PT1807048E - Composição de micelas inversas para administração de catiões metálicos compreendendo um diglicérido e um fitosterol e método de preparação - Google Patents

Description

ΡΕ1807048 - 1 -

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO DE MICELAS INVERSAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE CATIÕES METÁLICOS COMPREENDENDO ΌΜ DIGLICÉRIDO E DM FITOSTEROL E MÉTODO DE PREPARAÇÃO"

DOMÍNIO DO INVENTO O presente invento refere-se a um método para a preparação de micelas inversas com base em esteróis, acilgliceróis e sais metálicos através de agitação mecânica ou de sonicação. As micelas inversas obtidas pelo método do invento, são capazes de atravessar a mucosa e então as membranas celulares. Estas permitem assim a intemalização de iões metálicos pelas células alvo. Estas são vantajosamente úteis a nível industrial nos domínios farmacêutico e dietético.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Ao longo dos últimos anos têm sido propostas várias aproximações para melhorar a administração de fármacos no local alvo. Primeiro o fármaco deve ser administrado através de uma via adequada e fácil, tal como oralmente ou rectalmente e em segundo lugar o ingrediente activo deve ser administrado nas células alvo sob uma forma activa. Não existe um dispositivo correntemente disponível que permita tal transporte vectorizado de moléculas -2- PE 1807048 activas.

Muitas publicações e patentes descrevem métodos para encapsular ingredientes activos em nano ou micro-partículas, mas o problema não resolvido até à data é, por um lado, o de proporcionar uma via fácil de administração diferente da via injectável, i.e. oral ou bucal e, por outro lado, ter uma administração quase completa do produto activo nos locais alvo. 0 melhor exemplo desta impossibilidade é a pesquisa durante décadas para desenvolver uma insulina administrada oralmente. Por exemplo, os sistemas de administração descritos até aqui permitiram uma absorção de insulina de apenas 2-5%.

Os inventores verificaram previamente que agitando dois tipos de lípidos com alguns sais metálicos isso permitia aumentar a biodisponibilidade do sal e, consequentemente, obter a mesma actividade terapêutica com doses 1000 a 5000 vezes inferiores; a toxicidade potencial dos referidos sais pode ser então reduzida (ver os documentos US 6.129.924, WO 02/36134 e WO 2004/075990, por exemplo).

Os inventores verificaram em particular que certos produtos, fracções vegetais ou complexos destas fracções com metais de outro modo inactivos ou insuficientemente activos, tais como os agentes hipocolesterolémicos tinham actividades consideravelmente aumentadas quando estas eram administradas numa solução de -3- PE 1807048 azeite. Isto resultou em procurar quais de entre os vários componentes do azeite poderiam conduzir, por mistura ou reacção com os produtos testados, a produtos mais activos. É, deste modo, que os inventores foram capazes de identificar novos produtos indicados segundo a designação "complexos organometálicos" e obtidos por reacção entre um derivado de vanádio num estado de oxidação 4 ou 5 e dois compostos orgânicos isolados de extractos de plantas e, respectivamente, constituídos por sitosteróis e acilgliceróis.

Os inventores verificaram também que complexos semelhantes podem ser preparados a partir de outros derivados de metais em que o metal está num estado de oxidação pelo menos igual a 2 e conhecido pela sua actividade antidiabética.

Estes também verificaram que complexos semelhantes podem ser obtidos a partir de dois tipos de derivados orgânicos mencionados previamente e vários catiões de metais úteis como biocatalisadores em metabolismos de seres vivos, sendo estes complexos, em todos os casos, agentes particularmente eficazes como vectores dos referidos catiões. "Catiões com actividade biocatalítica" refere-se a catiões possuindo uma actividade biocatalítica directa e catiões capazes de substituírem biocatalisadores e assim de modificar certas vias metabólicas patológicas. O exemplo do -4- PE 1807048 vanádio pode ser mencionado, pela razão de que a sua química de coordenação semelhante pode substituir o fosfato: deste modo, quer as fosfatases ácidas quer alcalinas são inibidas pelos compostos vanadilo e vanadato; assim também é a tirosina fosfatase que induz uma estimulação das fosforilação da tirosina do receptor periférico de insulina assim como as proteína cinases associadas. O presente invento proporciona agora um método para preparar micelas inversas, compreendendo um ou mais sais metálicos, podendo as tais micelas inversas ser administradas através de quaisquer vias, em particular via mucosa e capazes de atravessar as membranas celulares. Este processo torna vantajosamente possível o controlo e a optimização da composição compreendendo micelas para as suas ulteriores utilizações nos domínios farmacêutico e dietético.

SUMÁRIO DO INVENTO O invento refere-se a um méteodo para preparar micelas inversas com base em esteróis, acilgliceróis e sais metálicos, que se pretende sejam utilizadas nos domínios farmacêutico e dietético. O invento refere-se também a micelas inversas com um núcleo aquoso inferior ou igual a 100 nm, em que as referidas micelas são obtidas através de um método de -5- PE 1807048 preparação compreendendo: (a) contacto entre (i) esterol, (ii) acilglicerol, preferencialmente diacilglicerol de ácidos gordos, (iii) água (em particular água purificada), (iv) um catião metálico, (b) agitação da mistura obtida no passo (a) a 40°C ou menos e durante um tempo suficiente para se obter a formação de micelas inversas, sendo a referida agitação realizada mecanicamente a uma velocidade de cerca de 1000 até cerca de 5000 r/min ou por sonicação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Micelas inversas

Um sistema micelar inverso de acordo com o invento é caracterizado como uma microemulsâo compreendendo uma dispersão de microgotículas de água em óleo. Esta dispersão é estabilizada por um tensioactivo (acilglicerol, mais preferencialmente diglicerol de ácidos gordos) na interface água/óleo. A fase micelar inversa pode ser definida como um sistema em que a água forma a fase interna e as caudas hidrofóbicas dos lípidos formam a fase contínua. As micelas inversas contendo óleo(s), tensioactivo (s) e uma fase aquosa são também caracterizadas como microemulsões de água-em-óleo. -6- PE 1807048 A dimensão das micelas é controlada pela quantidade de água solubilizada no sistema. Isto varia de maneira linear com a razão em peso (água)/(tensioactivo) W (água solubilizada na mistura tensioactivo na mistura). Tal como mencionado atrás, a razão W = (água)/ (acilglicerol) é, preferencialmente, inferior ou igual a cerca de 2,5, mais preferencialmente inferior ou igual ale mais especificamente de 0,01 a 0,2. De acordo com uma forma de concretização particular, a razão W está, preferencialmente, na gama de 0,05 a 0,18.

As micelas inversas, tal como a dimensão do núcleo destas, podem ser caracterizadas através de vários métodos:

- Dispersão de raios X - Dispersão de neutrões - Microscopia Electrónica de Transmissão (TEM) - Dispersão de Luz Dinâmica (DLS)

Os compostos necessários para a preparação das micelas inversas de acordo com o invento compreendem dois lipidos: um esterol e um acilglicerol, preferencialmente um diglicérido de ácidos gordos, que actua como tensioactivo. As micelas inversas de acordo com o invento compreende, pelo menos, um catião metálica.

As razões dos constituintes lipidicos (esteróis e acilglicerol) podem variar em grande extensão, por exemplo, -7- PE 1807048 a razão em peso de esterol/acilglicerol pode variar de 0,01 a 1 (inclusive). De acordo com uma forma de concretização particular, pode ser utilizado um excesso de acilglicerol (preferencialmente diglicérido de ácidos gordos) em comparação com o esterol (preferencialmente sitosterol). Mais particularmente, a razão em peso esterol/acilglicerol é superior ou igual a 0,1, mais preferencialmente de 0,1 a 0,2. O metal pode ser utilizado numa quantidade muito pequena em comparação com os outros dois componentes, vantajosamente numa razão molar de 1/100 a 1/10000 em comparação com o acilglicerol.

