PT1676579E - Utilização de tetraciclinas sub-antimicrobianas para o tratamento de rosácea ocular - Google Patents

Description

ΕΡ 1 676 579/PT DESCRIÇÃO "Utilização de tetraciclinas sub-antimicrobianas para o tratamento de rosácea ocular"

Antecedentes da invenção A disfunção das glândulas de Meibom é o distúrbio mais comum do filme lacrimal e da superfície ocular causador de irritação ocular. A incidência da doença aumenta com a idade, e ocorre em cerca de 50% dos pacientes com a doença de pele rosácea. Uma estimativa conservadora do número de pacientes afectados por esta condição é de 10 milhões nos Estados Unidos apenas. Referiu-se que 15% dos pacientes com rosácea ocular desenvolvem erosões epiteliais recorrentes da córnea, o que é um problema potencialmente ameaçador para a visão.

As queixas comuns dos pacientes que sofrem de disfunção das glândulas de Meibom incluem visão turva ou embaçada, ardor ou sensação de corpo estranho no olho, fotofobia, e dor suficientemente grave para acordar uma pessoa. Embora os pacientes com esta condição tenham uma produção normal de lágrimas aquosas pelas suas glândulas lacrimais, as suas glândulas de Meibom podem atrofiar e isto é frequentemente acompanhado de metaplasia do epitélio ductal destas glândulas. Observa-se frequentemente anterior erosão da junção mucocutânea da pálpebra, bem como infecção da pálpebra e conjuntiva, irregularidade da margem palpebral, alterações no epitélio corneano e vascularização da córnea.

Os mecanismos responsáveis pelas alterações nas superfícies palpebral e ocular, e os sintomas de irritação experimentados pelos pacientes com disfunção das glândulas de Meibom eram até agora desconhecidos. Por isso, os tratamentos anteriores da disfunção das glândulas de Meibom estavam direccionados apenas ao tratamento do que se presumia ser infecção nas pálpebras ou das glândulas de Meibom, ou tinham certas desvantagens que tornavam impraticável a sua aplicação por períodos de tempo prolongados. Por exemplo, pacientes com disfunção das glândulas de Meibom eram tratados sintomaticamente com lágrimas artificiais, mas estes agentes, quando resultavam, era apenas numa pequena melhoria. A 2

ΕΡ 1 676 579/PT aplicação tópica de esteróides nas superfícies palpebral ou ocular é eficaz como terapia intermitente a curto prazo. No entanto, os esteróides não são boas soluções a longo prazo devido aos seus potenciais efeitos colaterais, por exemplo, catarata e glaucoma. Actualmente, a disfunção das glândulas de Meibom não é curável nem reversível; por isso, os pacientes com esta condição devem ser tratados durante toda a vida. A administração oral de tetraciclinas e dos seus análogos (por exemplo, a doxiciclina e a minociclina) com actividade antibiótica é usada vulgarmente como forma eficaz de tratamento terapêutico ou profiláctico da disfunção das glândulas de Meibom. 0 mecanismo das tetraciclinas no tratamento da disfunção das glândulas de Meibom não é conhecido, mas tem sido relatado algum alívio dos sintomas. No entanto, uma desvantagem da administração oral de tetraciclinas ou de análogos de tetraciclina com actividade antimicrobiana no tratamento da disfunção das glândulas de Meibom é que uma elevada percentagem dos pacientes não tolera tetraciclinas orais durante longos períodos de tempo. A intolerância a tetraciclinas pode manifestar-se em problemas gastrointestinais, como por exemplo, dor epigástrica, náuseas, vómitos e diarreia, ou outros problemas relacionados com o consumo prolongado de antibióticos orais, tal como candidíase das mucosas. Presentemente, não existem tratamentos prolongados para a disfunção das glândulas de Meibom.

Recentemente, foi revelado que a tetraciclina e os seus análogos possuem efeitos antimicrobianos inflamatórios (por exemplo, redução de IL-1 e produção de óxido nítrico) e inibem a síntese e activação das MMPs. As tetraciclinas foram descritas como sendo eficazes no tratamento de doenças em que estão implicadas inflamação crónica e destruição tecidular devido à actividade aumentada da colagenase. Estas doenças incluem artrite reumatóide, ulceração estéril da córnea, e periodontite.

