WO2006053917A2 - Mezcla oleosa de ingredientes bioactivos naturales para la preparación de un producto alimenticio enriquecido - Google Patents

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Definitions

  • alpha-tocopherol has important advantages as an antioxidant, as mentioned.
  • the alpha-tocopherol marketed by Roche can be used, for example.
  • the oil mixture also comprises Dunaliella saline microalgae.
  • Said microalgae is one of the most used in food because its toxicity is well evaluated and, therefore, its use does not pose health risks.
  • Dunaliella salina microalgae has an important content in carotenoids that can enhance the antioxidant action of alpha-tocopherol and rosemary supercritical extract and that, in addition, have preventive properties of specific diseases such as some related to vision.
  • the synergistic action between the alpha-tocopherol and the supercritical extract of rosemary allows maintaining said carotenoid content in the food product to which the oily mixture of the invention is incorporated.
  • the mixture Oil of bioactive ingredients is injected into the raw breast pieces together with the brine.
  • the pieces are then introduced into a massage drum to achieve the internal diffusion of the mixture of bioactive compounds evenly inside the meat.
  • the pieces are cooked, vacuum packed, refrigerated for a maximum period ranging from 30 to 90 days.
  • the ⁇ -carotene bleaching method measures Ia ability of a substance that has a potentially antioxidant effect to inhibit the oxidation of ⁇ -carotene when it is in a medium emulsified with linoleic acid under pro-oxidant conditions.
  • HPLC From each sample, 10 g were taken and mixed with 20 ml of ethanol. It was homogenized in the ultraturrax for 1 min and centrifuged. The supernatant was passed through a filter and concentrated on a rotary evaporator to dryness. Then 2 ml of ethanol was added. The concentrates were passed through a filter and injected into HPLC for analysis using a revealing phase column (Nova-Pak C18 6OA 4 ⁇ m 3.9 x 150 mm, Waters) and were developed at a flow of 1 ml / min following a method Socratic of a mixture of 97% methanol in 1% acetic acid (v / v) for 20 min. The detection of the peaks was performed with a photodiode detector to identify the peaks by their retention time and their spectrum according to the mentioned standards and was quantified at a maximum wavelength for most of the compounds (295 nm).

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Abstract

La presente invención proporciona una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales para usar en la preparación de un producto alimenticio enriquecido que comprende aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA, alfa-tocoferol y extracto supercrítico de romero. Dicha mezcla puede contener opcionalmente microalga Dunaliella salina. Asimismo, la invención proporciona un producto alimenticio enriquecido con dicha mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales que presenta grandes beneficios para la salud humana por su contenido estable en ácidos grasos poliinsaturados con una relación -3 y -6 inferior a 5, así como en alfa-tocoferol, en diterpenos fenólicos del extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, en carotenoides de la microalga Dunaliella salina. Por último la invención proporciona también un procedimiento para la preparación de dicho producto alimenticio enriquecido.

Description

MEZCLA OLEOSA DE INGREDIENTES BIOACTIVOS NATURALES PARA LA PREPARACIÓN DE UN PRODUCTO ALIMENTICIO ENRIQUECIDO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo de los productos alimenticios enriquecidos con ingredientes bioactivos naturales. Más en particular, se refiere a una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales que se añade a productos alimenticios, particularmente a productos cárnicos, a fin de compensar eficazmente el desequilibrio lipídico de los productos alimenticios de origen animal terrestre y aportar actividades beneficiosas para Ia salud humana, especialmente en Ia prevención de enfermedades, sin detrimento de las características de calidad y seguridad de dichos productos alimenticios.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En el mercado existen desde hace unos años diversos productos alimentarios de origen animal, principalmente lácteos (aunque también algunos cárnicos), con ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (ω-3) incorporados al alimento mediante Ia adición de un porcentaje bajo de aceite de pescado. Los ácidos grasos ω-3 no están presentes de forma natural en
Ia carne de los animales terrestres y con su incorporación a los alimentos de origen animal se persiguen beneficios saludables que se basan en conocimientos científicos de hace muchos años.
Tradicionalmente, Ia grasa animal ha sido considerada poco saludable.
Su composición lipídica se ha relacionado desde hace décadas con Ia probabilidad de sufrir enfermedades cardiovasculares. De hecho, Ia leche entera y los productos cárnicos suelen desaconsejarse en las dietas de las personas sometidas a riesgo cardiovascular. Desde hace muchos años se investiga al respecto para tratar de conocer cuáles son las bases científicas de ello. Las teorías al respecto han ido evolucionando notablemente, especialmente en el periodo más reciente. Hace años, se consideraba a Ia grasa animal responsable del incremento de los niveles de colesterol sérico y se establecía una asociación directa del nivel de colesterol con Ia enfermedad cardiovascular. Más recientemente se atribuye a los triglicéridos, concretamente a su concentración en Ia sangre y ai tiempo de permanencia en Ia misma, el origen del factor de riesgo cardiovascular.
Desde mediados del siglo pasado se llevan a cabo investigaciones orientadas a conocer los efectos de los ácidos grasos poliinsaturados o PUFA (PoIyUnsaturated Fatty Acids) en Ia disminución de los niveles de colesterol sérico y en las enfermedades cardiovasculares. Los trabajos más relevantes en este sentido fueron los de Ahrens et al, 1954 (Ahrens E. H., D. H. Blankenhorn, TT. Tastas (1954), "Effect on human serum lipids of substituting plant for animal far in the diet", Proc. Soc. Exp, Biol. Med. 86, 872.) y Keys et al., 1957 (Keys A., JT. Anderson, F. Grande (1957), "Serum cholesterol response to dietary fat", Lancet 1, 787) que establecieron evidencias claras acerca de Ia importancia de los PUFA en Ia prevención de enfermedades cardiovasculares. Desde entonces se han llevado a cabo multitud de estudios al respecto, Ia mayoría de los cuales han confirmado los efectos cardiosaludables de los ω-3. Por ejemplo, en un ensayo clínico llevado a cabo recientemente por investigadores del Laboratory of Cardiovascular Nutrition del Baker Medical Research Institute de Melbourne, el Department of Medicine del Medical Defense College de Tokio, el CSIRO de Ia División of Health Sciences and Nutrition de Adelaide (Australia) y de Vitamin Research de F Hoffmann-La Roche (Suiza) publicado en el
American Journal of Clinical Nutrition (Am J Clin Nutr 76 (2002) 326-330) de Ia American Society for Clinical Nutrition, se demuestra que los ácidos grasos ω-3, especialmente los de cadena larga, es decir, DHA (ácido docosahexanoico) y EPA (ácido eicosapentanoico), tienen efectos en el mantenimiento de Ia elasticidad arterial y en consecuencia del mantenimiento de los niveles normales de Ia presión arterial y de Ia reducción del riesgo cardiovascular. El estudio consistió en suministrar DHA o EPA o placebo a pacientes con hipercolesterolemia durante siete semanas. Los investigadores determinaron, a continuación, Ia elasticidad de las arterias de los participantes a través de ultrasonidos. Aquellos que recibieron los ácidos grasos ω-3 mostraron una reducción significativa en Ia esclerosis arterial, mientras que los que tomaron el placebo no experimentaron cambios. Los que tomaron EPA presentaron un aumento del 36% en Ia resistencia sistémica arterial, una determinación de Ia elasticidad de las arterias principales, mientras que los que tomaron DHA tuvieron un aumento del 27%.
Los ácidos grasos ω-3 (EPA/DHA) mejoran el perfil lipídico sanguíneo, ya que aumentan Ia elasticidad, disminuyen el colesterol LDL, aumentan el HDL, reducen Ia trigliceridad arterial y son antitrombóticos. Adeemia (López- Huertas-E; Baro,-L; Carrero,-J-J; Fonolla,-J (2003) "n-3 fatty acids: health effects and opportunities to increase intake", Agro Food Industry hi tech.
2003; 14(3): 18-21 ; Dewailly,-E; Blanchet-C; Gingras,-S; Lemieux,-S; Holub,-B-J (2002), "Cardiovascular disease risk factors and n-3 fatty acid status in the adult population of James Bay Cree", Amerícan-Journal-of- Clinical-Nutrition. 2002; 76(1 ): 85-92).
