EA012210B1

EA012210B1 - Обратные мицеллы для доставки катионов металлов, включающие в себя диглицерид и фитостерол, и способ их получения

Info

Publication number: EA012210B1
Application number: EA200700994A
Authority: EA
Inventors: Жан-Клод Морель
Original assignee: Медзис Фарма
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2009-08-28
Also published as: ES2353804T3; EP1807048B1; IL182756A; CA2584684C; JP4975631B2; EP1807048A1; JP2008519026A; ATE483454T1; US9173838B2; CN101102751B; DK1807048T3; WO2006048773A1; AU2005300253A1; EA200700994A1; PL1807048T3; HK1108368A1; ZA200704286B; CA2584684A1; DE602005024036D1; AU2005300253B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения обратных мицелл, содержащих стеролы, ацилглицеролы и металлические соли, и к полученным этим методом обратным мицеллам. Их лучше использовать в фармацевтической и диетической областях.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения обратных мицелл, содержащих стеролы, ацилглицеролы и соль металла, путем механического смешивания или обработки ультразвуком. Обратные мицеллы, полученные по способу настоящего изобретения, могут проходить через слизистую оболочку и затем через клеточные мембраны. Они, таким образом, делают возможной интернализацию ионов металлов клетками-мишенями. Их преимущество состоит в возможности использования в промышленных масштабах в фармацевтической и диетической отраслях.

Уровень техники

В последние годы были предложены разные способы улучшения доставки лекарств к участку действия. Во-первых, лекарство должно быть введено удобным и простым путем, например, перорально или ректально, и, во-вторых, действующее вещество должно быть доставлено в клетки-мишени в активной форме. В настоящее время нет способа, обеспечивающего такую целенаправленную доставку действующих молекул.

Многие публикации и патенты описывают способы инкапсулирования действующих веществ в нано- и микрочастицы, но проблема, до сих пор не решенная, состоит, с одной стороны, в обеспечении простого пути введения, отличного от инъекционного, например перорального или буккального, и, с другой стороны, в обеспечении максимально полной доставки действующего вещества к участку действия. Лучшим примером невозможности этого являются выполненные в последние десятилетия исследования, направленные на получение инсулина для перорального введения. Например, изученные до сих пор системы доставки обеспечивали степень абсорбции инсулина всего лишь 2-5%.

Изобретатели установили ранее, что смешивание двух типов липидов с некоторыми металлическими солями позволяло увеличить биодоступность соли и, следовательно, добиться определенной терапевтической активности при меньших в 1000-5000 раз дозах; потенциальная токсичность указанных солей могла, таким образом, быть уменьшена (смотрите, например, И8 6129924, XVО 02/36134 и XVО 2004/075990).

Изобретатели, в частности, установили, что определенные продукты, в частности растительные фракции или комплексы этих фракций с металлами, обычно неактивные или недостаточно активные в качестве гипохолестеролэмических веществ, проявляли повышенную в значительной степени активность, когда их вводили растворенными в оливковом масле. Это явилось поводом к поиску среди многочисленных компонентов оливкового масла таких, которые могли бы приводить при смешивании или вступлении в реакцию с протестированными продуктами к образованию более активных продуктов. Следуя таким путем, изобретатели смогли идентифицировать новые продукты, названные «органометаллическими комплексами» и полученные в результате реакции между производным ванадия с валентностью 4 или 5 и двумя органическими соединениями, выделенными из растительных экстрактов и включавшими в свой состав, соответственно, ситостеролы и ацилглицеролы.

Изобретатели установили также, что аналогичные комплексы могут быть получены из других производных металлов, в которых металл имеет валентность как минимум 2 и известен своей антидиабетической активностью.

Они установили также, что аналогичные комплексы могут быть получены из ранее указанных двух типов органических производных и различных катионов металлов, пригодных в качестве биокатализаторов метаболизма в живых системах, комплексы, являющиеся, во всех случаях, особенно эффективными средствами в качестве переносчиков указанных катионов.

Под катионами с биокаталитической активностью» понимают катионы, обладающие непосредственной биокаталитической активностью и катионы, способные замещать биокатализаторы и, таким образом, изменять определенные патологические метаболические пути. Можно напомнить пример ванадия, который, по причине его координационных химических свойств, может замещать фосфат, в результате происходит ингибирование как кислых, так и щелочных фосфатаз ванадил и ванадат соединениями; в числе таких фосфатаз и тирозин фосфатаза, которая способствует усилению фосфорилирования тирозина периферийного рецептора инсулина, а также ассоциированных протеин киназ.

Настоящее изобретение раскрывает теперь способ получения обратных мицелл, включающих в себя одну или большее количество металлических солей, таких обратных мицелл, которые могут быть введены любым путем, в частности через слизистую оболочку, и которые могут проникать через клеточные мембраны. Преимущество этого способа состоит в том, что он делает возможным регулирование и оптимизацию состава мицелл с целью их последующего использования в фармацевтической и диетической областях техники.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к способу получения обратных мицелл, содержащих стеролы, ацилглицеролы и металлическую соль и предназначенных для использования в фармацевтической и диетической отраслях.

Изобретение относится также к обратным мицеллам с водным ядром размером меньше или равным 100 нм, причем указанные мицеллы получают по способу, включающему:

(а) контактирование (1) стерола, (ίί) ацилглицерола, предпочтительно диацилглицерола жирных ки

- 1 012210 слот, (ίίί) воды (в частности, дистиллированной воды), (ίν) катион металла, (Ь) перемешивание полученной на этапе (а) смеси, при температуре 40°С или более низкой, и в течение времени, достаточного для образования обратных мицелл, при осуществлении указанного перемешивания механически при скорости от примерно 1000 до примерно 5000 об./мин или путем обработки ультразвуком.

Осуществление изобретения

Обратные мицеллы

Система обратных мицелл, соответствующая изобретению, характеризуется как микроэмульсия, включающая в себя дисперсию микрокапель воды в масле. Эта дисперсия стабилизирована поверхностно-активным веществом (ацилглицерол, более предпочтительно диглицерол жирных кислот) на поверхности раздела вода/масло. Фаза обратных мицелл может быть определена как система, в которой вода образует внутреннюю фазу, а гидрофобные хвосты липидов образуют непрерывную фазу. Обратные мицеллы, содержащие масло (масла), поверхностно-активное вещество (поверхностно-активные вещества) и водную фазу, характеризуют также как микроэмульсии «вода в масле».

Размер мицелл регулируют количеством солюбилизированной воды в системе. Он находится в линейной зависимости с весовым (вода)/(поверхностно-активное вещество) отношением V (солюбилизированная вода в смеси/поверхностно-активное вещество в смеси). Как указано выше, отношение V = (вода)/(ацилглицерол) предпочтительно меньше или равно примерно 2,5, более предпочтительно меньше или равно 1, а более конкретно от 0,01 до 0,2. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, отношение V предпочтительно находится в пределах от 0,05 до 0,18.