Os vários componentes podem ser formalmente identificados através de meios analíticos adaptados. O sitosterol pode ser identificado através de uma análise de cromatografia gasosa e o acilglicerol através de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) utilizando um detector de dispersão de luz, numa coluna de sílica (kromasil C18), na presença de um eluente, e.g. acetonitrilo isocrático. A cromatografia gasosa pode ser também utilizada para identificar diglicéridos.

As micelas inversas são sistemas dinâmicos. O movimento Browninano provoca colisões perpétuas de micelas, que conduzem à coalescência de micelas e à permuta de núcleos aquosos. A separação e a regeneração das micelas ocorre e permite reacções químicas entre soluções -8- PE 1807048 diferentes. A taxa de permuta entre as micelas aumenta em particular com a temperatura, o comprimento das cadeias de hidrocarboneto do tensioactivo e a razão W (a água livre aumenta a referida permuta). Dentro do contexto do invento, a dimensão do núcleo aquoso das micelas varia, preferencialmente, de 5 a 100 nm. A quantidade relativa de água na mistura (W) é, preferencialmente, igual ou inferior a 2,5 e, preferencialmente, igual ou inferior a 1 da quantidade de acilglicerol, preferencialmente de diglicérido de ácidos gordos. De acordo com uma forma de concretização, a razão W é, preferencialmente, de 0,01 a 0,2. A vantagem das micelas inversas do presente invento em relação aos sistemas de administração da arte precedente é a de que as primeiras permitem incluir ai qualquer tipo de iões metálicos. Método de preparação de micelas inversas de acordo com o invento

Numa forma de concretização particular, o invento refere-se a um método para preparar micelas inversas que apresentam um núcleo aquoso igual ou inferior a 100 nm e compreendendo um catião metálico farmaceuticamente activo solúvel em água, em que o referido método compreende os passos seguintes: (a) contacto de (i) um esterol (ii) um acilglicerol, preferencialmente um diacilglicerol de ácidos -9- ΡΕ1807048 gordos, (iii) água (em particular água purificada) e (iv) um catião metálico solúvel em água, em que a razão W = (água purificada)/(acilglicerol, preferencialmente diglicérido de ácidos gordos) é preferencialmente inferior ou igual a cerca de 2,5. (b) agitação da mistura obtida no passo (a) a 40°C ou menos e durante um tempo suficiente para obter formação de micelas inversas, sendo a referida agitação efectuada mecanicamente a uma velocidade de cerca de 1000 até cerca de 5000 r/min ou por sonicação.

As micelas inversas obtidas e recobertas são então particularmente úteis como sistema de administração do fármaco. O passo (b) do processo é de importância particular uma vez que permite obter micelas inversas que são então úteis como sistema de transporte para administrar fármacos no local alvo num ser humano ou num animal.

Os compostos que constituem micelas inversas são feitos contactar durante o passo (a). Os compostos úteis no presente invento serão descritos com mais detalhe abaixo. A agitação da mistura obtida através do passo (a) é, mais particularmente, realizada a uma temperatura inferior ou igual a 40°C variando, preferencialmente, de 30°C a 38°C, mais preferencialmente de 30°C a 35°C, durante um tempo suficiente para se obter a formação de micelas inversas. O tempo suficiente pode variar em particular com -10- PE 1807048 as técnicas de agitação, i.e. agitação mecânica com uma velocidade de cerca de 1000 a cerca de 5000 r/min ou sonicação. O tempo de agitação mecânica ou sonicação é de qualquer modo o tempo necessário para converter a mistura inicial numa solução micelar inversa monofásica. A agitação por sonicação é preferida.

Numa forma de concretização particular, o catião metálico é primeiramente solubilizado em água purificada que é então colocada em contacto com os outros constituintes (passo (a)).

Um especialista na matéria sabe como seleccionar excipientes e/ou componentes a serem utilizados em conjunto com as composições de acordo com o presente invento de modo a respeitar as suas propriedades benéficas. Em particular, a presença de glicerol pode, quando introduzido em grande quantidade, evitar a formação de micelas inversas ou quebrar o sistema micelar. Mais especificamente, não mais do que 1% e, preferencialmente, nenhum glicerol (percentagem expressa em peso de glicerol/quantidade total em peso de água na composição) é utilizado para a preparação de micelas inversas de acordo com o presente invento.

SONICAÇÃO

Os ultrassons da sonicação conduzem a uma cavitação acústica nos líquidos, i.e., formação de bolhas -11 - PE 1807048 no líquido. Uma elevada amplitude da oscilação gera uma cavitação mais importante. Os ultrassons produzem uma agitação homogénea dentro de todas as partes da câmara da reacção e proporciona pouca turbulência dentro do líquido. É o método mais fiável para preparar nanopartículas. A estabilidade da nanoemulsão obtida é devida, em particular, ao acilglicerol (preferencialmente diglicérido de ácidos gordos) que actua como tensioactivo.

Diferentes tipos de materiais de sonicação podem ser utilizados à escala laboratorial ou industrial. O processo de ultrassons de alta intensidade é o processo mais adequado. Para preparar pequenas quantidades, materiais de 400 W ou 600 W com ultrassons a 20 kHz origina resultados satisfatórios com uma boa homogeneidade do produto acabado e são, deste modo, preferidos. O controlo electrónico da temperatura e a duração da emissão do processo é também possível com aquele tipo de dispositivos Existem materiais do mesmo tipo para utilizações industriais.

Parâmetros físicos, em particular o tempo (3—5— minutos, em uma ou mais vezes) são dependentes do material utilizado, volumes da mistura e viscosidade desta. Um especialista na matéria pode definir tais parâmetros prontamente. Mais especificamente, a temperatura da mistura não deve exceder 40°C de modo a evitar a degradação dos reagentes. A temperatura é, preferencialmente, inferior a -12- PE 1807048 cerca de 38°C, e ainda mais preferencialmente igual ou inferior a cerca de 35°C.

AGITAÇÃO MECÂNICA

Os materiais usuais utilizam propulsores cujos movimentos rápidos geram turbulências e redemoinhos que permitem a interpenetração das partículas e a formação de nanopartículas dentro da mistura. A velocidade de agitação para obter um resultado óptimo depende da viscosidade da mistura; a velocidade de agitação varia, preferencialmente, de 1000 a 5000 r/min. Os volumes implementados, dispositivo, velocidade de agitação e razão W dependem e devem ser adaptados ao catião metálico farmaceuticamente activo introduzido.

Para optimizar esta preparação, a mistura é mantida a uma temperatura inferior a, aproximadamente, 40°C de modo a evitar a degradação dos reagentes, preferencialmente a uma temperatura inferior a aproximadamente 35°C, ainda mais preferencialmente variando entre aproximadamente 30 a 35°C.

Outro objectivo do invento refere-se a micelas inversas obtidas pelo processo de acordo com o invento tal como descrito atrás. PE 1807048 -13-

Compostos de micelas inversas

ACILGLICEROL

Os acilgliceróis, mais particularmente acilgliceróis de ácidos gordos, úteis na preparação do sistema micelar inverso de acordo com o invento, podem ser isolados da maior parte das plantas e são componentes maioritários das plantas e substâncias gordas animais. O número de ácidos gordos, a sua posição no glicerol, o comprimento da sua cadeia e o número das suas possíveis insaturações varia de um acilglicerol para outro. Os acilgliceróis, incluem em particular mono, di ou triacilgliceróis. Numa forma de concretização particular, os mono, di ou triglicéridos utilizados no presente invento apresentam a seguinte fórmula (I): CH2ORt CHOR2 ch2or3 em que: - Ri é um resíduo acilo de um ácido gordo saturado ou não saturado linear ou ramificado possuindo entre 14 e 24 átomos de carbono, um átomo de hidrogénio ou uma mono, di ou tri-galactose ou glucose; -14- PE 1807048 - R2 é um resíduo acilo de um ácido gordo saturado ou não saturado linear ou ramificado possuindo entre 2 e 19 átomos de carbono, - Ri é um resíduo acilo de um ácido gordo saturado ou não saturado linear ou ramificado possuindo entre 14 e 24 átomos de carbono ou um átomo de hidrogénio.

