CN101098885B - 包含非细胞毒性蛋白酶、寻靶部分、蛋白酶切割位点和转运结构域的融合蛋白 - Google Patents

包含非细胞毒性蛋白酶、寻靶部分、蛋白酶切割位点和转运结构域的融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供了单链、多肽融合蛋白，其包含：非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；寻靶部分，其能结合到靶细胞上的结合位点，该结合位点能经历内吞作用而被导入到靶细胞内的内体中；蛋白酶切割位点，在该位点上融合蛋白可被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位点位于非细胞毒性蛋白酶或其片段与寻靶部分之间；以及转运结构域，其能转运蛋白酶或蛋白酶片段从胞内体内部穿过胞内体膜，并进入靶细胞的胞质溶胶。

Description

包含非细胞毒性蛋白酶、寻靶部分、蛋白酶切割位点和转运结构域的融合蛋白
本发明涉及非细胞毒性融合蛋白，及其治疗应用。
毒素按它们对靶细胞影响的类型通常可被分为两类。更具体地说，第一类毒素杀死它们自然靶细胞，因此被称为细胞毒素分子(cytotoxictoxinmolecules)。这组毒素的例子是植物毒素例如蓖麻毒素、相思豆毒素，和细菌毒素例如白喉毒素、假单细胞外毒素A等等。为了治疗细胞失调和像癌症这样的疾病，细胞毒性已经吸引了很多人设计“魔法子弹(magicbullet)”的兴趣(例如，免疫偶联物(immunoconjugates)，其包括细胞毒性组分和与靶细胞上特定标志物结合的抗体)。典型地，细胞毒素通过抑制细胞的蛋白合成过程杀掉它们的靶细胞。
第二类毒素，其被称为非细胞毒素(non-cytotoxictoxins)，并不杀死它们的自然靶细胞(如它们的名字证实的)。非细胞毒素与它们的细胞毒素对等物相比，吸引了较少的商业兴趣，非细胞毒素通过抑制蛋白合成以外的其它细胞过程来施加它们对靶细胞的影响。非细胞毒素可被多种植物和微生物所产生，这些微生物例如梭菌属某种(Clostridiumsp.)和奈瑟菌属某种(Neisseriasp.)。
梭菌神经毒素(Clostridialneurotoxins)是典型地分子量在150KDa(150,000道尔顿)级别的蛋白。它们可由多种细菌产生，特别是梭菌属(Clostridium)，其最重要的为破伤风梭菌(C.tetani)，和肉毒梭菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)和阿根廷梭菌(C.argentinense)的多个种。目前，有八种不同类别的梭菌神经毒素，即：破伤风毒素和血清型为A、B、Cl、D、E、F、G的肉毒神经毒素，它们具有相似的结构和作用方式。
梭菌神经毒素代表了非细胞毒素分子的一个主要类型，它们作为单链多肽由宿主细菌所合成，该多肽通过蛋白水解切割活动被翻译后修饰进而形成被二硫键连在一起的两条多肽链。这两条链叫做重链(H-chain)和轻链(L-chain)，该重链的分子量大约为100KDa(100,000道尔顿)，轻链的分子量大约为50KDa(50,000道尔顿)。
轻链具有蛋白酶功能(锌依赖性肽链内切酶活性)以及对与囊泡和/或质膜相连且涉及胞吐过程的蛋白具有高度的底物特异性。源自不同梭菌种类或血清型的轻链可水解不同的、但是特异的三种底物蛋白中的一种的肽键，这三种蛋白即突触囊泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25。这些底物是神经分泌机制的重要成分。
奈瑟菌属某种(Neisseriasp.)，最重要的为来自淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)种类，可产生功能相似的非细胞毒性蛋白酶。这种蛋白酶的一个实例是IgA蛋白酶(见WO99/58571)。
在本领域，已经充分证明了毒素分子可重新靶向(retarget)于不是毒素自然靶细胞的细胞。当发生所谓的重新靶向时，修饰的毒素能结合于期望的靶细胞并随后转运进入细胞溶胶，从而能够对靶细胞施加其影响。所述的重新靶向通过用不同的寻靶部分(TargetingMoiety(TM))代替毒素的天然寻靶部分来完成。在这点上，选择TM以便其能与期望的靶细胞结合，并且允许修饰的毒素随后进入靶细胞内的内体中。修饰的毒素也包含转运结构域，以便能让非细胞毒性蛋白酶进入胞质溶胶。该转运结构域可以是毒素的天然转运结构域，或者它也可以是源自于有转运活性的微生物蛋白的不同的转运结构域。
例如，WO94/21300描述了修饰的梭菌神经毒素分子，该分子能调控存在于靶细胞表面的膜内在蛋白(整合膜蛋白，IntegralMembranceProtein(IMP))的密度。该修饰的神经毒素分子因此能控制靶细胞的细胞活性(举例来说，葡萄糖的吸收)。WO96/33273和WO99/17806描述了定位于外周感觉传入神经的修饰的梭菌神经毒素分子。该修饰的神经毒素分子因此能表现出镇痛作用。WO00/10598描述了定位于粘液分泌过多细胞(或者控制所述的粘液分泌过多细胞的神经细胞)的修饰的梭菌神经毒素分子的制备，该修饰的神经毒素能抑制所述细胞的分泌过多。WO01/21213描述了定位于多种不同类型的非神经靶细胞的修饰的梭菌神经毒素分子。该修饰的分子因此能抑制靶细胞的分泌。在重新靶向的毒素分子的技术领域里，其它的公布包括WO00/62814、WO00/04926、US5,773,586、WO93/15766、WO00/61192和WO99/58571。
上述的TM替代作用可被传统的化学偶联技术所实现，这些技术对于技术人员是众所周知的。在这点上，Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugatetechniques，AcademicPress和Wang，S.S.(1991)，Chemistryofproteinconjugationandcross-linking，CRCPress，可作为参考。
然而，化学偶联(chemicalconjugation)经常是不精确的。例如，在偶联之后，TM可以在一个以上的附着点上连接到结合体的其它部分。
化学偶联也难以控制。例如，TM可通过蛋白酶成分和/或转运成分上的附着点连接到修饰的毒素的其它部分。当为了治疗功效要求仅仅附着于其中一个所述的成分时(优选地在单一位点)，这是有问题的。
因此，化学偶联导致了修饰的毒素分子的混合群体，这是不想要的结果。
作为对化学偶联的替代方法，TM替代可通过单一多肽融合蛋白的重组制备来实现(见WO98/07864)。这种技术是基于细菌体内制备天然梭菌神经毒素(也就是全毒素)的机制，该技术导致融合蛋白具有以下结构排列：氨基-[蛋白酶成分]-[转运成分]-[TM]-羧基
依照WO98/07864，TM被置于靠近融合蛋白的C-末端的地方。然后融合蛋白通过使用蛋白酶处理被活化，该蛋白酶的切割位点位于蛋白酶成分和转运成分之间。双链蛋白被如此产生了，该蛋白包括蛋白酶成分，其作为单一多肽链通过共价键(通过二硫桥)与包含转运成分和TM的另一条单一多肽链相连接。当WO98/07864的方法遵照梭菌全毒素的自然表达的系统时(依照融合蛋白的结构排列)，本发明人发现这个系统可以导致某些融合蛋白的生成，这些融合蛋白对目的靶细胞具有基本上降低的结合能力。
因此需要一个替代的或改善的系统去构建非细胞毒性的融合蛋白。
本发明通过提供单链多肽融合蛋白，来致力于解决一个或多个上述的问题，所述单链多肽融合蛋白包括：a.非细胞毒性蛋白酶，或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能在靶细胞里切割胞吐融合器(exocyticfusionapparatus)的蛋白；b.寻靶蛋白，其能结合于靶细胞上的结合位点，该结合位点能经历内吞作用以导入处于靶细胞内的内体中；c.蛋白酶切割位点，在该位点融合蛋白可被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位点位于非细胞毒性蛋白酶或其片段与寻靶部分之间；以及转运结构域，其能转运蛋白酶或蛋白酶片段从内体中穿过内体膜并进入靶细胞的胞质溶胶中。
WO98/07864系统对于制备含有TM的结合体进行得很好，为了与靶细胞上的结合位点发生相互作用，该TM需要C-末端结构域。在这点上，WO98/07864提供了具有C-末端结构域的融合蛋白，该结构域可“自由地”与靶细胞上结合位点作用。本发明人已发现这种结构排列并不是适合所有TM。更详细地说，本发明人已发现WO98/07864融合蛋白系统对于需要用于与靶细胞上结合位点进行相互作用的N-末端结构域的TM并不是最佳的。当TM需要特定的N-末端氨基酸残基，或包括用于与靶细胞上结合位点进行相互作用的N-末端氨基酸残基的特定的氨基酸残基序列时，这个问题变得特别尖锐。
与WO98/07864相反，本发明提供了用于制备非细胞毒性偶联物的系统，其中偶联物的TM成分具有N-末端结构域(或内部结构域序列)，其能结合于靶细胞上的结合位点。
本发明的非细胞毒性蛋白酶成分是非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割三个底物蛋白之一的不同、但是特异性的肽键，这三个蛋白就是胞吐融合器官的突触囊泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25。这些底物是神经分泌系统的重要成分。本发明的非细胞毒性蛋白酶成分优选为奈瑟菌IgA蛋白酶或其片段，或者梭菌神经毒素的轻链或其片段。特别优选的非细胞毒性蛋白酶成分是肉毒神经毒素(BoNT)的轻链或其片段。
本发明的转运成分能让非细胞毒性蛋白酶(或其片段)转运入靶细胞，于是蛋白酶活性的功能表达在靶细胞的胞质溶胶中进行。转运成分优选在低pH值的条件中能在脂膜上形成离子可渗透孔的成分。优选地，已经发现仅使用能在内体膜内形成孔的那部分蛋白分子。转运成分可得自微生物蛋白源，特别地得自细菌或病毒蛋白源。因此，在一个实施方式中，转运成分是酶的转运结构域，例如细菌毒素或病毒蛋白。本发明的转运成分优选地是梭菌神经毒素的重链或其片段。最优选地是HN结构域(或其功能成分)，其中HN是指梭菌神经毒素的重链(H-链)的一部份或片段，其大约相当于重链的氨基-端的那半部分，或者与完整重链那一片段相一致的结构域。
本发明的TM成分负责本将发明的偶联物结合于靶细胞上的结合位点。因此，TM成分仅仅是一种配体，通过它，本发明的偶联物与选定的靶细胞结合。
在本发明的背景中，靶细胞可以是任意的靶细胞，尽管在限制性条文中靶细胞不是伤害性感觉传入神经细胞(nociceptivesensoryafferent)，例如初级感觉传入神经细胞(primarysensoryafferent)。因此，TM可结合于非神经细胞和/或神经细胞。
按惯例，需要确定TM是否结合一种给定的靶细胞。例如，可使用简单的辐射取代实验进行，在该实验中，在过量未标记配体存在下，代表靶细胞的组织或细胞暴露于标记的(例如用氚示踪的)配体。在该实验中，非特异性和特异性结合的相对比例可以被估计，因此能够证实配体是否与靶细胞结合。任选地，所述实验可包括一种或多种结合拮抗剂，并且所述实验可进一步包含观测配体结合的丧失。这种类型的实验的实例可在Humle，E.C.(1990)，receptor-bindingstudies，abriefoutline，pp.303-311，InReceptorbiochemistry，ApracticalApproach，Ed.E.C.Hulme，OxfordUnivesityPress(牛津大学出版社出版的“受体生物化学，实践方法”中的303到311的一篇名为“受体结合研究”的概述)中找到。
本发明的融合蛋白，当与相应的“自由”TM的比较时，总体上表现了对靶细胞减少的结合亲和力(在高达100倍的区域)。然而，尽管有这样的观测结果，本发明的融合蛋白令人惊奇的展示了良好的功效。这被归功于两个主要的特性。第一，非细胞毒性蛋白酶成分是有催化性的，因此少许这种分子的治疗效果被迅速放大。第二，存在于靶细胞上的受体仅仅作为治疗剂进入的入口，不需要为了完成配体受体介导的药理反应而被刺激到一个期望的水平。因此，本发明的融合蛋白使用的剂量可低于将被使用的其它类型的治疗分子的剂量，后者典型地以高达微克到毫克的数量(甚至高达数百毫克)被使用。相反，本发明的融合蛋白可被以低得多的剂量使用，典型地为低至少10倍的剂量，更典型地为低100倍的剂量。
优选地，TM包括最多50个氨基酸残基，更优选地，最多40个氨基酸残基，特别优选地，最多为30个氨基酸残基，最优选地，最多为20个氨基酸残基。
蛋白酶活化的受体配体代表了本发明的TM的优选组，特别是PAR1。PARs代表了7跨膜受体G-蛋白偶联受体的独特亚型，因为它们经蛋白水解修饰暴露出一个新的细胞外N-末端，其作为锚定的活化配体发挥作用。已经被确定，PAR1的激动剂(例如TFLLR)能活化它们的同源受体。
甲状旁腺激素(Parathyroidhormone(PTH))也代表了本发明的优选的TM。PTH由甲状旁腺释放并且结合于PTH-1受体。这种受体分布广泛，但在主要位于肾脏的PTH靶组织和骨骼中特别丰富。
因此，本发明最优选的TM是：
配体 参考文献
蛋白酶活化的受体配体(Proteaseactivated receptor Ligand(PAR1)) C.K.Derian，B.E.Maryanoff，P.Andrade-Gordon，and H-C Zhang DRUGDEVELOPMENT RESEARCH 59：355(2003)
PTH Shimizu M.，et al 2000，J Biol Chem.Jul21；275(29)：21836-43
依照本发明的一个实施方式，TM结合于粘液分泌细胞，或结合于控制或引导粘液分泌的神经细胞。更具体地，TM结合于(a)分泌粘蛋白的细胞，例如上皮杯状细胞和粘膜下腺粘液分泌细胞，(b)分泌粘液水溶成分的细胞，例如克拉雷细胞和浆液细胞，或者(c)控制或引导粘液分泌的细胞，例如“感觉传入神经细胞”C-纤维或者NANC神经系统纤维。在这点上，具体提到的是TMs：-VIP；β2肾上腺素受体激动剂；胃泌素释放肽；和降钙素基因相关肽。因此，依照这个实施方式，所述的偶联物具有治疗粘液分泌过多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病的治疗应用。
在另一个实施方式中，TM结合于内分泌细胞。这里具体提到的是促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone(TSH))、胰岛素及胰岛素型的生长因子、TSH(促甲状腺激素)释放激素(普罗瑞林(protirelin))、FSH/LH释放激素(格纳瑞林(gonadorelin))、促肾上腺皮质激素释放激素(cortictrophinreleasinghormone(CRH))和ACTH。因此，依照该实施方式，所述的偶联物具有治疗包括MEN在内的内分泌腺肿瘤形成；甲状腺功能亢进和其它依赖甲状腺分泌过多的疾病；肢端肥大症、血中催乳激素过多、库欣病及其它依赖于腺垂体分泌过多的疾病；雄激素过多症、持续无排卵和其它与多囊卵巢综合症相关的疾病的治疗应用。
在另一个实施方式中，TM与炎性细胞结合。这里具体提到的是(i)对肥大细胞的配体，例如FcIgE的C4结构域；(ii)对嗜曙红细胞的配体，例如对C3a/C4a-R补体受体的配体、与CR4补体受体反应的抗原；(iii)对巨噬细胞和单核细胞的配体，例如巨噬细胞刺激因子；(iv)对嗜中性粒细胞的配体，例如与iC3b补体受体相连的抗原，或IL8。因此，依照该实施方式，所述的偶联物具有治疗过敏症(季节性变应性鼻炎(枯草热)、过敏性结膜炎、血管运动性鼻炎及食物过敏)、嗜曙红细胞过多、哮喘、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、溃疡性结肠炎、慢性狭窄性小肠结肠炎、痔、搔痒症、血管球性肾炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脉管炎、心肌炎、牛皮癣、湿疹、慢性辐射诱导的纤维症、肺瘢痕化和其它纤维变性的病症的治疗应用。
在另一个实施方式中，TM结合于外分泌细胞。这里具体提到的是垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP-38)。因此，依照该实施方式，所述的偶联物具有治疗位于消化道内，特别是位于结肠内的粘液分泌细胞粘液分泌过多的治疗应用。
在进一步的实施方式中，TM结合于免疫细胞。这里提到的是配体：爱泼斯坦-巴尔病毒片段/表面特性。因此，依照该实施方式，所述的偶联物具有治疗重症肌无力、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、器官移植、组织移植、体液移植、毒性弥漫性甲状腺肿、甲状腺功能亢进、自身免疫性糖尿病、溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜、嗜中性白细胞减少症、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、恶性贫血、淋巴细胞性甲状腺炎、青铜色皮肤病、干燥角膜结膜炎综合征、原发性胆汁性肝硬变、多肌炎、硬皮病、系统性硬化症、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、心肌炎、风湿性心炎、血管球性肾炎(古德帕斯彻型)、眼色素层炎、睾丸炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、萎缩性胃炎、恶性贫血和1型糖尿病的治疗应用。
