JP5438901B2 - 非細胞傷害性プロテアーゼ、ターゲティング部分、プロテアーゼ切断部位およびトランスロケーションドメインを含む融合タンパク質 - Google Patents
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Description
NH2−[プロテアーゼ構成部分]−[トランスロケーション構成部分]−[TM]−COOH
a.非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであって、標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント;
b.該標的細胞上の結合部位に結合し得るターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ得る、ターゲティング部分;
c.プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位;および
トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る、トランスロケーションドメイン
を含む。
エンテロキナーゼ(DDDDK↓)
第Xa因子(IEGR↓/IDGR↓)
TEV(タバコエッチウイルス)(ENLYFQ↓G)
トロンビン(LVPR↓GS)
PreScission(LEVLFQ↓GP)。
His−タグ(例えば、6×ヒスチジン)、好ましくはC末端タグおよび/またはN末端タグとして
MBP−タグ(マルトース結合タンパク質)、好ましくはN末端タグとして
GST−タグ(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、好ましくはN末端タグとして
His−MBP−タグ、好ましくはN末端タグとして
GST−MBP−タグ、好ましくはN末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはN末端タグとして
CBD−タグ(キチン結合ドメイン)、好ましくはN末端タグとして。
a.本発明の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程;
b.プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程。
a.第一鎖は、非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントを含み、このプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントは、標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る;
b.第二鎖は、TMおよびトランスロケーションドメインを含み、トランスロケーションドメインは、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る;そして
第一鎖および第二鎖は、一緒にジスルフィド結合で連結されている。
ターゲティング部分(TM)は、薬剤と標的細胞の表面との間に物理的会合を引き起こすように、結合部位と機能的に相互作用する薬剤と会合する任意の化学的構造を意味する。本発明においては、標的細胞は、侵害受容感覚求心性神経以外の任意の細胞である。TMとの用語は、結合部位が内在化(例えば、エンドソーム形成)−レセプター媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる−を行い得る、標的細胞上の結合部位に結合し得る任意の分子(すなわち、天然に存在する分子またはそれらの化学的/物理的に改変された改変体)を含む。TMは、エンドソーム膜トランスロケーション機能を保有し得、この場合、本発明の薬剤に、TM構成部分とトランスロケーションドメイン構成部分とが別々に存在する必要はない。
ボツリヌス菌A型神経毒素−アミノ酸残基(449〜871)
ボツリヌス菌B型神経毒素−アミノ酸残基(441〜858)
ボツリヌス菌C型神経毒素−アミノ酸残基(442〜866)
ボツリヌス菌D型神経毒素−アミノ酸残基(446〜862)
ボツリヌス菌E型神経毒素−アミノ酸残基(423〜845)
ボツリヌス菌F型神経毒素−アミノ酸残基(440〜864)
ボツリヌス菌G型神経毒素−アミノ酸残基(442〜863)
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基(458〜879)。
配列番号1 LC/AのDNA配列
配列番号2 HN/AのDNA配列
配列番号3 LC/BのDNA配列
配列番号4 HN/BのDNA配列
配列番号5 LC/CのDNA配列
配列番号6 HN/CのDNA配列
配列番号7 CP PAR1−BリンカーのDNA配列
配列番号8 CP PTH−CリンカーのDNA配列
配列番号9 CP PAR1−B融合物のDNA配列
配列番号10 CP PAR1−B融合物のタンパク質配列
配列番号11 CP PTH−C融合物のDNA配列
配列番号12 CP PTH−C融合物のタンパク質配列
配列番号13 CP RGD−CリンカーのDNA配列
配列番号14 CP RGD−C融合物のDNA配列
配列番号15 CP RGD−C融合物のタンパク質配列
配列番号16 CP 環状RGD−CリンカーのDNA配列
配列番号17 CP 環状RGD−C融合物のDNA配列
配列番号18 CP 環状RGD−C融合物のタンパク質配列
配列番号19 CP THALWHT−CリンカーのDNA配列
配列番号20 CP THALWHT−C融合物のDNA配列
配列番号21 CP THALWHT−C融合物のタンパク質配列
配列番号22 CP 環状THALWHT−CリンカーのDNA配列
配列番号23 CP 環状THALWHT−C融合物のDNA配列
配列番号24 CP 環状THALWHT−C融合物のタンパク質配列
配列番号25 CP ANP−CリンカーのDNA配列
配列番号26 CP ANP−C融合物のDNA配列
配列番号27 CP ANP−C融合物のタンパク質配列
配列番号28 CP VIP−CリンカーのDNA配列
配列番号29 CP VIP−C融合物のDNA配列
配列番号30 CP VIP−C融合物のタンパク質配列
配列番号31 CP ガストリン放出ペプチド−CリンカーのDNA配列
配列番号32 CP ガストリン放出ペプチド−C融合物のDNA配列
配列番号33 CP ガストリン放出ペプチド−C融合物のタンパク質配列。
以下の手順によって、マルチドメイン融合物発現用の構成部分バックボーンとして使用するためのLCおよびHNフラグメントを作製する。本実施例は、血清型Bベースのクローン(配列番号3および配列番号4)の調製に基づいているが、手順および方法は他の血清型にも同等に適用可能である(血清型A(配列番号1および配列番号2)ならびに血清型C(配列番号5および配列番号6)については配列表に図示)。