De acordo com uma forma de concretização preferida, pelo menos um de Ri e R3, preferencialmente apenas um, representa um resíduo acilo de ácido oleico (C18 : l[cis]-9) .

De acordo com um aspecto particular, R2 tem uma ligação insaturada (e.g.; ligação etilénica) e tem vantajosamente 18 átomos de carbono, preferencialmente R2 é um resíduo de ácido oleico (grupo oleilo), um dos seus isómeros posicionais em relação à ligação dupla (cis-6,7,9,11 e 13) ou um dos seus isómeros iso-ramifiçados.

De acordo com outro aspecto particular, R2 representa um grupo acetilo. De acordo com uma forma de concretização preferida, R3 representa um átomo de hidrogénio.

Os acilgliceróis utilizados na preparação das micelas de acordo com o invento podem ser isolados a partir da maior parte das plantas.

Os óleos vegetais insaturados são particularmente -15- PE 1807048 vantajosos como fontes de acilgliceróis, especialmente azeite da primeira prensagem a frio.

Como regra geral, um óleo contendo uma elevada concentração de ácido oleico será escolhido como fonte útil de acilgliceróis de acordo com o invento. Um tal óleo contém usualmente uma elevada proporção de acilgliceróis úteis de acordo com o invento.

De acordo com um aspecto particular do invento, os diglicéridos de ácidos gordos preferidos são seleccionados do grupo constituído por 1,2-dioleina e 1-oleil-2-acetilglicerol.

Os acilgliceróis e, mais particularmente, aqueles que se verifica serem mais activos nas aplicações previstas adiante, existem também comercialmente. Este é o caso particularmente para o l-oleil-2-acetilglicerol e 1,2-dioleilglicerol, que existem como produtos comerciais com um elevado teor de pureza. Em particular, o monooleato de glicérido contendo cerca de 44% de glicéridos dioleicos dos quais cerca de 14% é 1,2-dioelina. Tal composto é farmaceuticamente aceite (European Pharmacopeia (4a edição) , USP 25/NF20 e Japanese Standard of Food Additives). Um tal produto está, por exemplo, comercialmente disponibilizado Gattefossé Company sob a designação PECEOL®. ΡΕ1807048 -16-

ESTEROL

Os esteróis úteis para a preparação do sistema micelar inverso de acordo com o invento podem ser qualquer esterol e, preferencialmente, um esterol vegetal. O sitosterol é o esterol útil preferido para o sistema micelar inverso de acordo com o invento. O sitosterol incorporado no sistema micelar inverso do invento pode ser beta ou gama-sitosterol, preferencialmente beta-sitosterol ou pode ser introduzido sob a forma de um extracto de planta contendo, pelo menos, uma destas duas formas de sitosterol. O sitosterol é, na verdade, um componente da maior parte das plantas. É em particular possivel utilizar vários produtos comerciais. Mais particularmente, o sitosterol comercial que é extraído da soja pode ser utilizado. Em tal produto, o sitosterol, representa geralmente de cerca de 50 até 70% em peso do produto e é geralmente encontrado numa mistura com campesterol e sitostanol nas proporções relativas de cerca de 15% cada. O sitosterol comercial que é extraído de uma variedade de produto de pinheiro designado por talóleo pode ser também utilizado, compreendendo o referido talóleo uma média de 75% em peso de beta-sitosterol. Em geral, será possível utilizar o sitosterol numa mistura com sitostanol. Preferencialmente, a referida mistura compreende, pelo menos, 50% de sitosterol em peso da mistura. -17- PE 1807048

Consegue-se obter beta-sitosterol possuindo uma pureza superior a 95% ou mesmo 99%, procedendo-se da seguinte maneira: realizam-se várias sucessivas recristalizações com acetona de mistura comercial, o que permite a pré-purificação de beta-sitosterol por eliminação do campestenol e do sitostanol presentes na mistura. Então, sujeita-se o produto assim pré-purifiçado a 1 a 3 passos de purificação por cromatografia líquida de alta pressão numa coluna preparativa C18 utilizando misturas eluentes, tais como metanol, em particular metanol a 100% ou misturas de metanol e acetonitrilo, em particular misturas 80-20 ou qualquer mistura intermédia tornando possível obter sitosterol com uma pureza superior a 95 ou mesmo 99%. Esta pureza é determinada por cromatografia gasosa. O sitosterol e, deste modo, o sitostanol podem ser também preparados por extracção de plantas de acordo com as técnicas da literatura, por exemplo, p. 95 da tese apresentada em Montpellier em Novembro de 1993 por Claude cerdon com o título "Modulation de la protection de sapogénines stéroidiques en résponse à 1'inhibition de la synthèse de sterols".

Esta extracção é realizada com vantagem por complexação com metais, de acordo com o método descrito em particular na Patente Francesa FR 2 316 247 em que é descrito um método para isolar 3-hidroxi-esteróides e 3-oxo-esteróides a partir de uma mistura contendo estes compostos. -18- PE 1807048

Para efectuar esta extracção qualquer planta ou produtos de origem vegetal conhecidos pelo seu teor relativamente elevado de sitosterol pode ser utilizado.

Como exemplos de plantas ou produtos de origem vegeteal com um teor de sitosterol relativamente elevado pode ser mencionado em particular o azeite, o óleo de soja, as folhas de algodoeiro, as folhas do cafeeiro, gérmen de trigo, para os quais o teor de esterol livre e a percentagem de sitosterol na fracção de esterol livre são dados na tabela abaixo: ESPÉCIE Teor/kg % da fracção de sitosterol Azeite 1310 mg 91% Óleo de soja 1908 mg 53% Folhas de algodoeiro 3961 mg 93% Folhas de cafeeiro 9914 mg 51% Gérmen de trigo 17336 mg 67% % é expressa em peso.

Tal como mencionado atrás, as razões de esterol e acilglicerol podem variar em grande extensão, por exemplo a razão em peso de esterol/acliglicerol podem variar de 0,01 a 1 (inclusive). De acordo com uma forma de concretização particular, um excesso de acilglicerol (preferencialmente diglicérido de ácidos gordos) pode ser utilizado em -19- PE 1807048 comparaçâo com o esterol (preferencialmente sitosterol). Mais particularmente, a razão em peso esterol/acilglicerol é igual ou superior a 0,1, mais preferencialmente de 0,1 a 0,2.

METAL

Os catiões metálicos que podem ser utilizados para preparar o sistema micelar inverso do invento que são qualquer catião num estado de oxidação de, pelo menos, 2 e cuja actividade biocatalitica é conhecida ou falta ser descoberta.

No contexto do presente invento, o termo "biocatalisador" indicará estes metais que exercem uma actividade catalitica nos sistemas biológicos.

Os iões metálicos desempenham uma parte essencial em aproximadamente um terço dos enzimas (Metal Ions in Biological Systems, Jenny P. Glusker, Amy K. Katz e Charles W. Bock, The Rigaku Journal, vol 16, N°2, 1999) . Estes podem ter diferentes tipos de acções: modificação dos fluxos de electrões do substrato ou do enzima, permitindo o controlo de uma reacção catalitica enzimática, - ligação com os componentes proteicos do enzima para originar uma configuração espacial que permita que apresente os seus locais activos, -20- PE 1807048 - permitir uma actividade de oxidação-redução quando o metal tem várias valências. O metal M será seleccionado de acordo com a actividade biológica desejada.

