PT1642910E

PT1642910E - Anticorpos concebidos de modo racional

Info

Publication number: PT1642910E
Application number: PT05076105T
Authority: PT
Inventors: Shana Frederickson; Mark Renshaw; Katherine S Bowdish
Original assignee: Alexion Pharma Inc
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2012-03-22
Also published as: US20030049683A1; AU2002234001B2; WO2002046238A3; DK1642910T3; EP1642910A1; CA2436671C; CA2436671A1; ES2316919T3; EP1589034A3; ATE320450T1; ES2380367T3; US7482435B2; EP1589034B1; US8771932B2; DE60136656D1; EP1642910B1; DE60118023D1; WO2002046238A2; US20100041012A1; ES2258558T3

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS CONCEBIDOS DE MODO RACIONAL"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo e péptidos biologicamente activos como reagentes de diagnóstico e terapêuticos.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA RELACIONADA

Os anticorpos são produzidos pelos linfócitos B e defendem contra infecção. Os anticorpos são produzidos em milhões de formas, cada com uma sequência de aminoácidos diferente. As moléculas de anticorpo são compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Quando digeridas pela enzima papaína, são produzidos dois fragmentos de Fab idênticos, juntamente com um fragmento Fc. Quando digeridas com a enzima pepsina é produzido um fragmento de F(ab')2· As cadeias leve e pesada consistem em regiões constante e variável. Dentro das regiões variáveis estão as regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDR)) que formam o sitio de ligação de antigénio. As restantes partes das regiões variáveis são referidas como regiões de estrutura.

As funções biológicas importantes, tais como ligação ao receptor, activação e actividade enzimática, são frequentemente 1 atribuíveis a regiões discretas de moléculas de proteínas maiores, compreendendo um número limitado de resíduos de aminoácidos. Os péptidos apresentando ligação, activação ou actividade enzimática também foram identificados através do rastreio de bibliotecas de péptidos, produzidos pela ligação aleatória de resíduos de aminoácidos. Estes péptidos podem não corresponder a uma disposição linear de aminoácidos numa molécula de proteína maior exibindo actividade biológica semelhante e são referidos como epitopos ou mimotopos peptídicos descontínuos. Foram descritos e clonados determinados miméticos peptídicos. Ver, e. g., Pat. U.S. N° 6083913 (mimético de trombopoietina (TPO)), Pat. U.S. N° 5835382 (mimético de eritropoetina (EPO)), Pat. U.S. N° 5830851 (mimético de EPO) e Wrighton et al., Science, (1996) 273:458-63. Devido à sua dimensão reduzida, os epitopos e mimotopos peptídicos são potencialmente vantajosos em relação a moléculas de proteínas de grandes dimensões para utilização como reagentes terapêuticos. Contudo, os resultados com estes péptidos como fármacos podem ser, frequentemente, insatisfatórios. Uma desvantagem da utilização de péptidos como reagentes terapêuticos é que são, em geral, instáveis ín vivo, i. e., as suas taxas de eliminação do soro podem ser bastante rápidas. Além disso, é dificil prever a actividade, terapêutica ou outra de um péptido se estiver fundido a uma molécula maior, visto que as alterações conformacionais e outras forças moleculares podem interferir ou inibir totalmente a actividade do péptido. Foram feitas tentativas para introduzir determinados polipéptidos em regiões de CDR de anticorpos. Ver, e. g., Pedido PCT WO 94/18221. Contudo, como mencionado anteriormente, devido a alterações conformacionais que podem ser causadas por aminoácidos circundantes, a actividade biológica dos polipéptidos activos pode ser diminuída ou inibida. Por conseguinte, é um objectivo 2 presente proporcionar anticorpos concebidos de modo racional ou os seus fragmentos, que incluem péptidos biologicamente activos para utilização como reagentes de diagnóstico e terapêuticos. 0 documento WO99/45110 divulga a substituição de estruturas em gancho de CDR nos domínios do tipo V de ligandos de não anticorpo, tal como CTLA-4.

SUMÁRIO São aqui proporcionados anticorpos recombinantes biologicamente activos e os seus fragmentos que mimetizam a actividade de péptidos biologicamente activos, métodos de preparação desses anticorpos e métodos para a sua utilização em terapia e diagnóstico. Estes anticorpos e os seus fragmentos não sofrem de algumas das desvantagens de péptidos isolados, visto que os anticorpos têm meias-vidas séricas naturalmente longas e são altamente específicos na ligação ao seu alvo. Verificou-se, surpreendentemente, que a incorporação de particulares aminoácidos circundando um péptido alvo que tenha sido combinado numa molécula de anticorpo aumenta, na realidade, a actividade biológica do péptido.

