PT1826265E - Materiais e métodos para a modificação do teor de lenhina de plantas - Google Patents

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Ilkka Jaakko Havukkala
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Description

ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Materiais e métodos para a modificação do teor de lenhina de plantas"
CAMPO TÉCNICO DO INVENTO
Este invento refere-se a polinucleótidos que se crê serem novos, incluindo sequências parciais e prolongadas bem como sondas e iniciadores, construções compreendendo os polinucleótidos, materiais biológicos (incluindo plantas, microrganismos e organismos multicelulares) incorporando os polinucleótidos, polipéptidos codificados pelos polinucleótidos e métodos para utilização dos polinucleótidos e polipéptidos. 0 invento refere-se, mais particularmente, à modificação do teor e composição da lenhina em materiais biológicos incluindo plantas, aos polipéptidos envolvidos na via biossintética da lenhina, e aos polinucleótidos codificando tais enzimas.
ANTECEDENTES DO INVENTO A lenhina é um polimero insolúvel que é primariamente responsável pela rigidez dos caules das plantas.
Especificamente, a lenhina serve como matriz em torno dos componentes polissacaridicos de algumas paredes celulares vegetais. Quanto mais elevado for o teor em lenhina, mais rigida é a planta. Por exemplo, as espécies arbóreas sintetizam grandes quantidades de lenhina, com a lenhina a constituir entre 20% a 30% do peso seco da madeira. Para além de proporcionar rigidez, a lenhina ajuda no transporte de água dentro das plantas tornando as paredes celulares hidrófobas e impermeáveis à água. A lenhina tem também um papel na resistência a doenças das plantas impedindo a penetração e propagação de agentes patogénicos. A elevada concentração de lenhina em árvores apresenta um problema significativo na indústria do papel em que têm de ser empregues recursos consideráveis para separar a lenhina das fibras de celulose necessárias para a produção de papel. Os métodos tipicamente empregues para a remoção de lenhina são muito dispendiosos energeticamente e quimicamente, 2 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ resultando em maiores custos e maiores níveis de resíduos indesejáveis. Só nos EUA, são removidos cerca de 20 milhões de toneladas de lenhina da madeira por ano. A lenhina é grandemente responsável pela digestibilidade, ou falta desta, das culturas forrageiras, com pequenos aumentos do teor de lenhina nas plantas a resultar em diminuições relativamente elevadas na digestibilidade. Por exemplo, culturas com reduzido teor de lenhina proporcionam forragens mais eficazes para o gado, sendo a produção de leite e carne mais elevada relativamente à quantidade de cultura forrageira consumida. Durante o crescimento normal das plantas, o aumento no teor de matéria seca é acompanhado de uma correspondente diminuição na digestibilidade. Quando se decide sobre o momento óptimo para colher as culturas forrageiras, os agricultores têm portanto de escolher entre uma elevada produção de material menos digestível e uma menor produção de material mais digestível.
Para algumas aplicações, é desejável um aumento no teor de lenhina uma vez que o aumento do teor de lenhina de uma planta conduziria a maior força mecânica da madeira, alterações na sua cor e maior resistência ao apodrecimento. A composição e abundância das espécies de micorrizas podem também ser favoravelmente manipuladas através da modificação do teor de lenhina e da composição estrutural.
Tal como discutido em detalhe abaixo, a lenhina é formada através de polimerização de pelo menos três monolinhóis diferentes que são sintetizados numa via de vários passos, sendo cada passo da via catalisado por uma enzima diferente. Mostrou-se que a manipulação do número de cópias de genes codificando certas enzimas, tais como álcool cinamílico-desidrogenase (CAD) e ácido cafeico-3-Ο-metiltransferase (COMT) resulta na modificação da quantidade de lenhina produzida; ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5451514 e Publicação PCT N°. WO 94/23044. Além disso, mostrou-se que a expressão anti-sentido de sequências codificando CAD em choupo conduz à produção de lenhina possuindo uma composição modificada (Grand C, et al., Planta (Berl.) 163: 232-237, 1985). 3 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
Embora tenham sido isolados para certas espécies de plantas polinucleótidos codificando algumas das enzimas envolvidas na via biossintética da lenhina, os genes codificando muitas das enzimas numa ampla variedade de espécies vegetais não foram ainda identificados. Assim, permanece a necessidade na arte de materiais úteis na modificação do teor e composição da lenhina em plantas e de métodos para a sua utilização.
SUMÁRIO DO INVENTO
Resumidamente, o presente invento proporciona polinucleótidos isolados tal como exposto na reivindicação 1, que incluem o polinucleótido identificado na Listagem de Sequências anexa como SEQ ID NO:161, variantes dessa sequência, construções compreendendo uma tal sequência, sequências prolongadas compreendendo as sequências de SEQ ID NO:161, as quais são todas aqui referidas, colectivamente, como "polinucleótidos do presente invento". Os polinucleótidos do presente invento são de preferência obteníveis a partir de espécies de eucalipto e pinheiro e de preferência codificam enzimas envolvidas na via biossintética da lenhina. São proporcionadas construções incorporando tais sequências, métodos para utilização de tais sequências e construções, e materiais biológicos, incluindo células vegetais e plantas possuindo um teor genómico e/ou de lenhina e composição alterados. 0 presente invento proporciona também sequências polipeptídicas isoladas tal como definidas na reivindicação 17.
Num aspecto, o presente invento proporciona polinucleótidos isolados codificando as seguintes enzimas, ou porções das seguintes enzimas: cinamato-4-hidroxilase (C4H).
Numa concretização, os polinucleótidos do presente invento englobam polinucleótidos compreendendo uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo consistindo em: (a) polinucleótido citado em SEQ ID NO: 161; (b) um complemento inteiro do polinucleótido citado em SEQ ID NO:161; (c) um complemento inverso inteiro da sequência citada em SEQ ID NO:161; e (d) variantes do polinucleótido citado em SEQ ID NO:161 possuindo pelo menos 90% de 4 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ identidade com este e codificando um polipéptido possuindo actividade de cinamato-4-hidroxilase.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona construções compreendendo um polinucleótido do presente invento, sozinho ou em combinação com uma ou mais das sequências do invento, ou em combinação com um ou mais polinucleótidos conhecidos; juntamente com células hospedeiras e células transgénicas compreendendo tais construções.
Num aspecto relacionado, o presente invento proporciona construções compreendendo, na direcção 5'-3', uma sequência promotora de um gene; um enquadramento de leitura aberto codificando para pelo menos uma porção funcional de uma enzima codificada por um polinucleótido do presente invento; e uma sequência de terminação de um gene. Um enquadramento de leitura aberto pode estar orientado numa direcção com sentido ou anti-sentido. São também proporcionadas construções de ADN compreendendo uma região não codificadora de um gene codificando para uma enzima codificada pelos polinucleótidos acima ou um polinucleótido complementar a uma região não codificadora, juntamente com uma sequência promotora de um gene e uma sequência de terminação de um gene. De preferência, as sequências promotora e de terminação de um gene são funcionais numa célula hospedeira, tal como uma célula vegetal. De maior preferência, as sequências promotora e de terminação de um gene são as dos genes originais da enzima mas outras geralmente utilizadas na arte, tais como o promotor do Virus do Mosaico da Couve-flor (CMV), com ou sem estimuladores, tais como a sequência de Kozak ou o estimulador Omega, e o terminador da nopalina-sintetase de Agrobacterium tumefaciens, podem ser utilizadas no presente invento. Promotores específicos de tecidos podem ser empregues para direccionar a expressão para um ou mais tecidos desejados. Numa concretização preferida, a sequência promotora de um gene proporciona transcrição no xilema. A construção pode ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.
Noutro aspecto, são proporcionadas células transgénicas, tais como células vegetais transgénicas, compreendendo as 5 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ construções do presente invento, juntamente com plantas compreendendo tais células transgénicas, e frutos e sementes de tais plantas.
Ainda noutro aspecto, são proporcionados métodos para modulação do teor e composição de lenhina de um organismo alvo tal como uma planta, incluindo tais métodos a incorporação no genoma da planta alvo de uma construção compreendendo um polinucleótido do presente invento. Numa concretização preferida, a planta alvo é uma planta lenhosa, de preferência seleccionada a partir do grupo consistindo em espécies de eucalipto e pinheiro, de maior preferência a partir do grupo consistindo em Eucalyptus grandis e Pinus radiata. Num aspecto relacionado, é proporcionado um método para produção de uma planta possuindo teor de lenhina alterado, compreendendo o método a transformação de uma célula vegetal com uma construção compreendendo um polinucleótido do presente invento para proporcionar uma célula transgénica, e cultura da célula transgénica sob condições que conduzam à regeneração e crescimento da planta madura.
Ainda noutro aspecto, o presente invento proporciona métodos para modificação da actividade de uma enzima num organismo alvo tal como uma planta, compreendendo a incorporação estável no genoma do organismo alvo de uma construção do presente invento. Numa concretização preferida, a planta alvo é uma planta lenhosa, de preferência seleccionada a partir do grupo que consiste em espécies de eucalipto e pinheiro, de maior preferência a partir do grupo que consiste em Eucalyptus grandis e Pinus radiata. 0 presente invento proporciona também polipéptidos tal como definido na reivindicação 17.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As características acima mencionadas e adicionais do presente invento e o modo de as obter tornar-se-ão aparentes, e o invento será melhor compreendido através de referência à seguinte descrição mais detalhada, lida em conjunto com o desenho associado. 6 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ A Figura 1 é uma perspectiva esquemática da via biossintética da lenhina. A Figura 2 mostra a quantidade de lenhina extraivel, como percentagem do teor de lenhina de tipo selvagem, presente em plantas de tabaco transformadas com construções genéticas com sentido e anti-sentido.
DESCRIÇÃO DETALHADA A lenhina é formada através de polimerização de pelo menos três monolinhóis diferentes, principalmente álcool para-coumarilico, álcool coniferilico e álcool sinapilico. Embora estes três tipos de subunidades de lenhina sejam bem conhecidos, é possível que variantes ligeiramente diferentes destas subunidades possam estar envolvidas na via biossintética da lenhina em várias plantas. A concentração relativa destes resíduos na lenhina varia entre diferentes espécies vegetais e dentro das espécies. Adicionalmente, a composição da lenhina pode variar também entre diferentes tecidos dentro de uma planta específica. Os três monolinhóis são derivados de fenilalanina num processo de diversos passos e crê-se que sejam polimerizados em lenhina através de um mecanismo de radicais livres. A Fig. 1 mostra diferentes passos na via biossintética para o álcool coniferilico juntamente com as enzimas responsáveis por catalisar cada passo. 0 álcool para-coumarilico e o álcool sinapilico são sintetizados através de vias semelhantes. A fenilalanina é primeiro desaminada pela fenilalanina-amónia-liase (PAL) para dar cinamato que é então hidroxilado pela cinamato-4-hidroxilase (C4H) para formar p-coumarato. 0 p-coumarato é hidroxilado pela coumarato-3-hidroxilase para dar cafeato. 0 grupo hidroxilo recentemente adicionado é então metilado pela O-metil-transferase (OMT) para dar ferulato que é conjugado com coenzima A através de 4-coumarato:CoA-ligase (4CL) para formar feruloil-CoA. A redução de feruloil-CoA em coniferaldeido é catalisada pela cinamoil-CoA-redutase (CCR). 0 coniferaldeido é ainda reduzido através da acção da álcool cinamilico-desidrogenase (CAD) para dar álcool coniferilico que é então convertido na 7 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ sua forma glicosilada para exportar do citoplasma para a parede celular através da coniferol-glucosil-transferase (CGT). Após a exportação, a forma desglicosilada do álcool coniferilico é obtida através da acção da coniferina-beta-glicosidase (CBG). Finalmente, a polimerização dos três monolinhóis para proporcionar lenhina é catalisada pela fenolase (PNL), lacase (LAC) e peroxidase (POX). A formação de álcool sinapilico envolve mais uma enzima, ferulato-5-hidroxilase (F5H). Para uma revisão mais detalhada da via biossintética da lenhina, ver Whetton, R. e Sederoff, R. The Plant Cell, 7: 1001-1013, 1995.