在进一步的实施方式中，TM结合于心血管细胞。这里提到的是凝血酶和TRAP(凝血酶受体促效肽)，以及结合于心血管内皮细胞例如GP1b表面抗原识别抗体的配体。因此，依照该实施方式，所述的偶联物具有治疗心血管疾病和/或高血压的治疗应用。
在进一步的实施方式中，TM结合于骨细胞。这里提到的是结合于成骨细胞用于治疗选自骨硬化症和包括降血钙素的骨质酥松的疾病的配体，以及结合于包括破骨细胞分化因子的破骨细胞的配体(例如，TRANCE，或者RANKL或OPGL)。因此，依照该实施方式，所述的偶联物具有治疗骨骼疾病的治疗应用。
直线的和环状的整合蛋白的结合序列是本发明TM的优选组。许多整合蛋白识别精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的三肽序列(Ruoslahti，1996)。RGD模体在包括纤维结合蛋白、生腱蛋白、纤维蛋白原和玻璃体结合蛋白的100多种蛋白中被发现。RGD-整合蛋白的相互作用作为进入细胞的保守机制，已被包括柯萨奇病毒(Roivaninenetal.，1991)和腺病毒(Mathiasetal.，1994)在内的许多病原体所利用。PLAEIDIGEL和CPLAEIDGIELC，分别为直线肽和环状肽的序列，已经被发现在表达α9β1整合蛋白的细胞中，结合并内化DNA(Schneideretal.，1999)。
本发明的其它TM包括用噬菌体展示技术发现的TM，特别是那些把人类呼吸道上皮细胞作为目标和被人类呼吸道上皮细胞内化的TM。这包括，直线和环形的THALWAT(Jostetal.，2001)、LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)和LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wuetal.，2003)；CDSAFVTVDWGRSMSLC(Floreaetal.，2003)；SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP和LQHKSMP(Writeretal.，2004)；FSLSKPP、HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahimetal.，2003)。
本发明的蛋白酶切割位点允许在非细胞毒性蛋白酶成分和TM成分之间的位置切割(优选受约束的切割)融合蛋白。该切割反应将融合蛋白从一个单链多肽转变为二硫键连接的双链多肽。
依照本发明的优选实施方式，TM通过远离TM的C-末端结构域或氨基酸序列进行结合。例如，相关的结合结构域可以包括位于接近TM中间(也就是说，直线肽序列的中间)的内部结构域或氨基酸序列。优选地，相关的结合结构域位于接近TM的N-末端的位置，更优选地在N-末端或靠近N-末端的位置。
在一个实施方式中，单链多肽的融合可包括一个以上蛋白水解的切割位点。然而，在两个或两个以上该位点存在的情况下，位点是不同的，因此基本上阻止了单一蛋白酶存在时多个切割事件的发生。在另一个实施方式中，优选地，单链多肽融合具有单一的蛋白酶切割位点。
蛋白酶的切割序列(多个序列)可在DNA水平用传统的方法导入，例如通过定点诱变导入(和/或去除任意固有的切割序列)。筛选以证实切割序列的存在，这可通过手动或在计算机软件的帮助下进行(例如，DNASTAR，Inc.公司的MapDraw程序)。
虽然任意的蛋白酶切割位点可以被使用，但是下面的蛋白酶切割位点是优选的：肠激酶(DDDDK↓)Xa因子(IEGR↓/IDGR↓)TEV(烟草蚀刻病毒)(ENLYFQ↓G)凝血酶(LVPR↓GS)PreScission(LEVLFQ↓GP)
其它包括在术语蛋白酶切割位点中的是内含肽(intein)，其是自切割序列。该自我剪接反应是可控制的，例如通过改变存在的还原剂的浓度。
在使用中，蛋白酶切割位点被切割，TM的N-末端区域(优选N-末端)暴露出来。所形成的多肽具有TM，且该TM含有N-末端结构域或基本上没有偶联物其它部分的内结构域。这样排列确保了TM的N-末端成分(或内结构域)可直接与靶细胞上结合位点相互作用。
在优选的实施方式中，TM和蛋白酶切割位点在融合蛋白上被至多10个氨基酸残基，更优选地至多5个氨基酸残基，最优选地0个氨基酸残基分隔开。因此，在蛋白酶切割位点切割之后，提供了携带具有N-末端结构域的TM的偶联物，其基本上没有偶联物的其它部分。这种排列确保了寻靶部分的N-末端成分可直接与靶细胞上的结合位点反应。
与上述的活化步骤相关的一个优点是：一旦融合蛋白的蛋白水解切割发生，TM变得仅仅易于进行N-末端降解。另外，特定的蛋白酶切割位点的选择允许将多肽融合物选择性活化成为双链构象。
本发明的单链多肽融合物的构建是将蛋白酶切割位点置于TM和非细胞毒性性蛋白酶成分之间。
优选地，在单链融合物中，TM位于蛋白酶切割位点和转运成分之间。这确保了TM连接于转运结构域(也就是，如天然梭菌全毒素发生的那样)，尽管在本发明的一些实例中，与天然全毒素相比，两个成分的顺序是相反的。这种排列进一步的优点是TM位于融合蛋白中暴露的环区域，其最小化了TM对融合蛋白构象的结构影响。在这点上，所说的环被不同地称作连接子、活化环、结构域间连接子或者仅仅称表面暴露环(Schiavoetal.，2000，Phys.Rev.，80：717-766和Turtonetal.，2002，TrendsBiochem.，Sci，27：552-558)。
在一个实施方式中，在单链多肽中，非细胞毒性蛋白酶成分和转运成分被二硫键连接在一起。因此在蛋白酶切割位点切割以后，多肽呈现双链构象，其中蛋白酶和转运成分被二硫键保持连接在一起。为了达到这个目的，优选地，蛋白酶和转运成分在单链融合蛋白中的距离最大为100个氨基酸残基，更优选地最大为80个氨基酸残基，特别优选地最大为60个氨基酸残基，最优选地最大为50个氨基酸残基。
在一个实施方式中，非细胞毒性蛋白酶成分与融合蛋白的转运成分形成二硫键。例如，形成二硫键的蛋白酶成分的氨基酸残基位于蛋白酶成分的C-末端的最后20个氨基酸残基以内，优选地在最后10个氨基酸残基以内。相似的，在形成二硫键的第二部分的转运成分内的氨基酸残基可位于转运成分N-末端的前20个氨基酸残基之内，优选地在前10个氨基酸残基之内。
可选地，在单链多肽中，非细胞毒性蛋白酶成分和TM可被二硫键连接在一起。在这点上，形成二硫键的TM的氨基酸残基优选地位于远离TM的N-末端，更优选地接近TM的C-末端。
在一个实施方式中，非细胞毒性蛋白酶成分与融合蛋白的TM成分形成二硫键。在这点上，形成二硫键的蛋白酶成分的氨基酸残基优选地位于蛋白酶成分C-末端的最后20个氨基酸残基以内，更优选地，在最后10个氨基酸残基以内。相似的，形成二硫键的第二部分的TM成分内的氨基酸残基优选地位于TM的C-末端的最后20个氨基酸残基以内，更优选地在最后10个氨基酸残基以内。
上述的二硫键排列具有蛋白酶和转运成分以相似于天然梭菌神经毒素的方式排列的优点。作为对照，参照组成天然梭菌神经毒素的一级氨基酸序列，各自的半胱氨酸残基间的距离是在8到27个氨基酸残基之间——取自Popoff，MR&Marvaud，J-C，1999，Structural&genomicfeaturesofclostridialneurotoxins，Chapter9，inTheComprehensiveSourcebookofBacterialProteinToxins.Ed.Alouf&Freer：——
血清型1 序列 C-C之间的“天然”长度
BoNT/A1 CVRGIITSKTKS------LDKGYNKALNDLC 23
BoNT/A2 CVRGIIPFKTKS------LDEGYNKALNDLC 23
BoNT/B CKSVKAPG-------------------------IC 8
BoNT/C CHKAIDGRS------------LYNKTLDC 15
BoNT/D CLRLTK------------------NSRDDSTC 12
BoNT/E CKN-IVSVK------------GIRK----SIC 13
BoNT/F CKS-VIPRK--------------GTKAPP-RLC 15
BoNT/G CKPVMYKNT--------------GKSE-----QC 13
TeNT CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 27
1信息仅来自蛋白水解的菌株
融合蛋白可包含一种或几种纯化标签(purificationtags)，其位于靠近蛋白酶成分的N-末端和/或靠近转运成分的C-末端。
虽然任何纯化标签都可被使用，但下面的纯化标签是优选的：His-标签(例如6x组氨酸)，优选地作为C-末端和/或N-末端标签MBP-标签(麦芽糖结合蛋白)，优选地作为N-末端标签GST-标签(谷胱甘肽S转移酶)，优选地作为N-末端标签His-MBP-标签，优选地作为N-末端标签GST-MBP-标签，优选地作为N-末端标签硫氧还蛋白-标签，优选地作为N-末端标签CBD-标签(几丁质结合结构域)，优选地作为N-末端标签。
依照本发明的进一步实施方式，融合蛋白可包括一种或几种肽间隔分子。例如，肽间隔可被使用在纯化标签和融合蛋白分子的剩余部分之间(举例来说，在本发明的N-末端纯化标签和蛋白酶成分之间；和/或本发明的C-末端纯化标签和转运成分之间)。肽间隔也可被使用在本发明的TM和转运成分之间。
根据本发明的第二方面，提供了编码上述单链多肽的DNA序列。
在本发明的优选的方面，DNA序列作为DNA载体的一部分被制备，其中载体包含启动子和终止子。
多种不同的间隔分子可被使用在本发明的融合蛋白的任意一个中。这种间隔分子的实例包括GS15、GS20、GS25和Hx27。
发明人出乎意料地发现：当间隔物的大小被选择以便(在使用中)TM的C-末端和转运成分的N-末端被相互分开40到105埃，优选地50到100埃，更优选地50到90埃时，本发明的融合蛋白可以表现出与靶细胞改良的结合能力。在另一个实施方式中，优选的间隔物具有11到29个氨基酸残基的氨基酸序列，优选地15到27个氨基酸残基，更优选地20到27个氨基酸残基。适当的间隔物可被常规地鉴别和获得，依照Crasto，C.J.andFeng，J.A.(2000)May；13(5)；pp.309-312-也可参看http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html。
在优选的实施方式中，载体具有选自下面的启动子：启动子诱导剂典型的诱导条件tac(杂合物)IPTG0.2mM(0.05-2.0mM)AraBADL-阿拉伯糖0.2％(0.002-0.4％)T7-lac操纵子IPTG0.2mM(0.05-2.0mM)
本发明的DNA构建物优选地在计算机芯片上设计，然后通过传统的DNA合成技术进行合成。
依照将被使用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，由于密码子偏爱(codon-biasing)，上述的DNA序列信息任选地被予以修饰。
DNA的骨架被优选地筛选以获得任意固有的核酸序列，当其被转录和翻译时，将产生与编码第二肽的序列编码的蛋白酶结合位点相一致的氨基酸序列。这个筛选可被手动或在计算机软件(例如DNASTAR公司的MapDraw程式)的帮助下施行。
依照本发明进一步的实施方式，其提供了制造非细胞毒性药剂的方法，其包括：a.将本发明的单链多肽融合蛋白与能切割蛋白酶切割位点的蛋白酶相接触；b.切割蛋白酶切割位点，从而形成双链融合蛋白。
这方面提供了双链多肽，其通常模拟梭菌全毒素的结构。更具体而言，所形成的双链多肽典型地具有如此结构，其中：a.第一条链包含非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；b.第二条链包含TM和转运结构域，该转运结构域能使蛋白酶或蛋白酶片段从内体内转运穿过内体膜并进入靶细胞的胞质溶胶；以及第一和第二链被二硫键连接在一起。
依照本发明的进一步的方面，提供了本发明的单链或双链多肽的用途，用于制备治疗、预防或改善以下医疗疾病的药物，该疾病选自粘液分泌过多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病、包括MEN的内分泌腺肿瘤形成、甲状腺功能亢进和其它依赖甲状腺分泌过多的疾病；肢端肥大症、血中催乳激素过多、库欣病及其它依赖于腺垂体分泌过多的疾病；雄激素过多症、持续无排卵和其它与多囊卵巢综合症相关的疾病、过敏症(季节性变应性鼻炎(枯草热)、过敏性结膜炎、血管运动性鼻炎及食物过敏)、嗜曙红细胞过多、哮喘、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、溃疡性结肠炎、慢性狭窄性小肠结肠炎、痔、搔痒症、血管球性肾炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脉管炎、心肌炎、牛皮癣、湿疹、慢性辐射诱导的纤维症、肺瘢痕化和其它纤维变性的病症、位于消化道内，特别是位于结肠内的粘液分泌细胞粘液分泌过多、治疗重症肌无力、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、器官移植、组织移植、体液移植、毒性弥漫性甲状腺肿、甲状腺功能亢进、自身免疫性糖尿病、溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜、嗜中性白细胞减少症、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、恶性贫血、淋巴细胞性甲状腺炎、青铜色皮肤病、干燥角膜结膜炎综合征、原发性胆汁性肝硬变、多肌炎、硬皮病、系统性硬化症、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、心肌炎、风湿性心炎、血管球性肾炎(古德帕斯彻型)、眼色素层炎、睾丸炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、萎缩性胃炎、恶性贫血和1型糖尿病、心血管疾病和/或高血压和例如骨硬化症和骨质酥松的骨胳疾病。
依照相关的方面，本发明提供了治疗、预防或改善患者医疗症状或疾病的方法，其包括给所述患者服用治疗上有效量的本发明的单链或双链多肽，其中医疗症状或疾病选自粘液分泌过多、哮喘、和/或慢性阻塞性肺病、包括MEN的内分泌腺肿瘤形成、甲状腺功能亢进和其它依赖甲状腺分泌过多的疾病；肢端肥大症、血中催乳激素过多、库欣病及其它依赖于腺垂体分泌过多的疾病；雄激素过多症、持续无排卵和其它与多囊卵巢综合症相关的疾病、过敏症(季节性变应性鼻炎(枯草热)、过敏性结膜炎、血管运动性鼻炎及食物过敏)、嗜曙红细胞过多、哮喘、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、溃疡性结肠炎、慢性狭窄性小肠结肠炎、痔、搔痒症、血管球性肾炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脉管炎、心肌炎、牛皮癣、湿疹、慢性辐射诱导的纤维症、肺瘢痕化和其它纤维变性的病症、位于消化道内，特别是位于结肠内的粘液分泌细胞粘液分泌过多、治疗重症肌无力、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、器官移植、组织移植、体液移植、毒性弥漫性甲状腺肿、甲状腺功能亢进、自身免疫性糖尿病、溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜、嗜中性白细胞减少症、慢性自身免疫性肝炎、自身免疫性胃炎、恶性贫血、淋巴细胞性甲状腺炎、青铜色皮肤病、干燥角膜结膜炎综合征、原发性胆汁性肝硬变、多肌炎、硬皮病、系统性硬化症、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、心肌炎、风湿性心炎、血管球性肾炎(古德帕斯彻型)、眼色素层炎、睾丸炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、萎缩性胃炎、恶性贫血和1型糖尿病、心血管疾病和/或高血压和例如骨硬化症和骨质酥松的骨胳疾病。
在使用中，本发明的多肽典型地以与药物载体、稀释剂和/或赋形剂相关联的药物组合物的形成被利用，尽管组合物的精确形式可被修改成适合投药的模式。优选投药于哺乳动物，更优选地是投药于人。
例如，多肽可被使用，以用于吸入的气溶胶或雾化溶液的形式或者用于肠胃外投药、关节内投药或颅内投药的无菌溶液的形式使用。
