxicose, diabetes auto-imune, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatite auto-imune crónica, gastrite auto-imune, anemia perniciosa, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, síndrome de Sjogren, cirrose biliar primária, polimiosite, escleroderma, esclerose sistémica, pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso, miocardite, cardite reumática, glomerulonefrite (tipo Goodpasture), uveíte, orquite, colite ulcerosa, vasculite, gastrite atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo 1.

Numa forma de realização adicional, a TM liga-se a uma célula cardiovascular. É aqui feita menção à trombina e ao TRAP (péptido agonista do receptor de trombina) e a ligandos que se ligam a células endoteliais cardiovasculares, tal como anticorpos que reconhecem antigénios de superfície de GPlb. Assim, de acordo com esta forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica para tratar estados cardiovasculares e/ou hipertensão 12

Numa forma de realização adicional, a TM liga-se a uma célula óssea. É aqui feita menção a ligandos que se ligam a osteoblastos para o tratamento de uma doença seleccionada de osteopetrose e osteoporose, incluindo calcitonina, e a ligandos que se ligam a osteoclastos, incluindo factores de diferenciação de osteoclastos (e. g., TRANCE ou RANKL ou OPGL) . Assim, de acordo com esta forma de realização, os referidos conjugados têm aplicação terapêutica para tratar estados ósseos.

As sequências de ligação a integrina lineares e cíclicas são um grupo preferido de TM da presente invenção. Muitas integrinas reconhecem a sequência peptídica tripla Arg-Gly-Asp (RGD) (Ruoslahti, 1996) . 0 motivo RGD é encontrado em mais de 100 proteínas incluindo fibronectina, tenascina, fibrinogénio e vitronectina. A interacção RGD integrina é explorada como um mecanismo conservado de entrada celular por muitos patogéneos incluindo coxsackievírus (Roivaninen et al., 1991) e adenovírus (Mathias et al., 1994). Foi demonstrado que as sequências peptídicas lineares e cíclicas, PLAEIDGIEL e CPLAEIDGIELC, respectivamente, se ligam e internalizam ADN em células que expressam a integrina oígPi (Schneider et al., 1999).

Outras TM da presente invenção incluem as identificadas por técnicas de apresentação de fagos, em particular aquelas que são direccionadas e internalizadas por células epiteliais das vias aéreas humanas. Estas incluem THALWHT linear e cíclica (Jost et al., 2001); LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC), LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) e LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (WU et al., 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Flórea et al., 2003); SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al. , 2004); Péptidos FSLSKPP, HSMQLST e STQAMFQ (Rahim et al., 2003). 13 0 local de clivagem de protease da presente invenção permite a clivagem (de um modo preferido, clivagem controlada) da proteína de fusão numa posição entre o componente de protease não citotóxica e o componente de TM. É esta reacção de clivagem que converte a proteína de fusão do polipéptido de cadeia simples num polipéptido de cadeia dupla ligado por persulfureto.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a TM liga-se através de um domínio ou sequência de aminoácidos que está localizado afastado do C- -terminal da TM. Por exemplo, 0 domínio de ligação relevante pode incluir um domínio interno ou uma sequência de aminoácidos localizada próximo do meio (i. e., da sequência peptídica linear) da TM. De um modo preferido, o domínio de ligação relevante está localizado próximo do N-terminal da TM, de um modo mais preferido, no N-terminal ou perto deste.

Numa forma de realização, a fusão polipeptídica de cadeia simples pode incluir mais do que um local de clivagem proteolítica. Contudo, quando existem dois ou mais desses locais, estes são diferentes, prevenindo assim substancialmente a ocorrência de múltiplos eventos de clivagem na presença de uma única protease. Noutra forma de realização, é preferido que a fusão polipeptídica de cadeia simples tenha um único local de clivagem de protease. A(s) sequência(s) de clivagem de protease pode(m) ser introduzida(s) (e/ou qualquer sequência de clivagem inerente removida) ao nível do ADN por meios convencionais, tal como mutagénese dirigida. 0 rastreio para confirmar a presença de sequências de clivagem pode ser realizado manualmente ou com o auxílio de software computacional (e. g., o programa MapDraw pela DNASTAR, Inc.) . 14

Embora possa ser utilizado qualquer local de clivagem de protease, os seguintes são preferidos:- (DDDDKj.) (IEGRi/IDGR;) (ENLYFQJ;G) (LVPR4.GS) (LEVLFQiGP).

Enterocinase Factor Xa TEV (Vírus da Gravura do Tabaco)

Trombina

PréCisão

Está também abrangido pela expressão local de clivagem de protease uma inteína, o qual é uma sequência de autoclivagem. A reacção de autoclivagem é controlável, por exemplo, através de variação da concentração do agente redutor presente.

Em utilização, o local de clivagem de protease é clivado e a região N-terminal (de um modo preferido, o N-terminal) da TM torna-se exposta. 0 polipéptido resultante tem uma TM com um domínio N-terminal ou um domínio interno que está substancialmente livre do remanescente do conjugado. Esta organização garante que o componente N-terminal (ou o domínio interno) da TM possa interagir directamente com um Local de Ligação numa célula alvo.

Numa forma de realização preferida, a TM e o local de clivagem de protease estão separados entre si na proteína de fusão no máximo em 10 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, no máximo em 5 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, em zero resíduos de aminoácidos. Assim, após clivagem do local de clivagem de protease, um conjugado é proporcionado com uma TM que tem um domínio de N-terminal que está substancialmente livre do remanescente do conjugado. Esta organização garante que o componente do N-terminal da Unidade de 15

Direccionamento possa interagir directamente com um Local de Ligação numa célula alvo.

Uma vantagem associada com o passo de activação mencionado acima é que a TM apenas se torna susceptível à degradação N-terminal uma vez ocorrida clivagem proteolítica da proteína de fusão. Além disso, a selecção de um local de clivagem de protease específico permite a activação selectiva da fusão polipeptídica numa conformação de cadeia dupla. A construção da fusão polipeptídica de cadeia simples da presente invenção coloca o local de clivagem de protease entre a TM e o componente de protease não citotóxica.

Na fusão de cadeia simples, a TM está localizada entre o local de clivagem de protease e o componente de translocação. Isto garante que a TM esteja ligada ao domínio de translocação (i. e., como ocorre com a holotoxina clostridial nativa), embora no caso da presente invenção a ordem dos dois componentes seja invertida vis-à-vis a holotoxina nativa. Uma vantagem adicional desta organização é que a TM está localizada numa região de ansa exposta da proteína de fusão, que tem efeitos estruturais mínimos na conformação da proteína de fusão. Quanto a isto, a referida ansa é referida de várias formas como o ligante, a ansa de activação, o ligante inter-domínio ou apenas a ansa exposta à superfície (Schiavo et al., 2000, Phys. Rev., 80, 717-766; Turton et al., 2002, Trends Biochem. Sei, 27, 552-558).

Numa forma de realização, no polipéptido de cadeia simples, o componente de protease não citotóxica e o componente de translocação estão ligados, em conjunto, através de uma ligação persulfureto. Assim, após clivagem do local de clivagem de protease, o polipéptido assume uma conformação de cadeia dupla, 16 em que os componentes de protease e de translocação permanecem ligados conjuntamente através da ligação persulfureto. Para este objectivo, é preferido que os componentes de protease e de translocação estejam separados entre si numa proteína de fusão da cadeia simples num máximo de 100 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, um máximo de 80 resíduos de aminoácidos, de um modo particularmente preferido, por um máximo de 60 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, por um máximo de 50 resíduos de aminoácidos.

Numa forma de realização, os componentes de protease não citotóxica formam uma ligação persulfureto com o componente de translocação da proteína de fusão. Por exemplo, o resíduo de aminoácido do componente de protease que forma a ligação persulfureto está localizado nos últimos 20, de um modo preferido, nos últimos 10 resíduos de aminoácidos do C-terminal do componente de protease. De modo semelhante, o resíduo de aminoácido dentro do componente de translocação que forma a segunda parte da ligação persulfureto pode estar localizado nos primeiros 20, de um modo preferido, nos primeiros 10 resíduos de aminoácidos do N-terminal do componente de translocação.

Alternativamente, no polipéptido da cadeia simples, o componente de protease não citotóxica e a TM podem ser ligados, em conjunto, através de uma ligação persulfureto. Quanto a isto, o resíduo de aminoácido da TM que forma a ligação persulfureto está, de um modo preferido, localizado afastado do N-terminal da TM, de um modo mais preferido, próximo do C-terminal da TM.

Numa forma de realização, o componente de protease não citotóxica forma uma ligação persulfureto com o componente de TM da proteína de fusão. Quanto a isto, o resíduo de aminoácido do componente de protease que forma a ligação persulfureto está, de 17 um modo preferido, localizado nos últimos 20, de um modo mais preferido, nos últimos 10 resíduos de aminoácidos do C-terminal do componente de protease. De modo semelhante, o resíduo de aminoácido dentro do componente de TM que forma a segunda parte da ligação persulfureto está, de um modo preferido, localizado nos últimos 20, de um modo mais preferido, nos últimos 10 resíduos de aminoácidos do C-terminal da TM.

As organizações da ligação persulfureto acima têm a vantagem de os componentes de protease e de translocação estarem organizados de um modo semelhante àquele da neurotoxina clostridial nativa. A título comparativo, com referência à sequência de aminoácidos primária para a neurotoxina clostridial nativa, os respectivos resíduos de aminoácidos de cisteína estão separados entre si por 8 e 27 resíduos de aminoácidos - retirado de Popoff, MR e Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Capítulo 9, em The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer:-

Serotipo1 Sequência Comprimento "Nativo" entre C-C BoNT/Al CVRGIITSKTKS—LDKGYNKALNDLCI 23 ΒΟΝΤ/Α2 CVRGIIPFKTKS—LDEGYNKALNDLC 23 BoNT/B CKSVKAPG IC| 8 BoNT/C CHKAIDGRS LYNKTLDC 15 BoNT/D CLRLTK NSRDDSTC 12 BoNT/E CKN-IVSVK--GIRK-^SIC 13 BoNT/F CKS-V1PRK GTKAPP-RLC 15 BoNT/G CKPVMYKNT GKSE QC 13 TeNT CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 27 1 Informação apenas de estirpes proteolíticas 18 A proteína de fusão pode compreender um ou mais marcadores de purificação que estão localizados numa posição N terminal relativamente ao componente de protease e/ou numa posição C terminalrelativamente ao componente de translocação.

Embora possa ser utilizado qualquer marcador de purificação, os seguintes são preferidos marcador His (e. g., 6 x histidina) , de um modo preferido, como um marcador C-terminal e/ou N-terminal marcador MBP (proteína de ligação a maltose), de um modo preferido, como um marcador N-terminal marcador GST (glutationo-S-transferase), de um modo preferido, como um marcador N-terminal marcador His-MBP, de um modo preferido, como um marcador N-terminal marcador GST-MBP, de um modo preferido, como um marcador N-terminal marcador Tiorredoxina, de um modo preferido, como um marcador N-terminal marcador CBD (domínio de ligação a quitina), de um modo preferido, como um marcador N-terminal. De acordo com uma forma de realização adicional da presente invenção, uma ou mais moléculas espaçadoras peptídicas podem ser incluídas na proteína de fusão. Por exemplo, um espaçador peptídico pode ser utilizado entre um marcador de purificação e o resto da molécula da proteína de fusão (e. g., entre um marcador de purificação N-terminal e um componente de protease da presente invenção; e/ou entre um marcador de purificação C-terminal e um componente de translocação da presente invenção). Um espaçador peptídico pode também ser utilizado 19 entre a TM e os componentes de translocação da presente invenção.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é proporcionada uma sequência de ADN que codifica o polipéptido de cadeia simples mencionado acima.

Num aspecto preferido da presente invenção, a sequência de ADN é preparada como parte de um vector de ADN, em que o vector compreende um promotor e um terminador.

Pode ser utilizada uma variedade de diferentes moléculas espaçadoras em qualquer das proteínas de fusão da presente invenção. Os exemplos de tais moléculas espaçadoras incluem GS15, GS20, GS25 e Hx27. A presente requerente verificou inesperadamente que as proteínas de fusão da presente invenção podem demonstrar uma actividade de ligação melhorada para célula alvo quando o tamanho do espaçador é seleccionado de modo que (em utilização) o C-terminal da TM e o N-terminal do componente de translocação estejam separados um do outro por 40-105 angstrõms, de um modo preferido, por 50-100 angstrõms e, de um modo mais preferido, por 50-90 angstrõms. Noutra forma de realização, os espaçadores preferidos têm uma sequência de aminoácidos de 11-29 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, 15-27 resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, 20-27 resíduos de aminoácidos. Os espaçadores adequados podem ser identificados rotineiramente e obtidos de acordo com Crasto, CJ. e Feng, J.A. (2000) Maio; 13(5); pp. 309-312 - ver também http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html. 20

Numa forma de realizaçao preferida, o vector tem um promotor seleccionado de:

Condição típica de indução 0,2 mM (0,05 - 2,0 mM) 0,2% (0, 002 - 0,4%) 0,2 mM (0,05 - 2,0 mM)

Promotor tac (híbrido) AraBAD Operador T7-lac

Agente indutor IPTG L-arabinose IPTG A construção de ADN da presente invenção é, de um modo preferido, concebida in silico e depois sintetizada por técnicas convencionais de síntese de ADN. A informação de sequência de ADN mencionada acima é opcionalmente modificada para a utilização de codão de acordo com o sistema final de expressão de célula hospedeira (e. g., E. coli) que é para ser utilizado. A estrutura básica do ADN é rastreada, de um modo preferido, para qualquer sequência de ácido nucleico inerente, a qual quando transcrita e traduzida produziria uma sequência de aminoácidos que corresponde ao local de clivagem de protease codificado pela sequência codificante do segundo péptido. Este rastreio pode ser realizado manualmente ou com o auxílio de software informático (e. g., o programa MapDraw pela DNASTAR, Inc.).

De acordo com uma forma de realização adicional da presente invenção, é proporcionado um método de preparação de um agente não citotóxico, compreendendo:- 21 a. contactar uma proteína de fusão polipeptídica de cadeia simples da invenção com uma protease capaz de clivar o local de clivagem de protease; b. clivar o local de clivagem de protease e formar assim a uma proteína de fusão de cadeia dupla.

Este aspecto proporciona um polipéptido de cadeia dupla que mimetiza de forma geral a estrutura da holotoxina clostridial. Em mais detalhe, o polipéptido de cadeia dupla resultante tem tipicamente uma estrutura em que:- a. a primeira cadeia compreende a protease não citotóxica, ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica de uma célula alvo; b. a segunda cadeia compreende a TM e o domínio de translocação que é capaz de translocação a protease ou o fragmento de protease de dentro de um endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol da célula alvo; e a primeira e a segunda cadeia estão ligadas, em conjunto, por persulfureto.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado a utilização de um polipéptido de cadeia simples ou de cadeia dupla da invenção, para o fabrico de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar um estado clínico seleccionado do grupo consistindo em hipersecreção de muco, asma e/ou doença pulmonar obstrutiva crónica, neoplasia endócrina incluindo MEN, tirotoxicose e outras doenças dependentes de hipersecreções a partir da tiróide; acromegalia, hiperprolactinemia, doença de Cushings e outras doenças dependentes da hipersecreção da 22 pituitária anterior; hiperandrogenismo, anovulação crónica e outro doença associadas com sindrome do ovário poliquistico, alergias (rinite alérgica sazonal (febre dos fenos), conjuntivite alérgica, rinite vasomotora e alergia alimentar), eosinofilia, asma, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, colite ulcerosa, doença de Crohn, hemorroidas, prurido, glomerulonefrite, hepatite, pancreatite, gastrite, vasculite, miocardite, psoriase, eczema, fibrose crónica induzida por radiação, cicatrização pulmonar e outros distúrbios fibróticos, hipersecreção de muco de células secretoras de muco localizadas no tracto alimentar, em particular localizadas no cólon, miastenia grave, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, transplante de órgãos, transplante de tecidos, transplante de fluidos, doença de Graves, tirotoxicose, diabetes auto-imune, anemia hemolitica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatite auto-imune crónica, gastrite auto-imune, anemia perniciosa, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, sindrome de Sjogren, cirrose biliar primária, polimiosite, escleroderma, esclerose sistémica, penfigóide vulgar, pênfigo bolhoso, miocardite, cardite reumática, glomerulonefrite (tipo de Goodpasture), uveite, orquite, colite ulcerosa, vasculite, gastrite atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo 1, estados cardiovasculares e/ou hipertensão, e estados ósseos, tais como osteopetrose e osteoporose.