Sabe-se que as modificações quantitativas e qualitativas no teor de lenhina das plantas são induzidas por factores externos tais como estimulação luminosa, baixos níveis de cálcio e stress mecânico. A síntese de novos tipos de lenhina, por vezes em tecidos normalmente não lenhifiçados, pode também ser induzida através de infecção com patogénios. Além da lenhina, várias outras classes de produtos vegetais são derivadas de fenilalanina, incluindo flavonóides, coumarinos, estilbenos e derivados de ácido benzóico, sendo os passos iniciais na síntese de todos estes compostos os mesmos. Assim, a modificação da acção de PAL, C4H, 4CL e outras enzimas envolvidas na via biossintética da lenhina pode afectar a síntese de outros produtos vegetais para além da lenhina.
Utilizando os métodos e materiais do presente invento, o teor de lenhina de uma planta pode ser modulado através da modulação da expressão dos polinucleótidos do presente invento, ou através da modificação dos polipéptidos codificados pelos polinucleótidos ou dos polinucleótidos. O teor de lenhina de um organismo alvo, tal como uma planta, pode ser modificado, por exemplo, através da incorporação de cópias adicionais de genes codificando enzimas envolvidas na via biossintética da lenhina no genoma da planta alvo. Semelhantemente, um teor de lenhina modificado pode ser obtido através da transformação da planta alvo com cópias anti-sentido de tais genes. Adicionalmente, o número de cópias de genes codificando para diferentes enzimas na via biossintética da lenhina pode ser manipulado para modificar a 8 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ quantidade relativa de cada monolinhol sintetizado, conduzindo deste modo à formação de lenhina possuindo uma composição alterada. A alteração da composição de lenhina seria vantajosa, por exemplo, em aplicações de processamento de madeira para papel, e pode também ser eficaz na alteração da palatabilidade de materiais lenhosos para fungos de apodrecimento.
Num primeiro aspecto, o presente invento proporciona sequências polinucleotidicas isoladas tal como exposto na reivindicação 1, que inclui a sequência polinucleotidica identificada na Listagem de Sequências anexa como SEQ ID NO:161, variantes dessas sequências, e sequências prolongadas compreendendo as sequências expostas em SEQ ID NO:161 as quais são todas aqui referidas, colectivamente, como "polinucleótidos do presente invento". 0 presente invento proporciona também sequências polipeptidicas isoladas tal como definido na reivindicação 17.
Os polinucleótidos aqui divulgados foram derivados de fontes vegetais florestais, nomeadamente de Eucalyptus grandis. Alguns dos polinucleótidos do presente invento podem ser sequências "parciais", por não representarem um gene inteiro codificando um polipéptido inteiro. Tais sequências parciais podem ser prolongadas através da análise e sequenciação de várias bibliotecas de ADN utilizando iniciadores e/ou sondas e técnicas de hibridação e/ou PCR bem conhecidas. As sequências parciais podem ser prolongadas até um enquadramento de leitura aberto codificando um polipéptido, um polinucleótido inteiro e/ou gene capaz de expressar um polipéptido, ou outra porção útil do genoma ser identificado. Tais sequências prolongadas, incluindo polinucleótidos e genes inteiros, são descritas como "correspondentes a" SEQ ID NO:161. Semelhantemente, sequências de ARN, sequências inversas, sequências complementares, sequências anti-sentido e semelhantes, correspondendo aos polinucleótidos do presente invento, podem ser rotineiramente verificadas e obtidas utilizando a sequência de ADNc identificada como SEQ ID NO:161.
Os polinucleótidos identificados como SEQ ID NO: 161 contêm um enquadramento de leitura aberto ("ORF") ou 9 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ enquadramento de leitura aberto parcial, codificando um polipéptido. Adicionalmente, os enquadramentos de leitura abertos codificando polipéptidos podem ser identificados em sequências prolongadas ou inteiras correspondendo à sequência exposta como SEQ ID NO:161. Os enquadramentos de leitura abertos podem ser identificados utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. Estas técnicas incluem, por exemplo, análise para a localização de codões de início e de terminação conhecidos, mais provavelmente identificação de enquadramentos de leitura com base na frequência dos codões, etc. As ferramentas e suporte lógico adequados para análise de ORF estão disponíveis, por exemplo, na Internet em http: //www.ncbi.nlm.nih.qov/qorf/qorf.html. Os enquadramentos de leitura abertos e porções dos enquadramentos de leitura abertos podem ser identificados nos polinucleótidos do presente invento. Uma vez identificado um enquadramento de leitura aberto, o polinucleótido pode ser prolongado na área do enquadramento de leitura aberto parcial utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte até o polinucleótido para o enquadramento de leitura aberto inteiro ser identificado. Assim, os enquadramentos de leitura abertos codificando polipéptidos podem ser identificados utilizando os polinucleótidos do presente invento.
Uma vez identificados os enquadramentos de leitura abertos nos polinucleótidos do presente invento, os enquadramentos de leitura abertos podem ser isolados e/ou sintetizados. Construções genéticas expressáveis compreendendo os enquadramentos de leitura abertos e promotores, iniciadores, terminadores, etc. adequados, que são bem conhecidos na arte, podem então ser construídas. Tais construções genéticas podem ser introduzidas numa célula hospedeira para expressar o polipéptido codificado pelo enquadramento de leitura aberto. Células hospedeiras adequadas podem incluir várias células procarióticas e eucarióticas, incluindo células vegetais, células de mamífero, células bacterianas, algas e semelhantes.
Os polipéptidos codificados pelos polinucleótidos do presente invento podem ser expressos e utilizados em vários ensaios para determinar a sua actividade biológica. Tais polipéptidos podem ser utilizados para criar anticorpos, para 10 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ isolar as correspondentes proteínas interactuantes ou outros compostos e para determinar quantitativamente os níveis de proteínas interactuantes ou outros compostos. O presente invento contempla também métodos para modulação do teor e da composição de polinucleótidos e/ou polipéptidos de uma espécie florestal, envolvendo tais métodos a incorporação no genoma do organismo de uma construção genética compreendendo um ou mais polinucleótidos do presente invento. Numa concretização, o organismo alvo é uma espécie florestal, de preferência uma planta lenhosa, de maior preferência uma planta lenhosa de uma espécie de Pinus ou Eucalyptus, e ainda de maior preferência Eucalyptus grandis ou Pinus radiata. Num aspecto relacionado, é proporcionado um método para produção de uma planta florestal possuindo um genótipo ou fenótipo alterado, compreendendo o método a transformação de uma célula vegetal com uma construção genética do presente invento para proporcionar uma célula transgénica, e a cultura da célula transgénica sob condições que conduzam à regeneração e crescimento de uma planta madura. As plantas florestais possuindo um genótipo ou fenótipo alterado em consequência de modulação do nível ou teor de um polinucleótido ou polipéptido do presente invento em comparação com um organismo de tipo selvagem, bem como componentes (sementes, etc.) de tais plantas florestais, e a descendência de tais plantas florestais, estão contempladas e englobadas dentro do presente invento.
Os polinucleótidos isolados do presente invento têm também utilidade no mapeamento do genoma, em mapeamento físico, e em clonagem posicionai de genes. Adicionalmente, a sequência polinucleotídica identificada como SEQ ID NO:161, e suas variantes, podem ser utilizadas para desenhar sondas e iniciadores oligonucleotídicos. As sondas e iniciadores oligonucleotídicos têm sequências que são substancialmente complementares ao polinucleótido de interesse em relação a uma certa porção do polinucleótido. As sondas oligonucleotídicas desenhadas utilizando os polinucleótidos do presente invento podem ser utilizadas para detectar a presença e examinar os padrões de expressão de genes em qualquer organismo possuindo sequências de ADN e ARN suficientemente semelhantes nas suas células utilizando 11 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ técnicas que são bem conhecidas na arte, tais como técnicas de hibridação de ADN slot blot. Os iniciadores oligonucleotidicos desenhados utilizando os polinucleótidos do presente invento podem ser utilizados para amplificações por PCR. As sondas e os iniciadores oligonucleotidicos desenhados utilizando os polinucleótidos do presente invento podem também ser utilizados em ligação com as várias metodologias de microarrays, incluindo a tecnologia de microarray utilizada por Synteni (Paio Alto, Califórnia).
Os polinucleótidos do presente invento podem também ser utilizados para marcar ou identificar um organismo ou material reprodutivo deste. Tal marcação pode ser alcançada, por exemplo, através da introdução estável de um identificador polinucleotidico heterólogo não disruptivo não funcional num organismo, compreendendo o polinucleótido um dos polinucleótidos do presente invento.
Os polipéptidos do presente invento e os polinucleótidos codificando os polipéptidos têm actividade nas vias biossintéticas da lenhina nas plantas. Os polinucleótidos foram putativamente identificados através de pesquisas de semelhanças de ADN e de polipéptidos. Os seguintes polinucleótidos são aqui descritos: TABELA 1 IDENTIDADE DO POLIPÉPTIDO POLINUCLEÓTIDO SEQ ID NO. POLIPÉPTIDO SEQ ID NO. Cinamato-4-hidroxilase (C4H) 48, 49, 161, Coumarato-3-hidroxilase (C3H) 18, Fenolase (PNL) 81, O-metil-transferase (OMT) 6, Cinamoil-CoA-redutase (OCR) 26 Fenilalanina-amónia-liase (PAL) 45,47 325-331 Coniferol-glicosil-transferase (CGT) 31 Lacase (LAC) 83 Ferulato-5-hidroxilase (F5H) 19
Numa concretização, os polinucleótidos isolados do presente invento compreendem uma sequência seleccionada a 12 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ partir do grupo que consiste em: (a) a sequência citada em SEQ ID NO:161 (b) um complemento inteiro dessa sequência; (c) um complemento inverso inteiro dessas sequências; e (d) sequências possuindo pelo menos, identidade, tal como aqui definido, com uma sequência de (a).
Num outro aspecto, são proporcionados polipéptidos isolados codificados pelos polinucleótidos do presente invento.
Noutro aspecto, o invento proporciona construções genéticas compreendendo um polinucleótido do presente invento, sozinho, em combinação com um ou mais polinucleótidos adicionais do presente invento, ou em combinação com um ou mais polinucleótidos conhecidos, juntamente com células e organismos alvo compreendendo tais construções.
Num aspecto relacionado, o presente invento proporciona construções genéticas compreendendo, na direcção 5'-3', uma sequência promotora de um gene, um enquadramento de leitura aberto codificando para pelo menos uma porção funcional de um polipéptido codificado por um polinucleótido do presente invento, e uma sequência de terminação de um gene. 0 enquadramento de leitura aberto pode estar orientado na direcção com sentido ou anti-sentido. Construções genéticas compreendendo uma sequência promotora de um gene, um polinucleótido do presente invento, e uma sequência de terminação de um gene estão também contempladas, tal como o estão construções genéticas compreendendo uma sequência promotora de um gene, uma região não traduzida de um polinucleótido do presente invento, ou uma sequência nucleotídica complementar a uma região não traduzida, e uma sequência de terminação de um gene. A construção genética pode ainda incluir um marcador para a identificação das células transformadas.
As sequências promotora e de terminação de um gene são de preferência funcionais numa planta hospedeira, de maior preferência, são as nativas da planta hospedeira. As sequências promotora e de terminação que são geralmente utilizadas na arte, tais como o promotor do Virus do Mosaico 13 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ da Couve-flor (CMV), com ou sem estimuladores tais como a sequência de Kozak ou o estimulador Omega, e o terminador da nopalina-sintetase de Agrobacterium tumefaciens, são úteis. Promotores específicos dos tecidos podem ser empregues para direccionar a expressão para um ou mais tecidos desejados.
Noutro aspecto, são proporcionados métodos para produção de plantas florestais possuindo um teor modificado de um polinucleótido ou polipéptido do presente invento em comparação com um organismo nativo. Os métodos envolvem a transformação de uma planta florestal alvo com uma construção genética do presente invento para proporcionar uma célula transgénica, e a cultura da célula transgénica sob condições que conduzam à regeneração e crescimento da planta madura. Células compreendendo as construções genéticas do presente invento são proporcionadas, juntamente com tecidos e plantas florestais compreendendo tais células transgénicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou descendência de tais plantas florestais. Propágulos das plantas transgénicas do invento estão incluídos no presente invento. Tal como aqui se utiliza, a palavra "propágulo" significa qualquer parte de uma planta que pode ser utilizada em reprodução ou propagação, sexuada ou assexuada, incluindo cortes.