对于治疗内分泌目标，优选静脉注射、直接注射入腺体或者用于肺部输送的雾化吸入(aerosolisation)；对于治疗炎症细胞目标，优选静脉注射、皮下注射、表面贴剂投药或用于肺部输送的雾化吸入；对于治疗外分泌目标，优选静脉注射、直接注射或直接投药于腺体或者用于肺部输送的雾化吸入；对于治疗免疫目标，优选静脉注射或者直接注射入特定的组织例如胸腺、骨髓或淋巴组织；对于心血管目标的治疗，优选静脉注射；以及对于骨胳目标的治疗，优选静脉注射或者直接注射。假如用静脉注射，应该也包括泵系统的使用。在用于治疗神经目标的组合物的情况下，可使用脊髓注射(例如硬膜外的或鞘内的)或留置泵。
本发明的多肽的给药的剂量范围是能产生需要的治疗效果的剂量。可理解的是：需要的剂量范围依赖于精确的成分性质；给药途径；制剂性质；患者年龄；患者疾病的性质、程度或严重度；禁忌症，如果有的话；以及主治医师的判断。
适当的日剂量在0.0001-1mg/kg的范围内，优选地为0.0001-0.5mg/kg，更优选地为0.002-0.5mg/kg，以及特别优选地0.004-0.5mg/kg。单位剂量能从小于1微克变化到30mg，但是典型地，每剂量在0.01-1mg的范围，其可每天给药或优选地更低的频率给药，例如每周或每六个月给药。
特别优选地给药方案基于2.5ng融合蛋白作为患者重量每千克1×的剂量。在这点上，优选的剂量在1×-100×(即2.5-250ng)的范围。这个剂量范围明显低于(即低至少10倍，典型的100倍)将被使用的其它类型的治疗分子的剂量范围。而且当同样的比较在摩尔基础上进行时，上述的差异被明显放大，这是因为本发明的融合蛋白具有比传统的“小”分子疗法大得多的分子量。
然而，依赖于精确的成分性质以及不同的给药途径的不同效率，预期需要剂量具有宽广的变化。例如，口服给药将预望比静脉注射给药需要更高的剂量。
在这些剂量水平上的变化可用为了达到最优化的标准经验程序进行调整，这一点在本领域是很容易理解的。
适合注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳浊液或者干粉的形式，该干粉在使用前溶解或悬浮在适当的媒介物中。
液体单位剂量形式典型地利用无热原的无菌媒介物进行制备。依赖于所使用的媒介物和浓度，有效成分可被溶解或悬浮在媒介物中。
溶液可被用于所有形式的肠胃外投药，并且其特别适用于静脉注射。在制备溶液中，成份可溶于载体，该溶液被制成等渗压和无菌的，其中如果必要的话通过加入NaCl来形成等渗压，在装入适当的无菌瓶或安瓿以及密封前，使用无菌技术通过无菌过滤器过滤进行灭菌。可选地，如果溶液的稳定性是足够的，在密封容器中的溶液可用高压灭菌器进行灭菌。
有利地，添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化试剂和/或局部麻醉药，可被溶于载体中。
使用前溶解或悬浮于适当载体的干粉，可通过在无菌区域使用无菌技术把预先灭菌的药物和其它成分装入无菌容器进行制备。
可选地，该成份(即药品加抑制剂)和其它成分可溶于含水载体，溶液可在无菌区域使用无菌技术通过过滤进行灭菌并且被分配入适当的容器。然后，产品被冷冻干燥并且容器被无菌密封。
适合肌肉注射、皮下注射或皮内注射的肠胃外悬浮液基本上用相同的方式制备，除了无菌成分被悬浮于无菌载体，而不是被溶解于无菌载体以及灭菌不能用过滤来进行。该成分可在无菌状态下被分离，或者可选地，该组分可在分离后灭菌例如使用γ辐射。
有利地，悬浮剂例如聚乙烯吡咯烷酮，被包括在组合物里，用于促进这些成分均匀分布。
适合经呼吸道给药的组合物包括气溶胶、雾化溶液(nebulisablesolution)或用于吹入法的微细颗粒粉末。在后面的情形里，优选颗粒大小小于50微米，特别地，小于10微米。该组合物可用传统的方式制造并且与传统给药器械一起使用。定义部分
寻靶部分(TargetingMoiety(TM))指与药剂相结合的任何化学结构，其在功能上与结合位点反应，从而引起药剂与靶细胞表面的物理连接。在本发明的背景中，靶细胞是除伤害性感受传入神经细胞以外的任意细胞。术语TM包含能结合到靶细胞上结合位点的任意分子(即天然存在的分子或其化学或物理修饰的变体)，该结合位点能内化(例如内体(胞内体)的形成)——也称为受体介导的细胞内吞作用。TM可具有内体膜转运功能；在该情况下，在本发明的药剂中，不需要存在单独的TM和转运结构域成分。
本发明的TM结合(优选地特异性结合)到靶细胞。
术语非细胞毒性指正被讨论的蛋白酶分子不杀死重新定位的靶细胞。
本发明的蛋白酶包含所有自然出现的非细胞毒性蛋白酶，在真核细胞中其能切割胞吐融合器的一个或多个蛋白。
本发明的蛋白酶优选地为细菌蛋白酶(或其片段)。更优选地，细菌蛋白酶选自梭菌属(Clostridium)或奈瑟菌属(Neisseria)(例如梭菌L-链或优选来自淋病奈瑟菌的奈瑟菌IgA蛋白酶)。
本发明也含有修饰的非细胞毒性蛋白酶，其包括不出现在天然和/或合成的氨基酸残基中的氨基酸序列，只要修饰的蛋白酶仍然表现出上述蛋白酶的活性便可。
本发明的蛋白酶优选地表现出丝氨酸或金属蛋白酶的活性(例如肽链内切酶活性)。优选地，蛋白酶对SNARE蛋白(例如SNAP-25、突触囊泡蛋白/VAMP或突触融合蛋白)具有特异性。
特别提到的是神经毒素的蛋白酶结构域，例如细菌神经毒素的蛋白酶结构域。因此，本发明包括神经毒素结构域的用途，其自然出现，也作为所述的天然的神经毒素的重组制备形式出现。
代表性的神经毒素由梭菌所产生，术语梭菌神经毒素包括由破伤风梭杆菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的紧密相关的BoNT样神经毒素。上述缩写贯穿运用于整个本说明书。例如，专用术语BoNT/A表示神经毒素的来源为BoNT(血清型A)。相应的专用术语适用于其它BoNT血清型。
术语L-链片段指神经毒素L-链的成分，该片段表现出金属蛋白酶的活性以及能蛋白水解性切割与囊泡膜和/或原生质膜相结合的、涉及细胞胞外分泌的蛋白。
转运结构域是能使蛋白酶(或其片段)转运进入靶细胞的分子，这样蛋白酶活性的功能表达发生在靶细胞的细胞溶胶之内。任何分子(例如蛋白或肽)是否具有本发明必要的转运功能可被许多传统分析方法中的任意一种所证实。
例如，ShoneC.(1987)描述了使用脂质体的体外分析方法，该脂质体受到测试分子的挑战。必要的转运功能的存在被从脂质体中释放的K+和/或标记的NAD所证实，其可被很容易的监测[见ShoneC.(1987)Eur.J.Biochem；vol.167(1)：pp.175-180]。
进一步的实例由BlausteinR.(1987)所提供，其描述了使用平面磷脂双层膜的简单的体外分析方法。该膜受到测试分子的挑战，必要的转运功能被所述膜的跨膜电导的增加所证实[见Blaustein(1987)FEBSLetts；vol.226，no.1：pp.115-120]。
另外能进行膜融合的评定因而能进行转运结构域适合在本发明中使用的鉴定的方法，由MethodsinEnzymologyVol220-221，MembraneFusionTechniques，PartsAandB，AcademicPress1993所提供。
转运结构域优选地，能在低pH的条件下，在脂膜上形成离子渗透孔。优选地，已发现仅使用能在内体膜上形成小孔的那部分蛋白分子。
转运结构域可从微生物蛋白源获得，特别从细菌或病毒蛋白源获得。因此，在一个实施方式中，转运结构域是酶的异位结构域，例如细菌毒素或病毒蛋白。
一些细菌毒素分子的结构域能形成这些小孔已被充分证明了。某些病毒表达的膜融合蛋白的转运结构域能形成这些小孔也是已知的。这些结构域可被用于本发明。
转运结构域(TranslocationDomain)可以是梭菌来源，也就是HN结构域(或其功能成分)。HN指梭菌神经毒素H-链的部分或片段，近似等于H-链的氨基酸端的那半部分，或者与完整H-链那一片段相一致的结构域。优选地，H-链基本上缺乏H-链的HC成分的天然结合功能。在这点上，HC功能可通过HC氨基酸序列的缺失(在DNA合成阶段，或者合成后阶段通过核酸酶或蛋白酶处理)所除去。可选地，HC功能可通过化学或生物处理而失活。因此，优选地，H-链能结合到天然梭菌神经毒素(即全毒素)结合的靶细胞的结合位点。
在一个实施方式中，转运结构域是梭菌神经毒素的HN结构域(或其片段)。适当的梭菌转运结构域的实例包括：肉毒杆菌A型神经毒素氨基酸残基(449-871)肉毒杆菌B型神经毒素氨基酸残基(441-858)肉毒杆菌C型神经毒素氨基酸残基(442-866)肉毒杆菌D型神经毒素氨基酸残基(446-862)肉毒杆菌E型神经毒素氨基酸残基(423-845)肉毒杆菌F型神经毒素氨基酸残基(440-864)肉毒杆菌G型神经毒素氨基酸残基(442-863)破伤风神经毒素氨基酸残基(458-879)
关于肉毒梭菌和破伤风梭菌产生毒素的遗传基础的进一步细节，我们参考亨德森等(Hendersonetal.)(1997)的TheClostridia：MolecularBiologyandPathogenesis，Academicpress。
术语HN涵盖：天然存在的神经毒素的HN部分，以及修饰的具有如此氨基酸序列的HN部分，该氨基酸序列不出现在天然和/或合成的氨基酸残基内，只要修饰的HN部分仍然表现出上述的转运功能便可。
可选地，转运结构域可源于非梭菌(见表1)。源于非梭菌转运结构域的实例包括但不限定于白喉毒素的转运结构域[O＝Keefeetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89，6202-6206；Silvermanetal.，J.Biol.Chem.(1993)269，22524-22532；以及London，E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.，1112，pp.25-51]、假单细胞外毒素A型的转运结构域[Prioretal.Biochemisty(1992)31，3555-3559]、炭疽热毒素的转运结构域[Blankeetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，8437-8442]、转运功能的多种促融肽或疏水肽[Planketal.J.Biol.Chem.(1994)269，12918-12924；以及Wagneretal(1992)PNAS，89，pp.7934-7938]；以及两性分子肽[Murataetal(1992)Biochem.，31，pp.1986-1992]。转运结构域可为在天然蛋白中存在的转运结构域的镜像(对映体，mirror)，或者可包括氨基酸变体，只要其不破坏转运结构域的转运能力便可。
适合在本发明中使用的病毒转运结构域的具体的实例包括病毒表达的膜融合蛋白的一些转运结构域。例如，瓦格纳等(Wagneretal，1992)和村田等(Murataetal，1992)描述了许多源自流感病毒血凝素的N-末端区域的促融肽和两性分子肽的转运功能(即膜融合和囊泡化作用)。其它已知具有需要的转运活性的病毒表达的膜融合蛋白是塞姆利基森林病毒(SemlikiForestVirus(SFV))的促融肽的转运结构域、水泡性口膜炎病毒(VSV)糖蛋白G的转运结构域、SER病毒F蛋白的转运结构域以及泡沫病毒被膜糖蛋白的转运结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明的背景中具有具体的应用，例如，SFV的E1蛋白和VSF的G蛋白。
列于表1中的转运结构域的使用包括其序列变体的使用。变体可包含一个或多个保守的核酸取代和/或核酸缺失或插入，其条件是变体具有必要的转运功能。变体也可以包含一个或多个氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，其条件是变体具有必要的转运功能。表1
转运结构域来源 氨基酸残基 参考文献
白喉毒素 194-380 Silverman et al.，1994，J.Biol.Chem.269，22524-22532London E.，1992，Biochem.Biophys.Acta.，1113，25-51
假单细胞外毒素的结构域II 405-613 Prior et al.，1992，Biochemisty，31，3555-3559Kihara & Pastan，1994，Bioconj Chem.5，532-538
流感病毒血凝素 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG，和其变体 Plank et al.，1994，J.Biol.Chem.269，12918-12924Wagner et al.，1992，PNAS，89，7934-7938Murata et al.，1992，Biochemistry，31，1986-1992
塞姆利基森林病毒促融蛋白 转运结构域 Kielian et al.，1996，J CellBiol.134(4)，863-872
水泡性口膜炎病毒糖蛋白G 118-139 Yao et al.，2003，Virology310(2)，319-332
SER病毒F蛋白 转运结构域 Seth et al.，2003，JVirol 77(11)6520-6527
泡沫病毒被膜糖蛋白 转运结构域 Picard-Maureau et al.，2003，J Virol.77(8)，4722-4730
SEQIDNOsSEQID1LC/A的DNA序列SEQID2HN/A的DNA序列SEQID3LC/B的DNA序列SEQID4HN/B的DNA序列SEQID5LC/C的DNA序列SEQID6HN/C的DNA序列SEQID7CPPAR1-B连接子的DNA序列SEQID8CPPTH-C连接子的DNA序列SEQID9CPPAR1-B融合的DNA序列SEQID10CPPAR1-B融合的蛋白质序列SEQID11CPPTH-C融合的DNA序列SEQID12CPPTH-C融合的蛋白质序列SEQID13CPRGD-C连接子的DNA序列SEQID14CPRGD-C融合的DNA序列SEQID15CPRGD-C融合的蛋白质序列SEQID16CP环RGD-C连接子的DNA序列SEQID17CP环RGD-C融合的DNA序列SEQID18CP环RGD-C融合的蛋白质序列SEQID19CPTHALWHT-C连接子的DNA序列SEQID20CPTHALWHT-C融合的DNA序列SEQID21CPTHALWHT-C融合的蛋白质序列SEQID22CP环THALWHT-C连接子的DNA序列SEQID23CP环THALWHT-C融合的DNA序列SEQID24CP环THALWHT-C融合的蛋白质序列SEQID25CPANP-C连接子的DNA序列SEQID26CPANP-C融合的DNA序列SEQID27CPANP-C融合的蛋白质序列SEQID28CPVIP-C连接子的DNA序列SEQID29CPVIP-C融合的DNA序列SEQID30CPVIP-C融合的蛋白质序列SEQID31胃泌素释放肽-C连接子的DNA序列SEQID32胃泌素释放肽-C融合的DNA序列SEQID33胃泌素释放肽-C融合的蛋白质序列
实施例
实施例1——LC/B和HN/B骨架克隆的制备
下面的步骤产生用作成分骨架的LC和HN片段，该成分骨架用于多结构域融合物的表达。这个实施例基于血清型B基克隆(SEQID3和SEQID4)的制备，尽管步骤和方法同样适用于其它血清型(如序列表所列出的血清型A(SEQID1和SEQID2)和血清型C(SEQID5和SEQID6))。克隆和表达载体的制备
pCR4(Invitrogen)是被选定的标准的克隆载体，其被选择的原因是由于在载体内缺少限制性序列以及邻近的测序引物位点，以便构建物容易被证实。表达载体基于pMAL(NEB)表达载体，其在多克隆位点内正确方位上具有需要的限制性序列，以便构建物(BamHI-SalI-PstI-HindIII)的插入。表达载体的片段已被除去以制造不易移动的质粒，多种不同的融合标签已被插入以增加纯化选择。蛋白酶(例如LC/B)插入物的制备
通过下述两种方法中的一种制造LC/B(SEQID3)：DNA序列通过LC/B氨基酸序列(使用几种反向翻译软件工具中的一种(例如EditSeq最佳大肠杆菌反向翻译(DNASTARInc)或者Backtranslation工具v2.0(Entelechon))从免费使用的数据库来源例如GeneBank(登录号码P10844)或者Swissport(登录位置BXB_CLOBO)得到氨基酸序列)的反向翻译(backTranslation)进行设计。BamHI/SalI识别序列分别引入在序列的5’和3’端，以保持正确的读码(阅读框，readingframe)。筛选(使用软件例如MapDraw，DNASTARInc.)在反向翻译期间整合了限制性内切酶切割序列的DNA序列。被发现与克隆系统所需要的序列共有的任何切割序列，都要从计划的编码序列中手动除去，以确保共有的大肠杆菌密码子使用被保持。大肠杆菌密码子的使用率通过参考软件程序例如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)进行评定，而且GC％含量和密码子使用率通过参考公开的密码子使用表(例如GenBankRelease143，2004/09/13)进行评定。然后，该包含LC/B开放阅读框架(ORF)的、优化的DNA序列，被商业上合成(例如被Entelechon、Geneart或Sigma-Genosys)，并且被提供在pCR4载体中。