Certas modificações da estrutura química da tetraciclina resultam num análogo de tetraciclina destituído de actividade antimicrobiana. Estas tetraciclinas quimicamente modificadas não antimicrobianas (CMTs) mantêm as suas actividades anti- 3

ΕΡ 1 676 579/PT inflamatórias e anticolagenoliticas. A administração tópica de tetraciclinas antimicrobianas ou de CMTs não antimicrobianas, e a administração oral de CMTs não antimicrobianas representam um grande avanço na terapia de pacientes com disfunção das glândulas de Meibom porgue ambas as modalidades de tratamento eliminam a toxicidade sistémica e irão permitir a administração destes agentes terapêuticos para esta doença crónica por toda a vida. A utilização de tetraciclinas em guantidades antimicrobianas no tratamento de rosácea ocular é conhecida na arte. Por exemplo, "Ocular Rosacea" (Quaterman et al., Arch. Dermatol. 1997, vol. 133, pp. 49-54) divulga o uso de 100 mg/dia de doxiciclina; "Oxytetracycline in the treatment of ocular rosacea: a double blind trial" (Bartholomew et al., Br. J. Ophthalmology, 1982, vol. 66, pp. 386-388) divulga o uso de 500 mg/dia de oxitetraciclina; "Ocular Rosacea"(Browning et al., Survey of Ophthalmology, 1986, vol. 31, No. 3, pp. 145-158) divulga o uso de 500 a 1000 mg/dia de tetraciclina, "Tetracyclines in Ophthalmology" (Salamon, Survey of Ophthalmology, 1985, vol. 29, No. 4, pp. 265-275) divulga o uso de 1000 mg/dia de tetraciclina; e "Meibomian gland dysfunction and tear film abnormalities in rosacea" (Zengin et al., Cornea, 1995, 14 (2), pp. 144-146) divulga o uso de 100 mg/dia de tetraciclina.

Breve resumo da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se a utilização de uma tetraciclina no fabrico de um medicamento para tratar um paciente portador de rosácea ocular, através da administração oral ou tópica num olho do paciente de uma quantidade eficaz do referido medicamento, em que a referida quantidade não tem um efeito antimicrobiano significativo in vitro ou in vivo. como

Numa concretização preferida, a presente invenção diz respeito à administração tópica de uma quantidade eficaz de uma tetraciclina antimicrobiana ou de um seu análogo, ou um análogo não antimicrobiano da tetraciclina. Os análogos não antimicrobianos da tetraciclina são comummente referidos e aceites na literatura cientifica como "tetraciclinas quimicamente modificadas" (CMTs). 4

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Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 mostra as concentrações de IL-Ια no fluido lacrimal de grupos de indivíduos constituídos por pacientes com rosácea, controlos ideais, e controlos na mesma faixa etária. A Fig. 2 é uma representação gráfica da actividade da gelatinase em função das concentrações de IL-Ια em pacientes controlo normais (NL) e pacientes com disfunção das glândulas de Meibom (DGM). A Fig.3 é uma representação gráfica da concentração lacrimal de fluoresceína em função da concentração de IL-α em pacientes controlo normais (NL) e em pacientes com disfunção das glândulas de Meibom (DGM). A Fig. 4 é uma representação gráfica da actividade da concentração lacrimal de fluoresceína em função da actividade da gelatinase em pacientes controlo normais (NL) e em pacientes com disfunção das glândulas de Meibom (DGM). A Fig. 5 mostra a concentração (pg/ml) de IL-1 madura em sobrenadantes de culturas de células epiteliais da córnea humana. Meio = controlo negativo; LPS = culturas tratadas com lipopolissacárido durante 24h; LPS MP = culturas tratadas com LPS e com o corticosteróide metilprednisolona durante 24h; LPS Doxi = culturas tratadas com LPS e doxiciclina (5pg/ml) durante 24h. A Fig. 6 mostra a razão entre as formas madura e precursora de IL-Ια em sobrenadantes de culturas de células epiteliais da córnea humana. Meio = controlo negativo; LPS = culturas tratadas com lipopolissacárido durante 24h; LPS MP = culturas tratadas com LPS e com o corticosteróide metilprednisolona durante 24h; LPS Doxi = culturas tratadas com LPS e doxiciclina (5 pg/ml) durante 24h. A Fig. 7 mostra a concentração (pg/ml) de IL-1RA em sobrenadantes de culturas de células epiteliais da córnea humana. Meio = controlo negativo; LPS = culturas tratadas com lipopolissacárido durante 24h; Doxi = culturas tratadas com 5 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ doxiciclina (5μg/ml) durante 24h; CMT 3 = culturas tratadas com tetraciclina quimicamente modificada CMT 3 (1 μg/ml) durante 24 h; Doxi + LPS = culturas tratadas com LPS e doxiciclina (5 pg/ml) durante 24h; CMT 3 + LPS = culturas tratadas com LPS e tetraciclina quimicamente modificada CMT 3 (1 pg/ml) durante 24 hr. A Fig. 8 é um zimograma em gelatina de sobrenadante de células epiteliais da córnea humana: tratamento com doxiciclina e activação com MMP-3. Legenda das faixas: (1) padrão de pro-MMP-9 purificada de 92 kDa (0,1 ng) (2); sobrenadante de epitélio corneano + 50 pg/mL de doxiciclina; (3) sobrenadante + 50 pg/mL de doxiciclina + 1,5 ng/pL de MMP-3; (4) sobrenadante + 100 pg/mL de doxiciclina + 1,5 ng/pL de MMP-3; (5) sobrenadante de cultura de células pré-tratadas com doxiciclina; (6) Sobrenadante de cultura de células pré-tratadas com doxiciclina +1,5 ng/pL de MMP-3.