Variedades vegetais, particularmente variedades vegetais registáveis de acordo com o Certificado de Obtenção Vegetal, podem ser excluídas do presente invento. Uma planta não necessita de ser considerada uma "variedade vegetal" simplesmente por conter estavelmente dentro do seu genoma um transgene, introduzido numa célula da planta ou de um ancestral desta. A palavra "polinucleótido(s)", tal como aqui se utiliza, significa uma colecção polimérica de nucleótidos e inclui moléculas de ADN e as correspondentes de ARN e moléculas de cadeia simples e dupla, incluindo moléculas de ARNHn e ARNm, cadeias com sentido e anti-sentido de moléculas de ADN e ARN, e ADNc, ADN genómico e polinucleótidos totalmente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de ARNHn contém intrões e "corresponde a" uma molécula de ADN de um modo geralmente de um para um. Uma molécula de ARNm "corresponde a" uma molécula de ARNHn e de ADN das quais foram excisados 14 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ os intrões. Um polinucleótido do presente invento pode ser um gene inteiro ou qualquer porção deste. Um gene é uma sequência de ADN que codifica para uma proteína funcional ou molécula de ARN. Polinucleótidos anti-sentido operativos podem compreender um fragmento do polinucleótido correspondente, e a definição de "polinucleótido" inclui por isso todos os fragmentos anti-sentido operativos. Os polinucleótidos anti-sentido e as técnicas envolvendo polinucleótidos anti-sentido são bem conhecidos na arte e são descritos, por exemplo, em Robinson-Benion et al., "Antisense techniques," Methods in Enzymol. 254(23): 363-375, 1995; e Kawasaki et al., Artific. Organs 20(8): 836-848, 1996. São também proporcionados complementos de tais polinucleótidos isolados, complementos inversos de tais polinucleótidos isolados, e sequências inversas de tais polinucleótidos isolados, juntamente com variantes de tais sequências. A definição dos termos "complemento", "complemento inverso" e "sequência inversa", tal como aqui se utiliza, é melhor ilustrada através do seguinte exemplo. Para a sequência 5' AGGACC 3', o complemento, complemento inverso e a sequência inversa são como se segue: 3' TCCTGG 5' 3' GGTCCT 5' 5' CCAGGA 3' complemento complemento inverso sequência inversa
Tal como aqui se utiliza, o termo "oligonucleótido" refere-se a um segmento relativamente curto de uma sequência polinucleotídica, compreendendo geralmente entre 6 e 60 nucleótidos, e compreende sondas para utilização em ensaios de hibridação e iniciadores para utilização na amplificação de adn através de reacção em cadeia da polimerase. A identificação de ADN genómico e de ADN de espécies heterólogas pode ser alcançada através de técnicas de hibridação ADN/ADN padrão, sob condições apropriadamente rigorosas, utilizando toda ou parte de uma sequência de adnc como sonda para pesquisar uma biblioteca apropriada. Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos que são desenhados com base em sequências de ADN genómico, ADNc e proteicas 15 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ conhecidas para amplificar e identificar sequências genómicas e de ADNc. Os ADNs sintéticos correspondentes às sequências e variantes identificadas podem ser produzidos através de métodos de síntese convencionais. Todos os polinucleótidos aqui descritos são isolados e purificados, tal como esses termos são vulgarmente utilizados na arte.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona polipéptidos isolados codificados, ou parcialmente codificados, pelos polinucleótidos de cima. Tal como aqui se utiliza, o termo "polipéptido" engloba cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas inteiras, em que os resíduos de aminoácidos são ligados através de ligações peptídicas covalentes. 0 termo "polipéptido codificado por um polinucleótido" tal como aqui se utiliza, inclui polipéptidos codificados por um polinucleótido que compreende uma sequência ou variante de ADN isolada aqui proporcionada.
Os polipéptidos do presente invento podem ser produzidos de forma recombinante através da inserção de uma sequência de ADN que codifica o polipéptido num vector de expressão e da expressão do polipéptido num hospedeiro apropriado. Qualquer um de uma variedade de vectores de expressão conhecidos dos peritos na arte pode ser empregue. A expressão pode ser alcançada em qualquer célula hospedeira apropriada que tenha sido transformada ou transfectada com um vector de expressão contendo uma molécula de ADN que codifique um polipéptido recombinante. Células hospedeiras adequadas incluem procariotas, leveduras e células eucarióticas superiores. De preferência, as células hospedeiras empregues são E. coli, de insecto, de levedura ou uma linha celular de mamífero tal como COS ou CHO. As sequências de ADN expressas deste modo podem codificar polipéptidos de ocorrência natural, porções de polipéptidos de ocorrência natural ou outras variantes destes.
Tal como aqui se utiliza, a "porção funcional" de um polipéptido é a porção que contém o sítio activo essencial para afectar a função do polipéptido, por exemplo, a porção da molécula que é capaz de se ligar a um ou mais reagentes. 0 sítio activo pode ser constituído por porções separadas 16 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ presentes numa ou mais cadeias polipeptídicas e exibirão geralmente elevada afinidade de ligação.
As porções funcionais de um polipéptido podem ser identificadas primeiro através da preparação de fragmentos do polipéptido por digestão química ou enzimática do polipéptido ou através de análise de mutações do polinucleótido que codifica o polipéptido e subsequente expressão dos polipéptidos mutantes resultantes. Os fragmentos dos polipéptidos ou polipéptidos mutantes são então testados para determinar que porções mantêm actividade biológica, utilizando, por exemplo, os ensaios representativos proporcionados abaixo.
Uma porção funcional compreendendo um sítio activo pode ser constituída por porções separadas presentes numa ou mais cadeias polipeptídicas e exibe geralmente elevada especificidade para o substrato. 0 termo "polipéptido codificado por um polinucleótido" tal como aqui se utiliza, inclui polipéptidos codificados por um polinucleótido compreendendo um polinucleótido parcial isolado do presente invento.
Porções e outras variantes dos polipéptidos do invento podem também ser geradas através de meios sintéticos ou recombinantes. Polipéptidos sintéticos possuindo menos de cerca de 100 aminoácidos, e geralmente menos de cerca de 50 aminoácidos, podem ser gerados utilizando técnicas bem conhecidas dos vulgares peritos na arte. Por exemplo, tais polipéptidos podem ser sintetizados utilizando qualquer uma das técnicas de fase sólida comercialmente disponíveis, tais como o método de síntese de fase sólida de Merrifield, onde os aminoácidos são sequencialmente adicionados à cadeia de aminoácidos em crescimento. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. O equipamento para síntese automática de polipéptidos está comercialmente disponível em fornecedores tais como Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Califórnia), e pode ser operado de acordo com as instruções do fabricante. Variantes de um polipéptido nativo podem ser preparadas utilizando técnicas de mutagénese padrão, tal como mutagénese específica do local dirigida por oligonucleótidos (Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492, 1985). 17 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
Secções de sequências de ADN podem também ser removidas utilizando técnicas padrão para permitir a preparação de polipéptidos truncados.
Em geral, os polipéptidos aqui divulgados são preparados numa forma isolada substancialmente pura. De preferência, os polipéptidos são pelo menos cerca de 80% puros; de maior preferência pelo menos cerca de 90% puros; e ainda de maior preferência, pelo menos cerca de 99% puros. Em certas concretizações preferidas, descritas em detalhe abaixo, os polipéptidos isolados são incorporados em composições farmacêuticas ou vacinas para utilizar no tratamento de distúrbios da pele.
Tal como aqui se utiliza, o termo "variante" compreende sequências nucleotidicas ou de aminoácidos diferentes das sequências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleótidos ou resíduos de aminoácidos são suprimidos, substituídos ou adicionados. As variantes podem ser variantes alélicas de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. Os polinucleótidos de sequência variante exibem pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO:161. A percentagem de identidade é determinada através do alinhamento das duas sequências a comparar tal como descrito abaixo, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo esse número pelo número total de resíduos na sequência do invento (de busca), e multiplicando o resultado por 100.
As sequências polinucleotídicas e polipeptídicas podem ser alinhadas, e a percentagem de nucleótidos idênticos numa região especificada pode ser determinada contra outro polinucleótido, utilizando algoritmos de computador que estão publicamente disponíveis. Dois algoritmos exemplares para alinhamento e identificação da semelhança de sequências polinucleotídicas são os algoritmos BLASTN e FASTA. Os polinucleótidos podem também ser analisados utilizando o algoritmo BLASTX, que compara produtos conceptuais de tradução em seis enquadramentos de uma sequência nucleotídica de busca (ambas as cadeias) contra uma base de dados de sequências proteicas. A semelhança das sequências polipeptídicas pode ser examinada utilizando o algoritmo BLASTP. Os programas BLASTN, BLASTX e BLASTP estão 18 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ disponíveis no servidor FTP anónimo de NCBI (ftp://ncbi.nlm.nih.gov) em /blast/executables/. O algoritmo BLASTN Versão 2.0.4 [Fev-24-1998] e Versão 2.0.6 [passo-16-1998], definido para os parâmetros por defeito descritos na documentação e distribuídos com o algoritmo, são preferidos para utilizar na determinação de variantes polinucleotídicas de acordo com o presente invento. O algoritmo BLASTP, definido para os parâmetros por defeito descritos na documentação e distribuídos com o programa, é preferido para utilização na determinação de variantes polipeptídicas de acordo com o presente invento. A utilização da família de algoritmos BLAST, incluindo BLAST, BLASTP, e BLASTX, é descrita no sítio da Internet de NCBI em URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html e na publicação de Altschul Stephen F, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997. O algoritmo de computador FASTA está disponível na Internet no sítio ftp ftp://ftp.virginia.edu/publ/fasta/. A Versão 2.0.4, Fevereiro 1996, definida para os parâmetros por defeito descritos na documentação e distribuídos com o algoritmo, pode ser utilizada na determinação de variantes de acordo com o presente invento. A utilização do algoritmo FASTA é descrita em Pearson WR e Lipman DJ, "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444-2448, 1988; e Pearson WR, "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183: 63-98, 1990.
Os seguintes parâmetros de funcionamento são preferidos para determinação de alinhamentos e semelhanças utilizando BLASTN que contribuem para os valores de E e para a percentagem de identidade para as sequências polinucleotídicas: Comando para correr em Unix: blastall -p blastn -d embldb -e 10 -G0-E0 -r 1-v 30 -b 30 -i queryseq -o resultados; os parâmetros são: -p Nome do Programa [Cadeia de caracteres]; -d Base de dados [Cadeia de caracteres]; -e Valor esperado (E) [Real]; -G Custo de abrir um intervalo (zero invoca o comportamento por defeito) [Inteiro]; -E Custo de prolongar um intervalo (zero invoca o comportamento por defeito) [Inteiro]; -r Recompensa pela coincidência de um 19 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ nucleótido (apenas blastn) [Inteiro]; -v Número de descrições numa linha (V) [Inteiro]; -b Número de alinhamentos a apresentar (B) [Inteiro]; -i Ficheiro de Busca [Ficheiro de Entrada]; e -o BLAST apresenta o Ficheiro do Resultado (Output File) [Ficheiro de Saida] Opcional. Os seguintes parâmetros de funcionamento são preferidos para determinação de alinhamentos e semelhanças utilizando BLASTP que contribui para os valores de E e para a percentagem de identidade de sequências polipeptidicas: blastall -p blastp -d swissprotdb -e 10 -G 0 -E 0 -v 30 -b 30 -i queryseq -o resultados; os parâmetros são: -p Nome do Programa [Cadeia de caracteres]; -d Base de dados [Cadeia de caracteres]; -e Valor Esperado (E) [Real]; -G Custo de abrir um intervalo (zero invoca o comportamento por defeito) [Inteiro]; -E Custo de prolongar um intervalo (zero invoca o comportamento por defeito) [Inteiro]; -v Número de descrições numa linha (v) [Inteiro]; -b Número de alinhamentos a apresentar (b) [Inteiro]; -I Ficheiro de Busca [Ficheiro de Entrada]; -o BLAST apresenta o Ficheiro do Resultado [Ficheiro de Saida] Opcional. Os "acertos" numa ou mais sequências da base de dados de uma sequência de busca produzidos através de BLASTN, FASTA, BLASTP ou um algoritmo semelhante, alinham e identificam porções de sequências. Os acertos são dispostos por ordem do grau de semelhança e do comprimento da sobreposição das sequências. Os acertos numa sequência da base de dados representam geralmente uma sobreposição ao longo de apenas uma fracção do comprimento da sequência da sequência pesquisada.