Como exemplos, se um produto pretende uma actividade hipolipidémica ou hipoglicémica e/ou antidiabética e/ou actividade insulinomimética, um derivado metálico de vanádio, nióbio, molibdénio, selénio, crómio, zinco ou titânio será mais particularmente escolhido.

Nestes derivados metálicos: - o nióbio tem, vantajosamente, um estado de oxidação igual a 4 ou 5, preferencialmente 5, - o vanádio tem, vantajosamente, um estado de oxidação igual a 3, 4 ou 5, preferencialmente 4, - o selénio tem, vantajosamente, um estado de oxidação igual a 4 ou 6, preferencialmente 4, - o molibdénio está, em geral, com um estado de oxidação compreendido entre 3 e 6, preferencialmente 3, - o crómio está, preferencialmente, num estado de oxidação igual a 3, - o zinco está, preferencialmente, num estado de oxidação igual a 2, 3 ou 4.

Exemplos de metais adaptados para outros tipos de actividade são indicados abaixo: -21 - PE 1807048 antimónio ou estanho, se for desejado o tratamento de doenças autoimunes que se referem, em particular, ao sistema nervoso central, por exemplo, esclerose múltipla e cancerologia, ouro, em doenças autoimunes que afectam o sistema locomotor, por exemplo, na artrite reumatóide, - vanádio em tumores ou neoplasias do tracto digestivo, particularmente do pâncreas, do cólon e do recto, ruténio ou paládio em tumores do tracto respiratório ou neoplasias, - litio em patologias do sistema nervoso central, tal como a doença de Huntington, estanho, em síndromas de imunodeficiência adquirida, - selénio em cancerologia, - estrôncio em osteoporose.

Numa forma de concretização particular, o catião metálico é seleccionado do grupo constituído por zinco, nióbio, vanádio, selénio, molibdénio, crómio, antimónio, estanho, ouro, ruténio, paládio, platina, litio e estrôncio.

Como exemplos, derivados metálicos particularmente úteis de acordo com o invento são seleccionados de sulfatos, hidratos, halogenetos, em particular cloretos e qualquer outro sal solúvel em água. -22- PE 1807048

Será possível nalguns casos utilizar sais de amónio, metóxidos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos que podem, com vantagem, ser dissolvidos em água ou, por vezes, em álcoois. Os derivados metálicos orgânicos como os acetilacetonatos, alcóxidos ou complexos metálicos com solventes orgânicos, por exemplo éteres, THF, DMF podem ser também utilizados. Estes derivados metálicos orgânicos são geralmente solúveis em solventes orgânicos, mais particularmente em solventes clorados, tais como o clorofórmio ou o diclorometano. As experiências mostram que estes podem ser reolhidos por micelas numa forma de metal reduzido no núcleo aquoso. Contudo serão preferidos sais solúveis em água.

Qualquer metal possuindo um sal solúvel em água pode ser introduzido nas micelas inversas de acordo com o invento. A escolha do metal variará com a actividade terapêutica desejada.

Uma tal aplicação é tão importante que, geralmente, um especialista na matéria, estará consciente das dificuldades inerentes da utilização terapêutica de catiões metálicos devido à toxicidade dos referidos catiões metálicos numa quantidade activa eficaz: exemplos bem conhecidos são os sais de lítio utilizados em doenças psiquiátricas ou neurológicas ou os sais de platina, ruténio ou paládio utilizados em cancerologia.

Tal como indicado atrás, um metal preferido é um -23- PE 1807048 metal que apresente uma actividade biocatalítica.

Pode ser utilizado metal em quantidades muito pequenas em comparação com os dois outros componentes, preferencialmente numa razão molar de 1/100 a 1/10 000 em comparação com o acilglicerol. A actividade terapêutica é obtida com quantidades de metal divididas por 1000 a 10 000 em comparação com a actividade obtida com um sal ou derivado orgânico do mesmo metal.

CARACTERIZAÇAO DE MICELAS INVERSAS

As micelas inversas podem ser fisicamente caracterizadas através de vários métodos:

- Dispersão de raios X - Dispersão de Neutrões - Microscopia Electrónica de Transmissão (TEM) - Dispersão de Luz Dinâmica (DLS)

Análise por dispersão de raios X dos produtos, tal como descrito nos exemplos 1 e 2, revelou micelas inversas numa microemulsão.

Utilização do sistema micelar inverso

As micelas inversas do invento melhoram a -24- PE 1807048 biodisponibilidade do catião metálico aí incluído, permitindo a sua utilização terapêutica ou utilização dietética com uma toxicidade reduzida ou uma toxicidade igual a zero. Esta é uma vantagem considerável em comparação com o estado da arte. Devido à sua natureza de microemulsão, o sistema micelar inverso permite proporcionar diferentes tipos de formulações, compreendendo vários excipientes, veículos ou suportes, que podem ser administrados através de várias vias, incluindo per mucosa, por exemplo numa administração na boca ou rectal, sendo as micelas inversas capazes de atravessar as membranas celulares.

Tal como aqui utilizados, os termos "mucosa" e "mucosal" referem-se a um tecido mucoso tal como epitélio, lâmina própria e uma camada do tecido muscular no tracto digestivo. "Administração mucosal" e termos análogos, tal como aqui utilizados, referem-se à administração de uma composição ao tecido mucosal. "Administração mucosal" e termos análogos incluem, mas não estão limitados a, administração de uma composição através do tecido mucosal bronquial, gengival, lingual, nasal, oral, vaginal, rectal e intestinal. É sabido hoje que um sistema micelar inverso pode ser utilizado para a preparação de nanomateriais que actuam como microrreactores que assim melhoram as reacções de co-precipitações ou de reduções químicas dos iões. Estes tornam possível preparar nanomateriais num estado -25- ΡΕ1807048 metaestável que usualmente não são formados, num estado maciço, à temperatura ambiente. É assim possível preparar, de acordo com o invento, reduzir partículas metálicas de cobre, ouro, prata, níquel, cádmio etc., assim como semicondutores e fluidos magnéticos.

As propriedades dinâmicas do sistema tornam possível realizar reacções de reduções de iões em volumes internos de micelas cuja dimensão, forma e reactividade são finamente controlados graças ao processo de acordo com o invento, tal como indicado atrás.

As equipas de investigação em nanotecnologia demonstraram que o núcleo aquoso de um sistema micelar inverso se comporta como um nanoreactor, i.e. capaz, à temperatura ambiente, de transformar um sal metálico num metal numa forma iónica reduzida, instável em teoria, mas completamente estável no núcleo das micelas. A maior actividade terapêutica obtida com quantidades muito pequenas de metais (1 a 10 μρ/]«5/άί3 no animal, dependendo dos metais) pode ser explicada pela presença, dentro das micelas inversas de acordo com o invento, de metal numa forma matálica reduzida e através da especificidade dos componentes lípidos da micela devido à sua internalização celular. Esta transformação do sal metálico (em geral um sulfato) numa partícula metálica livre reduzida é um elemento fundamental que permite que o metal tenha uma actividade biológica de modulação -26- PE 1807048 enzimática intracelular.

Além disso, os resultados de actividade obtidos no animal para 4 metais, vanádio no tratamento da diabetes, manganês para uma actividade do "tipo SOD", estrôncio para estimular o crescimento ósseo e para tratar a osteoporose e litio para neuroprotecção para tratar, em particular , a doença de Huntington, mostra que qualquer metal que apresente uma actividade biológica pode ser incluído em micelas de acordo com o invento para a preparação de composições farmacêuticas.