Descrição detalhada da invenção

Numa concretização preferida, esta invenção refere-se ao uso de tetraciclinas antimicrobianas aplicadas topicamente, incluindo tetraciclina ou um seu análogo, ou tetraciclinas quimicamente modificadas (CMTs) administradas por via oral ou tópica, para o tratamento de um paciente com disfunção das glândulas de Meibom. O tratamento de um paciente com disfunção das glândulas de Meibom inclui reduzir ou contrariar os sintomas de irritação ocular, drenagem lacrimal retardada, erosão recorrente do epitélio corneano ou deficiência aquosa do fluido lacrimal. As CMTs não possuem actividade antimicrobiana. Para efeitos da presente invenção, a tetraciclina e os seus análogos com actividade antimicrobiana são denominados "tetraciclinas antimicrobianas" e os análogos de tetraciclina destituídos de actividade antimicrobiana são denominados "CMTs".

Recentemente, constatámos que os pacientes com disfunção das glândulas de Meibom exibem uma drenagem lacrimal significativamente retardada, um tempo curto de ruptura lacrimal (muitas vezes instantâneo) e instabilidade do filme lacrimal. Além disso, verificou-se que os pacientes com disfunção das glândulas de Meibom possuem concentrações 6 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ significativamente mais elevadas da citocina pró-inflamatória, a interleucina 1 alfa (IL-Ια) no seu fluido lacrimal. A IL-Ια foi descrita como tendo vários efeitos biológicos, incluindo o aumento da expressão de moléculas de adesão pelas células vasculares endoteliais e epiteliais que facilitam a ligação de células inflamatórias, a indução da expressão de citocinas quimiotáticas tais como a interleucina 8, a estimulação da produção de prostaglandinas que aumentam a permeabilidade vascular e a dor, a estimulação da produção de óxido nítrico que provoca vasodilatação e vermelhidão, e a estimulação da produção de enzimas degradantes da matriz, denominadas matriz-metaloproteinases (MMPs), por vários tipos de células, incluindo o epitélio das mucosas.

Constatámos que a actividade de um membro da família das MMP, a MMP-9 (também denominada gelatinase B) , encontra-se significativamente aumentada no fluido lacrimal de pacientes com disfunção das glândulas de Meibom associada a rosácea, comparado com pacientes assintomáticos normais. Além disso, a actividade da gelatinase B parece estar inversamente correlacionada com a drenagem lacrimal.

Estes dados indicam que as tetraciclinas antimicrobianas e os análogos de tetraciclina e as CMTs possuem actividades biológicas capazes de neutralizar os factores inflamatórios e degradantes da matriz, os quais se constataram nos nossos estudos como estando fortemente relacionados com o desenvolvimento da rosácea ocular.

Vantajosamente, as tetraciclinas ou CMTs aplicadas topicamente podem ser mais eficazes devido às concentrações mais altas que podem ser atingidas no local da doença. Devido à sua falta de efeito bacteriano antimicrobiano e à sua maior actividade terapêutica, as CMTs podem ter menos efeitos sistémicos ou outros efeitos colaterais do que as tetraciclinas quando administradas por via oral ou tópica. A administração tópica de um análogo de tetraciclina numa pomada (por exemplo, oxitetraciclina) ou em solução (por exemplo, colírio de doxiciclina), a pacientes com disfunção 7 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ das glândulas de Meibom associada a rosácea resultou na resolução completa dos sintomas em 73% (8 de 11) dos pacientes tratados com a pomada de análogo de tetraciclina, e em mais de 90% (10 de 11) dos pacientes tratados com a solução de análogo de tetraciclina. Vários pacientes que tinham anteriormente utilizado tetraciclina oral afirmaram que a melhoria nos seus sintomas foi mais evidente com oxitetraciclina aplicada topicamente do que com tetraciclina administrada oralmente. Três pacientes apresentaram alivio moderado, se bem que não completo, dos sintomas. Três outros pacientes experimentaram ardor devido à medicação, um dos quais interrompeu o tratamento. A tetraciclina utilizada na presente invenção pode ser qualquer uma das tetraciclinas farmaceuticamente aceitáveis de fácil obtenção conhecidas na arte médica. Neste grupo de tetraciclinas constam exemplos tais como clorotetraciclina, que é comercializada sob os nomes comerciais Acronize, Aureocina, Aureomycin, Biomitsin, Biomicyn e Chrysomykine; Demecliciclina comercializada como Ledermicyn, Detravis, Meciclin e Mexocine; Doxiciclina comercializada como Vibramycin, Vibramycin Hyclace, Liomycin, Vibradox, Panamycin, Titradox, Hydramycin, Tecacin; Limeciclina que é comercializada como Armyl, Mucomycin, Tetramyl, Tetralysal; Metaciclina que é comercializada como Adriamicina, Cyclobiotic, Germicilclin, Globociclina, Megamicyne, Pindex, Londomycin, Optimycin, Rondomycin; Minociclina que é comercializada como Minocin, Klinomycin, Vectrin; Oxitetraciclina que é comercializada como Biostat, Oxacycline, Oxatets, Oxydon, Oxymycin, Oxytan, Oxytetracid, Ryomycin, Stezazin, Tetraject, Terramycin, Tetramel, Tetran, Dendarcin; Rolitetraciclina comercializada como Bristacin, Reverin, Superciclin, Syntetrex, Syntetrin, Synotodecin, Tetraverin, Transcycline, Velacicline, Velacycline; e Tetraciclina que é comercializada como Achromycin, Ambramycin, Cyclomycin, Polycycline, Tetrabon e Tetracyn.