Em utilização, os polipéptidos da presente invenção são tipicamente utilizados na forma de uma composição farmacêutica em associação com um veiculo, diluente e/ou excipiente farmacêutico, embora a forma exacta da composição possa ser adaptada ao modo de administração. A administração é, de um modo preferido, a um mamífero, de um modo mais preferido, a um humano. 23

Os polipéptidos podem, por exemplo, ser utilizados na forma de um aerossol ou uma solução de nebulização para inalação ou uma solução estéril para administração parentérica, administração intra-articular ou administração intracraniana.

Para tratar alvos endócrinos é preferida a injecção i.v., injecção directa em glândula ou aerossolização para distribuição pulmonar; para tratar alvos celulares inflamatórios é preferida a injecção i.v., injecção subcutânea ou administração por penso superficial ou aerossolização para distribuição pulmonar; para tratar alvos exócrinos é preferida a injecção i.v., ou injecção directa ou administração directa à glândula ou aerossolização para distribuição pulmonar; para tratar alvos imunológicos é preferida a injecção i.v. ou a injecção em tecidos específicos, e. g., timo, medula óssea ou tecido linfático; para tratar alvos cardiovasculares é preferida a injecção i.v.; e para tratar alvos ósseos é preferida a injecção i.v. ou a injecção directa. Nos casos de injecção i.v., isto deve também incluir a utilização de sistemas de bomba. No caso de composições para tratar alvos neuronais, pode ser utilizada a injecção na espinha (e. g., epidural ou intratecal) ou bombas interiores.

As gamas de dosagem para administração dos polipéptidos da presente invenção são aquelas para produzir o efeito terapêutico desejado. Deve ser entendido que a gama de dosagem requerida depende da natureza precisa dos componentes, da via de administração, da natureza da formulação, da idade do doente, da natureza, extensão ou gravidade do estado do doente, contra indicações, se alguma, e avaliação do médico assistente.

As dosagens diárias adequadas são na gama de 0,0001-1 mg/kg, de um modo preferido, 0,0001-0,5 mg/kg, de um modo mais 24 preferido, 0,002-0,5 mg/kg e, de um modo particularmente preferido, 0,004- 0,5 mg/kg. A dosagem unitária varia de menos de 1 micrograma a 30 mg, mas tipicamente será na região de 0,01 a 1 mg por dose, a qual pode ser administrada diariamente ou, de um modo preferido, menos frequentemente, semanalmente ou semestralmente.

Um regime de dosagem particularmente preferido é baseado em 2,5 ng de proteína de fusão como a dose lx por kg de doente. Quanto a isto, as dosagens preferidas são na gama de lx-lOOx (i. e., 2,5 - 250 ng). Esta gama de dosagem é significativamente menor (i. e., pelo menos 10 vezes, tipicamente 100 vezes menor) do que seria utilizada com outros tipos de moléculas terapêuticas. Além disso, a diferença mencionada acima é significativamente ampliada quando a mesma comparação é feita numa base molar - isto é porque as proteínas de fusão da presente invenção têm um peso molecular consideravelmente maior do que os agentes terapêuticos de molécula "pequena" convencionais.

Contudo, são esperadas grandes variações na dosagem requerida dependendo da natureza precisa dos componentes e das diferentes eficiências de várias vias de administração. Por exemplo, espera-se que a administração oral requeira dosagens mais elevadas do que a administração por injecção intravenosa.

As variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas utilizando rotinas empíricas convencionais para optimização, como é bem entendido na técnica.

As composições adequadas para injecção podem ser na forma de soluções, suspensões ou emulsões, ou pós secos que são 25 dissolvidos ou suspensos num veiculo adequado antes da utilização.

As formas de dosagem unitária fluidas são preparadas tipicamente utilizando um veículo estéril apirógeno. Os ingredientes activos, dependendo do veículo e da concentração utilizados, podem ser dissolvidos ou suspensos no veículo.

As soluções podem ser utilizadas para todas as formas de administração parentérica e são particularmente utilizadas para a injecção intravenosa. Na preparação de soluções, os componentes podem ser dissolvidos no veículo, se necessário a solução tornada isotónica por adição de cloreto de sódio e esterilizada por filtração através de um filtro estéril, utilizando técnicas assépticas antes de encher em frasquinhos ou ampolas estéreis adequadas e selagem. Alternativamente, se a estabilidade da solução for adequada, a solução nos seus recipientes selados pode ser esterilizada por autoclavagem.

Vantajosamente, podem ser dissolvidos no veículo aditivos, tais como agentes tamponantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes ou bactericidas, agentes de suspensão ou emulsionantes e/ou anestésicos locais. Pós secos que são dissolvidos ou suspensos num veículo adequado antes da utilização podem ser preparados por enchimento da substância farmacológica pré-esterilizada e outros ingredientes num recipiente estéril, utilizando técnica asséptica numa área estéril.

Alternativamente, os componentes (i. e., agente mais inibidor) e outros ingredientes podem ser dissolvidos num veículo aquoso, a solução é esterilizada por filtração e 26 distribuída em recipientes adequados, utilizando técnica asséptica numa área estéril. 0 produto é depois liofilizado e os recipientes são selados assepticamente.

As suspensões parentéricas adequadas para injecção intramuscular, subcutânea ou intradérmica são preparadas substancialmente do mesmo modo, excepto que os componentes estéreis são suspensos no veículo estéril, em vez de serem dissolvidos, e a esterilização não pode ser realizada por filtração. Os componentes podem ser isolados numa estado estéril ou, alternativamente, podem ser esterilizados após isolamento, e. g., por irradiação gama.

Vantajosamente, um agente de suspensão, por exemplo a polivinilpirrolidona, é incluído na composição ou composições para facilitar a distribuição uniforme dos componentes.

As composições adequadas para administração através do tracto respiratório incluem aerossóis, soluções de nebulização ou pós microfinos para insuflação. No último caso, é preferido um tamanho de partícula de menos de 50 mícrones, especialmente menos de 10 mícrones. Tais composições podem ser preparadas de um modo convencional e utilizadas, em conjunto, com dispositivos de administração convencionais.

Secção de Definições

Unidade de Direccionamento (TM) significa qualquer estrutura química associada com um agente que interactua funcionalmente com um Local de Ligação para provocar uma associação física entre o agente e a superfície de uma célula alvo. No contexto da presente invenção, a célula alvo é qualquer célula, excepto um 27 aferente sensorial nociceptivo. A expressão TM abrange qualquer molécula (i. e., uma molécula natural ou uma sua variante modificada quimicamente/fisicamente) que é capaz de ligação a um Local de Ligação na célula alvo, cujo Local de Ligação é capaz de internalização (e. g., formação de endossoma) - também referida como endocitose mediada por receptor. A TM pode possuir uma função de translocação da membrana endossomal, caso esse em que não precisam estar presentes componentes separados de TM e de domínio de translocação num agente da presente invenção. A TM da presente invenção liga-se (de um modo preferido, liga-se especificamente) a uma célula alvo. A expressão não citotóxica significa que a molécula de protease em questão não mata a célula alvo à qual foi re-direccionada. A protease da presente invenção abrange todas as proteases não citotóxicas naturais que são capazes de clivar uma ou mais proteínas do aparelho de fusão exocítica em células eucarióticas. A protease da presente invenção é, de um modo preferido, uma protease bacteriana (ou um seu fragmento) . De um modo mais preferido, a protease bacteriana é seleccionada do género Clostridium ou Neisseria (e. g., um cadeia L clostridial ou uma protease de IgA neisserial, de um modo preferido, de N. gonorrhoeae) . A presente invenção abrange também proteases não citotóxicas modificadas, as quais incluna SEQuências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ou resíduos de aminoácidos sintéticos, 28 desde que as proteases modificadas ainda demonstrem a actividade de protease mencionada acima. A protease da presente invenção demonstra, de um modo preferido, uma actividade de metaloprotease ou de serina (e. g., actividade de endopeptidase) . A protease é, de um modo preferido, especifica para uma proteína SNARE (e. g., SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP ou sintaxina). É feita menção particular aos domínios de protease de neurotoxinas, por exemplo, os domínios de protease de neurotoxinas bacterianas. Assim, a presente invenção abrange a utilização de domínios de neurotoxina, os quais ocorrem na natureza, assim como versões preparadas de forma recombinante das referidas neurotoxinas naturais.

As neurotoxinas exemplificativas são produzidas por clostridia e a expressão neurotoxina clostridial abrange neurotoxinas produzidas por serotipos A-G de C. tetani (TeNT) e C. botulinum (BoNT) , assim como as neurotoxinas de tipo BoNT intimamente relacionadas, produzidas de C. barati e C. butyricum. As abreviaturas mencionadas acima são utilizadas ao longo da presente descrição. Por exemplo, a nomenclatura BoNT/A denota a fonte de neurotoxina como BoNT (serotipo A). A nomenclatura correspondente aplica-se a outros serotipos de BoNT. A expressão fragmento de cadeia L significa um componente da cadeia L de uma neurotoxina, cujo fragmento demonstra uma actividade de metaloprotease e é capaz de clivar proteoliticamente uma proteína associada à membrana plasmática e/ou uma vesícula em exocitose celular. 29

Um Domínio de Translocação é uma molécula que permite a translocação de uma protease (ou um seu fragmento) para uma célula alvo, de modo a ocorrer uma expressão funcional da actividade de protease dentro do citosol da célula alvo. 0 facto de qualquer molécula (e. g., uma proteína ou um péptido) possuir a função de translocação requerida da presente invenção pode ser confirmado através de qualquer um de vários de ensaios convencionais.

Por exemplo, Shone C. (1987) descreve um ensaio in vitro que utiliza lipossomas, o qual é desafiado com uma molécula de teste. A presença da função de translocação requerida é confirmada por libertação a partir dos lipossomas de K+ e/ou NAD marcado, que podem ser prontamente monitorizados [ver Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol: 167(1): pp. 175-180].

Um exemplo adicional é proporcionado por Blaustein R. (1987), o qual descreve um simples ensaio in vitro que utiliza membranas planares de bicamada fosfolipídica. As membranas são desafiadas com uma molécula de teste e a função de translocação requerida é confirmada por um aumento na conductância através das referidas membranas [ver Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, N° 1: pp. 115-120].

Metodologia adicional para permitir a avaliação de fusão membranar e assim a identificação de Domínios de Translocação adequados para utilização na presente invenção é proporcionada por Methods in Enzymology, Vol 220 e 221, Membrane Fusion Techniques, Partes A e B, Academic Press 1993. O domínio de translocação é, de um modo preferido, capaz de formação de poros permeáveis a iões em membranas lipídicas sob condições de pH baixo. De um modo preferido, verificou-se que se 30 deve apenas utilizar aquelas porções da molécula proteica capaz da formação de poro dentro da membrana endossomal. 0 Dominio de Translocação pode ser obtido a partir de uma fonte de proteína microbiana, em particular, a partir de uma fonte de proteína bacteriana ou virai. Assim, numa forma de realização, o Domínio de Translocação é um domínio de translocação de uma enzima, tais como uma toxina bacteriana ou proteína virai.

Está bem documentado que determinados domínios de moléculas de toxinas bacterianas são capazes de formar tais poros. É também conhecido que determinados domínios de translocação de proteínas de fusão membranares expressos em vírus, são capazes de formar tais poros. Tais domínios podem ser utilizados na presente invenção. 0 domínio de translocação pode ser de uma origem clostridial, nomeadamente o domínio HN (ou um seu componente funcional). HN significa uma porção ou fragmento da cadeia H de uma neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente à metade amino-terminal da cadeia H, ou o domínio correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. É preferido que a cadeia H careça substancialmente da função de ligação natural do componente Hc da cadeia H. Quanto a isto, a função Hc pode ser removida por deleção da sequência de aminoácidos de Hc (ao nível da síntese de ADN ou ao nível pós-síntese por tratamento com nuclease ou protease). Alternativamente, a função Hc pode ser inactivada por tratamento químico ou biológico. Assim, a cadeia H é, de um modo preferido, incapaz de ligação ao Local de Ligação numa célula alvo à qual se liga a neurotoxina clostridial nativa (i. e., holotoxina). 31

Numa forma de realização, o domínio de translocação é um domínio HN (ou um seu fragmento) de uma neurotoxina clostridial. Os exemplos de Domínios Clostridiais de Translocação adequados incluem:-

Neurotoxina botulínica de tipo A - resíduos de aminoácidos (449-871) neurotoxina botulínica de tipo B - resíduos de aminoácidos (441-858) Neurotoxina botulínica de tipo C - resíduos de aminoácidos (442-866) Neurotoxina botulínica de tipo D - resíduos de aminoácidos (446-862) Neurotoxina botulínica de tipo E - resíduos de aminoácidos (423-845) Neurotoxina botulínica de tipo F - resíduos de aminoácidos (440-864) Neurotoxina botulínica de tipo G - resíduos de aminoácidos (442-863) Neurotoxina do tétano - resíduos de aminoácidos (458-879)

Para detalhes adicionais na base genética da produção de toxina em Clostridium botulinum e C. tetani, faz-se referência a Henderson et al. (1997) em The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic Press. A expressão HN abrange porções naturais da neurotoxina HN e porções modificadas de HN tendo sequências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ou resíduos de aminoácidos sintéticos, desde que as porções modificadas de HN demonstram ainda a função de translocação mencionada acima. 32

Alternativamente, o Domínio de Translocação pode ser de uma origem não clostridial (ver a Tabela 1). Os exemplos de origens não clostridiais do Domínio de Translocação incluem, mas não estão restritos ao, domínio de translocação da toxina da difteria [0=Keefe et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al.r J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; e London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51], o domínio de translocação da exotoxina de tipo A de Pseudomonas [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], os domínios de translocação da toxina antraz [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) 93, 8437-8442], uma variedade de péptidos fusogénicos ou hidrofóbicos da função de translocação [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; e Wagner et al. (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938] e péptidos anfifílicos [Murata et al. (1992) Biochem., 31, pp. 1986-1992] . O Domínio de Translocação pode espelhar o Domínio de Translocação presente numa proteína natural ou pode incluir variações de aminoácidos desde que as variações não destruam a capacidade de translocação do Domínio de Translocação.

Os exemplos particulares de Domínios de Translocação virais adequados para utilização na presente invenção incluem determinados domínios de translocação de proteínas de fusão membranar expressas em vírus. Por exemplo, Wagner et al. (1992) e Murata et al. (1992) descrevem a função de translocação (i. e., fusão e vesiculação membranar) de uma variedade de péptidos fusogénicos e anfifílicos derivados da região N-terminal da hemaglutinina do vírus da gripe. Outras proteínas de fusão membranar expressas em vírus, conhecidas por terem a actividade de translocação desejada, são um domínio de translocação de um péptido fusogénico do vírus da floresta de Semliki (SFV), um domínio de translocação da glicoproteína G do vírus de estomatite vesicular (VSV), um domínio de translocação 33 da proteína F do vírus SER e um domínio de translocação da glicoproteína do envelope do vírus Espumoso. As proteínas Aspike codificadas em vírus têm aplicação particular no contexto da presente invenção, por exemplo, a proteína EI de SFV e a proteína G da proteína G de VSV. A utilização dos Domínios de Translocação listados na Tabela 1 inclui a utilização das suas variantes de sequência. Uma variante pode compreender uma ou mais substituições conservadoras de ácido nucleico e/ou deleções ou inserções de ácidos nucleicos, com a condição da variante possuir a função de translocação requerida. Uma variante pode também compreender uma ou mais substituições de aminoácidos e/ou deleções ou inserções de aminoácidos, desde que a variante possua a função de translocação requerida.