Os algoritmos BLASTN, FASTA, e BLASTP produzem também valores "Esperados" (E) para os alinhamentos. O valor Esperado (E) indica o número de acertos que se podem "esperar" observar ao longo de um certo número de sequências contíguas por acaso quando se pesquisa uma base de dados de um certo tamanho. O valor Esperado é utilizado como limiar de significância para determinação de se o acerto numa base de dados, tal como na base de dados preferida EMBL, indica uma verdadeira semelhança. Por exemplo, um valor de E de 0,1 atribuído a um acerto de um polinucleótido é interpretado como significando que numa base de dados do tamanho da base de dados EMBL, se pode esperar observar 0,1 coincidências ao longo da porção alinhada da sequência com um registo 20 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ semelhante simplesmente por acaso. Por este critério, as porções alinhadas e coincidentes das sequências polinucleotidicas têm então uma probabilidade de 90% de serem a mesma. Para sequências possuindo um valor de E de 0,01 ou menos ao longo de porções alinhadas e coincidentes, a probabilidade de descobrir uma coincidência por acaso na base de dados EMBL é de 1% ou menos utilizando o algoritmo BLASTN OU FASTA.
De acordo com uma concretização, os polinucleótidos e polipéptidos "variantes", com referência a cada um dos polinucleótidos e polipéptidos do presente invento compreendem, de preferência, sequências possuindo o mesmo número ou menos de ácidos nucleicos ou aminoácidos que cada um dos polinucleótidos ou polipéptidos do presente invento e a produção de um valor de E de 0,01 ou menos quando em comparação com o polinucleótido ou polipéptido do presente invento. Isto é, um polinucleótido ou polipéptido variante é qualquer sequência que tenha pelo menos uma probabilidade de 99% de ser o mesmo polinucleótido ou polipéptido do presente invento, medida como possuindo um valor de E de 0,01 ou menos utilizando os algoritmos BLASTN, FASTA, ou BLASTP definidos nos parâmetros descritos acima. De acordo com uma concretização preferida, um polinucleótido variante é uma sequência possuindo o mesmo número ou menos de ácidos nucleicos que um polinucleótido do presente invento que tenha pelo menos uma probabilidade de 99% de ser o mesmo que o polinucleótido do presente invento, medida como possuindo um valor de E de 0,01 ou menos utilizando os algoritmos BLASTN ou FASTA definidos nos parâmetros descritos acima. Semelhantemente, de acordo com uma concretização preferida, um polipéptido variante é uma sequência possuindo o mesmo número ou menos de aminoácidos que um polipéptido do presente invento que tenha pelo menos uma probabilidade de 99% de ser o mesmo que o polipéptido do presente invento, medida como possuindo um valor de E de 0,01 ou menos utilizando o algoritmo BLASTP definido nos parâmetros descritos acima. O presente invento engloba também polinucleótidos que diferem das sequências divulgadas mas que, em consequência da degenerescência do código genético, codificam a mesma sequência de aminoácidos e estão contemplados pelo presente 21 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ invento. Tais polinucleótidos são referidos como sendo "degenerativamente equivalentes" a um polinucleótido aqui divulgado. Semelhantemente, os polinucleótidos que diferem das sequências divulgadas mas que codificam um polipéptido possuindo actividade enzimática semelhante à de um polipéptido codificado por um polinucleótido do presente invento estão incluídos dentro do presente invento. Assim, os polinucleótidos compreendendo sequências que diferem das sequências polinucleotídicas citadas em SEQ ID NO:161 em resultado de substituições conservativas estão contemplados e englobados dentro do presente invento. Adicionalmente, polinucleótidos compreendendo sequências que diferem da sequência polinucleotídica, citada em SEQ ID NO:161 em resultado de deleções e/ou inserções totalizando menos de 10% do comprimento total da sequência estão também contemplados e englobados dentro do presente invento.
Os polinucleótidos do presente invento, incluindo variantes, podem ser isolados de várias bibliotecas montadas a partir de organismos vegetais ou não vegetais, ou podem ser sintetizados utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. Os polinucleótidos do presente invento podem ser isolados através de sequenciação de elevado rendimento de bibliotecas de ADNc preparadas a partir de Eucalyptus grandis e Pinus radiata tal como descrito abaixo nos Exemplos 1 e 2. Alternativamente, sondas oligonucleotidicas baseadas nas sequências proporcionadas em SEQ ID NO:1-266 e 350-375 podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar clones positivos em bibliotecas de ADNc ou ADN genómico de Eucalyptus grandis e Pinus radiata por meio de técnicas de hibridação ou PCR. As sondas podem ser mais curtas que as sequências aqui proporcionadas mas devem ter pelo menos cerca de 10, de preferência pelo menos cerca de 15 e de maior preferência pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento. As técnicas de hibridação e de PCR adequadas para utilizar com tais sondas oligonucleotidicas são bem conhecidas na arte. Os clones positivos podem ser analisados através de digestão com enzimas de restrição, sequenciação de ADN ou semelhantes.
Variantes dos polinucleótidos do presente invento derivadas de outras espécies de eucalipto e pinheiro, bem 22 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ como de outras espécies comercialmente importantes utilizadas pela indústria madeireira, estão contempladas. Estas incluem as seguintes gimnospérmicas, como exemplo: pinheiro amarelo Pinus taeda, pinheiro de Alepo Pinus elliotti, pinheiro branco americano Pinus clausa, pinheiro de folha longa Pinus palustris, pinheiro de folha curta Pinus echinata, pinheiro ponderosa Pinus ponderosa, pinheiro de Jeffrey Pinus jeffrey, pinheiro vermelho americano Pinus resinosa, pinheiro duro Pinus rígida, pinheiro cinzento Pinus banksiana, pinheiro da lagoa Pinus serotina, pinheiro de Weymouth Pinus strobus, pinheiro branco do oeste Pinus monticola, pinheiro de Lambert Pinus lambertiana, pinheiro da Virgínia Pinus virginiana, pinheiro da praia Pinus contorta, pinheiro das Caraíbas Pinus caribaea, P. pinaster, pinheiro da Calábria P. brutia, pinheiro eldárica P. eldarica, pinheiro de pinhas grandes P. coulteri, pinheiro negro P. nigra e P. sylvestris; abeto de Douglas Pseudotsuga menziesii; as tsugas que incluem a tsuga do pacífico Tsuga heterophylla, tsuga do Canadá Tsuga canadensis, tsuga da montanha Tsuga mertensiana; os abetos que incluem o abeto falso Picea abies, abeto vermelho Picea rubens, abeto do Canadá Picea glauca, picea negra Picea mariana, picea de Sitka Picea sitchensis, picea de Englemann Picea engelmannii, e picea azul Picea pungens; Sequóia-sempre-verde Sequoia sempervírens; os verdadeiros abetos incluem o abeto alpino Abies lasiocarpa, abeto bonito Abies amabilis, abeto gigante Abies grandis, abeto nobre Abies procera, abeto branco Abies concolor, abeto vermelho da Califórnia Abies magnifica, e abeto de Fraser Abies balsamea, os cedros que incluem a tuia gigante Thuja plicata, cedro do incenso Libocedrus decurrens, cedro branco Thuja occidentalis, falso cipreste de Lawson Chamaecyparis lawsoniona, cedro branco Atlântico Chamaecyparis thyoides, cedro amarelo do Alasca Chamaecyparis nootkatensis, e cedro vermelho da Virgínia Huniperus virginiana; os lariçios que incluem o Larício oriental Larix laricina, laricio ocidental Larix occidentalis, larício europeu Larix decídua, laricio do Japão Larix leptolepís, e laricio siberiano Larix siberica·, cipreste de folha caduca Taxodium distichum e sequóia gigante Sequoia gigantea·, e as seguintes angiospérmicas, como exemplo: Eucalyptus alba, E. bancroftii, E. botyroides, E. bridgesiana, E. calophylla, E. camaldulensis, E. citriodora. E. cladocalyx, E. coccifera, E. curtísii, E. dalrympleana, E. 23 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ deglupta, Ε. delagatensis, Ε. diversícolor. Ε. dunnii, Ε. fícífolía, Ε. globulus, Ε. gomphocephala. Ε. gunnii, Ε. henryi, Ε. laevopinea, Ε. macarthurii, Ε. macrorlyncha, Ε. maculata, Ε. margínata, Ε. megacorpa, Ε. melliodora, Ε. nicholii, Ε. nitens, Ε. nova-angélica, Ε. obliqua, Ε. obtusiflora, Ε. oreades, Ε. pauciflora, E. polybractea, Ε. regnans, E. resinifera, Ε. robusta, Ε. rudis. Ε. saligna, Ε. sideroxylon, Ε. stuartiana, Ε. tereticornis, Ε. torelliana, Ε. urnigera, Ε. urophylla, Ε. viminalis, Ε. viridis, Ε. wandoo e Ε. youmanni.
Os polinucleótidos do presente invento podem ser alternativamente sintetizados, por exemplo, utilizando sintetizadores automáticos de oligonucleótidos (p.ex., Beckman Oligo 1000M DNA Synthesizer) para obter segmentos de polinucleótidos de até 50 ou mais ácidos nucleicos. Uma variedade de tais segmentos polinucleotidicos pode então ser ligada utilizando técnicas de manipulação de ADN padrão que são bem conhecidas na arte da biologia molecular. Uma técnica convencional e exemplar de sintese de polinucleótidos envolve a sintese de um segmento de polinucleótido de cadeia simples possuindo, por exemplo, 80 ácidos nucleicos, e hibridação desse segmento com um segmento complementar sintetizado de 85 ácidos nucleicos para produzir uma ponta solta de 5 nucleótidos. O segmento seguinte pode então ser sintetizado de um modo semelhante, com uma ponta solta de 5 nucleótidos na cadeia oposta. As extremidades "coesivas" asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são hibridadas. Deste modo, um polinucleótido completo do presente invento pode ser sintetizado inteiramente in vitro.
As sequências parciais não representam a porção de codificação inteira de um gene codificando um polipéptido de ocorrência natural. As sequências polinucleotídicas parciais aqui divulgadas podem ser empregues para obter os genes inteiros correspondentes para várias espécies e organismos, por exemplo, através de pesquisa de bibliotecas de expressão de ADN utilizando sondas de hibridação baseadas nos polinucleótidos do presente invento, ou utilizando amplificação por PCR com iniciadores baseados nos polinucleótidos do presente invento. Deste modo pode-se, utilizando métodos bem conhecidos na arte, prolongar um 24 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ polinucleótido do presente invento a montante e a jusante do correspondente ARNm, bem como identificar o ADN genómico correspondente, incluindo as regiões promotora e estimuladora do gene completo. 0 presente invento compreende assim polinucleótidos isolados compreendendo uma sequência identificada em SEQ ID NO:161 ou uma variante da sequência especificada que codifica o polipéptido funcional, incluindo genes inteiros.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona construções genéticas compreendendo, na direcção 5'-3', uma sequência promotora de um gene; um polinucleótido do presente invento; e uma sequência de terminação de um gene. 0 enquadramento de leitura aberto do polinucleótido do invento pode estar orientado numa direcção com sentido ou anti-sentido. Para pedidos onde é desejada a amplificação da sintese de lenhina, o enquadramento de leitura aberto pode ser inserido na construção numa orientação com sentido, de modo a que a transformação de um organismo alvo com a construção conduzirá a um aumento do número de cópias do gene e portanto a um aumento na quantidade de enzima. Quando é desejada a sub-regulação da síntese de lenhina, o enquadramento de leitura aberto pode ser inserido na construção numa orientação anti-sentido, de modo a que o ARN produzido através de transcrição do polinucleótido seja complementar à sequência de ARNm endógena, isto, por sua vez, resultará numa diminuição no número de cópias do gene e portanto numa diminuição na quantidade de enzima. Alternativamente, a regulação pode ser alcançada através da inserção de sequências ou subsequências adequadas (p.ex., ADN ou ARN) em construções de ribozimas.
