PT1842429E - Mistura oleosa de ingredientes bioactivos naturais para a preparação de um produto alimentar enriquecido - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MISTURA OLEOSA DE INGREDIENTES BIOACTIVOS NATURAIS PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO ALIMENTAR ENRIQUECIDO"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao domínio dos alimentos e processos de produção de alimentos. Mais especificamente, refere-se a uma mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais que é adicionada s produtos alimentares, em especial a produtos à base de carne, para compensar efectivamente o desequilíbrio lipídico dos produtos alimentares derivados de animais terrestres e exercer efeitos benéficos na saúde humana, em especial na prevenção de doenças, sem afectar a qualidade ou segurança destes produtos alimentares.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Por muitos anos, os produtos alimentares de origem animal têm aparecido no mercado, principalmente produtos lácteos (embora também alguns produtos à base de carne) que incorporam ácidos gordos polinsaturados ómega-3 (ω-3) adicionando uma pequena percentagem de óleo de peixe. Os ácidos gordos ómega-3 não se encontram presentes na carne na sua forma natural e a incorporação destes em produtos alimentares de origem animal para alcançar vantagens para a saúde baseia-se em muitos anos de experiência científica.

Tradicionalmente, as gorduras animais são consideradas pouco saudáveis. Durante décadas a composição lipídica tem 2 sido associada à probabilidade de sofrer de doenças cardiovasculares. Efectivamente, recomenda-se que os indivíduos com risco cardiovascular restrinjam o leite gordo e produtos à base de carne nas respectivas dietas. Durante muitos anos, a pesquisa concentrou-se neste aspecto numa tentativa de estabelecer explicações científicas para estas ocorrências. As teorias sobre esta associação desenvolveram-se consideravelmente, em especial nos anos mais recentes. Durante muitos anos, a gordura animal tem sido considerada como a responsável pelo aumento dos níveis de colesterol sérico e foi estabelecida uma associação directa entre os níveis de colesterol e as doenças cardiovasculares. Mais recentemente, os triglicéridos e especialmente os níveis de triglicéridos no sangue e a duração destes níveis no sangue tem sido considerado como a origem do factor de risco cardiovascular.

Desde meados do século passado a pesquisa tem-se baseado no estabelecimento dos efeitos dos ácidos gordos polinsaturados, ou PUFAS, na redução dos níveis de colesterol sérico e na doença cardiovascular. Os trabalhos mais significativos nesta área foram os efectuados por Ahrens et al, 1954 (Ahrens E.H., D.H. Blankenhorn, T.T. Tastas (1954), "Effect on human serum lipids of substituting plant for animal far in the diet", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86, 872.) e Keys et al., 1957 (Keys A., J.T. Anderson, F. Grande (1957), "Serum cholesterol response to dietary fat", Lancet 1, 787) que estabeleceram dados evidentes da importância dos PUFA na prevenção das doenças cardiovasculares. Desde então que numerosos estudos se têm concentrado neste aspecto, tendo a maioria confirmado os efeitos benéficos do ω-3 para o coração. Por 3 exemplo, num ensaio clínico efectuado recentemente por investigadores do Cardiovascular Nutrition do Baker Medicai Research Institute of Melbourne, Departamento de Medicina do Medicai Defence College of Tokio, CSIRO da Division of Health Sciences and Nutrition of Adelaide (Austrália) e Vitamin Research de F Hoffmann-La Roche (Suiça) publicado no American Journal of Clinicai Nutrition (Am J Clin Nutr 76 (2002) 326-330) da American Society for Clinicai Nutrition, revelou que os ácidos gordos ω-3 e especialmente os de cadeia longa, por outras palavras, DHA (ácido docosa-hexanóico) e EPA (ácido eicosapentanóico) pode ajudar a manter a elasticidade arterial e consequentemente os níveis de pressão arterial normais e reduzir o risco cardiovascular. O estudo consistiu na administração de DHA ou EPA ou placebo a doentes com hipercolesterolemia durante sete semanas. Os investigadores mediram depois a elasticidade das artérias dos participantes com ultrassons. Os que receberam ácidos gordos ω-3 apresentaram uma redução significativa da esclerose arterial, enquanto os participantes que receberam o placebo não apresentaram alterações significativas. Os que receberam EPA apresentaram aumento da resistência sistémica arterial de 36%, reflectindo a elasticidade das principais artérias, enquanto os que tomaram DHA apresentaram um aumento de 27%.

Os ácidos gordos o-3 (EPA/DHA) melhoram o perfil lipídico do sangue uma vez que aumenta a elasticidade, reduz o colesterol LDL, aumenta o HDL, reduz os níveis arteriais de triglicéridos e são antitrombóticos. Adeemia (López-Huertas-E; Baro,-L; Carrero,-J-J; Fonolla,-J (2003) "n-3 fatty acids: health effects and opportunities to increase intake", Agro Food Industry hi tech. 2003; 14(3): 4 18-21; Dewailly,-E; Blanchet,-C; Gingras,-S; Lemieux,-S; Holub,-B-J (2002), "Cardiovascular disease risk factors and n-3 fatty acid status in the adult population of James Bay Cree", American-Journal-of-Clinical- Nutrition. 2002; 76 (1): 85-92).

Além dos efeitos cardiovasculares benéficos do ω-3, como mencionado no inicio do texto, estes ácidos gordos têm importantes efeitos na expressão de genes e outros processos bioquímicos do corpo. Uma das mais importantes funções de ω-3 consiste na formação de membranas celulares. A maioria dos tecidos encefálicos são ricos em ácidos gordos ω-3. Os conhecimentos actuais sobre os efeitos encontram-se resumidos num artigo da autoria de Donald B. Jump do Departamento de Fisiologia, Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade do Estado do Michigan, publicado no Journal of Biological Chemistry da American Society for Biochemistry and Molecular Biology (J. Biol. Chem 227 (2002) 8755-8758).

Actualmente sabe-se que os ácidos gordos polinsaturados (PUFA) ω-3 e ω-6 encontram-se envolvidos em importantes processos biológicos no corpo humano e que a proporção destes constitui o principal factor na prevenção de numerosas doenças crónicas (Simopoulos A.P. (2002), "The importance of the ratio omega-6/omega-3 essential fatty acids", Biomedicine and Pharmacotherapy 56, 365), incluindo o cancro (Nkondjock A., B. Shatenstein, P. Maisonneuve, P. Ghadirian (2003), "Specific fatty acids and human colorectal câncer: an overview", Câncer Detection and Prevention 27, 55) . Uma proporção recomendada situa-se próximo de 1 (Simopoulos A.P. (1999), "Evolutionary aspects of omega-3 fatty acids in the food supli Prostaglandins, 5

Leucotrienes and Essential Fatty Acids", 60, 421) . A proporção de ω-β/ω-3 na carne de porco é, em média, superior a 10 e na gordura de porco é ainda superior. Em ambos os casos, por conseguinte, é muito superior ao recomendado.

Uma pesquisa interessante executada por A.P. Simopoulos [Biomedicine & Pharmacotherapy 56 (2002) 365-379] descreveu os benefícios de diferentes proporções de ω-6/ω-3. De acordo com este trabalho: ω-6/ω-3 = 5 tem efeitos benéficos na asma. ω-6/ω-3 = 4 tem efeitos comprovados na redução do risco cardiovascular. ω-6/ω-3 = entre 2 e 3 previne o cancro do cólon e artrite reumatóide.

Quanto menor a proporção de ω-6/ω-3, melhor o efeito preventivo contra o cancro da mama.