De acordo com uma primeira forma de concretização, a composição farmacêutica contém micelas inversas tal como previamente definido num suporte farmaceuticamente aceitável.

De acordo com uma primeira forma de concretização, a composição farmacêutica contém micelas inversas tal como definidas previamente num suporte farmaceuticamente aceitável.

De acordo com uma forma de concretização particular, a composição farmacêutica pode compreender uma mistura de, pelo menos dois tipos de micelas, tal como previamente definido, em que cada tipo compreende um catião metálico distinto do outro tipo.

Uma tal mistura proporciona, em certos casos, um efeito sinergístico; este é o caso, em particular, em que a -27- PE 1807048 composiçâo contém uma mistura de complexo de zinco e vanádio. Pode-se observar, neste caso, um efeito sinérgico quando se utiliza uma composição farmacêutica contendo uma mistura destes dois tipos de complexos no tratamento da diabetes (cf. WO 96/23811) .

Um outro objectivo do invento refere-se à utilização de micelas inversas, tal como definido atrás, para preparar uma composição farmacêutica pretendida para a administração, mais especificamente a administração mucosal, de um ou mais catiões metálicos, tal como definido atrás. A forma de concretização é, mais particularmente, pretendida para tratar um ou mais sintomas associados à doença ou distúrbio.

Outro objecto do invento refere-se a métodos para administração de um ou mais catiões metálicos a um animal, compreendendo os referidos métodos a administração ao referido animal de uma composição de micelas inversas, tal como definido atrás. Numa forma de concretização especifica, o presente invento proporciona métodos para a administração mucosal de um ou mais catiões metálicos a um animal, compreendendo os referidos métodos a administração mucosal ao referido animal de uma composição de micelas inversa, tal como definido atrás. O presente invento proporciona métodos para a prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados a uma doença ou distúrbio, compreendendo os referidos métodos uma quantidade eficaz necessária de uma composição de micelas -28- PE 1807048 inversas, tal como definido atrás e compreendendo um ou mais catiões metálicos úteis na prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados à referida doença ou distúrbio. Numa forma de concretização especifica, o presente invento proprociona métodos para a prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados à doença ou distúrbio compreendendo os referidos métodos uma quantidade eficaz mucosalmente necessária de uma composição de micelas inversas, tal como definida atrás e um ou mais catiões metálicos úteis na prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados à referida referida doença ou distúrbio.

Como excipiente veículo ou portador farmaceuticamente aceitável, pode ser utilizado qualquer veículo ou portador excipiente bem conhecido pelos especialistas na matéria. Como exemplos podem ser citados os seguintes de maneira não limitativa: lactose, amido de milho, glucose, sacarose, agentes adoçantes, tal como xarope de maltitol, goma arábica, gelatina, carragenanas, ácido esteárico, estearato de magnésio, dextrina, maltodextrinas, manitol, talco, gorduras de origem animal, particularmente óleos de origem vegetal ricos em ácidos gordos insaturados e esteróis. Em particular, se eventualmente necessário, podem ser utilizados outros aditivos bem conhecidos pelos especialistas na matéria, tais como estabilizantes, agentes de secagem, ligantes ou tampões de pH. Excipientes preferidos de acordo com o invento promovem a aderência ao produto acabado à mucosa. -29- PE 1807048

As composições do invento podem ser administradas através de diferentes vias, preferencialmente através do tecido mucosal, em particular através da via oral com uma absorção bucal ou digestiva. Pode ser também por via rectal.

Numa forma de concretização preferida do invento, as composições de micela inversa do invento são administradas mucosalmente sob a forma de uma cápsula, caplet, aerosol, pulverização, solução, suspensão, emulsão, cachet, comprimido, cápsula de gelatina elástica mole, aerosol, pó ou grânulo. As composições do invento podem ser introduzidas em frma liquida dentro de cápsulas que libertam o seu conteúdo na boca. Preferencialmente, as composições de micela inversa do invento são administradas a um mamífero, mais preferencialmente um ser humano para evitar ou tratar uma doença ou distúrbio.

De acordo com outra forma de concretização particularmente importante, o invento também se refere a produtos dietéticos, em particular a produtos dietéticos úteis como complementos alimentares para controlar disfunções metabólicas, incorporando as micelas inversas previamente definidas, assim como a um método para preparar estes produtos.

Na verdade, estes produtos podem ser facilmente formados fazendo contactar num óleo particularmente rico em diglicéridos de ácidos gordos, beta ou gama-sitosterol ou -30- PE 1807048 um extracto de planta contendo, pelo menos, uma das referidas duas formas de sitosterol, um sal de um metal e água purificada e então agitação sob as condições do processo de acordo com o invento tal como previamente definido.

Tal como visto previamente, o teor de ácido oleico C18:l dos óleos vegetais varia consideravelmente de acordo com a natureza da planta e a sua origem geográfica.

Para a preparação de produtos dietéticos de acordo com o invento, é possível com vantagem utilizar um óleo vegetal em que os ácidos oleicos atingem, pelo menos, 60% dos ácidos gordos.

De acordo com uma forma de concretização preferida, será utilizado azeite, preferencialmente o óleo obtido na primeira prensagem a frio. O sitosterol será com vantagem introduzido sob a forma de um extracto de planta. Ser-se-á capaz de utilizar, em particular, um extracto de planta comercial obtido a partir de soja ou, preferencialmente, extraído de talóleo.

Para se obter um produto dietético, em particular utilizável como complemento alimentar com actividade reguladora do metabolismo glucídico e/ou efeito protector cardiovascular, utilizar-se-á vantajosamente como sal metálico, um sal de vanádio, em que o vanádio está num -31- PE 1807048 estado de oxidação igual a 4, em particular um sulfato de vanadilo.

Legendas das figuras

Figura 1: ensaio de actividade antidiabética em ratazanas alimentadas a frutose de micelas inversas à base de vanádio em comparação com fármacos de referência e controlos: glicémia (mmol/1) durante o tratamento (dia)

Figura 2: ensaio de actividade antidiabética em ratazanas alimentadas a frutose de micelas inversas à base de vanádio em comparação com fármacos de referência e controlos: insulinemia (μπιοΐ/ΐ) a DO e D21.

Figura 3: teste de adriamicina em ratazanas Wistar com micelas inversas à base de manganês em comparação com controlos: % de volume durante o tratamento

Figura 4: avaliação de uma actividade de estimulação do crescimento ósseo em ratazanas que estão a crescer com micelas inversas à base de estrôncio em comparação com controlo e fármaco de referência: diâmetro femural (mm)

Figura 5: avaliação de uma actividade de estimulação do crescimento ósseo em ratazanas que estão a crescer com micelas inversas à base de estrôncio em comparação com controlo e fármaco de referência: quantidade -32- ΡΕ1807048 de estrôncio nos ossos (expresso em μς/g) A Figura 6: avaliação de uma actividade de estimulação do crescimento ósseo em ratazanas que estão a crescer com micelas inversas à base de estrôncio em comparação com controlo e fármaco de referência: quantidade de estrôncio no plasma (expresso em \iq/q)

Figura 7A e B: glicémia obtida em modelo de ratazanas STD a D3 e D7 respectivamente, dependendo da razão W das micelas inversas administradas contendo vanádio

Os exemplos seguintes pretendem exemplificar a operação do presente invento mas não limitar o seu domínio.

EXEMPLOS

Exemplo 1: preparação de micelas inversas contendo vanádio A 1,1 g de sitosterol solubilizado em 2,2 ml de etanol, são adicionados 870 μΐ de água purificada contendo 85 μρ de sulfato de vanadilo (26 μρ de vanádio metálico) e 40 ml de Peceol® (monooleato de glicérido comercialmente disponibilizado pela Gattefossé).

