PT1737734E

PT1737734E - Implantes revestidos, seu fabrico e utilização

Info

Publication number: PT1737734E
Application number: PT05715889T
Authority: PT
Inventors: Klaus Hellerbrand; Michael Siedler; Andreas Schuetz; Bernd Schimkat; Karin Wiedenmann-Schlembach
Original assignee: Scil Technology Gmbh
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2010-11-11
Also published as: US20070202144A1; EP1737734B1; CA2558395C; DE602005022998D1; JP2007527758A; DK1737734T3; PL1737734T3; CN1938194A; US8372419B2; WO2005089829A2; EP1737734A2; WO2005089829A3; CA2558395A1; ATE478008T1; CN1938194B; ES2350939T3; JP4944010B2

Description

ΕΡ1737734Β1

DESCRIÇÃO

IMPLANTES REVESTIDOS, SEU FABRICO E UTILIZAÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para o revestimento de um dispositivo, de preferência implantes, com uma substância que compreende os passos de, (a) proporcionar um recipiente com um espaço para receber o referido dispositivo a ser revestido, (b) proporcionar no referido espaço uma solução da referida substância de revestimento, (c) inserir o referido dispositivo na referida solução da referida substância no referido recipiente, em que a ordem dos passos (b) e (c) pode ser invertida, e (d) iniciar a secagem isotérmica do referido dispositivo enquanto o mesmo está localizado no referido recipiente em contacto com a referida solução, removendo assim os componentes voláteis da referida solução da referida substância. A presente invenção também se refere a um recipiente de embalagem para um dispositivo, em que o referido recipiente compreende um receptáculo que está localizado coaxialmente no invólucro do recipiente, em que o referido receptáculo para receber o referido dispositivo a ser revestido é adaptado de tal modo que o referido dispositivo pode ser revestido directamente no referido recipiente com uma substância, em que a superfície interna do referido receptáculo é revestida com uma camada de material inerte e repelente. Adicionalmente, a presente invenção utiliza o processo bem conhecido de revestir as superfícies internas de um recipiente de embalagem para um dispositivo, de preferência implantes, para se obter a deposição dirigida da substância no implante, compreendendo os passos de, (a) siliconizar as referidas superfícies internas do referido recipiente utilizando uma emulsão de silicone e (b) curar pelo calor para formar uma camada de 1 ΕΡ1737734Β1 silicone cozida nas referidas superfícies internas do referido recipiente. A presente invenção também se refere à utilização do referido processo de revestimento de dispositivos para melhorar a distribuição homogénea do revestimento no dispositivo.

Além disso, a presente invenção refere-se a um "kit" que compreende um recipiente de revestimento e embalagem e um dispositivo revestido obtido pelo processo da presente invenção.

Nas últimas décadas foram descritos muitos processos para melhorar a qualidade de implantes, referentes à sua biocompatibilidade e interacção com o tecido envolvente. Os requisitos para os implantes são extremos (e.g. para implantes de osso, porque estes dispositivos têm que estar fixos de forma rígida ao osso e ser estáveis, e.g. a pressão elevada (dentes, articulações). Outra aplicação de implantes revestidos é em "stents" de eluição de fármacos, para ultrapassar a restenose de artérias coronárias ou outras artérias. A resposta inicial do tecido após implantação depende da presença de factores de crescimento específicos libertados a partir dos tecidos envolventes que estimulam o crescimento e diferenciação celular, para melhorar a incorporação e modulação do crescimento celular.

Embora existam processos de fixação bem estabelecidos para implantes dentários, ainda há uma tendência para estes ficarem soltos com o tempo. Foi descrita uma variedade de abordagens para melhorar a incorporação do respectivo implante (integração óssea). Estas abordagens incluem o revestimento de implantes de diferentes fontes (e.g. cerâmica, metal ou outras, ver EP-Bl-0 657 146) com materiais 2 ΕΡ1737734Β1 biodegradáveis (e.g. fosfato tricálcico, hidroxilapatite, apatite carbonada, hidroxilapatite deficiente em cálcio) e vários processos para pré-tratar a superfície do dispositivo (e.g. entalhe de superfícies metálicas; ver EP-A-0 389 713, WO 95/13101, EP-A-1 251 889). É assumido que irregularidades na superfície na gama do nanómetro e micrómetro melhoram o crescimento de colagénio e células (T. Albrektsson in: Handbook of Biomaterials (Black, J e Hastings, G (eds.), Chapman & Hall, Londres, 1998, pp 500 - 512). O revestimento de implantes de metal com superfícies cerâmicas é descrito, e.g., como a mistura de dois pós, um pó metálico e um pó contendo fosfato de cálcio (EP-A-0 467 948) processado no material de implante durante um processo e sinterização. O documento US 2003/0204239 refere-se a um "stent" endovascular revestido com um revestimento conservante que compreende um agente bioactivo seleccionado de entre proteínas, análogo de proteínas, sacarídeos e seus derivados, uma matriz polimérica e um conservante, incluindo pelo menos um antioxidante. O revestimento pode ser aplicado ao "stent" por imersão, pulverização, pintura, ou qualquer outro processo adequado. Em seguida, o "stent" é seco por corrente de azoto ou outro meio adequado. A patente WO 03/043673 refere-se a um dispositivo com propriedades osteoindutoras e osteocondutoras, bem como a um processo para o preparar.

Uma variedade de outros processos de sinterização está descrita para o fabrico de materiais cerâmicos compósitos (DE-A-29 28 007, US-A- 4 882 196, EP 1251889) . É focado 3 ΕΡ1737734Β1 essencialmente o revestimento de superfícies metálicas com fosfatos de cálcio, como fosfato tricálcico ou hidroxiapatite (Y. Tsui et al. (1998), Plasma sprayed hydroxyapatite coatings on titanium substrates, Biomaterials, 19: 2031-43, 19: 2015-29), que permite uma incorporação melhorada dos implantes (US-A-6 312 472; US-A-2002/0038149). Os fosfatos de cálcio acima descritos e uma variedade de outros materiais biocompatíveis inorgânicos têm a característica de formar poros. Diz-se que estes poros melhoram a incorporação do implante no osso nativo (WO 00/72776; US-A-4 051 598; EP-A-0 806 211, Jennissen, H. et al. (2001), Biomaterialien, 2: 45-53) à medida que o osso nativo cresce para dentro dos poros, ao mesmo tempo que biodegrade a camada de fosfato de cálcio inorgânico do implante (WO 96/10370; WO 01/97679). Além dos implantes de material compósito descrevem-se implantes que consistem de camadas, em que a camada inferior do implante, muitas vezes compreendendo metais ou ligas como titânio ou liga de titânio (WO 98/43550; WO 00/72777) é revestido com uma camada dos fosfatos de cálcio (EP-A-0 478 532) . Tipicamente, o revestimento com fosfato de cálcio é conseguido por tratamento hidrotérmico (EP-A-0 548 365) ou por imersão e precipitação (US-A-6 129 928; WO 97/41273) ou pulverização de plasma (US-A-5 697 997; US-A-6 113 993; EP-A-0 548 365, EP-A-0 739 191; Lichtinger, T.K. et al. (2001), Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32: 937-941). A camada de fosfato de cálcio no corpo principal do implante pode ser parte, quer de uma mistura de materiais numa camada (WO 98/48862; US-A-5 934 287; US-A-2002/0033548), ou uma formação em multicamadas (WO 02/09788; US-A-6 322 728) . 4 ΕΡ1737734Β1

Além das modificações da superfície, descrevem-se vários processos em que as proteínas ou misturas de proteínas (essencialmente factores de crescimentos) são utilizadas para revestir implantes ortopédicos ou dentários. Diz-se que estas proteínas aceleram siqnificativamente a incorporação de implantes (Lichtinqer, T.K. et al. (2001), Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32: 937-941; Shah, A. et al. (1999), Biology of the cell 91: 131-142). São descritos vários processos para o revestimento directo superfícies metálicas com proteínas. No entanto, estes processos têm várias desvantagens, em especial a libertação rápida de proteínas da superfície metálica, que não permite manter a proteína durante o intervalo de tempo necessário para a indução da formação de osso (Lichtinger, T.K. et al. (2001), Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32: 937-941).

Para evitar a libertação rápida inicial (pulso espontâneo) da proteína, Endo (Endo K. et al. (1995), Dental Materials Journal 14: 185-198) e Voggenreiter (Voggenreiter G et al. (2001), Materialwiss. Werkstofftech. 32: 942-948) descrevem a imobilização das proteínas por ligação covalente à superfície metálica. A actividade das proteínas respectivas é mantida. No entanto, a ligação covalente pode induzir alterações estruturais que têm impacto na actividade e imunogenicidade das proteínas.

Muitos investigadores afirmaram que a implantação bem sucedida dos factores osteogénicos para a formação de osso endocondral requer que as proteínas estejam associadas a um material transportador ou matriz adequado que mantém as proteínas no local da aplicação (US-A-5 344 654). Para ultrapassar estas dificuldades, o documento US-A-5 258 029 ensina que a proteína osteogénica da invenção será 5 ΕΡ1737734Β1 normalmente formulada em quantidades osteogenicamente eficazes com transportadores sólidos ou fluidos farmaceuticamente aceitáveis. De preferência, as formulações incluem uma matriz que é capaz de proporcionar uma estrutura para desenvolver osso e cartilagem. As matrizes potenciais podem ser biodegradáveis ou não biodegradáveis e podem ser química ou biologicamente definidas. A suspensão da proteína TGF-β e transportador é seca e subsequentemente aplicada à prótese que transporta a carga. As desvantagens destes processos são a utilização de colagénios derivados de animais ou componentes inorgânicos que podem ser erodidos durante a implantação.

Outro processo para ultrapassar a rápida erosão da proteína é descrito em Lichtinger et al. (2001), loc. cit. que tratam a superfície de liga de titânio com ácido cromossulfúrico de modo a se obterem superfícies bioadesivas ultra-hidrófilas. No entanto, o ácido cromossulfúrico deve ser evitado durante o fabrico de produtos medicinais ou dispositivos médicos uma vez que quantidades residuais deste ácido que permaneçam na superfície podem causar oxidação da proteína com alterações estruturais e funcionais subsequentes e também podem causar dano no paciente (Material safety data sheet Cr (VI)).

Outros processos estão descritos na patente WO 00/72777 e WO 00/72778 que utilizam um depósito que é formado por um arranjo de poros de uma cama de óxido espessa na superfície de titânio ou por espaços internos, canais ou recessos. No entanto, é bem conhecido que as proteínas tendem a ficar oxidadas na presença de metais e iões metálicos (Li et al. (1997), em especial elementos de transição com actividade catalítica em contacto com oxigénio, na ausência de quaisquer 6 ΕΡ1737734Β1 substâncias protectoras, Ann. Occup. Hyg. 41, suppl. 1, 379 -383) . Deste modo, um revés dos dispositivos acima referidos poderá ser que as proteínas são oxidadas nas superfícies dos implantes. A oxidação poderá resultar em alterações estruturais que podem resultar na formação de reacções imunogénicas e perda de actividade. A patente WO 02/39946 descreve um sistema de embalagem e fornecimento para partículas de enxerto de osso. A patente US 5335769 refere-se a um recipiente de vidro revestido internamente com silicone e que tem um produto sólido liofilizado in situ e um processo para o fabrico do mesmo. O documento WO 00/21745 refere-se a um material de embalagem estéril, selável e o documento EP 1 072 31 descreve um processo para o revestimento de superfícies internas de dispositivos de embalagem primários, tais como uma seringa.

Outra desvantagem dos dispositivos revestidos conhecidos até agora é que não são revestidos de forma homogénea com uma substância bioactiva, o que torna estes dispositivos apenas insuficientemente adequados para, e.g. implantação. Há vários motivos porque estes dispositivos podem ter estas desvantagens. Por exemplo, se a substância de revestimento é uma proteína, esta é degradada ou oxidada durante o processo de revestimento e/ou precipita em agregados insolúveis, ou está presente em quantidades insuficientes. Deste modo, o revestimento não exerce o efeito biológico desejado, e.g. indução de crescimento ósseo ou atracção de potenciais células formadoras de osso. Além disso, as soluções de revestimento da arte anterior também contêm muitas vezes ingredientes tóxicos, e.g. solventes orgânicos, que são utilizados para solubilizar a substância, que deverá ser 7 ΕΡ1737734Β1 utilizada para revestir um implante. No entanto, as substâncias tóxicas não são, obviamente, desejáveis em implantes médicos (EMEA, ICH Topic Q 3 C, Impurities: Residual Solvents). Até agora, os dispositivos, e.g. implantes metálicos, são essencialmente revestidos manualmente com uma solução de revestimento que é um processo laborioso e provavelmente não aplicável sob condições de GMP. No entanto, a procura de dispositivos revestidos para utilização como implantes em vários campos de aplicação médica tem crescido drasticamente. Deste modo, há também uma necessidade de um revestimento rentável de dispositivos assépticos, em particular no que se refere à possibilidade de produção de quantidades em grande escala com uma qualidade GMP .