As construções genéticas do presente invento compreendem ainda uma sequência promotora de um gene e uma sequência de terminação de um gene, operativamente ligadas ao polinucleótido a transcrever, que controlam a expressão do gene. A sequência promotora de um gene é geralmente posicionada na extremidade 5' do polinucleótido a transcrever, e é empregue para iniciar a transcrição do polinucleótido. As sequências promotoras de um gene são 25 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ geralmente verificadas na região não codificadora a 5' de um gene mas podem existir em intrões (Luehrsen KR, Mol. Glen. Genet. 225: 81-93, 1991, ou na região de codificação, tal como por exemplo em PAL de tomate (Bloksberg, Studies on the Biology of Fenilalanina Ammonia Lyase and Plant Pathogen Interaction, Ph.D. Thesis, University of Califórnia, Davis, 1991, University Microfilms International Order No. 9217564). Quando a construção inclui um enquadramento de leitura aberto numa orientação com sentido, a sequência promotora de um gene inicia também a tradução do enquadramento de leitura aberto. Para construções de ADN compreendendo um enquadramento de leitura aberto numa orientação anti-sentido ou numa região não codificadora, a sequência promotora de um gene consiste apenas num local de inicio da transcrição possuindo um local de ligação à ARN-polimerase.
Uma variedade de sequências promotoras de genes que podem ser empregues de forma útil nas construções de ADN do presente invento é bem conhecida na arte. A sequência génica promotora, e também a sequência de terminação de um gene, pode ser endógena ao hospedeiro vegetal alvo ou pode ser exógena, desde que o promotor seja funcional no hospedeiro alvo. Por exemplo, as sequências promotora e de terminação podem ser de outras espécies vegetais, virus de plantas, plasmideos bacterianos e semelhantes. De preferência, as sequências promotora e de terminação de um gene são das próprias sequências do invento.
Factores que influenciam a escolha do promotor incluem a especificidade de tecido desejada da construção e o momento de transcrição e tradução. Por exemplo, promotores constitutivos, tais como o promotor do Virus do Mosaico da Couve-flor (CaMV 35S), afectarão a actividade da enzima em todas as partes da planta. A utilização de um promotor especifico de tecido resultará na produção do ARN com sentido ou anti-sentido desejado no tecido de interesse. Com construções de ADN empregando sequências promotoras de genes indutiveis, a taxa de ligação da ARN-polimerase e a iniciação podem ser moduladas por estímulos externos, tais como luz, calor, stress anaeróbico, alteração nas condições nutrientes e semelhantes. Promotores temporariamente regulados podem ser empregues para efectuar modulação da velocidade de ligação da 26 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ ARN-polimerase e iniciação num momento especifico durante o desenvolvimento de uma célula transformada. De preferência, são utilizados os promotores originais do gene da enzima em questão, ou promotores de um gene direccionado a um tecido especifico no organismo a transformar, tal como eucalipto ou pinheiro. Outros exemplos de promotores de genes que podem ser empregues de forma útil no presente invento incluem manopina-sintetase (mas), octopina-sintetase (ocs) e os revistos por Chua et al., Science 244: 174-181, 1989. A sequência de terminação de um gene, que se localiza a 3' do polinucleótido a transcrever, pode provir do mesmo gene que a sequência promotora do gene ou pode ser de um gene diferente. Muitas sequências de terminação de genes conhecidas na arte podem ser empregues de modo útil no presente invento, tal como a extremidade 3' do gene da nopalina-sintetase de Agrobacterium tumefaciens. No entanto, as sequências terminadoras de um gene preferidas são as do gene da enzima original ou da espécie alvo a transformar.
As construções genéticas do presente invento podem também conter um marcador de selecção que é eficaz em células vegetais, para permitir a detecção de células transformadas contendo a construção do invento. Tais marcadores, que são bem conhecidos na arte, conferem tipicamente resistência a uma ou mais toxinas. Um exemplo de um tal marcador é o gene NPTII cuja expressão resulta em resistência a canamicina ou higromicina, antibióticos que são habitualmente tóxicos para células vegetais a uma concentração moderada (Rogers et al., em Weissbach A. e H., eds., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press Inc.: San Diego, CA, 1988). Alternativamente, a presença da construção desejada em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas bem conhecidas na arte, tais como Southern e Western blots.
As técnicas para ligar operativamente os componentes das construções genéticas do invento são bem conhecidas na arte e incluem a utilização de ligadores sintéticos contendo um ou mais locais de endonucleases de restrição tal como descrito, por exemplo, por Maniatis et al., ("Molecular cloning: a laboratory manual", CSHL Press: Cold Spring Harbor, NY, 27 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ 1989) . A construção de ADN do presente invento pode ser ligada a um vector possuindo pelo menos um sistema de replicação, por exemplo, E. coli, pelo que após cada manipulação, a construção resultante pode ser clonada e sequenciada e determinada a correcção da manipulação.
As construções genéticas do presente invento podem ser utilizadas para transformar uma variedade de plantas, tanto monocotiledóneas (p.ex., ervas, milho, cereais, aveia, trigo e cevada), dicotiledóneas (p.ex., Arabidopsis, tabaco, legumes, alfalfa, carvalhos, eucaliptos, ácer), e Gimnospérmicas (p.ex., pinheiro silvestre: ver Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996), picea branca (Ellis et al., Biotechnology 11: 94-92, 1993), e laricio (Huang et al., In Vitro Cell 27: 201-207, 1991). Numa concretização preferida, as construções genéticas do invento são empregues para transformar plantas lenhosas, aqui definidas como uma árvore ou arbusto cujo caule vive durante vários anos e aumenta de diâmetro cada ano através da adição de tecido lenhoso. De preferência a planta alvo é seleccionada a partir do grupo que consiste em espécies de eucalipto e pinheiro, de maior preferência a partir do grupo que consiste em Eucalyptus grandis e Pinus radiata. Tal como discutido acima, a transformação de uma planta com uma construção genética incluindo um enquadramento de leitura aberto codificando para uma enzima codificada por um polinucleótido do invento em que o enquadramento de leitura aberto está orientado numa direcção com sentido produzirá um teor de lenhina modificado na planta. A transformação de uma planta com uma construção genética compreendendo um enquadramento de leitura aberto numa orientação anti-sentido ou uma região não codificadora (não traduzida) de um gene produzirá também uma modificação no teor de lenhina da planta transformada. A produção de ARN em células alvo pode ser controlada através da escolha da sequência promotora ou através da selecção do número de cópias funcionais ou do local de integração dos polinucleótidos incorporados no genoma do organismo alvo. A planta alvo pode ser transformada com mais de uma construção do presente invento, modulando deste modo a via biossintética da lenhina para a actividade de mais de uma 28 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ enzima, afectando a actividade da enzima em mais de um tecido ou afectando a actividade da enzima em mais de um momento de expressão. Semelhantemente, a construção pode ser montada contendo mais de um enquadramento de leitura aberto codificando para uma enzima codificada por um polinucleótido do presente invento ou mais de uma região não codificadora de um gene codificando para uma tal enzima. Os polinucleótidos do presente invento podem também ser empregues em combinação com outras sequências conhecidas codificando enzimas envolvidas na via biossintética da lenhina. Deste modo, pode ser possível adicionar uma via biossintética da lenhina a uma planta não lenhosa para produzir uma nova planta lenhosa.
As técnicas para incorporar de forma estável construções de ADN no genoma de plantas alvo são bem conhecidas na arte e incluem introdução mediada por Agrobacterium tumefaciens, electroporação, fusão de protoplastos, injecção em órgãos reprodutores, injecção em embriões imaturos, introdução de projécteis a alta velocidade e semelhantes. A escolha da técnica dependerá da planta alvo a transformar. Por exemplo, plantas dicotiledóneas e certas monocotiledóneas e gimnospérmicas podem ser transformadas através de tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacterium, tal como descrito, por exemplo por Bevan (Nucl. Acid Res. 12: 8711-8721, 1984). Os alvos para a introdução das construções de ADN do presente invento incluem tecidos, tais como tecido foliar, células disseminadas, protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas; cotilédones, hipocótilos e semelhantes. Um método preferido para transformação de eucalipto e pinheiro é um método biolístico utilizando pólen (ver, por exemplo, Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595: 53, 1996) ou tecidos embrionários facilmente regeneráveis. Outras técnicas de transformação que podem ser empregues de forma útil nos métodos do invento incluem as ensinadas por Ellis et al. (Plant Cell Reports, 8: 16-20, 1989), Wilson et al. (Plant Cell Reports 7: 704-707, 1989) e Tautorus et al. (Theor. Appl. Genet. 78: 531-536, 1989).
Uma vez transformadas as células, as que possuem a construção de ADN do invento incorporada no seu genoma podem ser seleccionadas por meio de um marcador, tal como o marcador de resistência a canamicina discutido acima. As 29 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ células transgénicas podem então ser cultivadas num meio apropriado para regenerar plantas inteiras, utilizando técnicas bem conhecidas na arte. No caso de protoplastos, a parede celular é deixada reformar sob condições osmóticas apropriadas. No caso de sementes ou embriões, é empregue um meio apropriado de germinação ou iniciação de callus. Para explantes, é utilizado um meio de regeneração apropriado. A regeneração de plantas está bem estabelecida para muitas espécies. Para uma revisão da regeneração de árvores florestais, ver Dunstan et al., "Somatic embryogenesis in woody plants", em Thorpe TA, ed., "In vitro embryogenesis of plants", Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture 20(12): 471-540, 1995. Protocolos específicos para a regeneração de abetos são discutidos em Roberts et al., ("Somatic embryogenesis of spruce," em Redenbaugh K, ed., "Synseed: applications of synthetic seed to crop improvement", CRC Press: Capítulo 23, págs. 427-449, 1993). As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas sexuadamente ou assexuadamente, utilizando métodos bem conhecidos na arte, para dar gerações sucessivas de plantas transgénicas.
Ainda noutro aspecto, o presente invento proporciona métodos para modificação do nível (concentração) ou actividade de um polipéptido num organismo hospedeiro, compreendendo a incorporação de forma estável no genoma da planta de uma construção compreendendo um polinucleótido do presente invento. As construções genéticas de adn do presente invento podem ser utilizadas para transformar uma variedade de organismos. Tais organismos incluem plantas, tais como angiospérmicas monocotiledóneas (p.ex., ervas, milho, cereais, aveia, trigo e cevada), e angiospérmicas dicotiledóneas (p.ex., Arabidopsis, tabaco, legumes, alfalfa, carvalhos, eucaliptos, ácer), e gimnospérmicas (p.ex., pinheiro silvestre; ver Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996), abeto branco (Ellis et al., Biotechnology 11: 94-92, 1993), e larício (Huang et al., In Vitro Cell 27: 201-207, 1991).
Em concretizações preferidas, as construções genéticas do presente invento são empregues para transformar plantas lenhosas, aqui definidas como uma árvore ou arbusto possuindo 30 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ um caule que vive durante vários anos e aumenta em diâmetro cada ano em consequência da adição de tecido lenhoso. A planta alvo é de preferência seleccionada a partir do grupo que consiste em espécies de eucalipto e pinheiro, de maior preferência a partir do grupo que consiste em Eucalyptus grandis e Pinus radiata, mas incluindo também qualquer uma das espécies na seguinte lista:
Pinheiros: Pinus banksiana, Pinus brutia, Pinus caribaea, Pinus clausa, Pinus contorta, Pinus coulteri, Pinus echinata, Pinus eldarica, Pinus ellioti, Pinus jeffreyi, Pinus lambertiana, Pinus monticola, Pinus nigra, Pinus palustrus, Pinus pinaster, Pinus ponderosa, Pinus resinosa, Pinus rígida, Pinus serotina, Pinus strobus, Pinus sylvestris, Pinus taeda, Pinus virginiana.