Os sais activos que são formados através da protonação do grupo dimetilamino no átomo de carbono 4 existem como compostos cristalinos e são muito estáveis em água. No entanto, estes antibióticos anfotéricos cristalizam em 8 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ soluções aquosas dos seus sais a menos que sejam estabilizados com um excesso de ácido. Os sais de cloridrato são usados comummente para administração oral. Sais solúveis em água podem ser também obtidos a partir de bases, tal como os hidróxidos de sódio ou de potássio, mas não são estáveis em solução aquosa, e podem também ser formados com metais divalentes e polivalentes.

As tetraciclinas ou CMTs utilizadas de acordo com a presente invenção são de preferência administradas por via oral. Dose terapêutica antibiótica normal significa a dosagem do especifico composto de tetraciclina que é comummente utilizado e recomendado para tratamento de infecções bacterianas. Uma dose sub-antimicrobiana significa uma dose que não tem um efeito antimicrobiano significativo in vitro ou in vivo. A dose terapêutica antibiótica normal de tetraciclina está, na maior parte dos casos, bem estudada e documentada.

As tetraciclinas e as tetraciclinas quimicamente modificadas para administração tópica podem ser adicionadas a soluções aquosas tamponadas e equilibradas de electrólitos, soluções aquosas tamponadas e equilibradas de electrólitos com um polímero lubrificante, uma pomada à base de óleo mineral ou vaselina, outros óleos, lipossomas, ciclodextrinas, polímeros de libertação sustentada ou géis. Estas preparações podem ser administradas no filme lacrimal pré-ocular ou na pele ou margem palpebrais 1 a 6 vezes por dia durante um período que pode ser a vida toda do paciente. Por exemplo, uma solução de gotas oftálmicas compreendendo doxiciclina como princípio activo foi preparada dissolvendo pó de cloridrato de doxiciclina de qualidade farmacêutica numa solução de sal equilibrada em electrólitos (BSS™, Alcon, Ft. Worth, TX), para dar uma concentração final de 0,025%.

Numa concretização preferida, os compostos úteis de acordo com a presente invenção são tetraciclinas que foram quimicamente modificadas de modo a eliminar ou reduzir substancialmente as suas propriedades antimicrobianas e a aumentar a sua actividade antimicrobiana inflamatória. São revelados métodos para reduzir as propriedades antimicrobianas de uma tetraciclina em The Chemistry of the 9

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Tetracyclines, Cap. 6, Mitscher (ed.), pp. 211. Conforme salientado por Mitscher, alterações nas posições 1, 2, 3, 4, 10 e 12 podem levar à perda da actividade antimicrobiana. Estas tetraciclinas quimicamente modificados (CMTs) estão incluídas na concretização preferida da presente invenção, uma vez que podem ser utilizadas sem perturbar a flora microbiana normal do mamífero tratado como aconteceria no caso de exposição prolongada a tetraciclinas antimicrobianas.