可选的方法是由现有的DNA序列使用PCR方法进行扩增，所述DNA序列具有分别整合入5’和3’端PCR引物的BamHI和SalI限制性内切酶序列。互补的寡核苷酸引物由供应商(例如MWG或Sigma-Genosys)化学合成，以至每个碱基对具有与相反链杂交的能力，该相反链位于梭菌靶DNA片段的侧翼(3’端指向“朝向”彼此)，一个寡核苷酸用于双链DNA中的每一条。为了产生PCR产物，将对梭菌DNA序列具有特异性的短寡核苷酸引物对，与梭菌DNA模板以及其它反应成分相混合，并放入仪器(PCR仪)中，其能自动地改变反应管的温育温度，循环在大约94℃(用于变性)，55℃(用于寡核苷酸解链)和72℃(用于合成)之间进行。PCR产物扩增需要的其它试剂包括：DNA聚合酶(例如Taq或Pfu聚合酶)、等摩尔量(50-200μm)的DNA的四种核苷dNTP构件中的每一种；以及适于酶的缓冲液(其最优化Mg2+浓度为0.5-5mM)。
使用用于TaqPCR产物的TOPOTA克隆或者用于PfuPCR产物的ZeroBluntTOPO克隆(这两种试剂盒都是从Invitrogen商业上可获得的)，将扩增产物克隆到pCR4中。所得的克隆产品通过测序检测。然后，任何其它的与克隆系统不相容的限制性序列通过使用定点诱变而被除去(例如使用Quickchange(StratageneInc.))。转运(例如HN)插入物的制备
通过下述两种方法中的一种制造HN/B(SEQID4)：DNA序列通过HN/B氨基酸序列(使用多种反向翻译软件工具中的一种(例如EditSeq最佳大肠杆菌反向翻译(DNASTARInc)或者Backtranslation工具v2.0(Entelechon))从免费使用的数据库来源例如GeneBank(登录号码P10844)或者Swissport(登录位置BXBCLOBO)得到氨基酸序列)的反向翻译进行设计。PstI限制性序列被加到N-末端，Xbal-终止密码子-HindIII被加到C-末端，以确保正确阅读框被维持。筛选(使用软件例如MapDraw，DNASTARInc.)在反向翻译期间整合了限制性内切酶切割序列的DNA序列。被发现与克隆系统需要的序列共有的任何序列，从计划的编码序列中手动除去，以确保共有的大肠杆菌密码子使用被保持。大肠杆菌密码子使用通过参考软件程序例如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)进行评定，而GC％含量和密码子使用率通过参考公开的密码子使用表(例如GenBankRelease143，2004/09/13)进行评定。然后，该优化的DNA序列被商业上合成(例如由Entelechon、Geneart或Sigma-Genosys合成)，并被提供在pCR4载体中。
可选的方法是由现有的DNA序列使用PCR方法进行扩增，所述DNA序列具有分别整合入5’和3’端PCR引物的PstI/Xbal-终止密码子-HindIII的限制性内切酶序列。PCR扩增按上面描述的方法施行。PCR产物被插入pCR4载体并且通过测序进行检查。然后，任何其它的、与克隆系统不相容的限制性序列，被使用定点诱变除去(例如使用Quickchange(StratageneInc.))。实施例2——LC/B-PAR1-HN/B融合蛋白的制备连接子-PAR1-间隔区插入物的制备
LC-HN连接子可使用现有的连接子序列信息作为模板，根据第一原理进行设计。例如，血清型B连接子被定义为结构域间的多肽区域，该区域存在于蛋白水解作用发生的LC和HN之间的二硫桥的半胱氨酸之间。该序列信息从免费使用的数据库来源，例如从GenBank(登录号码P10844)或者Swissport(登录位置BXBCLOBO)获得。在这个连接子里，肠激酶位点、PAR1和间隔区被引入；并且使用多种反向翻译软件工具中的一种(例如EditSeq最佳大肠杆菌反向翻译(DNASTARInc)或者Backtranslation工具v2.0(Entelechon)，编码连接子-配体-间隔区区域的DNA序列被确定。然后限制性位点被整合入到该DNA序列，并被排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-PAR1-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID7)。重要的是确保对间隔区、PAR1和限制性序列维持正确的阅读框，以及确保XbaI序列之前不是碱基TC，其将导致DAM甲基化。DNA序列被筛选，以确保限制性序列的导入，以及任意其它序列被从剩余序列中人工除去，从而确保共有的大肠杆菌密码子使用被保持。大肠杆菌的密码子使用通过参考软件程序，例如GraphicalCodonUsageAnalyser(Geneart)进行评定，而且GC％含量和密码子使用率通过参考公开的密码子使用表(例如GenBankRelease143，2004/09/13)进行评定。然后，该优化的DNA序列被商业上合成(例如由Entelechon、Geneart或Sigma-Genosys合成)，并且被提供在pCR4载体中。
LC/B-PAR1-HN/B融合物的制备为了创建LC-连接子-PAR1-间隔区-HN构建物(SEQID9)，编码连接子(SEQID7)的pCR4载体用BamHI和SalI限制性内切酶切割。然后，该切割的载体作为用于采用BamHI和SalI切割的LC/BDNA(SEQID3)的插入和连接的受体载体。然后，所形成的质粒DNA用PstI和XbaI限制性内切酶切割，并且作为用PstI和XbaI切割的HN/BDNA(SEQID4)的插入和连接的受体载体。最终的构建物包含LC-连接子-PAR1-间隔区-HNORF(SEQID9)，用于转移进入表达载体进行表达，以产生具有在SEQID10中阐述的序列的融合蛋白。实施例3——LC/C-PTH-HN/C融合蛋白的制备
LC-HN连接子能使用在实施例2中描述的方法进行设计，但是其中使用排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-PTH-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID8)的血清型C连接子。然后LC/C-PTH-HN/C融合被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行的，以及使用实施例2中描述的方法构建。最终的构建物包含LC-连接子-PTH-间隔区-HNORF(SEQID11)，用于转移进入表达载体进行表达，以产生具有在SEQID12中阐述的序列的融合蛋白。实施例4——LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的制备和纯化
LC-HN连接子能使用在实施例2中描述的方法进行设计，但是其中使用排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-RGD-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID13)的血清型C连接子。然后通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)以及使用实施例2中描述的方法进行构建，组装LC/C-RGD-HN/C融合物。最终的构建物包含LC-连接子-RGD-间隔区-HNORF(SEQID14)，其转移进入用于表达的表达载体，以产生具有在SEQID15中阐述的序列的融合蛋白。为了进行重组蛋白表达，最终的表达质粒pMALLC/C-RGD-HN/C被转移进入大肠杆菌BL21。LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的表达
通过使用下面的实验计划，完成LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的表达。采用源自LC/C-RGD-HN/C表达菌株的单一菌落，在250ml的瓶中接种100ml包含0.2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的改良型TB。使培养物在37℃、225rpm的条件下，生长16小时。在2L的瓶中，用10ml过夜培养物接种1L包含0.2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的改良型TB。使培养物在37℃条件下生长，直至OD600nm的值约为0.5，在这时，降低温度至16℃。用1mMIPTG诱导培养物1小时后，使培养菌在16℃条件下进一步生长16小时。图1表示了使用SDS-PAGE分析的、在大肠杆菌中表达的蛋白。LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的纯化
解冻装有25ml的50mMHEPESpH7.2200mMNaCl和大约10克大肠杆菌BL21细胞糊(cellpaste)的Falcon管。在冰上，在22微瓦的功率下，以开30秒、关30秒的方式对细胞糊进行超声波作用，进行10个循环，以确保样品保持冷却。在18,000rpm、4℃条件下，离心裂解的细胞30分钟。将上清液加载到0.1MNiSO4填充的螯合柱(20-30ml的柱是足够的)，且该柱用50mMHEPESpH7.2200mMNaCl进行平衡。使用10mM和40mM步进梯度(stepgradient)的咪唑洗去非特异性结合的蛋白，并用100mM的咪唑洗脱融合蛋白。在5L的pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES中于4℃过夜，透析洗脱的融合蛋白；并且测量透析的融合蛋白的OD值。以每100μg融合蛋白加1单位的因子Xa，并且在25℃条件下静置过夜进行温育。加载到0.1MNiSO4填充的、且用pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES进行平衡的螯合柱上(20-30ml的柱是足够的)。用pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES洗该柱，直到基线水平。使用10mM和40mM步进梯度的咪唑洗去非特异性结合的蛋白，并用100mM的咪唑洗脱融合蛋白。在5L的pH7.2含200mMNaCl的50mMHEPES中于4℃过夜，透析洗脱的融合蛋白，且浓缩融合蛋白至大约2mg/ml，等分样品并在-20℃冷冻。使用OD、BCA和纯度分析法检测纯化的蛋白。图2显示用SDS-PAGE分析的纯化蛋白。实施例5——LC/C-环状RGD-HN/C融合蛋白的制备
可以使用在实施例2中描述的方法设计LC-HN连接子，但是其中使用血清型C连接子，其排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-环状RGD-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID16)。LC/C-环状RGD-HN/C融合然后被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行的，并使用实施例2中描述的方法进行构建。最终的构建物包含LC-连接子-环状RGD-间隔区-HNORF(SEQID17)，用于转移进入表达载体进行表达，以产生具有在SEQID18中阐述的序列的融合蛋白。为了进行重组蛋白表达，所得的表达质粒pMALLC/C-环状RGD-HN/C被转化进入大肠杆菌BL21。融合蛋白的表达按照实施例4的描述进行。图1表示了在大肠杆菌中表达的蛋白，如由通过SDS-PAGE所分析。实施例6——LC/C-THALWHT-HN/C融合蛋白的制备
LC-HN连接子能使用在实施例2中描述的方法进行设计，但是其中使用血清型C连接子，其排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-THALWHT-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID19)。LC/C-THALWHT-HN/C融合然后被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行的，并使用实施例2中描述的方法进行构建。最终的构建物包含LC-连接子-THALWHT-间隔区-HNORF(SEQID20)，其作用为转移进入用于表达的表达载体，以产生具有在SEQID21中阐述的序列的融合蛋白。融合蛋白的表达按照实施例4中的描述进行。图1表示了在大肠杆菌中表达的蛋白，如通过SDS-PAGE所分析。
在本实施例(SEQIDs19、20和21)中给出的THALWHT肽序列，能用采用噬菌体展示技术所发现的其它肽序列进行替换。例如，LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)和LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wuetal.，2003)；CDSAFVTVDWGRSMSLC(Floreaetal.，2003)；SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP(Writeretal.，2004)；FSLSKPP、HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahimetal.，2003)。实施例7-LC/C-环状THALWHT-HN/C融合蛋白的制备
可以使用在实施例2中描述的方法设计LC-HN连接子，但是其中使用排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-环THALWHT-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID22)的血清型C连接子。LC/C-环状THALWHT-HN/C融合然后被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行的，并使用实施例2中描述的方法进行构建。最终的构建物包含LC-连接子-环状THALWHT-间隔区-HNORF(SEQID23)，其作用为转移进入用于表达的表达载体，以产生具有在SEQID24中阐述的序列的融合蛋白。融合蛋白的表达按照实施例4中的描述进行。图1表示了SDS-PAGE分析的在大肠杆菌中表达的蛋白。
在本实施例(SEQIDs19、20和21)中给出的THALWHT肽序列能用噬菌体展示技术发现的其它肽序列进行替换。例如，LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)和LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wuetal.，2003)；CDSAFVTVDWGRSMSLC(Floreaetal.，2003)；SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP(Writeretal.，2004)；FSLSKPP、HSMQLST和STQAMFQ肽(Rahimetal.，2003).实施例8——LC/C-ANP-HN/C融合蛋白的制备
LC-HN连接子可以使用在实施例2中描述的方法进行设计，但是其中使用排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-ANP-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID25)的血清型C连接子。LC/C-ANP-HN/C融合然后被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行，并使用实施例2中描述的方法进行构建。最终的构建物包含LC-连接子-ANP-间隔区-HNORF(SEQID26)，其作用为转移进入用于表达的表达载体，以产生具有在SEQID27中阐述的序列的融合蛋白。实施例9——LC/C-VIP-HN/C融合蛋白的制备
LC-HN连接子可以用在实施例2中描述的方法进行设计，但是其中使用排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-VIP-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID28)的血清型C连接子。LC/C-VIP-HN/C融合然后被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行的，并使用实施例2中描述的方法进行构建。最终的构建物包含LC-连接子-VIP-间隔区-HNORF(SEQID29)，其作用为转移进入用于表达的表达载体，以产生具有在SEQID30中阐述的序列的融合蛋白。