Outras gimnospérmicas: Abíes amabilis, Abíes balsamea, Abies concolor, Abies grandis, Abies lasiocarpa, Abies magnifica, Abies procera, Chamaecyparis lawsoniona, Chamaecyparis nootkatensis, Chanraecyparis thyoides, Huniperus virginiana, Larix decidua, Larix laricina, Larix leptolepis, Larix occidentalis, Larix siberica, Libocedrus decurrens, Picea abies, Picea engelmanni, Picea glauca, Picea mariana, Picea pungens, Picea rubens, Picea sitchensís, Pseudotsuga menziesii, Sequoia gigantea, Sequoia sempervirens, Taxodium distichum, Tsuga canadensís, Tsuga heterophylla, Tsuga mertensiana, Thuja occidentalis, Thuja plicata.
Eucaliptos: Eucalyptus alba, Eucalyptus bancroftii, Eucalyptus botyroides, Eucalyptus bridgesiana, Eucalyptus calophylla, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus citriodora, Eucalyptus cladocalyx, Eucalyptus coccifera, Eucalyptus curtisii, Eucalyptus dalrympleana, Eucalyptus deglupta, Eucalyptus delagatensis, Eucalyptus diversicolor, Eucalyptus dunnii, Eucalyptus ficifolia, Eucalyptus globulus, Eucalyptus gomphocephala, Eucalyptus gunnii, Eucalyptus henryi, Eucalyptus laevopinea, Eucalyptus macarthurii, Eucalyptus macrorhyncha, Eucalyptus maculata, Eucalyptus marginata, Eucalyptus megacarpa, Eucalyptus melliodora, Eucalyptus nicholii, Eucalyptus nitens, Eucalyptus nova-anglica, Eucalyptus obliqua, Eucalyptus obtusiflora, Eucalyptus 31 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ oreades, Eucalyptus pauciflora, Eucalyptus polybractea, Eucalyptus regnans, Eucalyptus resinifera, Eucalyptus robusta, Eucalyptus rudis, Eucalyptus sallgna, Eucalyptus sideroxylon, Eucalyptus stuartiana, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana, Eucalyptus urnlgera, Eucalyptus urophylla, Eucalyptus viminalís, Eucalyptus viridis, Eucalyptus wandoo, Eucalyptus youmanni; e híbridos de qualquer uma das espécies de cima.
Mais, os polinucleótidos do presente invento têm aplicação particular para utilização como marcadores não disruptivos para marcação de organismos, particularmente plantas. Outros organismos podem, no entanto, ser marcados com os polinucleótidos do presente invento, incluindo animais comercialmente valiosos, peixes, bactérias e leveduras. Construções compreendendo polinucleótidos do presente invento podem ser estavelmente introduzidas num organismo como marcadores heterólogos, não funcionais, não disruptivos. É então possível identificar a origem ou fonte do organismo numa data posterior através da determinação da presença ou ausência do marcador ou marcadores numa amostra de material. A detecção do marcador ou marcadores pode ser alcançada utilizando uma variedade de técnicas convencionais, e envolverá geralmente a utilização de sondas de ácido nucleico. A sensibilidade no ensaio da presença da sonda pode ser aumentada de forma útil através da utilização de oligonucleótidos ramificados, tal como descrito em Horn, T., Chang, CA. e Urdea, MS., "Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays", Nucleic Acids Research 25(23): 4842-4849, 1997, permitindo a detecção de apenas 50 moléculas de ADN na amostra.
Os seguintes exemplos são oferecidos como ilustração e não como limitação. 32 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
Exemplo 1
Isolamento e Caracterização de Clones de ADNc de Eucalyptus grandis
Duas bibliotecas de expressão de ADNc de Eucalyptus grandis (uma de uma mistura de vários tecidos de uma única árvore e uma de folhas de uma única árvore) foram construídas e pesquisadas como se segue.
Foi extraído ARNm de tecido vegetal utilizando o protocolo de Chang et al. (Plant Molecular Biology Repórter 11: 113-116, 1993) com pequenas modificações. Especificamente, as amostras foram dissolvidas em CPC-RNAXB (Tris-Cl 100 mM, pH 8,0; EDTA 25 mM; NaCl 2,0 M; CTAB a 2%; PVP a 2% e Spennidine*3-HCl a 0,05%) e extraídas com clorofórmio:álcool isoamílico, 24:1. O ARNm foi precipitado com etanol e o preparado de ARN total foi purificado utilizando um Estojo de Isolamento de ARNm Poli(A) Quik (Stratagene, La Jolla, CA) . Uma biblioteca de expressão de ADNc foi construída a partir do ARNm purificado através de síntese por transcritase reversa seguida de inserção dos clones de ADNc resultantes em Lambda ZAP utilizando um Estojo de Síntese de ADNc ZAP Express (Stratagene), de acordo com o protocolo do fabricante. Os ADNcs resultantes foram empacotados utilizando um Extracto de Empacotamento Gigapack II (Stratagene) empregando 1 μΐ de ADN da amostra de 5 μΐ de mistura de ligação. A excisão massiva da biblioteca foi feita utilizando células XLl-Blue MRF' e células XLOLR (Stratagene) com fago ajudante ExAssist (Stratagene). Os fagomídeos excisados foram diluídos com caldo NZY (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) e plaqueados em placas de agar LB-canamicina contendo x-gal e isopropiltio-beta-galactósido (IPTG) .
Das colónias plaqueadas e apanhadas para miniprep de ADN, 99% continham uma inserção adequada para sequenciação. As colónias positivas foram cultivadas em caldo NZY com canamicina e o ADNc foi purificado por meio de lise alcalina e precipitação em polietilenoglicol (PEG). Um gel de agarose a 1% foi utilizado para pesquisar moldes de sequenciação para contaminação cromossómica. Sequências iniciadoras com corante 33 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ foram preparadas utilizando uma máquina Turbo Catalyst 800 (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.
As sequências de ADN para os clones positivos foram obtidas utilizando um sequenciador Prism 377 de Perkin Elmer/Applied Biosystems, os clones de ADNc foram sequenciados primeiro a partir da extremidade 5' e, nalquns casos, também a partir da extremidade 3'. Para alguns clones a sequência interna foi obtida utilizando fragmentos subclonados. A subclonagem foi efectuada utilizando procedimentos padrão de mapeamento de restrição e subclonagem no vector pBluescript II SK+.
As sequências de ADNc determinadas foram comparadas com sequências conhecidas na base de dados EMBL (edição 46, Março de 1996) utilizando o algoritmo FASTA de Fevereiro de 1996 (Versão 2.0.4) (disponível na Internet no sítio ftp ftp;//ftp.virginia.edu/pub/fasta/) ou o algoritmo BLASTN, Versão 2.0.4 [24-Fev-1998], ou Versão 2.0.6 [16-Set-1998], definidos para os parâmetros preferidos descritos acima. Múltiplos alinhamentos de sequências redundantes foram utilizados para construir sequências de consenso de confiança. Com base na semelhança com sequências conhecidas de outras espécies vegetais, os polinucleótidos isolados do presente invento foram identificados como codificando uma enzima especificada.
Utilizando os procedimentos descritos acima, foram isoladas sequências de ADNc derivadas da biblioteca de Eucalyptus grandis codificando os seguintes polipéptidos: PAL C4H (SEQ ID NO:161); C3H; F5H; OMT; CCR; CAD; CGT; CBG; PNL; LAC; POX; ácido cafeico-metil-transferase; cafeoil-CoA-metil-transferase; coumarato-Co-A-ligase; citocromo P450 LXX1A; difenol-oxidase; flavonol-glucosil-transferase; flavonóide-hidroxilase; e isoflavona-redutase. 34 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
Exemplo Comparativo 2
Isolamento e Caracterização de Clones de ADNc de Pinus radiata
Isolamento de clones de ADNc através de pesquisa de elevado rendimento
Uma biblioteca de expressão de ADNc de Pinus radiata foi construída a partir de xilema e pesquisada tal como descrito acima no Exemplo 1. As sequências de ADN para os clones positivos foram obtidas utilizando iniciadores directos e inversos num sequenciador Prism 377 de Perkin Elmer/Applied Biosystems e as sequências determinadas foram comparadas com sequências conhecidas na base de dados EMBL tal como descrito acima.
Exemplo Comparativo 3 a) Transformação de plantas de tabaco exemplificada através da utilização de um gene de OMT de Pinus radiata
Construções com sentido e anti-sentido contendo um polinucleótido incluindo a região de codificação de uma OMT de Pinus radiata foram inseridas em Agrobacterium tumefaciens LBA4301 (proporcionada como uma oferta pelo Dr. C. Kado, University of Califórnia, Davis, CA) através de transformação directa utilizando métodos publicados (ver, An, G., Ebert, PR., Mitra, A., Ha, SB., "Binary Vectors," em Gelvin, SB., Schilperoort, RA., eds., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, 1988). A presença e integridade das construções transgénicas foram verificadas através de digestão de restrição e sequenciação de adn.
Foram transformadas secções de folha de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Samsun) utilizando o método de Horsch et al. (Science, 227: 1229-1231, 1985). 35 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ b) Efeitos da OMT de Pinus na concentração de lenhina em plantas transformadas A concentração de lenhina nas plantas de tabaco transformadas foi determinada utilizando o procedimento bem estabelecido de extracção com ácido tioglicólico (ver, Freudenberg et al.r "Constitution and Biosynthesis of Lignin", Springer-Verlag: Berlin, 1968). Resumidamente, plantas de tabaco inteiras, com uma idade média de 38 dias, foram congeladas em azoto liquido e moídas num pó fino num almofariz com pilão. 100 mg de pó congelado de uma linha de plantas de controlo transformadas com vector vazio, das cinco linhas de plantas transformadas independentes contendo a construção com sentido para OMT e das oito linhas de plantas transformadas independentes contendo a construção anti-sentido para OMT foram extraídos individualmente com metanol, seguido de ácido tioglicólico a 10% e finalmente dissolvidos em NaOH 1 M. Os extractos finais foram ensaiados quanto à absorvância a 280 nm.
Exemplo Comparativo 4 a) Transformação de plantas de tabaco exemplificada através da utilização de um gene de 4CL de Pinus radiata
Construções com sentido e anti-sentido contendo um polinucleótido incluindo a região de codificação de uma 4CL de Pinus radiata foram inseridas em Agrobacterium tumefaciens LBA4301 através de transformação directa tal como descrito acima. A presença e integridade das construções transgénicas foram verificadas através de digestão de restrição e sequenciação de ADN.
Foram transformadas secções foliares de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Samsun) tal como descrito acima. b) Efeitos da 4CL de Pinus na concentração de lenhina em plantas transformadas A concentração de lenhina em amostras de material vegetal transformado foi determinada tal como descrito no Exemplo 3. 36 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
Exemplo 5
Transformação de Tabaco utilizando os Genes Biossintéticos da Lenhina
Construções com sentido e anti-sentido contendo polinucleótidos incluindo as regiões de codificação de C3H (SEQ ID NO:18), F5H (SEQ ID N0:19), CCR (SEQ ID NO:26) e CGT (SEQ ID N0:31) de Eucalyptus grandis, e OMT (SEQ id N0:6), PAL (SEQ ID NO:45 e 47), C4H (SEQ ID NO:48 e 49), PNL (SEQ ID NO:81) e LAC (SEQ ID NO:83) de Pinus radiata foram inseridas em Agrobacterium tumefaciens LBA4301 através de transformação directa tal como descrito acima. A presença e integridade de construções transgénicas foram verificadas através de digestão de restrição e seguenciação de ADN.
Foram transformadas secções foliares de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Samsun) tal como descrito no Exemplo 3. Foram estabelecidas até doze linhas de plantas transformadas independentes para cada construção com sentido e cada construção anti-sentido listadas no parágrafo anterior. As plantas transformadas contendo a construção génica de lenhina apropriada foram verificadas utilizando experiências de Southern blot. Todas as linhas de plantas transformadas analisadas foram confirmadas como linhas transformadas independentes.