Además de los efectos cardiosaludables de los ω-3, y tal como se ha comentado en párrafos anteriores, estos ácidos grasos tienen importantes efectos en expresiones génicas y otros procesos bioquímicos corporales. Entre otras funciones de los ω-3 destaca su intervención en Ia formación de las membranas celulares. La mayor parte de los tejidos cerebrales son ricos en ácidos grasos ω-3. El estado actual del conocimiento de estos efectos se recoge en un artículo de Donald B. Jump del Department of Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology de Michigan State University publicado en el Journal of Biological Chemistry de Ia American Society for Biochemistry and Molecular Biology (J. BhI. Chem 227 (2002) 8755-8758). Hoy se conoce que los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) ω-3 y ω-6 están involucrados en importantes procesos biológicos del cuerpo humano y que su relación es clave en Ia prevención de numerosas enfermedades crónicas (Simopoulos AP. (2002), "The ¡mportance of the ratio omega- 6/omega-3 essential fatty acids", Biomedicine and Phamacotherapy 56, 365), incluyendo el cáncer (Nkondjock A., B. Shatenstein, P. Maisonneuve, P. Ghadirian (2003), "Specific fatty acids and human colorectal cáncer: an overview", Cáncer Detection and Prevention 27, 55). Se recomienda que dicha relación sea próxima a 1 (Simopoulos A.P. (1999), "Evolutionary aspects of omega-3 fatty acids in the food suplí Prostaglandins, Leucotrienes and Esential Fatty Acids", 60, 421). La relación ω-6 / ω-3 en Ia carne de cerdo es, como término medio, superior a 10. En Ia grasa de cerdo aún es mayor. En cualquier caso muy superior a Ia recomendada.
Existe un interesante trabajo de investigación de A.P. Simopoulos [Biomedicine & Pharmacotherapy 56 (2002) 365-379] en el que concreta los beneficios que aportan diferentes relaciones ω-6/ω-3. Según este trabajo:
ω-6/ω-3= 5, tiene efectos beneficiosos sobre el asma. ω-6/ω-3= 4, tiene probados efectos de reducción del riesgo cardiovascular. ω-6/ω-3= entre 2 y 3, previene el cáncer de colon y Ia artritis reumatoide. ω-6/ω-3= cuanto más bajo, mayor efecto preventivo de cáncer de mama. ω-6/ω-3superior a 10 comienza a tener efectos adversos.
La compensación de los efectos negativos de los ω-6 mediante Ia adición de ω-3 requiere, para ser efectiva, Ia adición simultánea de compuestos de actividad antioxidante [B. Demmig-Adams y W.W. Adams, III. [Science 298 (2002) 2149-2153].
Las propiedades antioxidantes de las especias se conocen desde comienzos de los años 50 (Chipault J. R., Muzumo G. R., Hawkins J. M., Lundberg W. O. (1952), "The antioxidant properties of natural spices", Food Res. 17, 46). En 1955 se descubrió que el romero era una de las que poseían esta actividad en mayor medida (Rae M., Ostric-Matijasevic B. (1955), "The properties of rosemary as an antioxidant", Rev. Fr. Corps Gras 2, 796). Los compuestos responsables de Ia misma están bien determinados. En 1966 se aisló el camosol (Briescorn C. H., Fuchs A., Bredenberg J. B., McChesney J. D., Wenkert E. (1966), "The structure of carnoso!", J. Org. Chem. 29, 2293) y se atribuyeron a este diterpeno fenólico las propiedades antioxidantes de Ia planta. Su estructura y Ia del ácido carnósico fueron confirmadas en 1982 (Wu J.W., Lee M. H., Ho C.T., Chan
S. S. (1982), "Elucidation of the chemical structures of natural antioxidants ¡solated from Rosemary", JAOCS 59, 339) y en ese mismo año se identificaron el rosmanol y el ácido rosmarínico (Inatani R., Nakatani N., Fuwa H., Seto H. (1982), "Structure of a new antioxidative phenolic diterpene isolated from Rosemary", Agrie. Biol. Chem. 46, 1666). A continuación el rosmadial (Inatani R., Nakatani N., Fuwa H. (1983), "Antioxidative effect of the constituents of Rosemary and their derivatives", Agrie. Biol. Chem. 47, 521 ), el epirosmanol e isorosmanol (Nakatani N., Inatani R. (1984), "Two antioxidative diterpenes from Rosemary and a revised structure for rosmanol", Agrie. Biol. Chem. 48, 2081) el rosmaridifenol y Ia rosmariquinona
(Houlihan CM. , Ho C.T., Chang S.S. (1985), "The structure of rosmariquinone. A new antioxidant isolated from Rosmarinus officinalis L.", JAOCS 62, 1985). Además de los anteriores compuestos, se sabe que las hojas de romero contienen también flavonoides con actividad antioxidante (Okamura N., Haraguchi H., Hashimoto K., Yagi A. (1994), "Flavonoids in
Rosmarinus officinalis leaves", Phytochem. 37, 1463).
En términos generales, a nivel individual Ia mayor actividad antioxidante corresponde al ácido carnósico, seguido del camosol, ácido rosmarínico, rosmanol y rosmadial (Cuvelier M. E., Richard H., Berset C.
(1996), "Antioxidative activity and phenolic composition of pilot-plant and commercial extracte of sage and rosemary", JAOCS 73, 645). El carnosol es el componente que generalmente se ha detectado como mayoritario, llegando a suponer muchas veces el 90% de los extractos. En realidad procede, junto con otros compuestos fenólicos encontrados en el romero, de Ia oxidación del ácido carnósico durante las operaciones de extracción.
Los diterpenos fenólicos del romero actúan como antioxidantes primarios (Basaga H., Tekkaya C, Acikel F. (1997), "Antioxidative and free radical scavenging properties of rosemary extract", Lebensm. Wiss. Technol. 30, 105; Frankel E.N., Shu W.H., Aeschbatch R., Prior E. (1996), "Antioxidant activity of a rosemary extract and its constituents carnosic acid, carnosol, and rosmarinic acid in bulk oil and oil-in-water emulsión", J. Agrie. Food Chem. 44, 131 ; y Haraguchi H., Saito T., Okamura N., Yagi A. (1995), "Inhibition of lipid peroxidation and superoxide generation by diterpenoids from Rosemary officinalis", Planta Medica 61 , 333). Además, se ha demostrado que, estos productos tienen una actividad similar a Ia superóxido dismutasa (Seok J. K., Daeseok H., Kwang D. M., Joon S. R. (1995), "Measurement of superoxide dismutase-like activity of natural antioxidants", Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 822) y efectos sinérgicos con las enzimas glutatión reductasa y NADPH- quinona reductasa, regenerándolas y aumentando el efecto bloqueante de radicales libres que ejercen. A estas sinergias con las mencionadas enzimas se atribuyen los efectos protectores ante agentes cancerígenos en pulmón, hígado y estómago que se han puesto de manifiesto en ratones en los últimos años (Singletary K.W., Rokusek JT. (1997), "Tissue specific enhancement of xenobiotic detoxification enzymes in mice by dietary rosemary extract", Plant Foods for Human Nutrition 50, 47; Offord, E.A., K. Macé, O. Avanti, A.M.A. Pfeifer (1997), "Mechanisms involved in the chemoprotective effeets of rosemary extract studied in human liver and bronchial cells", Cáncer Letters 114, 275). Es también conocido el mecanismo de acción de los antioxidantes contra Ia peroxidación de las iipoproteínas en sangre que es clave en el desarrollo de Ia arterioesclerosis (Pinchuk L1 D. Lichtenberg (2002), "The mechanism of action of antioxidants against lipoprotein peroxidation, evaluation based on kinetic experiments", Progress in Lipid Research 41 , 279).
E! romero es muy conocido en usos alimentarios. Sin embargo, su intenso aroma y Ia alteración de Ia textura hace que no pueda añadirse a los productos cárnicos en Ia proporción necesaria para que su efecto sea apreciable. Por este motivo se emplean extractos.
La extracción supercrítica es una alternativa ventajosa a Ia extracción con disolventes para Ia obtención de antioxidantes. Existen procesos de extracción de aromas y colorantes naturales, lúpulo y oleorresinas de diversas plantas. La extracción en condiciones suaves y no oxidantes permite obtener productos de alta calidad con sus propiedades naturales intactas y exentos de residuos de disolventes.