As CMTs preferíveis utilizadas de acordo com a presente invenção incluem aquelas destituídas de uma cadeia lateral de dimetilamino na posição 4. Por exemplo, 4-desdimetilamino-tetraciclina, 4-desdimetilamino-5-oxitetraciclina, 4- desdimetilamino-7-clorotetraciclina, 4-hidroxi-4-desdimetil-aminotetraciclina, 4-desdimetilamino-12a-desoxitetraciclina, 4-desdimetilamino-11-hidroxi-12a-desoxitetraciclina, 4-desdimetilamino-7-dimetilaminotetraciclina, 6-dimetil-6-desoxi-4-desdimetilaminotetraciclina, 6-o-desoxi-5-hidroxi-4-desdimetilaminotetraciclina, 1la-clorotetraciclina, 12a-desoxitetraciclina, e os análogos 2-nitrilo de tetraciclina. A dosagem das tetraciclinas administradas na presente invenção depende ainda da idade e do peso do paciente, do modo de administração, bem como do tipo e da gravidade da doença inflamatória ou degradante da matriz a ser tratada. No caso de uma tetraciclina não antimicrobiana, por exemplo, 4-desdimetilaminotetraciclina, a dose pode ser de 0,1-30 mg/kg/dia. No entanto, em ambos os casos, o método preferido de tratamento inclui composições de tetraciclina ou de CMTs administradas topicamente nos olhos em transportadores farmacêuticos adequados. 0 transportador farmacêutico pode estar na forma de solução, suspensão, pomada, gel, ou qualquer outra forma adequada de administração tópica da tetraciclina, ou administração tópica ou oral das CMTs ao mamífero afectado. Para administração oral, as CMTs utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas na forma de comprimidos, cápsulas, elixires, ou afins. Além disso, as tetraciclinas ou CMTs da presente invenção podem ser razoavelmente incorporadas num sistema transportador à base de polímero para administração pelas vias tópica, subconjunctival, ou oral. Em adição, contemplam-se outros meios de administração, tais como injecção quer por via intravenosa ou intramuscular. 10 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ

Os exemplos a seguir descrevem em pormenor composições e métodos ilustrativos da presente invenção. Para os peritos na especialidade será evidente que se podem fazer muitas modificações, tanto de materiais como de métodos, sem fugir à finalidade e intenção desta divulgação.

Exemplo 1: Identificação do aumento nas concentrações de IL-Ια em pacientes com disfunção das glândulas de Meibom

Num dos estudos, as concentrações de Interleucina-l-alfa (IL-Ια), do Factor de Necrose Tumoral α (TNF-α), e do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) no fluido lacrimal de pacientes com rosácea ocular foram comparadas com as concentrações em pacientes normais (controlos).

Catorze (14) pacientes com disfunção grave das glândulas de Meibom, rosácea facial, e sintomas de irritação ocular foram examinados quanto a doença da superfície ocular, produção lacrimal e taxa de drenagem lacrimal (TCR). Na avaliação da disfunção das glândulas de Meibom, estas foram examinadas por biomicroscopia com lâmpada de fenda e classificadas quanto à presença de metaplasia do orifício, expressão de Meibom e secreção das glândulas de Meibom, e perda de glândulas de Meibom acinares, como descrito anteriormente e conhecido na literatura científica. Doze (12) controlos, distribuídos de acordo com a faixa etária, e quinze (15) normais ideais foram avaliados segundo os mesmos parâmetros.

Amostras de lágrimas ligeiramente estimuladas (20 μΐ) foram retiradas de cada indivíduo e analisadas por meio de um ensaio de sanduíche ELISA para detecção de IL-Ια, TNF-a, e EGF. Os ensaios de sanduíche ELISA para EGF, IL-Ια e TNF-a foram realizados utilizando kits comerciais (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Antes de cada análise, o analista extraiu lágrimas de forma simulada das varetas saturadas por centrifugação a 3 500 g durante 5 minutos dentro da ponta da pipeta.

As amostras de ambos os olhos de cada paciente foram combinadas. As varetas e as pontas de pipeta foram retiradas cuidadosamente e as lágrimas foram aspiradas (2 μΐ para a 11

ΕΡ 1 676 579/PT análise de EGF e 4 μΐ para as análises de IL-Ια e TNF-a) e diluídas em tampão ELISA (fornecido pelo fabricante) até um volume final de 200 μΐ. As amostras lacrimais foram transferidas para os poços de uma placa de microtitulação e o ensaio ELISA foi realizado de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. As concentrações de citocina foram determinadas a partir da curva padrão como descrito na literatura. Os resultados das análises da concentração de citocina para cada grupo de indivíduos estão apresentados na Tabela 1 a seguir. TABELA 1: Concentrações Lacrimais de Citocinas Inflamatórias Grupo de Indivíduos Factor de Necrose Tumoral α (pg/ml) Interleucina-la (pg/ml) Pacientes com Rosácea <10 pg/ml 45,4 ± 4,6 Controlos na mesma faixa etária <10 pg/ml 22,6 ± 5,0 (p=0,003) Controlos ideais <10 pg/ml 17,1 ± 3,4 (p<0,001)