在SEQID28中给出的VIP序列可被VIP类似物或激动剂序列所代替。例如：[R15，20，21，L17]-VIP或[R15，20，21，L17]-VIP-GRR(Kashimotoetal.，1996；Onoueetal.，2004)；[A2，8，9，16，19，24]-VIP或[A2，8，9，16，19，24，25]-VIP(Igarashietal.，2005).实施例10——LC/C-胃泌激素释放肽-HN/C融合蛋白的制备
LC-HN连接子能使用在实施例2中描述的方法进行设计，但是其中使用排列为BamHI-SalI-连接子-蛋白酶位点-胃泌激素释放肽-NheI-间隔区-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII(SEQID34)的血清型C连接子。LC/C-胃泌激素释放肽-HN/C融合然后被组装，是通过使用实施例1中描述的方法制备的LC/C(SEQID5)和HN/C(SEQID6)进行的，并使用实施例2中描述的方法进行构建。最终的构建物包含LC-连接子-胃泌激素释放肽-间隔区-HNORF(SEQID35)，其作用为转移进入用于表达的表达载体，以产生具有在SEQID36中阐述的序列的融合蛋白。实施例11——LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的功能性的评定
LC/C-RGD-HN/C融合蛋白(依照实施例4制备)的TM成分的功能性，通过配体结合试验进行评定。为了使配体结合的评定容易进行，RGD结合肽以生物素化的和非生物素化的形式合成。通过使用非生物素化形式的竞争分析方法(competitionassay)，测定融合蛋白的结合。简言之，NCL-H292细胞被铺入96孔平板，建立存活的培养物。细胞和溶液被预冷至4℃，该溶液使用细胞饲养培养基加HEPES(50mM)制备。在处理之前，将培养基和细胞分离，并用培养基加HEPES(500μl每孔)替换，然后其也被除去。标记的配体以两倍于所需的浓度，被加入到所有的孔中(每孔50μl)。融合蛋白以两倍于所需的浓度，被加入到孔中(每孔50μl)。4℃中培养1小时后，培养基被除去，并替换为培养基加HEPES(每孔100μl)。该培养基被除去，并替换为培养基加HEPES(每孔100μl)。细胞用每孔100μl的0.1％的PBS-Tween，在4℃条件下裂解5分钟。除去PBS-Tween，细胞用培养基加HEPES(每孔100μl)洗涤。除去该培养基，并替换为每孔100μlPBS和100μl链霉抗生物素-HPR。细胞在RTP下温育20分钟。除去PBS和链霉抗生物素，并用PBS-Tween洗涤细胞。每孔加入100μlTMB，细胞在37℃条件下温育10分钟。每孔加入50μl2MH2SO4并在450nM下读板。用这种方法，确认LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的TM成分结合到细胞表面的能力。附图描述图1——LC/C-RGD-HN/C、LC/C-环状RGD-HN/C、LC/C-THALWHT-HN/C和LC/C-环状THALWHT-HN/C融合蛋白在大肠杆菌中的表达
使用在实施例4中概述的方法，LC/C-RGD-HN/C、LC/C-环状RGD-HN/C、LC/C-THALWHT-HN/C和LC/C-环状THALWHT-HN/C融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中进行表达。简言之，用10ml起始培养物，接种1L含0.2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基。培养物在37℃下生长，直到OD600nm达到大约0.5；在该时间点，温度被降低到16℃。在用1mMIPTG诱导培养物1小时后，使培养物进一步生长16小时。电泳泳道1，LC/C-THALWHT-HN/C；电泳泳道2，LC/C-RGD-HN/C；电泳泳道3，LC/C-环状THALWHT-HN/C；电泳泳道4，LC/C-环状RGD-HN/C。图2-LC/C-RGD-HN/C融合蛋白的纯化
使用在实施例5中概述的方法，从大肠杆菌BL21细胞中纯化LC/C-RGD-HN/C融合蛋白。简言之，细胞破裂后得到的可溶性产物，被施加到镍填充的亲和捕获柱。用100mM的咪唑洗脱结合的蛋白，用因子Xa处理以活化融合蛋白，并且除去麦芽糖结合蛋白(maltose-bindingprotein(MBP))标签，然后再施加到第二根镍填充的亲和捕获柱。从纯化过程得到的样品用SDS-PAGE进行评定。最终的纯化材料，在存在和不存在还原剂的情况下，进行鉴别，分别在标记[-]和[+]的电泳泳道中。参考文献Floreaetal.，(2003)J.DrugTargeting11：383-390Jostetal.，(2001)FEBSlett.489：263-269Leeetal.，(2001)Eur.J.Biochem.268：2004-2012Mathiasetal.，(1994)J.Virol.68：6811-6814Rahimetal.，(2003)Biotechniques35：317-324Roivaninenetal.，(1991)J.Virol.65：4735-4740Ruoslahti(1996)Ann.Rev.CellDev.Biol.12：697-715Schneideretal.，(1999)FEBSlett.458：329-332Writeretal.，(2004)J.DrugTargeting12：185-193Wuetal.，(2003)GeneTher.10：1429-1436
序列表
<110>健康保护机构
J.查多克
L.杜勒斯
K.福斯特
<120>包含非细胞毒性蛋白酶、寻靶部分、蛋白酶切割位点和转运结构域的融合蛋白
<130>P27140WO/MRM
<150>GB0426397.6
<151>2004-12-01
<160>47
<170>PatentInversion3.2
<210>1
<211>1302
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>1
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tatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaa840
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aaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctct960
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<220>
<223>合成的
<400>5
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740745750
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835840845
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>14
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gatctgctgtatccgagcattgatagcgaaagcgaaattctgccgggcgaaaaccaggtg1680
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aacaacagcctgctgaaagatatcatcaacgaatacttcaatctagaagcactagcgagt2700
gggcaccatcaccatcaccattaatgaaagctt2733
<210>15
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CPRGD-C融合的蛋白质序列
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GlySerGluPheMetProIleThrIleAsnAsnPheAsnTyrSerAsp
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ProValAspAsnLysAsnIleLeuTyrLeuAspThrHisLeuAsnThr
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LeuAlaAsnGluProGluLysAlaPheArgIleThrGlyAsnIleTrp
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LeuSerThrAspSerAspLysAspThrPheLeuLysGluIleIleLys
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ArgLeuSerThrAspIleProPheProGlyAsnAsnAsnThrProIle
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AsnThrPheAspPheAspValAspPheAsnSerValAspValLysThr
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IleIleThrGlyProArgGluAsnIleIleAspProGluThrSerThr
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PheLysLeuThrAsnAsnThrPheAlaAlaGlnGluGlyPheGlyAla
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<223>CP环状THALWHT-C融合的DNA序列
<400>23
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<220>
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<210>25
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<212>DNA
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<220>
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<210>29
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<212>DNA
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<220>
<223>CPVIP-C融合的DNA序列
<400>29
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ctgcgtaaagataccctggataaaatcagcgatgttagcgcgattattccgtatattggt1980
ccggcgctgaacattagcaatagcgtgcgtcgtggcaattttaccgaagcgtttgcggtt2040
accggtgtgaccattctgctggaagcgtttccggaatttaccattccggcgctgggtgcg2100
tttgtgatctatagcaaagtgcaggaacgcaacgaaatcatcaaaaccatcgataactgc2160
ctggaacagcgtattaaacgctggaaagatagctatgaatggatgatgggcacctggctg2220
agccgtattatcacccagttcaacaacatcagctaccagatgtacgatagcctgaactat2280
caggcgggtgcgattaaagcgaaaatcgatctggaatacaaaaaatacagcggcagcgat2340
aaagaaaacatcaaaagccaggttgaaaacctgaaaaacagcctggatgtgaaaattagc2400
gaagcgatgaataacatcaacaaattcatccgcgaatgcagcgtgacctacctgttcaaa2460
aacatgctgccgaaagtgatcgatgaactgaacgaatttgatcgcaacaccaaagcgaaa2520
ctgatcaacctgatcgatagccacaacattattctggtgggcgaagtggataaactgaaa2580
gcgaaagttaacaacagcttccagaacaccatcccgtttaacatcttcagctataccaac2640
aacagcctgctgaaagatatcatcaacgaatacttcaatctagaagcactagcgagtggg2700
caccatcaccatcaccattaatgaaagctt2730
<210>30
<211>908
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CPVIP-C融合的蛋白质序列
<400>30
LysAsnIleLeuTyrLeuAspThrHisLeuAsnThrLeuAlaAsnGlu
151015
ProGluLysAlaPheArgIleThrGlyAsnIleTrpValIleProAsp
202530
ArgPheSerArgAsnSerAsnProAsnLeuAsnLysProProArgVal
354045
ThrSerProLysSerGlyTyrTyrAspProAsnTyrLeuSerThrAsp
505560
SerAspLysAspThrPheLeuLysGluIleIleLysLeuPheLysArg
65707580
IleAsnSerArgGluIleGlyGluGluLeuIleTyrArgLeuSerThr
859095
AspIleProPheProGlyAsnAsnAsnThrProIleAsnThrPheAsp
100105110
PheAspValAspPheAsnSerValAspValLysThrArgGlnGlyAsn
115120125
AsnTrpValLysThrGlySerIleAsnProSerValIleIleThrGly
130135140
ProArgGluAsnIleIleAspProGluThrSerThrPheLysLeuThr
145150155160
AsnAsnThrPheAlaAlaGlnGluGlyPheGlyAlaLeuSerIleIle
165170175
SerIleSerProArgPheMetLeuThrTyrSerAsnAlaThrAsnAsp
180185190
ValGlyGluGlyArgPheSerLysSerGluPheCysMetAspProIle
195200205
LeuIleLeuMetHisGluLeuAsnHisAlaMetHisAsnLeuTyrGly
210215220
IleAlaIleProAsnAspGlnThrIleSerSerValThrSerAsnIle
225230235240
PheTyrSerGlnTyrAsnValLysLeuGluTyrAlaGluIleTyrAla
245250255
PheGlyGlyProThrIleAspLeuIleProLysSerAlaArgLysTyr
260265270
PheGluGluLysAlaLeuAspTyrTyrArgSerIleAlaLysArgLeu
275280285
AsnSerIleThrThrAlaAsnProSerSerPheAsnLysTyrIleGly
290295300
GluTyrLysGlnLysLeuIleArgLysTyrArgPheValValGluSer
305310315320
SerGlyGluValThrValAsnArgAsnLysPheValGluLeuTyrAsn
325330335
GluLeuThrGlnIlePheThrGluPheAsnTyrAlaLysIleTyrAsn
340345350
ValGlnAsnArgLysIleTyrLeuSerAsnValTyrThrProValThr
355360365
AlaAsnIleLeuAspAspAsnValTyrAspIleGlnAsnGlyPheAsn
370375380
IleProLysSerAsnLeuAsnValLeuPheMetGlyGlnAsnLeuSer
385390395400
ArgAsnProAlaLeuArgLysValAsnProGluAsnMetLeuTyrLeu
405410415
PheThrLysPheCysValAspAlaIleAspGlyArgGlyGlyArgGly
420425430
AspMetPheGlyAlaAlaLeuAlaGlyValAspAlaIleAspGlyArg
435440445
HisSerAspAlaValPheThrAspAsnTyrThrArgLeuArgLysGln
450455460
MetAlaValLysLysTyrLeuAsnSerIleLeuAsnAlaLeuAlaGly
465470475480
GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaLeu
485490495
ValLeuGlnLysThrAspIlePheLeuArgLysAspIleAsnGluGlu
500505510
ThrGluValIleTyrTyrProAspAsnValSerValAspGlnValIle
515520525
LeuSerLysAsnThrSerGluHisGlyGlnLeuAspLeuLeuTyrPro
530535540
SerIleAspSerGluSerGluIleLeuProGlyGluAsnGlnValPhe
545550555560
TyrAspAsnArgThrGlnAsnValAspTyrLeuAsnSerTyrTyrTyr
565570575
LeuGluSerGlnLysLeuSerAspAsnValGluAspPheThrPheThr
580585590
ArgSerIleGluGluAlaLeuAspAsnSerAlaLysValTyrThrTyr
595600605
PheProThrLeuAlaAsnLysValAsnAlaGlyValGlnGlyGlyLeu
610615620
PheLeuMetTrpAlaAsnAspValValGluAspPheThrThrAsnIle
625630635640
LeuArgLysAspThrLeuAspLysIleSerAspValSerAlaIleIle
645650655
ProTyrIleGlyProAlaLeuAsnIleSerAsnSerValArgArgGly
660665670
AsnPheThrGluAlaPheAlaValThrGlyValThrIleLeuLeuGlu
675680685
AlaPheProGluPheThrIleProAlaLeuGlyAlaPheValIleTyr
690695700
SerLysValGlnGluArgAsnGluIleIleLysThrIleAspAsnCys
705710715720
LeuGluGlnArgIleLysArgTrpLysAspSerTyrGluTrpMetMet
725730735
GlyThrTrpLeuSerArgIleIleThrGlnPheAsnAsnIleSerTyr
740745750
GlnMetTyrAspSerLeuAsnTyrGlnAlaGlyAlaIleLysAlaLys
755760765
IleAspLeuGluTyrLysLysTyrSerGlySerAspLysGluAsnIle
770775780
LysSerGlnValGluAsnLeuLysAsnSerLeuAspValLysIleSer
785790795800
GluAlaMetAsnAsnIleAsnLysPheIleArgGluCysSerValThr
805810815
TyrLeuPheLysAsnMetLeuProLysValIleAspGluLeuAsnGlu
820825830
PheAspArgAsnThrLysAlaLysLeuIleAsnLeuIleAspSerHis
835840845
AsnIleIleLeuValGlyGluValAspLysLeuLysAlaLysValAsn
850855860
AsnSerPheGlnAsnThrIleProPheAsnIlePheSerTyrThrAsn
865870875880
AsnSerLeuLeuLysAspIleIleAsnGluTyrPheAsnLeuGluAla
885890895
LeuAlaSerGlyHisHisHisHisHisHisLysLeu
900905
<210>31
<211>210
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CP胃泌素释放肽-C连接子的DNA序列
<400>31
ggatccacgcacgtcgacgcgattgatggtcgtgttccgctgccggctggtggtggtacc60
gttctgaccaaaatgtacccgcgtggtaaccactgggctgttggtcacctgatggcgcta120
gcgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcgcactagtgctg180
cagacgcacggtctagaatgataaaagctt210
<210>32
<211>2787
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CP胃泌素释放肽-C融合的DNA序列
<400>32
ggatccgaattcatgccgatcaccatcaacaacttcaactacagcgatccggtggataac60
aaaaacatcctgtacctggatacccatctgaataccctggcgaacgaaccggaaaaagcg120
tttcgtatcaccggcaacatttgggttattccggatcgttttagccgtaacagcaacccg180
aatctgaataaaccgccgcgtgttaccagcccgaaaagcggttattacgatccgaactat240
ctgagcaccgatagcgataaagataccttcctgaaagaaatcatcaaactgttcaaacgc300
atcaacagccgtgaaattggcgaagaactgatctatcgcctgagcaccgatattccgttt360
ccgggcaacaacaacaccccgatcaacacctttgatttcgatgtggatttcaacagcgtt420
gatgttaaaacccgccagggtaacaattgggtgaaaaccggcagcattaacccgagcgtg480
attattaccggtccgcgcgaaaacattattgatccggaaaccagcacctttaaactgacc540
aacaacacctttgcggcgcaggaaggttttggcgcgctgagcattattagcattagcccg600
cgctttatgctgacctatagcaacgcgaccaacgatgttggtgaaggccgtttcagcaaa660
agcgaattttgcatggacccgatcctgatcctgatgcatgaactgaaccatgcgatgcat720
aacctgtatggcatcgcgattccgaacgatcagaccattagcagcgtgaccagcaacatc780
ttttacagccagtacaacgtgaaactggaatatgcggaaatctatgcgtttggcggtccg840
accattgatctgattccgaaaagcgcgcgcaaatacttcgaagaaaaagcgctggattac900
tatcgcagcattgcgaaacgtctgaacagcattaccaccgcgaatccgagcagcttcaac960
aaatatatcggcgaatataaacagaaactgatccgcaaatatcgctttgtggtggaaagc1020
agcggcgaagttaccgttaaccgcaataaattcgtggaactgtacaacgaactgacccag1080
atcttcaccgaatttaactatgcgaaaatctataacgtgcagaaccgtaaaatctacctg1140
agcaacgtgtataccccggtgaccgcgaatattctggatgataacgtgtacgatatccag1200
aacggctttaacatcccgaaaagcaacctgaacgttctgtttatgggccagaacctgagc1260
cgtaatccggcgctgcgtaaagtgaacccggaaaacatgctgtacctgttcaccaaattt1320
tgcgtcgacgcgattgatggtcgtgttccgctgccggctggtggtggtaccgttctgacc1380
aaaatgtacccgcgtggtaaccactgggctgttggtcacctgatggcgctagcgggcggt1440
ggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcgcactagtgctgcagtgtcgt1500
gaactgctggtgaaaaacaccgatctgccgtttattggcgatatcagcgatgtgaaaacc1560
gatatcttcctgcgcaaagatatcaacgaagaaaccgaagtgatctactacccggataac1620
gtgagcgttgatcaggtgatcctgagcaaaaacaccagcgaacatggtcagctggatctg1680
ctgtatccgagcattgatagcgaaagcgaaattctgccgggcgaaaaccaggtgttttac1740
gataaccgtacccagaacgtggattacctgaacagctattactacctggaaagccagaaa1800
ctgagcgataacgtggaagattttacctttacccgcagcattgaagaagcgctggataac1860
agcgcgaaagtttacacctattttccgaccctggcgaacaaagttaatgcgggtgttcag1920
ggcggtctgtttctgatgtgggcgaacgatgtggtggaagatttcaccaccaacatcctg1980
cgtaaagataccctggataaaatcagcgatgttagcgcgattattccgtatattggtccg2040
gcgctgaacattagcaatagcgtgcgtcgtggcaattttaccgaagcgtttgcggttacc2100
ggtgtgaccattctgctggaagcgtttccggaatttaccattccggcgctgggtgcgttt2160
gtgatctatagcaaagtgcaggaacgcaacgaaatcatcaaaaccatcgataactgcctg2220
gaacagcgtattaaacgctggaaagatagctatgaatggatgatgggcacctggctgagc2280
cgtattatcacccagttcaacaacatcagctaccagatgtacgatagcctgaactatcag2340
gcgggtgcgattaaagcgaaaatcgatctggaatacaaaaaatacagcggcagcgataaa2400
gaaaacatcaaaagccaggttgaaaacctgaaaaacagcctggatgtgaaaattagcgaa2460
gcgatgaataacatcaacaaattcatccgcgaatgcagcgtgacctacctgttcaaaaac2520
atgctgccgaaagtgatcgatgaactgaacgaatttgatcgcaacaccaaagcgaaactg2580
atcaacctgatcgatagccacaacattattctggtgggcgaagtggataaactgaaagcg2640
aaagttaacaacagcttccagaacaccatcccgtttaacatcttcagctataccaacaac2700
agcctgctgaaagatatcatcaacgaatacttcaatctagaagcactagcgagtgggcac2760
catcaccatcaccattaatgaaagctt2787
<210>33
<211>927
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CP胃泌素释放肽-C融合的蛋白质序列
<400>33
GlySerGluPheMetProIleThrIleAsnAsnPheAsnTyrSerAsp
151015
ProValAspAsnLysAsnIleLeuTyrLeuAspThrHisLeuAsnThr
202530
LeuAlaAsnGluProGluLysAlaPheArgIleThrGlyAsnIleTrp
354045
ValIleProAspArgPheSerArgAsnSerAsnProAsnLeuAsnLys
505560
ProProArgValThrSerProLysSerGlyTyrTyrAspProAsnTyr
65707580
LeuSerThrAspSerAspLysAspThrPheLeuLysGluIleIleLys
859095
LeuPheLysArgIleAsnSerArgGluIleGlyGluGluLeuIleTyr
100105110
ArgLeuSerThrAspIleProPheProGlyAsnAsnAsnThrProIle
115120125
AsnThrPheAspPheAspValAspPheAsnSerValAspValLysThr
130135140
ArgGlnGlyAsnAsnTrpValLysThrGlySerIleAsnProSerVal
145150155160
IleIleThrGlyProArgGluAsnIleIleAspProGluThrSerThr
165170175
PheLysLeuThrAsnAsnThrPheAlaAlaGlnGluGlyPheGlyAla
180185190
LeuSerIleIleSerIleSerProArgPheMetLeuThrTyrSerAsn
195200205
AlaThrAsnAspValGlyGluGlyArgPheSerLysSerGluPheCys
210215220
MetAspProIleLeuIleLeuMetHisGluLeuAsnHisAlaMetHis
225230235240
AsnLeuTyrGlyIleAlaIleProAsnAspGlnThrIleSerSerVal
245250255
ThrSerAsnIlePheTyrSerGlnTyrAsnValLysLeuGluTyrAla
260265270
GluIleTyrAlaPheGlyGlyProThrIleAspLeuIleProLysSer
275280285
AlaArgLysTyrPheGluGluLysAlaLeuAspTyrTyrArgSerIle
290295300
AlaLysArgLeuAsnSerIleThrThrAlaAsnProSerSerPheAsn
305310315320
LysTyrIleGlyGluTyrLysGlnLysLeuIleArgLysTyrArgPhe
325330335
ValValGluSerSerGlyGluValThrValAsnArgAsnLysPheVal
340345350
GluLeuTyrAsnGluLeuThrGlnIlePheThrGluPheAsnTyrAla
355360365
LysIleTyrAsnValGlnAsnArgLysIleTyrLeuSerAsnValTyr
370375380
ThrProValThrAlaAsnIleLeuAspAspAsnValTyrAspIleGln
385390395400
AsnGlyPheAsnIleProLysSerAsnLeuAsnValLeuPheMetGly
405410415
GlnAsnLeuSerArgAsnProAlaLeuArgLysValAsnProGluAsn
420425430
MetLeuTyrLeuPheThrLysPheCysValAspAlaIleAspGlyArg
435440445
ValProLeuProAlaGlyGlyGlyThrValLeuThrLysMetTyrPro
450455460
ArgGlyAsnHisTrpAlaValGlyHisLeuMetAlaLeuAlaGlyGly
465470475480
GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaLeuVal
485490495
LeuGlnCysArgGluLeuLeuValLysAsnThrAspLeuProPheIle
500505510
GlyAspIleSerAspValLysThrAspIlePheLeuArgLysAspIle
515520525