Destaca el caso de las oleorresinas que, generalmente, se pueden fraccionar en el mismo proceso de extracción supercrítica dando lugar a productos de funcionalidades diferentes. Numerosas aplicaciones se han realizado a Ia extracción de plantas labiadas (romero, tomillo, orégano, salvia, etc.) (Nguyen U., Evans D. D., Frakman G. (1994), "Natural antioxidants produced by supercritical fluid extraction", In "Supercritical Fluid Processing of Foods and Biomaterials", Ed. S. S. H. Rizvi. Chapman & Hall, London. p.103). En estos casos, mediante extracción con fluidos supercríticos o SFE (Supercritical Fluid Extraction) se obtiene una oleorresina fácilmente fraccionable en dos productos: un aceite esencial, generalmente con funcionalidades aromática y antimicrobiana, y un antioxidante .
En las actualidad se conoce bien que los antioxidantes naturales obtenidos por SFE poseen una actividad mayor que los extraídos con disolventes. Djarmati y colaboradores (Djarmati Z., Jankov R.M., Schwirtlich E., Djullnac B., Djordjevic A. (1991 ), "High antioxidant activity of extracts obtained from sage by supercritical CO2 extraction", JAOCS 68, 731) demostraron que los extractos antioxidantes de salvia obtenidos por extracción con CO2 supercrítico eran más eficaces que el BHT. Más recientemente se ha confirmado que Io mismo ocurre con los extractos de pimienta negra (Tipsrisukond N., Fernando L.N., Clarke A.D. (1998), "Antioxidant Effects of Essential OiI and Oleoresin of Black Pepper from Supercritical. Carbón Dioxide Extractions in Ground Pork", J. Agrie. Food Chem. 46, 4329).
Los fitoquímicos contenidos en el extracto antioxidante de romero tienen importantes actividades biológicas. Es especialmente interesante su efecto sobre los ácidos grasos insaturados.
Asimismo, son conocidas en el estado de Ia técnica las propiedades beneficiosas de Ia microalga Dunaliella salina, alga unicelular perteneciente al género de las microalgas verdes (clorofitas). Esta microalga fue Ia primera que se utilizó comercialmente para producir reactivos de química fina debido a que su extrema salinidad simplificaba en gran manera el mantenimiento de los cultivos, sin temor a contaminaciones externas por patógenos (Borowitzka LJ. , Moulton T.P., Borowitzka M.A. ( 1985), "Salinity and the commercial production of beta-carotene from Dunaliella salina", In: Barclay WJ. , Mclntosh R., eds. Algas Biomass: and Interdisciplinary Perspective. J. Cramer Verlag, Verduz). En Ia actualidad Ia Dunaliella salina se consume como suplemento alimentario rico en beta-caroteno (Mokady S., Abramovici A., Cogan U. (1989), "The safety evaluation of Dunaliella bardawil as a potential food supplement", Food Chem. Toxicol. 27, 221 ; Tanaka Y. (1990), "Process for production of encapsulated foodstuff containing Dunaliella algae", patente estadounidense US 4,915,965, y patente japonesa JP 88-
40755; Leach G., Oliveira G., Moráis R. (1998), "Spray-drying of Dunaliella salina to produce a beta-carotene rich powder", J. Ind. Microb. Biotechnol. 20, 82; Orset S., Leach G.C., Moráis R., Young AJ. (1999), "Spray-drying of the microalga Dunaliella salina: Effects on beta-carotene contení and isomer composition", J. Agrie. Food Chem. 47, 4782). Australia es el productor de más del 80% del beta-caroteno que se consume en el mundo, todo él procedente de cultivos de Dunaliella salina. El beta-caroteno se encuentra en esta microalga en concentraciones de hasta un 14% del peso seco de Ia misma, siendo el alga de mayor contenido en este compuesto y dependiendo su acumulación de las condiciones de cultivo (salinidad, temperatura, intensidad de luz). Estudios recientes han permitido el aislamiento y purificación de distintos isómeros del beta-caroteno, como el 9- cis (Yamano Y., Yoshizawa M., lto M. (1999), "Isolation of 9Z beta-carotene from Dunaliella bardawil and its stereoselective synthesis", J. Nutr. Sci. Vitamin. 45, 49) y han determinado su actividad antioxidante en comparación con el beta-caroteno sintético (de composición mayoritariamente "all-trans").
Otros compuestos con propiedades funcionales presentes en esta microalga son los tocoferoles (que habitualmente se cuantifican como alfa-tocoferol debido a que se desconoce su composición isomérica), los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) (Franke H., Springer M., PuIz O., Tietz U., Mueller U. (1994), "Polyunsaturated fatty acids from microalgae", Int. Food Ingr.
4,41), esteróles (como ergosterol) y vitaminas hidrosolubles (como tiamina, piridoxina, biotina, riboflavina, etc.). No se ha descrito en esta alga Ia presencia de flavonoides o compuestos fenólicos aunque es esperable teniendo en cuenta que se ha detectado su presencia en especies parecidas de microalgas (Rauha, JP; Remes, S; Heinonen, M; Hopia, A; Káhkδnen, M;
Kujala, T; Pihlaja, K; Vuorela, H; Vuorela, P. (2000), "Antimicrobial effects of Finnish plant extraets containing flavonoids and other phenolic compounds", Int. J. Food Microbio!..56, p. 3-12).
En cuanto a efecto de los carotenoides, además de Io ya conocido, muy recientemente se ha demostrado que efectos de carotenoides como Ia luteína, por ejemplo, en Ia prevención de Ia degeneración macular asociada a Ia edad, son mejores si se combinan dichos carotenoides con otros antioxidantes no carotenoides (Beatty S et al. Sun/. Ophtalmol 2000; 45:115- 134; Cait et al. Prog Retín Eye Res 2000; 10:205-211 ), (Junqueira VB et al. Mol Aspects Meó 2004;25:5-16) (Koh HH et al. Experimental Eye Research
2004; 79:21-27; Beatty S et al. Arch Biochem Biophys 2004 ¡430:70-76).
Por último, el alfa-tocoferol es conocido en el estado de Ia técnica por sus efectos beneficiosos como antioxidante, tanto desde el punto de vista alimentario como a nivel corporal.
Los presentes inventores han descubierto ahora que Ia combinación de aceite de salmón enriquecido con ácidos grasos poliinsaturados ω-3 de cadena larga tal como EPA y DHA, alfa-tocoferol y extracto supercrítico de romero para su posterior adición a un producto alimenticio da como resultado una acción sinérgica inesperada entre los antioxidantes y los ácidos grasos poliinsaturados que se traduce en un aumento de Ia actividad antioxidante mucho mayor de Io esperado y, además, en el mantenimiento de los contenidos de las sustancias bioactivas durante Ia elaboración, conservación y cocinado de los productos alimenticios enriquecidos, con los consiguientes beneficios para Ia salud humana por el consumo de los mismos.
Así pues, Ia presente invención proporciona una composición oleosa sinérgica a base de aceite de salmón enriquecido con EPA y DHA, alfa- tocoferol y extracto supercrítico de romero para usar en Ia preparación de un producto alimenticio enriquecido. Dicha composición puede comprender, además, microalga Dunaliella salina, que contiene también componentes beneficiosos para Ia salud tales como los carotenoides luteína o beta- caroteno, por ejemplo.
Asimismo, Ia invención proporciona productos alimenticios enriquecidos con dicha mezcla oleosa que presentan una relación de ácidos grasos poliinsaturados ω-3 y ω-6 inferior a 5, ventajosa para Ia prevención de enfermedades tales como el asma, el cáncer, o diversas dolencias cardiovasculares. Dicha relación, además, se mantiene también durante Ia elaboración, conservación y cocinado del producto alimenticio enriquecido debido a Ia mencionada acción sinérgica de dichos ácidos grasos poliinsaturados con el alfa-tocoferol y los diterpenos fenólicos procedentes del extracto supercrítico de romero. Dichos alimentos enriquecidos conservan, además, sus características de calidad en cuanto a valoración sensorial, por ejemplo, así como sus características de seguridad.