pCR 4(Invitrogen)は、構築物の確認を容易にするために、ベクター内の制限配列の欠損および隣接する配列決定プライマー部位によって選択した、選り抜きの標準的なクローニングベクターである。この発現ベクターは、pMAL(NEB)発現ベクターに基づいており、これは、構築物の挿入のために正しい方向でマルチプルクローニング部位内に所望の制限配列を有する(BamHI-SalI-PstI-HindIII)。非動員性プラスミドを作製するため、発現ベクターのフラグメントが除去されており、そして精製の選択肢を増大させるため、種々の異なる融合タグが挿入されている。
LC/B(配列番号3)を、二通りの方法の一方によって作製する:
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール(例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon))の1つを用いて、(GenBank(アクセッション番号P10844)またはSwissprot(アクセッション位置BXB_CLOBO)のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる)LC/Bアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。BamHI/SalI認識配列を、配列の5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み取り枠を維持する。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて)スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、LC/Bオープンリーディングフレーム(ORF)を含有するこの最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
HN/B(配列番号4)を、二通りの方法の一方によって作製する:
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール(例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon))の1つを用いて、(GenBank(アクセッション番号P10844)またはSwissprot(アクセッション位置BXB_CLOBO)のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる)HN/Bアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。N末端にPstI制限配列を、そしてC末端にXbaI−停止コドン−HindIIIを付加し、正しい読み取り枠を維持する。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて)スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
(リンカー−PAR1−スペーサー挿入片の調製)
LC−HNリンカーを、リンカーについての既存配列情報を鋳型として用いて、第一の原則から設計し得る。例えば、タンパク質分解活性化が生じるLCとHNとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域として定義された血清型Bリンカー。この配列情報は、GenBank(アクセッション番号P10844)またはSwissprot(アクセッション位置BXB_CLOBO)のような利用可能なデータベースソースから自由に入手可能である。このリンカーに、エンテロキナーゼ部位、PAR1およびスペーサーを組み込み、そして種々の逆翻訳ソフトウェアツール(例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon))の1つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−PAR1−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号7)として配置させ得る。スペーサー、PAR1、および制限配列について正しい読み枠を維持し、そしてDAMメチル化を生じ得るので塩基TCがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このDNA配列を、組み込まれた制限配列についてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
LC−リンカー−PAR1−スペーサー−HN構築物(配列番号9)を作製するために、リンカー(配列番号7)をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したLC/BのDNA(配列番号3)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをPstIおよびXbaI制限酵素で切断し、そしてPstIおよびXbaIで切断したHN/BのDNA(配列番号4)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。最終構築物は、LC−リンカー−PAR1−スペーサー−HN ORF(配列番号9)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号10に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−PTH−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号8)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−PTH−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−PTH−スペーサー−HN ORF(配列番号11)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号12に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−RGD−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号13)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計する。次いで、LC/C−RGD−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−RGD−スペーサー−HN ORF(配列番号14)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号15に示される配列の融合タンパク質が発現される。得られた発現プラスミドであるpMAL LC/C−RGD−HN/Cを大腸菌BL21に形質転換して、組換えタンパク質を発現させる。