Consequentemente, o problema técnico subjacente à presente invenção consiste em proporcionar um processo melhorado para o revestimento de um dispositivo, de preferência um implante, com uma substância e proporcionar um recipiente para ser utilizado no referido processo. 0 objectivo é assegurar um processo rentável, para depositar a substância de forma quantitativa e homogénea no dispositivo. Isto inclui a realização comercial, em especial no processamento asséptico farmaceuticamente aceitável e do estado da técnica. Este problema é resolvido com as caracteristicas das reivindicações.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para revestir um dispositivo com uma substância, compreendendo os passos de: (a) proporcionar um recipiente com um espaço para receber o referido dispositivo a ser revestido; (b) proporcionar no referido espaço uma solução da referida substância de revestimento; (c) inserir o 8 ΕΡ1737734Β1 referido dispositivo na referida solução da referida substância no referido recipiente, em que a ordem dos passos (b) e (c) pode ser invertida; e (d) iniciar a secagem isotérmica do referido dispositivo enquanto o mesmo está localizado no referido recipiente em contacto com a referida solução, removendo desse modo componentes voláteis da referida solução da referida substância. De acordo com a invenção, o recipiente preenche ambas as propriedades como recipiente de revestimento e recipiente de embalagem primário, para o dispositivo revestido. A remoção de componentes voláteis influencia, em particular desvia, e.g. o valor de pH da solução, para controlar a solubilidade da substância para um valor pretendido.

Quando utilizado no contexto da presente invenção, os termos "substância" e "substrato" são utilizados de forma interpermutável.

De preferência a substância farmaceuticamente activa tal como uma proteína ou péptido, um polissacárido (Schnaar et al., 1978, Adhesion of hepatocytes to polyacrylamide gels derivitized with N-acetylglucosamine, J. Biol. Chem. 253, 7940-7951), um glicolípido (Blackbourn e Schnaar, (1983) J. Biol. Chem., 258(2), 1180-1188) ou um péptido ou uma molécula pequena. Os termos "proteína" ou "péptido" são utilizados de forma interpermutável no contexto da presente invenção.

Um exemplo de uma proteína é uma proteína osteoindutora dissolvida, de preferência um membro da superfamília de TGF-β. No âmbito da referida substância farmaceuticamente activa, incluem-se combinações de uma ou mais proteínas, péptidos ou 9 ΕΡ1737734Β1 pequenas moléculas, como descrito infra. Também se contemplam combinações de proteínas, péptidos ou moléculas pequenas.

Verificou-se que a família de TGF-β de factores de crescimento e diferenciação está envolvida em vários processos biolóqicos que compreendem a formação de osso. Todos os membros da referida família são péptidos segregados que compreendem uma estrutura de domínio característica. No terminal-N, os membros da família de TGF-β compreendem um péptido de sinal ou líder de secreção. Esta sequência é seguida, no terminal-C, pelo prodomínio e pela sequência do péptido maduro. A sequência do péptido maduro compreende sete cisteínas conservadas, seis das quais são necessárias para a formação de pontes dissulfureto intramoleculares, enquanto que uma delas é necessária para a dimerização de dois péptidos. 0 membro da família de TGF-β biologicamente activo é um dímero, de preferência composto por dois péptidos maduros. Os membros da família de TGF-β são normalmente segregados como pró-proteínas compreendendo adicionalmente à sequência madura, o prodomínio. Os prodomínios são clivados extracelularmente e não fazem parte da molécula de sinalização. Foi referido, no entanto que o prodomínio poderá ser necessário para estabilização extracelular dos péptidos maduros. No contexto da presente invenção, o termo "membro da família de TGF-β" ou proteínas da referida família mencionadas a seguir, incluem todas as variantes biologicamente activas das referidas proteínas ou membros e todas as variantes, bem como os seus precursores inactivos. Deste modo, as proteínas que compreende apenas a sequência madura, bem como as proteínas que compreendem a proteína madura e o prodomínio ou a proteína madura, o prodomínio e a sequência líder, estão no âmbito da invenção, bem como os seus fragmentos biologicamente activos. Se um fragmento de um 10 ΕΡ1737734Β1 membro de TGF-β tem a actividade biológica isso pode ser facilmente determinado por ensaios biológicos descritos, e.g. em: Katagiri et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299 ou Nishitoh et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 21345-21352.

De preferência, a actividade biológica de acordo com a invenção pode ser determinada por modelos in vivo, como descrito na patente WO 03/043673. Além disso, incluem-se na presente invenção variantes dos membros de TGF-β que têm uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica às sequências de aminoácido dos membros da familia de TGF-β.

Uma revisão dos membros da superfamilia de TGF-β é dada em: Wozney JM, Rosen V (1998) Clin Orthop 346: 26-37. As sequências de aminoácido dos membros da família de TGF-β podem ser obtidas de bases de dados bem conhecidas, tais como Swiss-Prot, através da Internet (http: / ,/www. expasy. cb/ sprot /sprot -t op. html) .

Mais preferivelmente, o referido membro da família de TGF-β é um membro da subfamília de BMP. Verificou-se que os membros da subfamília da proteína morfogénica de osso (BMP) estão envolvidos, inter alia, na indução e remodelação do tecido ósseo. As BMPs foram originalmente isoladas a partir da matriz óssea. Estas proteínas caracterizam-se pela sua capacidade de induzir a formação de osso novo em locais ectópicos. vários estudos in vivo demonstraram a promoção de osteogénese e condrogénese de células precursoras pelas BMPs e colocam a possibilidade de cada molécula de BMP ter um papel distinto durante o desenvolvimento do esqueleto. Mais 11 ΕΡ1737734Β1 detalhes acerca das propriedades moleculares e biológicas das BMPs estão descritos em : Wozney JM, Rosen V (1998) loc. cit.,, Schmitt et al. (1999), J Orthop Res 17: 269-278 e Lind (1996), Acta Orthop Scand 67: 407-17. Os membros da familia de morfógenos de proteínas incluem a proteína-1 osteogénica de mamífero (OP-1, também conhecida como BMP-7, e o homólogo de Drosophila 60A), proteína-2 osteogénica (OP-2, também conhecida como BMP-8), proteína-3 osteogénica (OP-3), BMP-2 (também conhecida como BMP-2A ou CBMP-2A, e o homólogo de Drosophila DPP), BMP-3, BMP-4 (também conhecido como BMP-2B ou CBMP-2B), BMP-5, BMP-6 e o seu homólogo de murino Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF-3 (também conhecido como Vgr2), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (também conhecido como CDMP-1 ou MP52), GDF-6 (também conhecido como CDMP-2), GDF-7 (também conhecido como CDMP-3), o homólogo de Xenopus Vgl e NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, e NEURAL. Os membros desta família codificam para cadeias de péptido segregadas que partilham características estruturais comuns, incluindo o processamento a partir de uma "pró-forma" precursora para se obter uma cadeia de péptido maduro competente para dimerização e que contém um domínio activo de terminal carboxilo de aproximadamente 97-106 aminoácidos. Todos os membros partilham um padrão conservado de cisternas neste domínio e a forma activa destas proteínas pode ser, ou um homodimero ligado a dissulfureto de um único membro da família, ou um heterodímero de dois membros diferentes (ver, e.g. Massague (1990), Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 13198). Ver também, patente U.S. No. 5011691; patente U.S. No. 5266683, Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085-2093, Wharton et al. (1991), PNAS 88:9214-9218), (Ozkaynak (1992), J. Biol. Chem. 267: 25220-25227 e patente U.S. No. 5,266,683); (Celeste et al. (1991), PNAS 87:9843-9847); 12 ΕΡ1737734Β1 (Lyons et al. (1989), PNAS 86:4554-4558). Estas revelações descrevem as sequências de aminoácido e ADN, bem como as características químicas e físicas destas proteínas osteogénicas. Ver também, Wozney et al. (1988), Science 242:1528-1534; BMP 9 (WO93/00432,); DPP (Padgett et al. (1987), Nature 325:81-84; e Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861-867) .

De preferência, o referido membro da família BMP é BMP-1, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-14 OU BMP-16.

Mais preferencialmente, o referido membro da família de BMP é BMP-2 ou BMP-7. A sequência de aminoácidos para a pré-proforma de BMP-2 está depositada na Swiss-Prot com o número de acesso da P12643 (Genebank número de acesso GI: 115068). Os aminoácidos 1 a 23 correspondem a uma sequência de sinal, os aminoácidos 24 a 282 correspondem ao pró-péptido e os aminoácidos 283 a 396 correspondem à proteína madura. A sequência de aminoácidos para a pré-próforma de BMP-7 está depositada na Swiss-Prot com o número de acesso P18075 (Genebank número de acesso GI: 115078). De preferência, BMP-2 ou BMP-7 refere-se à pré-próforma; à pró-forma ou ao péptido BMP-2 ou BMP-7 maduro, respectivamente. Além disso, também se incluem fragmentos das referidas proteínas com essencialmente a mesma actividade biológica, de preferência propriedades osteoindutoras. Mais informação de sequência para BMP-2 e BMP-7 é proporcionada a seguir. Também mais preferencialmente, o referido membro da família de TGF-β é um GDF. Também se verificou que o factor de crescimento e diferenciação (GDF) está envolvido, inter alia, na indução e remodelação do tecido ósseo. O factor 5 de diferenciação de crescimento 5 (GDF-5), também conhecido como proteína 1 13 ΕΡ1737734Β1 morfogenética derivada de cartilagem (CDMP-1) é um membro do subgrupo da família de BMP, que também inclui outras proteínas relacionadas, de preferência GDF-6 e GDF-7. A forma madura da proteína é um homodímero de 27 kDa. Vários estudos in vivo e in vitro demonstram o papel de GDP-5 durante a formação de diferentes características morfológicas no esqueleto do mamífero. As mutações de GDF-5 são responsáveis por anomalias do esqueleto, incluindo diminuição do comprimento de ossos longos dos membros, desenvolvimento anormal de articulações no membro e esterno (Storm & Kingsley (1999), Development Biology, 209, 11-27). A sequência de aminoácidos entre o ratinho e humanos é altamente conservada.

De preferência, o referido membro da subfamília de GDF é GDF-1, GDF-3, GDF-β, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10 OU GDF-11.

Mais preferencialmente, o referido membro da subfamília de GDF é GDF-5. A sequência de aminoácidos para a pré-próforma de GDF-5 está depositada na Swiss-Prot com o número de acesso P 43026 (Genebank número de acesso GI: 20141384). De preferência, o GDF-5 refere-se à pré-próforma ou ao péptido GDF-5 maduro. Além disso, também se incluem fragmentos de GDF-5 que têm essencialmente a mesma actividade biológica, de preferência propriedades osteoindutoras.

Outros exemplos de membros da família de TGF-β contemplados para ser revestidos num dispositivo da presente invenção estão descritos, por exemplo, nos documentos EP-Bl 0 372 031, EP-A2 0 723 013, EP-A2 1 221 484, EP-Bl 0 362 367, EP-A2, 1 225 225, EP-Bl 0 714 665, EP-Al 0 646 022, EP-Bl 0 584 283, EP-Bl 0 448 704, EP-Bl 0 643 767, EP-Bl 0 812 207, EP-Al 1 220 693, EP-Al 1 223 990, EP-Al 1 150 725, EP-Bl 0 14 ΕΡ1737734Β1 679 097, EP-Bl 0 601 106, EP-A2 0 601 135, EP-Al 0 972 520 ou EP-Bl 0 57 5 555.