Uma proporção ω-6/ω-3 superior a 10 começa a ter efeitos negativos.

Para que os efeitos negativos de ω-6 sejam compensados efectivamente com a adição de ω-3, os compostos com actividade antioxidante devem ser simultaneamente adicionados [B. Demmig-Adams y W.W. Adams, III. [Science 298 (2002) 2149-2153] .

As propriedades antioxidantes das especiarias são conhecidas desde o início da década de cinquenta do século passado (Chipault J.R., Muzumo G.R., Hawkins J.M., Lundberg W.O. (1952), "The antioxidant properties of natural spices", Food Res. 17, 46). Em 1955 descobriu-se pela primeira vez que o rosmaninho era uma das ervas com maior 6 actividade antioxidante (Rac M., Ostric-Matijasevic B. (1955), "The properties of rosemary as an antioxidant", Rev. Fr. Corps Gras 2, 796). Os compostos responsáveis por este facto foram identificados. Em 1966, isolou-se a carnosol (Briescorn C.H., Fuchs A., Bredenberg J.B., McChesney J.D., Wenkert E. (1966), "The structure of carnosol", J. Org. Chem. 29, 2293) e as propriedades antioxidantes da planta foram atribuídas a este diterpeno fenólico. A estrutura deste e a do ácido carnósico foram confirmadas em 1982(Wu J.W., Lee M.H., Ho C.T., Chan S.S. (1982), "Elucidation of the Chemical structures of natural antioxidants isolated from Rosemary", JAOCS 59, 339) e no mesmo ano o rosmanol e ácido rosmarínico foram identificados (Inatani R., Nakatani N., Fuwa H., Seto H. (1982), "Structure of a new antioxidative phenolic diterpene isolated from Rosemary", Agric. Biol. Chem. 46, 1666). Depois foram identificados o rosmadial (Inatani R., Nakatani N., Fuwa H. (1983), "Antioxidative effect of the constituents of Rosemary and their derivatives", Agric. Biol. Chem. 47, 521), o epirosmanol e isorosmanol (Nakatani N., Inatani R. (1984), "Two antioxidative diterpenes from Rosemary and a revised structure for rosmanol", Agric. Biol. Chem. 48, 2081) rosmaridiphenol and rosmariquinone (Houlihan C.M., Ho C.T., Chang S.S. (1985), "The structure of rosmariquinone. A new antioxidant isolated from Rosmarinus officinalis L.", JAOCS 62, 1985). Além destes compostos sabe-se que as folhas de rosmaninho contêm ainda flavonóides com actividade antioxidante (Okamura N., Haraguchi H., Hashimoto K., Yagi A. (1994), "Flavonoids in Rosmarinus officinalis leaves", Phytochem. 37, 1463) . 7

Em termos gerais e considerando individualmente estes compostos, constatou-se que o ácido carnosinico é o que possui a maior actividade antioxidante, seguido do carnosol, ácido rosmarínico, rosmanol e rosmadial (Cuvelier M.E., Richard H., Berset C. (1996), "Antioxidative activity and phenolic composition of pilot-plant and commercial extracts of sage and rosemary", JAOCS 73, 645). 0 Carnosol é normalmente o composto em maioria, correspondendo frequentemente até 90% destes extractos. Na realidade é produzido em conjunto com outros compostos fenólicos no rosmaninho a partir da oxidação do ácido carnosinico durante operações de extracção.

Os diterpenos fenólicos do rosmaninho actuam como antioxidantes primários (Basaga H., Tekkaya C., Acikel F. (1997), "Antioxidative and free radical scavenging properties of rosemary extract", Lebensm. Wiss. Technol. 30, 105; Frankel E.N., Shu W.H., Aeschbatch R., Prior E. (1996), "Antioxidant activity of a rosemary extract and its constituents carnosic acid, carnosol, and rosmarinic acid in bulk oil and oil-in-water emulsion", J. Agric. Food Chem. 44, 131; y Haraguchi H., Saito T., Okamura N., Yagi A. (1995), "Inhibition of lipid peroxidation and superoxide generation by diterpenoids from Rosemary officinalis", Planta Medica 61, 333). Demonstrou-se também que estes produtos possuem actividade idêntica à superóxido dismutase (Seok J.K., Daeseok H., Kwang D.M., Joon S.R. (1995), "Measurement of superoxide dismutase-like activity of natural antioxidants", Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 822) e efeito sinergético com a enzima glutationa reductase e NADPH-quinona reductaase, regenerando-as e aumentando o efeito de bloqueio de radicais livres que possuem. Estas 8 sinergias com as enzimas mencionadas têm sido atribuídas aos efeitos protectores contra agentes cancerígenos no pulmão, fígado e estômago demonstrados nos anos recentes em ratinhos (Singletary K.W., Rokusek J.T. (1997), "Tissue specific enhancement of xenobiotic detoxification enzymes in mice by dietary rosemary extract", Plant Foods for Human Nutrition 50, 47; Offord, E.A., K. Mace, O. Avanti, A.M.A. Pfeifer (1997), "Mechanisms involved in the chemoprotective effects of rosemary extract studied in human liver and bronchial cells", Câncer Letters 114, 275). O mecanismo de acção dos antioxidantes contra a peroxidação das lipoproteínas do sangue é também conhecido e constitui um factor principal no desenvolvimento da arteriosclerose (Pinchuk I., D. Lichtenberg (2002), "The mechanism of action of antioxidants against lipoprotein peroxidation, evaluation based on kinetic experiments", Progress in Lipid Research 41, 279). O rosmaninho é um ingrediente muito comum na cozinha. No entanto, devido ao seu aroma intenso e textura não pode ser adicionado a produtos de carne em quantidades suficientes para ter o efeito desejado. É esta a razão para utilizar extratos. A extracção supercrítica é uma boa alternativa à extracção com solventes para obter os antioxidantes. Existem vários processos de extracção de aromas e pigmentos naturais, lúpulo e oleorresinas de diferentes plantas. A extracção em condições não-extremas e não-oxidantes pode produzir produtos de grande qualidade com propriedades naturais intactas, isentos de resíduos de solventes. 9 0 caso das oleorresinas é notável e estas podem geralmente ser fraccionadas no mesmo processo de extracção supercrítica, gerando produtos com diferentes funções. Foram efectuadas várias aplicações com extracções de plantas labiadas (rosmaninho, tomilho, orégãos, sálvia, etc) (Nguyen U., Evans D.D., Frakman G. (1994), "Natural antioxidants produced by supercritical fluid extraction", In "Supercritical Fluid Processing of Foods and Biomaterials", Ed. S.S.H. Rizvi. Chapman & Hall, Londres, p.103). Nestes casos, a extracção com fluidos supercriticos ou SFE (Supercritical Fluid Extraction - Extracção com Fluido Supercritico), é obtida uma oleorresina que é facilmente fraccionável em dois produtos: Um óleo essencial, geralmente com propriedades aromáticas e antimicrobianas e um antioxidante.

Actualmente, sabe-se que os antioxidantes naturais obtidos com SFE possuem maior actividade do que os extraídos com solventes. Djarmati e colaboradores (Djarmati Z., Jankov R.M., Schwirtlich E., Djulinac B., Djordjevic A. (1991), "High antioxidant activity of extracts obtained from sage by supercritical C02 extraction", JAOCS 68, 731) revelaram que os extractos antioxidantes da sálvia obtidos por extracção supercrítica com CO2 supercritico foram mais eficazes que BHT. Mais recentemente, descobriu- •se que ocorre 0 mesmo com extractos de pimenta preta. (Tipsrisukond N., Fernando L.N., Clarke A.D. (1998), "Antioxidant Effects of Essential Oil and Oleoresin of

Black Pepper from Supercritical. Carbon Dioxide Extractions in Ground Pork", J. Agric. Food Chem. 46, 4329).