Sonicação da mistura é realizada durante 4 minutos monitorizando a temperatura a menos de 38°C. -33- PE 1807048 A razão W é de 0,07. O produto obtido é constituído por uma mistura homogénea de micelas inversas estáveis contendo vanádio. A análise por dispersão de raios X mostra uma microemulsâo homogénea com micelas inversas.

Exemplo 2: preparação de micelas inversas contendo vanádio para o tratamento de ratazanas diabéticas A 1,1 g de sitosterol solubilizado em 2,2 ml de etanol, são adicionados 4,14 ml de água purificada contendo 85 μρ de sulfato de vanadilo (26 μρ de vanádio metálico) e 40 ml de Peceol®.

Sonicação da mistura é realizada em duas vezes (3 minutos cada) monitorizando a temperatura a menos de 38°C. A razão W é de 0,27. O produto obtido é constituído por uma mistura homogénea de micelas inversas estáveis contendo vanádio. A análise por dispersão de raios X mostra uma microemulsâo homogénea com micelas inversas.

Exemplo 3: preparação de micelas inversas contendo manganês para avaliar a actividade do tipo SOD em -34- PE 1807048 animais A 1,1 g de sitosterol solubilizado em 2,2 ml de etanol, são adicionados 4,14 ml de água purificada contendo 313 μg de sulfato de manganês (102 μg de manganês metálico) e 40 ml de Peceol®. A mistura é agitada com um agitador magnético aquecendo a 35°C durante 15 minutos. A razão W é de 0,27. O produto obtido é constituído por uma mistura homogénea de micelas inversas estáveis contendo manganês.

Exemplo 4: preparação de micelas inversas contendo estrôncio para avaliar a estimulação da actividade de crescimento ósseo em animais (NP 05 A) A 5 g de sitosterol solubilizado em 20 ml de etanol, são adicionados 20 ml de água purificada contendo 2570 mg de sulfato de estrôncio (1229 mg de estrôncio metálico), 48 ml de Peceol® e 160 ml de azeite. A mistura é agitada com um agitador magnético aquecendo a 35°C durante 15 minutos. A razão W é de 0,85.

Pode ser administrada a ratazanas a 2 ml/kg através de via rectal (12,15 mg de metal Sr/24 h/kg).

Exemplo 5: preparação de micelas inversas contendo estrôncio para avaliar a estimulação da actividade -35- PE 1807048 de crescimento ósseo em animais (NP 05 B) A 5 g de sitosterol solubilizado em 20 ml de etanol, são adicionados 20 ml de água purificada contendo 257 mg de sulfato de estrôncio (133 mg de estrôncio metálico), 48 ml de Peceol® e 160 ml de azeite. A mistura é agitada com um agitador magnético aquecendo a 35°C durante 15 minutos. A razão W é de 0,85.

Pode ser administrada a ratazanas a 2 ml/kg através de via rectal (1,21 mg de metal Sr/24 h/kg).

Exemplo 6: preparação de micelas inversas contendo estrôncio para avaliar a estimulação da actividade de crescimento ósseo em animais (NP 05 C) A 5 g de sitosterol solubilizado em 20 ml de etanol, são adicionados 20 ml de água purificada contendo 26 mg de sulfato de estrôncio (12,3 mg de estrôncio metálico), 48 ml de Peceol® e 160 ml de azeite. A mistura é agitada com um agitador magnético aquecendo a 35°C durante 15 minutos. A razão W é de 0,85.

Pode ser administrada a ratazanas a 2 ml/kg através de via rectal (0,12 mg de metal Sr/24 h/kg).

Exemplo 7: preparação de micelas inversas contendo vanádio (NP 01 A) -36- PE 1807048 A 1,1 g de sitosterol solubilizado em 2,2 ml de etanol, são adicionados 1,5 ml de água purificada contendo 71 μg de sulfato de vanadilo (22 μg de vanádio metálico), 40 ml de azeite (4% de diglicéridos).

Sonicação da mistura é realizada durante 4 minutos, monitorizando a temperatura a menos de 38°C. A razão W é de 2,33.

Exemplo 8: preparação de micelas inversas contendo vanádio (NP 01 B) A 1,1 g de sitosterol solubilizado em 2,2 ml de etanol, são adicionados 5,92 ml de água purificada contendo 85 μg de sulfato de vanadilo (26 μρ de vanádio metálico), 40 ml de Peceol®.

Sonicação da mistura é realizada durante 4 minutos, monitorizando a temperatura a menos de 38°C. A razão W é de 0,38.

Exemplo 9: preparação de micelas inversas contendo vanádio (NP 01 C) A 1,1 g de sitosterol solubilizado em 2,2 ml de etanol, são adicionados 414 μΐ de água purificada contendo 85 μρ de sulfato de vanadilo (26 μρ de vanádio metálico), -37- PE 1807048 40 ml de Peceol®.

Sonicação da mistura é realizada durante 4 minutos, monitorizando a temperatura a menos de 38°C. A razão W é de 0,04.

Exemplo 10: preparação de micelas inversas contendo litio para proteger o cérebro na doença de Huntington (NP 03) A 3,6 g de sitosterol solubilizado em 5,4 ml de etanol, são adicionados 4 ml de água purificada contendo 9,43 mg de sulfato de litio (600 μg de litio metálico), e 110 ml de Peceol®. A mistura é agitada com um agitador magnético aquecendo a 35°C durante 15 minutos. A razão W é de 0,1.

Pode ser administrada a ratazanas a 2 ml/kg através de via rectal (10 μg de metal Li/24 h/kg). -38- PE 1807048

TESTES FARMACOLÓGICOS 1 - Actividade antidiabética em ratazanas alimentadas com frutose O modelo de ratazanas alimentadas com frutose é uma diabetes não insulino-dependente (NIDD) semelhante à observada diabetes humana do tipo 2.

Neste estudo, o produto NP 01 contém micelas inversas baseadas em vanádio, preparadas de acordo com o exemplo 2. A sua actividade terapêutica é comparada com a de dois fármacos de referência: Metformina e Rosiglitazona.

Protocolo A D-21, após o período de repouso as ratazanas foram pesadas e é tomada uma amostra de sangue para determinar os valores basais dos parâmetros bioquímicos.

As ratazanas são distribuídas ao acaso em grupos de 10 ratazanas. A água para beber é então substituída por uma solução de frutose a 10% em água destilada. Esta solução é proporcionada ad libitum durante 21 dias. Estas recebem então novamente água normal para os 21 dias seguintes de tratamento. A D0, os animais foram pesados e é recolhida uma amostra de sangue. -39- ΡΕ1807048 0 tratamento começa então com uma duração de 21 dias, com uma administração diária. - Grupo de controlo: 1 ml/kg de água normal per - Grupo NP 01: 2 ml/kg através de via rectal - Grupo de metformina: 50 mg/kg de metformina per os 5 mg/kg de

Grupo de rosiglitazona: rosiglitazona per os A D3, amostra de sangue. A D7, amostra de sangue. A D21, amostra de sangue e fim do tratamento.