Характеристики обратных мицелл так же, как и размер их ядра, могут быть определены разными методами:

рассеяния рентгеновских лучей

- рассеяния нейтронов

- трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ)

- динамического рассеяния света (ЛЬ8)

К числу необходимых для получения соответствующих изобретению обратных мицелл веществ относятся два липида: стерол и ацилглицерол, предпочтительно диглицерид жирных кислот, который действует как поверхностно-активное вещество. Соответствующие изобретению обратные мицеллы включают также как минимум один катион металла. Соотношения между липидными компонентами (стеролы и ацилглицерол) могут изменяться в больших пределах, например, весовое отношение стерол/ацилглицерол может быть в пределах от 0,01 до 1 (включительно). В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, ацилглицерол (предпочтительно диглицерид жирных кислот) может быть применен в избытке по отношению к стеролу (предпочтительно ситостерол). Более конкретно, весовое отношение стерол/ацилглицерол больше или равно 0,1, более предпочтительно от 0,1 до 0,2.

Металл может быть использован в значительно меньшем количестве по сравнению с двумя другими компонентами, преимущественно в молярном отношении от 1/100 до 1/10000 относительно ацилглицерола.

Разные компоненты могут быть правильно идентифицированы с помощью соответствующих аналитических методов. Ситостерол может быть идентифицирован методом газовой хроматографии, а ацилглицерол с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС) с использованием светорассеивающего детектора, на кремниевой колонне (кромасил С18), в присутствии элюента, например изократного ацетонитрила. Для идентификации диглицеридов может быть применена также газовая хроматография.

Обратные мицеллы являются динамичными системами. Следствием броуновского движения являются непрерывные столкновения молекул, которые приводят к слиянию мицелл и обмену водными ядрами. Происходят распад и образование мицелл, что позволяет протекать химическим реакциям между разными растворами. Скорость обмена между мицеллами возрастает, в частности, увеличением температуры, длины углеводородной цепочки поверхностно-активного вещества и отношения V (свободная вода усиливает указанный обмен). В контексте изобретения, размер водного ядра мицелл изменяется предпочтительно от 5 до 100 нм. Относительное содержание воды (XV) в смеси предпочтительно меньше или равно 2,5 и более предпочтительно меньше или равно 1 относительно содержания ацилглицерола, предпочтительно диглицерида жирных кислот. В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, предпочтительно отношение V от 0,1 до 0,2.

Преимущество соответствующих настоящему изобретению обратных мицелл над уже известными системами доставки состоит в том, что они позволяют включать в них ионы металлов любого типа.

Способ получения обратных мицелл в соответствии с настоящим изобретением

В одном из вариантов осуществления, изобретение относится к способу получения обратных мицелл, имеющих водное ядро размером меньше или равным 100 нм и включающих в свой состав водорастворимый фармацевтически активный катион металла, причем в указанном варианте осуществления указанный метод включает следующие этапы:

(а) контактирование (ί) стерола, (ίί) ацилглицерола, предпочтительно диацилглицерола жирных ки

- 2 012210 слот, (ίίί) воды (в частности, дистиллированной воды) и (ίν) водорастворимого катиона металла, при отношении = [дистиллированная вода]/[ацилглицерол, предпочтительно диглицерид жирных кислот] предпочтительно меньше или равно примерно 2,5, (Ь) перемешивание полученной на этапе (а) смеси, при температуре 40°С или более низкой, и в течение времени, достаточного для образования обратных мицелл, при осуществлении указанного перемешивания механически при скорости от примерно 1000 до примерно 5000 об./мин или путем обработки ультразвуком.

Полученные и выделенные обратные мицеллы в последующем пригодны, в частности, для использования в качестве систем доставки лекарственных веществ. Этап (Ь) указанного способа имеет особую важность, так как он позволяет получить обратные мицеллы, которые в последующем пригодны для использования в качестве транспортирующих систем для доставки лекарственных веществ к участку действия в теле человека или животного.

Вещества, входящие в состав обратных мицелл, объединяют на этапе (а). Более детально пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением вещества будут описаны ниже.

Перемешивание смеси, полученной на этапе (а) осуществляется, более конкретно, при температуре меньше или равной 40°С, предпочтительно в интервале от 30 до 38°С, более предпочтительно от 30 до 35°С, в течение времени, достаточного для образования обратных мицелл. Достаточное время может зависеть, в частности, от применяемых способов перемешивания, конкретно, механического перемешивания при скорости примерно 1000-5000 об./мин или обработки ультразвуком. Время механического перемешивания или обработки ультразвуком в любом случае является временем, необходимым для превращения исходной смеси в монофазный обратный мицеллярный раствор. Предпочтительно перемешивание путем обработки ультразвуком.

В одном из вариантов осуществления изобретения, катион металла сначала солюбилизируют в дистиллированной воде, которую затем объединяют с другими компонентами (этап (а)).

Специалистам в данной области техники известно, как выбрать вспомогательные вещества и/или компоненты, необходимые для использования вместе с соответствующими настоящему изобретению системами, чтобы способствовать проявлению их выгодных свойств. В частности, присутствие глицерола, когда он введен в большом количестве, может препятствовать образованию обратных мицелл или привести к разрушению мицеллярной системы. Более конкретно, для получения соответствующих настоящему изобретению обратных мицелл стирола используют не более 1% (количество процентов определяют исходя из отношения вес глицерола/общее весовое количество воды в системе), предпочтительно вовсе не используют.

Обработка ультразвуком

Ультразвуки при ультразвуковой обработке приводят к акустической кавитации в жидкостях, т.е. к образованию пузырьков в жидкостях. Большая амплитуда колебаний приводит к более значительной кавитации. Ультразвук осуществляет гомогенное перемешивание во всех частях реакционной камеры и обеспечивает слабую турбулентность в жидкости. Это наиболее надежный способ получения наночастиц.

Устойчивость полученных наночастиц обусловлена, в частности, ацилглицеролом (предпочтительно диглицерид жирных кислот), действующим как поверхностно-активное вещество.

В лабораторных или промышленных масштабах для обработки ультразвуком могут быть использованы ультразвуковые установки разных типов. Наиболее предпочтительной является обработка ультразвуком большой мощности. При небольших объемах вырабатываемого продукта с хорошей гомогенностью приемлемые результаты обеспечивают установки мощностью 400 или 600 Вт с частотой ультразвука 20 кГц, которые являются, следовательно, предпочтительными. При использовании установок такого типа возможно также электронное управление температурой и эмиссией во время протекания процесса. Имеются установки такого же типа и для промышленного использования.

Физические параметры, в частности параметры времени (3-5 мин, однократно или большее количество раз), зависят от используемой установки, объема смеси и ее вязкости. Специалисты в данной области техники могут легко определить такие параметры. Более конкретно, температура смеси не должна превышать 40°С, чтобы предотвратить разложение реагентов. Температура предпочтительно ниже, чем примерно 38°С, более же предпочтительно равна или ниже, чем примерно 35°С.

Механическое перемешивание

Обычные устройства включают в себя мешалки, быстрые движения которых вызывают вихревые потоки и завихрения, способствующие взаимопроникновению частиц и образованию наночастиц в смеси. Скорость перемешивания, необходимая для достижения оптимальных результатов, зависит от вязкости смеси: скорость перемешивания предпочтительно находится в интервале от 1000 до 5000 об./мин. Обрабатываемые объемы, применяемые устройства, скорость перемешивания и отношение зависят от включенного фармацевтически активного катиона металла и должны соответствовать ему.

Для оптимизации этого процесса смесь выдерживают при температуре ниже, чем примерно 40°С, чтобы предотвратить разложение реагентов, предпочтительно при температуре ниже, чем примерно

- 3 012210

35°С, более предпочтительно при температуре, находящейся в интервале от примерно 30 до 35°С.