Ainda outras proteínas úteis incluem proteínas codificadas por ADNs competentes para hibridar com um ADN que codifica com uma proteína osteogénica como aqui descrito e análogos, homólogos, muteínas (variantes biossintéticas) relacionados e semelhantes. As publicações que revelam estas sequências de ADN, bem como as suas propriedades físicas e químicas incluem: OP-1 e OP-2: patente U.S. No. 5011691, patente U.S. No. 5266683, Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085-2093; OP-3: W094/1020 (PCT US93/10520) ; BMP-2, BMP-3, BMP-4: W088/00205, Wozney et al. (1988), Science 242:1528- 1534); BMP-5 e BMP-6: Celeste et al. (1991), PNAS 87: 9843-9847; Vgr-1: Lyons et al. (1989), PNAS 86: 4554-4558; DPP:

Padgett et al. (1987), Nature 325: 81-84; Vg-1: Weeks (1987), Cell 51: 861-867; BMP-9: WO95/33830 (PCT/US95/07084); BMP-10: W094/26893 (PCT/US94/05290); BMP-11: W094/26892 (PCT/US94/05288); BMP-12: WO95/16035 (PCT/US94/14030) ; BMP- 13: WO95/16035 (PCT/US94/14030); GDF-1: W092/00382 (PCT/US91/04096) e Lee et al. (1991), PNAS 88: 4250-4254; GDF-8: W094/21681 (PCT/US94/03019); GDF-9: W094/15966 (PCT/US94/00685); GDF-10: WO95/10539 (PCT/US94/11440); GDF- 11: WO96/01845 (PCT/US95/08543) ; BMP-15: WO96/36710 (PCT/US96/06540); MP121: WO96/01316 (PCT/EP95/02552); GDF-5 (CDMP-1, MP52): W094/15949 (PCT/US94/00657) e W096/14335 (PCT/US94/12814) e WO93/16099 (PCT/EP93/00350); GDF-6 (CDMP-2, BMP-13): WO95/01801 (PCT/US94/07762) e W096/14335 e WO95/10635 (PCT/US94/14030) ; GDF-7 (CDMP-3 , BMP-12): WO95/10802 (PCT/US94/07799) e WO95/10635 (PCT/US94/14030).

Noutra concretização, as proteínas úteis incluem construções biossintéticas biologicamente activas, incluindo novas proteínas morfogénicas biossintéticas e proteínas quiméricas 15 ΕΡ1737734Β1 concebidas utilizando sequências de dois ou mais morfógenos conhecidos. Ver também as construções biossintéticas descritas na patente U.S. No. 5011691 (e.g. COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, e COP-16).

No contexto da presente invenção, prefere-se um péptido ou molécula pequena que tem a actividade biológica de uma proteina que é membro da familia de TGF-β. Mais preferencialmente, o péptido ou molécula pequena tem propriedades osteoindutoras e/ou osteogénicas. Estas propriedades podem ser determinadas por processos como aqui descrito, ou no documento WO 03/043673. O termo "osteoindutor" refere-se à capacidade de transformação de hemocitoblastos do mesênquima e pré-osteoblastos em osteoblastos. Um pré-requisito para a osteoindução é um sinal que é distribuído pelo dispositivo até aos tecidos envolventes, onde os precursores de osteoblastos acima referidos e outras células de mesênquima são activados. A osteoindução, tal como aqui utilizada, inclui a diferenciação de células de mesênquima em células precursoras de osso, os osteoblastos. Além disso, a osteoindução também compreende a diferenciação dos referidos osteoblastos em osteócitos, as células maduras do osso. Deste modo, a osteoindução requer a diferenciação de células indiferenciadas ou menos diferenciadas em osteócitos, que são capazes de formar o osso. Tal como descrito acima, as proteínas osteoindutoras utilizadas de acordo com a presente invenção, são libertadas lentamente do dispositivo após implantação e são distribuídas de forma eficaz aos tecidos envolventes. Além disso, as proteínas e péptidos incluídos na presente invenção têm propriedades osteoindutoras in vivo. Por exemplo, é bem conhecido na arte que a superfamília do factor de crescimento transformante-β (TGF-β) inclui membros que têm propriedades 16 ΕΡ1737734Β1 osteoindutoras. Os membros individuais da referida superfamilia do TGF-β que têm propriedades osteoindutoras particularmente boas são enumerados supra e infra e aqui descritos. Em conclusão, as proteínas osteoindutoras do dispositivo da presente invenção na superfície e após serem libertadas do transportador irão servir como sinal osteoindutor para os precursores de osteócitos do tecido que envolve o lado da implantação do dispositivo. 0 termo "osteoqénico" descreve a síntese de osso novo por osteoblastos. De acordo com a presente invenção, o osso pré-existente na envolvência do lado de implantação do dispositivo cresce para dentro do dispositivo utilizando a estrutura do dispositivo como uma matriz sobre a qual os osteócitos podem aderir.

Exemplos preferidos de substâncias farmaceuticamente activas são péptidos tais como interleucinas, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-alfa, TGF-beta, Hirudin, activador de plasminogénio tecidular e variantes, paratormona. Deve entender-se que uma "variante" ou "derivado" de qualquer das substâncias farmaceuticamente activas acima referidas tem a mesma actividade ou efeito que o fármaco não modificado. Exemplos preferidos de polissacáridos, lípidos ou glicolípidos ou moléculas pequenas são a heparina, ou substâncias que mimetizam a heparina, taxanos e.g. paclitaxel, antibióticos, esteróides ou hormonas ou fosforilcolina.

Outro exemplo de uma substância com a qual um dispositivo, e.g. um "stent" ou lentes oculares de acordo com a presente invenção, pode ser revestido são revestimentos orgânicos, tais como biogold. 0 Biogold é um revestimento de 17 ΕΡ1737734Β1 polímero comercial, que consiste de hidrocarbonetos de cadeia curta (USP 4,994,498 Biogold Cooperation). Outro exemplo de uma substância de revestimento inorgânico que pode ser utilizada para revestir um dispositivo, e.g . um "stent" da presente invenção, é carbeto de silício (SiC), óxido de irídio. (Ozbek (1997), Cathet. Cardiovasc Diagn 41: 71-78) ou TENISS que pode ser obtido da Tenax, Biotronik GmbH , Berlin, Alemanha (Unverdorben M. (2000), J. of interventional cardiology 16(4): 325). SiC é uma cerâmica e consiste de carbeto de silício hidrogenado amorfo. Além disso, os polímeros sintéticos podem ser utilizados para revestir um dispositivo, e.g. um "stent" de acordo com a presente invenção, tais como polímeros biocompatíveis ou degradáveis que são preferencialmente ácido poliláctico, celulose, poliuretano poliéster metacriloil fosforilcolina (PC) laurilmetacrilato ou politetrafluoroetileno (PTFE). Adicionalmente, os polímeros de origem natural podem ser utilizados para revestir um dispositivo da presente invenção, tal como ácido hialurónico, sulfato de condroitina, quitosano, alginato ou fibrina. Como exemplo não limitativo de uma proteína que pode ser utilizada para revestir um dispositivo, e.g. um "stent" da presente invenção, deve referir-se um anticorpo de glicoproteína Ilb/llla. Adicionalmente, contempla-se a utilização de fármacos como taxanos (e.g. paclitaxel) para revestir um dispositivo, e.g. um "stent" da presente invenção. Para uma revisão descrevendo vários exemplos de revestimentos de "stents", mas não limitativos, ver Sjoerd (2001), Curr. Intervent. Cardiol. Rep. 3: 28-36. A substância farmaceuticamente activa aqui descrita está, numa concretização preferida, imobilizada numa matriz ou material inorgânico ou orgânico, bioabsorvível. 18 ΕΡ1737734Β1

Alternativamente, a substância compreende ingredientes não activos. 0 termo "não-activo" quando utilizado no contexto da presente invenção é interpermutável com o termo "inactivo" e significa qualquer componente de um produto de fármaco que se pretende utilizar para fornecer uma actividade farmacológica ou outro efeito directo no diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção da doença, ou para afectar a estrutura ou qualquer função do corpo de humanos ou outros animais. Os ingredientes inactivos são, por exemplo, descritos em Brown (1983), N Engl J Med., 309: 439-441 ou em American Academy of Pediatrics, Commitee on Drugs "Inactive" ingredients in pharmaceutical products. Pediatrics (1985), 76: 635-643. Uma lista de ingredientes inactivos está também disponível da FDA. Estes ingredientes incluem metionina, sacarose ou ácido acético.

Também se contempla na presente invenção que a substância compreende qualquer tipo de cerâmica, como fosfato de cálcio. O termo "fosfato de cálcio" inclui composições que compreende iões de cálcio, iões fosfato e, opcionalmente, outros iões ou átomos que são adequados para o transportador da presente invenção, e.g. C032~, F~, O ET, Mg2+. Os fosfatos de cálcio que são utilizados de acordo com a presente invenção são cristalinos ou amorfos com uma estrutura tridimensional adequada para o dispositivo da presente invenção, como descrito acima. A seguir é apresentada uma lista de fosfatos de cálcio preferidos e bem conhecidos. O referido fosfato de cálcio é fosfato tricálcico beta, fosfato tricálcico alfa, hidroxiapatite, apatite carbonada ou uma hidroxiapatite deficiente em cálcio ou cimento contendo fosfato de cálcio. 19 ΕΡ1737734Β1

De preferência, um dispositivo revestido de acordo com os processos da presente invenção é revestido de forma homogénea na área de interesse com uma substância aqui descrita. A referida substância é de preferência na forma de uma solução. A referida solução pode ser composta pelo perito na arte com base na solubilidade, e.g. da proteína osteoindutora que depende do pH, da força iónica e da influência do transportador nos referidos parâmetros, após contacto do transportador com a referida solução. De acordo com a presente invenção, verificou-se que uma solução adequada para o processo da presente invenção compreende apenas componentes que não influenciam o estado de oxidação da proteina osteoindutora. 0 termo "revestido de forma homogénea" significa que a superfície do transportador é totalmente revestida com a referida proteina osteoindutora, onde estão presentes quantidades de proteina essencialmente reprodutíveis e definidas na área desejada da superfície do referido transportador. Um transportador revestido de forma homogénea de acordo com a presente invenção, de preferência exibe uma cobertura máxima com a proteína osteoindutora na sua superfície. 0 revestimento homogéneo é um pré-requisito para a libertação eficiente e distribuição e actividade homogéneas no tecido que envolve o sítio de implantação. Além disso, deve entender-se que as proteínas osteoindutoras não estão integradas e estão parcial ou totalmente inactivadas devido a precipitação ou micro-precipitação, sendo a ligação de proteínas não agregadas, biologicamente activas, conseguida por revestimento homogéneo. 0 referido revestimento homogéneo pode ser conseguido pelo processo da presente invenção e como descrito nos exemplos. Adicionalmente, meios e processos para controlar o revestimento homogéneo, quantificação e 20 ΕΡ1737734Β1 caracterização da proteína imobilizada estão descritos no documento WO 03/043673.

De acordo com a presente invenção, a proteína ou péptido é imobilizada na superfície do dispositivo. É preferido que a ligação da referida proteína ou péptido ao transportador seja reversível. Deste modo, é contemplado que a proteína ou péptido, que tem propriedades osteoindutoras não esteja acoplada à superfície do dispositivo (por exemplo metálica) por meio de ligação covalente. De preferência, o acoplamento ocorre via interacções electrostáticas, hidrófobas, não electrostáticas, tais como forças de Van-der-Waals. Devido à ligação reversível da proteína osteoindutora, a dissolução da referida proteína é permitida, uma vez que o dispositivo tenha sido colocado num meio in vivo adequado, tal como uma cavidade óssea ou uma artéria. De preferência, a referida dissolução das proteínas é de libertação lenta, permitindo a difusão da proteína para o tecido que envolve o dispositivo. Deste modo, o dispositivo permite a presença local de proteínas nativas, o que acelera a formação de e.g. osso novo e o crescimento de osso na superfície da matriz ou stents revestidos inibe a restenose rápida.