Tabela 1

Fonte do Domínio de Translocação Resíduos de Aminácidos Referências Toxina da Difteria 194-380 Silverman et ai., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532 London, E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51 Domínio II da exotoxina de Pseudomonas 405-613 Prior et al., 1992, Biochemistry 31, 3555-3559 Kihara e Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538 34 (continuação)

Fonte do Domínio de Translocação Resíduos de Aminácidos Referências Hemaglutinina do GLFGAIAGFIEN Plank et al.r 1994, J. Biol. vírus da gripe GWE GMIDGWYG e suas variantes Chem. 269, 12918-12924 Wagner et al., 1992, PNAS, 89, 7934-7938 Murata et al., 1992, Biochemistry 31, 1986-1992 Proteína Domínio de Kielian et al., 1996, J Cell fusogénica do Translocação Biol. 134(4), 863-872 vírus da Floresta de Semliki Glicoproteína G do Vírus de 118-139 Yao et al., 2003, Virology 310(2), 319-332 Estomatite Vesicular Proteína F do Domínio de Seth et al., 2003, J Virol. vírus SER Translocação 77(11) 6520-6527 Glicoproteína do Domínio de Picard-Maureau et al., 2003, J envelope do vírus Translocação Virol. 77(8) 4722-4730 Espumoso SEQ ID N2 SEQ ID N° 1 Sequência de ADN da LC/A SEQ ID N° 2 Sequência de ADN da hn/a SEQ ID N° 3 Sequência de ADN da LC/B SEQ ID N° 4 Sequência de ADN da hn/b 35

Sequência de ADN do LC/C Sequência de ADN do hn/c Sequência de ADN do CP PARl-ligante B Sequência de ADN do CP PTH-ligante C Sequência de ADN do CP PARl-fusão B Sequência de Proteína do CP PARl-fusão B Sequência de ADN do CP PTH-fusão C Sequência de Proteína do CP PTH-fusão C Sequência de ADN do CP RGD-ligante C Sequência de ADN do CP RGD-fusão C Sequência de Proteína do CP RGD-fusão C Sequência de ADN do CP RGDcíclico-ligante C Sequência de ADN do CP RGDcíclico-fusão C Sequência de Proteína do CP RGDcíclico -fusão C Sequência de ADN do CP THALWHT-ligante C Sequência de ADN do CP THALWHT-fusão C Sequência de Proteína do CP THALWHT-fusão C Sequência de ADN do CP THALWHTcíclico- ligante C Sequência de ADN do CP THALWHTcíclico- fusão C Sequência de Proteína do CP THALWHTcíclico-fusao C Sequência de ADN do CP ANP-ligante C Sequência de ADN do CP ANP-fusão C Sequência de Proteína do CP ANP-fusão C Sequência de ADN do CP VIP-ligante C Sequência de ADN do CP VIP-fusão C Sequência de Proteína do CP VIP-fusão C

Sequência de ADN do CP do péptido libertador de

gastrina-ligante C

Sequência de ADN do CP do péptido libertador de

gastrina-fusão C

Sequência de Proteína do CP do péptido libertador de gastrina-fusão C 36

EXEMPLOS

Exemplo 1 — Preparação de clones com estrutura básica de LC/B e Hn/B 0 seguinte processo cria os fragmentos LC e HN para utilização como o componente de estrutura básica para a expressão de fusão multidominio. Este exemplo é baseado na preparação de um clone baseado no serotipo B (SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4) , embora os processos e os métodos sejam igualmente aplicáveis aos outros serotipos (ilustrados pela lista de sequências para o serotipo A (SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2) e serotipo C (SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6)).

Preparação de vectores de clonagem e expressão pCR 4 (Invitrogen) é o vector de clonagem padrão escolhido, escolha essa devido à falta de sequências de restrição dentro do vector e locais adjacentes do iniciador de sequenciação para fácil confirmação da construção. 0 vector de expressão é baseado no vector de expressão pMAL (NEB) que tem as sequências de restrição desejadas dentro do local de clonagem múltipla na orientação correcta para a inserção da construção (BamHI-SalI-Pstl-HindlII). Um fragmento do vector de expressão foi removido para criar um plasmídeo não mobilizável e foi introduzida uma variedade de diferentes marcadores de fusão para aumentar as opções de purificação. 37

Preparação da inserção de protease (e. g.r LC/B) 0 LC/B (SEQ ID N° 3) é criado por um de dois modos: A sequência de ADN é concebida por retro-tradução da sequência de aminoácidos de LC/B (obtida de fontes de base de dados disponíveis qratuitamente, tais como GenBank (número de acesso P 10844) ou Swissprot (acesso locus BXB_CLOBO) utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, tradução inversa EditSeq best E. coli (DNASTAR Inc.) ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). As sequências de reconhecimento SamHI/Sail são incorporadas nas extremidades 5' e 3', respectivamente, da sequência que mantém a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software, tais como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Todas as sequências de clivagem que se verificarem ser comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem, são removidas manualmente a partir da sequência codificante proposta, assegurando que é mantida a utilização de codão comum de E. coli. A utilização de codão de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a razão entre o conteúdo de GC em % e a utilização de codão avaliada com referência a tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN optimizada contendo a grelha de leitura aberta (ORF) de LC/B é depois comercialmente sintetizada (por exemplo, através de Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4. 0 método alternativo é utilizar amplificação por PCR a partir de uma sequência de ADN existente com as sequências de 38 enzima de restrição Bamhl e sall incorporadas nos iniciadores de PCR 5' e 3', respectivamente. Os iniciadores oligonucleotidicos complementares são sintetizados quimicamente por um fornecedor (por exemplo, MWG ou Sigma-Genosys) de modo que cada par tenha a capacidade para hibridar com as cadeias opostas (extremidades 3' a apontar no "sentido" um do outro) que flanqueiam o trecho de ADN alvo de Clostridium, um oligonucleot ido para cada uma das duas cadeias de ADN. Para gerar um produto de PCR, o par de iniciadores oligonucleotidicos curtos, específicos para a sequência de ADN de Clostridium, é misturado com o molde de ADN de Clostridium e outros componentes de reacção e colocados numa máquina (a "máquina de PCR") que pode alterar a temperatura de incubação do tubo de reacção automaticamente, fazendo ciclos entre aproximadamente 94 °C (para denaturação) , 55 °C (para emparelhamento oligonucleotídico) e 72 °C (para síntese). Outros reagentes requeridos para a amplificação de um produto de PCR incluem uma ADN polimerase (tais como a Taq ou Pfu polimerase) , cada uma das quatro unidades de construção dNTP nucleotídicas de ADN em quantidades equimolares (50-200 μΜ) e um tampão apropriado para a enzima optimizado para a concentração de Mg2+ (0,5-5 mM). 0 produto de amplificação é clonado em pCR4 utilizando TOPO TA Cloning para produtos de Taq PCR ou Zero Blunt TOPO TA Cloning para produtos de Pfu PCR (ambos kits comercialmente disponíveis da Invitrogen). 0 clone resultante é verificado por sequenciação. Quaisquer sequências de restrição adicionais que não forem compatíveis com o sistema de clonagem são depois removidas utilizando mutagénese dirigida (por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)). 39

Preparação de inserção de translocação (e. g., HN) 0 Hn/B (SEQ ID N° 4) é criado por um de dois modos: A sequência de ADN é concebida por retro-tradução da sequência de aminoácidos de HN/B (obtida de fontes de base de dados disponíveis gratuitamente, tais como GenBank (número de acesso P 10844) ou Swissprot (acesso locus BXB_CLOBO) utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, tradução inversa EditSeq best E. coli (DNASTAR Inc.) ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Uma sequência de restrição PstI adicionada ao N-terminal e Xbal-codão de terminação-fíindIII ao C-terminal assegura que é mantida a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software, tal como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Todas as sequências de clivagem que se verificarem ser comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem são removidas manualmente a partir da sequência codificante proposta, assegurando que é mantida a utilização de codão comum de E. coli. A utilização de codão de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a razão entre o conteúdo de GC em % e a utilização de codão avaliada com referência a tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004). Esta sequência de ADN optimizada é depois comercialmente sintetizada (por exemplo, através de Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4.

O método alternativo é utilizar amplificação por PCR a partir de uma sequência de ADN existente com sequências de enzimas de restrição PstI e Xbal-codão de terminação-HindIII 40 incorporadas nos iniciadores de PCR 5' e 3', respectivamente. A amplificação por PCR é realizada como descrita acima. 0 produto de PCR é introduzido no vector pCR4 e verificado por sequenciação. Quaisquer sequências de restrição adicionais que não forem compatíveis com o sistema de clonagem são depois removidas utilizando mutagénese dirigida (por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)).

Exemplo 2 - Preparação de uma proteína de fusão

LC/B-PAR1-Hn/B

Preparação da inserção ligante-PARl-espaçador 0 ligante LC-HN pode ser concebido a partir do primeiro princípio, utilizando a informação de sequência existente para o ligante como molde. Por exemplo, o ligante serotipo B definido como a região polipeptídica inter-domínio que existe entre as cisteínas da ponte persulfureto entre LC e Hn, dentro da qual ocorre activação proteolítica. Esta informação de sequência está disponível gratuitamente a partir de fontes de base de dados disponíveis, tais como GenBank (número de acesso P10844) ou Swissprot (locus de acesso BXB_CLOBO). É neste ligante que um local de Enterocinase, PARI e um espaçador são incorporados e utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, tradução inversa EditSeq best E. coli (DNASTAR Inc.) ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)), é determinada a sequência de ADN que codifica a região ligante-ligando-espaçador. Os locais de restrição são depois incorporados na sequência de ADN e podem ser organizados como BamHI-SalI-ligante-local de protease-PARl-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-PindlII (SEQ ID N° 7). É importante assegurar que a grelha de leitura correcta seja 41 mantida para o espaçador, PARI e sequências de restrição e que a sequência XbaI não seja precedida pelas bases, TC que resultaria em metilação DAM. A sequência de ADN é rastreada para sequências de restrição incorporadas e quaisquer sequências adicionais são removidas manualmente a partir da sequência remanescente assegurando que é mantida a utilização comum de codão de E. coli. A utilização de codão de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon

Usage Analyser (Geneart) e a razão entre o conteúdo de GC em % e a utilização de codão avaliada com referência a tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN optimizada é depois comercialmente sintetizada (por exemplo, através de Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4.

Preparação da fusão LC/B-PAR1-HN/B

De modo a criar a construção LC-ligante-PARl-espaçador-HN (SEQ ID N° 9), o vector pCR4 que codifica o ligante (SEQ ID N° 7) é clivado com enzimas de restrição BamEI + SalI. Este vector clivado serve depois como o vector recipiente para inserção e ligação do ADN de LC/B (SEQ ID N° 3) clivado com BamHI + SalI. O ADN plasmidico resultante é depois clivado com enzimas de restrição PstI + Xbal e serve como vector recipiente para inserção e ligação do ADN de HN/B (SEQ ID N° 4) clivado com PstI + Xbal. A construção final contém a ORF LC-ligante-PARl-espaçador-HN (SEQ ID N° 9) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 10. 42

Exemplo 3 - Preparação da proteína de fusão LC/C-PTH-Hc/C 0 ligante LC-HN é concebido utilizando os métodos descritos no exemplo dois, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como BamHI-SalI-ligante-local de protease-PTH-Miel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-fíindl11 (SEQ ID N° 8) . A fusão LC/C-PTH-HN/c é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e Hn/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no exemplo um e construídos utilizando métodos descritos no exemplo dois. A construção final contém a ORF LC-ligante-PTH-espaçador-HN (SEQ ID N° 11) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 12.

Exemplo 4 - Preparação e purificação da proteína de fusão LC/C-RGD-Hn/c 0 ligante LC-HN é concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como o BamHI-SalI-ligante-local de protease-RGD-Miel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID N° 13). A fusão LC/C-RGD-Hn/C é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e Hn/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no Exemplo 1 e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-RGD-espaçador-HN (SEQ ID N° 14) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 15. 0 plasmídeo de expressão resultante, pMAL LC/C-RGD-HN/c é transformado em E. coli BL21 para expressão recombinante da proteína. 43

Expressão da proteína de fusão LC/C-RGD-HN/C

A expressão da proteína de fusão LC/C-RGD-HN/C é realizada utilizando o seguinte protocolo. Inocular 100 mL de TB modificado contendo 0,2% de glucose e 100 pg/mL de ampicilina num balão de 250 mL, com uma única colónia da estirpe de expressão de LC/C-RGD-HN/C. Cultivar a cultura a 37 °C, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 L de TB modificado contendo 0,2% de glucose e 100 pg/mL de ampicilina num balão de 2 L com 10 mL de cultura, de um dia para o outro. Cultivar as culturas a 37 °C até ser atingido uma ODeoonm aproximadamente de 0,5, a cujo ponto a temperatura é reduzida para 16 °C. Após 1 hora, induzir as culturas com 1 mM de IPTG e cultivar a 16 °C durante mais 16 horas. A Figura 1 mostra a proteína expressa em E. coli como analisada por SDS-PAGE.

Purificação da proteína de fusão LC/C-RGD-HN/c

Descongelar tubo Falcon contendo 25 mL de 50 mM HEPES pH 7, 2, 200 mM de NaCl e aproximadamente 10 g de pasta de células E. coli BL21. Sonicar a pasta de células em gelo durante 30 segundos ligado, 30 segundos desligado, durante 10 ciclos a uma potência de 22 mícrones, assegurando que a amostra permanece fresca. Centrifugar as células lisadas a 18000 rpm, 4 °C durante 30 minutos. Carregar o sobrenadante numa coluna quelante carregada com NiSCp a 0,1 M (coluna de 20-30 mL é suficiente) equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl. Utilizando um gradiente descontínuo de 10 e 40 mM de imidazole, remover a proteína ligada não específica e eluir a proteína de fusão com imidazole a 100 mM. Dialisar a proteína de fusão eluída contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7, 2, 200 mM de NaCl a 4 °C, de um dia para o outro, e medir a OD da proteína de fusão 44 dialisada. Adicionar 1 unidade de factor Xa por 100 pg de a proteína de fusão e incubar estaticamente a 25 °C, de um dia para o outro. Carregar numa coluna quelante carregada com NiSCq a 0,1 M (coluna de 20-30 mL é suficiente) equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7, 2, 200 mM de NaCl. Lavar a coluna até linha de base com 50 mM de HEPES pH 7, 2, 200 mM de NaCl. Utilizando um gradiente descontínuo de 10 e 40 mM de imidazole, remover a proteína ligada não específica e eluir a proteína de fusão com imidazole a 100 mM. Dialisar a proteína de fusão eluída contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl a 4 °C, de um dia para o outro, e concentrar a fusão até cerca de 2 mg/mL, fraccionar a amostra e congelar a -20 °C. Testar a proteína purificada utilizando OD, BCA e análise de pureza. A Figura 2 mostra a proteína purificada como analisada por SDS-PAGE.

Exemplo 5 - Preparação da proteína de fusão LC/C-RGDcíclico-

Hn/C O ligante LC-HN pode ser concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como BamHI-SalI-ligante-local protease-RGDcíclico-IVhel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID N° 16). A fusão LC/C-RGDcíclico-HN/C é depois montada utilizando LC/C (SEQ ID N° 5) e HN/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no Exemplo 1 e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-RGDcíclico-espaçador-HN (SEQ ID N° 17) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 18. O plasmídeo de expressão resultante, pMAL LC/C-RGDcíclico-HN/C foi transformado em E. coli BL21 para expressão recombinante da proteína. A expressão da proteína de 45 fusão foi realizada como descrita no Exemplo 4. A Figura 1 mostra a proteína expressa em E. coli como analisada por SDS-PAGE.

Exemplo 6 - Preparação da proteína de fusão LC/C-THALWHT-

Hn/C 0 ligante LC-HN pode ser concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como BamHI-SalI-ligante-local de protease-THALWHT-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID N° 19). A fusão LC/C-THALWHT-Hn/C é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e HN/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no Exemplo 1 e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-THALWHT-espaçador-HN (SEQ ID N° 20) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 21. A expressão da proteína de fusão foi realizada como descrita no Exemplo 4. A Figura 1 mostra a proteína expressa em E. coli como analisada por SDS-PAGE. A sequência peptídica THALWHT dada neste exemplo (SEQ ID N° 19, 20 e 21) pode ser trocada com outra sequência peptídica encontrada por técnicas de apresentação de fagos. Por exemplo, LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC) , LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) e LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (Wu et al. , 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Flórea et al., 2003); SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al., 2004); Péptidos FSLSKPP, HSMQLST e STQAMFQ (Rahim et al., 2003). 46

Exemplo 7 - Preparação da proteína de fusão

LC/C-THALWHTcíclico-HN/C 0 ligante LC-HN pode ser concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como BamHI-SalI-ligante-local de protease-THALWHTcí clico-iVhel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação--Hindi11 (SEQ ID N° 22) . A fusão LC/C-THALWHTciclico-Hn/C é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e HN/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no Exemplo um e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-THALWHTcíclico-espaçador-HN (SEQ ID N° 23) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 24. A expressão da proteína de fusão foi realizada como descrita no Exemplo 4. A Figura 1 mostra a proteína expressa em E. coli como analisada por SDS-PAGE. A sequência peptídica THALWHT dada neste exemplo (SEQ ID N° 19, 20 e 21) pode ser trocada com outra sequência peptídica encontrada por técnicas de apresentação de fagos. Por exemplo, LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC) , LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) e LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (Wu et al. , 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Flórea et al., 2003); SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al., 2004); Péptidos FSLSKPP, HSMQLST e STQAMFQ (Rahim et al., 2003). 47

Exemplo 8 - Preparação da proteína de fusão LC/C-ANP-Hn/c 0 ligante LC-HN pode ser concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como DamHI-SalI-ligante-local de protease-ANP-IVbel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-ifindl 11 (SEQ ID N° 25). A fusão LC/C-ANP-Hn/C é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e Hn/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no Exemplo 1 e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-ANP-espaçador-HN (SEQ ID N° 26) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 27.