Exemplo 6
Manipulação do Teor de Lenhina em Plantas Transformadas a) Determinação da expressão do transgene através de experiências de Northern blot ARN total foi isolado a partir de cada linha de planta transformada independente descrita no Exemplo 5. As amostras de ARN foram analisadas em experiências de Northern blot para determinar o nivel de expressão do transgene em cada linha transformada. A coluna marcada como "Northern" na Tabela 2 mostra o nivel de expressão do transgene para todas as linhas de plantas ensaiadas, relativamente ao fundo nos Northern 37 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ blots. Não houve hibridação detectável com amostras de ARN das plantas de controlo transformadas com vector vazio. b) Determinação da concentração de lenhina em plantas transformadas A concentração de lenhina em linhas de plantas de controlo transformadas com vector vazio e em até doze linhas transformadas independentes para cada construção com sentido e cada construção anti-sentido descritas no Exemplo 5 foi determinada tal como descrito no Exemplo 3. A coluna marcada como "TGA" na Tabela 2 mostra as lenhinas extraíveis com ácido tioglicólico para linhas de plantas transformadas com C3H, F5H, CCR, PAL, C4H, PNL e LAC, expressas como percentagem média de lenhinas extraiveis com TGA em plantas transformadas versus plantas de controlo. 0 intervalo de variação é indicado dentro de parênteses.
Tabela 2 transgene orientação n°. de linhas Northern TGA controlo na 3 branco 100 (92-104) C3H com sentido 5 3,7E+4 74 (67-85) F5H com sentido 10 5,8E+4 70 (63-79) F5H anti-sentido 9 5,8E+4 73 (35-93) CCR com sentido 1 na 74 CCR anti-sentido 2 na 74 (62-86) PAL com sentido 5 1,9E+5 77 (71-86) PAL anti-sentido 4 1,5E+4 62 (37-77) C4H anti-sentido 10 5,8E+4 86 (52-113) PNL anti-sentido 6 1,2E+4 88 (70-114) LAC com sentido 5 1,7E+5 na LAC anti-sentido 12 1,7E+5 88 (73-114)
A Fig. 2 ilustra a quantidade de lenhina extraivel, em percentagem de teor de lenhina de tipo selvagem, em plantas de tabaco transformadas com construções de PAL (com sentido e anti-sentido), C4H (anti-sentido), C3H (com sentido), F5H (com sentido e anti-sentido), C5H (com sentido e anti-sentido) C3H (com sentido; referido como COMT na Fig. 2), OMT 38 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ (com sentido e anti-sentido; referido como CCOMT na Fig. 2), 4CL (com sentido e anti-sentido), CCR (com sentido e anti-sentido) e CGT (anti-sentido) tal como descrito no Exemplo 5. As quantidades de lenhina extraivel com ácido tioglicólico foram medidas em plantas transgénicas, normalizadas para as plantas de controlo de vector vazio. Três extractos foram independentemente derivados de cada uma de aproximadamente 10 plantas transgénicas independentemente derivadas. A média dos três extractos é mostrada através de um ponto negro, como o valor de lenhina para essa planta. A média de dez plantas transgénicas independentes transformadas com uma dada construção de ADNc é mostrada como uma barra. A média das plantas de controlo transformadas com vector vazio é mostrada como um X. O valor para os controlos é extrapolado ao longo do campo para facilitar a comparação. As barras negras indicam médias que são significativamente reduzidas (p<0,05) no teor de lenhina em relação às plantas de controlo. As barras cinzentas indicam médias que não são significativamente mudadas em relação às plantas de controlo.
As linhas de plantas transformadas contendo as construções de genes biossintéticos de lenhina com sentido e anti-sentido exibiram um nivel médio de teor de lenhina que foi significativamente inferior ao das linhas de plantas de controlo transformadas com vector vazio. Os efeitos mais dramáticos na concentração de lenhina foram observados nas plantas com OMT com sentido, e nas plantas com PAL com sentido. Estes dados indicam claramente que a concentração de lenhina, tal como medido através do ensaio de TGA, pode ser directamente manipulada através de metodologia anti-sentido convencional e também através de sobre-expressão com sentido utilizando os genes biossintéticos de lenhina do invento. SEQ ID NOS: 161 e 48, 49, 18, 81, 6, 26, 45, 47, 31, 83, 19 (comparativa) são expostas na Listagem de Sequências anexa. Os códigos para as sequências nucleotidicas utilizados na Listagem de Sequências anexa, incluindo o símbolo "n", obedecem a WIPO Standard ST.25 (1998), Apêndice 2, Tabela 1. 39 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> ArborGen, LLC <120> Materiais e Métodos para a Modificação do Teor de Lenhina de Plantas <130> SMK/FP6426225 <140> EP 07005020.8 <141> 1999-10-06 <150> EP 99954500.7 <151> 1999-10-06 <150> PCT/NZ99/00168 <151> 1999-10-06 <150> US 09/169,789 <151> 1998-10-09 <150> US 60/143,811 <151> 1999-07-14 <170> FastSEQ para Windows Versão 3.0 < 210 > 6 <211> 1026
< 212 > ADN <213> Pinus radiata < 4 0 0 > 6 gaattcggca cgagctttga ggcaacctac attcattgaa tcccaggatt tcttcttgtc 60 caaacaggtt taaggaaatg gcaggcacaa gtgttgctgc agcagaggtg aaggctcaga 120 caacccaagc agaggagccg gttaaggttg tccgccatca agaagtggga cacaaaagtc 180 ttttgcagag cgatgccctc tatcagtata tattggaaac gagcgtgtac cctcgtgagc 240 ccgagccaat gaaggagctc cgcgaagtga ctgccaagca tccctggaac ctcatgacta 200 cttctgccga tgagggtcaa tttctgggcc tcctgctgaa gctcattaac gccaagaaca 360 ccatggagat tggggtgtac actggttact cgcttctcag cacagccctt gcattgcccg 420 atgatggaaa gattctagcc atggacatca acagagagaa ctatgatatc ggattgccta 480 ttattgagaa agcaggagtt gcccacaaga ttgacttcag agagggccct gctctgccag 540 ttctçgacga actgcttaag aatgaggaca tgcatggatc gttcgatttt gtgttcgtgg 600 atgcggacaa agacaactat ctaaactacc acaagcgtct gatcgatctg gtgaaggttg 660 gaggtctgat tgcatatgac aacaccctgt ggaacggatc tgtggtggct ccacccgatg 120 ctcccctgag gaaatatgtg agatattaca gagatttcgt gatggagcta aacaaggccc 780 ttgctgtcga tccocgcatt gagatcagcc aaatcccagt cggtgacggc gtcacccttt 840 gcaggcgtgt ctattgaaaa caatccttgt ttctgctcgt ctattgcaag cataaaggct 900 ctccgattat aaggagaacg ctataatata tggggttgaa gccatttgtt ttgtttagtg 960 tattgataat aaagtagtac agcatatgca aagtttgtat caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaa 1026
< 210 > 18 <211> 414 <212> ADN <213> Eucalyptus grandis 40 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ <4 0 0> 18 cacgctcgac gaattcggta ccccgggttc gaaatcgata agcttggatc caaagcaaca 60 cattgaactc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tcccccaccc ccccttccca 120 accccaccca catacagaca agtagatacg cgcacacaga agaagaaaag atgggggttt 180 caatgcagtc aatcgcacta gcgacggttc tggccgtcct aacgacatgg gcgtggaggg 240 cggtgaactg ggtgtggctg aggccgaaga ggctcgagag gcttctgaga cagcaaggtc 300 tctccggcaa gtcctacacc ttcctggtcg gcgacctcaa ggagaacctg cggatgctca 360 aggaagccaa gtccaagccc atcgccgtct ccgatgacat caagcctcgt ctct 414
<210> 19 <211> 469 <212> ADN <213> Eucalyptus grandis <400> 19 gaattcggca cgagtgtctc tctctctctc tctctctgta aaccaccatg ctcttcctca 60 ctcatctcct agcagttcta ggggttgtgt tgctcctgct aattctatgg agggcaagat 120 cttctccgaa caaacccaaa ggtactgcct tacccccgga gctgccgggc gcatggccga 180 tcataggcca catccacttg ctgggcggcg agaccccgct ggccaggacc ctgçccgcca 240 tggcggacaa gcagggcccg atgtttcgga tccgtctcgg agtccacccg gcgaccatca 300 taagcagccg tgaggcggtc cgggagtgct tcaccaccca cgacaaggac ctcgcttctc 360 gccccaaatc caaggcggga atccacttgg gctacgggta tgccggtttt .ggcttcgtag 420 aatacgggga cttttggcgc gagatgagga agatcaccat gctcgagct 469
<210> 26 <211> 508 <212> ADN <213> Eucalyptus grandis <400> 26 gaattcggta cccçggttcg aaatcgataa gcttggatcc aaagaattcg gcacgagatc 60 actaaccatc tgcctttctt catcttcttt cttctgcttc tcctccgttt cctcgtttcg 120 atatcgtgaa aggagtccgt cgacgacaat ggccgagaag agcaaggtcc tgatcatcgg 180 agggacgggc tacgtcggca agttcatcgt ggaagcgagt gcaaaagcag ggcatcccac 240 gttcgcgctg gttaggcaga gcacggtctc cgaccccgtc aagggccagc tcgtcgagag 300 cttcaagaac ttgggcgtca ctctgctcat cggtgatctg tacgatcatg agagcttggt 360 gaaggcaatc aagcaagccg acgtggtgat atcgacagtg gggcacatgc aaatggcgga 420 tcagaccaaa gaatcgtcga cgccattaaa ggaagctggc aacgttaagg tttgttggtt 480 ggttcatttg atctggtttg ggggggtc 508
<210> 31 <211> 468 <212> ADN <213> Eucalyptus grandis <400> 31 gaattcggca cgagaactca tcttgaaatg tcattggagt catcatcctc tagtgagaag 60 aaacaaatgg gttccgccgg attcgaatcg gccacaaagc cgcacgccgt ttgcattccc 120 taccctgcac aaagccacat tggcgccatg ctcaagctag caaagctcct ccatcacaag 180 ggcttccaca tctccttcgt caacaccgag ttcaaccacc ggcggctcgc cagggctcga 240 ggccccgagt tcacaaatgg aatgctgagc gactttcagt tcctgacaat ccccgatggt 300 cttcctcctt cggacttgga tgcgatccaa gacatcaaga tgctctgcga atcgtccagg 360 aactatatgg tcagccccat caacgatctt gtatcgagcc tgggctcgaa cccgagcgtc 420 cctccggtga cttgcatcaa tctcggatgg tttcatgaca ctcgtgac 468
<210> 45 <211> 684 <212> ADN <213> Pínus radiata 41 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ <4Ο0> 45 gaattcctgc agcccggggg atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc 60 gcgcgcctgc aggtcgacac tagtggatcc aaagaattcg gcacgaggcc cgacggccac 120 ttgttggacg ccatggaagc tctccggaaa gccgggattc Cggaaccgtt taaactgcag 180 cccaaggaag gactggctct cgtcaacggc acagcggtgg gatccgccgt ggccgcgtcc 240 gtctgttttg acgccaacgt gctgggcgtg ctggctgaga ttctgtctgc gctcttctgc 300 gaggtgatgc aagggaaacc ggagttcgta gatccgttaa cccaccagct gaagcaccac 360 ccagggcaga tcgaagccgc ggccgtcatg gagttcctcc tcgacggtag cgactacgtg 420 aaagaagcag cgcggcttca cgagaaagac ccgttgagca aaccgaaaca agaccgctac 480 gctctgcgaa catcgccaca gtggttgggg cctccgatcg aagtcatccg cgctgctact 540 cactccatcg agcgggagat caattccgtc aacgacaatc cgttaatcga tgtctccagg 600 gacatggctc tccacggcgg caacttccag ggaacaccca tcggagtttc catggacaac 660 atgcgaatct ctttggcagc cgtc 684