Estão descritos muitos processos para a estabilização de proteínas em produtos farmacêuticos. No entanto, as experiências subjacentes a esta invenção demonstram que as técnicas de estabilização de proteínas bem conhecidas em formulações de proteína líquidas ou liofilizadas não podem ser directamente adaptadas à proteína adsorvida numa superfície metálica. O revestimento de proteínas sobre superfícies cerâmicas ou metálicas, e.g. titânio ou ligas de titânio de acordo com os processos descritos no estado da arte referidos acima, origina o aparecimento de espécies da 21 ΕΡ1737734Β1 proteína modificadas, o que resulta na agregação ou oxidação das proteínas (para detalhes, ver Exemplo 6) . Além disso, mesmo a adição de agentes redutores não diminui a quantidade de proteína oxidada. Graças ao processo da presente invenção, é possível fabricar dispositivos que após implantação irão aumentar de forma eficiente o osso. Com vantagem, podem-se evitar os efeitos secundários indesejáveis, tais como inflamação, devido a uma maior imunogenicidade das proteínas oxidadas. Além disso, o processo da presente invenção irá permitir um processo de fabrico menos moroso e mais rentável para os dispositivos médicos da presente invenção, uma vez que o revestimento do corpo de metal ou liga do implante pode ser feito num procedimento de um passo, como aqui descrito. Além disso, o referido procedimento de um passo assegura a conservação da actividade da substância revestida no dispositivo ou implante, devido a uma secagem rápida a baixa temperatura, como descrito aqui, e à ausência de oxigénio durante o processo de revestimento, bem como no recipiente de embalagem. Outra vantagem é que o revestimento e processo de embalagem permitem uma produção em quantidade, sendo que a produção está de acordo com padrões GMP para o processamento asséptico, em vez de outras técnicas de aplicação para a solução de revestimento, por imersão, gotejamento ou pulverização. Deste modo, os implantes revestidos com os processos aqui descritos têm a qualidade asséptica elevada desejada para aplicações médicas, em especial parenteralia. 0 dispositivo revestido de acordo com os processos da invenção pode ser um implante, o que significa que os termos "dispositivo" e "implante", são aqui utilizados de forma interpermutável. É bem conhecido que o termo "implante" se refere a cada dispositivo como proporcionado pela presente invenção, que seja concebido para ser colocado total, ou 22 ΕΡ1737734Β1 parcialmente sob a superfície epitelial (Koeck, B. e Wagner, W. (Eds.) 1996). 0 implante pode ser plano, denso ou com uma forma complexa, i.e. pode-se utilizar qualquer dispositivo convencionalmente utilizado ou operável. Os implantes acima mencionados variam entre uma forma cilíndrica simples, tal como utilizado e.g. para a substituição de ossos longos, ou como uma base para dentes artificiais, para implantes planos, tal como utilizado para a substituição de ossos cefálicos planos e articulações artificiais, tais como anca, joelho e cotovelo. Outros tipos de implantes são implantes cerâmicos biodegradáveis de forma tridimensional estruturada (porosos) (e.g. blocos ou cilindros) de origem natural (bovino, humano), ou de material sintético (beta-TCP).

De preferência, o implante ou dispositivo é uma entidade que compreende pelo menos dois componentes. Um dos referidos componentes é um transportador. Os transportadores que podem ser utilizados no contexto da presente invenção incluem transportadores sólidos, tais como transportadores totalmente metálicos ou de ligas metálicas e matrizes metálicas ou de ligas metálicas. Adicionalmente, a presente invenção inclui transportadores sólidos que compreendem espaços ocos e cavidades. Além disso, o referido transportador tem, de preferência, uma superfície aumentada devido à formação de macro e microporos. De preferência, os referidos macro e microporos são restritos à camada de superfície do transportador. Também se incluem na presente invenção transportadores que consistem de pelo menos dois componentes diferentes, em que um componente metálico ou de liga metálica é utilizado como núcleo ou camada nuclear e, e.g. um material cerâmico é utilizado como camada de superfície. Isto também inclui a formação de implantes ou próteses cirúrgicas completas. Estas próteses são, de preferência, formadas ou 23 ΕΡ1737734Β1 revestidas com superfícies metálicas, como será descrito em maior detalhe a seguir. As próteses são feitas de titânio ou ligas de titânio ou de aço inoxidável.

Antes de contactar a solução que compreende, por exemplo, proteína osteoindutora dissolvida, com um transportador que contém uma superfície de um metal ou liga metálica, como aqui descrito, é contemplado que a superfície metálica respectiva seja preferencialmente limpa ou tratada para remover quaisquer contaminantes da superfície, tais como gases atmosféricos (e.g. oxigénio) ou outros contaminantes hidrófobos, para promover uma boa resistência de adesão ao revestimento. Vários processos que são adequados para este fim são bem conhecidos na arte e estão também exemplificados nos exemplos anexos. Por exemplo, a superfície metálica dos dispositivos da invenção pode ser lavada com e.g. acetona, álcoois vinílicos como etanol e em seguida aquecida para desadsorver contaminantes voláteis e em seguida lavada com água destilada ou desmineralizada, estéril.

Noutro aspecto da presente invenção é contemplado que o transportador de dispositivos ou implantes seja seleccionado do grupo constituído por materiais orgânicos sintéticos, materiais inorgânicos sintéticos, materiais orgânicos de origem natural e materiais inorgânicos de origem natural. A origem natural significa compostos que ocorrem na natureza.

De preferência, os referidos materiais orgânicos sintéticos são ácido poliglicólido (PGA), poliláctido (PLLA), poli-D/L-láctido (pdlla) , poli(glicólico-co-láctido) (PLGA), ácido poli(3-hidroxibutírico) (P(3 —HB), poli(ácido 3-hidroxivalérico) P(3-HV), poli(p-dioxanona) (PDS), ρο1ί(ε-caprolactona) (PCL), polianidrido (PA), poliortoéster, 24 ΕΡ1737734Β1 polietileno (PE), polipropileno (PP), polietilenotereftalato (PET), poliglactina, poliamida (PA), polimetilmetacrilato (PMMA), polihidroximetilmetacrilato (phema), cloreto de polivinilo (PVC), álcool polivinílico (PVA), politetrafluoretileno (PTFE), poliéterétercetona (PEEK), polissulfona (PSU), polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona, poliuretano ou polissiloxano. Deve entender-se que qualquer combinação ou copolímeros dos materiais orgânicos sintéticos acima referidos é também contemplada.

Noutra forma de realização preferida, os referidos materiais inorgânicos sintéticos são aço 316L, liga de cobalto-crómio, titânio, liga de titânio como aqui descrito, ouro, ou platina. Deve entender-se que também se contempla qualquer combinação dos materiais inorgânicos sintéticos acima referidos.

Noutra forma de realização preferida, os referidos materiais inorgânicos são fosfato β-tricálcico, fosfato a-tricálcico, hidroxilapatite, apatite carbonada, óxido de alumínio, óxido de zircónio, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio ou biovidro. Deve entender-se que também é contemplada qualquer combinação dos materiais inorgânicos acima referidos.

Ainda noutra forma de realização preferida os referidos materiais orgânicos de origem natural são colagénio, quitina, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, alginato, osso autólogo, gelatina ou fibrina. Deve entender-se que também é contemplada qualquer combinação dos materiais orgânicos acima referidos. 25 ΕΡ1737734Β1

Noutra forma de realizaçao, os materiais de origem natural são osso calcificado ou material derivado de coral.

Todos os materiais orgânicos ou inorgânicos aqui referidos também podem ser utilizados como transportador para o ingrediente farmacêutico activo, e.g. como agente de encapsulação ou para transmitir/embeber para se obter a imobilização do fármaco, proteger e/ou estabilizar e/ou libertar de forma controlada. A referida substância farmaceuticamente activa preferida pode ser imobilizada num material inorgânico ou orgânico bioabsorvivel. 0 dispositivo ou implante revestido de acordo com os processos da presente invenção tem, de preferência, uma superfície aumentada, devido a modificações de superfície porosas, em pérola ou em malha. Estas modificações podem ser introduzidas por processos bem conhecidos na arte, incluindo meios químicos ou mecânicos. Além disso, verificou-se que a maior superfície com irregularidades na gama de nanómetros e micrómetros é benéfica para a integração óssea. 0 termo "integração óssea" quando aqui utilizado significa que o osso tem a capacidade de formar osso novo em torno do implante e de se integrar com o implante. Integração significa a ligação de células ósseas à superfície do implante resultando numa ancoragem firme e permanente da reconstrução prostética sob carga funcional, sem dor, inflamação ou afrouxamento. É contemplado que a integração óssea acompanhada de formação de osso novo deve ser realizada para o tratamento de defeitos traumáticos, malignos ou artificiais, para o tratamento de defeitos dentários ou para o tratamento da articulação da anca, cotovelo, coluna, joelho, dedo, ou tornozelo ou material de enchimento de 26 ΕΡ1737734Β1 defeitos ósseos. Os sintomas das doenças e distúrbios referidos acima são descritos em detalhe em livros de texto de medicina convencionais, tal como Pschyrembel e Stedman. "Formação de osso novo" significa formação de osso endocondral ou formação de osso intramembranar. Em humanos, a formação óssea começa durante as primeiras 6-8 semanas de desenvolvimento fetal. Os hemocitoblastos progenitores com origem no mesênquima migram para sitios pré-determinados, onde: (a) condensam, proliferam e se diferenciam em células formadoras de osso (osteoblastos), um processo observado no crânio e designado por "formação de osso intramembranar;" ou, (b) condensam, proliferam e diferenciam-se em células formadoras de cartilagem (condroblastos) como intermediários, que são subsequentemente substituídos com células formadoras de osso. Mais especificamente, os hemocitoblastos de mesênquima diferenciam-se em condrócitos. Os condrócitos ficam então calcificados, sofrem hipertrofia e são substituídos por osso formado de novo constituído por osteoblastos diferenciados que estão agora presentes no local. Subsequentemente, o osso mineralizado é extensivamente remodelado, tornando-se em seguida ocupado por um ossículo cheio com elementos de medula funcionais. Este processo é observado em ossos longos e designado por "formação de osso endocondral." Na vida pós-fetal, o osso tem a capacidade para se reparar a ele próprio após dano, mimetizando o processo celular de desenvolvimento de osso endocondral embrionário. Isto é, os hemocitoblastos progenitores de mesênquima da medula óssea, periósteo e músculo podem ser induzidos a migrar para o sítio do defeito e começar a cascata de fenómenos descrita acima. Aí, eles acumulam-se, proliferam e diferenciam-se em cartilagem, que é subsequentemente substituída com osso formado de novo. 27 ΕΡ1737734Β1

Também se descreve aqui que um dispositivo ou implante da presente invenção pode ser utilizado num processo para tratar uma ou mais das doenças referidas de acordo com as utilizações da presente invenção, em que o referido processo compreende pelo menos o passo de administrar o dispositivo da invenção ou um dispositivo que pode ser obtido pelo processo da invenção numa forma farmaceuticamente aceitável, para um indivíduo. De preferência, o referido indivíduo é um humano. 0 dispositivo ou implante revestido de acordo com a presente invenção pode, além disso, compreender excipientes adicionais. Estes excipientes e.g. sacarídeos, aminoácidos, polióis ou detergentes, servem para a estabilização ou preservação da proteína, ou manutenção do pH, e.g. substâncias tampão. Outros excipientes preferidos contemplados pela presente invenção incluem amido ou amido modificado, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, óleos naturais (e.g. óleo de rícino), polietilenoglicol, polipropilenoglicolpropileno, glicol, água, etanol e semelhantes. 0 termo "sacarídeos" inclui mono-, di- e polissacáridos. A estrutura e composição dos mono-, di, e polissacáridos são bem conhecidas na arte e estão descritas em livros de texto convencionais, tais como Rõmpp, léxico de química. Mais preferencialmente, o referido sacárido é um dissacárido. Muito preferencialmente, o referido dissacárido é sacarose ou trealose.

Noutra forma de realização preferida do dispositivo revestido de acordo com a presente invenção, ou o processo da 28 ΕΡ1737734Β1 invenção o referido dispositivo é isento de substâncias tóxicas. 0 termo "substâncias tóxicas", inclui, de preferência, os solventes orgânicos tóxicos e aditivos que são utilizados pelos processos descritos na arte, e.g. acetonitrilo. As referidas substâncias podem causar inflamação e outras reacções após implantação dos dispositivos que contêm as referidas substâncias. Os referidos dispositivos são terapeuticamente menos aceitáveis devido aos referidos efeitos indesejáveis que não podem ser evitados pelos processos de revestimento descritos na arte. Além disso, o guia internacional para o desenvolvimento de proteínas terapêuticas requer que no processo de fabrico sejam evitadas substâncias prejudiciais e tóxicas (para detalhes, ver: International Conference on Harmonization (ICH), Topic Q3C; www. emea.eu.int/). No entanto, o dispositivo da presente invenção ou um dispositivo que pode ser obtido pelo processo da presente invenção é, com vantagem, isento de, ou com o minimo das referidas substâncias tóxicas e, portanto, terapeuticamente bem aceite e preenche os requisitos das autoridades reguladoras.

Além disso, noutra forma de realização preferida do implante revestido de acordo com a presente invenção, ou o processo da invenção, o referido dispositivo é isento de material infeccioso.