Os valores de P listados para cada grupo controlo foram derivados pela comparação do valor médio daquele grupo com o valor médio da mesma variável no grupo com rosácea. A concentração lacrimal de IL-Ια encontrava-se significativamente mais elevada em pacientes com rosácea do que nos controlos da mesma faixa etária (p = 0,003) e do que nos controlos normais ideais (p <0,00 1) (Fig. 1). Não se detectou TNF-α nem nos pacientes nem nos controlos, sinal de que os níveis eram inferiores a 10 pg/ml. O EGF não se encontrava significativamente mais elevado nos pacientes com rosácea do que nos controlos da mesma faixa etária. A Drenagem Lacrimal (TCR) era significativamente inferior nos pacientes com rosácea em relação tanto aos controlos na mesma faixa etária (p = 0, 048) como aos controlos ideais (p = 0,002). Os valores de Schirmer I eram estatisticamente inferiores nos pacientes com rosácea relativamente aos controlos ideais (p = 0,013), mas não em relação aos controlos da mesma faixa etária. A concentração de IL-Ια foi correlacionada inversamente com a drenagem lacrimal LN (TCR) (r = 0,58, p<0, 0001) e com Schirmer I (r = -0,39, p = 0,012) .

Assim, concluiu-se que a IL-Ια está presente em lágrimas em condições normais mas a sua concentração aumenta na presença de rosácea ocular, ao passo que a concentração de 12 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ TNF-α não. A drenagem lacrimal reduzida LN (TCR) , a sua correlação inversa com a IL-Ια e a ausência de TNF-α nas lágrimas destes pacientes, sugere que o aumento observado na concentração de IL-Ια pode ser em grande parte devido ao deficiente aclaramento das citocinas que são normalmente produzidas na superfície ocular.

Em resumo, existe um aumento diferenciado no nível da citocina inflamatória IL-Ια no fluido lacrimal em pacientes com rosácea ocular. Grande parte deste aumento pode ser causado pela redução na drenagem lacrimal, que pode incentivar a estagnação das lágrimas e perpetuar a inflamação da superfície ocular, estimulando a produção de moléculas inflamatórias.

Exemplo 2: Correlação da actividade da gelatinase com a concentração de IL-Ια e com a drenagem lacrimal 0 aclaramento lacrimal de fluoresceína foi correlacionado com a concentração de IL-Ια e com a actividade da gelatinase de 92 kD (MMP 9) nas lágrimas dos pacientes. Avaliaram-se treze pacientes com rosácea ocular (incluindo 1 paciente com erosão epitelial recorrente, 2 pacientes com infiltrados corneanos periféricos recorrentes e vascularização, e 2 pacientes com distrofia da membrana basal epitelial) e 13 indivíduos normais com produção normal de lágrimas aquosas e sem sintomas de irritação. 0 aclaramento lacrimal da fluoresceína foi avaliado através da medição de fluorescência no fluido lacrimal recolhido do menisco lacrimal inferior 15 minutos após a instilação de 5 ml de fluoresceína de sódio a 2% com um Cytofluor II. A IL-Ια foi analisada por ELISA com um kit de R&D Systems. A actividade da gelatinase foi avaliada por zimografia em gelatina, comparando a actividade das lágrimas com gelatinase de 92kD purificada (MMP 9).

Em comparação com os controlos normais, os pacientes com rosácea ocular apresentaram maior atraso no aclaramento da fluoresceína (p <0,001), maior concentração lacrimal de IL-la (p <0,001), e maior actividade da gelatinase de 92 kD (p <0,001). A concentração lacrimal de IL-Ια foi correlacionada com a actividade da gelatinase (rho = 0,58, p 13 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ <0,002) (Fig. 2); a drenagem lacrimal retardada foi correlacionada com a elevada concentração lacrimal de IL-la (rho = 0,84, p <0,001) (Fig. 3) e com a actividade aumentada da gelatinase (rho = 0,84, p <0,001) (Fig. 4).

Exemplo 3: Drenagem lacrimal reduzida em irritação ocular É vulgar encontrar uma drenagem lacrimal reduzida na maioria dos pacientes com irritação ocular independentemente da sua produção lacrimal. Quarenta (40) pacientes com uma queixa maior de irritação ocular e quarenta (40) controlos assintomáticos de distribuição etária semelhante foram testados para correlacionar e comparar um novo método de medição do aclaramento lacrimal da fluoresceina e o teste de Schirmer 1 com a gravidade dos sintomas de irritação ocular, a presença de disfunção das glândulas de Meibom, os resultados da coloração da córnea com fluoresceina, e a sensibilidade da córnea e da conjuntiva. Todos os indivíduos preencheram um questionário de sintomatologia e fizeram um exame ocular de linha base, um teste de aclaramento da fluoresceina (FCT) e o teste de Schirmer. Métodos. O teste de aclaramento da fluoresceina (FCT) foi realizado através da medição da concentração de fluoresceina em amostras de lágrimas ligeiramente estimuladas colhidas do menisco lacrimal inferior 15 minutos após a instilação de 5 μΐ de fluoresceina de sódio a 2% com um fluorofotómetro Cytofluor 11. A gravidade da irritação ocular foi avaliada através de um questionário de sintomatologia.