Por tanto, el producto enriquecido proporcionado por Ia invención presenta grandes beneficios para Ia salud humana tanto por su contenido estable en ácidos grasos poliinsaturados con una relación ω-3 y ω-6 inferior a 5, como por su contenido estable en alfa-tocoferol, diterpenos fenólicos procedentes del extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, carotenoides procedentes de Ia microalga Dunaliella salina.
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención, por tanto, tiene por objeto proporcionar una mezcla oleosa sinérgica a base de ingredientes bioactivos naturales para usar en Ia preparación de un producto alimenticio enriquecido que comprende aceite de salmón enriquecido con EPA y DHA, alfa-tocoferol y extracto supercrítico de romero.
Otro objeto de Ia invención es proporcionar un producto alimenticio enriquecido con dicha mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales.
Por último, otro objeto de Ia invención es proveer un procedimiento para Ia preparación de dicho producto alimenticio enriquecido. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales para usar en Ia preparación de un producto alimenticio enriquecido, caracterizada porque comprende aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA, alfa-tocoferol y extracto supercrítico de romero.
En el contexto de Ia presente solicitud, el término "producto alimenticio enriquecido" se refiere a un producto de uso alimentario a cuya composición se han añadido sustancias que de modo natural no contiene o que las contiene en concentraciones bajas.
Asimismo, el término "ingredientes bioactivos naturales" hace referencia a sustancias de origen natural con actividades biológicas de interés para Ia salud según el estado actual del conocimiento científico.
Tal y como se ha comentado previamente, el aceite de salmón enriquecido en EPA (ácido eicosapentanoico) y DHA (ácido docosahexanoico) proporciona ácidos grasos poliinsaturados omega-3, ingredientes funcionales muy conocidos y empleados en el ámbito alimentario, por Io que su utilización es de bajo riesgo. La incorporación de ácidos grasos co-3 sirve para compensar el perfil lipídico desfavorable de Ia grasa de animales terrestres, particularmente de cerdo, ya que Ia ingesta de cerdo provoca un incremento de ácidos grasos ω-6. La intervención de dichos ácidos grasos ω-6 en desequilibrios redox a nivel celular puede conducir a un incremento de Ia proliferación celular, como es el caso de cáncer; al desencadenamiento de procesos inflamatorios, como es el caso de enfermedades cardiovasculares, autoinmunes y neurológicas; y a deficiencias en Ia neurotransmisión provocando desórdenes neurológicos. Asimismo, el equilibrio redox celular influye en Ia expresión génica de reguladores de procesos vitales y en Ia generación de daños al DNA que dan lugar a mutaciones en genes claves. Así pues, Ia adición de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA a productos alimenticios de origen animal terrestre que se desean enriquecer contribuye a compensar el desequilibrio natural ω-6 / ω-3 de los mismos, ya que, por ejemplo, Ia relación ω-6 / ω-3 en Ia grasa de animales terrestres como cerdo y pavo es, como término medio, superior a 10 (si bien Ia carne de pavo sólo presenta un 1 % de contenido graso frente al 40% de contenido graso de Ia carne de cerdo). En Ia grasa de cerdo Ia relación ω-6 / ω-3 aún es mayor. En cualquier caso, dicha relación en Ia carne de los animales mencionados es muy superior a Ia recomendada.
Sin embargo, puesto que Ia ingesta de ácidos grasos ω-3 puede aumentar el estrés oxidativo, es conveniente combinar Ia adición de estos ácidos grasos a alimentos con Ia adición simultánea de antioxidantes tales como el extracto supercrítico de romero o el alfa-tocoferol. Dichos antioxidantes, tal como se ha mencionado anteriormente, son conocidos en el estado de Ia técnica, si bien no era conocida hasta ahora su importante acción sinérgica al combinarlos con aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA.
El extracto supercrítico de romero, además de contribuir a reducir el estrés oxidativo provocado por los ácidos grasos ¡nsaturados, tiene potenciales efectos preventivos de enfermedades muy graves, además de ser un excelente conservante alimentario natural. Para Ia realización de Ia invención puede usarse el extracto supercrítico de romero comercializado por Flavex (Austria), por ejemplo, o bien el preparado mediante extracción con CO2 supercrítico a presiones comprendidas entre 150 y 250 bares y temperaturas comprendidas entre 40 y 70 0C.
Por otro lado, el alfa-tocoferol presenta importantes ventajas como antioxidante, tal y como se ha mencionado. Para Ia realización de Ia invención se puede emplear el alfa-tocoferol comercializado por Roche, por ejemplo.
La interacción sinérgica de los ácidos grasos poliinsaturados del aceite de salmón enriquecido, el alfa-tocoferol y el extracto supercrítico de romero, permite lograr una relación ω-3 / ω-6 inferior a 5 y mantenerla durante Ia elaboración, conservación y preparación culinaria del producto alimenticio al que se añade Ia mezcla oleosa. Dicha acción sinérgica se traduce, además, en el mantenimiento de Ia actividad antioxidante del alfa-tocoferol y del extracto supercrítico de romero, así como en el mantenimiento tanto del contenido de alfa-tocoferol como del contenido de diterpenos fenólicos del extracto supercrítico de romero en el producto alimenticio al que se añade Ia mezcla oleosa de Ia invención.
En una realización particular de Ia invención, Ia mezcla oleosa comprende:
- un 70-99,9% de aceite de salmón enriquecido entre eMO y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001 -1 % de alfa-tocoferol, y
- un 0,1-5% de extracto supercrítico de romero, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa
En una realización preferida, Ia mezcla oleosa comprende:
- un 80-97% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001-0,1 % de alfa-tocoferol, y
- un 1-3% de extracto supercrítico de romero, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
En una realización aún más preferida, Ia mezcla oleosa comprende: - un 82% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,08% de alfa-tocoferol, y
- un 1 ,6% de extracto supercrítico de romero, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
En otra realización particular de Ia invención, Ia mezcla oleosa comprende, además, microalga Dunaliella salina. Dicha microalga, tal y como se ha comentado anteriormente, es una de las más empleadas en alimentación por Io que su toxicidad está bien evaluada y, por tanto, su empleo no supone riesgos para Ia salud. La microalga Dunaliella salina presenta un importante contenido en carotenoides que pueden potenciar Ia acción antioxidante del alfa-tocoferol y del extracto supercrítico de romero y que, además, tienen propiedades preventivas de enfermedades específicas como algunas relacionadas con Ia visión. La acción sinérgica entre el alfa- tocoferol y el extracto supercrítico de romero permite mantener dicho contenido de carotenoides en el producto alimenticio al que se incorpora Ia mezcla oleosa de Ia invención.
Para Ia realización de Ia invención se puede usar Ia microalga Dunaliella salina comercializada por Nature Beta Technologies (NBT) Ltd. (Israel), por ejemplo.
En una realización preferida de Ia invención, Ia mezcla oleosa comprende un 0,1-20%, preferiblemente un 3-18% y, más preferiblemente, un 16% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
En otro aspecto, Ia invención proporciona un producto alimenticio enriquecido con una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales que comprende aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA, alfa- tocoferol y extracto supercrítico de romero, tal y como se ha detallado previamente.
En una realización particular, dicho producto alimenticio está enriquecido con una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales que comprende aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA, alfa- tocoferol y extracto supercrítico de romero y, además, microalga Dunaliella salina.
En una realización preferida de Ia invención, dicho producto alimenticio enriquecido comprende:
- un 0,1-20% de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA entre el 10 y el 40%, - un 0,00001-1 % de alfa-tocoferol,
- un 0,001-5% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente,
- un 0,01-5% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso respecto al peso total de producto alimenticio.
En una realización aún más preferida de Ia invención, dicho producto alimenticio enriquecido comprende:
- un 1-10% de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA entre el 10 y el 40%, - un 0,001-0,5% de alfa-tocoferol,
- un 0,01-3% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, un 0,1-3% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso respecto al peso total de producto alimenticio.
Asimismo, en una realización aún más preferida de Ia invención, dicho producto alimenticio enriquecido comprende:
- un 5% de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA entre eMO y el 40%,
- un 0,005% de alfa-tocoferol, - un 0,1 % de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, un 1 % de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso respecto al peso total de producto alimenticio.