Os conteúdos fitoquímicos em extracto antioxidante de rosmaninho possuem importantes actividades biológicas. 0 10 efeito destes nos ácidos gordos insaturados é especialmente interessante.

De modo idêntico, no estado da técnica, são conhecidas propriedades benéficas para a microalga Dunaliella salina, uma alga unicelular que pertence ao género das microalgas verdes (clorofitos). Esta microalga foi a primeira a ser utilizada comercialmente para produzir produtos químicos finos dado que a sua elevada salinidade simplifica em muito a manutenção em cultura sem perigo de contaminação externa por patogénios (Borowitzka L.J., Moulton T.P., Borowitzka M.A. (1985), "Salinity and the commercial production of beta-carotene from Dunaliella salina", In: Barclay W.J., Mclntosh R., eds. Algas Biomass: and Interdisciplinary Perspective. J. Cramer Verlag, Verduz). Actualmente, a Dunaliella salina é consumida como suplemento alimentar rico em betacaroteno (Mokady S., Abramovici A., Cogan U. (1989), "The safety evaluation of Dunaliella bardawil as a potential food supplement", Food Chem. Toxicol. 27, 221;

Tanaka Y. (1990), "Process for production of encapsulated foodstuff containing Dunaliella algae", patente norte-americana US 4,915,965 e patente japonesa JP 88-40755; Leach G., Oliveira G., Morais R. (1998), "Spray-drying of Dunaliella salina to produce a beta-carotene rich powder", J. Ind. Microb. Biotechnol. 20, 82; Orset S., Leach G.C., Morais R., Young A.J. (1999), "Spray-drying of the microalga Dunaliella salina: Effects on beta-carotene content and isomer composition", J. Agric. Food Chem. 47, 4782). A Austrália produz mais de 80% do beta-caroteno que é consumido mundialmente, todo a partir de culturas de Dunaliella salina. O beta-caroteno encontra-se nesta microalga em concentrações até 14% em peso do respectivo 11 peso seco, tornando esta a alga com mais elevado teor deste composto, cuja acumulação depende das condições de cultura (salinidade, temperatura, intensidade luminosa). Estudos recentes atingiram o isolamento e purificação de diferentes isómeros de beta-caroteno, tal como 9-cis (Yamano Y., Yoshizawa M., Ito M. (1999), "Isolation of 9Z beta-carotene from Dunaliella bardawil and its stereoselective synthesis", J. Nutr. Sei. Vitamin. 45, 49) e estabeleceram a actividade antioxidante deste em comparação com o beta-caroteno sintético (principalmente da composição "trans integral"). Outros compostos presentes nesta microalga com propriedades funcionais são os tocoferóis (que são normalmente quantificados como alfa-tocoferol dado que a composição isomérica destes é desconhecida), ácidos gordos poliisaturados (PUFA) (Franke H., Springer M., Pulz O., Tietz U., Mueller U. (1994), "Polyunsaturated fatty acids from microalgae", Int. Food Ingr. 4,41), esteróis (tal como o ergosterol) e vitaminas hidrossolúveis (tal como a tiamina, piridoxina, biotina, riboflavina, etc.). A presença de flavonóides ou compostos fenólicos não foi descrita nesta alga. No entanto, seria de esperar a presença destes compostos dado que foram detectados em espécies de microalgas semelhantes (Rauha, JP; Remes, S; Heinonen, M; Hopia, A; Kahkonen, M; Kujala, T; Pihlaja, K; Vuorela, H; Vuorela, P. (2000), "Antimicrobial effects of Finnish plant extraets containing flavonoids and other phenolic compounds", Int. J. Food Microbiol. 56, p. 3-12).

Relativamente ao efeito dos carotenóides diferentes dos descritos anteriormente, muito recentemente ficaram demonstrados os efeitos dos carotenóides, tal como a luteína na prevenção da degeneração macular senil. Estes 12 efeitos são mais evidentes quando estes carotenóides são combinados com outros antioxidantes não-carotenóides (Beatty S et al. Surv. Opthalmol 2000; 45:115-134; Cait et al. Prog Retin Eye Res 2000; 10:205-211), (Junqueira VB et al. Mol Aspects Med 2004;25:5-16) (Koh HH et al. Experimental Eye Research 2004; 79:21-27; Beatty S et al. Arch Biochem Biophys 2004;430:70-76).

Finalmente, no actual estado da técnica, o alfa-tocoferol é conhecido pelos seus efeitos benéficos como antioxidante, tanto de uma perspectiva alimentar como no corpo.

Os autores da presente invenção descobriram que a combinação do óleo de salmão enriquecido com ácidos polinsaturados ω-3 de cadeia longa, tais como EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto de rosmaninho supercritico, adicionado a um produto alimentar resulta numa reacção sinergética inesperada entre os antioxidantes e ácidos gordos polinsaturados. Esta reacção traduz-se num aumento muito maior da actividade antioxidante do que o previsto. Este facto ajuda também a manter os níveis de substâncias bioactivas durante a produção, armazenamento e cozinhar dos produtos alimentares enriquecidos, com os subsequentes efeitos benéficos para a saúde humana ou respectivo consumo.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição oleosa sinergética à base de óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto de rosmaninho supercritico para utilização na preparação de um produto alimentar enriquecido. Esta composição pode também compreender a microalga Dunaliella salina que contém também 13 componentes benéficos para a saúde, tal como os carotenóides luteína ou beta-caroteno, por exemplo.

De modo semelhante, a invenção proporciona também produtos alimentares enriquecidos com esta mistura oleosa numa proporção de ácidos gordos polinsaturados ω-3 para ω-6 inferior a 5, benéficos na prevenção de doenças tal como a asma, o cancro ou várias doenças cardiovasculares. Esta proporção mantém-se também durante a produção, armazenamento e cozinhar do produto alimentar devido à acção sinergética entre estes ácidos gordos polinsaturados e alfa-tocoferol e os diterpenos fenólicos do extracto supercritico de rosmaninho. Estes produtos alimentares enriquecidos conservam as caracteristicas de qualidade relativamente às propriedades sensoriais e ainda segurança.

Por conseguinte, este produto enriquecido apresentado pela invenção é benéfico para a saúde humana devido aos seus niveis estáveis em ácidos gordos polinsaturados com uma proporção de ω-3 para ω-6 inferior a 5 e os seus conteúdos estáveis em alfa-tocoferol, diterpenos fenólicos derivados de extracto supercritico de rosmaninho e, opcionalmente, carotenóides derivados da microalga Dunaliella salina.

OBJECTO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, 0 objectivo da presente invenção consiste em apresentas uma mistura oleosa sinergética à base de ingredientes bioactivos naturais, destinada à preparação de um produto alimentar enriquecido que inclui salmão enriquecido com EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto de rosmaninho supercritico. 14 A invenção apresenta também um produto alimentar enriquecido com esta mistura oleosa à base de ingredientes naturais bioactivos.

Finalmente, outro objecto da presente invenção consiste em apresentar um método de preparação deste produto alimentar enriquecido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta uma mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais, destinada à preparação de um produto alimentar enriquecido, caracterizado por incluir óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto de rosmaninho supercritico.

No contexto do presente pedido de patente, o termo "produto alimentar enriquecido" refere-se a um produto alimentar, cuja composição foi adicionada com substâncias que não contém naturalmente ou que contém em baixas concentrações.