Другая цель настоящего изобретения касается обратных мицелл, получаемых соответствующим настоящему изобретению методом, описанным выше.

Вещества, входящие в состав мицелл

Ацилглицерол

Ацилглицеролы, в частности ацилглицеролы жирных кислот, пригодные для получения соответствующей настоящему изобретению обратной мицеллярной системы, могут быть выделены из большинства растений и являются основными компонентами растительных и животных жиров.

Число жирных кислот, их место присоединения к глицеролу, длина цепей и количество их возможных ненасыщенных связей у разных ацилглицеролов разные. К ацилглицеролам относятся, в частности, моно-, ди- и триацилглицеролы. В одном из вариантов осуществления, используемые в настоящем изобретении моно-, ди и триглицериды имеют следующую формулу (I):

ΟΗ,,ΟΕς снок₂

СН₂ОН₃ где Κι представляет собой ацил - остаток линейной или разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с количеством атомов углерода от 14 до 24, атом водорода, или моно-, ди- или тригалактозу или глюкозу;

К₂ представляет собой ацил - остаток линейной или разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с количеством атомов углерода от 2 до 18,

К₃ представляет собой ацил - остаток линейной или разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с количеством атомов углерода от 14 до 24, или атом водорода.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, как минимум один из Κ₁ и Κ₃, предпочтительно один, обозначает ацильный остаток олеиновой кислоты (С18:1[цис]-9).

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, К₂ имеет одну ненасыщенную связь (например, этиленовую связь) и имеет предпочтительно 18 атомов углерода, предпочтительно К₂является остатком олеиновой кислоты (олеоил группа), одним из его позиционных изомеров относительно двойной связи (цис-6,7,9,11 и 13) или одним из его изо-разветвленных изомеров.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, К₂ обозначает ацетильную группу.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, К₃ обозначает атом водорода.

Ацилглицеролы, используемые при получении мицелл в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выделены из большинства растений.

Ненасыщенные растительные масла особенно и преимущественно используют в качестве источников ацилглицеролов, особенно оливковое масло первого холодного прессования.

Как правило, используют масло с высоким содержанием олеиновой кислоты в качестве пригодного источника соответствующих настоящему изобретению ацилглицеролов. В таком масле обычно большая доля используемых в соответствии с настоящим изобретением ацилглицеролов.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, предпочтительные диглицериды жирных кислот относятся к группе, состоящей из 1,2-диолеина и 1-олеоил-2-ацетилглицерола.

Ацилглицеролы, а более конкретно те, которые признаны наиболее активными в изучавшихся вариантах применения, имеются также в торговой сети. Это относится, в частности, к 1-олеоил-2ацетилглицеролу и 1,2-диолеоилглицеролу, которые имеются в виде коммерческих продуктов высокой чистоты. В частности, глицерид моноолеат, содержащий около 44% диолеиновых глицеридов, из которых около 14% приходится на 1,2-диолеин. Такое соединение фармацевтически признано (Еигореап Рйаттасоре1а (4‘^ь Еййюп), И8Р 25/ΝΡ20, и 1арапе§е 81апйатй οί Гоой АййШуек). Этот продукт серийно выпускается, например, компанией СаИеГокке Сотрапу под торговой маркой РЕСЕОЬ®.

Стерол

Стеролом, пригодным для получения соответствующей настоящему изобретению обратной мицеллярной системы, может быть любой стерол, а предпочтительно растительный стерол. Предпочтительным стеролом, пригодным для получения соответствующей изобретению обратной мицеллярной системы, является ситостерол.

Ситостеролом, введенным в соответствующую настоящему изобретению обратную мицеллярную систему, может быть [бета]- или [гамма]ситостерол, предпочтительно [бета]ситостерол, или же ситостерол, введенный в форме растительного экстракта, содержащего как минимум одну их этих форм ситостерола. Ситостерол является ведь компонентом большинства растений.

Можно, в частности, использовать различные коммерческие продукты. Более конкретно, можно использовать коммерческий ситостерол, экстрагируемый из сои. В таком продукте доля ситостирола обычно составляет 50-70% от веса продукта, и находится он обычно в смеси с кампестеролом и ситостанолом

- 4 012210 при соответствующих долях каждого из них порядка 15%. Можно использовать также коммерческий ситостерол, получаемый из разных видов хвойных растений и называемый талловым маслом, в указанном же талловом масле весовая доля бета-ситостерола составляет в среднем 75%. В принципе, можно использовать ситостерол в смеси с ситостанолом. Предпочтительно, указанная смесь содержит ситостерола как минимум 50% от ее веса.

Можно получить бета-ситостерол с чистотой более чем 95%, или даже 99%, действуя следующим образом: проводят несколько последовательных рекристаллизации коммерческой смеси ацетоном, что позволяет предварительно очистить бета-ситостерол от кампестанола и ситостанола, присутствующих в смеси. Далее, подвергают очищенный таким образом продукт 1-3 этапам очистки методом жидкостной хроматографии высокого давления на препаративной колонке С18 при использовании смесей элюантов, таких как метанол, в частности при доле метанола 100%, или в смесях метанола и ацетонитрила, в частности в смеси 80-20 и в любой промежуточной смеси, делая возможным получение ситостерола с чистотой более чем 95% или даже 99%. Такая чистота определена методом газовой хроматографии.

Ситостерол, а именно ситостанол, можно получить также путем экстракции из растений известными в литературе методами, например, по методу, изложенному на стр. 95 диссертации, представленной в Монпелье в ноябре 1993 году Клодом Цердоном (С1аибе Сегбоп) под названием «Моби1а1юи бе 1а ргобисбоп бе кародешпек к1Сго1бк|шк еп геропке а ГшЫЬНюп бе 1а купШеке бе к1его1к».

Эта экстракция проводится лучше всего путем комплексирования с металлами, по методу, описанному, в частности, во Французском патенте РЯ 2316247, в котором описан метод выделения 3-гидроксистероидов и 3-оксо-стероидов из смеси, содержащей эти вещества.

Для осуществления этой экстракции можно использовать любое растение или продукт растительного происхождения, в которых относительно высокое содержание ситостерола.

В качестве примеров растений или продуктов растительного происхождения с относительно высоким содержанием ситостерола можно назвать, в частности, оливковое масло, соевое масло, листья хлопчатника, листья кофейного дерева, проростки пшеницы, а данные о содержании свободного стерола и процентном содержании ситостерола в фракции свободного стерола в них указаны в приведенной ниже таблице:

Объекты	Содержание в 1 кг	% фракции стерола
Оливковое масло	1310 мг	91%
Соевое масло	1908 мг	53%
Листья хлопчатника	3961 мг	93%
Листья кофейного дерева	9914 мг	51%
Проросток пшеницы	17336 мг	67%

* указан весовой процент

Как отмечено выше, соотношения между стеролом и ацилглицеролом могут варьировать в больших пределах, например, весовое отношение стерол/ацилглицерол может изменяться от 0,01 до 1 (включительно). В соответствии с одним из вариантов осуществления, может быть создан избыток ацилглицерола (предпочтительно диглицерид жирных кислот) относительно стерола (предпочтительно ситостерол). Более конкретно, весовое отношение стерол/ацилглицерол составляет более чем 0,1 или равно этой величине, более предпочтительно от 0,1 до 0,2.

Металл

Катионы металлов, которые можно использовать для получения соответствующей изобретению обратной мицеллярной системы являются катионами с валентностью как минимум 2, биокаталитическая активность их известна или подлежит еще изучению.