El aceite de salmón se enriquece con EPA y DHA en una proporción que va del 10 al 40% en peso respecto al peso total de aceite. En una realización preferida, el aceite de salmón está enriquecido en un 18% en EPA y un 12% en DHA en peso respecto al peso total de aceite.
Para llevar a cabo Ia invención se pueden emplear el aceite de salmón enriquecido con un 18% en EPA y un 12% en DHA comercializado por Productos Químicos de Murcia S.A., por ejemplo.
El producto alimenticio enriquecido de Ia invención presenta un contenido de ácidos grasos poliinsaturados con una relación de ácidos grasos poliinsaturados ω-6/ω-3 inferior a 5, Io que supone importantes beneficios para Ia salud humana, tal y como se ha explicado previamente.
Dicha relación, gracias a Ia interacción sinérgica de los ácidos grasos ω-3, el alfa-tocoferol y el extracto supercrítico de romero, se mantiene a Io largo de los procesos de elaboración, conservación y posterior tratamiento culinario de los productos alimenticios así enriquecidos.
En una realización particular, el producto alimenticio enriquecido de Ia invención es un producto cárnico. Preferiblemente, el producto alimenticio enriquecido de Ia invención es un producto cárnico que se selecciona del grupo que comprende salchichas tipo frankfurt, jamón cocido, pechuga de pavo cocida, chorizo curado, salchichón curado, lomo curado y jamón curado.
En otro aspecto, Ia invención proporciona un procedimiento para Ia preparación de dicho producto alimenticio enriquecido que comprende las etapas de: a) preparar una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales mezclando dichos ingredientes bioactivos naturales, y b) incorporar Ia mezcla oleosa preparada en a) al producto alimenticio a enriquecer.
En una realización particular de dicho procedimiento, los ingredientes bioactivos naturales se mezclan en una proporción de:
- un 70-99,9% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001-1 % de alfa-tocoferol,
- un 0,1-5% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente,
- un 0,1-20% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
En una realización preferida del procedimiento de Ia invención, los ingredientes bioactivos naturales se mezclan en una proporción de:
- un 80-97% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001-0,1 % de alfa-tocoferol,
- un 1-3% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente,
- un 3-18% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
En una realización aún más preferida del procedimiento de Ia invención, los ingredientes bioactivos naturales se mezclan en una proporción de:
- un 82% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA, - un 0,08% de alfa-tocoferol,
- un 1 ,6% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente,
- un 16% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
Así pues, para Ia preparación de los productos alimenticios enriquecidos de Ia invención, se pesan las cantidades adecuadas de cada uno de los ingredientes funcionales y se mezclan posteriormente hasta obtener un producto oleoso y ligeramente coloreado.
En el caso de que el producto alimenticio a enriquecer sea un producto cárnico como las salchichas de tipo frankfurt, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se añade en Ia operación de mezcla y formación de Ia emulsión cárnica. A continuación se procede a embutir Ia emulsión, a Ia cocción de las salchichas, a su envasado a vacío, y a su conservación en refrigeración durante un periodo máximo que oscila entre 30 y 90 días.
Para el caso de jamón cocido enriquecido, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se inyecta en las piezas crudas de jamón junto con Ia . salmuera. A continuación se introducen las piezas en un bombo de masaje para conseguir Ia difusión interna de Ia mezcla de compuestos bioactivos de manera uniforme en el interior de Ia carne. Posteriormente, se procede a Ia cocción de las piezas, a su envasado a vacío, y a su conservación en refrigeración durante un periodo máximo que oscila entre 30 y 90 días.
Para Ia preparación de pechuga de pavo cocida enriquecida, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se inyecta en las piezas crudas de pechuga junto con Ia salmuera. A continuación se introducen las piezas en un bombo de masaje para conseguir Ia difusión interna de Ia mezcla de compuestos bioactivos de manera uniforme en el interior de Ia carne. A continuación se procede a Ia cocción de las piezas, su envasado a vacío, conservación en refrigeración durante un periodo máximo que oscila entre 30 y 90 días.
Para Ia preparación de lomo curado enriquecido, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se inyecta en las piezas crudas de lomo. A continuación se procede a embutir Ia carne y al curado de Ia misma.
Para Ia preparación de jamón curado enriquecido, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se deposita en Ia superficie de las piezas crudas de jamón junto con Ia sal. Las piezas se someten luego a prensado suave y a curado.
Para Ia preparación de chorizo curado enriquecido, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se mezcla junto con Ia carne picada y las especias. A continuación se procede a embutir Ia mezcla y al curado de Ia misma.
Para Ia preparación de salchichón curado enriquecido, Ia mezcla oleosa de ingredientes bioactivos se mezcla junto con Ia carne picada y las especias. A continuación se procede a embutir Ia mezcla y al curado de Ia misma.
Así pues, resumiendo, gracias a Ia adición de Ia mezcla oleosa sinérgica de Ia invención, el producto alimenticio enriquecido presenta las siguientes ventajas:
1. Presenta una relación ω-6 / ω-3 inferior a 5, manteniendo dicho perfil de ácidos grasos a Io largo de los procesos de elaboración, sí como durante su vida útil y en las operaciones de preparación culinaria del mismo tales como Ia fritura.
2. No presenta un incremento significativo de su índice de oxidación por el hecho de haberle incorporado PUFA, sino que éste se mantiene prácticamente inalterado durante su elaboración, conservación y preparación culinaria.
3. No presenta un descenso significativo de Ia actividad antioxidante de los productos antioxidantes añadidos durante su elaboración, conservación y preparación culinaria.
4. No presenta cambios significativos del contenido de alfa-tocoferol durante su elaboración, conservación y preparación culinaria.
5. No presenta cambios significativos del contenido de diterpenos fenólicos que aporta el extracto supercrítico de romero durante su elaboración, conservación y preparación culinaria.
6. No presenta alteraciones significativas de los carotenoides que aporta Ia microalga Dunalliela salina durante su elaboración, conservación y preparación culinaria.
A continuación se presentan dos ejemplos de productos alimenticios enriquecidos que cubren todas las operaciones posibles de procesado de productos cárnicos:
• Ejemplo 1. Salchichas tipo frankfurt, en las que se pone de manifiesto la consecución y mantenimiento de las propiedades mencionadas en un proceso con cocción, conservación durante 60 días en refrigeración y a vacío, y posterior fritura • Ejemplo 2. Chorizo ibérico curado, en el que se pone de manifiesto Ia consecución y mantenimiento de las propiedades mencionadas en un proceso con 50 días de curado.
5 Dichos ejemplos se exponen para una mejor comprensión de Ia invención. En ningún caso deben considerarse una limitación del alcance de Ia misma.
MÉTODOS
0
1. Perfil de ácidos grasos
Extracción: se evaluaron diversos métodos para Ia extracción de Ia fracción lipídica presente en las muestras: a) hexano, b) hexano/metanol, y c) hexano/agua (5/1 ). Los métodos a) y b) dieron lugar a Ia aparición de 5 interfases que hacían difícil Ia separación de Ia fase hexano. El método c) fue el único de los probados que permitió una correcta separación de Ia fase hexano, por Io que fue elegido para el resto de extracciones.
Protocolo de extracción de los lípidos: 5 gramos de muestra fueron triturados previamente con el fin de homogeneizar Ia muestra.
0 Posteriormente, se tomó 1 g de cada muestra en un vial falcon de 50 mi de capacidad y se añadieron 5 mi de H2O milli-Q, y seguidamente 25 mi de hexano. Se agitó vigorosamente Ia muestra con un Ultra Turrax durante 1 minuto y se recogió Ia fase sobrenadante. En algunos casos se hizo necesaria una etapa de centrifugación para una completa separación de Ia
5 fase acuosa y Ia fase hexano. Dicha centrifugación se llevó a cabo a 3800 rpm durante 5 minutos. Con el fin de garantizar que Ia mayor parte de Ia grasa presente en Ia muestra hubiera sido extraída, se efectuó una segunda extracción con 25 mi de hexano. En cada extracto el hexano fue evaporado hasta peso constante en rota-vapor a 40 0C, y el residuo obtenido se guardó
¡0 en un vial en atmósfera de Nitrógeno y protegido de Ia luz.