De modo idêntico, o termo "ingredientes bioactivos naturais" refere-se a compostos de origem natural, com actividades biológicas benéficas para a saúde, de acordo com o estado actual da técnica do conhecimento cientifico.

Como anteriormente mencionado, o óleo de salmão enriquecido em EPA (ácido eicosapentanóico) e DHA (ácido docosa-hexanóico) proporciona ácidos gordos polinsaturados ómega-3. Estes são ingredientes funcionais bem conhecidos na indústria alimentar, portanto o uso destes apresenta um risco muito baixo. A incorporação de ácidos gordos ω-3 pode compensar o perfil lipidico desfavorável da gordura dos animais terrestres, especialmente no caso dos porcos dado 15 que o consumo de porco pode resultar no aumento dos ácidos gordos ω-6. A intervenção destes ácidos gordos ω-6 nos desequilíbrios redox a nível celular pode conduzir a um aumento da proliferação celular, tal como ocorre no cancro, até ao desencadear de processos inflamatórios, tal como ocorrem em doenças cardiovasculares, autoimunes e neurológicas e a deficiências em termos de neurotransmissão, provocando perturbações neurológicas. De modo idêntico, o desequilíbrio redox celular afecta a expressão genética em reguladores de processos vitais e a geração de danos no ADN que produz mutações em genes fundamentais.

Assim, a adição de óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA a produtos alimentares de animais terrestres para enriquecimento destes ajuda a compensar o desequilíbrio ω-6/ω-3 natural, dado que, por exemplo a proporção ω-6/ω-3 na gordura animal dos animais terrestres, tal como o porco e o peru é, em média, superior a 10 (embora a carne de peru apresente apenas 1% de teor de gordura comparativamente com o teor de gordura de 40% do porco). Na gordura do porco, a proporção ω-6/ω-3 é ainda maior e esta proporção na carne destes animais é muito superior ao recomendado.

No entanto, dado que o consumo de ácidos gordos ω-3 pode aumentar a tensão oxidativa, a adição destes ácidos gordos a produtos alimentares deve ser combinada com a adição simultânea de antioxidantes, tais como o extracto de rosmaninho supercrítico ou o alfa-tocoferol. Estes antioxidantes, como anteriormente mencionado, são conhecidos no estado da técnica, muito embora, até à actualidade, se desconhecesse a importante acção 16 sinergética destes quando combinados com óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA. O extracto de rosmaninho supercritico, para além de ajudar a reduzir a tensão oxidativa provocada pelos ácidos gordos insaturados, tem efeitos protectores potenciais contra doenças muito graves, sendo ainda um excelente conservante alimentar natural. Para os fins previstos da presente invenção, um extracto de rosmaninho supercritico vendido pela Flavex (Áustria) pode ser utilizado, por exemplo, ou um preparado por meio de extracção com CO2 supercritico a pressões que oscilam entre os 150 e 250 bar e temperaturas entre os 40 e 70 °C.

Por outro lado, o alfa-tocoferol apresenta importantes benefícios como antioxidante, como anteriormente mencionado. Para os fins previstos da invenção, pode ser empregue o alfa-tocoferol vendido pela Roche, por exemplo. A interacção sinergética dos ácidos gordos polinsaturados de óleo de salmão enriquecido, o alfa-tocoferol e o extracto de rosmaninho supercritico podem alcançar uma proporção ω-6/ω-3 inferior a 5 e mantê-la durante a produção, armazenamento e cozinhar do produto alimentar ao qual se adicionou a mistura oleosa. Esta acção sinergética tem como resultado manter a actividade antioxidante do alfa-tocoferol e do extracto de rosmaninho supercritico e manter o conteúdo em alfa-tocoferol e o conteúdo em diterpenos fenólicos do extracto de rosmaninho supercritico no produto alimentar ao qual a mistura oleosa da invenção é adicionado.

Numa forma de realização da invenção específica, a mistura oleosa contém: 17 70-99, 9% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-1 % de alfa-tocoferol e 0,1-5% de extracto de rosmaninho supercrítico, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Numa forma de realização preferida, a mistura oleosa contém: 80-97% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-0,1% de alfa-tocoferol e 1-3% de extracto de rosmaninho supercrítico, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Numa forma de realização mais preferida, a mistura oleosa contém: 82% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,08% de alfa-tocoferol e 1,6% de extracto de rosmaninho supercrítico, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Noutra forma de realização da invenção específica, a mistura oleosa contém também a microalga Dunaliella salina. A microalga, como anteriormente mencionado, é um dos mais utilizados produtos alimentares, por conseguinte a sua toxicidade está bem estudada e o uso desta não representa 18 risco para a saúde. A microalga Dunaliella salina possui um teor em carotenóide significativo, o qual pode aumentar a acçâo antioxidante do alfa-tocoferol e do extracto de rosmaninho supercrítico e que possui também uma acção preventiva contra determinadas doenças, como algumas das que afectam os olhos. Devido à acção sinergética entre o alfa-tocoferol e o extracto de rosmaninho supercrítico, este conteúdo carotenóide pode ser mantido no produto alimentar ao qual a mistura oleosa da invenção foi adicionada. 0 objecto da invenção pode ser preparado, por exemplo, com a microalga Dunaliella salina, comerciada pela Nature Beta Technologies (NBT) Ltd. (Israel).

Numa forma de realização preferida da invenção, a mistura oleosa compreende 0,1-20%, de preferência 3-18% e ainda mais preferencialmente 16% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores a percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Noutro aspecto, a invenção apresenta um produto alimentar enriquecido com uma mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais que contêm óleo de salmão enriquecido em EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto supercrítico de rosmaninho, como anteriormente descrito.

Numa forma de realização específica, este produto alimentar ]e enriquecido com uma mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais que contêm óleo de salmão enriquecido em EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto supercrítico de rosmaninho, bem como a microalga Dunaliella salina. 19

Numa forma de realização preferida este produto alimentar contém: 0,1-20% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,00001-1 % de alfa-tocoferol, 0,001-5% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 0,01-5% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total do produto alimentar.

Numa forma de realização mais preferida este produto alimentar enriquecido contém: 1-10% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-0,5% de alfa-tocoferol, 0,01-3% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 0,1-3% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total do produto alimentar.

De modo idêntico, numa forma de realização ainda mais preferida este produto alimentar enriquecido contém: 5% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,005% de alfa-tocoferol, 0,0010,1 % de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 20 1 % da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total do produto alimentar. O óleo de salmão é enriquecido com EPA e DHA numa proporção entre 10 e 40% em peso, relativamente ao peso total do óleo. Numa forma de realização preferida, o óleo de salmão é enriquecido com 18% de EPA e 12% de DHA em peso relativamente ao peso total do óleo.

Para os fins da presente invenção, o óleo de salmão pode ser enriquecido com 18% de EPA e 12% de DHA, comercializados pela Productos Químicos de Murcia S.A., por exemplo. O produto alimentar enriquecido da invenção possui um teor de ácidos gordos polinsaturados com uma proporção de ácidos gordos polinsaturados ω-6/ω-3 inferior a 5, o que possui importantes vantagens para a saúde humana, como anteriormente exposto. Esta proporção, graças à interacção sinergética dos ácidos gordos ω-3, alfa-tocoferol e extracto de rosmaninho supercrítico, é mantida durante toda a produção, armazenamento e posterior cozinhar dos produtos alimentares enriquecidos desta forma.