AsnGluGluThrGluValIleTyrTyrProAspAsnValSerValAsp
530535540
GlnValIleLeuSerLysAsnThrSerGluHisGlyGlnLeuAspLeu
545550555560
LeuTyrProSerIleAspSerGluSerGluIleLeuProGlyGluAsn
565570575
GlnValPheTyrAspAsnArgThrGlnAsnValAspTyrLeuAsnSer
580585590
TyrTyrTyrLeuGluSerGlnLysLeuSerAspAsnValGluAspPhe
595600605
ThrPheThrArgSerIleGluGluAlaLeuAspAsnSerAlaLysVal
610615620
TyrThrTyrPheProThrLeuAlaAsnLysValAsnAlaGlyValGln
625630635640
GlyGlyLeuPheLeuMetTrpAlaAsnAspValValGluAspPheThr
645650655
ThrAsnIleLeuArgLysAspThrLeuAspLysIleSerAspValSer
660665670
AlaIleIleProTyrIleGlyProAlaLeuAsnIleSerAsnSerVal
675680685
ArgArgGlyAsnPheThrGluAlaPheAlaValThrGlyValThrIle
690695700
LeuLeuGluAlaPheProGluPheThrIleProAlaLeuGlyAlaPhe
705710715720
ValIleTyrSerLysValGlnGluArgAsnGluIleIleLysThrIle
725730735
AspAsnCysLeuGluGlnArgIleLysArgTrpLysAspSerTyrGlu
740745750
TrpMetMetGlyThrTrpLeuSerArgIleIleThrGlnPheAsnAsn
755760765
IleSerTyrGlnMetTyrAspSerLeuAsnTyrGlnAlaGlyAlaIle
770775780
LysAlaLysIleAspLeuGluTyrLysLysTyrSerGlySerAspLys
785790795800
GluAsnIleLysSerGlnValGluAsnLeuLysAsnSerLeuAspVal
805810815
LysIleSerGluAlaMetAsnAsnIleAsnLysPheIleArgGluCys
820825830
SerValThrTyrLeuPheLysAsnMetLeuProLysValIleAspGlu
835840845
LeuAsnGluPheAspArgAsnThrLysAlaLysLeuIleAsnLeuIle
850855860
AspSerHisAsnIleIleLeuValGlyGluValAspLysLeuLysAla
865870875880
LysValAsnAsnSerPheGlnAsnThrIleProPheAsnIlePheSer
885890895
TyrThrAsnAsnSerLeuLeuLysAspIleIleAsnGluTyrPheAsn
900905910
LeuGluAlaLeuAlaSerGlyHisHisHisHisHisHisLysLeu
915920925
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>34
ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeu
1510
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>35
CysProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuCys
1510
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>36
ThrHisAlaLeuTrpHisThr
15
<210>37
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LEBP-1肽
<400>37
GlnProPheMetGlnCysLeuCysLeuIleTyrAspAlaSerCys
151015
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LEBP-2肽
<400>38
ArgAsnValProProIlePheAsnAspValTyrTrpIleAlaPhe
151015
<210>39
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LEBP-3肽
<400>39
ValPheArgValArgProTrpTyrGlnSerThrSerGlnSer
1510
<210>40
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>40
SerGluArgSerMetAsnPhe
15
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>41
TyrGlyLeuProHisLysPhe
15
<210>42
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>42
ProSerGlyAlaAlaArgAla
15
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>43
LeuProHisLysSerMetPro
15
<210>44
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>44
LeuGlnHisLysSerMetPro
15
<210>45
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>45
PheSerLeuSerLysProPro
15
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>46
HisSerMetGlnLeuSerThr
15
<210>47
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>47
SerThrGlnAlaMetPheGln
15

Claims (31)

1.一种单链、多肽融合蛋白，其包括：
(a).非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；
(b).寻靶部分，其能结合到所述靶细胞的结合位点，该结合位点能经过细胞内吞作用而被导入到所述靶细胞内的内体中；
(c).蛋白酶切割位点，在该位点所述融合蛋白可以被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶切割位点位于所述非细胞毒性蛋白酶或其片段与所述寻靶部分之间；以及
(d).转运结构域，其能转运所述蛋白酶或蛋白酶片段从内体内部穿过所述内体的膜，进入所述靶细胞的胞质溶胶；
其中所述寻靶部分位于所述蛋白酶切割位点与所述转运结构域之间。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分和所述蛋白酶切割位点被至多10个氨基酸残基分开。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分和所述蛋白酶切割位点被至多5个氨基酸残基分开。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分和所述蛋白酶切割位点被至多0个氨基酸残基分开。
5.根据任意一项前述的权利要求所述的融合蛋白，其中所述非细胞毒性蛋白酶是梭菌神经毒素的L-链。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述转运结构域是梭菌神经毒素的HN结构域。
7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分包含至多50个氨基酸残基。
8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分包含至多40个氨基酸残基。
9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分包含至多30个氨基酸残基。
10.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分包含至多20个氨基酸残基。
11.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分由PAR配体组成。
12.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分由配体PAR1组成。
13.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分是结合PTH-1的配体；或其中所述寻靶部分是线性的和环状的整合蛋白结合序列。
14.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分是PTH肽；或其中所述寻靶部分是Arg-Gly-Asp三联结合序列。
15.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分与选自下列的细胞结合：粘液分泌细胞或控制或引导粘液分泌的神经细胞；内分泌细胞；炎性细胞；外分泌细胞；免疫细胞；心血管细胞；或骨细胞。
16.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述寻靶部分由选自下列的配体组成：TFLLR；PAR-1；PTH；VIP或[R15，20，21，L17]-VIP、[R15，20，21，L17]-VIP-GRR、[A2，8，9，16，19，24]-VIP或[A2，8，9，16，19，24，25]-VIP；β2肾上腺素受体激动剂；胃泌素释放肽；降钙素基因相关肽；促甲状腺激素；胰岛素；胰岛素型生长因子；TSH释放激素，普罗瑞林；FSH/LH释放激素，格纳瑞林；促肾上腺皮质激素释放激素；促皮激素；垂体腺苷酸环化酶激活肽；对FcIgE的C4结构域的配体；对C3a/C4a-R补体受体的配体；与CR4补体受体反应的抗原；巨噬细胞刺激因子；与iC3b补体受体相连的抗原；IL8；爱泼斯坦-巴尔病毒片段/表面特性；凝血酶；凝血酶受体促效肽；GP1b表面抗原识别抗体；降血钙素；破骨细胞分化因子TRANCE、RANKL或OPGL；肽，其选自THALWAT、QPFMQCLCLIYDASC、RNVPPIFNDVYWIAF、VFRVRPWYQSTSQS、CDSAFVTVDWGRSMSLC、SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP、FSLSKPP、HSMQLST、STQAMFQ；和ANP。
17.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括纯化标签。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含纯化标签，其存在于所述融合蛋白的N-末端和/或C-末端。
19.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述纯化标签通过肽间隔分子被结合到所述融合蛋白。
20.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述转运结构域通过肽间隔分子与所述的寻靶部分分开。
21.一种多肽融合蛋白，其包含SEQIDNOs：10、12、15、18、21、24、27、30和33中的任意一个。
22.一种核酸序列，其编码根据任意一项前述的权利要求所述的多肽融合蛋白。
23.根据权利要求22所述的核酸序列，其中所述核酸分子包括SEQIDNOs：1-9、11、14、17、20、23、26、29和32中的任意一个。
24.一种DNA载体，其包括启动子、根据权利要求22或23所述的核酸序列，其中所述核酸序列位于所述启动子的下游，以及终止子，其位于所述核酸序列的下游。
25.根据权利要求22或23所述核酸序列的互补DNA链。
26.一种制备根据权利要求1-21中的任意一项所述的多肽融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中，表达根据权利要求22或23所述的核酸序列，或者表达根据权利要求24所述的DNA载体。
27.一种制备非细胞毒性剂的方法，其包括：
(a).使根据权利要求1-21中的任意一项所述的多肽融合蛋白与能切割所述蛋白酶切割位点的蛋白酶相接触；
(b).切割所述的蛋白酶切割位点；
以及，因此形成双链融合蛋白。
28.一种非细胞毒性多肽，其可以通过权利要求27所述的方法获得，其中所述多肽是双链多肽，并且其中
(a).第一条链包含所述非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；
(b).第二条链包含寻靶部分和转运结构域，该转运结构域能转运所述蛋白酶或蛋白酶片段从内体内部穿过所述内体膜，并进入所述靶细胞的胞质溶胶；以及
所述第一条链和第二条链被二硫键连接在一起。
29.根据权利要求1-21中的任意一项所述的融合蛋白或根据权利要求28所述的多肽在制备用于治疗、预防或改善以下医疗症状或疾病的药物中的用途，所述医疗症状或疾病选自粘液分泌过多、和/或慢性阻塞性肺病、内分泌腺肿瘤形成、甲状腺功能亢进和其它依赖甲状腺分泌过多的疾病；肢端肥大症、血中催乳激素过多、库欣病及其它依赖于腺垂体分泌过多的疾病；雄激素过多症、持续无排卵和其它与多囊卵巢综合症相关的疾病、过敏症、血管运动性鼻炎、嗜曙红细胞过多、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、溃疡性结肠炎、慢性狭窄性小肠结肠炎、痔、搔痒症、血管球性肾炎、肝炎、胰腺炎、胃炎、脉管炎、心肌炎、牛皮癣、湿疹、慢性辐射诱导的纤维症、肺瘢痕化和其它纤维变性的病症、治疗重症肌无力、器官移植、组织移植、体液移植、毒性弥漫性甲状腺肿、自身免疫性糖尿病、溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜、嗜中性白细胞减少症、恶性贫血、淋巴细胞性甲状腺炎、青铜色皮肤病、干燥角膜结膜炎综合征、原发性胆汁性肝硬变、多肌炎、硬皮病、系统性硬化症、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮、风湿性心炎、血管球性肾炎古德帕斯彻型、眼色素层炎、睾丸炎、1型糖尿病、心血管疾病和/或高血压和骨骼疾病。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述内分泌腺肿瘤形成包括MEN；所述过敏包括季节性变应性鼻炎、过敏性结膜炎、食物过敏和哮喘；所述胃炎包括自身免疫性胃炎和萎缩性胃炎；所述粘液分泌过多包括位于消化道内的粘液分泌细胞粘液分泌过多；所述骨骼疾病包括骨硬化症和骨质酥松；并且所述肝炎包括慢性自身免疫性肝炎。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述位于消化道内包括位于结肠内。
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Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192596B2 (en) * 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
KR100876060B1 (ko) 1999-08-25 2008-12-26 알러간, 인코포레이티드 활성화가능한 재조합 신경독
US20080038274A1 (en) 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US7138127B1 (en) 2000-01-19 2006-11-21 Allergan, Inc. Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain
AU2888702A (en) * 2000-11-06 2002-05-15 Us Army Med Res Mat Command Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
WO2006026780A1 (en) 2004-09-01 2006-03-09 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