В контексте настоящего изобретения, термин «биокатализатор» указывает на то, что эти металлы оказывают каталитическое действие на биологические системы.

Ионы металлов играют важную роль примерно в одной трети ферментов (Ме1а1 юпк ш Вю1од1са1 8ук1етк, 1еппу Р.О1иккег, Ату К. Ка1х апб Сйаг1ек ХУ.Воск. ТПе Я1даки 1оита1, уо1 16, № 2, 1999). Они могут проявлять разные типы действий:

изменение потока электронов от субстрата или фермента, позволяющее управлять ферментной каталитической реакцией, соединение с белковым компонентом фермента для придания ему пространственной конфигурации, позволяющей ему обнаруживать его активные участки, обеспечение окислительно-восстановительной активности при наличии у металла нескольких валентностей.

Металл М следует выбирать, исходя из требуемой биологической активности.

В качестве примеров, если необходим продукт с гиполипидемичной активностью, или гипогликемичной и/или антидиабетической и/или инсулиномиметичной активностью, более конкретно, выбирают металлическое производное ванадия, ниобия, молибдена, селена, хрома, цинка или титана.

В этих металлических производных:

лучше, если ниобий имеет валентность 4 или 5, предпочтительно 5, лучше, если ванадий имеет валентность 3, 4 или 5, предпочтительно 4,

- 5 012210 лучше, если селен имеет валентность 4 или 6, предпочтительно 4, молибден, как правило, имеет валентность от 3 до 6, предпочтительно 3, хром предпочтительно имеет валентность 3, цинк предпочтительно имеет валентность 2, 3 или 4.

Примеры металлов, подходящих для других типов активности, приведены ниже:

сурьма или олово, если требуется терапия автоиммунных болезней, в частности, болезней нервной системы, например, рассеянного склероза и онкологических болезней, золото при аутоиммунных болезнях, поражающих локомоторную систему, например при ревматоидном артрите, ванадий при опухолях или неоплазии пищеварительного тракта, в частности, поджелудочной железы, толстой кишки и прямой кишки, рутений или палладий при опухолях дыхательных путей или неоплазии, литий при патологиях центральной нервной системы, таких как болезнь Хунтингтона, олово при синдроме приобретенного иммунодефицита, селен в онкологии, стронций при остеопорозе.

В одном из вариантов осуществления катион металла выбран из группы, в которую входят цинк, ниобий, ванадий, селен, молибден, хром, сурьма, олово, золото, рутений, палладий, платина, литий и стронций.

В качестве примера, конкретные пригодные в соответствии с изобретением металлические производные выбраны из сульфатов, гидратов, галоидов, в частности хлоридов, и любой другой водорастворимой соли.

В некоторых случаях можно использовать соли аммония, метоксиды щелочных металлов или щелочноземельных металлов, которые лучше растворять в воде или, иногда, в спиртах. Можно также использовать органические металлические производные типа ацетилацетонатов, алкоксидов или металлических комплексов с органическими растворителями, например простые эфиры, ТНР, ΌΜΡ. Эти органические металлические производные обычно растворимы в органических растворителях, более конкретно, в хлорсодержащих растворителях типа хлороформа или дихлорметана. Эксперимент показывает, что они могут быть собраны мицеллами в восстановленной форме металла в водном ядре. Тем не менее, предпочтительны водорастворимые соли.

Любой металл, имеющий водорастворимую соль, может быть включен в соответствующие изобретению обратные мицеллы. Выбор металла определяется желательной терапевтической активностью.

Такое применение настолько ответственно, что, обычно, специалист в данной области техники осведомлен о неизбежных трудностях терапевтического использования катионов металлов ввиду токсичности указанных катионов металлов в эффективном активном количестве: хорошо известными примерами являются соли лития, используемые при психиатрических или неврологических нарушениях, или соли платины, рутения или палладия, используемые в онкологии.

Как отмечено выше, предпочтительным металлом является металл, проявляющий биокаталитическую активность.

Металл может быть использован в очень малых по отношению к двум другим компонентам количествах, предпочтительно при молярном отношении от 1/100 до 1/10000 по отношению к ацилглицеролу.

Терапевтическая активность достигнута при количествах металла, которые в 1000-10000 раз меньше по сравнению с количествами соли или органического производного этого же металла, необходимыми для обеспечения такой активности.

Характеристика обратных мицелл

Физические характеристики обратных мицелл могут быть определены разными методами: рассеяния рентгеновских лучей, рассеяния нейтронов, трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ), динамического рассеяния света (ОЬ8).

При анализе продуктов методом рассеяния рентгеновских лучей, как это описано в примерах 1 и 2, обнаруживали обратные мицеллы в микроэмульсии.

Использование обратной мицеллярной системы

Соответствующие изобретению обратные мицеллы повышают биодоступность включенных в них катионов металла, обеспечивая их терапевтическое или диетическое использование с уменьшенной токсичностью или с токсичностью, равной нулю. Это большое преимущество по сравнению с известным уровнем техники. Благодаря ее микроэмульсионной природе, обратная мицеллярная система допускает использование разных типов препаратов, включающих в себя различные вспомогательные вещества, наполнители, носители и пригодных для введения разными путями, в том числе через слизистую оболочку, например в полость рта или ректально, в результате чего обратные мицеллы могут проходить через клеточные мембраны.

В принятом в настоящем документе значении термины «слизистая оболочка» и «слизистый» отно

- 6 012210 сятся к слизистым тканям, таким как эпителий, собственная пластинка слизистой оболочки и слой гладкой мышцы в пищеварительном тракте. «Доставка через слизистую оболочку», «введение через слизистую оболочку» и аналогичные термины в принятом в настоящем документе значении относятся к введению состава в слизистую оболочку. «Доставка через слизистую оболочку», «введение через слизистую оболочку» и аналогичные термины распространяются на введение препарата через бронхи, ткани десны, под язык, назально, орально, вагинально, ректально и через слизистую пищеварительного тракта.

В настоящее время известно, что обратная мицеллярная система может быть использована для получения наноматериалов, действующих как микрореакторы, которые, в связи с этим, усиливают реакции совместного осаждения или химического восстановления ионов. Они дают возможность получить наноматериалы в метастабильном состоянии, которые обычно не образуются, в плотном состоянии, при комнатной температуре. Следовательно, можно получить соответствующим изобретению способом частицы восстановленного металла, а именно меди, золота, серебра, никеля, кадмия и т.д., а также полупроводники, сплавы и магнитные текучие среды.

Динамические свойства системы дают возможность осуществить реакции восстановления ионов во внутренних объемах мицелл, размер, форма и реакционность которых, в конечном счете, как показано выше, регулируются, благодаря соответствующему изобретению методу.

Работавшие в области нанотехнологии исследовательские группы установили, что водное ядро обратной мицеллярной системы ведет себя как нанореактор, т.е. способно при комнатной температуре превращать металлическую соль в металл в восстановленной ионной форме, теоретически нестабильной, но полностью стабильной в ядре мицелл.

Большую терапевтическую активность, достигаемую при использовании очень малых количеств металла (в зависимости от металла, 1-10 мкг/кг/сутки в теле животного), можно объяснить присутствием, внутри соответствующих изобретению обратных мицелл, металла в свободной металлической форме и специфичностью липидных компонентов мицеллы, обусловленной ее целлюлярной интернализацией. Указанное превращение металлической соли (как правило, сульфата) в частицу восстановленного свободного металла является основным свойством, позволяющим металлу проявлять биологическую активность внутрицеллюлярной ферментной модуляции.