LC/C−RGD−HN/C融合タンパク質の発現を、以下のプロトコルを用いて行う。250mlフラスコ中の100mlの改変TB(0.2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含有する)にLC/C−RGD−HN/C発現株からの単一コロニーを接種する。この培養物を37℃にて225rpmで16時間増殖させる。2Lフラスコ中の1Lの改変TB(0.2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含有する)に10mlの終夜培養物を接種する。この培養物を37℃にて、OD600nmが約0.5に達するまで増殖させ、この時点で温度を16℃に下げる。1時間後、培養物を1mM IPTGで誘導し、そして16℃にてさらに16時間増殖させる。図1は、大腸菌における発現タンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
25ml 50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClおよび約10gの大腸菌BL21細胞ペーストを含むファルコン管を解凍する。この細胞ペーストを氷上にて、22ミクロンのパワーで30秒間オン、30秒間オフを10サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにする。溶解した細胞を18,000rpmで4℃にて30分間遠心分離する。この上清を、50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム(20〜30mlカラムが十分である)に流す。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClに対して4℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のODを測定する。100μg融合タンパク質当たり1単位の第Xa因子を添加し、そして25℃にて終夜静置インキュベートする。50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム(20〜30mlカラムが十分である)に流す。50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClでベースラインまでカラムを洗浄する。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClに対して4℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約2mg/mlに濃縮し、試料を小分けし、そして−20℃にて凍結する。OD、BCAおよび純度分析を用いて精製タンパク質を試験する。図2は、精製タンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−環状RGD−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号16)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−環状RGD−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−環状RGD−スペーサー−HN ORF(配列番号17)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号18に示される配列の融合タンパク質が発現される。得られた発現プラスミドであるpMAL LC/C−環状RGD−HN/Cを大腸菌BL21に形質転換して、組換えタンパク質を発現させた。融合タンパク質の発現は、実施例4に記載のように実施した。図1は、大腸菌において発現したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−THALWHT−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号19)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−THALWHT−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−THALWHT−スペーサー−HN ORF(配列番号20)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号21に示される配列の融合タンパク質が発現される。融合タンパク質の発現は、実施例4に記載のように実施した。図1は、大腸菌において発現したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−環状THALWHT−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号22)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−環状THALWHT−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−環状THALWHT−スペーサー−HN ORF(配列番号23)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号24に示される配列の融合タンパク質が発現される。融合タンパク質の発現は、実施例4に記載のように実施した。図1は、大腸菌において発現したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ANP−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号25)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−ANP−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−ANP−スペーサー−HN ORF(配列番号26)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号27に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−VIP−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号28)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−VIP−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−VIP−スペーサー−HN