Exemplo 9 - Preparação da proteína de fusão LC/C-VIP-HN/C 0 ligante LC-HN pode ser concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como EamHI-SalI-ligante-local de protease-VIP-Miel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-ííindlll (SEQ ID N° 28). A fusão LC/C-VIP-HN/C é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e Hn/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos descritos no exemplo) 1 e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-VIP-espaçador-HN (SEQ ID N° 29) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 30. A sequência VIP dada na SEQ ID N° 28 podia ser substituída com sequências agonistas ou análogas de VIP. Por exemplo, [R15'20'21, L17] -VIP ou [R15,20,21^ l17] -VIP-GRR (Kashimoto et al., 48 1996; Onoue et al., 2004), [R2'8'9'16'24] _VIP ou [R2,8,9,i6,24,25j _yIp (Igarashi et al., 2005).

Exemplo 10 - Preparação da proteína de fusão LC/C-péptido libertador de gastrina-HN/C O ligante LC-HN pode ser concebido utilizando os métodos descritos no Exemplo 2, mas utilizando o ligante do serotipo C organizado como EamHI-SalI-ligante-local de protease-péptido libertador de gastrina-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-PindlII (SEQ ID N° 34). A fusão LC/C-péptido libertador de gastrina-HN/C é depois montada utilizando o LC/C (SEQ ID N° 5) e HN/C (SEQ ID N° 6), feitos utilizando os métodos do Exemplo 1 e construídos utilizando os métodos descritos no Exemplo 2. A construção final contém a ORF LC-ligante-péptido libertador de gastrina-espaçador-HN (SEQ ID N° 35) para transferir em vectores de expressão para expressão, de modo a resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID N° 36.

Exemplo 11 - Avaliação da funcionalidade da proteína de

fusão LC/C-RGD-Hn/C A funcionalidade do componente de TM da proteína de fusão LC/C-RGD-HN/C (preparada de acordo com o Exemplo 4) é avaliada através de um ensaio de ligação de ligando. Para facilitar a avaliação da ligação de ligando, um péptido de ligação de RGD é sintetizado numa forma biotinilada e não biotinilada. A ligação da proteína de fusão é determinada através de um ensaio de competição com a forma biotinilada. Resumidamente, as células 49 NCI-H292 são plaqueadas em placas de 96 poços e as culturas viáveis estabelecidas. As células e as soluções são pré-arref ecidas a 4 °C e as soluções são preparadas em meio alimentador de células-mais-HEPES (50 mM) . Antes do tratamento, é removido meio das células e substituído com meio-mais-HEPES (500 pL por poço) que é depois também removido. O ligando marcado, em x2 a concentração requerida, é adicionado a todos os poços (50 pL por poço) . A proteína de fusão, em x2 a concentração requerida, é depois adicionada aos poços (50 pL por poço) . Após 1 hora a O O > o meio é removido e substituído com meio + HEPES (100 pL por poço) • Este meio é removido e substituído com meio + HEPES (100 pL por poço). As células são lisadas com 100 pL por poço de PBS-Tween 0,1% durante 5 minutos a 4 °C. O PBS-Tween é removido e as células são lavadas com meio + HEPES (100 pL por poço) . Este meio é removido e substituído com 100 pL de PBS + 100 pL de estreptavidina-HRP por poço. As células são incubadas à temperatura e pressão ambiente durante 20 minutos. O PBS + estreptavidina é removido e as células são lavadas com PBS-Tween. São adicionados 100 pL por poço de TMB e as células são incubadas a 37 °C durante 10 min. São adicionados 50 pL por poço de H2S04 2 M e a placa lida a 450 nm. Utilizando esta metodologia, a capacidade do componente de TM da proteína de fusão LC/C-RGD-Hn/C para se ligar à superfície celular é confirmada. 50

Descrição das Figuras:

Figura 1 - Expressão das proteínas de fusão LC/C-RGD-HN/C, LC/C-RGDcíclico-HN/C, LC/C-THALWHT-Hn/C e LC/C-THALWHTcíclico-Hn/C em E. coli.

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 4, as proteínas de fusão LC/C-RGD-HN/C, LC/C-RGDcíclico-HN/C, LC/C-THALWHT-Hn/C e LC/C-THALWHTcíclico-HN/C foram expressas em células de E. coli BL21. Resumidamente, 1 L de meio TB contendo 0,2% de glucose e 100 pg/mL de ampicilina foi inoculado com 10 mL de cultura de partida. As culturas foram cultivadas a 37 °C até ser atingido uma ODeoonm aproximada de 0,5, a cujo ponto a temperatura foi reduzida até 16 °C. Após 1 hora, as culturas foram induzidas com 1 mM de IPTG e cultivadas durante mais 16 horas.

Pista 1, LC/C-THALWHT-Hn/C;

Pista 2, LC/C-RGD-HN/C;

Pista 3, LC/C-THALWHTcíc1ÍCO-Hn/C;

Pista 4, LC/C-RGDcíclíco-Hn/C .

Figura 2 - Purificação de uma proteína de fusão LC/C-RGD-Hn/c

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 5, uma proteína de fusão LC/C-RGD-HN/C foi purificada a partir de células de E. coli BL21. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos após rompimento das células foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com imidazole a 100 mM, tratadas com 51

Factor Xa para activar a proteína de fusão e remover o marcador de proteína de ligação de maltose (MBP), depois re-aplicadas numa segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE. 0 material purificado final na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [ + ] , respectivamente.

Referências

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Chaddock, John Durose, Lyndsey Foster, Keith <120> Proteínas de fusão

<130> P27140WO/MRM <150> GB 0426397.6 <151> 2004-12-01 <16 0 > 4 7 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 1302

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 1 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 60 120 180 240 53 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg ac 1302 <210> 2 <211> 1257 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético 54 <4 Ο 0> 2 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 60 accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 120 gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 180 cçggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 240 ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 300 cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 360 gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 420 aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 480 tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 540 atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 600 ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cccggaaatc 660 gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 720 gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 780 tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 840 atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 900 aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 960 aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 1020 tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggacttc 1080 gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 1140 ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 1200 cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta gaagctt 1257 55 1323 1323 3 <210> <211>

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 3 ggatccatgc cggttaccat caacaacttc aactacaacg acccgatcga caacaacaac 60 atcattatga tggaaccgcc gttcgcacgt ggtaccggac gttactacaa ggcttttaag 120 atcaccgacc gtatctggat catcccggaa cgttacacct tcggttacaa acctgaggac 180 ttcaacaaga gtagcgggat tttcaatcgt gacgtctgcg agtactatga tccagattat 240 ctgaatacca acgataagaa gaacatattc cttcagacta tgattaaact cttcaaccgt 300 atcaaaagca aaccgctcgg tgaaaaactc ctcgaaatga ttatcaacgg tatcccgtac 360 ctcggtgacc gtcgtgtccc gcttgaagag ttcaacacca acatcgcaag cgtcaccgtc 420 aacaaactca tcagcaaccc aggtgaagtc gaacgtaaaa aaggtatctt cgcaaacctc 480 atcatcttcg gtccgggtcc ggtcctcaac gaaaacgaaa ccatcgacat cggtatccag 540 aaccacttcg caagccgtga aggtttcggt ggtatcatgc agatgaaatt ctgcccggaa 600 tacgtcagtg tcttcaacaa cgtccaggaa aacaaaggtg caagcatctt caaccgtcgt 660 ggttacttca gcgacccggc actcatcctc atgcatgaac tcatccacgt cctccacggt 720 ctctacggta tcaaagttga cgacctcccg atcgtcccga acgagaagaa attcttcatg 780 cagagcaccg acgcaatcca ggctgaggaa ctctacacct tc99t99cca agacccaagt 840 atcataaccc cgtccaccga caaaagcatc tacgacaaag tcctccagaa cttcaggggt 900 atcgtggaca gactcaacaa agtcctcgtc tgcatcagcg acccgaacat caatatcaac 960 atatacaaga acaagttcaa agacaagtac aaattcgtcg aggacagcga aggcaaatac 1020 agcatcgacg tagaaagttt cgacaagctc tacaaaagcc tcatgttcgg tttcaccgaa 1080 accaacatcg ccgagaacta caagatcaag acaagggcaa gttacttcag cgacagcctc 1140 56 1200 ccgcctgtca aaatcaagaa cctcttagac aacgagattt acacaattga agagggcttc aacatcagtg acaaagacat ggagaaggaa tacagaggtc agaacaaggc tatcaacaaa 1260 caggcatacg aggagatcag caaagaacac ctcgcagtct acaagatcca gatgtgcgtc 1320 gac 1323 <210> 4 <211> 1260 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 4 ctgcagtgca tcgacgttga caacgaagac ctgttcttca tcgctgacaa aaacagcttc 60 agtgacgacc tgagcaaaaa cgaacgtatc gaatacaaca cccagagcaa ctacatcgaa 120 aacgacttcc cgatcaacga actgatcctg gacaccgacc tgataagtaa aatcgaactg 180 ccgagcgaaa acaccgaaag tctgaccgac ttcaacgttg acgttccggt ttacgaaaaa 240 cagccggcta tcaagaaaat cttcaccgac gaaaacacca tcttccagta cctgtacagc 300 cagaccttcc cgctggacat ccgtgacatc agtctgacca gcagtttcga cgacgctctg 360 ctgttcagca acaaagttta cagtttcttc agcatggact acatcaaaac cgctaacaaa 420 gttgttgaag cagggctgtt cgctggttgg gttaaacaga tcgttaacga cttcgttatc 480 gaagctaaca aaagcaacac tatggacaaa atcgctgaca tcagtctgat cgttccgtac 540 atcggtctgg ctçtgaacgt tggtaacgaa accgctaaag gtaactttga aaacgctttc 600 gagatcgctg gtgcaagcat cctgctggag ttcatcccgg aactgctgat cccggttgtt 660 ggtgctttcc tgctggaaag ttacatcgac aacaaaaaca agatcatcaa aaccatcgac 720 aacgctctga ccaaacgtaa cgaaaaatgg agtgatatgt acggtctgat cgttgctcag 780 tggctgagca ccgtcaacac ccagttctac accatcaaag aaggtatgta caaagctctg 840 57 aactaccagg ctcaggctct ggaagagatc atcaaatacc gttacaacat ctacagtgag 900 aaggaaaaga gtaacatcaa catcgacttc aacgacatca acagcaaact gaacgaaggt 960 atcaaccagg ctatcgacaa catcaacaac ttcatcaacg gttgcagtgt tagctacctg 1020 atgaagaaga tgatcccgct ggctgttgaa aaactgctgg acttcgacaa caccctgaaa 1080 aagaacctgc tgaactacat cgacgaaaac aagctgtacc tgatcggtag tgctgaatac 1140 gaaaaaagta aagtgaacaa atacctgaag accatcatgc cgttcgacct gagtatctac 1200 accaacgaca ccatcctgat cgaaatgttc aacaaataca actctctaga ctagaagctt 1260 <210> 5 <211> 1329 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <40 0> 5 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 58 660 cgctttatgc tgacctatag agcgaatttt gcatggaccc aacctgtatg gcatcgcgat ttttacagcc agtacaacgt accattgatc tgattccgaa tatcgcagca ttgcgaaacg aaatatatcg gcgaatataa agcggcgaag ttaccgttaa atcttcaccg aatttaacta agcaacgtgt ataccccggt aacggcttta acatcccgaa cgtaatccgg cgctgcgtaa tgcgtcgac caacgcgacc aacgatgttg gatcctgatc ctgatgcatg tccgaacgat cagaccatta gaaactggaa tatgcggaaa aagcgcgcgc aaatacttcg tctgaacagc attaccaccg acagaaactg atccgcaaat ccgcaataaa ttcgtggaac tgcgaaaatc tataacgtgc gaccgcgaat attctggatg aagcaacctg aacgttctgt agtgaacccg gaaaacatgc gtgaaggccg tttcagcaaa aactgaacca tgcgatgcat gcagcgtgac cagcaacatc tctatgcgtt tggcggtccg aagaaaaagc gctggattac cgaatccgag cagcttcaac atcgctttgt ggtggaaagc tgtacaacga actgacccag agaaccgtaa aatctacctg ataacgtgta cgatatccag ttatgggcca gaacctgagc tgtacctgtt caccaaattt 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1329 <210> 6 <211> 1263 <212> ADN <213> Sequência <220> <223> Sintético <400> 6 Artificial ctgcagtgtc gtgaactgct gatgtgaaaa ccgatatctt tacccggata acgtgagcgt cagctggatc tgctgtatcc ggtgaaaaac accgatctgc cctgcgcaaa gatatcaacg tgatcaggtg atcctgagca gagcattgat agcgaaagcg cgtttattgg cgatatcagc aagaaaccga agtgatctac aaaacaccag cgaacatggt aaattctgcc gggcgaaaaic 60 120 180 59 240 300 300 7 159

ADN <223> caggtgtttt acgataaccg tacccagaac gtggattacc tgaacagcta ttactacctg gaaagccaga aactgagcga taacgtggaa gattttacct ttacccgcag cattgaagaa gcgctggata acagcgcgaa agtttacacc tattttccga ccctggcgaa caaagttaat gcgggtgttc agggcggtct gtttctgatg tgggcgaacg atgtggtgga agatttcacc accaacatcc tgcgtaaaga taccctggat aaaatcagcg atgttagcgc gattattccg tatattggtc cggcgctgaa cattagcaat agcgtgcgtc gtggcaattt taccgaagcg tttgcggtta ccggtgtgac cattctgctg gaagcgtttc cggaatttac cattccggcg ctgggtgcgt ttgtgatcta tagcaaagtg caggaacgca acgaaatcat caaaaccatc gataactgcc tggaacagcg tattaaacgc tggaaagata gctatgaatg gatgatgggc acctggctga gccgtattat cacccagttc aacaacatca gctaccagat gtacgatagc ctgaactatc aggcgggtgc gattaaagcg aaaatcgatc tggaatacaa aaaatacagc ggcagcgata aagaaaacat caaaagccag gttgaaaacc tgaaaaacag cctggatgtg aaaattagcg aagcgatgaa taacatcaac aaattcatcc gcgaatgcag cgtgacctac ctgttcaaaa acatgctgcc gaaagtgatc gatgaactga acgaatttga tcgcaacacc aaagcgaaac tgatcaacct gatcgatagc cacaacatta ttctggtggg cgaagtggat aaactgaaag cgaaagttaa caacagcttc cagaacacca tcccgtttaa catcttcagc tataccaaca acagcctgct gaaagatatc atcaacgaat acttcaatct agactagaag ctt <210> <211> <212> <213> Sequência Artificial <220>