Более того, полученные на животных результаты активности для 4 металлов, ванадия при лечении диабета, марганца в отношении активности, «аналогичной активности 8ΟΌ (8ирег Ох1бе ΟίχιηιιΙαχο - супероксидисмутаза)», стронция при стимулировании роста костей и лечении остеопорозиса, и лития для нейропротекции при лечении, в частности, болезни Хунтингтона, показывают, что любой проявляющий биологическую активность металл может быть включен в соответствующие изобретению мицеллы при получении фармацевтических композиций.

В соответствии с первым вариантом осуществления, фармацевтический препарат содержит описанные выше обратные мицеллы в фармацевтически приемлемом носителе.

В соответствии с одним из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может содержать смесь как минимум двух типов описанных выше мицелл, и каждый тип в нем включает в себя металл, отличный от металла в другом типе.

Такая смесь в определенных случаях оказывает синергическое действие, такое имеет место, например, когда состав содержит смесь цинкового и ванадиевого комплексов. В данном случае, можно наблюдать синергическое действие, используя при лечении диабета лекарственный препарат, содержащий смесь этих обоих типов комплексов (подтверждено \¥О 96/23811).

Следующая цель изобретения относится к использованию описанных выше обратных мицелл для получения фармацевтической композиции, предназначенной для доставки, более конкретно для доставки через слизистую, описанных выше одного или большего числа катионов. Фармацевтическая композиция, в частности, предназначена для профилактики или лечения одного или большего числа симптомов болезни или нарушения здоровья.

Следующая задача изобретения относится к способам доставки одного или большего числа катионов металлов в тело животного, указанных методов, включающих введение в указанное тело животного охарактеризованной выше обратной мицеллярной системы. В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение предлагает методы доставки через слизистую одного или большего числа катионов в тело животного, в частности, указанные методы, включающие введение через слизистую в указанное тело животного охарактеризованной выше обратной мицеллярной системы.

Настоящее изобретение предлагает способы для профилактики, лечения или ослабления одного или большего числа симптомов болезни или нарушения здоровья, указанные способы, содержащие, при необходимости в этом, эффективное количество охарактеризованного выше обратного мицеллярного состава и содержащие один или большее число катионов металлов, пригодных для профилактики, лечения и ослабления одного или большего числа симптомов указанных болезни или нарушения здоровья. В одном из конкретных осуществлений, настоящее изобретение предлагает способы для профилактики, лечения или ослабления одного или большего числа симптомов болезни или нарушения здоровья, указанные, способы включают вводимые через слизистую, содержащие, при необходимости в этом, эффективное количество охарактеризованного выше обратного мицеллярного состава и содержащие один или боль

- 7 012210 шее число катионов металлов, пригодных для профилактики, лечения и ослабления одного или большего числа симптомов указанных болезни или нарушения здоровья.

Что касается фармацевтически допустимого вспомогательного вещества, наполнителя или носителя, то могут быть использованы любые вспомогательные вещества, наполнители или носители, известные специалисту в данной области техники.

Ниже, в качестве примеров, не ограничивающего характера, приводится следующий перечень: лактоза, кукурузный крахмал, глюкоза, сахароза, подсластители типа мальтилового сиропа, гуммиарабик, желатин, каррагенаны, стеариновая кислота, стеарат магния, декстрин, мальтодекстрины, маннитол, тальк, натуральные жиры, в частности богатые ненасыщенными жирными кислотами и стеролами масла растительного происхождения. В особых случаях, при появлении необходимости, могут быть использованы другие хорошо известные специалистам в данной области техники добавки, такие как стабилизаторы, высушивающие вещества, связующие вещества или буферы рН. Предпочтительные соответствующие изобретению вспомогательные вещества способствуют прилипаемости конечного продукта к слизистой оболочке.

Соответствующие изобретению композиции могут быть введены различными путями, предпочтительно через слизистую ткань, в частности пероральным путем с всасыванием в буккальной области или в пищеварительном тракте. Возможен также ректальный путь.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, соответствующие изобретению обратные мицеллярные составы вводят через слизистую в виде капсулы, таблетки в капсуле, аэрозоля, спрея, раствора, суспензии, эмульсии, крахмальной облатки, таблетки, мягкой эластичной желатиновой капсулы, аэрозоля, порошка или гранулы. Соответствующие изобретению композиции можно вводить в жидкой форме в капсулы, которые высвобождают свое содержимое в ротовой полости. Предпочтительно, соответствующие изобретению композиции вводят млекопитающим, более предпочтительно человеку, для лечения или профилактики болезни или нарушения здоровья.

В соответствии с другим важньм вариантом осуществления, изобретение относится также к диетическим продуктам, в частности к диетическим продуктам, используемым в качестве продуктов питания при лечении метаболических дисфункций путем включения выше охарактеризованных обратных мицелл, а также к способу получения этих продуктов.

В самом деле, эти продукты могут быть легко получены путем смешивания, в особенно богатом диглицеридами жирных кислот масле, бета- или гамма-ситостерола или содержащего как минимум одну из указанных двух форм ситостерола растительного экстракта, металлической соли и дистиллированной воды с последующим перемешиванием их при условиях соответствующего изобретению выше изложенного метода.

Как отмечалось выше, содержание олеиновой кислоты С18:1 в растительных маслах значительно варьирует, в зависимости от природы растения и его географического происхождения.

Для получения соответствующих изобретению диетических продуктов, с лучшим эффектом можно использовать растительное масло, в котором доля олеиновых кислот в общем содержании жирных кислот составляет, как минимум 60%.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления, следует использовать оливковое масло, предпочтительно масло первого холодного прессования.

Ситостерол лучше включать в форме растительного экстракта. Можно, в частности, использовать коммерческие растительные экстракты из сои или, предпочтительно, из таллового масла.

Для получения диетического продукта, в частности, используемого как продукт питания с регулирующей глюцидный метаболизм активностью и/или защищающим сердечно-сосудистую систему действием, в качестве металлической соли лучше использовать соль ванадия, в которой валентность ванадия равна 4, в частности ванадил сульфат.

Описание фигур

Фиг. 1 - определение антидиабетической активности содержащих ванадий обратных мицелл на получавших фруктовую диету крысах в сравнении с получавшими лекарственные препараты и контрольными группами крыс: гликемия (ммоль/л) в период (в сутках, Ό) терапии;

фиг. 2 - определение антидиабетической активности содержащих ванадий обратных мицелл на получавших фруктовую диету крысах в сравнении с получавшими лекарственные препараты и контрольными группами крыс: инсулинемия (мкмоль/мл) в Ό0 и Ό21;

фиг. 3 - адриамициновый тест на крысах линии Вистар, получавших содержащие марганец обратные мицеллы, в сравнении с контрольной группой: % начального объема за период терапии;

фиг. 4 - определение стимулирующей рост костей активности у растущих крыс, получавших содержавшие стронций обратные мицеллы в сравнении с контролем и эталонным лекарственным препаратом: диаметр головки бедра (мм);

фиг. 5 - определение стимулирующей рост костей активности у растущих крыс, получавших содержавшие стронций обратные мицеллы в сравнении с контролем и эталонным лекарственным препаратом: содержание стронция в кости (выражено в мкг/г);

фиг. 6 - определение стимулирующей рост костей активности у растущих крыс, получавших содер

- 8 012210 жавшие стронций обратные мицеллы в сравнении с контролем и эталонным лекарственным препаратом: содержание стронция в плазме (выражено в мкг/г);

фиг. 7А - гликемия, определенная у модели δΤΖ-крыс, соответственно в Ό3 и Ό7, в зависимости от отношения во введенных обратных мицеллах, содержащих ванадий.