Numa forma de realização específica, o produto alimentar enriquecido da invenção é um produto derivado da carne. De preferência, o produto alimentar enriquecido da invenção é um produto derivado da carne, seleccionado do grupo constituído por salsichas tipo frankfurter, fiambre cozido, peito de peru cozinhado, chouriço curado, salsichão curado, lombo de porco curado e fiambre curado. 21

Noutro aspecto, a invenção corresponde a um método de preparação deste produto alimentar enriquecido, compreendendo as seguintes fases: a) preparação de uma mistura oleosa de ingredientes naturais bioactivos por meio de mistura destes ingredientes bioactivos naturais e b) Incorporação da mistura oleosa preparada em a) no produto alimentar que se deseja enriquecer.

Numa forma de realização especifica deste método, os ingredientes bioactivos naturais são combinados numa proporção de: 70-99, 9% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-1% de alfa-tocoferol, 0,1-5% de extracto de rosmaninho supercritico e opcionalmente 0,1-20% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Numa forma de realização especifica do método da invenção, os ingredientes bioactivos naturais são combinados numa proporção de: 80-97% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-0,1% de alfa-tocoferol, 1-3% de extracto de rosmaninho supercritico e opcionalmente 22 3-18% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Numa forma de realização preferível do método da invenção, os ingredientes bioactivos naturais são combinados numa proporção de: 82% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,08% de alfa-tocoferol, 1,6% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 16% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

Assim, para preparar os produtos alimentares enriquecidos da invenção, pesam-se quantidades adequadas de cada um dos ingredientes funcionais e depois misturam-se para se obter um produto oleoso e ligeiramente colorido.

Caso o produto alimentar que se pretende enriquecer corresponda a um produto derivado da carne, tal como salsichas frankfurter, a mistura oleosa dos ingredientes bioactivos é adicionada durante o processo de mistura e a produção da emulsão à base de carne. A emulsão à base de carne é depois utilizada para encher a tripa para enchidos, as salsichas são cozinhadas, embaladas a vácuo e refrigeradas durante um período máximo de 30 a 90 dias.

No caso de fiambre enriquecido, a mistura oleosa de ingredientes bioactivos é injectada nas peças de fiambre 23 cruas em conjunto com a salmoura. Depois, as peças são colocadas num tambor de massagem para ajudar a misturar os compostos bioactivos de forma a que se misturem internamente na carne de forma uniforme. Estas peças são então cozinhadas, embaladas a vácuo e mantidas sob refrigeração por um periodo máximo entre 30 e 90 dias.

Para preparar peito de peru cozinhado enriquecido, a mistura oleosa de ingredientes bioactivos é injectada nas peças de peito de peru cruas em conjunto com a salmoura. Depois, as peças são colocadas num tambor de massagem para ajudar a misturar os compostos bioactivos de forma a que se misturem internamente na carne de forma uniforme. Em seguida, estas peças são então cozinhadas e embaladas a vácuo e armazenadas sob refrigeração por um periodo máximo entre 30 e 90 dias.

Para preparar lombo de porco enriquecido, a mistura oleosa de ingredientes bioactivos é injectada nas peças de lombo de porco cruas. Em seguida os invólucros são cheios com a carne e curados.

Para preparar fiambre curado enriquecido, a mistura oleosa de ingredientes bioactivos é espalhada sobre a superfície das peças de fiambre cruas em conjunto com o sal. As peças são depois ligeiramente prensadas e curadas.

Para preparar chouriço curado enriquecido, a mistura oleosa de ingredientes bioactivos é combinada com a carne picada e especiarias. Em seguida são preparadas salsichas com a mistura e estas são curadas.

Para preparar salsichão curado enriquecido, a mistura oleosa de ingredientes bioactivos é combinada com a carne 24 picada e as especiarias. Depois são preparadas salsichas com a mistura e estas são curadas.

Assim, resumidamente, devido à adição da mistura oleosa sinergética da invenção, o produto alimentar enriquecido possui as seguintes vantagens: 1. Possui uma proporção ω-6/ω-3 inferior a 5 e este perfil de ácido gordo é mantido ao longo dos processos de fabrico, durante o prazo de validade e ainda durante os processos de cozedura destes produtos, tal como a fritura. 2. Não constitui um aumento significativo do indice de oxidação devido à incorporação de PUFE, mantendo-se este quase inalterado durante a produção, armazenamento e cozedura. 3. Não constitui uma diminuição significativa da actividade antioxidante dos produtos antioxidantes adicionados durante a produção, armazenamento e cozedura. 4. Não constitui alterações significativas no teor de alfa-tocoferol durante a sua produção, armazenamento e cozedura. 5. Não constitui alterações significativas no teor de diterpenos fenólicos proporcionados pelo extracto de rosmaninho supercritico durante a sua produção, armazenamento e cozedura. 6. Não constitui alterações significativas no teor de carotenóides proporcionados pela microalga Dunaliella salina durante a sua produção, armazenamento e cozedura.

Seguem-se dois exemplos de produtos alimentares enriquecidos que englobam todas as operações de processamento de produtos derivados da carne: 25 • Exemplo 1. Salsichas tipo frankfurt, demonstrando como obter e conservar as propriedades descritas num processo que inclui a cozedura e armazenamento durante 60 dias em refrigeração e sob vácuo e posterior fritura. • Exemplo 2. Chouriço ibérico curado, demonstrando como obter e conservar as propriedades descritas num processo com 50 dias de cura.

Estes exemplos são apresentados para ajudar a compreensão da invenção. O âmbito da invenção não fica limitado de forma alguma por estes exemplos.

MÉTODOS 1. Perfil em ácidos gordos

Extracção: Foram avaliados diferentes métodos de extracção da fracção lipidica presente nas amostras: a) hexano, b) hexano/metanol e c) hexano/água (5/1) . Os métodos a) e b) produziram interfases que dificultaram a separação da fase hexano. O método c) foi o único que permitiu a separação corercta da fase hexano pelo que foi eleito para as restantes extracções.

Protocolo de extracção de lipidos: 5 gramas de amostra foram previamente moídos para homogeneizar a amostra. Depois, colocou-se 1 g de cada amostra num frasco falcon de 50 ml e adicionaram-se 5 ml de milli-Q H2O, seguido de 25 ml de hexano. A amostra foi agitada vigorosamente com um Ultra Turrax durante 1 minuto e o sobrenadante foi recolhido. Nalguns casos, foi necessária uma fase de centrifugação para separar completamente a fase aquosa e a fase hexano. Esta centrifugação foi efectuada a 3800 rpm durante 5 minutos. Para assegurar que a maior parte da 26 gordura na foi extraída, procedeu-se a uma segunda extracção com 25 ml de hexano. Em cada extracto o hexano foi evaporado até atingir um peso constante num rota-vapor a 40° C e o resíduo obtido foi mantido num frasco sob atmosfera de azoto, protegido da luz solar.

Protocolo de derivatização do extracto: Foram preparadas soluções com concentrações de 25 mg/ml (para amostras sem o óleo de salmão) e 50 mg/ml (para amostras com o óleo de salmão) dos extractos em clorofórmio/metanol 2/1 (v/v). Metilou-se um total de 0,5 ml destas soluções com NaOH em metanol (0,1 M) a 60° C durante 30 min. De seguida, parou-se a derivatização adicionando 0,2 ml de água mQ. Depois, extraiu-se por duas vezes com 1 ml de hexano o éster metílico de ácidos gordos formado. Para remover a água residual da fase hexano, as fracções foram secas com sulfato de sódio anidro. Método de cromatografia para a análise lipídica_ Foram realizadas análises num cromatógrafo autosystem XL da Perkin-Elmer, com uma coluna BTR-Carbowax com as seguintes dimensões: L = 30 m; I.D.: 250 pm; espessante de fase: 0,25 pm. O método de cromatografia utilizado foi o seguinte:

Temperatura do injector: 220 °C

Programa da temperatura da fornalha: 100 °C---180 °C (a 20 °C/min) - 220 °C (a 15 °C/min) (33 min)

Temperatura do detector FID: 230 °C

Tempo de análise total: 40 min.