Protocolo de derivatización de los extractos: Se prepararon disoluciones de concentración 25 mg/ml (para las muestras sin aceite de salmón) y 50 mg/ml (para las muestras con aceite de salmón) de los extractos en cloroformo/metanol 2/1 (v/v). Se metilaron 0,5 mi de dichas disoluciones con NaOH en metanol (0,1 M), a 60 0C durante 30 min. A continuación, Ia derivatización se detuvo con Ia adición de 0,2 mi de agua mQ. Posteriormente los ácidos grasos metil éster formados fueron extraídos dos veces con 1 mi de hexano. Con el fin de eliminar el agua residual en Ia fase hexano, las fracciones se secaron con sulfato sódico anhidro.
Método cromatográfico para el análisis lipídico: Los análisis fueron llevados a cabo en un cromatógrafo Perkin-Elmer autosystem XL, con una columna BTR-Carbowax, de dimensiones: L = 30 m; I. D.: 250 μm; espesor de fase: 0,25 μm. EI método cromatográfico fue el siguiente:
Temperatura del inyector: 220 0C Programa de temperatura del horno: 100 0C —180 0C (a 20 °C/min) —
220 °C (a 15 °C/m¡n) (33 min)
Temperatura del detector FID: 230 0C
Tiempo total de análisis: 40 min.
Presión He: 4 bares (4 .1O5 Pa) Presión Aire sintético: 4 bares (4 .1O5 Pa)
Presión Hidrógeno: 2 bares (2 .1O5 Pa)
Presión Cabeza de columna: 12 bares (12 .1O5 Pa)
Flujo He: 1 ml/min.
Split Ratio: 20: 1 Volumen inyección: 1 μl
Los tiempos de retención de los distintos ácidos grasos metil esteres fueron determinados inyectando una disolución de 20 mg/ml (en hexano) de PUFA N°1 Marine Source, Supelco (4-7033). 2. índice de oxidación
E! método se basa en Ia cuantificación del malondialdehído (MDA) originado como compuesto final de Ia oxidación de lípidos. Para Ia medida de dicho compuesto se procedió a su extracción de Ia muestra mediante ácido tricloroacético y su posterior cuantificación por reacción colorimétrica con ácido tiobarbitúrico, que dio lugar a Ia formación de un aducto de color rosa, que presentaba un máximo de absorbancia a 531 nm. A continuación se detalla el método de cuantificación utilizado: se tomaron 10 g de muestra (± 0,005 g) anotando su peso, se añadieron 20 mi de ácido tricloroacético al 10% y se homogeneizó Ia muestra durante 30 segundos a 20000 rpm.
Posteriormente se centrifugó durante 30 minutos a 4000 rpm a 10 0C. Una vez centrifugada, se filtró Ia muestra y se tomaron 2 mi del sobrenadante en un tubo de ensayo. A estos 2 mi de sobrenadante se Ie adicionaron otros 2 mi de una disolución de ácido tiobarbitúrico (TBA, 300 mg/100 mi), se mezclaron con vortex, se taparon con papel de aluminio y se mantuvieron los tubos durante 20 minutos en un baño de agua a ebullición. Posteriormente se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se midió el color formado a 531 nm. Con el fin de evaluar el color propio de Ia muestra se llevaron a cabo ensayos en blanco, de igual forma que con las muestras pero sustituyendo los 2 mi de TBA por 2 mi de agua.
3. Actividad antioxidante
La extracción de los compuestos añadidos se llevó a cabo mediante Ia adición de etanol (20 mi de etanol por 10 g de muestra) y el filtrado obtenido tras Ia centrifugación se llevo a sequedad. El residuo seco obtenido en cada caso se disolvió en etanol a una concentración de 15 mg/ml. Se utilizaron 0,1 mi de esta disolución para medir Ia capacidad antioxidante de los diferentes compuestos mediante el método del blanqueamiento del β-caroteno, Io que dio lugar a una concentración del compuesto estudiado en el medio de reacción de 60 μg/ml. El método del blanqueamiento del β-caroteno mide Ia capacidad de una sustancia que posee un efecto potencialmente antioxidante para inhibir Ia oxidación del β-caroteno cuando se encuentra en un medio emulsionado con ácido linoleico en condiciones pro-oxidantes.
4. Análisis de tocoferoles
Preparación de las muestras
Para cuantificar el contenido de tocoferoles del aceite de salmón suministrado a las muestras se inyectaron directamente 20 μl de aceite en
HPLC. De cada muestra se tomaron 10 g y se mezclaron con 20 mi de etanol. Se homogeneizó en el ultraturrax por 1 min y se centrifugó. El sobrenadante se pasó por un filtro y se concentró en un rotavapor a sequedad. Después se añadieron 2 mi de etanol. Los concentrados fueron pasados por un filtro e inyectados en HPLC para su análisis usando una columna de fase revesa (Nova-Pak C18 6OA 4μm 3,9 x 150 mm, Waters) y fueron desarrolladas a un flujo de 1 ml/min siguiendo un método ¡socrático de una mezcla de 97% metanol en 1 % ácido acético (v/v) durante 20 min. La detección de los picos se realizó con un detector de fotodiodos para identificar los picos por su tiempo de retención y su espectro según los estándares mencionados y se cuantificó a una longitud de onda máxima para Ia mayoría de los compuestos (295 nm).
Para Ia cuantificación de las áreas detectadas se realizaron curvas de calibrado usando patrones de tocoferoles para cuantificar los picos de correspondientes de las muestras.
5. Antioxidantes del extracto de romero
Método de extracción: Se pesaron 10 gramos de cada una de las muestras y se les añadió 20 mi de acetona. Después de la homogeneización durante 1 minuto en el ultraturrax, se mantuvieron en reposo durante 2 horas para favorecer Ia separación de las fases. Posteriormente se centrifugaron a
3500 r.p.m durante 30 minutos. El sobrenadante se filtró a través de papel de filtro y se evaporó posteriormente en el rotavapor.
Método cromatográfico: Los análisis se llevaron a cabo en un equipo de HPLC con una columna Nova Pack Ci8 de 150 mm de longitud, 4,6 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 3,5 μm. La fase móvil utilizada en Ia separación consistió en una mezcla de solventes A (acetonitrilo con 1% de ácido acético) y B (agua con 1% de ácido acético). Se varió Ia composición de Ia fase móvil de acuerdo con un gradiente de 30 minutos, comenzando por un 50% de B durante 5 minutos, 30% de B a los 15 minutos y alcanzando 0% de B a los 30 min. El flujo se mantuvo durante toda Ia separación a 0,7 ml/min. La detección de los compuestos se realizó con un detector de haz de diodos en un rango de longitud de onda desde 200 hasta 450 nm. La ranura de detección se estableció en 4 nm y el intervalo de muestreo en 200 ms. La longitud de onda elegida para Ia detección de los compuestos fue de 230 nm. El equipo estaba equipado con un inyector de
20 μl de capacidad.
6. Perfil de carotenoides
Extracción de carotenoides de las microalgas: Se prepararon extractos de 0,05 g/ml de Spirulina y Dunaliella en éter de petróleo: acetona
(1 :1 ) para comparar Ia concentración de carotenoides de ambas algas. Se preparó un extracto de 0,005 g/ml de Dunaliella (correspondiendo al 1 % añadido a muestras) en éter de metilo tere-butilo para cuantificar Ia pérdida de carotenoides que se produce en Ia extracción de carotenoides por hacerse una única extracción en las muestras. Se realizó una segunda extracción para corroborar los datos experimentales con los bibliográficos.
Extracción de carotenoides de las muestras De cada muestra se pesó
5 g y se trituró durante 1 min a intervalos de 5 seg de pausa en una picadora domestica. Se tomaron 5 g del picadillo y se mezclaron con 10 mi de éter de metilo tere-butilo. La mezcla se homogeneizó en un Ultraturrax durante 1 min y se dejó reposar hasta que las dos fases se separaron (en oscuridad). El supemadante (20 μl) fue inmediatamente inyectado en el HPLC para su análisis.