Resultados (expressos em mmol/1 para a glicémia e pmol/ml para a insulinemia - SD quer dizer desvio padrão) -Figuras 1 e 2 respectivamente -40- PE 1807048

Glicemia D0 SD D0 D3 SD D3 D7 SD D7 D21 SD D21 Controlos não diabéticos 6,39 0,15 6,39 0,15 6,39 0,15 6,39 0,15 Controlos diabéticos 10,65 0,15 12,18 0,36 11,76 0,31 11,22 0,4 NP 01 10,95 0,34 10,95 0,56 10,99 0,33 7, 63 0,39 Metformina 10,64 0,17 10,63 0,22 9,68 0,15 8, 91 0,16 Rosiglitazona 10,38 0,4 10,47 0,38 9,37 0,26 9,13 0,17

Insulinemia D0 SD D21 SD Controlos não diabéticos 13,1 0,7 13,1 0,7 Controlos diabéticos 53,5 0,7 53,1 1,2 NP 01 53, 6 0,8 25,4 1,6 Metformina 53,4 0,5 44,5 1 Rosiglitazona 53,7 0,8 46 0,8 A D21 todas as substâncias são activas. Contudo, o efeito mais importante é observado com NP 01 (exemplo 2 de acordo com o invento), em particular para insulinemia que é o marcador da insulino-resistência na origem da evolução desfavorável da diabetes. -41 - PE 1807048 2 - Actividade "do tipo SOD" em ratazanas: teste com adriamicina 0 teste com adriamicina é um teste especifico para evidenciar a actividade anti-radicais livres de uma substância. O produto contém micelas inversas baseadas em manganês preparadas de acordo com o exemplo 3.

Protocolo

Uma hora após injecção na perna de uma ratazana Wistar macho de 0,2 ml de uma solução de adriamicina, aparece uma inflamação temporária durante aproximadamente 12 horas. A hiperpermeabilidade vascular e o edema que dai resulta, com uma deterioração das células de membranas endotelianas, são provocados pela libertação de radicais livres. Os esteróides e não esteróides anti-inflamatórios não têm qualquer acção durante esta segunda fase. O edema é medido por pletismografia (expressa em % volume). 3 lotes de 10 ratazanas são constituídos. - lote de controlos negativos: administração de azeite (2 ml/kg) através de via rectal - lote de controlos positivos: administração de 100 mg/kg de diosmina - lote tratado com NP 02 (produzido de acordo com o exemplo 3): 2 ml/kg através de via rectal ΡΕ1807048 -42-

Resultados (SD significa desvio padrão) - Figura 3

Dl D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 Controlo negativo 109,3 132,3 192,8 202,1 202,1 191,6 182,3 166,2 SD 9,64 10,13 16,49 17,08 24,08 16,33 12,53 12,24 Controlo positivo 106,7 120,8 152,2 163 177,6 177,5 168,2 163,5 SD 8,25 14,96 16,61 28, 71 14,58 15,38 13,46 10,58 NP 02 102,3 115,2 154 171,2 163,6 170,3 161,5 155,5 SD 8,03 14,22 13,15 17,47 29,81 20, 73 20,28 14,22 O produto de controlo Diosmine tem uma actividade anti-radicais livres similar à manganês superoxidismutase (Mn-SOD); aqueles produtos são os únicos produtos que apresentam uma actividade neste teste. O produto NP 02 preparado de acordo com o exemplo 3 do invento tem uma actividade anti-radicais livres comparável (mesmo discretamente superior à do produto de referência). 3 - Simulação do crescimento ósseo em ratazanas que estão a crescer O objectivo deste estudo é a avaliação de uma actividade de estimulação do crescimento ósseo em ratazanas em crescimento. O produto contém micelas inversas com base em estrôncio preparadas de acordo com o exemplo 4. PE 1807048 -43-

Protocolo

Os animais são ratazanas Wistar fêmeas de 200 g (média).

Foram feitos lotes homogéneos de 10 ratazanas partindo do seu peso. O tratamento é administrado uma vez por dia durante 6 semanas.

Lotes e produtos administrados: - lote de controlo (administração de azeite pela via rectal) - lote de SrCl2 (SrCl2 e ranelato de estrôncio são ingredientes activos conhecidos para o desenvolvimento ósseo e tratamento da osteoporose) . 68,2 mg de Sr metálico/kg/dia são administrados por via rectal. - lote NP 05 A: produto preparado de acordo com o exemplo 4 do invento, com 12,5 mg de Sr metálico/kg/dia. - lote NP 05 B: produto preparado de acordo com o exemplo 5 do invento, com 1,21 mg de Sr metálico/kg/dia. - lote NP 05 C: produto preparado de acordo com o exemplo 6 do invento, com 0,12 mg de Sr metálico/kg/dia.

Parâmetros analizados no final do tratamento: - peso dos animais -44- PE 1807048 - medições do diâmetro da cabeça do fémur das ratazanas após eutanásia e amostragem (craveira sob lente binocular) - quantidade de estrôncio no osso (através de absorção atómica). - quantidade de estrôncio no plasma (através de absorção atómica).

Resultados

Diâmetro femural (expresso em mm) - Figura 4 - SD significa desvio padrão mm Controlo SrCl2 NP 05 A NP 05 B NP 05 C Diâmetro femural 3,86 3,93 4,12 4 4,08 SD 0,14 0,12 0,28 0,17 0,14

Os produtos NP 05 possuem uma actividade de estimulação do crescimento ósseo superior à do produto de referência. O produto NP 05 C possui uma actividade superior à do produto de referência com 600 vezes menos estrôncio metálico.

Quantidade de estrôncio nos ossos (expressa em μρ/g) - Figura 5 - SD significa desvio padrão -45- PE 1807048 μg/g Controlo SrCl2 NP 05 A NP 05 B NP 05 C Sr nos 77,85 1508,83 261,44 172,19 77, 03 ossos SD 16,85 670,43 109,58 18,48 7,3 0 efeito negativo do estrôncio no tratamento da osteoporose (Protelos®) está relacionado com a importante fixação de estrôncio nos ossos com as quantidades terapêuticas utilizadas (2 g por dia para humanos e 68,2 mg/kg para animais). O produto NP 05, em particular com as menores quantidades de estrôncio (NP 05 C) não induz qualquer fixação de estrôncio nos ossos.

Quantidade de estrôncio no plasma (expressa em \iq/q) - Figura 6 - SD significa desvio padrão pg/g μq/q Controlo SrCl2 NP 05 A NP 05 B NP 05 C Níveis de Sr no plasma Média 150 3160 371 101 92 SD 41,15 599,43 165,63 37,08 43,33 A taxa de estrôncio plasmático do lote NP 05 C preparado de acordo com o exemplo 6 do invento é semelhante à taxa de lote de controlo não tratado. -46- PE 1807048 4 - Efeito neuroprotector do lítio: modelo da ratazana da doença de Huntington

Algumas aplicações demonstraram que o lítio protege neurónios de CNS desenvolvidos em cultura contra o glutamato mediado pelos receptores NMDA. In vivo, foi avaliado o efeito neuroprotector do lítio contra lesão estriatal num modelo de ratazana da doença de Huntington. Esta actividade farmacológica é obtida com as mesmas doses clínicas do tratamento da doença bipolar: 500 mg a 1000 mg por dia de carbonato de lítio (litémia: 0,5-0,8 m Eq/1) em seres humanos e 2-10 mg por dia em ratos ou ratazanas. O lítio tem uma elevada toxicidade e é necessário vigiar a litémia todos os dias por causa dos efeitos adversos. 6 ratazanas receberam através de via rectal 2 ml/kg por dia (produto do exemplo 10: 10 μρ Li) 24 g antes e durante os 7 dias após a infusão unilateral de ácido quinolínico no estriato. O estriato é recolhido e crio-seccionado utilizando um criostato Lecia CM 1850. As secções são tratadas com etanol, limpas com xileno e então plaqueadas utilizando uma montagem DPX e deixadas a secar.

As secções que contêm neurónios NM são analizadas utilizando um programa estereológico para comparar o número -47- PE 1807048 de neurónios no lado da lesão versus o lado intacto. 7 dias após injecção QA, NP 03 protege significativamente os neurónios NM da morte a seguir à injecção. Num relatório anterior, 20/30% da morte das células foi obtida em sujeitos tratados com solução salina. Aqui, é obtida apenas 9,2% da morte das células com a administração de NP 03. É obtido um resultado semelhante aos resultados obtidos com o cloreto de litio administrado através de via IP, mas apenas 10 \iq/dia é utilizado em vez de 10 mg/dia de litio metálico.