Além de substâncias tóxicas, o material infeccioso compreendido pelo implante pode causar infecções graves num indivíduo no qual se transplantou o dispositivo. A gelatina potencialmente infecciosa de osso de bovino ou porcino é, no entanto, utilizada como proteína protectora em muitos 29 ΕΡ1737734Β1 processos do estado da arte (M. Lind (1996), Acta Orthop Scand 67: 407-17). O revestimento do dispositivo de acordo com os processos da invenção com, por exemplo, uma proteína osteoindutora, destina-se a iniciar e estimular a transformação de hemocitoblastos de mesênquima em osteoblastos e condrócitos. Assim, contempla-se que será necessário revestir apenas as partes do dispositivo da invenção que são dirigidas para o tecido ósseo respectivo. A referida parte é de preferência toda a superfície ou pelo menos as suas partes que estão justapostas ao tecido ósseo. Por exemplo, um implante dentário que é utilizado para substituir um dente em falta, compreende uma parte roscada que é aparafusada no osso do maxilar e uma parte estendida (encaixe) que é utilizada para ancorar uma coroa de dente artificial. Deste modo, apenas é necessário revestir a parte roscada com a proteína osteoindutora. No entanto, a parte que não é revestida com a proteína osteoindutora pode ser revestida com outros agentes, tal como fosfatos de cálcio, colagénio ou agentes semelhantes. 0 termo "proteína osteoindutora" ou, como descrito acima, refere-se a membros da superfamília do factor de crescimento transformante-β (TGF-β) que têm propriedades osteoindutoras, tais como o factor-5 de crescimento e diferenciação, ou as proteínas aqui descritas, ou nos pedidos de patente EP ou patentes EP acima mencionadas. Uma pré-condição importante para este processo de adsorção ou para a superfície metálica é uma solubilidade suficiente das proteínas na solução de revestimento, como descrito no documento WO 03/043673. 30 ΕΡ1737734Β1 0 passo de secagem utilizado no processo de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção é a secagem isotérmica, que é como se descreve a seguir. 0 termo "secagem isotérmica" refere-se a um processo de secagem em que o solvente é removido por evaporação do solvente da fase liquida para a fase gasosa e subsequentemente condensado num condensador de gelo. 0 condensador de gelo é ajustado a temperaturas muito baixas para reduzir a pressão de vapor saturado do solvente, para se obter um transporte de massa do solvente para fora da solução e para imobilizar o solvente. De preferência, o condensador de gelo é ajustado para menos de -50°C.

Este processo é realizado sob pressão reduzida (i.e. abaixo da pressão atmosférica convencional) para aumentar a evaporação do solvente, enquanto que a temperatura da solução é mantida a uma temperatura definida, de preferência utilizando uma manga de temperatura regulada na qual está localizado o produto. A temperatura é ajustada pelo equilíbrio entre evaporação e aquecimento a um nível constante, para aumentar a evaporação do solvente e para prevenir um congelamento da solução, diminuindo a temperatura devido à entalpia da evaporação do solvente e para proteger o substrato da degradação induzida pela temperatura. De preferência, a temperatura é constante ao longo do processo de secagem. É necessário que ambas, a temperatura e pressão sejam ajustadas cuidadosamente para assegurar que a solução permanece no estado líquido ao longo da secagem. De preferência, o processo de secagem é realizado num 31 ΕΡ1737734Β1 liofilizador para manter e controlar os parâmetros de secagem definidos, durante o processo de secagem. De preferência, o processo de secagem é realizado num ambiente isento de oxigénio, e.g. ventilando a câmara de secagem com azoto, argon etc.

Recentemente, o revestimento de "stents" tornou-se importante para aumentar a histocompatibilidade e compatibilidade de tecido. Pensa-se que os ensaios em curso com "stents" de eluição de fármacos novos melhoram o tratamento da restenose e em especial a restenose in-stent (ver, e.g. o relatório "Recent Developments in Coated Stents), Hofma, Sjoerd H. et al. (2001), Current Interventional Cardiology Reports, 3: 28-36). A presente invenção também contempla o revestimento de "stents" com o processo de acordo com a presente invenção. O revestimento de "stents" de acordo com a presente invenção resulta em "stents" com um revestimento homogéneo ao longo de toda superfície do "stent", por exemplo, "stents" metálicos (como "stents" de Nitinol), como aqui descrito.

De acordo com a presente invenção, o revestimento do referido dispositivo é realizado enquanto o referido dispositivo é contactado com a solução de revestimento no seu recipiente de embalagem adaptado, especial. Por outras palavras, de acordo com a presente invenção, o recipiente para o dispositivo a ser revestido durante o processo de revestimento é idêntico ao recipiente utilizado para o empacotamento e armazenamento do dispositivo revestido, i.e. o mesmo recipiente é utilizado para o revestimento e subsequente embalagem e.g., utilização na produção em grande escala de produtos assépticos de dose única, em particular para a utilização para produtos farmacêuticos. 32 ΕΡ1737734Β1

De preferência, a solução que contém a substância é uma solução aquosa, muito preferencialmente uma solução ácida. Obviamente, como é bem conhecido na arte, o pH da solução que contém a substância bem como excipientes para o ajuste do pH deverá ser escolhido com cuidado.

Por exemplo, os dispositivos de Ti são de preferência revestidos com proteinas por meio de uma solução aquosa da proteína aplicada à superfície metálica e secagem adicional. Esta solução de revestimento é formulada para se obter uma estabilidade suficiente para a proteína durante o processamento e armazenamento. Por exemplo, o rhGDF-5 é solúvel apenas em soluções ácidas. Deste modo, o valor de pH da solução de revestimento deve ser ajustado cuidadosamente para evitar a degradação ácida da proteína por um lado, e a precipitação a valores de pH mais elevados, por outro lado. Alguns estudos identificaram uma gama de pH de 3,0 a 3,5 como sendo ideal (WO 03/043673). Este pH deverá ser constante durante a secagem e não se deverá desviar para valores mais elevados ou mais baixos, quando a solução é concentrada durante a evaporação do solvente. Algumas experiências mostraram que um ácido fraco, por exemplo, ácido acético, é um excipiente ideal para este fim. O termo "ácido fraco" refere-se a compostos orgânicos ou inorgânicos contendo pelo menos um átomo de hidrogénio ligado ionogenicamente. Os ácidos fracos são bem conhecidos na arte e estão descritos em livros de texto convencionais, tais como Rõmpp, léxico de química. De preferência, os referidos ácido fracos que têm graus de dissociação baixos e estão descritos por valores de pK entre 3 e 7, de preferência entre 4 e 6. 33 ΕΡ1737734Β1

Como referido aqui, a solução da substância a ser revestida no dispositivo é uma solução ácida. De preferência, a solução aquosa ácida contém HC1, ácido acético, ácido cítrico e/ou ácido succínico.

Noutra forma de realização da presente invenção, a solução da substância que vai ser revestida no dispositivo é um solvente orgânico. De preferência, o solvente orgânico é ácido acético glacial, DSMO, anisolo.

No entanto, a presente invenção também contempla que a solução da substância a ser revestida no dispositivo de acordo com os processos da presente invenção é dissolvida em álcoois alifáticos ou aromáticos, ésteres, éteres, hidrocarbonetos alifáticos ou aromáticos halogenados.

Também se prefere que a solução contenha um antioxidante, como metionina ou seus derivados (sulfito, ácido ascórbico, glutationa) ou neutralizador de radicais, como descrito em livros de texto convencionais (Bauer, Frõmming Fuhrer, Lehrbuch der Pharmaceutischen Technologie, 6. Auflage, 1999). Exemplos são: butilhidroxitoluol, butilhidroxianisolo, EDTA, manitol, isopropanol, tocoferol, ésteres de ácido galúrico. 0 dispositivo a ser revestido é, por exemplo, feito de metal ou liga metálica, de preferência titânio ou uma liga de titânio, ou qualquer um dos materiais aqui descritos. É preferido que os metais/ligas metálicas ou outros materiais da invenção aqui descritos sejam biocompatíveis. 0 termo "biocompatível" significa a qualidade de não ser tóxico ou ter efeitos prejudiciais nos sistemas biológicos (Williams, D.F., (1988), Consensus and definitions in biomaterials, in 34 ΕΡ1737734Β1

Advances in Biomaterials, 8, de Putter, C., de Lange K., de Groot K., Lee A.J.C. (eds.), Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam). As referidas propriedades são conhecidas para ligas de titânio. Mais preferencialmente, a liga de titânio é uma liga de titânio contendo pelo menos 50% de titânio. Além disso, de preferência, a referida liga de titânio é uma liga de Ti-Al-V-, uma liga de Ti-Al-Fe, uma liga de Ti-AI-Nb ou uma liga de Ti-Mo-Zr-Al, uma liga de Ti-Ni, muito preferencialmente TÍ6A14V. O dispositivo a ser revestido com o processo do primeiro aspecto é de preferência um implante ou um "stent", muito preferencialmente um implante dentário ou "stent" coronário.

Mais detalhadamente, o processo da presente invenção compreende os sub-passos de (al) proporcionar um recipiente de embalagem para o referido dispositivo; (a2) inserir a referida solução de revestimento no referido recipiente e (a3) inserir o referido dispositivo no referido recipiente pré-cheio. A ordem dos passos (a2) e (a3) pode ser invertida de modo que primeiro o dispositivo é inserido no recipiente e subsequentemente a solução de revestimento. Mais preferencialmente, o processo compreende também o passo de aplicar uma pressão reduzida abaixo da atmosférica, para assegurar um humedecimento completo da superfície de interesse, e.g. para remover bolhas de ar, antes do passo de secagem. É contemplado que o recipiente de embalagem pode ser revestido de acordo com os processos aqui descritos. Alternativamente, o recipiente de embalagem pode já estar revestido com um material, por exemplo, um material hidrófobo, como aqui descrito. 35 ΕΡ1737734Β1

Mais detalhadamente, a solução de revestimento é de preferência formulada, filtrada em condições estéreis e doseada no recipiente (por exemplo, um frasco de vidro) utilizando uma bomba de micro-pistões. Os dispositivos, tais como fixações de Ti, são adicionados e imersos na solução de proteína. Os recipientes são então fornecidos com rolhas que são apenas parcialmente inseridas antes de serem carregados no liofilizador. Para remover bolhas de ar possivelmente presas nos poros da superfície de titânio da fixação, aplica-se um vácuo de, por exemplo, 30 hPa (que é acima das condições de fervura da solução de proteína, à temperatura ambiente). Subsequentemente, a pressão da câmara do liofilizador é ajustada para, por exemplo, <500hPa, mais preferencialmente <250 hPa, muito preferencialmente <100 hPa e o solvente é removido por secagem isotérmica sob azoto, à temperatura ambiente (aproximadamente 25°C). O vapor do solvente evaporado é condensado no condensador de gelo, ajustado para uma temperatura muito baixa (por exemplo, aprox. <-50°C) como descrito em Murgatroyd K, The Freeze Dryer and Freeze Dryer Design, in Good Pharmaceutical Freeze-Drying Practice, 2, Cameron, P (ed.), Interpharm Press, Inc, Buffalo Grove Amsterdam, 1997. Após secagem, a câmara é evacuada a vácuo máximo e ventilada com azoto estéril antes de fechar os dispositivos no liofilizador, colapsando as prateleiras de liofilização umas nas outras.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um recipiente de embalagem para um dispositivo, em que o referido recipiente compreende um receptáculo que está localizado coaxialmente no invólucro do recipiente, estando o referido receptáculo para receber o referido dispositivo a ser revestido adaptado de modo a que o referido dispositivo possa ser revestido com uma substância 36 ΕΡ1737734Β1 directamente no referido recipiente, em que a superfície interna do referido receptáculo é revestida com uma camada de material inerte e repelente. Deste modo, o recipiente de acordo com a presente invenção preenche ambas as funções, vaso para um processo de revestimento in-situ do dispositivo (e.g. implante) e sistema de embalagem primário para armazenamento a longo prazo.

De preferência, o receptáculo é adaptado ao tamanho e forma do referido dispositivo. É preferido que a superfície interna do referido receptáculo seja revestida, por exemplo, com uma camada de um material inerte, repelente, tal como um material hidrófilo ou hidrófobo, como silicone ou PTFE, ou um material tipo PTFE no caso de soluções de revestimento aquosas. Para o revestimento de superfícies hidrófobas com substâncias hidrófobas é necessário um revestimento hidrófilo no vaso, se necessário. 0 revestimento da superfície interna assegura a deposição quantitativa da substância a ser utilizada para revestir o dispositivo ou implante. Isto é muito vantajoso no âmbito de uma produção rentável de dispositivos ou implantes revestidos.

Como referido acima, o receptáculo do recipiente está localizado coaxialmente num invólucro do recipiente. 0 invólucro do recipiente compreende uma abertura para passar o dispositivo e a solução de revestimento/substrato ou substância através do receptáculo e uma porção inferior localizada oposta à abertura. Adicionalmente, o receptáculo compreende uma abertura para receber o dispositivo e o substrato ou substância de revestimento e a porção inferior está localizada oposta à sua abertura. A abertura do referido 37 ΕΡ1737734Β1 invólucro e a abertura do referido receptáculo estão alinhadas uma com a outra, e o receptáculo está ligado na sua porção Inferior ao invólucro. De preferência, a porção de abertura do receptáculo está espaçada da porção de abertura do invólucro. É preferido que o recipiente de embalagem seja feito de vidro. Alternativamente, é feito de um material plástico. De preferência, as dimensões externas deste recipiente de vidro são idênticas às de um frasco do tipo convencional (DIN ISO 8362: Injektionsbehãltnisse fur Injektionsprãparate und Zubehõr). As dimensões internas são adaptadas para formar um microvaso para o revestimento e armazenamento dos dispositivos, tais como fixações de Ti, por exemplo.