Следующие примеры служат для пояснения применения настоящего изобретения, не ограничивая его объема.

Примеры

Пример 1. Получение обратных мицелл, содержащих ванадий

К 1,1 г ситостерола, солюбилизированного в 2,2 мл этанола, добавляют 870 мкл дистиллированной воды, содержащей 85 мкг ванадил сульфата (26 мкг металла ванадия) и 40 мл Ресео1® (глицерид моноолеат, имеющийся в продаже у компании Са11сГо55С).

Обработка смеси ультразвуком проводится в течение 4 мин, при выдерживании температуры на уровне менее чем 38°С.

Отношение менее чем 0,07.

Полученный продукт представляет собой гомогенную смесь стабильных обратных мицелл, содержащих ванадий.

Анализ методом рассеяния рентгеновских лучей позволяет считать ее микроэмульсией с обратными мицеллами.

Пример 2. Получение обратных мицелл, содержащих ванадий, для терапии диабетических крыс

К 1,1 г ситостерола, солюбилизированного в 2,2 мл этанола, добавляют 4,14 мл дистиллированной воды, содержащей 85 мкг ванадил сульфата (26 мкг металла ванадия) и 40 мл Ресео1®.

Обработка смеси ультразвуком проводится дважды (каждый раз по 3 минуты), при выдерживании температуры на уровне менее чем 38°С.

Отношение менее чем 0,27.

Пример 3. Получение обратных мицелл, содержащих марганец, для определения активности, аналогичной активности 8ΘΌ в теле животных.

К 1,1 г ситостерола, солюбилизированного в 2,2 мл этанола, добавляют 4,14 мл дистиллированной воды, содержащей 313 мкг сульфата марганца (102 мкг металла марганца) и 40 мл Ресео1®.

Смесь перемешивают магнитной мешалкой, выдерживая температуру 35°С, в течение 15 мин.

Отношение равно 0,27.

Полученный продукт представляет собой гомогенную смесь стабильных обратных мицелл, содержащих марганец.

Пример 4. Получение обратных мицелл, содержащих стронций, для определения стимулирующего действия на рост костей у животных (ΝΡ 05 А)

К 5 г ситостерола, солюбилизированного в 20 мл этанола, добавляют 20 мл дистиллированной воды, содержащей 2570 мг сульфата стронция (1229 мг металла стронция), 48 мл Ресео1® и 160 мл оливкового масла.

Смесь перемешивают магнитной мешалкой, выдерживая температуру 35°С, в течение 15 мин. Отношение равно 0,85.

В последующем ее можно вводить в тело крыс в количестве 2 мл/кг ректальным путем (12, 15 мг металла 8г /24 ч/кг).

Пример 5. Получение обратных мицелл, содержащих стронций, для определения стимулирующего действия на рост костей у животных (№ 05 В)

К 5 г ситостерола, солюбилизированного в 20 мл этанола, добавляют 20 мл дистиллированной воды, содержащей 257 мг сульфата стронция (133 мг металла стронция), 48 мл Ресео1® и 160 мл оливкового масла.

Смесь перемешивают магнитной мешалкой, выдерживая температуру 35 С, в течение 15 мин. Отношение равно 0,85.

В последующем ее можно вводить в тело крыс в количестве 2 мл/кг ректальным путем (1,21 мг металла 8г/24 ч/кг).

Пример 6. Получение обратных мицелл, содержащих стронций, для определения стимулирующего действия на рост костей у животных (№ 05 С)

К 5 г ситостерола, солюбилизированного в 20 мл этанола, добавляют 20 мл дистиллированной воды, содержащей 26 мг сульфата стронция (12,3 мг металла стронция), 48 мл Ресео1® и 160 мл оливкового масла.

- 9 012210

В последующем ее можно вводить в тело крыс в количестве 2 мл/кг ректальным путем (0,12 мг металла 8т/24 ч/кг).

Пример 7. Получение обратных мицелл, содержащих ванадий (ΝΡ 01 А)

К 1,1 г ситостерола, солюбилизированного в 2,2 мл этанола, добавляют 1,5 мл дистиллированной воды, содержащей 71 мкг ванадил сульфата (22 мкг металла ванадия), 40 мл оливкового масла (4% диглицеридов).

Обработку смеси ультразвуком проводят в течение 4 мин, выдерживая температуру на уровне менее чем 38°С.

Отношение V равно 2,33.

Пример 8. Получение обратных мицелл, содержащих ванадий (ΝΡ 01 В)

К 1,1 г ситостерола, солюбилизированного в 2,2 мл этанола, добавляют 5,92 мл дистиллированной воды, содержащей 85 мкг ванадил сульфата (26 мкг металла ванадия), 40 мл Ресео1®.

Отношение V равно 0,38.

Пример 9. Получение обратных мицелл, содержащих ванадий (ΝΡ 01 С)

К 1,1 г ситостерола, солюбилизированного в 2,2 мл этанола, добавляют 414 мкл дистиллированной воды, содержащей 85 мкг ванадил сульфата (26 мкг металла ванадия), 40 мл Ресео1®.

Отношение V равно 0,04.

Пример 10. Получение обратных мицелл, содержащих литий, для защиты мозга при болезни Хунтингтона (ΝΡ 03)

К 3,6 г ситостерола, солюбилизированного в 5,4 мл этанола, добавляют 4 мл дистиллированной воды, содержащей 9,43 мг сульфата лития (600 мкг металла лития) и 110 мл Ресео1®).

Отношение V равно 0,1.

В последующем ее можно вводить в тело крыс в количестве 2 мл/кг ректальным путем (10 мкг металла Ы/24 ч/кг).

Фармакологические испытания

- Антидиабетическая активность на получавших фруктозную диету крысах

Модель на получавших фруктозную диету крысах является инсулиннезависимым диабетом (ΝΙΌΌ), аналогичным симптомному человеческому диабету 2 типа.

В данном исследовании, продукт ΝΡ 01 включает в себя содержащие ванадий мицеллы, полученные в соответствии с примером 2. Их терапевтическую активность сравнивали с таковой у эталонных лекарственных препаратов: метформина и розиглитазона.

Протокол

В Ό21, после периода стабилизации веса, крыс взвешивали и отбирали образцы крови для определения исходных значений биохимических параметров.

Крыс распределяли в случайном порядке на группы по 10 животных. Питьевую воду затем заменяли 10%-ным раствором фруктозы в дистиллированной воде. Этот раствор крысы получали без ограничений в течение 21 дня. В последующие 21 день терапиии они снова получали обычную воду.

В Ό0 животных взвешивали и отбирали образцы крови.

Затем начиналась терапия продолжительностью 21 день, при ежедневном введении:

контрольная группа: 1 мл/кг обычной воды перорально

ΝΡ 01-группа: 2 мл/кг ректальным путем метформингруппа: 50 мг/кг метформина перорально розиглитазонгруппа: 5 мг/кг розиглитазона перорально В Ό3, отбор образцов крови.