Pressão He: 4 bar (4.105 Pa)

Pressão de ar sintética: 4 bar (4.105 Pa) 27

Pressão de hidrogénio: 2 bar (2.105 Pa)

Pressão na cabeça da coluna: 12 bar (12.105 Pa)

Fluxo He: 1 ml/min.

Razão de separação: 20: 1

Volume de injecção: 1 μΐ

Os tempos de retenção dos diferentes ésteres metilicos do ácidos gordos foram determinados por meio de injecção de uma solução de 20 mg/ml (em hexano) de PUFA N°1 Marine Source, Supelco (4-7033). 2. índice de oxidação

Este método baseia-se na quantificação do malondialdeído (MDA) produzido como composto final da oxidação dos lipidos. Para medir este composto, este foi extraído da amostra com ácido tricloroacético e depois foi quantificado por reacção colorimétrica com ácido tiobarbitúrico, resultando na formação de um aducto de cor rosa, com um pico máximo de absorvância a 531 nm. Para o método de quantificação: Recolheram-se 10 g da amostra (± 0.005 g) e registou-se o peso, adicionaram-se 20 ml de ácido tricloroacético a 10% e a amostra foi homogeneizada durante 30 segundos a 20000 rpm. Depois, esta foi centrifugada durante 30 minutos a 4000 rpm e 10° C. Após a centrifugação, a amostra foi filtrada e foram recolhidos 2 ml do sobrenadante num tubo de ensaio. A estes 2 ml do sobrenadante adicionaram-se 2 ml de uma solução de ácido tiobarbitúrico (TBA, 300 mg/100 ml), a solução foi misturada num vortex, coberta com folha de prata e colocada durante 20 minutos em banho de água com água em ebulição. Foi depois deixada arrefecer até à temperatura ambiente e 28 mediu-se a cor formada a 531 nm. Para medir a cor da própria amostra, foram realizados numa amostra em branco os mesmos exames anteriormente executados nas amostras, substituindo 2 ml de TBA por 2 ml de água. 3. Actividade antioxidante A extracção dos compostos adicionados foi efectuada mediante adição de etanol (20 ml de etanol por 10 g de amostra) e o filtrado obtido depois da centrifugação foi levado à secura. O resíduo seco obtido em cada caso foi dissolvido em etanol a uma concentração de 15 mg/ml. Um total de 0,1 ml desta solução foi utilizado para estimar a capacidade antioxidante dos diferentes compostos pelo teste de branqueamento do β-caroteno, que produziu uma concentração do composto do estudo no meio de reacção de 60 pg/ml. O teste do branqueamento do β-caroteno estima a capacidade de uma substância com um potencial efeito antioxidante para inibir a oxidação do β-caroteno quando este se encontra numa emulsão com o ácido linoleico em condições pró-oxidantes. 4. Análise dos tocoferóis

Preparação das amostras

Para quantificar o teor de tocoferol do óleo de salmão adicionado às misturas, injectaram-se 20 μΐ de óleo directamente em HPLC. De cada amostra, recolheram-se 10 g e misturou-se com 20 ml de etanol. Esta foi homogeneizada em ultraturrax durante 1 minuto e centrifugado. O sobrenadante foi passado por um filtro e concentrado à secura num rotavapor. 29

Depois adicionou-se 2 ml de etanol. Os concentrados foram passados através de um filtro e injectados em HPLC para análise em coluna de fase inversa (Nova-Pak C18 60A 4 pm 3,9 x 150 mm, Waters) e foram desenvolvidos a um fluxo de 1 ml/min segundo um método isocrático de uma mistura de 97% de metanol em 1 % de ácido acético (v/v) durante 20 min. Os picos foram detectados com um detector de fotodíodo para identificar picos por tempo de retenção e o respectivo espectro em relação aos padrões mencionados e foram quantificados a um comprimento de onda máximo para a maioria dos compostos (295 nm).

Para quantificar as áreas detectadas, foram desenvolvidas curvas de calibração utilizando padrões de tocoferol para quantificar os picos correspondentes às amostras.5. Antioxidantes de extracto de rosmaninho Método de extracção: Um total de 10 gramas de cada uma das amostras foi pesado e adicionaram-se 20 ml de acetona a cada um. Após homogeneização durante 1 minuto no ultraturrax deixou-se repousar durante 2 horas para facilitar a separação em fases. Depois, centrifugaram-se a 3500 r.p.m. durante 30 minutos. O sobrenadante foi filtrado através de papel de filtro e depois foi evaporado no rotavapor. Método de cromatografia: Foram realizadas análises num sistema HPLC com uma coluna NovaPack Ci8 de 150 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e uma dimensão de partícula de 3,5 pm. A fase móvel utilizada na separação consistia numa mistura de solventes A (acetonitrilo com 1 % de ácido acético) e B (água com 1% de ácido acético) . A composição da fase móvel variou ao longo de um gradiente de 30 minutos, a começar com 50% de B durante 5 minutos, 30% 30 de B aos 15 minutos e atingindo 0% de B aos 30 min. O fluxo foi mantido durante toda a separação a 0,7 ml/min. Os compostos foram detectados com um detector de feixe e díodos num comprimento de onda entre 200 a 450 nm. A fenda de detecção ficou estabelecida a 4 nm e o intervalo de amostragem a 200 ms. O comprimento de onda seleccionado para a detecção dos compostos foi 230 nm. O equipamento foi fornecido com um injector de 20 μΐ. 6. Perfil do carotenóide

Extracção de carotenóides a partir de microalgas: Foram preparados extractos de 0,05 g/ml de Spirulina e Dunaliella em éter de petróleo:acetona (1:1) para comparar a concentração de carotenóide em ambas as algas. Foi preparado um extracto de 0,005 g/ml de Dunaliella (correspondente a 1 % adicionado às amostras) em éter terc-butilmetílico para quantificar a perda de carotenóides produzida na extracção dos carotenóides, porque foi realizada apenas uma extracção das amostras. Foi efectuada uma segunda extracção para corroborar os dados da experiência com os dados da literatura.

Extracção de carotenóides a partir de amostras. Um total de 5 g de cada amostra foi pesado e fragmentado durante 1 minuto com pausas de 5 s num liquidificador doméstico. Misturou-se um total de 5 g de mistura fragmentada com 10 ml de éter terc-butilmetilico. A mistura foi homogeneizada em Ultraturrax durante 1 min e deixada repousar até se separarem as duas fases (no escuro). O sobrenadante (20 μΐ) foi imediatamente injectado no HPLC para análise. 31

Análise por HPLC: As amostras e padrões foram injectados num HPLC utilizando uma coluna de fase inversa (Microsorb C18, 250 x 4,6 mm of Varian) e foram reveladas a um fluxo de 1 ml/min segundo um gradiente com início a 50% da mistura B, que aumentou em 14 min até 100% de B e permaneceu constante até ao final da revelação a 53 minutos. As misturas de solventes utilizados correspondiam: Mistura A: diclorometano: metanol:acetonitrilo:água (0:60:5:35) e mistura B: diclorometano:metanol:acetonitrilo:água (25:28:42.5:4.5) . Foi efectuada a detecção dos picos com um detector de fotodíodo para identificar picos por tempo de retenção e o respectivo espectro em relação aos padrões mencionados e foram quantificados a um comprimento de onda máximo para a maioria dos compostos (450 nm) . Para quantificar as áreas detectadas, foram desenvolvidas curvas de calibração com luteína para quantificar picos de luteína das amostras. Os picos de β-caroteno e 9-cis-p-caroteno são quantificados com a linha recta obtida a partir da curva de β-caroteno devido à similaridade do seu espectro. EXEMPLO 1 Salsichas tipo frankfurt.