Também se descreve aqui um processo para revestir as superfícies internas de um recipiente de embalagem, de preferência implantes, a ser revestidos com uma substância, que compreende os passos de: (A) aplicar um material hidrófobo nas referidas superfícies internas do referido recipiente e (B) curar pelo calor o referido material aplicado, para formar uma camada nas superfícies internas do referido recipiente, em que o referido revestimento influencia o coeficiente de distribuição da substância a ser utilizada para revestir o referido dispositivo entre o referido recipiente e o referido dispositivo. Como explicado acima, o material hidrófobo é de preferência silicone ou PTFE ou um material do tipo PTFE. Em mais detalhe, o passo (A) compreende siliconizar as referidas superfícies internas do recipiente utilizando uma emulsão de silicone.

Também é aqui descrito um dispositivo revestido que se pode obter por um processo de acordo com o primeiro aspecto da invenção. De preferência, o dispositivo é um implante ou 38 ΕΡ1737734Β1 um "stent" coronário. Por exemplo, o implante é um "stent", um prego, um parafuso, uma gaiola, ou uma placa, respectivamente.

Em particular, o dispositivo compreende uma proteína osteoindutora que é revestida homogeneamente numa superfície do dispositivo metálica ou de uma liga, porosa ou não porosa, em que o estado de oxidação da proteina osteoindutora não está significativamente aumentado em comparação com a proteina osteoindutora que não foi revestida na referida superfície metálica ou de liga metálica. A presente invenção compreende ainda a utilização do processo de revestimento de um dispositivo de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção para melhorar a distribuição homogénea do revestimento no dispositivo. A presente invenção também inclui um kit que compreende um revestimento e recipiente de embalagem de acordo com a presente invenção e um dispositivo revestido que pode ser obtido pelo processo do primeiro aspecto da presente invenção. As definições e explicações dos termos dadas acima no contexto dos processos, dispositivos e utilizações da presente invenção aplicam-se mutatis mutandis ao kit aqui descrito. As partes do kit da invenção podem ser embaladas individualmente em frascos ou outros meios adequados, dependendo do ingrediente respectivo ou em combinação em recipientes adequados ou unidades multi-recipiente. 0 fabrico do kit segue, de preferência, procedimentos convencionais que são conhecidos dos peritos na arte. De preferência, o dispositivo é empacotado num recipiente ou frasco, numa atmosfera isenta de oxigénio, tal como uma atmosfera de gás inerte, consistindo de preferência de azoto. 39 ΕΡ1737734Β1 A presente invenção é descrita a seguir, com referência às figuras anexas, nas quais:

Figura 1 - mostra de forma esquemática o processo de revestimento de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, para titânio;

Figura 2 - mostra uma secção transversal de um recipiente preferido de acordo com o segundo aspecto da presente invenção;

Figura 3 - mostra um outro recipiente alternativo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção;

Figura 4 - mostra um segundo recipiente alternativo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção;

Figura 5 - mostra de forma esquemática recipientes que contêm um dispositivo a ser revestido: na posição direita (esquerda) e invertida (direita);

Figura 6 - mostra o processo de revestimento adaptado num processo asséptico de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção por meio de um fluxograma de fabrico;

Figura 7 - mostra o efeito protector da metionina na estabilidade da proteína;

Figura 8 - mostra o efeito protector da metionina sobre a estabilidade de rhGDF-5 por análise de RP-HPLC- de 40 ΕΡ1737734Β1 diferentes formulações de rhGDF-5 (com e sem metionina); TiU = TiUite;

Figura 9 - mostra o efeito do recipiente não siliconizado vs. siliconizado sobre a distribuição da proteína (teor de proteína no implante, barra a preto vs. perda no recipiente, barra branca) e menor degradação da proteína por (análise de RP-HPLC-) primeiro aspecto da; TiU = TiUite; ICC = cartucho de revestimento por imersão;

Figura 10 - mostra a distribuição e degradação do rhGDF-5 revestido em implantes de titânio com carga máxima de rhGDF-5 (análise de RP-HPLC); ICC = cartucho de revestimento por imersão;

Figura 11 - mostra a distribuição de rhGDF-5 seco à pressão atmosférica, sob condições não optimizadas, utilizando coloração por fluorescência;

Figura 12 - mostra a distribuição homogénea de rhGDF-5 adsorvido na superfície do implante por coloração por fluorescência de fixações secas após optimização das condições de secagem; e

Figura 13 - mostra figuras SEM da superfície do implante porosa (Figura A lOOx, Figura B lOOOx).

Descrição pormenorizada da presente invenção

A figura 1 mostra de forma esquemática o processo de revestimento de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, utilizado para revestir as fixações de titânio. O 41 ΕΡ1737734Β1 recipiente de embalagem utilizado de acordo com a presente invenção para revestir o implante (aqui: fixação de titânio) é apresentado na figura 1 em cinco passos do processo. No primeiro passo, a solução de proteina é adicionada ao recipiente que na concretização preferida da figura 1 é um recipiente siliconizado. Em seguida, o dispositivo, e.g. um implante como um parafuso, é inserido no recipiente e fica assim completamente envolvido pelo liquido. No terceiro passo, utiliza-se uma rolha para fechar o recipiente. No entanto, a rolha não é colocada na sua posição de fecho final (o que é apresentado na figura mais à direita da figura 1) mas numa posição intermédia. Tendo a rolha parcialmente inserida no recipiente, inicia-se o processo de secagem o que resulta no revestimento do dispositivo. Devido à posição semi-fechada da rolha, é possível, por exemplo, que a água se escape do recipiente durante o processo de secagem. Após o procedimento de secagem/revestimento, a câmara do liofilizador pode ser ventilada com azoto estéril ou com outro gás inerte, antes de fechar completamente os recipientes, pressionando a rolha no recipiente. Alternativamente, pode-se aplicar vácuo antes de fechar os recipientes. 0 implante totalmente revestido já está inserido no recipiente de embalagem e pronto para envio. A figura 2 mostra outro recipiente alternativo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. Este recipiente de embalagem compreende um frasco de vidro sólido especialmente concebido. As dimensões externas deste frasco de vidro são idênticas às do frasco 2R convencional. As dimensões internas são adaptadas para formar um microvaso para revestimento e armazenamento de, por exemplo, fixações de Ti. Este frasco de vidro é siliconizado utilizando emulsão 42 ΕΡ1737734Β1 de silicone de grau médico cozida no vidro por tratamento pelo calor. A figura 3 mostra uma secção transversal de um recipiente preferido de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. Este recipiente de embalagem preferido consiste de um frasco de vidro tipo 2R, convencional, com um tubo de vidro interno firmemente moldado no fundo do frasco (frasco de vidro de um componente) . Utilizando este tubo de vidro, cria-se um microvaso para revestir os implantes (tal como fixações de Ti) numa posição invertida. 0 frasco é siliconizado de acordo com a presente invenção utilizando emulsão de silicone de grau médico, que é cozida no vidro por tratamento pelo calor. A figura 4 mostra um outro recipiente alternativo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. Este recipiente compreende um frasco de vidro 2R convencional, uma rolha de liofilização de bromobutilo, convencional, um micro-cartucho de vidro siliconizado pelo calor no seio do frasco, e um suporte de plástico flexível (PE) para o cartucho. 0 frasco é de preferência selado por cravação de uma tampa de alumínio (não apresentado).

Os cartuchos são siliconizados utilizando emulsão de silicone de grau médico cozido no vidro por tratamento pelo calor (ver também capítulo 4.3 Processo). Os frascos são lavados e siliconizados utilizando emulsão de silicone. A cura pelo calor para formar uma camada de silicone cozida e para esterilizar o frasco é feita a uma temperatura de 250°C mínimo. Os suportes de plástico são ligados manualmente aos cartuchos, colocados no frasco. 43 ΕΡ1737734Β1 A figura 5 mostra esquematicamente concepções de recipiente alternativas contendo um dispositivo a ser revestido na posição direita (desenho da esquerda) e invertida (desenho da direita). Em ambas as alternativas, a forma do recipiente é adaptada à forma do implante, o que assegura um revestimento eficaz. Algumas experiências mostraram que o revestimento na posição invertida origina uma camada de proteína mais homogénea na superfície das fixações. Isto deve-se à geometria complexa do dispositivo e ao facto de as bolhas de ar, que resultam de baixar a pressão, poderem levar a defeitos do revestimento. Essas bolhas de ar ficam facilmente aprisionadas na cabeça do parafuso da fixação quando esta está na posição direita, mas podem escapa do cartucho quando a fixação está na posição invertida. A figura 6 mostra o processo de revestimento adaptado num processo asséptico de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, por meio de um fluxograma de fabrico. No primeiro passo, i.e., o passo de formulação, a solução de proteína e os excipientes são postos em contacto. Em seguida, ocorre uma filtração estéril. Isto é feito utilizando uma unidade de filtro. 0 frasco de vidro, i.e., o recipiente, é primeiro lavado e siliconizado, em seguida esterilizado pelo calor e por fim colocado na estação de enchimento. Na estação de enchimento, a solução é colocada no recipiente, por exemplo, utilizando uma bomba de micro-pistões. Numa estação de recolha e colocação (pick-and-place) subsequente, as fixações esterilizadas pelo calor são colocadas no recipiente que contém a solução do material de revestimento. Subsequentemente, os recipientes prosseguem para a estação de rolhamento e são parcialmente fechados por rolhas de liofilização autoclavadas. Este conjunto é então carregado num liofilizador onde a secagem e rolhamento final 44 ΕΡ1737734Β1 subsequente são realizados. Numa estação de cravação os recipientes são selados com uma tampa cravada. 0 último passo compreende rotulagem e embalamento secundário, para envio. Os componentes de borracha, i.e. as rolhas de liofilização são rolhas de liofilização do tipo convencional. Os frascos são de preferência selados com tampas cravadas Flip-Tear up do tipo convencional. A figura 7 mostra a degradação da proteína quantificada por RP-HPLC de implantes de titânio revestidos com rhGDF-5 (utiliza-se solução de revestimento rhGDF-5 em ácido acético 50 mM e rhGDF-5 em ácido acético 50 mM com metionina 10 mM). Apenas se observa um pequeno aumento da degradação de proteína em comparação com o material de partida. Isto mostra a praticabilidade do processo de revestimento da presente invenção. A figura 8 mostra a estabilidade de duas soluções de proteína (rhGDF-5) em soluções de revestimento diferentes, HC1 10 mM (barras brancas) vs. Ácido acético 50 mM (barra preta), ambos com e sem metionina, estando em contacto com o implante a ser revestido durante 7 horas. Os dados mostram que é possível evitar a degradação da proteína quando a formulação é adaptada ao processo de revestimento (ácido acético 50 mM com metionina 10 mM) . Adicionalmente, esta experiência é uma primeira prova de conceito para o processo de fabrico em grande escala pretendido, em que uma estabilidade da solução de revestimento é um pré-requisito para assegurar uma qualidade de produto consistente. A = solução GDF-5 de partida; B = solução GDF-5 após 7 h, c = solução GDF-5 + fixação de TiU, D = solução GDF-5 + Met. Após 7h, E = solução GDF-5 + Met. + TiU após 7 h. 45 ΕΡ1737734Β1 A figura 9 mostra o efeito de utilizar um recipiente siliconizado para o revestimento. Os dados obtidos apresentados na figura 9 indicam claramente as vantagens, em relação à distribuição de proteínas entre o recipiente e o implante. Enquanto que para o recipiente não tratado mais de 30% de rhGDF-5 permanecem no recipiente, esta quantidade pode ser massivamente reduzida para 5% se forem utilizados recipientes siliconizados. Este efeito é essencialmente independente da carga de rhGDF-5 absoluta e é reprodutível, como se pode ver para duas quantidades de proteína diferentes (34 pg, 121,5 pg por fixação). A figura 10 mostra a distribuição de rhGDF-5 seco à pressão atmosférica. Para evitar a formação de bolhas, fez-se uma primeira experiência, secando o implante sem aplicar vácuo. Deste modo, a secagem foi conseguida apenas por condensação da água no condensador de gelo ultra-frio. A figura 10 também mostra que mesmo com uma maior dosagem de revestimento até 298 pg de rhGDF-5 por implante, a distribuição de proteína entre o recipiente e o implante é ainda praticamente quantitativa no implante. Esta constatação demonstra que a distribuição de proteína é independente da dosagem de revestimento, o que é outra vantagem do processo de revestimento da presente invenção. A figura 11 mostra a análise de fluorescência correspondente das fixações secas deste modo. Pode ver-se pelas figuras que a proteína é muito mais segregada entre a cabeça da fixação, onde o rhGDF-5 está obviamente concentrado na parte inferior. Com interesse, o revestimento parece ser relativamente homogéneo ao longo do raio correspondente. 46 ΕΡ1737734Β1 A figura 12 mostra a distribuição homogénea de rhGDF-5 adsorvido na superfície do implante por coloração por fluorescência de fixações secas após optimização das condições de secagem. Numa tentativa de optimizar as condições de revestimento, alguns parâmetros que têm um efeito na distribuição da proteína foram variados: • A pressão; para permitir molhar completamente também dentro das cavidades da superfície da fixação microestruturada. Foi alterada de uma pressão constante para vácuo pulsado; • A posição da fixação no recipiente em posição direita vs. posição invertida porque a forma cónica da fixação permite que as bolhas de ar se escapem do recipiente mais facilmente; e • A forma do recipiente.

As figuras demonstram que as fixações, secas na posição direita têm um revestimento simétrico radial vantajoso, com alguma concentração de proteína na cabeça da fixação. A figura 13 mostra figuras SEM da superfície do implante de titânio porosa (Figura A lOOx, Figura B 1 OOOx ) que foi utilizado para o revestimento com rhGDF-5 descrito.

Exemplo 1: Quantificação de 6DF-5 em solução, por RP-HPLC 0 teor de GDF-5 foi determinado por análise de (RP-)-HPLC de fase inversa. Analisaram-se alíquotas da amostra utilizando uma coluna Poros C8-18 (R2/10, 2.1 * 30 mm,

Applied Biosystems), ácido fórmico 0,1% em acetonitrilo a 21% 47 ΕΡ1737734Β1 (solvente A) e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrilo a 84% (solvente B) como solventes, a um fluxo de 0,4 ml/min. O perfil de eluição foi registado medindo a absorvência a 220 nm. As quantidades de GDF-5 foram calculadas a partir da área de pico a 220 nm, utilizando uma curva padrão.

Exemplo 2: Extracção e quantificação da proteína imobilizada A proteína foi extraída por incubação do dispositivo revestido primeiro em HC1 10 mmol/1 durante 3 h à temperatura ambiente. Após ajuste a amostra de PBS para pH 2. As soluções de HC1 que contêm factor de crescimento ósseo extraído foram analisadas por RP-HPLC como descrito no exemplo 1.

Exemplo 3: Determinação de modificações químicas da proteína extraída A quantidade de modificações químicas, i.e. oxidação do factor de crescimento ósseo em soluções que contêm proteína extraída, foi determinada por RP-HPLC. A amostra é aplicada a uma coluna Vydak C8-18 (2 x 250 mm) que foi equilibrada com TFA a 0,15%, acetonitrilo a 20%. Após lavagem da coluna, a eluição do factor de crescimento ósseo ocorre com uma mistura de TFA a 0,1%, e um gradiente por passos de acetonitrilo 20% - 84% (fluxo: 0,3 ml/min). A eluição é observada medindo a absorção a 220 nm. A quantificação é feita através razão da área de pico de espécies modificadas em relação à área de pico total.

Exemplo 4: Determinação da homogeneidade do revestimento de factor de crescimento ósseo em superfícies de titânio, por microscopia de fluorescência 48 ΕΡ1737734Β1

Investigámos a homogeneidade do revestimento de rhGDF-5 no implante de titânio utilizando um marcador de fluorescência para proteínas. A determinação foi realizada por microscopia de fluorescência.

Coloração por Fluorescência da proteína imobilizada:

Os dispositivos revestidos foram preparados como descrito no exemplo 5. Para coloração, adicionaram-se 2,3 μΐ de uma solução 10 mmol/1 de Alexa Fluor™ 488 a 1 ml de uma solução de NaHC03 0,15 M. Os implantes foram incubados em 1 ml da mistura de corante de fluorescência no escuro, durante 4 h, à temperatura ambiente. A razão de proteína: fluoróforo é de 1:10. O implante utilizado como branco foi incubado durante 20 min, apenas. Após o período de incubação os implantes foram extensivamente lavados com água desmineralizada e secos durante 15 min, sob vácuo, no escuro. O sinal de fluorescência foi detectado por microscopia de fluorescência e documentado por um programa de imagiologia.

Nas figuras 11 e 12 a distribuição de rhGDF-5 pode ser claramente determinada por microscopia de fluorescência. Isto significa que o marcador de fluorescência está ligado à proteína. Para excluir quaisquer efeitos do solvente também preparámos um implante que não foi revestido com rhGDF-5, mas foi também incubado com marcador de fluorescência Alexa Fluor™ 488 (dados não apresentados). 49 ΕΡ1737734Β1

Exemplo 5: Revestimento de implantes de titânio com rhGDF-5 0 objectivo deste exemplo era demonstrar a aplicabilidade deste processo de revestimento. Em mais detalhe, testou-se se a metionina como excipiente conservante anti-oxidação tinha um efeito benéfico na taxa de degradação de rhGDF-5. 0 revestimento de teste foi realizado por duas configurações experimentais diferentes e com duas fixações por montagem. A primeira configuração testada foi realizada com o rhGDF-5 reformulado de fresco, em ácido acético 50 mM. Na segunda configuração, testou-se uma solução de revestimento de rhGDF-5 em ácido acético 50 mM, que contém adicionalmente metionina, para avaliar a possibilidade de minimizar a taxa de oxidação. A Tabela 1 dá uma ideia das montagens de revestimento testadas. Todas as amostras foram secas no liofilizador durante quatro horas a cerca de 66 mbar com um condensador de gelo ajustado para cerca de -80°C. As prateleiras de liofilização foram mantidas de forma constante à temperatura ambiente de aproximadamente 20°C, pelo que não ocorreu congelamento e liofilização. Obteve-se uma secagem eficaz por evaporação do solvente e condensação do vapor de solvente no condensador de gelo ultra-frio.

Tab . 1 Esquema das amostras testadas Amostra n.2 Descrição 1.1 Frasco siliconizado 1.2 Frasco siliconizado 2.1 Frasco siliconizado + metionina CN Osl Frasco siliconizado + metionina 50 ΕΡ1737734Β1

Resultados

As observações relativas à degradação de rhGDF-5 das duas experiências, estão resumidas na figura 7. 0 aumento de degradação foi medido de acordo com o processo descrito no exemplo 2. A comparação entre as soluções de revestimento com ou sem adição de metionina não mostram, surpreendentemente, nenhuma diferença significativa em relação a rhGDF-5 na formação de produtos de degradação. Em ambos os casos, apenas se observa um ligeiro aumento da degradação de proteína (< 2%) . Isto pode ser explicado por um efeito estabilizador do ácido acético, que pode actuar como um neutralizador de radicais e, desse modo, actuar como um agente protector de curto prazo. No entanto, esta não influência da metionina é apenas o caso sob condições ideais, num fabrico em pequena escala. No exemplo 7, em que o fabrico em grande escala foi estabelecido e são inevitáveis tempos de espera mais longos, por exemplo de 7 horas no processo de fabrico, esta degradação aumentada da proteína pode ser evitada utilizando metionina.

Em resumo, estes resultados demonstram o revestimento bem sucedido de rhGDF-5 na superfície de um implante metálico. Além disso, foi demonstrada a prova de conceito de um processo de secagem isotérmico. 51 ΕΡ1737734Β1

Exemplo 6: Processo para o revestimento de titânio ou liga de titânio com factor de crescimento ósseo, manualmente ou à escala laboratorial 0 processo de revestimento é realizado sob uma atmosfera de gás inerte, para excluir o oxigénio. Para manter estas condições utiliza-se uma câmara. A câmara consiste de um compartimento hermeticamente fechado, com uma corrente continua de gás inerte, e.g. gás N2. Dentro da câmara, é mantido um ligeiro excesso de pressão. Os materiais necessários para o processo de revestimento são transportados para a câmara através de uma caixa de ar. A câmara permite um processo de revestimento manual. Para a definição e padronização do processo de revestimento, a humidade relativa na câmara é monitorizada e ajustada.

Revestimento:

As folhas de titânio foram limpas, lavadas com água desmineralizada e secas. As folhas de titânio foram revestidas com 60 pg de rhGDF-5. Cada folha foi deitada numa placa e revestida com solução de rhGDF-5 de um lado da folha de metal. O revestimento foi realizado sob atmosfera de gás N2 numa câmara, como descrito acima e a uma temperatura de 0°C a 4°C. Após revestimento, a folha foi seca nas condições respectivas, durante 30 min, sob vácuo.

Extracção: O rhGDF-5 foi incubado primeiro em PBS para mimetizar condições quase fisiológicas. Para manter as amostras praticamente isentas de oxigénio, a solução de PBS foi saturada com gás N2 para as amostras respectivas. Após 52 ΕΡ1737734Β1 incubação em PBS, as folhas foram incubadas em HC1 10 mmol/1 durante 3 h, à temperatura respectiva. O rhGDF-5 nas soluções de extracção foi quantificado por rp-hplc (ver exemplo 1). A quantidade de rh-GDF-5 oxidado também foi determinada por RP-HPLC (ver exemplo 2).

Para ser capaz de comparar amostras revestidas e extraídas como descrito acima, utilizou-se o mesmo procedimento à temperatura ambiente e sob atmosfera de oxigénio.

Tabela 2:

Amostra Atmosfera Temperatura % proteína oxidada após extracção (Média) DP Implante ar TA 10, 0 1,6 Implante N2 O O 5,6 0, 6 Sol mãe ar TA 4,7 O O

Os parâmetros testados nas experiências têm uma influência na quantidade de rhGDF-5 oxidado após extracção a partir de folhas de titânio: Amostras revestidas na presença de oxigénio do ar à temperatura ambiente revelam uma quantidade de rhGDF-5 oxidado de 10,0% ± 1,6% como apresentado na tabela 2.

As amostras processadas a 4°C e sob gás N2 apresentam 5,6% ± 0,6% de rhGDF-5 oxidado após extracção. Em comparação com a solução mãe de rhGDF-5, as amostras processadas a 4°C e gás N2 não revelam nenhuma diferença significativa na quantidade de rhGDF-5 oxidada (4,7% ± 0%). 53 ΕΡ1737734Β1

Exemplo 7: Avaliação do processo à escala industrial

As experiências seguintes demonstram a adequabilidade do processo de revestimento desenvolvido para o fabrico à escala industrial de implantes revestidos, utilizando recipientes siliconizados.

Num primeiro passo, a solução mãe de rhGDF-5 foi reformulada em duas formulações acidicas diferentes com e sem adição de metionina. As formulações foram testadas em termos da sua adequabilidade e estabilidade no recipiente siliconizado, durante o fabrico. Para identificar e quantificar a degradação causada pela fixação de titânio, todas as formulações foram testadas com e sem adição de uma fixação à solução inserida no recipiente siliconizado. Na tabela 3 a seguir é dada uma visão geral da configuração experimental.

Para simular o fabrico à escala industrial, as soluções foram incubadas durante sete horas, a 23°C sob atmosfera de ar normal (cenário pior) . 0 aumento de degradação de proteína resultante foi quantificado em seguida por análise de RP-HPLC. 54 ΕΡ1737734Β1

Tabela 3 Esquema das diferentes formulações de rhGDF-5 testadas rhGDF-5 em HCL 10 mM rhGDF-5 em ácido acético 50mM Sem metionina 10 mM Com metionina 10 mM Sem metionina 10 mM Com metionina 10 mM Solução em recipiente siliconizado #1 #3 #5 #7 Solução em recipiente siliconizado + implante #2 #4 #6 #8

Resultados

Os dados de RP-hplc obtidos são apresentados na figura 8. Os dados para a formulação de rhGDF-5 em HC1 10 mM (colunas vermelhas) mostram que um armazenamento durante 7 horas já afecta um aumento da quantidade de produtos de degradação de rhGDF-5 a partir de uma percentagem inicial de 4,8% até 7,8%. Na presença de uma fixação de titânio, o valor aumentou ainda até 9,3%.

Obtém-se um resultado completamente diferente para as soluções que contêm metionina. A análise mostra um efeito claramente benéfico deste excipiente na taxa de degradação de rGDF-5. Nem a solução isolada, nem a solução com fixação de titânio mostram um aumento significativo da oxidação/desamidação. 55 ΕΡ1737734Β1 A formulação de rhGDF-5 em ácido acético 50 mM também investigada origina resultados bastante semelhantes. Embora o valor inicial esteja 5,2% ligeiramente mais elevado em comparação com a solução mãe de fármaco rhGDF-5 em HC1 10 mM (4,8%), todos os outros valores determinados eram significativamente mais baixos.