US8778634B2 (en) 2004-12-01 2014-07-15 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8603779B2 (en) 2004-12-01 2013-12-10 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
GB0426397D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
US7659092B2 (en) 2004-12-01 2010-02-09 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
US8512984B2 (en) 2004-12-01 2013-08-20 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8399400B2 (en) 2004-12-01 2013-03-19 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
CA2601577A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells
US8021859B2 (en) 2005-03-15 2011-09-20 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells
US8323666B2 (en) * 2005-08-01 2012-12-04 Allergan, Inc. Botulinum toxin compositions
AU2006315117A1 (en) * 2005-11-17 2007-05-24 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins
GB0610867D0 (en) 2006-06-01 2006-07-12 Syntaxin Ltd Treatment of pain
US7993656B2 (en) 2006-07-11 2011-08-09 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells
JP2009543556A (ja) 2006-07-11 2009-12-10 アラーガン、インコーポレイテッド 増強した転位置能力および増強したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素
US20100215670A1 (en) * 2006-10-30 2010-08-26 Jeannick Cizeau Immunotoxin Fusions Comprising An Antibody Fragment and a Plant Toxin Linked by Protease Cleavable Linkers
EP2211890A1 (en) 2007-10-23 2010-08-04 Allergan, Inc. Methods of treating urogenital-neurological disorders using modified clostridial toxins
US10466245B2 (en) 2008-02-20 2019-11-05 The Secretary Of State For Health Covalently linked thermostable kinase for decontamination process validation
GB0803068D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Health Prot Agency Cross-linked biological indicator
US8470337B2 (en) * 2008-03-13 2013-06-25 Allergan, Inc. Therapeutic treatments using botulinum neurotoxin
US20110171191A1 (en) * 2008-06-12 2011-07-14 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
US8796216B2 (en) 2008-06-12 2014-08-05 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
EP3473643A1 (en) * 2008-06-12 2019-04-24 Ipsen Bioinnovation Limited Fusion proteins for use in the treatemnt of cancer
US8748155B2 (en) * 2008-08-13 2014-06-10 An Educational Foundation Kinki University Protein exhibiting activity of pyrethrin biosynthetic enzyme, gene encoding the protein, and vector bearing the gene
US8759072B2 (en) 2008-08-13 2014-06-24 An Educational Foundation Kinki University Protein exhibiting activity of pyrethrin biosynthetic enzyme, gene encoding the protein, and vector bearing the gene
GB0820970D0 (en) * 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
GB0903006D0 (en) * 2009-02-23 2009-04-08 Syntaxin Ltd Modified non-cytotoxic proteases
HUE047067T2 (hu) 2009-03-13 2020-04-28 Allergan Inc Retargetált endopeptidáz aktivitás immunalapú vizsgálata
US20110111056A1 (en) * 2009-06-03 2011-05-12 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Peptide dicer substrate agents and methods for their specific inhibition of gene expression
AU2011203060A1 (en) * 2009-06-11 2013-01-17 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
WO2011007193A1 (en) * 2009-07-17 2011-01-20 Cellectis Viral vectors encoding a dna repair matrix and containing a virion-associated site specific meganuclease for gene targeting
EP2473031A4 (en) * 2009-09-02 2013-12-04 Univ Chicago METHOD AND SYSTEMS FOR THE INDUCIBLE ABERMENTATION OF NERVE CELLS
US8846603B2 (en) 2010-03-12 2014-09-30 Synageva Biopharma Corp. NPP1 fusion proteins
WO2011123525A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-06 The Regents Of The University Of California Forming an artificial cell with controlled membrane composition, asymmetry and contents
EP3106170B1 (en) 2010-05-20 2020-04-08 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
US20140056870A1 (en) * 2012-08-27 2014-02-27 Allergan, Inc. Fusion proteins
CA2880897C (en) 2012-11-21 2020-01-14 Syntaxin Limited Methods for the manufacture of proteolytically processed polypeptides
GB201303108D0 (en) * 2013-02-21 2013-04-10 Syntaxin Ltd Therapeutics for suppressing osteoporosis
AU2015348254B2 (en) * 2014-11-21 2021-03-25 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Methods for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides
TW201814045A (zh) 2016-09-16 2018-04-16 英商艾普森生物製藥有限公司 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法
EP3519430A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Ipsen Biopharm Limited Hybrid neurotoxins
EP3312290A1 (en) 2016-10-18 2018-04-25 Ipsen Biopharm Limited Cellular vamp cleavage assay
EP3746463A1 (en) 2018-01-29 2020-12-09 Ipsen Biopharm Limited Non-neuronal snare-cleaving botulinum neurotoxins
JP7416433B2 (ja) * 2018-04-10 2024-01-17 ノースウェスタン ユニバーシティ 標的指向性親和性ドメインに基づく膜タンパク質を含む細胞外小胞
CN114269932A (zh) * 2019-12-18 2022-04-01 Mvrix株式会社 肉毒神经毒素的安全制备方法
WO2023080159A1 (ja) * 2021-11-02 2023-05-11 レナセラピューティクス株式会社 リガンド結合核酸複合体

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1176658A (zh) * 1994-10-24 1998-03-18 蛇药制品有限公司 治疗和预防艰难梭菌疾病的疫苗和抗毒素

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9305735D0 (en) 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
GB9508204D0 (en) * 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US7192596B2 (en) * 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
GB9721189D0 (en) * 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
US20040071736A1 (en) * 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
GB9818548D0 (en) * 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
KR100876060B1 (ko) * 1999-08-25 2008-12-26 알러간, 인코포레이티드 활성화가능한 재조합 신경독
US20080032931A1 (en) * 1999-08-25 2008-02-07 Steward Lance E Activatable clostridial toxins
US7740868B2 (en) * 1999-08-25 2010-06-22 Allergan, Inc. Activatable clostridial toxins
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US20030180289A1 (en) * 1999-09-23 2003-09-25 Foster Keith Alan Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US6649161B1 (en) 2000-02-22 2003-11-18 Allergan, Inc. Method for treating hypocalcemia
US6831059B2 (en) 2000-10-20 2004-12-14 Allergan, Inc. Compositions and methods for treating gonadotrophin related illnesses
GB0321344D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Health Prot Agency Re-targeted toxin conjugates
US7811584B2 (en) * 2004-06-30 2010-10-12 Allergan, Inc. Multivalent clostridial toxins
WO2006026780A1 (en) * 2004-09-01 2006-03-09 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
WO2006059105A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Health Protection Agency Non-cytotoxic Protein Conjugates
EP1830872B1 (en) 2004-12-01 2010-11-17 Health Protection Agency Fusion proteins
GB0426397D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
CA2601577A1 (en) * 2005-03-15 2006-09-21 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1176658A (zh) * 1994-10-24 1998-03-18 蛇药制品有限公司 治疗和预防艰难梭菌疾病的疫苗和抗毒素

Also Published As

Publication number Publication date
GB0426397D0 (en) 2005-01-05
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EP1874807A2 (en) 2008-01-09
US8124405B2 (en) 2012-02-28
PT1874807E (pt) 2013-10-09
CA2593707C (en) 2015-01-20
US20120149084A1 (en) 2012-06-14
US8372615B2 (en) 2013-02-12
CN101098885A (zh) 2008-01-02
WO2006059113A2 (en) 2006-06-08
US20090004174A1 (en) 2009-01-01
US8956847B2 (en) 2015-02-17
CY1114839T1 (el) 2016-12-14

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