5 Análisis por HPLC: Las muestras y los patrones se inyectaron en un
HPLC usando una columna de fase inversa (Microsorb C18, 250 x 4,6 mm de Varían) y fueron desarrolladas a un flujo de 1 ml/min siguiendo un gradiente donde se comenzó con 50% de mezcla B que se incrementó en 14 min hasta 100% B y se mantuvo hasta final del desarrollo a los 53 minutos.
IO Las mezclas de disolventes empleados fueron: como mezcla A: diclorometano: metanol: acetonitrilo: agua (0:60:5:35) y como mezcla B: diclorometano: metanol: acetonitrilo: agua (25:28:42,5:4,5). La detección de los picos se realizó con un detector de fotodiodos para identificar los picos por su tiempo de retención y su espectro según los estándares mencionados
15 y se cuantificó a una longitud de onda máxima para Ia mayoría de los compuestos (450 nm). Para Ia cuantificación de las áreas detectadas se realizaron curvas de calibrado usando luteína para cuantificar los picos de luteína de las muestras. Los picos de β-caroteno y 9-cis-β-caroteno se cuantificaron con Ia recta obtenida de Ia curva de β-caroteno debido a Ia
.0 similitud de su espectro.
EJEMPLO 1. Salchichas tipo frankfurt.
PREPARACIÓN
,5 Una vez obtenida Ia emulsión cárnica convencional para Ia fabricación de las salchichas tipo frankfurt, se añaden a dicha emulsión las siguientes cantidades de los ingredientes de Ia mezcla oleosa, por Kg. de pasta cárnica:
- 50 gramos de aceite de salmón desodorizado y enriquecido en un 50 18% en EPA y un 12% en DHA
- 1 gramo de extracto supercrítico de romero - 0,05 gramos de alfa-tocoferol
- 10 gramos de Dunaliella salina
La mezcla oleosa se añade a Ia pasta cárnica en una mezcladora con el fin de obtener una emulsión con una distribución homogénea de los ingredientes de Ia mezcla oleosa. Posteriormente se realiza el embutido y Ia cocción a 70 0C durante 60 minutos. A continuación las salchichas se envasan a vacío y se mantienen en refrigeración a 5 0C durante 90 días. La fritura se realiza a 180 0C durante tres minutos.
RESULTADOS
En Ia siguiente Tabla 1.1. se presenta el perfil lipídico de las salchichas determinado tras las operaciones de procesado y diversos tiempos de conservación.
Figure imgf000031_0001
Pasta Pasta Salchicha Salchicha a 21 Salchicha a 60 Salchicha
Control sin cocida días de días de frita embutir conservación conservación σ
Mirístico (C14:0) 1 ,4 3,0 3,0 2,1 2,1 2,9 L-,
Palmítico (C16:0) 25,0 23,0 23,9 23,7 22,9 23,5 "D
Palmitoleico (C16:1) 2,3 4,4 4,1 4,0 3,9 4,2 O
Esteárico (C18:0) 12,4 10,7 11,4 11,9 11,3 11,0 O Φ
Oleico (C18:1) 40,7 35,0 36,1 36,9 35,3 36,0
Linoleico (C18:2) n-6 14,7 12,3 12,5 12,4 12,1 12,6 1
Linolenico (C18:3) n-3 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,8 3
Estearidonico (C 18:4) n-3 O1O 0,6 0,5 0,4 0,4 0,5 o_ CD
Q)
C20:1 0,6 0,8 0,7 0,9 0,7 0,7
EPA (C20:5) n-3 0,0 4,5 3,3 3,2 3,2 3,5 Φ
S>«
DPA (C22:5) n-3 0,0 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 O
DHA (C22:6) n-3 0,0 2,6 1 ,5 1,5 2,0 2,0 α 8
(Q saturados 38,8 36,7 38,3 37,6 36,2 37,4 3 monoinsaturados 43,7 40,2 41,0 41 ,8 40,0 41,0 o n-6 14,7 12,3 12,5 12,4 12,1 12,6 <fí n-3 0,8 8,9 6,3 6,2 6,6 7,1 n-6/n-3 17,9 1 ,4 2,0 2,0 1 ,8 1 ,8
De los datos de Ia Tabla 1.1. puede deducirse en primer lugar que con Ia adición de 50g/kg de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA se reduce Ia relación ω-6 / ω-3 desde 17,9 hasta un valor inferior a 2, que se mantiene durante todo el proceso de elaboración, conservación y preparación culinaria. Además, se demuestra igualmente el mantenimiento del perfil lipídico.
El mantenimiento de Ia actividad antioxidante de Ia mezcla oleosa durante el procesado y Ia conservación es imprescindible para que se consigan los fines pretendidos. Además, Ia actividad antioxidante contribuye al mantenimiento del perfil lipídico ya que los PUFA son oxidables.
En Ia Tabla 1.2. los datos relativos al índice de oxidación de las salchichas.
Tabla 1.2. índice de oxidación
Pasta Pasta Salchicha Salchicha a Salchicha a Salchicha control sin cocida 21 días de 60 días de frita embutir conservación conservación mg 0,10 0,27 0,32 0,29 0,32 0,35
MDA/Kg salchicha
Aun con Ia adición de una cantidad apreciable de PUFA, el índice de oxidación se mantiene en valores bajos durante todo el procesado y Ia conservación. Este resultado es coincidente con el resto de los presentados y confirma el mantenimiento del perfil lipídico de PUFA, y por tanto Ia relación ω-3 6 / ω-3, así como el de Ia actividad antioxidante de los integrantes de Ia mezcla oleosa.
En Ia Tabla 1.3. se presentan se presentan los resultados de Ia determinación de Ia actividad antioxidante de las salchichas. Tabla 1.3. Actividad antioxidante
Pasta Pasta Salchicha Salchicha a Salchicha a Salchicha control sin cocida 21 días de 60 días de frita embutir conservación conservación
Actividad 19,23% 68,73% 57,48% 56,58% 51,80% 63,66%
Antioxidante
La incorporación de Ia mezcla oleosa aumenta en un factor de 3,4 veces Ia actividad antioxidante determinada en las salchichas antes del proceso. Dicha actividad antioxidante se reduce ligeramente durante las operaciones de procesado y Ia conservación pero durante Ia vida útil se mantiene en un factor nunca inferior a 2,5 sobre el producto sin mezcla oleosa.
El aumento de Ia actividad antioxidante tras Ia fritura puede deberse al efecto de Ia adsorción del aceite usado (aceite de oliva virgen).
En Ia Tabla 1.4. se presentan los resultados de los análisis de alfa- tocoferol en las salchichas. La presencia de alfa-tocoferol en las salchichas al final del procesado y Ia conservación es un indicador más de Ia alta actividad antioxidante de Ia mezcla oleosa.
Efectivamente, en un experimento paralelo en el que solamente se añadió aceite de salmón más alfa-tocoferol a las salchichas, no se pudo detectar al alfa-tocoferol incluso antes de Ia cocción, siendo Ia actividad antioxidante en ese punto de 32,92%, es decir, menos de Ia mitad de Ia obtenida cuando se añadió Ia mezcla oleosa completa. Esto constituye una demostración de Ia sinergia entre el alfa-tocoferol v el extracto supercrítíco de romero. Tabla 1.4. Concentración de alfa-tocoferol
Pasta Pasta Salchicha Salchicha a Salchicha a Salchicha control sin cocida 21 días de 60 días de frita embutir conservación conservación μg/g alfa- tocoferol 0,0 30,0 14,5 11 ,5 10,2 8,7
La presencia de componentes del extracto supercrítico de romero es un indicador de su permanencia en las salchichas a Io largo de todo el proceso. En Ia Tabla 1.5 se presentan los resultados del análisis de ácido carnósico el componente antioxidante más activo del extracto supercrítico de romero y por otro lado el más lábil.
Tabla 1.5. Concentración de ácido carnósico
Pasta Pasta Salchicha Salchicha a Salchicha a Salchicha control sin cocida 21 días de 60 días de frita embutir conservación conservación mg/10g ácido 0,0 224,9 198,5 167,6 141 ,9 140,2 carnósico
Aunque se aprecia Ia disminución de Ia cantidad de ácido carnósico presente en las salchichas al avanzar el proceso y Ia conservación, Ia presencia de este compuesto en concentración apreciable al final del proceso, incluyendo Ia preparación culinaria, queda demostrada.