В Ό7, отбор образцов крови.

В Ό21, отбор образцов крови и завершение терапии.

Результаты (выражены в ммоль/л для гликемии и мкмоль/мл для инсулинемии - 8Ό обозначает стандартное отклонение) - фиг. 1 и 2, соответственно.

Гликемия	Ώ0	30 ОО	эз	80 ϋ3	ϋ7	80 07	ϋ21	8ϋ 021
Недиабетический контроль	6,39	0,15	6,39	0,15	6,39	0,15	6,39	0.15
Диабетический контроль	10,65	0,15	12,18	0,36	11,76	0,31	11,22	0,4
ΝΡ 01	10,95	0,34	10,95	0,56	10,99	0,33	7,63	0,39
Метформин	10,64	0,17	10,63	0,22	9,68	0,15	8,91	0,16
Розиглитазон	10,38	0,4	10,47	0,38	9,37	0,26	9,13	0,17

- 10 012210

Инсулинемии	Ώ0	8Э	Б21	80
Недиабетическ ий контроль	13,1	0,7	13,1	0,7
Диабетический контроль	53,5	0,7	53,1	1,2
ΝΡ01	53,6	0,8	25,4	1,6
Метформин	53,4	0,5	44,5	1
Розиглитазон	53,7	0,8	46	0,8

В Ό21 все вещества активны. Тем не менее, наиболее сильное действие отмечено в варианте ΝΡ 01 (соответственно изобретению, пример 2), в частности для инсулинемии, которая является маркёром устойчивости на инсулин в начале неблагоприятного прогноза болезни.

- «8ΘΌ - подобная» активность на крысах: тест с адриамицином

Тест с адриамицином является специфичным тестом на обнаружение активности вещества по отношению к свободным антирадикалам. Продукт включает в себя содержащие марганец обратные мицеллы, полученные в соответствии с примером 3.

Протокол

Через 1 ч после инъекции 0,2 мл раствора адриамицина в ногу мужской особи крысы линии Вистар, на период продолжительностью примерно 12 ч появлялось временное воспаление. Вторая воспалительная фаза начинается на 3-й день и продолжается в течение 5 дней. Проявляющаяся в результате этого сосудистая гиперпроницаемость и отек, с повреждением клеток эндотелиальных мембран, вызваны высвобождением свободных радикалов. Антивоспалительные стероиды и нестероиды во время этой второй фазы не проявляют никакой активности. Отек измеряется методом плетисмографии (выражен в % начального объема).

Сформированы 3 группы крыс по 10 особей:

отрицательная контрольная группа: введение оливкового масла (2 мл/кг) ректальным путем положительная контрольная группа: введение 100 мг/кг диосмина группа с терапией ΝΡ 02 (получен в соответствии с примером 3): 2 мл/кг ректальным путем

Результаты (8Э обозначает стандартное отклонение) - фиг. 3

	01	Ό2	оз	04	Ω5	Ώ6	ϋ7	08
Отрицательная контрольная группа	109,3	132,3	192,8	202,1	202,1	191,6	182,3	166.2
8Ό	9,64	ю,1з	16,49	17,08	24,08	16,33	12,53	12,24
Поло жительная контрольная группа	106,7	120,8	152,2	163	177,6	177,5	168,2	163,5
80	8,25	14,96	16,61	28,71	14,58	15,38	13,46	10,58
ΝΡ02	102,3	115,2	154	171,2	163,6	170,3	161,5	155,5
δϋ	8,03	14,22	13,15	17,47	29,81	20,73	20,28	14,22

Эталонный продукт диосмин проявляет активность в отношении свободных антирадикалов, аналогичную активности марганец-супероксидисмутазы, (ΜηδΟΏ); эти продукты являются единственными, которые проявляют активность в данном тесте. Продукт ΝΡ 02 получен в соответствии с примером 3 настоящего изобретения, проявляет аналогичную активность в отношении свободных антирадикалов (даже несколько более значительную по сравнению с эталонным продуктом).

- Стимулирование роста костей на растущих крысах

Целью данного исследования является оценка стимулирующей активности в отношении роста костей на растущих крысах.

Продукт включает в себя содержащие стронций обратные мицеллы, полученные в соответствии с примером 4.

Протокол

Животными являются мужские особи крыс линии Вистар весом 200 г (в среднем).

Гомогенные группы по 10 крыс сформированы с учетом их веса.

Продукт вводили один раз в сутки в течение 6 недель.

Изучавшиеся группы и продукты:

контрольная группа (введение оливкового масла ректальным путем);

8гС1₂ - группа (8гС1₂ и ранелат стронция известны в качестве активных ингредиентов для роста костей и при лечении остеопороза). Введение ректальным путем 68,2 мг металла 8г/кг/сутки;

ΝΡ 05 А - группа: продукт получен в соответствии с примером 4 настоящего изобретения, введение 12,5 мг металла 8г/кг/сутки;

ΝΡ 05 В - группа: продукт получен в соответствии с примером 5 настоящего изобретения, введение 1,21 мг металла 8г/кг/сутки;

ΝΡ 05 С - группа: продукт получен в соответствии с примером 6 настоящего изобретения, введение

- 11 012210

0,12 мг металла Бг/кг/сутки.

Определяемые в конце терапии параметры:

вес животных, определение у крыс после автаназии диаметра головки бедра и взятие образцов (раздвижной калибр под увеличительным стеклом бинокуляра), содержание стронция в кости (методом атомной абсорбции), содержание стронция в плазме (методом атомной абсорбции).

Результаты

Диаметр головки бедра (выражено в мм) - фиг. 4.

БЭ обозначает стандартное отклонение

ММ	Контроль	5гС1₂	ΝΡ 05 А	ΝΡ 05 В	ΝΡ05 С
Диаметр головки бедра	3,86	3,93	4,12	4	4,08
50	0,14	0,12	0,28	0,17	0,14

По сравнению с эталонным продуктом, ΝΡ 05 продукты проявляют более высокую стимулирующую рост костей активность. При меньшем в 600 раз содержании металла стронция ΝΡ 05 С продукт проявляет более высокую активность по сравнению с эталонным продуктом.

Содержание стронция в кости (выражено в мкг/г) - фиг. 5

БЭ обозначает стандартное отклонение

мкг/г	Контроль	БгС1₂	ΝΡ05 А	ΝΡ05Β	ΝΡ 05 С
Бг в кости	77,85	1508,83	261,44	172,19	77,03
8Ώ	16,85	670,43	109,58	18,48	7,3

Отрицательное действие стронция при лечении остеопороза (Ресео1®) связано со значительным фиксированием стронция в кости при использовании в терапевтических количествах (2 г в сутки для человека и 68,2 мг/кг для животных). ΝΡ 05 продукт, в частности с наименьшим содержанием стронция (ΝΡ 05 С), не вызывает никакого накопления стронция в кости.

Содержание стронция в плазме (выражено в мкг/г) - фиг. 6

БЭ обозначает стандартное отклонение

мкг/г	мкг/г	Контроль	8гС1₂	ΝΡ05 А	ΝΡ 05 В	ΝΡ 05 С
Содержание Бг в плазме	Среднее	150	3160	371	101	92
	5ϋ	41,15	599,43	165,63	37,08	43,33

Содержание стронция в плазме крыс при терапии продуктом ΝΡ 05 С, полученным в соответствии с примером 6 настоящего изобретения, близко к содержанию его в плазме крыс контрольной группы, не подвергавшейся терапии.