PREPARAÇÃO

Depois de obter a emulsão de carne padrão para produção de salsichas de tipo frankfurt adicionaram-se as seguintes quantidades dos ingredientes da mistura oleosa por kg de pasta de carna: 50 gramas de óleo de salmão desodorizado e enriquecido com 18% de EPA e 12% de DHA. 1 grama de extracto de rosmaninho supercrítico 32 0,05 gramas de alfa-tocoferol 10 gramas de Dunaliella salina A mistura oleosa foi adicionada à pasta de carne numa misturadora a fim de obter uma emulsão com uma distribuição homogénea dos ingredientes da mistura oleosa. Depois, esta pasta foi transformada em salsichas e cozinhada a 70° C durante 60 minutos.

Em seguida as salsichas foram embaladas a vácuo e refrigeradas a 5o C durante 90 dias. Procedeu-se à fritura a 180° C durante três minutos.

RESULTADOS O quadro 1.1. seguinte mostra o perfil lipidico para as salsichas determinado depois das operações de processamento e a diferentes períodos de armazenagem.

Quadro 1.1 Percentagem molar de ácidos gordos

Pasta de controlo Pasta sem ser em salsichas Salsicha cozinhada Salsicha ao fim de 21 dias de armazenagem Salsichas ao fim de 60 dias de armazenagem Salsicha frita Miristico (Cl 4:0) 1,4 3, 0 3,0 2,1 2,1 2,9 Palmítico (Cl 6:0) 25,0 23,0 23,9 23,7 22, 9 23,5 Palmitoleico (Cl 6:1) 2,3 4,4 4,1 4,0 3,9 4,2 Esteárico (C18:0) 12,4 10,7 11,4 11,9 11,3 11,0 Oleico (Cl8 :1) 40,7 35,0 36,1 36, 9 35,3 36,0 33

Linoleico (Cl8:2) n-6 14,7 12,3 12,5 12,4 12,1 12, 6 Linolénico (Cl8:3) n-3 0,8 0, 8 0,8 0,8 0,7 0, 8 Estearidónico (Cl8:4) n-3 0,0 0, 6 0,5 0,4 0,4 0,5 C20 :1 0, 6 0, 8 0,7 0, 9 0,7 0,7 EPA (C20:5) n-3 0,0 4,5 3,3 3,2 3,2 3,5 DPA (C22:5) n-3 0,0 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 DHA (C22:6) n-3 0,0 2, 6 1,5 1,5 2,0 2, 0 saturado 38,8 36,7 38,3 37, 6 36,2 37,4 monosaturado 43,7 40,2 41,0 41,8 40,0 41,0 n-6 14,7 12,3 12,5 12,4 12,1 12,6 n-3 0,8 8,9 6,3 6,2 6,6 7,1 n-6/n-3 17,9 1,4 2,0 2,0 1,8 1,8 A partir dos dados do quadro 1.1. pode-se deduzir em primeiro lugar que com a adição de 50g/kg de óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA a proporção ω-β/ω-3 é reduzida de 17,9 para um valor abaixo de 2, o qual se mantém durante todo o processo de produção, armazenamento e cozedura. Além disso, o perfil lipidico também permanece estável. É essencial manter a actividade antioxidante da mistura oleosa durante o processamento e armazenamento para alcançar os objectivos pretendidos. Além disso, a 34 actividade antioxidante contribui para manter o perfil lipidico estável dado que PUFA são oxidáveis. 0 quadro 1.2. mostra os dados do índice de oxidação para as salsichas.

Quadro 1,2. índice de oxidação

Pasta de controlo Pasta sem ser em salsichas Salsicha cozinhada Salsicha ao fim de 21 dias de armazenagem Salsichas ao fim de 60 dias de armazenagem Salsicha frita mg MDA/Kg 0,10 0,27 0,32 0,29 0,32 0,35

Mesmo com a adição de uma quantidade apreciável de PUFA, o índice de oxidação permaneceu baixo durante todo o período de processamento e armazenagem. Este resultado coincide com outros apresentados e confirma a manutenção do perfil lipidico de PUFA e por conseguinte a proporção ω-6/ω-3 e a actividade antioxidante da mistura oleosa de ingredientes. 0 quadro 1.3 apresenta os resultados da análise da actividade antioxidante para as salsichas.

Quadro 1.3. Actividade antioxidante

Pasta de Pasta sem Salsicha Salsicha ao Salsicha ao Salsicha controlo ser em cozinhada fim de 21 fim de 60 frita salsichas dias de dias de armazenagem armazenagem Actividade antioxidante 19,23% 68,73% 57,48% 56,58% 51,80% 63,66% 35

Embora possam ser observadas algumas oscilações, constatou-se que os carotenóides permanecem estáveis ao longo do processo. 0 aumento durante as fases fianis pode ficar a dever-se à libertação destes compostos dentro das células da microalga.

Embora se tenha constatado que a quantidade de ácido carnosinico presente nas salsichas diminuiu à medida que o processo avançava e durante o armazenamento, ficou demonstrada a presença de quantidades significativas deste composto no final do processo, mesmo depois de cozinhar. A adição da mistura oleosa aumenta a actividade antioxidante em um factor de 3,4 vezes o valor determinado nas salsichas antes do processo. Esta actividade antioxidante sofre uma ligeira redução durante o processamento e armazenagem mas durante a validade nunca desce abaixo de 2,5 vezes o valor obtido para o produto sem a mistura oleosa. 0 aumento da actividade antioxidante após a fritura pode ficar a dever-se ao efeito de adsorção do óleo usado (azeite virgem). 0 quadro 1.4 mostra os resultados da análise alfa-tocoferol em salsichas. A presença de alfa-tocoferol em salsichas no final do processamento e armazenagem constitui outro indicador da elevada actividade antioxidante da mistura oleosa.

Efectivamente, numa experiência paralela em que foi adicionado apenas óleo de salmão mais alfa-tocoferol às salsichas, o alfa-tocoferol nem sequer foi detectado após a cozedura. Neste momento, a actividade antioxidante era 32,92%, por outras palavras, menos de metade do obtido 36 quando a mistura oleosa completa foi adicionada. Fica assim demonstrada a sinergia entre o alfa/tocoferol e o extracto de rosmaninho supercritico.

Quadro 1.4. Concentração de alfa-tocoferol

Pasta de controlo Pasta sem ser em salsichas Salsicha cozinhada Salsichas ao fim de 21 dias de armazenagem Salsichas ao fim de 60 dias de armazenagem Salsicha frita gg/g alfa-tocoferol 0, 0 30, 0 14,5 11,5 10,2 8,7 A presença de componentes do extracto de rosmaninho supercritico constitui um indicador da permanência deste nas salsichas durante o processo. 0 quadro 1.5 mostra os resultados da análise do ácido carnosinico, o componente antioxidante mais activo do extracto de rosmaninho supercritico e, ainda, o mais volátil.