Sintético 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1263 60 <4 Ο 0> 7 ggatccacgc acgtcgacga agaaaagctg tacgacgacg acgacaaaac ctttttactg 60 cgtgcgctag cgggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcgca 120 ctagtgctgc agacgcacgg tctagaatga taaaagctt 159 <210> 8 <211> 231 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 8 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgtagcgtct ctgagattca gctgatgcat 60 aatttaggca aacacttgaa tagtatggaa c9tgttgaat ggctgcgcaa aaaacttcaa 120 gatgtgcata actttgcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 180 99c93tagcg cactagtgct gcagacgcac ggtctagaat gataaaagct t 231 <210> 9 <2ll> 2685 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 61 <4 Ο 0> 9 ggatccatgc cggttaccat caacaacttc aactacaacg acccgatcga caacaacaac 60 atcattatga tggaaccgcc gttcgcacgt ggtaccggac gttactacaa ggcttttaag 120 atcaccgacc gtatctggat catcccggaa cgttacacct tcggttacaa acctgaggac 180 ttcaacaaga gtagcgggat tttcaatcgt gacgtctgcg agtactatga tccagattat 240 ctgaatacca acgataagaa gaacatattc cttcagacta tgattaaact cttcaaccgt 300 atcaaaagca aaccgctcgg tgaaaaactc ctcgaaatga ttatcaacgg tatcccgtac 360 ctcggtgacc gtcgtgtccc gcttgaagag ttcaacacca acatcgcaag cgtcaccgtc 420 aacaaactca tcagcaaccc aggtgaagtc gaacgtaaaa aaggtatctt cgcaaacctc 480 atcatcttcg gtccgggtcc ggtcctcaac gaaaacgaaa ccatcgacat cggtatccag 540 aaccacttcg caagccgtga aggtttcggt ggtatcatgc agatgaaatt ctgcccggaa 600 tacgtcagtg tcttcaacaa cgtccaggaa aacaaaggtg caagcatctt caaccgtcgt 660 ggttacttca gcgacccggc actcatcctc atgcatgaac tcatccacgt cctccacggt 720 ctctacggta tcaaagttga cgacctcccg atcgtcccga acgagaagaa attcttcatg 780 cagagcaccg acgcaatcca ggctgaggaa ctctacacct tcggtggcca agacccaagt 840 atcataaccc cgtccaccga caaaagcatc tacgacaaag tcctccagaa cttcaggggt 900 atcgtggaca gactcaacaa agtcctcgtc tgcatcagcg acccgaacat caatatcaac 960 atatacaaga acaagttcaa agacaagtac aaattcgtcg aggacagcga aggcaaatac 1020 agcatcgacg tagaaagttt cgacaagctc tacaaaagcc tcatgttcgg tttcaccgaa 1080 accaacatcg ccgagaacta caagatcaag acaagggcaa gttacttcag cgacagcctc 1140 ccgcctgtca aaatcaagaa cctcttagac aacgagattt acacaattga agagggcttc 1200 aacatcagtg acaaagacat ggagaaggaa tacagaggtc agaacaaggc tatcaacaaa 1260 caggcatacg aggagatcag caaagaacac ctcgcagtct acaagatcca gatgtgcgtc 1320 gacgaagaaa agctgtacga cgacgacgac aaaacctttt tactgcgtgc gctagcgggc 1380 ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcgcactagt gctgcagtgc 1440 atcgacgttg acaacgaaga cctgttcttc atcgctgaca aaaacagctt cagtgacgac 1500 ctgagcaaaa acgaacgtat cgaatacaac acccagagca actacatcga aaacgacttc 1560 62 1620 ccgatcaacg aactgatcct ggacaccgac ctgataagta aaatcgaact gccgagcgaa aacaccgaaa gtctgaccga cttcaacgtt gacgttccgg tttacgaaaa acagccggct 1680 atcaagaaaa tcttcaccga cgaaaacacc atcttccagt acctgtacag ccagaccttc 1740 ccgctggaca tccgtgacat cagtctgacc agcagtttcg acgacgctct gctgttcagc 1800 aacaaagttt acagtttctt cagcatggac tacatcaaaa ccgctaacaa agttgttgaa 1860 gcagggctgt tcgctggttg ggttaaacag atcgttaacg acttcgttat cgaagctaac 1920 aaaagcaaca ctatggacaa aatcgctgac atcagtctga tcgttccgta catcggtctg 1980 gctctgaacg ttggtaacga aaccgctaaa ggtaactttg aaaacgcttt cgagatcgct 2040 ggtgcaagca tcctgctgga gttcatcccg gaactgctga tcccggttgt tggtgctttc 2100 ctgctggaaa gttacatcga caacaaaaac aagatcatca aaaccatcga caacgctctg 2160 accaaacgta acgaaaaatg gagtgatatg tacggtctga tcgttgctca gtggctgagc 2220 accgtcaaca cccagttcta caccatcaaa gaaggtatgt acaaagctct gaactaccag 2280 gctcaggctc tggaagagat catcaaatac cgttacaaca tctacagtga gaaggaaaag 2340 agtaacatca acatcgactt caacgacatc aacagcaaac tgaacgaagg tatcaaccag 2400 gctatcgaca acatcaacaa cttcatcaac ggttgcagtg ttagctacct gatgaagaag 2460 atgatcccgc tggctgttga aaaactgctg gacttcgaca acaccctgaa aaagaacctg 2520 ctgaactaca tcgacgaaaa caagctgtac ctgatcggta gtgctgaata cgaaaaaagt 2580 aaagtgaaca aatacctgaa gaccatcatg ccgttcgacc tgagtatcta caccaacgac 2640 accatcctga tcgaaatgtt caacaaatac aactctctag actag 2685 <210> 10 <211> 894

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 63 10 <400>

Gly Ser Met Pro Vai Thr Ile Aan Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile 15 10 15

Asp Asn Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr 20 25 30

Gly Arg Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile 35 40 45

Pro Glu Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser 50 55 60

Ser Gly Ile Phe Asn Arg Asp Vai Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr 65 70 75 80

Leu Asn Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gin Thr Met Ile Lys 85 90 95

Leu Phe Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu 100 105 110

Met Ile Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Vai Pro Leu 115 120 125

Glu Glu Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Vai Thr Vai Asn Lys Leu Ile 130 135 140

Ser Asn Pro Gly Glu Vai Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu 145 150 155 160

Ile Ile Phe Gly Pro Gly Pro Vai Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp 165 170 175

Ile Gly Ile Gin Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile 180 185 190 64

Cys Pro Glu Tyr Vai Ser 200

Met Gin Met Lys Phe 195

Vai Phe Asn Asn Vai 205

Ala Ser Ile Phe Asn Arg 215

Gin Glu Asn Lys Gly 210

Arg Gly Tyr Phe Ser 220

Leu Met His Glu Leu Ile 230 235

Asp Pro Ala Leu Ile 225

His Vai Leu His Gly 240

Vai Asp Asp Leu Pro Ile 250

Leu Tyr Gly Ile Lys 245

Vai Pro Asn Glu Lys 255

Lys Phe Phe Met Gin Ser Thr Asp Ala Ile Gin Ala Glu Glu Leu Tyr 260 265 270

Thr Phe Gly Gly Gin Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys 275 280 285

Ser Ile Tyr Asp Lys Vai Leu Gin Asn Phe Arg Gly Ile Vai Asp Arg 290 295 300

Leu Asn Lys Vai Leu vai Cys Ile Ser Asp Pro Asn lie Asn Ile Asn 305 310 315 320

Ile Tyr Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Vai Glu Asp Ser 325 330 335

Glu Gly Lys Tyr Ser Ile Asp Vai Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys 340 345 350

Ser Leu Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys 355 360 365

Ile Lys Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Vai Lys 370 375 380 65

Ile Lys Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe 385 390 395 400

Asn Ile Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gin Asn Lys 405 410 415

Ala Ile Asn Lys Gin Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala 420 425 430

Vai Tyr Lys Ile Gin Met Cys Vai Asp Glu Glu Lys Leu Tyr Asp Asp 435 440 445

Asp Asp Lys Thr Phe Leu LeU Arg Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin Cys 465 470 475 480

Ile Asp Vai Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser 485 490 495

Phe Ser Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gin 500 505 510

Ser Asn Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp 515 520 525

Thr Asp Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser 530 535 540

Leu Thr Asp Phe Asn Vai Asp Vai Pro Vai Tyr Glu Lys Gin Pro Ala 545 550 555 560

Ile Lys Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gin Tyr Leu Tyr 565 570 575 66

Ser Gin Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser 580 585 590 Phe Asp Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys vai Tyr Ser Phe Phe Ser 595 600 605 Met Asp Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Vai Vai Glu Ala Gly Leu Phe 610 615 620 Ala Gly Trp Vai Lys Gin Ile Vai Asn Asp Phe Vai Ile Glu Ala Asn 625 630 635 640 Lys Ser Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Vai Pro 645 650 655 Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Asn Vai Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn 660 665 670 Phe Glu Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe 675 680 685 Ile Pro Glu Leu Leu Ile Pro Vai Vai Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser 690 695 700 Tyr Ile Asp Asn Lys Asn Lys Ile lie Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu 705 710 715 720 Thr Lys Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Vai Ala 725 730 735 Gin Trp Leu Ser Thr Vai Asn Thr Gin Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly 740 745 750 Met Tyr Lys Ala Leu Asn Tyr Gin Ala Gin Ala Leu Glu Glu Ile Ile 755 760 765 67

Lys Tyr Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn 770 775 780

Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gin 785 790 795 800

Ala Ile Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Vai Ser Tyr 805 810 815

Leu Met Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Vai Glu Lys Leu Leu Asp Phe 820 825 830

Asp Asn Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys 835 840 845

Leu Tyr Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Vai Asn Lys 850 855 860

Tyr Leu Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp 865 870 875 880

Thr Ile Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Leu Asp 885 890 <210> 11 <211> 2766 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 68 <400> 11 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgtagcgtc tctgagattc agctgatgca taatttaggc 1380 aaacacttga atagtatgga acgtgttgaa tggctgcgca aaaaacttca agatgtgcat 1440 aactttgcgc tagcgggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc 1500 gcactagtgc tgcagtgtcg tgaactgctg gtgaaaaaca ccgatctgcc gtttattggc 1560 69 gatatcagcg atgtgaaaac cgatatcttc ctgcgcaaag atatcaacga agaaaccgaa gtgatctact acccggataa cgtgagcgtt gatcaggtga tcctgagcaa aaacaccagc gaacatggtc agctggatct gctgtatccg agcattgata gcgaaagcga aattctgccg ggcgaaaacc aggtgtttta cgataaccgt acccagaacg tggattacct gaacagctat tactacctgg aaagccagaa actgagcgat aacgtggaag attttacctt tacccgcagc attgaagaag cgctggataa cagcgcgaaa gtttacacct attttccgac cctggcgaac aaagttaatg cgggtgttca gggcggtctg tttctgatgt gggcgaacga tgtggtggaa gatttcacca ccaacatcct gcgtaaagat accctggata aaatcagcga tgttagcgcg attattccgt atattggtcc ggcgctgaac attagcaata gcgtgcgtcg tggcaatttt accgaagcgt ttgcggttac cggtgtgacc attctgctgg aagcgtttcc ggaatttacc attccggcgc tgggtgcgtt tgtgatctat agcaaagtgc aggaacgcaa cgaaatcatc aaaaccatcg ataactgcct ggaacagcgt attaaacgct ggaaagatag ctatgaatgg atgatgggca cctggctgag ccgtattatc acccagttca acaacatcag ctaccagatg tacgatagcc tgaactatca ggcgggtgcg attaaagcga aaatcgatct ggaatacaaa aaatacagcg gcagcgataa agaaaacatc aaaagccagg ttgaaaacct gaaaaacagc ctggatgtga aaattagcga agcgatgaat aacatcaaca aattcatccg cgaatgcagc gtgacctacc tgttcaaaaa catgctgccg aaagtgatcg atgaactgaa cgaatttgat cgcaacacca aagcgaaact gatcaacctg atcgatagcc acaacattat tctggtgggc gaagtggata aactgaaagc gaaagttaac aacagcttcc agaacaccat cccgtttaac atcttcagct ataccaacaa cagcctgctg aaagatatca toaacgaata cttcaatcta gactaa 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2766 <210> 12 <211> 921

<212> PRT <213> Sequência Artificial 70 <220> <220> <223>

Sintético <4 0 0> 12

Gly Ser Glu Phe Met Pro Ile Thr 1 5

Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 10 15

Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu 20

Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala 35 40

Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 45 val Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg 50 55

Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 60

Pro Pro Arg Val Thr Ser Pro Lys 65 70

Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp 85

Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 90 95

Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg 100

Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe 115 120

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Val Asp 130 135

Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 125

Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr 140

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Val Lys 145 150

Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val 155 160 71

Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr Ile Ser Ser Vai 245 250 255

Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 290 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320

Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335

Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365 72

Lys Ile Tyr Asn Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 370 375 380

Thr Pro Vai Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 385 390 395 400

Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 405 410 415

Gin Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Vai Asn Pro Glu Asn 420 425 430

Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg 435 440 445

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 450 455 460

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 465 470 475 480

Asn Phe Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485 490 495

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys 500 505 510

Asn Thr Asp Leu Pro Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp 515 520 525

Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr 530 535 540

Pro Asp Asn Val Ser Val Asp Gin Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser 545 550 555 560 73

Glu His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser 565 570 575 Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn Gin Vai Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin 580 585 590 Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu 595 600 605 Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala 610 615 620 Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn 625 630 635 640 Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn 645 650 655 Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu 660 665 670 Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 675 680 685 Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe 690 695 700 Ala Vai Thr Gly Vai Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr 705 710 715 720 Ile Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai Ile Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg 725 730 735 Asn Glu Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys 740 745 750 74

Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg 755 760 765

Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn Ile Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu 770 775 780

Asn Tyr Gin Ala Gly Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys 785 790 795 800

Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn 805 810 815

Leu Lys Asn Ser Leu Asp Vai Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile 820 825 830

Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Vai Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met 835 840 845

Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys 850 855 860

Ala Lys Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Vai Gly 865 870 875 880

Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala Lys Vai Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr 885 890 895

Ile Pro Phe Asn lie phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp 900 905 910

Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Asp 915 920 75 <210> 13 <211> 156

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência de ADN do ligante CP RGD-C <400> 13 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgtggtggtc gtggtgacat gttcggtgct gcgctagcgg gcggtggcgg tagcggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcgcacta gtgctgcaga cgcacggtct agaatgataa aagctt <210> 14 <211> 2733

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência de ADN da fusão CP RGD-C <400> 14

ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataacT aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacceg aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 60 120 156 ~60 120 180 240 300 360 420 76 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 640 accattgatc tgattccgaa aagcgcgegc: aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt 99fc99aaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgtggtggt cgtggtgaca tgttcggtgc tgcgctagcg 1380 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 1440 tgtcgtgaac tgctggtgaa aaacaccgat ctgccgttta ttggcgatat cagcgatgtg 1500 aaaaccgata tcttcctgcg caaagatatc aacgaagaaa ccgaagtgat ctactacccg 1560 gataacgtga gcgttgatca ggtgatcctg agcaaaaaca ccagcgaaca tggtcagctg 1620 gatctgctgt atccgagcat tgatagcgaa agcgaaattc tgccgggcga aaaccaggtg 1680 ttttacgata accgtaccca gaacgtggat tacctgaaca gctattacta cctggaaagc 1740 cagaaactga gcgataacgt ggaagatttt acctttaccc gcagcattga agaagcgctg 1800 gataacagcg cgaaagttta cacctatttt ccgaccctgg cgaacaaagt taatgcgggt 1860 gttcagggcg gtctgtttct gatgtgggcg aacgatgtgg tggaagattt caccaccaac 1920 atcctgcgta aagataccct ggataaaatc agcgatgtta gcgcgattat tccgtatatt 1980 77 ggtccggcgc tgaacattag caatagcgtg cgtcgtggca attttaccga agcgtttgcg 2040 gttaccggtg tgaccattct gctggaagcg tttccggaat ttaccattcc ggcgctgggt 2100 gcgtttgtga tctatagcaa agtgcaggaa cgcaacgaaa tcatcaaaac catcgataac 2160 tgcctggaac agcgtattaa acgctggaaa gatagctatg aatggatgat gggcacctgg 2220 ctgagccgta ttatcaccca gttcaacaac atcagctacc agatgtacga tagcctgaac 2280 tatcaggcgg gtgcgattaa agcgaaaatc gatctggaat acaaaaaata cagcggcagc 2340 gataaagaaa acatcaaaag ccaggttgaa aacctgaaaa acagcctgga tgtgaaaatt 2400 agcgaagcga tgaataacat caacaaattc atccgcgaat gcagcgtgac ctacctgttc 2460 aaaaacatgc tgccgaaagt gatcgatgaa ctgaacgaat ttgatcgcaa caccaaagcg 2520 aaactgatca acctgatcga tagccacaac attattctgg tgggcgaagt ggataaactg 2580 aaagcgaaag ttaacaacag cttccagaac accatcccgt ttaacatctt cagctatacc 2640 aacaacagcc tgctgaaaga tatcatcaac gaatacttca atctagaagc actagcgagt 2700 gggcaccatc accatcacca ttaatgaaag ctt 2733 <210> 15 <211> 909

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência de proteína da fusão CP RGD-C 15 <400>

Gly Ser Glu Phe Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15

Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 35 40 45 78

Vai Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60

Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 85 90 95

Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg 100

Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp IIe Pro Phe 115 120

Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Vai Asp 130 135

Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 14 0

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys 145 150

Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 155 160

Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240 79

Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr Ile Ser Ser Vai 245 250 255

Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 290 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320

Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335

Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365

Lys ile Tyr Asn Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 370 375 380

Thr Pro Vai Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 385 390 395 400

Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 405 410 415

Gin Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Vai Asn Pro Glu Asn 420 425 430 80

Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys~Phe~~Cys~17ãirAsp Ala lie Asp Gly Arg 435 440 445

Gly Gly Arg Gly Asp Met Phe Gly Ala Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly 450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin 465 470 475 480

Cys Arg Glu Leu Leu Vai Lys Asn Thr Asp Leu Pro Phe Ile Gly Asp 485 490 495

Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn Glu 500 505 510

Glu Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp Gin Vai 515 520 525

Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr 530 535 540

Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn Gin Vai 545 550 555 560

Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr 565 570 575

Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr Phe 580 585 590

Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr Thr 595 600 605

Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly Gly 610 615 620

Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr Asn 625 630 635 640 81

Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys lie Ser Asp Vai Ser Ala Ile 645 650 655