- Нейрозащитное действие лития: модель болезни Хунтингтона на крысах.

В некоторых публикациях сообщается, что литий защищает культивируемые нейроны центральной нервной системы (С'АБ-нейроны) от глутамата, взаимодействующего с ΝΜΌΆ-рецепторами. Ιη νίνο, на модели болезни Хунтингтона с использованием крыс было определено нейрозащитное действие лития от стриальной дегенерации. Эта фармакологическая активность достигнута при тех же самых клинических дозах, что и при лечении биполярного расстройства: 500-1000 мг карбоната лития в сутки (урикемия: 0,50,8 мэкв/л) у человека и 2-10 мг в сутки у мышей или крыс.

Литий имеет высокую токсичность, и по причине отрицательных эффектов необходимо определять урикемию ежедневно.

Ректальным путем 6 крыс получают ежедневно 2 мл/кг (продукт соответственно примеру 10: 10 мкг Ь1) за 24 ч до и в течение 7 суток после одностороннего введения хинолиновой кислоты в стриатум.

Стриатум собирают и после замораживания с использованием криостата Ьес1а СМ 1850 изготовляют из него срезы. Срезы обрабатывают этанолом, очищают в ксилене и затем накрывают покровным стеклом, используя ΌΡΧ среду для заключения гистологических препаратов, и оставляют для высыхания.

Срезы, содержащие ΝΜ нейроны, анализируют по стереологической программе, чтобы сопоставить число нейронов на пораженной и на здоровой стороне.

Через 7 суток после инъекции хинолиновой кислоты (ОД) отмечали, что ΝΡ 03 в значительной степени защищает ΝΜ нейроны от гибели в результате инъекции. По данным предшествующего сообщения, гибель клеток у подвергшихся солевой терапии организмов составляла 20/30%. В данном случае, при введении ΝΡ 03 доля погибших клеток составляла всего лишь 9,2%.

Результат примерно такой же, как и при введении хлорида лития ΙΡ путем, но при дозе всего лишь 10 мкг/сутки вместо 10 мг металла лития в сутки.

Оптимизация фармакологической активности изменением размера мицелл

На модели БТ2 крыс было проведено фармацевтическое исследование по сравнению 5 полученных в соответствии с изобретением продуктов, единственньм отличающим друг от друга параметром которых является количество включенной в смесь воды (содержание солюбилизированного ванадил сульфата в них одинаковое). Из этого следует, что единственным различием между этими 5 продуктами является

- 12 012210 размер обратных мицелл.

Модель 8ΤΖ крыс является смешанной моделью для диабетов 1 типа и 2 типа. Эта модель позволяет получить быструю реакцию на антидиабетическую активность веществ.

Протокол

Стрептозотоцин (8ΤΖ) введен в организм мужских особей крыс линии Вистар весом от 250 до 300 г, IV путем в количестве 50 мг/кг. Через 3 дня после введения 8ΤΖ гликемия животных составляла от 20 до 30 ммоль/л и оставалась стабильной в течение 7 дней. Гликемию измеряли в Ό0, Ό1, Ό3 и Ό7.

В каждую группу входило по 6 крыс. контрольная группа: оливковое масло в эмульсии с водой ректальным путем группа А: введено ректальным путем [2 мл/кг (XV = 2,30)]: пример 7 группа В: введено ректальным путем [2 мл/кг (V = 0,38)]: пример 8 группа С: введено ректальным путем [2 мл/кг (V = 0,04)]: пример 9 группа Ό: введено ректальным путем [2 мл/кг (V = 0,90)] группа Е: введено ректальным путем [2 мл/кг (V = 0,125)]

Результаты

Гликемия (моль/л)	XV	Ό0	03	Э7
Контрольная группа		21,02 80 = 2,66	21,93 80 = 3,36	20,23 80 = 2,19
Группа А	2,30	27,56 8ϋ = 0,96	24 8ϋ= 1,27	19,8 80 = 2,09
Группа ϋ	0,90	21,1 8ϋ= 1,10	14 8ϋ= 1,32	12,20 80 = 1,64
Группа В	0,38	21,54 80 = 0,90	16,31 80 = 0,78	13,44 80 = 0,81
Группа Е	0,125	17,6 8ϋ = 1.18	11,80 80= 1,22	8 80= 1,45
Группа С	0,04	22,13 80= 1,84	20,55 80 = 1,70	14,70 80 = 2,26

Фиг. 7А и 7В показывают гликемию, измеренную, соответственно, в Ό0 и Ό7.

Выводы

Наибольшая антидиабетическая активность достигается при V отношении от 0,12 до 1.

Более крупные мицеллы содержат свободную воду, в которой металл уже не находится в восстановленной металлической форме и остается в сульфатной форме, которая обеспечивает более слабую активность.

Изменяя размер мицелл (отношение V), можно оптимизировать активность полученного в соответствии с изобретением продукта.

Оптимизация количества включенной воды

Протокол

Образцы, содержавшие пецеол, ситостерол и этанол в указанных в выше рассмотренных примерах относительных количествах, были получены с использованием разного количества воды, содержавшей солюбилизированные металлические ионы. Шкала разбавления была составлена с шагом увеличения содержания воды 0,3%.

Образцы были гомогенизированы путем перемешивания при 35°С, как изложено выше.

Влияние количества воды на стабильность обратной мицеллярной системы было определено визуально (мутность) и методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.

Результат

При увеличении содержания воды в системе, начиная с 6,9% (т.е., отношение V равно примерно 0,175), микроэмульсия становится все более мутной и в системах, где содержание воды увеличивается, появляются две фазы. Процентное содержание воды выражено отношением вес всей воды: общий вес системы.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения обратных мицелл с водным ядром меньше или равным 100 нм, включающий:

(a) контактирование (ί) стерола, (и) ацилглицерола, предпочтительно диацилглицерола жирных кислот, (ίίί) воды (в частности, дистиллированной воды) и (ίν) водорастворимого катиона металла, (b) перемешивание полученной на этапе (а) смеси при температуре 40°С или менее и в течение времени, достаточного для образования обратных мицелл при осуществлении указанного перемешивания механически при скорости от примерно 1000 до примерно 5000 об./мин или путем обработки ультразвуком.
2. Способ по п.1, в котором отношение V = (вода)/(ацилглицерол) меньше или равно примерно 2,5, более предпочтительно меньше или равно 1 и наиболее предпочтительно от 0,01 до 0,2.

- 13 012210
3. Способ по п.1 или 2, в котором стерол является бета-ситостеролом.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором диацилглицерол жирных кислот выбирают из 1-2 диолеина и 1-олеоил-2-ацетилглицерола.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором металл является металлом, имеющим водорастворимую соль.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором металл является металлом, проявляющим биокаталитическую активность.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором отношение составляет от 0,05 до 0,18.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором перемешивание смеси проводят при температурах от примерно 30 до примерно 35 °С.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором катион металла представлен катионом с валентностью, как минимум, 2.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором катион металла выбирают из группы металлов, которую входят цинк, ниобий, ванадий, селен, молибден, хром, сурьма, олово, золото, рутений, палладий, платина, литий и стронций.
11. Обратные мицеллы, получаемые способом по любому из предшествующих пунктов.
12. Фармацевтическая композиция, включающая в себя мицеллы по п.11 в фармацевтически допустимом носителе.