ORF(配列番号29)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号30に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC−HNリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ガストリン放出ペプチド−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号34)として配置されるC血清型リンカーを用いること以外は、実施例2に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、LC/C−ガストリン放出ペプチド−HN/C融合物を、実施例1に記載の方法を用いて作製したLC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を用いて組み立て、そして実施例2に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、LC−リンカー−ガストリン放出ペプチド−スペーサー−HN ORF(配列番号35)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号36に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC/C−RGD−HN/C融合タンパク質(実施例4に従って調製)のTM構成部分の機能性をリガンド結合アッセイによって評価する。リガンド結合の評価を容易にするために、RGD結合ペプチドをビオチン化形態および非ビオチン化形態で合成する。融合タンパク質の結合を、ビオチン化形態を用いる競合アッセイによって決定する。簡潔にいえば、NCI-H292細胞を96ウェルプレート中に播種して生存培養物を樹立する。細胞および溶液を4℃に予冷し、そして溶液を細胞供給培地+HEPES(50mM)中で調製する。処理前に、培地を細胞から取り除いて培地+HEPES(500μl/ウェル)と取り替え、次いでこれも取り除く。標識リガンド(所要濃度の2倍濃度)を全てのウェルに添加する(50μl/ウェル)。次いで、融合タンパク質(所要濃度の2倍濃度)をウェルに添加する(50μl/ウェル)。4℃にて1時間後、培地を取り除いて培地+HEPES(100μl/ウェル)と取り替える。この培地を取り除いて培地+HEPES(100μl/ウェル)と取り替える。細胞を、100μl/ウェルのPBS-Tween 0.1%に4℃にて5分間溶解する。PBS-Tweenを取り除いて細胞を培地+HEPES(100μl/ウェル)で洗浄する。この培地を取り除いて1ウェル当たり100μl PBS+100μlストレプトアビジン−HRPと取り替える。細胞を室温にて20分間インキュベートする。PBS+ストレプトアビジンを取り除いて細胞をPBS-Tweenで洗浄する。100μl/ウェルのTMBを添加して細胞を37℃にて10分間インキュベートする。50μl/ウェルの2M H2SO4を添加してプレートを450nmで読み取る。この方法を用いて、LC/C−RGD−HN/C融合タンパク質のTM構成部分が細胞表面に結合する能力を確認する。
図1−大腸菌におけるLC/C−RGD−HN/C、LC/C−環状RGD−HN/C、LC/C−THALWHT−HN/C、およびLC/C−環状THALWHT−HN/C融合タンパク質の発現。
レーン2、LC/C−RGD−HN/C;
レーン3、LC/C−環状THALWHT−HN/C;
レーン4、LC/C−環状RGD−HN/C。
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Claims (29)
- 単鎖ポリペプチド融合タンパク質であって:
(a)クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼであって、標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼ;
(b)該標的細胞上の結合部位に結合し得るターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ得る、ターゲティング部分;
(c)プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位;および
(d)トランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼをトランスロケートさせ得、
該トランスロケーションドメインが、クロストリジウム神経毒素のHNトランスロケーションドメインである、トランスロケーションドメインを含み、
該ターゲティング部分が、該プロテアーゼ切断部位と該トランスロケーションドメインとの間に位置しており、かつ、
該単鎖ポリペプチド融合タンパク質は、N末端からC末端へ[クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼ]―[プロテアーゼ切断部位]―[ターゲティング部分]―[トランスロケーションドメイン]の順に配置されている、
融合タンパク質。 - 前記ターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも10アミノ酸残基離れている、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも5アミノ酸残基離れている、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも0アミノ酸残基離れている、請求項1から3のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、標的細胞上の結合部位に結合し得るN末端側ドメインまたは内部ドメイン配列を有する、請求項1から4のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、多くとも50アミノ酸残基を含む、請求項1から5のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、多くとも40アミノ酸残基を含む、請求項1から6のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、多くとも30アミノ酸残基を含む、請求項1から7のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、多くとも20アミノ酸残基を含む、請求項1から8のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、プロテイナーゼ活性化レセプターリガンドを含む、請求項1から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記プロテイナーゼ活性化レセプターリガンドが、リガンドPAR1である、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、PTH-1に結合するリガンドを含む、請求項1から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記リガンドがPTHペプチドを含む、請求項12に記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、直鎖状または環状のインテグリン結合配列を含む、請求項1から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記インテグリン結合配列が、Arg-Gly-Asp(RGD)の三アミノ酸結合配列を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、粘液分泌細胞または粘液分泌を制御または指揮する神経細胞;内分泌細胞;炎症細胞;外分泌細胞;免疫細胞;心血管細胞;および骨細胞からなる群から選択される細胞に結合する、請求項1から15のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ターゲティング部分が、以下からなる群から選択されるリガンドを含む、請求項1から16のいずれかに記載の融合タンパク質:
TFLLR;PAR1;PTH;VIPまたは[R15,20,21,L17]-VIP、[R15,20,21,L17]-VIP-GRR、[A2,8,9,16,19,24]-VIPおよび[A2,8,9,16,19,24,25]-VIPからなる群から選択されるVIPアナログ;β2アデレノレセプターアゴニスト;ガストリン放出ペプチド(GRP);カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP);甲状腺刺激ホルモン(TSH);インスリン;インスリン様成長因子;TSH放出ホルモン(プロチレリン);FSH/LH放出ホルモン(ゴナドレリン);コルチコトロピン放出ホルモン(CRH);副腎皮質刺激ホルモン(ACTH);下垂体アデニルシクラーゼ活性化ペプチド;Fc IgEのC4ドメインに対するリガンド;C3a/C4a-R補体レセプターに対するリガンド;CR4補体レセプターに対して反応性である抗原;マクロファージ刺激因子;iC3b補体レセプターと会合する抗原;IL8;エプスタインバールウイルスフラグメント/表面特徴;トロンビン;トロンビンレセプターアゴニストペプチド(TRAP);GP1b表面抗原認識抗体;カルシトニン;破骨細胞分化因子TRANCE、RANKLまたはOPGL;THALWHT、LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)、LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)、CDSAFVTVDWGRSMSLC、SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP、FSLSKPP、HSMQLSTおよびSTQAMFQからなる群から選択される直鎖状または環状のペプチド;およびANP。 - 前記融合タンパク質が精製タグを含む、請求項1から17のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が精製タグを含み、該精製タグが該融合タンパク質のN末端および/またはC末端に存在する、請求項18に記載の融合タンパク質。
- 前記精製タグが、ペプチドスペーサー分子によって前記融合タンパク質に結合されている、請求項18または19に記載の融合タンパク質。
- 前記トランスロケーションドメインが、ペプチドスペーサー分子によって前記ターゲティング部分から離されている、請求項1から20のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 配列番号10、12、15、18、21、24、27、30、および33のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド融合タンパク質。
- 請求項1から22のいずれかに記載のポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸配列を含むDNA。
- 前記核酸配列が、配列番号1から9、11、14、17、20、23、26、29および32のいずれか1つに示される塩基配列を含む、請求項23に記載のDNA。
- プロモーター、請求項23または請求項24に記載のDNA、およびターミネーターを含むDNAベクターであって、該DNAが、該プロモーターの下流に位置し、そして該ターミネーターが、該DNA構築物の下流に位置している、ベクター。
- 請求項23または請求項24に記載のDNAの相補DNA鎖。
- 請求項1から22のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質を調製するための方法であって、請求項23または請求項24に記載のDNA、または請求項25に記載のDNAベクターを宿主細胞で発現させる工程を含む、方法。
- 非細胞傷害性薬剤を調製する方法であって、該方法が、
(a)請求項1から22のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、前記プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程;
(b)該プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程を含む、方法。 - 請求項28に記載の方法により得られ得る非細胞傷害性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが二本鎖ポリペプチドであり、そして
(a)第一鎖が前記クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼを含み、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼが標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得;
(b)第二鎖が前記ターゲティング部分および前記トランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼをトランスロケートさせ得;そして
該第一鎖および第二鎖がジスルフィド結合で一緒に連結されている、非細胞傷害性ポリペプチド。
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