OPTIMIZAÇÃO DA ACTIVIDADE FARMACOLÓGICA DEPENDENDO DA DIMENSÃO MICELAR

Um estudo farmacológico foi realizado com um modelo de ratazana STZ para comparar a actividade de 5 produtos preparados de acordo com o invento, em que a quantidade de água introduzida na mistura é o único parâmetro variável (é utilizada a mesma quantidade de sulfato de vanadilo solubilizado). Segue-se daqui que a única diferença entre estes 5 produtos é a dimensão das micelas inversas. O modelo de ratazana STZ é um modelo de mistura para a diabetes do tipo 1 e tipo 2. Este modelo permite obter uma resposta rápida na actividade diabética das -48- PE 1807048 substâncias.

Protocolo A estreptozotocina (STZ) é administrada a ratazanas Wistar machos de 250 a 300 g, por via IV numa quantidade de 50 mg/kg. 3 dias após a administração da STZ, a glicémia dos animais está entre 20 e 30 mmol/1 e permanece estável durante os 7 dias seguintes. Os produtos estudados são administrados diariamente durante 7 dias. A glicémia é medida a D0, Sl, D3 e D7.

Cada lote corresponde a 6 ratazanas. - lote de controlo: azeite em emulsão com água por via rectal - lote A: administrado através de via rectal [2 ml/kg (W=2,30)]: exemplo 7 - lote B: administrado através de via rectal [2 ml/kg (W=0,38)]: exemplo 8 - lote C: administrado através de via rectal [2 ml/kg (W=0,04)]: exemplo 9 - lote D: administrado através de via rectal [2 ml/kg (W=0,90)] - lote E: administrado através de via rectal [2 ml/kg (W=0,125)] PE 1807048 -49-

Resultados

Glicémia (mmol/1) W D0 D3 D7 Lote de 21,02 21,93 20,03 controlo SD 2,66 SD 3,36 SD 2,19 Lote A 2,30 27,56 24 19, 8 SD 0,96 SD 1,27 SD2,09 Lote D 0,90 21,1 14 12,20 SD=1,10 SD=1,32 SD=1,64 Lote B 0,38 21,54 16,31 13,44 SD 0,90 SD 0,78 SD 0,81 Lote E 0,125 17,6 11,80 8 SD=1,18 Sd=l,22 SD=1,45 Lote C 0,04 22,13 20,55 14,70 SD=1,84 SD=1,70 SD=2,26

As Figuras 7A e 7B representam a glicémia obtida em D3 e D7 respectivamente.

Comentários A actividade antidiabética mais importante parece ser obtida quando a razão W varia de 0,12 a 1.

As micelas de maior dimensão contêm água livre em que o metal já não está sob forma metálica reduzida e permanece numa forma de sulfato que produz uma actividade -50- PE 1807048 inferior.

Por variação da dimensão das micelas (razão W), a actividade do produto preparado de acordo com o invento pode ser optimizada.

OPTIMIZAÇÃO DA QUANTIDADE DE ÁGUA INCORPORADA

Protocolo

Amostras contendo as quantidades relativas de peceol, sitosterol e etanol dadas nos exemplos anteriores foram preparadas variando a quantidade de água em que os iões metálicos eram solubilizados. Foi feita uma escala de diluição aumentando a quantidade de água com um incremento de 0,3%.

As amostras foram homogeneizadas agitando a 35°C, tal como descrito atrás. O impacto da quantidade de água na estabilidade do sistema micelar inverso foi determinado visualmente (turvação) e através de difracção de raios X de pequeno ângulo.

Resultado A partir de 6,9% de água na composição (i.e. W de cerca de 0,175) e mais, a microemulsão torna-se mais e mais -51 - PE 1807048 turva e aparecem duas fases quando a quantidade de áqua aumenta. A percentagem de água é expressa em peso da água total:peso total da composição.

Lisboa, 18 de Novembro de 2010

Claims (13)

1. PE 1807048 - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Método para preparar micelas inversas com um núcleo aquoso igual ou inferior a 100 nm, compreendendo: (a) o contacto de (i) um sistosterol, (ii) um acilglicerol, preferencialmente um diacilglicerol de ácidos gordos, (iii) água, em particular água purificada, e (iv) um catiâo metálico solúvel em água, (b) agitação da mistura obtida no passo (a), a 40°C ou menos, e durante um tempo suficiente para obter formação de micelas inversas, sendo a referida mistura efectuada mecanicamente a uma velocidade de cerca de 1000 até cerca de 5000 r/min ou por sonicação.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação , em que a razão W = (água)/(acilglicerol) é igual ou inferior a cerca de 2,5, mais preferencialmente igual ou inferior a 1 e mais especificamente de 0,01 a 0,2.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o esterol é o beta-sitosterol.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o diaclglicerol de ácidos gordos é seleccionado de 1,2-dioleina e l-oleil-2-acetil-glicerol.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das -2- PE 1807048 reivindicações precedentes, em que o metal é um metal que possui um sal solúvel em água.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o metal é um metal que apresenta uma actividade biocatalitica.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a razão W é de 0,05 a 0,18.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a agitação da mistura é realizada a aproximadamente entre 30 e 35°C.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o catião metálico apresenta um catião num estado de oxidação de, pelo menos, 2.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que em que o catião metálico é seleccionado do grupo constituído por zinco, nióbio, vanádio, selénio, molibdénio, crómio, antimónio, estanho, ouro, ruténio, paládio, platina, lítio e estrôncio.
11. 11. Micelas inversas obtidas através de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes. -3- PE 1807048
12. 12. Composição farmacêutica compreendendo micelas inversas tal como definidas na reivindicação 11 num portador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 18 de Novembro de 2010 PE 1807048 1/6 Glicémia

    Controlos não diabéticos-Controlos diabéticos--NF> 01 Metforrnina -Rosiglitazona Figura 1 INSULINEMIA

    Controlos não Controlos diabéticos diabéticos Metforrnina Rosiglitazona

    Figura 2 PE 1807048 2/6

    Figura 3 PE 1807048 3/6 DIÂMETRO FEMURAL mm 4.6 γ 4.4 — 4.2 -4 — 3,8 — 3.6 — 3.4 — 3.2 -

    Controlo SrCi* NP 05 A NP 05 B NP QS C O Controlo ss SrCl® α NP OS A a NP 05 B * NP 05 C Figura 4 PE 1807048 4/6 2500 ESTRÔNCIO NOS OSSOS 2000 1500 1000 500 0 T Bi i.l 1.1 jj HBH9 1¾ ÍNÉfStoait » 1 l t l Controlo SíCP MP Q5 A NP 05 B NP OS C O Controlo M SrCF
13. 13 NP 05 A m NP 05 8 * NP 05 C Figura 5 ΡΕ1807048 5/6 NÍVEIS DE ESTRÔNCIO NO PLASMA 40BQ 3500 3000 2500 || 2000 1500 1000 500 O .......urnm.. Controlo

    SrCP NP 05 A NP 05 B NP 05 O O controlo «STCP NP 05 A «NP 05 B M NP 05 C Figura 6 PE 1807048 6/6 GiícéiTiía deita D7

    (leita D7

    Figuras 7Â e 7B - 1 - PE 1807048 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição . FR 2316247 . WO 9623811 A . US 6129924 A . WO 0236134 A . WO 2004075990 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição • Jenny P.QIusker; Amy K.Katz; Charles W.Bock. Metal lons In Biologiea! Systems, The Rigaku Journal, 1999, vol. 16 <2 tOOSSJ