Todos os indivíduos foram avaliados através do teste de Schirmer 1, a avaliação biomicroscópica das glândulas de Meibom, a coloração da córnea com fluoresceina e a sensibilidade da conjuntiva e da córnea com o anestesiómetro de Cochet-Bonnet.

Resultados. Os sintomas de irritação correlacionaram com os valores maiores do log da concentração lacrimal de fluoresceina (pacientes sintomáticos 3,08 ± 0,62 unidades/μΐ, controlos normais 1,89 ± 0,7 unidades/μΐ, p <0,005) e com os resultados mais baixos do teste de Schirmer 1 (sintomático 12,6 mm, controlo normal 22,3 mm, p <0, 005). O teste de 14 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ aclaramento da fluoresceína apresentou um valor preditivo maior para a identificação da irritação ocular do que o teste de Schirmer 1.

Exemplo Comparativo 4: Terapia com doxiciclina melhora a drenagem lacrimal e reduz a concentração de IL-1 no fluido lacrimal

Seis pacientes foram tratados por via oral com 50 mg de doxiciclina oral, duas vezes por dia durante 3 semanas. Observou-se melhoria dos sintomas de irritação em 5 dos 6 pacientes. Além disso, todos os pacientes registaram redução da hiperemia conjuntival e da coloração da córnea com fluoresceína. Uma melhoria no aclaramento da fluoresceína foi observada em 5 dos 6 pacientes assim como uma redução na concentração de IL-1 no fluido lacrimal. Estes achados indicam que as tetraciclinas reduzem dois importantes factores de risco na irritação ocular em pacientes com disfunção das glândulas de Meibom.

Exemplo 5; Eliminação dos sintomas da disfunção das glândulas de Meibom através da administração tópica de oxitetraciclina

Onze (11) pacientes com sintomas de irritação ocular devido a disfunção das glândulas de Meibom associada com rosácea e drenagem lacrimal retardada foram tratados com uma pomada de oxitetraciclina comercialmente disponível (Terak, Akorn Pharmaceuticals) de administração tópica para a superfície ocular ou pálpebras. Setenta e três por cento (73%) desses pacientes tiveram uma eliminação completa dos sintomas de irritação. Ver Tabela 2 a seguir. 15

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TABELA 2: Pacientes com rosácea ocular tratados com pomada de oxitetracidina Número Iniciais do Paciente ΒΡΕΙ # Data de Tratamento Resposta Clinica Comentários 1 LP 410606 1/2/97 E 2 HB 393796 1/13/97 E 3 HP 214814 12/23/96 E 4 BP 358105 12/2/96 G Ardor moderado 5 JS 547453 1/10/97 G Ardor e parou 6 FC 225688 1/7/97 E 7 JI 422804 1/13/97 E 8 RR 401297 1/13/97 E 9 CA 88261 1/27/97 E 10 DL 531404 1/21/97 G Ardor moderado 11 ES 554804 12/16/96 E Ε = Resposta excelente, alívio completo ou quase completo dos sintomas. G = Resposta boa, sintomas aliviados moderadamente, se bem que não totalmente. Vários pacientes que tinham anteriormente tomado tetraciclina oral, afirmaram que a melhoria nos seus sintomas era mais evidente com oxitetraciclina aplicada topicamente do que com tetraciclina administrada oralmente. Três pacientes apresentaram alívio moderado, se bem que não completo, dos sintomas. Três outros pacientes experimentaram ardor e um deles interrompeu o tratamento.

Exemplo 6: Eliminação da irritação ocular através da administração de solução tópica de doxiciclina

Alívio moderado a completo dos sintomas de irritação ocular foi também observado em 10 de 11 pacientes vítimas de irritação ocular devido a disfunção das glândulas de Meibom e drenagem lacrimal retardada, os quais foram tratados topicamente com uma solução aquosa de doxiciclina a 0,025% nos seus olhos 3 a 4 vezes por dia durante 2 semanas. Ver Tabela 3. A solução foi preparada como aqui descrito. Em vários destes pacientes, observou-se redução da coloração de fluoresceína na córnea. 16 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ TABELA 3: Pacientes tratados com doxiciclina tópica No. ΒΡΕΙ # DIAGNÓSTICO RESPOSTA 1 585447 DGM, DTC Completa 2 480606 DGM, DTC Moderada, melhor do que via oral 3 537137 DGM, DTC Completa, melhor do que via oral 4 606807 DGM, DTC Completa 5 590395 DGM, DTC Completa 6 593046 DGM, DTC Moderada 7 503909 DGM, DTC Completa, melhor do que via oral 8 558105 DGM, DTC Moderada, não tão boa como oral 9 405797 DGM, DTC Sem efeitos 10 576264 DGM, DTC Moderada 11 562422 DGM, DTC Completa DGM = Disfunção das glândulas de Meibom DTC = Drenagem lacrimal retardada

Deve ser reconhecido que as concretizações e exemplos aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e, como tal, várias modificações ou alterações serão sugeridas por pessoas peritas na especialidade e devem ser incluídas dentro do espírito e competência deste pedido no âmbito das reivindicações em anexo.