Quadro 1,5. Concentração de ácido carnosinico

Pasta de Pasta sem Salsicha Salsicha ao Salsicha ao Salsicha controlo ser em cozinhada fim de 21 fim de 60 frita salsichas dias de dias de armazenagem armazenagem mg/10g ácido carnosinico 0,0 224, 9 198,5 167, 6 141,9 140,2 0 quadro 1.6 mostra os resultados das análises do carotenóide nas salsichas. Estes compostos são derivados da microalga Dunaliella salina. 37

Quadro 1.6. Concentração de carotenóide

Pasta de controlo Pasta sem ser em salsichas Salsicha cozinhada Salsicha ao fim de 21 dias de armazenagem Salsicha ao fim de 60 dias de armazenagem Salsicha frita mg/g luteina 0,001 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02 mg/g de betacaroteno 0,004 0,42 0,37 0,37 0,28 0,41

CONCLUSÃO A incorporação da mistura oleosa nas salsichas tipo frankfurt confere a estas uma actividade antioxidante, um teor de antioxidantes naturais e uma proporção ω-6/ω-3 >5 que permanece estável ao longo do processo de produção, armazenagem e cozedura. EXEMPLO 2 Chouriço Ibérico curado

PREPARAÇÃO

Aos ingredientes padrão do chouriço ibérico tradicional foram acrescentadas as seguintes quantidades de ingredientes de uma mistura oleosa por kg de pasta de carne: 50 gramas de óleo de salmão desodorizado e suplementado com 18% de EPA e 12% de DHA. 1 grama de extracto de rosmaninho supercritico 0,05 gramas de alfa-tocoferol 10 gramas de Dunaliella salina 38

Depois a mistura foi colocada num misturador industrial sob vácuo, introduzida em invólucros e curada durante até 50 dias.

RESULTADOS O quadro 2.1. seguinte mostra o perfil lipidico para o chouriço curado determinado depois das operações de processamento e a diferentes períodos de armazenagem.

Quadro 2,1. Percentagem molar determinada de ácidos gordos

Mistura de controlo Chouriço Chouriço com 25 dias de cura Chouriço com 50 dias de cura Miristico (Cl4:0) 1,3 3,9 3,0 2,2 Palmitico (Cl6:0) 27,5 25,2 26,5 26,5 Palmitoleico (Cl 6:1) 2,6 5, 6 4,8 4,5 Esteárico (Cl 8:0) 12, 7 10,8 11,7 12,0 Oleico (18:1) 46, 6 3 6,5 40,1 40,6 Linoleico (Cl 8:2) n-6 6,1 5,1 5,2 6, 2 Linolénico (Cl8:3) n-3 0,4 0,5 0,3 0,5 Estearidónico (Cl8 : 4) n-3 0,0 0,7 0,3 0,4 020:1 0,7 0, 8 0,8 0, 8 EPA (C20:5) n-3 0,0 5,3 3,0 2,3 DPA (C22:5) n-3 0,0 0,4 0,3 0,3 39 DHA (C22 : 6) n-3 O O 3,2 2,0 1,5 saturado 41, 6 39,9 41,2 40,8 monossaturado 49, 9 42, 9 45,6 46,0 n-6 6,1 5,1 5,2 6, 2 n-3 0,4 10,1 5,9 5, 0 n-6/n-3 14,2 0,5 0, 9 1,2 A partir dos dados do quadro 2.1. pode-se deduzir em primeiro lugar que com a adição de 50g/kg de óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA a proporção ω-6/ω-3 é reduzida de 14,2 para um valor abaixo de 1, o qual se mantém durante todo o processo de produção, incluindo processo de cura de 50 dias.

Relativamente às determinações da actividade antioxidante, o alfa-tocoferol, ácido carnosinico, carotenóides e índice de oxidação, os resultados são análogos aos apresentados para as salsichas.

CONCLUSÃO A incorporação da mistura oleosa em chouriço ibérico curado confere-lhe uma actividade antioxidante, os teores de antioxidantes naturais e uma proporção ω-6/ω-3 >5 que permanece estável ao longo de todo o processo, incluindo os 50 dias de cura. 40

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Esta lista não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o EPO rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição:

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Claims (18)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais destinada a utilização na preparação de um produto alimentar enriquecido, caracterizada por compreender um óleo de salmão enriquecido com EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto de rosmaninho supercrítico.

2. Mistura oleosa de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter: 70-99, 9% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-1% de alfa-tocoferol e 0,1-5% de extracto de rosmaninho supercrítico, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

3. Mistura oleosa de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por conter: 80-97% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-0,1% de alfa-tocoferol e 1-3% de extracto de rosmaninho supercrítico, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

4. Mistura oleosa de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por conter: 82% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 2 0,08% de alfa-tocoferol e 1,6% de extracto de rosmaninho supercrítico, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

5. Mistura oleosa de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por conter também a microalga Dunaliella salina.

6. Mistura oleosa de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender 0,1-20%, de preferência 3-18% e ainda mais preferencialmente 16% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores a percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

7. Produto alimentar enriquecido com uma mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais que contêm óleo de salmão enriquecido em EPA e DHA, alfa-tocoferol e extracto supercrítico de rosmaninho.

8. Produto alimentar enriquecido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a mistura oleosa à base de ingredientes bioactivos naturais conter ainda a microalga Dunaliella salina.

9. Produto alimentar enriquecido de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado por conter: 0,1-20% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,00001-1% de alfa-tocoferol, 0,001-5% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 3 0,01-5% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

10. Produto alimentar enriquecido de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por conter: 1-10% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-0,5% de alfa-tocoferol, 0,01-3% de extracto de rosmaninho supercritico e opcionalmente 0,1-3% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total do produto alimentar.

11. Produto alimentar enriquecido de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por conter: 5% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,005% de alfa-tocoferol, 0,1% de extracto de rosmaninho supercritico e opcionalmente 1 % da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total do produto alimentar.

12. Produto alimentar de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado por apresentar um teor de ácidos gordos polinsaturados com uma proporção de ω-6/ω-3 ácidos gordos polinsaturados inferior a 5. 4

13. Produto alimentar enriquecido de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser um produto derivado da carne.

14. Produto alimentar enriquecido de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser um produto derivado da carne, seleccionado do grupo constituído por salsichas tipo frankfurt, fiambre cozido, peito de peru cozido, chouriço curado, salsichão curado, lombo de porco curado e fiambre curado.

15. Método de preparação de um produto alimentar enriquecido de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado por incluir as seguintes fases: a) preparação de uma mistura oleosa de ingredientes naturais bioactivos por meio de mistura destes ingredientes bioactivos naturais e b) incorporação da mistura oleosa preparada em a) no produto alimentar que se deseja enriquecer.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os ingredientes bioactivos naturais serem combinados numa proporção de: 70-99, 9% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-1% de alfa-tocoferol, 0,1-5% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 0,1-20% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa. 5

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por os ingredientes bioactivos naturais serem combinados numa proporção de: 80-97% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,001-0,1% de alfa-tocoferol, 1-3% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 3-18% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por os ingredientes bioactivos naturais serem misturados numa proporção de: 82% de óleo de salmão enriquecido com 10 a 40% de EPA e DHA, 0,08% de alfa-tocoferol, 1,6% de extracto de rosmaninho supercrítico e opcionalmente 16% da microalga Dunaliella salina, correspondendo estes valores às percentagens em peso relativamente ao peso total da mistura oleosa. LISBOA, 15/04/2011