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg Arg 660 665 670

Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr Ile Leu Leu 675 680 685

Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai Ile 690 695 700

Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys Thr ile Asp Asn 705 710 715 720

Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met 725 730 735

Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn Ile Ser 740 745 750

Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala lie Lys Ala 755 760 765

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn 770 775 780

Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Vai Lys Ile 785 790 795 800

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Vai 805 810 815

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu Leu Asn 820 825 830 82

Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu lie Asn Leu Ile Asp Ser 835 840 845

His Asn Ile Ile Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala Lys Vai 850 855 860

Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr 865 870 875 880

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Glu 885 890 895

Ala Leu Ala Ser Gly His His His His His His Lys Leu 900 905

<210> 16 <211> 162 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência de ADN do ligante CP RGDciclico-C <400> 16 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgtggtggtt gccgtggtga catgttcggt 60 tgcgctgcgc tagcgggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc 120 gcactagtgc tgcagacgca cggtctagaa tgataaaagc tt 162 <210> 17 <211> 2739

<212> ADN 83 <213>

Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADN da fusão CP RGDciclico-C <400> 17 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 6ΙΓ aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 12 0 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcacega tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 84 1380 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgtggtggt tgccgtggtg acatgttcgg ttgcgctgcg ctagcgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cgcactagtg 1440 ctgcagtgtc gtgaactgct ggtgaaaaac accgatctgc cgtttattgg cgatatcagc 1500 gatgtgaaaa ccgatatctt cctgcgcaaa gatatcaacg aagaaaccga agtgatctac 1560 tacccggata acgtgagcgt tgatcaggtg atcctgagca aaaacaccag cgaacatggt 1620 cagctggatc tgctgtatcc gagcattgat agcgaaagcg aaattctgcc gggcgaaaac 1680 caggtgtttt acgataaccg tacccagaac gtggattacc tgaacagcta ttactacctg 1740 gaaagccaga aactgagcga taacgtggaa gattttacct ttacccgcag cattgaagaa 1800 gcgctggata acagcgcgaa agtttacacc tattttccga ccctggcgaa caaagttaat 1860 gcgggtgttc agggcggtct gtttctgatg tgggcgaacg atgtggtgga agatttcacc 1920 accaacatcc tgcgtaaaga taccctggat aaaatcagcg atgttagcgc gattattccg 1980 tatattggtc cggcgctgaa cattagcaat agcgtgcgtc gtggcaattt taccgaagcg 2040 tttgcggtta ccggtgtgac cattctgctg gaagcgtttc cggaatttac cattccggcg 2100 ctgggtgcgt ttgtgatcta tagcaaagtg caggaacgca acgaaatcat caaaaccatc 2160 gataactgcc tggaacagcg tattaaacgc tggaaagata gctatgaatg gatgatgggc 2220 acctggctga gccgtattat cacccagttc aacaacatca gctaccagat gtacgatagc 2280 ctgaactatc aggcgggtgc gattaaagcg aaaatcgatc tggaatacaa aaaatacagc 2340 ggcagcgata aagaaaacat caaaagccag gttgaaaacc tgaaaaacag cctggatgtg 2400 aaaattagcg aagcgatgaa taacatcaac aaattcatcc gcgaatgcag cgtgacctac 2460 ctgttcaaaa acatgctgcc gaaagtgatc gatgaactga acgaatttga tcgcaacacc 2520 aaagcgaaac tgatcaacct gatcgatagc cacaacatta ttctggtggg cgaagtggat 2580 aaactgaaag cgaaagttaa caacagcttc cagaacacca tcccgtttaa catcttcagc 2640 tataccaaca acagcctgct gaaagatatc atcaacgaat acttcaatct agaagcacta 2700 gcgagtgggc accatcacca tcaccattaa tgaaagctt 2739 85 <210> 18 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artifici <220> <223> Sequência de prote <400> 18 Gly Ser 1 Glu Phe Met 5 Pro Ile Pro Vai Asp Asn 20 Lys Asn Ile Leu Ala Asn Glu 35 Pro Glu Lys Vai Ile 50 Pro Asp Arg Phe Ser 55 Pro Pro 65 Arg Vai Thr Ser 70 Pro Leu Ser Thr Asp Ser 85 Asp Lys Leu Phe Lys Arg 100 Ile Asn Ser Arg Leu Ser Thr 115 Asp Ile Pro Asn Thr 130 Phe Asp Phe Asp Vai 135

da fusão CP RGDcíclico-C

Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 10 15

Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 25 30

Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 45

Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 60

Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 75 80

Thr Phe Leu Lys Glu lie He Lys 90 95

Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 105 110

Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 125

Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 140 86

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 145 150 155 160 Ile Ile Thr Gly Pro 165 Arg Glu Asn Ile lie Asp Pro Glu Thr Ser Thr 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190 Leu Ser Ile Ile Ser 195 Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 200 205 Ala Thr Asn Asp Vai 210 Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 215 220 Met Asp Pro Ile Leu 225 Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 230 235 240 Asn Leu Tyr Gly Ile 245 Ala ile Pro Asn Asp Gin Thr Ile Ser Ser Vai 250 255 Thr Ser Asn Ile Phe 260 Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 265 270 Glu Ile Tyr Ala Phe 275 Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser 280 285 Ala Arg Lys Tyr Phe 290 Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Ile Gly Glu 325 Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 330 335 87

Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365

Lys Ile Tyr Asn Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 370 375 380

Thr Pro Vai Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 385 390 395 400

Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 405 410 415

Gin Asn Leu

Ser Arg Asn Pro Ala 420

Leu Arg 425

Lys Vai Asn

Pro Glu Asn 430

Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg 435 440 445 Gly Gly Cys Arg Gly Asp Met Phe Gly Cys Ala Ala Leu Ala Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai 465 470 475 480 Leu Gin Cys Arg Glu Leu Leu Vai Lys Asn Thr Asp Leu Pro Phe Ile 485 490 495 Gly Asp Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile 500 505 510 Asn Glu Glu Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp 515 520 525 88

Gin Vai Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gin Leu Asp Leu 530 535 540 Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn 545 550 555 560 Gin Vai Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser 565 570 575 Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe 580 585 590 Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai 595 600 605 Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin 610 615 620 Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr 625 630 635 640 Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser 645 650 655 Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser Val 660 665 670

Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr Ile 675 680 685

Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Ala Phe 690 695 700

Vai Ile Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys Thr Ile 705 710 715 720 89

Asp Asn Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu 725 730 735

Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn

Ile Ser 740 745 750 Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala Ile 755 760 765 Lys Ala 770 Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys 775 780

Glu Asn Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Vai 785 790 795 800 Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys 805 810 815 Ser Vai Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu 820 825 830 Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn Leu Ile 835 840 845 Asp Ser 850 His Asn Ile Ile Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala 855 860 Lys Vai 865 Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser 870 875 880

Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn 885 890 895

Leu Glu Ala Leu Ala Ser Gly His His His His His His Lys Leu 900 905 910 90 <210> 19 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADN do ligante CP THALWHT-C <400> 19 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgtactcacg ctctgtggca caccgcgcta 60 120 150 gcgggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt agcggcggtg gcggtagcgc actagtgctg cagacgcacg gtctagaatg ataaaagctt <210> 20 <211> 2727 <212> ADN <213> Sequência <220> <223> Sequência <400> 20 THALWHT-C acagcgatcc ggtggataac cgaacgaacc ggaaaaagcg ttagccgtaa cagcaacccg gttattacga tccgaactat tcatcaaact gttcaaacgc tgagcaccga tattccgttt atgtggattt caacagcgtt gcagcattaa cccgagcgtg ggatccgaat tcatgccgat aaaaacatcc tgtacctgga tttcgtatca ccggcaacat aatctgaata aaccgccgcg ctgagcaccg atagcgataa atcaacagcc gtgaaattgg ccgggcaaca acaacacccc gatgttaaaa cccgccaggg

Artificial

de ADN da fusão CP caccatcaac aacttcaact tacccatctg aataccctgg ttgggttatt ccggatcgtt tgttaccagc ccgaaaagcg agataccttc ctgaaagaaa cgaagaactg atctatcgcc gatcaacacc tttgatttcg taacaattgg gtgaaaaccg 60 120 180 240 300 360 420 91 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgtactcac gctctgtggc acaccgcgct agcgggcggt 1380 ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtcgt 1440 gaactgctgg tgaaaaacac cgatctgccg tttattggcg atatcagcga tgtgaaaacc 1500 gatatcttcc tgcgcaaaga tatcaacgaa gaaaccgaag tgatctacta cccggataac 1560 gtgagcgttg atcaggtgat cctgagcaaa aacaccagcg aacatggtca gctggatctg 1620 ctgtatccga gcattgatag cgaaagcgaa attctgccgg gcgaaaacca ggtgttttac 1680 gataaccgta cccagaacgt ggattacctg aacagctatt actacctgga aagccagaaa 1740 ctgagcgata acgtggaaga ttttaccttt acccgcagca ttgaagaagc gctggataac 1800 agcgcgaaag tttacaccta ttttccgacc ctggcgaaca aagttaatgc gggtgttcag 1860 ggcggtctgt ttctgatgtg ggcgaacgat gtggtggaag atttcaccac caacatcctg 1920 cgtaaagata ccctggataa aatcagcgat gttagcgcga ttattccgta tattggtccg 1980 92 gcgctgaaca ttagcaatag cgtgcgtcgt ggcaatttta ccgaagcgtt tgcggttacc 2040 ggtgtgacca ttctgctgga agcgtttccg gaatttacca ttccggcgct gggtgcgttt 2100 gtgatctata gcaaagtgca ggaacgcaac gaaatcatca aaaccatcga taactgcctg 2160 gaacagcgta ttaaacgctg gaaagatagc tatgaatgga tgatgggcac ctggctgagc 2220 cgtattatca cccagttcaa caacatcagc taccagatgt acgatagcct gaactatcag 2280 gcgggtgcga ttaaagcgaa aatcgatctg gaatacaaaa aatacagcgg cagcgataaa 2340 gaaaacatca aaagccaggt tgaaaacctg aaaaacagcc tggatgtgaa aattagcgaa 2400 gcgatgaata acatcaacaa attcatccgc gaatgcagcg tgacctacct gttcaaaaac 2460 atgctgccga aagtgatcga tgaactgaac gaatttgatc gcaacaccaa agcgaaactg 2520 atcaacctga tcgatagcca caacattatt ctggtgggcg aagtggataa actgaaagcg 2580 aaagttaaca acagcttcca gaacaccatc ccgtttaaca tcttcagcta taccaacaac 2640 agcctgctga aagatatcat caacgaatac ttcaatctag aagcactagc gagtgggcac 2700 catcaccatc accattaatg aaagctt 2727 <210> <211> <212> <213> 21 907

PRT

Sequência de proteína da fusão CP THALWHT-C <220> <223> Sintético <400> 21

Gly Ser Glu Phe Met Pro Ile Thr lie Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15

Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 35 40 45 93

Vai Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60

Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 85 90 95

Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 100 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 115 120 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Vai Asp Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 130 135 140

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 145 150 155 160

Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220 94

Met Asp Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr Ile Ser Ser Vai 245 250 255

Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 290 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320

Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335

Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365

Lys Ile Tyr Asn Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 370 375 380

Thr Pro Vai Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 385 390 395 400

Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 405 410 415 95

Gin Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Vai Asn Pro Glu Asn 420 425 430 Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg 435 440 445 Thr His Ala Leu Trp His Thr Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin Cys Arg 465 470 475 480 Glu Leu Leu Vai Lys Asn Thr Asp Leu Pro Phe Ile Gly Asp Ile Ser 485 490 495 Asp Vai Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn Glu Glu Thr 500 505 510 Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp Gin Vai Ile Leu 515 520 525 Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gin Leu ASp Leu Leu Tyr Pro Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn Gin Vai Phe Tyr 545 550 555 560 Asp Asn Arg Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu 565 570 575 Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr Phe Thr Arg 580 585 590 Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr Thr Tyr Phe 595 600 605 96

Pro Thr Leu Ala Asn Lys Vai Asn 610 615

Ala Gly Vai Gin Gly Gly Leu Phe 620

Leu Met Trp Ala Asn Asp Vai Vai 625 630

Glu Asp Phe Thr Thr Asn Ile Leu 635 640

Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile 645

Ser Asp Vai Ser Ala Ile Ile Pro 650 655

Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile 660

Ser Asn Ser Vai Arg Arg Gly Asn 665 670

Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr 675 680

Gly Vai Thr Ile Leu Leu Glu Ala 685

Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala 690 695

Leu Gly Ala Phe Vai Ile Tyr Ser 700

Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile 705 710

Ile Lys Thr Ile Asp Asn Cys Leu 715 720

Glu Gin Arg

Ile

Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met Met Gly 725 730 735

Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn Ile Ser Tyr Gin 740 745 750

Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala Ile Lys Ala Lys Ile 755 760 765

Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn Ile Lys 770 775 780

Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Vai Lys Ile Ser Glu 785 790 795 800 97

Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Vai Thr Tyr 805 810 815 Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu Leu Asn Glu Phe 820 825 830

Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser His Asn 835 840 845 Ile Ile 850 Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala Lys Vai Asn Asn 855 860 Ser Phe 865 Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr Asn Asn 870 875 880

Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Glu Ala Leu 885 890 895 Ala Ser Gly His His His His His His Lys Leu 900 905 <210> 22 <211> 156 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADN do ligante CP THALWHTcíclico-C <400> 22 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgttgtactc acgctctgtg gcacacctgc 60 gcgctagcgg gcggtggcgg tagcggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcgcacta 120 gtgctgcaga cgcacggtct agaatgataa aagctt 156 98 <210> 23 <211> 2733

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADN da fusão CP THALWHTcíclico-C <40 0> 23 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggeaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 99 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgttgtact cacgctctgt ggcacacctg cgcgctagcg 1380 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 1440 tgtcgtgaac tgctggtgaa aaacaccgat ctgccgttta ttggcgatat cagcgatgtg 1500 aaaaccgata tcttcctgcg caaagatatc aacgaagaaa ccgaagtgat ctactacccg 1560 gataacgtga gcgttgatca ggtgatcctg agcaaaaaca ccagcgaaca tggtcagctg 1620 gatctgctgt atccgagcat tgatagcgaa agcgaaattc tgccgggcga aaaccaggtg 1680 ttttacgata accgtaccca gaacgtggat tacctgaaca gctattacta cctggaaagc 1740 cagaaactga gcgataacgt ggaagatttt acctttaccc gcagcattga agaagcgctg 1800 gataacagcg cgaaagttta cacctatttt ccgaccctgg cgaacaaagt taatgcgggt 1860 gttcagggcg gtctgtttct gatgtgggcg aacgatgtgg tggaagattt caccaccaac 1920 atcctgcgta aagataccct ggataaaatc agcgatgtta gcgcgattat tccgtatatt 1980 ggtccggcgc tgaacattag caatagcgtg cgtcgtggca attttaccga agcgtttgcg 2040 gttaccggtg tgaccattct gctggaagcg tttccggaat ttaccattcc ggcgctgggt 2100 gcgtttgtga tctatagcaa agtgcaggaa cgcaacgaaa tcatcaaaac catcgataac 2160 tgcctggaac agcgtattaa acgctggaaa gatagctatg aatggatgat gggcacctgg 2220 ctgagccgta ttatcaccca gttcaacaac atcagctacc agatgtacga tagcctgaac 2280 tatcaggcgg gtgcgattaa agcgaaaatc gatctggaat acaaaaaata cagcggcagc 2340 gataaagaaa acatcaaaag ccaggttgaa aacctgaaaa acagcctgga tgtgaaaatt 2400 agcgaagcga tgaataacat caacaaattc atccgcgaat gcagcgtgac ctacctgttc 2460 aaaaacatgc tgccgaaagt gatcgatgaa ctgaacgaat ttgatcgcaa caccaaagcg 2520 aaactgatca acctgatcga tagccacaac attattctgg tgggcgaagt ggataaactg 2580 aaagcgaaag ttaacaacag cttccagaac accatcccgt ttaacatctt cagctatacc 2640 aacaacagcc tgctgaaaga tatcatcaac gaatacttca atctagaagc actagcgagt 2700 100 2733 gggcaccatc accatcacca ttaatgaaag ctt <210> 24 <211> 909

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> Sequência de proteina da fusão CP THALWHTciclico-C <400> 24

Gly Ser Glu Phe Met Pro He Thr He Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15

Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn ile Trp 35 40 45

Vai ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60

Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 85 90 95

Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu He Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 100 105 110 101

Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro lie 115 120 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Vai Asp Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 130 135 140

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 145 150 155 160

Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro Ile Leu ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr ile Ser Ser Vai 245 250 255

Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu lie Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser lie 290 295 300 102