Conclusão

Os dados demonstram uma maior estabilidade da formulação de rhGDF-5 em ácido acético para a aplicação no recipiente siliconizado, em comparação com a formulação em HC1. Para todos os parâmetros do processo investigados, a taxa de degradação da formulação de ácido acético é significativamente menor do que o valor correspondente da formulação de HCL convencional. Além disso, esta experiência demonstra claramente um efeito vantajoso da metionina para prevenir a degradação de rhGDF-5 na formulação concebida para a utilização no recipiente siliconizado.

Como resultado desta experiência, a formulação de rhGDF-5 optimizada em relação ao processamento e estabilidade foi identificada como sendo a formulação de rhGDF-5 de ácido acético 50 mM/metionina 10 mM. Adicionalmente, esta experiência é uma primeira prova de conceito para o processo de fabrico em grande escala pretendido.

Exemplo 8: Conformidade de dosagem dos implantes revestidos com rhGDF-5 utilizando recipientes siliconizados O objectivo principal era obter informação detalhada acerca da distribuição de rhGDF-5 entre a superfície do implante e o recipiente siliconizado, em especial em termos 56 ΕΡ1737734Β1 de reprodutibilidade e conformidade de dosagem. Além disso, deve testar-se a possibilidade de utilizar diferentes densidades de revestimento, i.e. doses de proteina por fixação. A deposição controlada de rhGDF-5 entre o recipiente siliconizado e o implante de titânio foi analisada quantificando a quantidade de proteína no implante, bem como a quantidade residual de proteína no recipiente siliconizado. Para esclarecer a questão fizeram-se experiências de deposição controlada com diferentes concentrações de rhGDF-5 na solução de revestimento (34 pg, 122 pg e 298 pg por implante) . Para permitir uma avaliação estatística da conformidade de dosagem de implantes revestidos utilizando este processo, revestiram-se seis fixações por dosagem. Em seguida, o implante e o recipiente correspondente foram analisados separadamente, em termos de quantidade de rhGDF-5 e produtos de degradação de proteína. Para determinar a importância da siliconização do recipiente, a influência em relação à distribuição de rhGDF-5 foi adicionalmente testada numa experiência separada em que não se utilizou nenhum recipiente siliconizado.

Resultados

Em relação à necessidade de utilizar recipientes siliconizados para o revestimento, os dados obtidos apresentados nas figuras 8 e 9 indicam claramente as vantagens em relação à distribuição de proteína entre o recipiente e o implante. Enquanto que para recipientes não tratados mais de 30% de rhGDF-5 permanece no frasco, esta quantidade pode ser massivamente reduzida para 5% quando se utilizam recipientes siliconizados. Este efeito é 57 ΕΡ1737734Β1 particularmente independente da carga absoluta de rhGDF-5 e é reprodutível para todas as dosagens investigadas (34 yg, 121,5 yg e 298 yg por fixação). A tabela 4 resume uma análise estatística da conformidade de dosagem. Apesar do facto de os recipientes utilizados serem fabricados manualmente e terem dimensões diferentes, a conformidade da dosagem parece ser fiável.

Tabela 4 análise estatística da conformidade de dosagem de implantes revestidos

Dosagem teórica Dosagem eficaz por implante Desvio padrão Coeficiente de variação [yg rhGDF-5 por implante] (Recuperação após extracção, valor médio) [%] [%] [% do teórico] 34 (não tratado) 51, 8 6, 5 12,5 34 (siliconizado) 82, 4 5,1 6, 2 121,5 (siliconizado) 85, 8 8,9 10, 4 298 (siliconizado) 94, 9 10,3 10, 9

Com interesse, pode-se observar um efeito benéfico adicional dos recipientes siliconizados na degradação de rhGDF-5. A degradação de rhGDF-5 determinada durante as quatro configurações de revestimento está resumida na tabela 5. A comparação entre recipientes não tratados e siliconizados (com a mesma dosagem de revestimento) mostra 58 ΕΡ1737734Β1 uma degradação de rhGDF-5 1% mais elevada para os recipientes siliconizados.

Tabela 5 análise estatística da degradação de rhGDF-5 de fixações revestidas

Descrição da amostra Degradação de rhGDF-5 Degradação de rhGDF-5 Degradação de rhGDF-5 (Recuperação (causada pelo (causada pelo após procedimento procedimento extracção, de de valor médio) revestimento) revestimento) [% do teórico] [% do teórico] [pg] Solução de revestimento para 34 pg rhGDF-5 /implante 5,1 Implantes revestidos com 34 pg rhGDF-5 /implante (revestimento não tratado) 7,7 2, 6 0,9 Implantes revestidos com 34 pg rhGDF-5 /implante (recipiente siliconizado) 6, 6 1,5 0, 5 Solução de revestimento para 121,5 pg rhGDF-5 /implante 5,3 Implantes revestidos com 34 5, 8 0,5 0, 6 59 ΕΡ1737734Β1 pg rhGDF-5 /implante (recipiente siliconizado)

Solução de 4,6 revestimento para 298 pg rhGDF-5 /implante

Implantes 4,8 0,2 0,6 revestidos com 298 pg rhGDF-5 (recipiente siliconizado)

Adicionalmente, os dados mostram que com uma dosagem de revestimento crescente a percentagem de degradação de rhGDF-5 foi suprimida de 6,6% para uma dosagem de 34pg por implante, até 4,8% para uma dosagem de 2 98 pg por implante. Com o conhecimento da quantidade inicial de degradação da solução de revestimento, a quantidade absoluta de degradação de rhGDF-5 causada pelo procedimento de revestimento foi calculada com aproximadamente 0,5 pg por implante para recipientes siliconizados, independentemente da dosagem de revestimento. Para recipientes não tratados, este valor é com aproximadamente 0,9 pg, duas vezes mais elevado.

Conclusão

Os dados apresentados mostram que se pode obter um revestimento reprodutível com rhGDF-5 em relação à distribuição de proteína entre o implante e o recipiente e a conformidade de dosagem, utilizando recipientes siliconizados. 60 ΕΡ1737734Β1

Exemplo 9: Determinação da distribuição homogénea de implantes revestidos com rhGDF-5 analisada por microscopia de fluorescência

Uma vez que os dados de RP-HPLC não permitem monitorizar a informação relativa à homogeneidade do revestimento na superfície do implante, utilizámos microscopia de fluorescência para obter informação detalhada da distribuição de proteína na superfície do implante. A homogeneidade do revestimento de rhGDF-5 foi analisada utilizando um microscópio de fluorescência, como descrito no exemplo 4. As primeiras amostras analisadas eram implantes obtidos a partir da experiência 8 anteriormente descrita e foram revestidos com 298 pg de rhGDF-5 por implante.

Para identificar os parâmetros que são responsáveis pela possível não homogeneidade do revestimento de proteína, fizeram-se análises visuais detalhadas do processo de secagem. Para este fim, registámos todo o processo com uma câmara digital. Com base nestes resultados, verificámos que podiam surgir bolhas de ar na superfície porosa do implante (ver figura 13) durante o abaixamento da pressão no liofilizador.

Numa tentativa adicional para optimizar as condições de revestimento, variámos alguns parâmetros que têm efeito na distribuição de proteína: ♦ A pressão; para permitir molhar completamente, em particular também dentro dos poros na superfície do implante. Alterámos o vácuo desde um nível de pressão constante até um perfil de pressão pulsada concebido. 61 ΕΡ1737734Β1 • A posição do implante no recipiente em posição direita vs. posição invertida, porque a forma cónica do implante permite que as bolhas de ar se escapem do recipiente mais facilmente. • A forma do recipiente.

Os resultados de teste com ambas as posições do implante no recipiente e parâmetros de secagem optimizados são apresentados na figura 11. As figuras demonstram que os implantes secos na posição invertida têm um revestimento simétrico radial vantajoso com alguma concentração de proteína na cabeça do implante.

Lisboa, 5 de Novembro de 2010. 62

Claims

ΕΡ1737734Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o revestimento de um dispositivo com uma substância que compreende os passos de: (a) proporcionar um recipiente com um espaço para receber o referido dispositivo a ser revestido, (b) proporcionar no referido espaço uma solução da referida substância de revestimento, (c) inserir o referido dispositivo na referida solução da referida substância no referido recipiente, em que a ordem dos passos (b) e (c) pode ser invertida e (d) iniciar a secagem isotérmica do referido dispositivo enquanto o mesmo está localizado no referido recipiente em contacto com a referida solução, removendo desse modo os componentes voláteis da referida solução da referida substância.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida substância é uma substância farmaceuticamente activa.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a referida substância farmaceuticamente activa é uma proteína, péptido, polissacárido ou um glicolípido, ou uma molécula pequena:
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a referida substância farmaceuticamente activa está imobilizada num material inorgânico ou orgânico, bioabsorvível. 1 ΕΡ1737734Β1
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a referida substância farmaceuticamente activa é uma proteína osteoindutora dissolvida.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a referida proteína osteoindutora é um membro da família de TGF-β.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o referido membro da família de TGF-β é um membro da subfamília de BMP de preferência BMP2 ou BMP 7.
8. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o referido membro da família TGF-β é uma proteína do grupo constituído por GDF-5, GDF-6, e GDF-7.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida substância compreende ingredientes não activos.
10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida substância compreende fosfatos de cálcio.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido recipiente do dispositivo é o seu recipiente de embalagem.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida solução é uma solução aquosa ou um solvente orgânico.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida solução é uma solução aquosa ácida. 2 ΕΡ1737734Β1
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida solução contém um antioxidante.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o referido antioxidante é metionina ou seus derivados.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido dispositivo é feito de metal ou liga metálica, de preferência titânio ou uma liga de titânio ou fosfato de cálcio, de preferência β-fosfato tricálcico.
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido dispositivo é um implante dentário, ou um "stent" coronário.
18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a superfície interna do referido recipiente é revestida com uma camada cozida de um material hidrófobo, em que o referido revestimento influencia o coeficiente de distribuição da substância a ser utilizada para revestir o referido dispositivo entre o referido recipiente e o referido dispositivo.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o referido material hidrófobo é silicone ou ptfe,
20. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o referido recipiente de embalagem compreende um receptáculo para receber o referido dispositivo a ser revestido, em que o referido receptáculo está adaptado em tamanho e forma ao tamanho e forma do referido dispositivo. 3 ΕΡ1737734Β1
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda o passo de aplicar vácuo para remover bolhas de ar, antes do passo (d).
22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo (d) é realizado a cerca de 100 hPa à temperatura ambiente.
23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo (d) é realizado utilizando um condensador de gelo.
24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda o passo de evacuar o referido recipiente, ventilar com azoto e fechar o referido recipiente sob azoto.
25. Recipiente de revestimento e embalagem para um dispositivo em que o referido recipiente compreende um receptáculo que está localizado coaxialmente no invólucro do recipiente, estando o referido receptáculo para receber o referido dispositivo a ser revestido adaptado de um modo tal que o referido dispositivo pode ser revestido com uma substância directamente no referido recipiente, em que a superfície interna do referido receptáculo é revestida com uma camada de material inerte e repelente.
26. Recipiente de acordo com a reivindicação 25, em que o referido receptáculo está adaptado em forma e tamanho à forma e tamanho do referido dispositivo. 4 ΕΡ1737734Β1
27. Recipiente de acordo com a reivindicação 25, em que o referido revestimento inerte e repelente é de um material hidrófobo ou hidrófilo.
28. Recipiente de acordo com a reivindicação 27, em que o material hidrófobo é silicone ou PTFE.
29. Recipiente de acordo com a reivindicação 25, em que o referido suporte do recipiente compreende uma abertura para receber o referido dispositivo e a referida substância de revestimento e uma porção inferior está localizada oposta à referida abertura, estando a referida abertura do referido invólucro e a referida abertura do referido receptáculo alinhadas uma com a outra e em que o referido receptáculo está ligado na sua porção inferior à porção inferior do referido invólucro.
30. Recipiente de acordo com a reivindicação 29, em que a porção de abertura do referido receptáculo está espaçada da porção de abertura do referido invólucro.
31. Utilização do referido processo de revestimento de um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 para melhorar a distribuição homogénea do revestimento no dispositivo.
32. Kit que compreende um recipiente de revestimento e embalagem de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30 e um dispositivo revestido obtido pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24. Lisboa, 5 de Novembro de 2010. 5