<210> 47 <211> 479 <212> ADN <213> Pinus radiata <400> 47 gatatcccaa cgaccgaaaa cctgtatttt cagggcgcca tggggatccg gaattcggca 60 cgagcaagga agaaaatatg gttgcagcag cagaaattac gcaggccaat gaagttcaag 120 ttaaaagcac tgggctgtgc acggacttcg gctcgtccgg cagcgatcca ctgaactggg 180 ttcgagcagc caaggccatg gaaggaagtc actttgaaga agtgaaagcg atggtggatt 240 cgtatttggg agccaaggag atttccattg aagggaaatc tctgacaatc tcagacgttg 300 ctgccgttgc tcgaagatcg caagtgaaag tgaaattgga tgctgcggct gccaaatcta 360 gggtcgagga gagttcaaac tgggttctca cccagatgac caaggggacg gatacctatg 420 gtgtcactac tggtttcgga gccacttctc acaggagaac gaaccaggga gccgagctt 479
<210> 48 <211> 1785 <212> ADN <213> Pínus radiata 42 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ <4Ο0> 48 tatcgataag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc 60 cgccaccgcg gtggagctcg cgcgcctgca ggtcgaeact agtggatcca aagaattcgg 120 cacgaggttg caggtcgggg atgatttgaa tcacagaaac ctcagcçatt ttgccaagaa 180 atatggcaaa atctttctgc tcaagatggg ccagaggaat cttgtggtag tttcatctcc 240 cgatctcgcc aaggaggtcc tgcacaccca gggcgtcgag tttgggtctc gaacccggaa 300 cgtggtgttc gatatcttca cgggcaaggg gcaggacatg gtgttcaccg tctatggaga 360 tcactggaga aagatgcgca ggatcatgac tgtgcctttc tttacgaata aagttgtcca 420 gcactacaga ttcgcgtggg aagacgagat cagccgcgtg gtcgcggatg tgaaatcccg 480 cgccgagtct tccacctcgg gcattgtcat ccgtaggcgc ctccagctca tgatgtataa 540 tattatgtat aggatgatgt tcgacaggag attcgaatcc gaggacgacc cgcttttcct 600 caagctcaag gccctcaacg gagagcgaag tcgattggcc cagagctttg agtacaatta 660 tggggatttc attcccattc ttaggccctt cctcagaggt tatctcagaa tctgcaatga 120 gattaaagag aaacggctct ctcttttcaa ggactacttc gtggaagagc gcaagaagct 780 caacagtacc aagactagta ccaacaccgg gggagctcaa gtgtgcaatg gaccatattt 840 tagatgctca ggacaaggga gagatcaatg aggataatgt tttgtacatc gttgagaaca 900 tcaacgttgc agcaattgag acaacgctgt gçtcgatgga'atggggaata gcggagctgg 960 tgaaccacca ggacattcag agcaaggtgc gcgcagagct ggacgctgtt cttggaccag 1020 gcgtgcagat aacggaacca gacacgacaa ggttgcccta ccttcaggcg gttgtgaagg 1080 aaacccttcg tctccgcatg gcgatcccgt tgctcgtccc ccacatgaat ctccacgacg 1140 ccaagctcgg gggctacgat attccggcag agagcaagat cctggtgaac gcctggtggt 1200 tggccaacaa ccccgccaac tggaagaacc ccgaggagtt ccgccccgag cggttcttcg 1260 aggaggagaa gcacaccgaa gccaatçgca acgacttcaa attcctgcct tcggtgtggg 1320 gaggaggagc tgcccgggaa tcattctggc gctgcctctc ctcgcactct ccatcggaag 1380 acttgttcag aacttccacc ttctgccgcc gcccgggcag agcaaagtgg atgtcactga 1440 gaagggcggg cagttcagcc ttcacattct caaccattct ctcatcgtcg ccaagcccat 1500 agcttctgct taatcccaac ttgtcagtga ctggtatata aatgcgcgca cctgaacaaa 1560 aaacactcca tctatcatga ctgtgtgtgc gtgtccactg tcgagtctac taagagctca 1620 tagcacttca aaagtttgct aggatttcaa taacagacac cgtcaattat gtcatgtttc 1680 aataaaagtt tgcataaatt aaatgatatt tcaatatact attttgactc tccaccaatt 1740 ggggaatttt actgctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1785
<210> 49 <211> 475 <212> ADN <213> Pinus radiata <400> 49 gaattcggca egagatttcc atggacgatt ccgtttggct tcaattcgtt tcctctggct 60 gtcctcgtcc tcgttttcct tgttcttcct ccgacttttt ctctggaagc tatggcgtaa 120 taggaacctg ccgccaggac ccccggcatg gccgatcgta gggaacgtcc ttcagattgg 180 attttccagc ggcgcgttcg agacctcagt gaagaaattc catgagagat acggtccaat 240 attcactgtg tggctcggtt cccgccctct gctgatgatc accgaccgcg agcttgccca 300 cgaggcgctc gtacagaagg gctccgtctt cgctgaccgc ccgcccgccc tcgggatgca 360 gaaaatcttc agtagcaacc agcacaacat cacttcggct gaatacggcc cgctgtggcg 420 gagccttcgc aggaatctgg ttaaagaagc cctgagactt cggcgatgaa ggctt 475
<210> 81 <211> 957 <212> ADN <213> Pinus radiata 43 ΕΡ 1 826 265/ΡΤ <4Ο0> 81 gaattcggca cgagaaagcc ctagaatttt ttcagcatgc tatcacagcc ccagcgacaa 60 ctttaactgc aataactgtg gaagcgtaca aaaagtttgt cctagtttct ctcattcaga 120 ctggtcaggt tccagcattt ccaaaataca cacctgctgt tgtccaaaga aatttçaaat 180 cttgcactca gccctacatt gatttagcaa acaactacag tagtgggaaa atttctgtat 240 tggaagcttg tgtcaacacg aacacagaga agttcaagaa tgatagtaat ttggggttag 300 tcaagcaagt tttgtcatct ctttataaac ggaatattca gagattgaca cagacatatc 360 tgaccctctc tcttcaagac atagcaagta cggtacagtt ggagactgct aagcaggctg 420 aactccatgt tctgcagatg attcaagatg gtgagatttt tgcaaccata aatcagaaag 480 atgggatggt gagcttcaat gaggatcccg aacagtacaa aacatgtcag atgactgaat 540 atatagatac tgcaattcgg agaatcatgg cactatcaaa gaagctcacc acagtagatg 600 agcagatttc gtgtgatcat tcctacctga gtaaggtggg gagagagcgt tcaagatttg 660 acatagatga ttttgatact gttccccaga agttcacaaa tatgtaacaa atgatgtaaa 720 tcatcttcaa gactcgctta tattcattac tttctatgtg aattgatagt ctgttaacaa 780 tagtactgtg gctgagtcca gaaaggatct ctcggtatta tcacttgaca tgccatcaaa 840 aaaatctcaa atttctcgat gtctagtctt gattttgatt atgaatgcga cttttagttg 900 tgacatttga gcacctcgag tgaactacaa agttgcatgt taaaaaaaaa aaaaaaa 957
<210> 83 <211> 471 <212> ADN <213> Pinus radiata <400> 83 gaattcggca cgagaaaacc ttttcagacg aatgttctga tgctcggccc cggccagaca 60 acagacatac ttctcactgc caatcaggct acaggtagat actacatggc tgctcgagca 120 tattccaacg ggcaaggagt tcccttcgat aacaccacta ccactgccat tttagaatac 180 gagggaagct ctaagacttc aactccagtc atgcctaatc ttccattcta taacgacacc 240 aacagtgcta ctagcttcgc taatggtctt agaagcttgg gctcacacga ccacccagtc 300 ttcgttcctc agagtgtgga ggagaatctg ttctacacca tcggtttggg gttgatcaaa 360 tgtccggggc agtcttgtgg aggtccaacg gatcaagatt tgcagcaagt atgaatacat 420 atcatttgtc ccgcaaccac ttcttccaat ccttcaagct cagcattttg g 471
< 210 > 161 <211> 412 < 212 > ADN <213> Eucalyptus grandis <4 0 0> 161 cgccacctcc ctcctcctct tccccctcct cctgctcctc ctggtcgccc cgcaaaagcc 60 ctccgcctct gtccgcagtc accgccagcc atggatctcc tcctcctgga gaagaccctc 120 ctgggcctct tcgccgccgc catcgtggcc atcgcggtct ccaagctccg gggcaagcgg 180 ttccgcctcc ccccgggccc cctccccgtg cccatcttcg gcaactggct ccaggtcggc 240 gacgacctca accaccgcaa cctcaccgac ctcgccaaga ggttcggcga catcctcctc 300 ctccgcatgg ggcagcgcaa cctcgtggtc gtctcgtccc cggacctctc caaggaggtg 360 ctccacacgc agggcgtcga gttcgggtcc cgcacccgga acgtcgtctt ct 412
Lisboa, 2011-04-12

Claims (17)

  1. ΕΡ 1 826 265/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido isolado compreendendo uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 161; (2) um complemento inteiro de SEQ ID N0:161; (3) um complemento inverso inteiro de SEQ ID N0:161; (4) uma sequência polinucleotídica possuindo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO:161, em que o polinucleótido codifica um polipéptido possuindo actividade de cinamato-4-hidroxilase (C4H).
  2. 2. Construção genética compreendendo o polinucleótido da reivindicação 1 operativamente ligado a uma sequência promotora de um gene.
  3. 3. Célula transgénica compreendendo uma construção genética de acordo com a reivindicação 2.
  4. 4. Construção tal como reivindicada na reivindicação 2 compreendendo, na direcção 5'-3': (a) uma sequência promotora de um gene; (b) o polinucleótido da reivindicação 1; e (c) uma sequência de terminação de um gene.
  5. 5. Construção da reivindicação 4, em que o polinucleótido está numa orientação com sentido.
  6. 6. Construção da reivindicação 4, em que o polinucleótido está numa orientação anti-sentido.
  7. 7. Construção da reivindicação 4, em que a sequência promotora de um gene é funcional numa célula vegetal.
  8. 8. Construção da reivindicação 5, em que a sequência promotora de um gene é um promotor especifico de um tecido vegetal.
  9. 9. Construção da reivindicação 5, em que a sequência promotora de um gene proporciona a transcrição no xilema. ΕΡ 1 826 265/ΡΤ 2/2
  10. 10. Célula vegetal transgénica estavelmente transformada com a construção da reivindicação 4.
  11. 11. Planta transgénica compreendendo a célula vegetal transgénica da reivindicação 10.
  12. 12. Método para modulação de um ou mais de teor de lenhina, composição da lenhina e estrutura da lenhina de uma planta, compreendendo a transformação da planta com uma construção genética recombinante compreendendo o polinucleótido da reivindicação 1.
  13. 13. Método da reivindicação 12, em que a planta é seleccionada a partir do grupo que consiste em espécies de eucalipto e pinheiro.
  14. 14. Método da reivindicação 12 compreendendo a transformação da planta com a construção da reivindicação 4.
  15. 15. Método para produção de uma planta transgénica possuindo um ou mais de teor alterado de lenhina, composição alterada da lenhina e estrutura alterada da lenhina, compreendendo: (a) a transformação de uma célula vegetal com uma construção da reivindicação 4 para proporcionar uma célula transgénica; e (b) a cultura da célula transgénica sob condições que conduzam à regeneração e crescimento da planta madura.
  16. 16. Método para modificação da actividade de um polipéptido envolvido numa via biossintética da lenhina numa planta compreendendo a transformação da planta com a construção da reivindicação 4.
  17. 17. Polipéptido isolado codificado por uma sequência polinucleotidica isolada da reivindicação 1 em que o polipéptido tem actividade de cinamato-4-hidroxilase (C4H) . Lisboa, 2011-04-12 EP 1 826 265/PT 1/2 FIGURA 1 L-fenilalanina 1 Fenilalanina-Amónia-Liase (PAL) cinamato 1 Cinamato-4-Hidroxilase (C4H) para-coumarato 1 Coumarato-3-Hidroxilase (C3H) cafeato 1 O-Metil-Transferase (OMT) ferulato 1 4-Coumarato:CoA-Liase (4CL) feruloil-CoA | Cinamoil-CoA-Redutase (CCR) coniferaldeído 1 Álcool Cinamílico-Desidrogenase (CAD álcool coniferllico 1 Coniferol-Glucosil-Transferase (CGT) forma glicosilada | Coniferina-beta-Glucosidase (CBG) forma desglicosilada 1 1 1 Fenolase (PNL) Lacase (LAC) Peroxidase (POX) LENHINA ΕΡ 1 826 265/ΡΤ 2/2 FIGURA 2
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