Ala 305 Lys Arg Leu Asn Ser 310 Ile Lys Tyr Ile Gly Glu 325 Tyr Lys Vai Vai Glu Ser Ser 340 Gly Glu Glu Leu Tyr Asn Glu 355 Leu Thr Lys Ile 370 Tyr Asn Vai Gin Asn 375 Thr 385 Pro Vai Thr Ala Asn 390 Ile Asn Gly Phe Asn Ile 405 Pro Lys Gin Asn Leu Ser Arg 420 Asn Pro Met Leu Tyr Leu Phe 435 Thr Lys Cys Thr 450 His Ala Leu Trp His 455 Ser Gly Gly Gly Gly 465 Ser 470 Gly Cys Arg Glu Leu Leu 485 Vai Lys

Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 315 320

Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 330 335

Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 350

Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 365

Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 380

Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 395 400

Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 410 415

Arg Lys Vai Asn Pro Glu Asn 430

Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg 445

Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly 460

Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin 475 480

Asp Leu Pro Phe Ile Gly Asp 490 495

Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn Glu 500 505 510

Glu Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp Gin Vai 515 520 525

Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr 530 535 540

Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn Gin Vai 545 550 555 560

Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr 565 570 575

Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr Phe 580 585 590

Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr Thr 595 600 605

Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly Gly 610 615 620

Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr Asn 625 630 635 640

Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala Ile 645 650 655

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg Arg 660 665 670

Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr Ile Leu Leu 675 680 685 104

Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile 690 695

Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai Ile 700

Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn 705 710

Glu Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn 715 720

Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg 725

Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met 730 735

Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile 740

Ile Thr Gin Phe Asn Asn Ile Ser 745 750

Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn 755 760

Tyr Gin Ala Gly Ala Ile Lys Ala 765

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn 770 775 780

Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn ser Leu Asp Vai Lys Ile 785 790 795 800

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Vai 805 810 815

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu Leu Asn 820 825 830

Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser 835 840 845

His Asn Ile Ile Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala Lys Vai 850 855 860

Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr 865 870 875 880 105

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Glu 885 890 895

Ala Leu Ala Ser Gly His His His His His His Lys Leu 900 905 <210> 25 <211> 213 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADN do ligante CP ANP-C <400> 25 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgttctctgc gtcgttcttc ttgcttcggt 60 ggtcgtatgg accgtatcgg tgctcagtct ggtctgggtt gcaactcttt ccgttacgcg 120 ctagcgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cgcactagtg 180 ctgcagacgc acggtctaga atgataaaag ctt 213

<210> 26 <211> 2790 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de ADN da fusão CP ANP-C 106 <400> 26 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataae 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgttctctg cgtcgttctt cttgcttcgg tggtcgtatg 1380 gaccgtatcg gtgctcagtc tggtctgggt tgcaactctt tccgttacgc gctagcgggc 1440 ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcgcactagt gctgcagtgt 1500 107 cgtgaactgc tggtgaaaaa caccgatctg ccgtttattg gcgatatcag cgatgtgaaa 1560 accgatatct tcctgcgcaa agatatcaac gaagaaaccg aagtgatcta ctacccggat 1620 aacqtqagcg ttgatcaggt gatcctgagc aaaaacacca gcgaacatgg tcagctggat 1680 ctgctgtatc cgagcattga tagcgaaagc gaaattctgc cgggcgaaaa ccaggtgttt 1740 tacgataacc gtacccagaa cgtggattac ctgaacagct attactacct ggaaagccag 1800 aaactgagcg ataacgtgga agattttacc tttacccgca gcattgaaga agcgctggat 1860 aacagcgcga aagtttacac ctattttccg accctggcga acaaagttaa tgcgggtgtt 1920 cagggcggtc tgtttctgat gtgggcgaac gatgtggtgg aagatttcac caccaacatc 1980 ctgcgtaaag ataccctgga taaaatcagc gatgttagcg cgattattcc gtatattggt 2040 ccggcgctga acattagcaa tagcgtgcgt cgtggcaatt ttaccgaagc gtttgcggtt 2100 accggtgtga ccattctgct ggaagcgttt ccggaattta ccattccggc gctgggtgcg 2160 tttgtgatct atagcaaagt gcaggaacgc aacgaaatca tcaaaaccat cgataactgc 2220 ctggaacagc gtattaaacg ctggaaagat agctatgaat ggatgatggg cacctggctg 2280 agccgtatta tcacccagtt caacaacatc agctaccaga tgtacgatag cctgaactat 2340 eaggcgggtg cgattaaagc gaaaatcgat ctggaataca aaaaatacag cggcagcgat 2400 aaagaaaaca tcaaaagcca ggttgaaaac ctgaaaaaca gcctggatgt gaaaattagc 2460 gaagcgatga ataacatcaa caaattcatc cgcgaatgca gcgtgaccta cctgttcaaa 2520 aacatgctgc cgaaagtgat cgatgaactg aacgaatttg atcgcaacac caaagcgaaa 2580 ctgatcaacc tgatcgatag ccacaacatt attctggtgg gcgaagtgga taaactgaaa 2640 gcgaaagtta acaacagctt ccagaacacc atcccgttta acatcttcag ctataccaac 2700 aacagcctgc tgaaagatat catcaacgaa tacttcaatc tagaagcact agcgagtggg 2760 caccatcacc atcaccatta atgaaagctt 2790 108 <210> 27 <211> 928 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de proteína da fusão CP ANP-C <400> 27 Gly Ser Glu Phe Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr 5 10

Ser Asp 15 pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn He Trp 35 40 45

Vai Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg 50 55

Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 60

Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys 65 70

Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp 85

Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 90 95

Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg 100

Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe 115 120

Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 125 109

Asn Thr Phe Asp 130

Phe Asp Vai Asp Phe Asn 135

Ser Vai Asp Vai Lys Thr 140

Arg Gin Gly Asn 145

Asn Trp Vai Lys Thr Gly 150

Ser Ile Asn Pro Ser Vai 155 160

Ile lie Thr Gly

Pro Arg Glu Asn Ile Ile 165 170

Asp Pro Glu Thr Ser Thr 175

Phe Lys Leu Thr 180

Asn Asn Thr Phe Ala Ala 185

Gin Glu Gly Phe Gly Ala 190

Leu Ser Ile Ile 195

Ser Ile Ser Pro Arg Phe 200

Met Leu Thr Tyr ser Asn 205

Ala Thr Asn Asp 210

Vai Gly Glu Gly Arg Phe 215

Ser Lys Ser Glu Phe Cys 220

Met Asp Pro Ile 225

Leu Ile Leu Met His Glu 230

Leu Asn His Ala Met His 235 240

Asn Leu Tyr Gly

Ile Ala Ile Pro Asn Asp 245 250

Gin Thr Ile Ser Ser Vai 255

Thr Ser Asn Ile 260

Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn 265

Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 270

Glu Ile Tyr Ala 275

Phe Gly Gly Pro Thr Ile 280

Asp Leu Ile Pro Lys Ser 285

Ala Arg Lys Tyr 290

Ala Lys Arg Leu 305

Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 295 300

Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser phe Asn 310 315 320 110

Tyr Lys Gin Lys Leu Ile 330

Lys Tyr Ile Gly Glu 325

Arg Lys Tyr Arg Phe 335

Gly Glu Vai Thr Vai Asn 345

Vai Vai Glu Ser Ser 340

Arg Asn Lys Phe Vai 350

Leu Thr Gin Ile Phe Thr 360

Glu Leu Tyr Asn Glu 355

Glu Phe Asn Tyr Ala 365

Gin Asn Arg Lys Ile Tyr 375

Lys Ile Tyr Asn Vai 370

Leu Ser Asn Vai Tyr 380

Asn Ile Leu Asp Asp Asn 390 395

Thr Pro Vai Thr Ala 385

Vai Tyr Asp Ile Gin 400

Pro Lys Ser Asn Leu Asn 410

Asn Gly Phe Asn Ile 405

Vai Leu Phe Met Gly 415

Asn Pro Ala Leu Arg Lys 425

Gin Asn Leu Ser Arg 420

Vai Asn Pro Glu Asn 430

Thr Lys Phe Cys Vai Asp 440

Met Leu Tyr Leu Phe 435

Ala Ile Asp Gly Arg 445

Ser Cys Phe Gly Gly Arg 455

Ser Leu Arg Arg Ser 450

Met Asp Arg Ile Gly 460

Gly Cys Asn Ser Phe Arg 470 475

Ala Gin Ser Gly Leu 465

Tyr Ala Leu Ala Gly 480

Gly Gly Gly Ser

Vai Leu Gin Cys 500

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu 485 490 495

Arg Glu Leu Leu Vai Lys Asn Thr Asp Leu Pro Phe 505 510 111

Ile Gly Asp Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp 515 520 525

Ile Asn Glu Glu Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai 530 535 540

Asp Gin Vai Ile Leu Ser Lys Asn 545 550

Thr Ser Glu His Gly Gin Leu Asp 555 560

Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser 565

Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu 570 575

Asn Gin Vai Phe Tyr Asp Asn Arg 580

Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn 585 590

Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin 595 600

Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp 605

Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu 610 615

Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys 620

Vai Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu 625 630

Ala Asn Lys Vai Asn Ala Gly Vai 635 640

Gin Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp 645

Ala Asn Asp Vai Vai Glu Asp Phe 650 655

Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp 660

Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Vai 665 670

Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly 675 680

Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser 685

Vai Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu 690 695

Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr 700 112

Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Ala 705 710 715 720

Phe Vai Ile Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys Thr 725 730 735

Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr 740 745 750

Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn 755 760 765

Asn Ile Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala 770 775 780

Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp 785 790 795 800

Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp 805 810 815

Vai Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu 820 825 830

Cys Ser Vai Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai lie Asp 835 840 845

Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn Leu 850 855 860

Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys 865 870 875 880

Ala Lys Vai Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn lie Phe 885 890 895 113

Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe 900 905 910 Asn Leu Glu Ala Leu Ala Ser Gly His His His His His His Lys Leu 915 920 925 <210> 28 <211> 213 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de ADN do ligante CP VIP-C <400> 28 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgtcactctg acgctgtttt caccgacaac 60 tacacccgtc tgcgtaaaca gatggctgtt aaaaaatacc tgaactctat cctgaacgcg 120 ctagcgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cgcactagtg 180 ctgcagacgc acggtctaga atgataaaag ctt 213

<21 0> 29 <211> 2730 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de ADN da fusão CP VIP-C 114 <4 Ο 0> 2 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 60 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 120 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 180 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 240 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 300 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 360 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 420 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 480 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 540 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 600 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 660 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 720 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 780 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 840 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 900 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 960 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1020 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1080 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1140 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1200 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1260 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgtggtggt cgtggtgaca tgttcggtgc tgcgctagcg 1320 ggcgtcgacg cgattgatgg tcgtcactct gacgctgttt tcaccgacaa ctacacccgt 1380 ctgcgtaaac agatggctgt taaaaaatac ctgaactcta tcctgaacgc gctagcgggc 1440 ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcgcactagt gctgcagaaa 1500 accgatatct tcctgcgcaa agatatcaac gaagaaaccg aagtgatcta ctacccggat 1560 115 aacgtgagcg ttgatcaggt gatcctgagc aaaaacacca gcgaacatgg tcagctggat 1620 ctgctgtatc cgagcattga tagcgaaagc gaaattctgc cgggcgaaaa ccaggtgttt 1680 tacgataacc gtacccagaa cgtggattac ctgaacagct attactacct ggaaagccag 1740 aaactgagcg ataacgtgga agattttacc tttacccgca gcattgaaga agcgctggat 1800 aacagcgcga aagtttacac ctattttccg accctggcga acaaagttaa tgcgggtgtt 1860 ca999cggtc tgtttctgat gtgggcgaac gatgtggtgg aagatttcac caccaacatc 1920 ctgcgtaaag ataccctgga taaaatcagc gatgttagcg cgattattcc gtatattggt 1980 ccggcgctga acattagcaa tagcgtgcgt cgtggcaatt ttaccgaagc gtttgcggtt 2040 accggtgtga ccattctgct ggaagcgttt ccggaattta ccattccggc gctgggtgog 2100 tttgtgatct atagcaaagt gcaggaacgc aacgaaatca tcaaaaccat cgataactgc 2160 ctggaacagc gtattaaacg ctggaaagat agctatgaat ggatgatggg cacctggctg 2220 agccgtatta tcacccagtt caacaacatc agctaccaga tgtacgatag cctgaactat 2280 caggcgggtg cgattaaagc gaaaatcgat ctggaataca aaaaatacag cggcagcgat 2340 aaagaaaaca tcaaaagcca ggttgaaaac ctgaaaaaca gcctggatgt gaaaattagc 2400 gaagcgatga ataacatcaa caaattcatc cgcgaatgca gcgtgaccta cctgttcaaa 2460 aacatgctgc cgaaagtgat cgatgaactg aacgaatttg atcgcaacac caaagcgaaa 2520 ctgatcaacc tgatcgatag ccacaacatt attctggtgg gcgaagtgga taaactgaaa 2580 gcgaaagtta acaacagctt ccagaacacc atcccgttta acatcttcag ctataccaac 2640 aacagcctgc tgaaagatat catcaacgaa tacttcaatc tagaagcact agcgagtggg 2700 caccatcacc atcaccatta atgaaagctt 2730 <210> 30 <211> 908

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223>

Sequência de proteína da fusão

CP VIP-C 116 30 <400>

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu 15 10 15

Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Vai Ile Pro Asp 20 25 30

Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Vai 35 40 45

Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp 50 55 60

Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg 65 70 75 80

Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr 85 90 95

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp 100 105 110

Phe Asp Vai Asp Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr Arg Gin Gly Asn 115 120 125

Asn Trp Vai Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai Ile Ile Thr Gly 130 135 140

Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr 145 150 155 160

Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile 165 170 175

Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp 180 185 190 117

Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys 195 200

Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile 205

Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn 210 215 Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr 225 230 Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys 245 Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu 260 Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr 275 280 Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro 290 295 Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg 305 310 Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg 325 Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu 340 Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu 355 360 Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai 370 375

Ala Met His Asn Leu Tyr Gly 220

Ser Ser Vai Thr Ser Asn Ile 235 240

Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala 250 255

Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr 270

Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu 285

Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly 300

Tyr Arg Phe Vai Vai Glu Ser 315 320

Lys Phe Vai Glu Leu Tyr Asn 330 335

Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn 350

Asn Vai Tyr Thr Pro Vai Thr 365

Asp IIe Gin Asn Gly Phe Asn 380 118

Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly Gin Asn Leu Ser 385 390 395 400 Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Vai Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu 405 410 415 Phe Thr Lys Phe Cys Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg Gly Gly Arg Gly 420 425 430 Asp Met Phe Gly Ala Ala Leu Ala Gly Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg 435 440 445 His Ser Asp Ala Vai Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin 450 455 460 Met Ala Vai Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Ala Leu Ala Gly 465 470 475 480 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu 485 490 495 Vai Leu Gin Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn Glu Glu 500 505 510 Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp Gin Vai Ile 515 520 525 Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr Pro 530 535 540 Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn Gin Vai Phe 545 550 555 560

Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr Tyr 565 570 575 119

Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr Phe Thr 580 585 590

Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr Thr Tyr 595 600 605

Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly Gly Leu 610 615 620

Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr Asn Ile 625 630 635 640

Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala Ile Ile 645 650 655

Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg Arg Gly 660 665 670

Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr lie Leu Leu Glu 675 680 685

Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai Ile Tyr 690 695 700

Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Cys 705 710 715 720

Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met Met 725 730 735

Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn lie Ser Tyr 740 745 750

Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala ile Lys Ala Lys 755 760 765 120

Ile Asp 770 Leu Glu Tyr Lys Lys 775 Lys 785 Ser Gin Vai Glu Asn 790 Leu Glu Ala Met Asn Asn 805 Ile Asn Tyr Leu Phe Lys 820 Asn Met Leu Phe Asp Arg 835 Asn Thr Lys Ala Asn ile 850 Ile Leu Vai Gly Glu 855 Asn 865 ser Phe Gin Asn Thr 870 Ile Asn Ser Leu Leu Lys 885 Asp Ile Leu Ala Ser Gly His 900 His His <210> 31 <211> 210 <212> ADN <213> Sequência Artificia

Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn Ile 780

Asn Ser Leu Asp Vai Lys Ile Ser 795 800 Phe IIe Arg Glu Cys Ser Vai Thr 810 815

Lys Vai Ile Asp Glu Leu Asn Glu 825 830

Leu lie Asn Leu Ile Asp Ser His 845

Asp Lys Leu Lys Ala Lys Vai Asn 860

Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr Asn 875 880

Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Glu Ala 890 895

His His Lys Leu 905 121 <220> <223> Sequência de ADN do ligante CP péptido libertador de

gastrina-C <400> 31 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgtgttccgc tgccggctgg tggtggtacc 60 gttctgacca aaátgtaccc gcgtggtaac cactgggctg ttggtcacct gatggcgcta 120 gcgggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt agcggcggtg gcggtagcgc actagtgctg 180 cagacgcacg gtctagaatg ataaaagctt 210 <210> 32 <211> 2787