Exemplo 7: A doxiciclina inibe a conversão da IL-Ιβ precursora para a sua forma madura em culturas de epitélio da córnea humana

Avaliou-se o efeito da doxiciclina nas concentrações das formas precursora e madura da IL-Ιβ de sobrenadantes de culturas de células epiteliais da córnea humana estimuladas com lipopolissacárido (LPS). A doxiciclina reduziu significativamente a concentração da forma biologicamente activa da IL-Ιβ comparado com as culturas estimuladas por LPS mas não estimuladas com doxiciclina (Figura 5). Além disso, a doxiciclina diminuiu acentuadamente a razão de IL-Ιβ madura para IL-Ιβ precursora (Figura 6). Foi igualmente observada uma diminuição do nível mRNA da IL-Ιβ em culturas tratadas com doxiciclina. Estes resultados mostram que a doxiciclina inibe a síntese e a activação da citocina inflamatória IL-Ιβ. 17 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ

Exemplo 8: A doxiciclina aumenta a libertação da forma anti-inflamatória de IL-1, a IL-1RA 0 antagonista dos receptores e-1 (IL-1RA) é uma molécula produzida pelas células epiteliais e inflamatórias que se liga ao tipo 1 dos receptores de IL-1, mas não inicia a transdução do sinal. 0 IL-1RA tem um efeito anti-inflamatório, competindo com as formas pró-inflamatórias de IL-1 (IL-Ια e IL-Ιβ) pelo receptor do tipo 1. A adição de doxiciclina ou da tetraciclina quimicamente modificada CMT-3 a culturas de células epiteliais da córnea humana aumentou significativamente a libertação de IL-1RA no meio comparado com culturas não tratadas. Além disso, a concentração de IL—IRA em culturas de células epiteliais da córnea humana estimuladas com LPS e tratadas quer com doxiciclina ou com CMT-3 era mais elevada do que nas culturas expostas a LPS isolado (Figura 7). Estes achados indicam que as tetraciclinas são anti-inflamatórias devido à sua capacidade para estimular a libertação de IL-1RA pelo epitélio da córnea humana.

Exemplo 9: A doxiciclina diminui a actividade da MMP-9 em culturas de células epiteliais da córnea humana A exposição de culturas do epitélio da córnea humana a doxiciclina (5 g/ml) durante 24 horas diminuiu o nivel de actividade da pro-MMP9 no sobrenadante em 70% comparado com culturas não tratadas (Figura 8). A MMP-9 é a metaloproteinase responsável por dar inicio à ulceração estéril da córnea e é também capaz de clivar a IL-Ιβ precursora à sua forma madura.

Todas as referências citadas são aqui incorporadas por referência. 18 ΕΡ 1 676 579/ΡΤ

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Lisboa, 2009-03-16

Claims (7)

1. ΕΡ 1 676 579/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma tetraciclina no fabrico de um medicamento para tratar um paciente com rosácea ocular, através da administração oral ou tópica a um olho do paciente de uma quantidade eficaz do referido medicamento, em que a referida quantidade não tem um efeito antimicrobiano significativo in vitro ou in vivo.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida tetraciclina é uma tetraciclina antimicrobiana.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida tetraciclina é oxitetraciclina, doxiciclina ou minociclina.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida rosácea ocular está associada com doença das glândulas de Meibom.
5. 5. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 4, em que a tetraciclina é uma tetraciclina não antimicrobiana.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida tetraciclina não antimicrobiana é uma tetraciclina destituída de uma cadeia lateral de dimetilamino na posição 4.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida tetraciclina não antimicrobiana é um membro seleccionado do grupo que consiste em: 4-desdimetilamino-tetraciclina, 4-desdimetilamino-5-oxitetraciclina, 4- desdimetilamino-7-clorotetraciclina, 4-hidroxi-4-desdimetilaminotetraciclina, 4-desdimetilamino-12a-desoxi-tetraciclina, 4-desdimetilamino-11-hidroxi-l2a-desoxi-tetraciclina, 4-desdimetilamino-7-dimetilaminotetraciclina, 6-dimeti1-6-desoxi-4-desdimetilaminotetraciclina, 6-o-desoxi- 5- hidroxi-4-desdimetilaminotetraciclina, lla-cloro-tetraciclina, 12a-desoxitetraciclina e análogos de 2-nitrilo de tetraciclina. Lisboa, 2009-03-16