La Tabla 1.6. recoge los resultados de los análisis de carotenoides en las salchichas. Estos compuestos son aportados por Ia microalga Dunaliella salina. Tabla 1.6. Concentración de carotenoides
Pasta Pasta Salchicha Salchicha a Salchicha a Salchicha control sin cocida 21 días de 60 días de frita embutir conservación conservación mg/g de luteína 0,001 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02 mg/g de 0,004 0,42 0,37 0,37 0,28 0,41 betacaroteno
Aunque se observan algunas oscilaciones, se comprueba que los carotenoides se mantienen durante todo el proceso. El incremento en las últimas etapas puede deberse a Ia liberación de estos compuestos del interior de las células de Ia microalga.
CONCLUSIÓN
La incorporación de Ia mezcla oleosa en las salchichas tipo frankfurt aporta una actividad antioxidante, un contenido en antioxidantes naturales y una relación ω-6 / ω-3 >5 que se mantienen durante el proceso, Ia conservación y Ia preparación culinaria.
EJEMPLO 2. Chorizo ibérico curado.
PREPARACIÓN
A los ingredientes tradicionales del chorizo ibérico tradicional, se añaden las siguientes cantidades de los ingredientes de Ia mezcla oleosa, por Kg. de pasta cárnica:
- 50 gramos de aceite de salmón desodorizado y enriquecido en un 18% en EPA y un 12% en DHA
- 1 gramo de extracto supercrítico de romero
- 0,05 gramos de alfa-tocoferol
- 10 gramos de Dunaliella salina A continuación se procede al amasado de Ia mezcla en una amasadora industrial a vacío, al embutido y al curado hasta 50 días.
RESULTADOS
En Ia siguiente Tabla 2.1. se presenta el perfil lipídico del chorizo curado determinado tras las operaciones de procesado y diversos tiempos de conservación.
Tabla 2.1. Porcentaje molar de ácidos grasos determinado
0
Mezcla Chorizo Chorizo Chorizo control 25 días de 50 días de curación curación
Mirístico (C14:0) 1 ,3 3,9 3,0 2,2
Palmítico (C16:0) 27,5 25,2 26,5 26,5 palmitoleico (C16:1) 2,6 5,6 4,8 4,5
Esteárico (C18:0) 12,7 10,8 11 ,7 12,0
Oleico (C18:1) 46,6 36,5 40,1 40,6
Linoleico (C18:2) n-6 6,1 5,1 5,2 6,2
Linolenico (C18:3) n-3 0,4 0,5 0,3 0,5
!0
Estearidonico (C18:4) n-3 0,0 0,7 0,3 0,4
C20:1 0,7 0,8 0,8 0,8
EPA (C20:5) n-3 O1O 5,3 3,0 2,3
DPA (C22:5) n-3 0,0 0,4 0,3 0,3
DHA (C22:6) n-3 0,0 3,2 2,0 1 ,5
!5
Saturados 41 ,6 39,9 41 ,2 40,8 monoinsaturados 49,9 42,9 45,6 46,0 n-6 6,1 5,1 5,2 6,2
;o n-3 0,4 10,1 5,9 5,0 n-6/n-3 14,2 0,5 0,9 1 ,2 De los datos de Ia Tabla 2.1. puede deducirse en primer lugar que con
Ia adición de 50g/kg de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA se reduce Ia relación ω-6 / ω-3 desde 14,2 hasta un valor próximo a 1 , que se mantiene durante todo el proceso de elaboración, incluyendo un periodo de curación de 50 días.
En cuanto a las determinaciones de actividad antioxidante, alfa- tocoferol, ácido carnósico, carotenoides e índice de oxidación, los resultados son análogos a los presentados para las salchichas.
CONCLUSIÓN
La incorporación de Ia mezcla oleosa en el chorizo ibérico curado aporta una actividad antioxidante, un contenido en antioxidantes naturales y una relación ω-6 / ω-3 >5 que se mantienen durante el proceso completo, incluido el curado durante 50 días.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales para usar en Ia preparación de un producto alimenticio enriquecido, caracterizada porque comprende aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA, alfa- tocoferol y extracto supercrítico de romero.
2. Mezcla oleosa según Ia reivindicación 1 , caracterizada porque comprende:
- un 70-99,9% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001 -1 % de alfa-tocoferol, y
- un 0,1-5% de extracto supercrítico de romero, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
3. Mezcla oleosa según Ia reivindicación 2, caracterizada porque comprende:
- un 80-97% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001 -0,1 % de alfa-tocoferol, y
- un 1-3% de extracto supercrítico de romero, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
4. Mezcla oleosa según Ia reivindicación 3, caracterizada porque comprende:
- un 82% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,08% de alfa-tocoferol, y
- un 1 ,6% de extracto supercrítico de romero, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
5. Mezcla oleosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende, además, microalga Dunaliella salina.
6. Mezcla oleosa según Ia reivindicación 5, caracterizada porque comprende un 0,1-20%, preferiblemente un 3-18% y, más preferiblemente, un 16% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
7. Un producto alimenticio enriquecido con una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales que comprende aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA, alfa-tocoferol y extracto supercrítico de romero.
8. Producto alimenticio enriquecido según Ia reivindicación 7, caracterizado porque Ia mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales comprende, además, microalga Dunaliella salina.
9. Producto alimenticio enriquecido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque comprende:
- un 0,1-20% de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA entre el 10 y el 40%,
- un 0,00001-1 % de alfa-tocoferol,
- un 0,001-5% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, - un 0,01-5% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso respecto al peso total de producto alimenticio.
10. Producto alimenticio enriquecido según Ia reivindicación 9, caracterizado porque comprende:
- un 1-10% de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA entre el 10 y el 40%,
- un 0,001-0,5% de alfa-tocoferol, - un 0,01-3% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, un 0,1-3% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso respecto al peso total de producto alimenticio.
11. Producto alimenticio enriquecido según Ia reivindicación 10, caracterizado porque comprende:
- un 5% de aceite de salmón enriquecido en EPA y DHA entre el 10 y el 40%, - un 0,005% de alfa-tocoferol,
- un 0,1 % de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, un 1% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso respecto al peso total de producto alimenticio.
12. Producto alimenticio enriquecido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 , caracterizado porque presenta un contenido de ácidos grasos poliinsaturados con una relación de ácidos grasos poliinsaturados ω-6/ω-3 inferior a 5.
13. Producto alimenticio enriquecido según Ia reivindicación 12, caracterizado porque es un producto cárnico.
14. Producto alimenticio enriquecido según Ia reivindicación 13, caracterizado porque el producto cárnico se selecciona del grupo que comprende salchichas tipo frankfurt, jamón cocido, pechuga de pavo cocida, chorizo curado, salchichón curado, lomo curado y jamón curado.
15. Un procedimiento para Ia preparación de un producto alimenticio enriquecido según cualquiera de las reivindicaciones 7-14, caracterizado porque comprende las etapas de:
a) preparar una mezcla oleosa a base de ingredientes bioactivos naturales mezclando dichos ingredientes bioactivos naturales, y b) incorporar Ia mezcla oleosa preparada en a) al producto alimenticio a enriquecer.
16. Procedimiento según Ia reivindicación 15, caracterizado porque los ingredientes bioactivos naturales se mezclan en una proporción de:
- un 70-99,9% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en
EPA y DHA,
- un 0,001-1 % de alfa-tocoferol,
- un 0,1-5% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente,
- un 0,1-20% de microalga Dunaliella salina,
siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
17. Procedimiento según Ia reivindicación 16, caracterizado porque los ingredientes bioactivos naturales se mezclan en una proporción de: - un 80-97% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,001-0,1% de alfa-tocoferol,
- un 1-3% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente, - un 3-18% de microalga Dunaliella salina, siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
18. Procedimiento según Ia reivindicación 17, caracterizado porque los ingredientes bioactivos naturales se mezclan en una proporción de:
- un 82% de aceite de salmón enriquecido entre el 10 y el 40% en EPA y DHA,
- un 0,08% de alfa-tocoferol, - un 1 ,6% de extracto supercrítico de romero y, opcionalmente,
- un 16% de microalga Dunaliella salina,
siendo dichos porcentajes en peso con respecto al peso total de mezcla oleosa.
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