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de ADN da fusão CP péptido libertador de

gastrina-C <400> 32 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 122 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgtgttccg ctgccggctg gtggtggtac cgttctgacc 1380 aaaatgtacc cgcgtggtaa ccactgggct gttggtcacc tgatggcgct agcgggcggt 1440 ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtcgt 1500 gaactgctgg tgaaaaacac cgatctgccg tttattggcg atatcagcga tgtgaaaacc 1560 gatatcttcc tgcgcaaaga tatcaacgaa gaaaccgaag tgatctacta cccggataac 1620 gtgagcgttg atcaggtgat cctgagcaaa aacaccagcg aacatggtca gctggatctg 1680 ctgtatccga gcattgatag cgaaagcgaa attctgccgg gcgaaaacca ggtgttttac 1740 gataaccgta cccagaacgt ggattacctg aacagctatt actacctgga aagccagaaa 1800 ctgagcgata acgtggaaga ttttaccttt acccgcagca ttgaagaagc gctggataac 1860 agcgcgaaag tttacaccta ttttccgacc ctggcgaaca aagttaatgc gggtgttcag 1920 ggcggtctgt ttctgatgtg ggcgaacgat gtggtggaag atttcaccac caacatcctg 1980 123 cgtaaagata ccctggataa aatcagcgat gttagcgcga ttattccgta tattggtccg 2040 gcgctgaaca ttagcaatag cgtgcgtcgt ggcaatttta ccgaagcgtt tgcggttacc 2100 ggtgtgacca ttctgctgga agcgtttccg gaatttacca ttccggcgct gggtgcgttt 2160 gtgatctata gcaaagtgca ggaacgcaac gaaatcatca aaaccatcga taactgcctg 2220 gaacagcgta ttaaacgctg gaaagatagc tatgaatgga tgatgggcac ctggctgagc 2280 cgtattatca cccagttcaa caacatcagc taccagatgt acgatagcct gaactatcag 2340 gcgggtgcga ttaaagcgaa aatcgatctg gaatacaaaa aatacagcgg cagcgataaa 2400 gaaaacatca aaagccaggt tgaaaacctg aaaaacagcc tggatgtgaa aattagcgaa 2460 gcgatgaata acatcaacaa attcatccgc gaatgcagcg tgacctacct gttcaaaaac 2520 atgctgccga aagtgatcga tgaactgaac gaatttgatc gcaacaccaa agcgaaactg 2580 atcaacctga tcgatagcca caacattatt ctggtgggcg aagtggataa actgaaagcg 2640 aaagttaaca acagcttcca gaacaccatc ccgtttaaca tcttcagcta taccaacaac 2700 agcctgctga aagatatcat caacgaatac ttcaatctag aagcactagc gagtgggcac 2760 catcaccatc accattaatg aaagctt 2787 <210> 33 <211> 927

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de proteína da fusão CP péptido libertador de

gastrina-C 124 33 <4 00>

Gly Ser Glu Phe Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15

Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 35 40 45

Vai Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60

Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 85 90 95

Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 100 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 115 120 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Vai Asp Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 130 135 140

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 145 150 155 160

Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn lie Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175 125

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr Ile Ser Ser Vai 245 250 255

Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 290 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320

Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335

Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365 126

Lys Ile 370

Tyr Asn

Vai Gin

Thr Pro 385

Vai Thr

Ala Asn 390

Asn Gly

Phe Asn

Ile Pro 405

Gin Asn

Leu Ser 420

Arg Asn

Asn Arg 375 Ile Leu Lys Ser Pro Ala

Lys Ile

Tyr Leu 380

Ser Asn

Vai Tyr

Met Leu

Tyr Leu 435

Phe Thr

Lys Phe 440

Vai Pro 450

Leu Pro

Ala Gly

Gly Gly 455

Arg Gly 465

Asn His

Trp Ala 470

Vai Gly

Asp Asp Asn Leu 410 Leu Arg 425 Cys Vai Thr Vai His Leu

Asn Vai 395

Tyr Asp

Ile Gin 400

Asn Vai

Leu Phe

Met Gly 415

Lys Vai

Asp Ala

Leu Thr 460

Met Ala 475

Asn Pro 430

Glu Asn

Ile Asp 445

Lys Met

Leu Ala

Gly Arg

Tyr Pro

Gly Gly 480

Gly Gly

Ser Gly

Gly Gly 485

Gly Ser

Gly Gly 490

Gly Gly

Ser Ala

Leu Vai 495

Leu Gin

Cys Arg 500

Glu Leu

Leu Vai

Lys Asn 505

Thr Asp

Leu Pro 510

Phe Ile

Gly Asp Ile 515

Ser Asp Vai

Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile 520 525

Asn Glu Glu Thr

Glu Vai 530

Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp 535 540

Gin val 545

Ile Leu Ser Lys 550

Asn Thr Ser Glu His Gly Gin Leu Asp Leu 555 560 127

Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn 565 570 575

Gin Vai Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser 580 585 590

Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe 595 600 605

Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai 610 615 620

Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin 625 630 635 640

Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr 645 650 655

Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser 660 665 670

Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai 675 680 685

Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr Ile 690 695 700

Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Ala Phe 705 710 715 720

Vai Ile Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys Thr Ile 725 730 735

Asp Asn Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu 740 745 750 128

Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn 755 760 765 Ile Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala Ile 770 775 780 Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys 785 790 795 800 Glu Asn Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Vai 805 810 815

Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys 820 825 830

Ser Vai Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu 835 840 845

Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn Leu Ile 850 855 860

Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala 865 870 875 880

Lys Vai Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser 885 890 895

Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp lie lie Asn Glu Tyr Phe Asn 900 905 910

Leu Glu Ala Leu Ala Ser Gly His His His His His His Lys Leu 915 920 925 129 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 34

Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 35

Cys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Cys 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Péptido sintético 130 36 <4 Ο 0>

Thr His Ala Leu Trp His Thr 1 5 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido LEBP-1 <400> 37

Gin Pro Phe Met Gin Cys Leu Cys Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Cys 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Péptido LEBP-2 <40 0> 38

Arg Asn Vai Pro Pro Ile Phe Asn Asp Vai Tyr Trp Ile Ala Phe 15 10 15 131 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido LEBP-3 <400> 39

Vai Phe Arg Vai Arg Pro Trp Tyr Gin Ser Thr Ser Gin Ser 15 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 40

Ser Glu Arg Ser Met Asn Phe 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético 132 41 <400>

Tyr Gly Leu Pro His Lys Phe 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <40 0> 42

Pro Ser Gly Ala Ala Arg Ala 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 43

Leu Pro His Lys Ser Met Pro 1 5 133 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 44

Leu Gin His Lys Ser Met Pro 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 45

Phe Ser Leu Ser Lys Pro Pro 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Péptido sintético 134 46 <4 Ο 0>

His Ser Met Gin Leu Ser Thr 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <40 0> 47 Ser Thr Gin Ala Met Phe Gin 1 5

Lisboa, 30 de Setembro de 2013 135

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão polipeptídica de cadeia simples, compreendendo: (a) uma protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar especificamente uma proteína SNARE do aparelho de fusão exocítica de uma célula alvo; (b) uma Unidade de Direccionamento que é capaz de ligação a um Local de Ligação na célula alvo, cujo Local de Ligação é capaz de sofrer endocitose para ser incorporado num endossoma dentro da célula alvo; (c) um local de clivagem de protease em cujo local a proteína de fusão é clivável por uma protease, em que o local de clivagem de protease está localizado entre a protease não citotóxica ou um seu fragmento e a Unidade de Direccionamento de modo que, quando o local de clivagem de protease for clivado, a região N-terminal da Unidade de Direccionamento torna-se exposta; e (d) um domínio de translocação que é capaz de translocar a protease ou fragmento de protease de dentro de um endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol da célula alvo; em que a Unidade de Direccionamento está localizada entre o local de clivagem da protease e o domínio de translocação; e em que a Unidade de Direccionamento tem um domínio N-terminal que é capaz de ligação ao Local de Ligação na célula alvo.
2. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 1, em que a Unidade de Direccionamento e o local de clivagem de protease 1 estão separados por no máximo 10 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, no máximo 5 resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, no máximo zero resíduos de aminoácidos.
3. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a protease não citotóxica é uma cadeia L de neurotoxina clostridial.
4. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o domínio de translocação é o domínio HN de uma neurotoxina clostridial.
5. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a Unidade de Direccionamento compreende no máximo 50 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, no máximo 40 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos 30 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, no máximo 20 resíduos de aminoácidos.
6. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a Unidade de Direccionamento compreende um ligando PAR, de um modo preferido, o ligando PARI.
7. Proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-5, em que a Unidade de Direccionamento é um ligando que se liga a PTH-1, de um modo preferido, o ligando compreende um péptido PTH; ou em que a Unidade de Direccionamento compreende uma sequência de ligação de integrina linear ou cíclica, de um modo preferido, uma sequência de ligação tripla Arg-Gly-Asp (RGD). 2
8. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a Unidade de Direccionamento liga-se a uma célula seleccionada do grupo consistindo em: uma célula secretora de muco ou uma célula neuronal que controla ou dirige a secreção de muco; uma célula endócrina; uma célula inflamatória; uma célula exócrina; uma célula imunológica; uma célula cardiovascular; ou uma célula óssea.
9. Proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-8, em que a Unidade de Direccionamento é um ligando seleccionado do grupo consistindo em: TFLLR; PAR-1; PTH; VIP ou análogo de VIP seleccionado do grupo consistindo em [r15'20'2i^ l17]-VIP, [R15'20'21, L17]-VIP-GRR, [R2'8'9'16'24]-VIP ou [rUuu!6,24,25j _yjp. agonistas do adrenorreceptor beta2; péptido libertador de gastrina (GRP); péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP); hormona estimuladora da tiróide (TSH); insulina; factor de crescimento de tipo insulina; hormona libertadora de TSH (protirrelina); hormona libertadora de FSH/LH (gonadorrelina); hormona libertadora de corticotrofina (CRH); hormona adenocorticotrófica (ACTH); péptido activador da adenilo ciclase pituitária; um ligando para o domínio C4 de Fc de IgE; um ligando para o receptor do complemento de C3a/C4a-R; um antigénio reactivo para o receptor do complemento de CR4; factor estimulador de macrófago; um antigénio associado com o complemento do receptor de iC3b; IL8; caracteristica de fragmento/superfície do vírus Epstein Barr; trombina; péptido agonista do receptor de trombina (TRAP); anticorpos que reconhecem antigénios de superfície de GPlb; calcitonina; factor de diferenciação de osteoclastos TRANCE, RANKL ou OPGL; péptido linear ou cíclico seleccionado do grupo consistindo de: THALWHT, LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC) , LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) e LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) , 3 CDSAFVTVDWGRSMSLC, SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP, FSLSKPP, HSMQLST, STQAMFQ; e ANP.
10. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a proteína de fusão compreende um marcador de purificação.
11. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 10, em que a proteína de fusão compreende um marcador de purificação que está presente na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína de fusão.
12. Proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 10 ou 11, em que o marcador de purificação está ligado à proteína de fusão através de uma molécula espaçadora peptídica.
13. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o domínio de translocação está separado da Unidade de Direccionamento através de uma molécula espaçadora peptídica.
14. Proteína de fusão polipeptídica compreendendo qualquer uma de SEQ ID N°: 10, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 e 33.
15. Sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão polipeptídica de acordo com qualquer Reivindicação anterior.
16. Sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 15, em que a molécula de ácido nucleico compreende qualquer uma de SEQ ID N° : 1-9, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29 e 32. 4
17. Vector de ADN, o qual compreende um promotor, uma sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 15 ou Reivindicação 16, em que a referida sequência de ADN está a localizada a jusante do promotor e um terminador está localizado a jusante da construção de ADN.
18. Cadeia de ADN complementar da sequência de ADN de acordo com a Reivindicação 15 ou Reivindicação 16.
19. Método para preparar uma proteína de fusão polipeptídica de cadeia simples de acordo com qualquer das Reivindicações 1-14, compreendendo a expressão de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 15 ou Reivindicação 16, ou um vector de ADN de acordo com a Reivindicação 17, numa célula hospedeira.
20. Método para preparar um agente não citotóxico, compreendendo: (a) contactar uma proteína de fusão polipeptídica de cadeia simples de acordo com qualquer das Reivindicações 1-14 com uma protease capaz de clivar o local de clivagem de protease; (b) clivar o local de clivagem de protease; e assim formar uma proteína de fusão de cadeia dupla.
21. Polipéptido não citotóxico, obtenível pelo método da Reivindicação 20, em que o polipéptido é um polipéptido de cadeia dupla e em que: (a) a primeira cadeia compreende a protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de 5 protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica de uma célula alvo; (b) a segunda cadeia compreende a TM e o domínio de translocação que é capaz de translocar a protease ou fragmento de protease de dentro de um endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol da célula alvo; e a primeira e a segunda cadeia estão ligadas, em conjunto, por persulfureto.
22. Utilização de uma proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-14 ou um polipéptido de acordo com a Reivindicação 21, para o fabrico de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar um estado clínico ou doença seleccionada do grupo consistindo de hipersecreção de muco, asma e/ou doença pulmonar obstrutiva crónica, neoplasia endócrina incluindo MEN, tirotoxicose e outras doenças dependentes de hipersecreções da tiróide; acromegalia, hiperprolactinemia, doença de Cushings e outras doenças dependentes da hipersecreção da pituitária anterior; hiperandrogenismo, anovulação crónica e outras doenças associadas com síndrome do ovário poliquístico, alergias (rinite alérgica sazonal (febre dos fenos), conjuntivite alérgica, rinite vasomotora e alergia alimentar), eosinofilia, asma, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, colite ulcerosa, doença de Crohn, hemorroidas, prurido, glomerulonefrite, hepatite, pancreatite, gastrite, vasculite, miocardite, psoríase, eczema, fibrose crónica induzida por radiação, cicatrização pulmonar e outros distúrbios fibróticos, hipersecreção de muco de células secretoras de muco localizadas no tracto alimentar, em particular localizadas 6 no cólon, miastenia grave, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, transplante de órgãos, transplante de tecidos, transplante de fluidos, doença de Graves, tirotoxicose, diabetes auto-imune, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatite auto-imune crónica, gastrite auto-imune, anemia perniciosa, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, síndrome de Sjogren, cirrose biliar primária, polimiosite, escleroderma, esclerose sistémica, penfigóide vulgar, pênfigo bolhoso, miocardite, cardite reumática, glomerulonefrite (tipo de Goodpasture), uveíte, orguite, colite ulcerosa, vasculite, gastrite atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo 1, estados cardiovasculares e/ou hipertensão, e estados ósseos, tais como osteopetrose e osteoporose.
23. Proteína de fusão de acordo com gualquer das Reivindicações 1-14 ou um polipéptido de acordo com a Reivindicação 21, para utilização no tratamento, prevenção ou melhoria de um estado clínico ou doença seleccionada do grupo consistindo de hipersecreção de muco, asma e/ou doença pulmonar obstrutiva crónica, neoplasia endócrina incluindo MEN, tirotoxicose e outras doenças dependentes de hipersecreções da tiróide; acromegalia, hiperprolactinemia, doença de Cushings e outras doenças dependentes da hipersecreção da pituitária anterior; hiperandrogenismo, anovulação crónica e outras doenças associadas com síndrome do ovário poliquístico, alergias (rinite alérgica sazonal (febre dos fenos), conjuntivite alérgica, rinite vasomotora e alergia alimentar), eosinofilia, asma, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, colite ulcerosa, doença de Crohn, hemorroidas, prurido, glomerulonefrite, hepatite, pancreatite, gastrite, 7 vasculite, miocardite, psoriase, eczema, fibrose crónica induzida por radiação, cicatrização pulmonar e outros distúrbios fibróticos, hipersecreção de muco de células secretoras de muco localizadas no tracto alimentar, em particular localizadas no cólon, miastenia grave, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso discóide, transplante de órgãos, transplante de tecidos, transplante de fluidos, doença de Graves, tirotoxicose, diabetes auto-imune, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, neutropenia, hepatite auto-imune crónica, gastrite auto-imune, anemia perniciosa, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, sindrome de Sjogren, cirrose biliar primária, polimiosite, escleroderma, esclerose sistémica, penfigóide vulgar, pênfigo bolhoso, miocardite, cardite reumática, glomerulonefrite (tipo de Goodpasture), uveite, orquite, colite ulcerosa, vasculite, gastrite atrófica, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo 1, estados cardiovasculares e/ou hipertensão, e estados ósseos, tais como osteopetrose e osteoporose. Lisboa, 30 de Setembro de 2013