Os anticorpos ou os seus fragmentos têm um péptido de interesse inserido numa região determinante de complementaridade (CDR) de uma molécula de anticorpo. A molécula de anticorpo serve como um esqueleto para a apresentação do péptido e confere ao péptido a estabilidade melhorada. 0 péptido substitui, opcionalmente, todos os aminoácidos de uma região de CDR, ou pode ser adicionado a uma CDR existente, pelo que a especificidade de antigénio original é dissociada, em que a 3 região de CDR é definida por qualquer dos dois esquemas aceites (Ver, Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunologics Interest, 5a ed. (1991), Publicação NIH 91-3242 e Chothia et al. , J. Mol. Bio (1992) (227) 776-98) . Além disso, podem ser aleatoriamente introduzidos aminoácidos adicionais que flanqueiem o péptido e permitam o rastreio da apresentação de péptido óptima na estrutura de anticorpo. Verificou-se, surpreendentemente, que em determinados casos uma prolina flanqueando o péptido proporciona um aumento na actividade biológica.

Em formas de realização particulares, uma molécula ou fragmento de anticorpo tem os resíduos de aminoácidos correspondentes a uma região determinante de complementaridade (CDR) substituídos com resíduos de aminoácidos compreendendo um péptido hematopoiético ou trombopoiético biologicamente activo. Noutra forma de realização particular, os resíduos de aminoácidos correspondentes a, pelo menos, duas regiões determinantes de complementaridade (CDR) são cada substituídos com os resíduos de aminoácidos compreendendo esse péptido biologicamente activo. Numa única molécula de anticorpo ou o seu fragmento, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade podem ser substituídas com um péptido; por exemplo, CDR3 de uma cadeia pesada, CDR3 de uma cadeia leve, CDR3 de uma cadeia pesada e leve, CDR2 e CDR3 de uma cadeia pesada ou CDR2 e CDR3 de uma cadeia leve. São possíveis outras combinações de regiões de CDR substituídas, incluindo a substituição de CDR1. Além disso, em vez da substituição de uma CDR, poderia adicionar-se o péptido a uma CDR nativa, sem substituição efectiva de resíduos de aminoácidos perturbando-se, simultaneamente, a especificidade de antigénio original. 4

Assim, num aspecto, é proporcionado um péptido biologicamente activo, com actividade melhorada, através da adição de uma prolina ao seu terminal carboxilo para formar um péptido biologicamente activo prolongado com uma prolina que é utilizado para substituir ou adicionar a, pelo menos, uma porção de, pelo menos, uma região de CDR numa molécula de anticorpo ou o seu fragmento. Noutro aspecto, é proporcionada uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento que tem um péptido mimético ou péptido mimético de EPO como uma substituição para, pelo menos, uma região de CDR nativa. Neste aspecto, o péptido mimético de TPO ou péptidos miméticos de EPO podem, opcionalmente, ser prolongados com prolina, como aqui descrito.

Em formas de realização particulares adicionais a molécula de anticorpo ou o seu fragmento é um Fab, um ScFv, uma região variável de cadeia pesada, uma cadeia leve ou uma molécula de IgG completa. A molécula de anticorpo ou o seu fragmento também pode ter um domínio de dimerização, de modo a possibilitar que as moléculas de anticorpo que tenham apenas uma CDR substituída com um péptido dimerizem e, deste modo, activem receptores que requerem dimerização para activação.

Em determinadas formas de realização, o péptido biologicamente activo pode ser um epitopo peptídico linear ou um epitopo peptídico descontínuo. Além disso, o péptido biologicamente activo, quando substituído com uma região de CDR, pode ter além da prolina, um, dois ou mais resíduos de aminoácidos flanqueantes adicionais, próximos dos terminais amino e/ou carboxilo do péptido, que estão posicionados entre o péptido e os resíduos da região de estrutura da imunoglobulina (i. e., no que era a junção entre uma CDR e a estrutura contígua). Os resíduos de aminoácidos flanqueantes não estão, 5 tipicamente, presentes no péptido activo. Se os resíduos de aminoácidos flanqueantes preferidos já forem conhecidos, os resíduos de aminoácidos flanqueantes são codificados por codões que designam os resíduos de aminoácidos específicos. Contudo, através da utilização inicial de codões, tais como NNK, NNY, NNR, NNS e semelhantes, que designam múltiplos resíduos de aminoácidos, é produzida uma colecção de péptidos que diferem uns dos outros meramente pelos resíduos flanqueantes. Os resíduos de aminoácidos flanqueantes podem determinar a apresentação do péptido na molécula de anticorpo ou o seu fragmento e, deste modo, podem influenciar a ligação e/ou actividade biológica exibida pelo péptido. Esta colecção aleatória dos aminoácidos flanqueantes permite a selecção do melhor contexto para apresentar a sequência peptídica na estrutura de anticorpo que resulte na ligação especifica à molécula alvo e na exibição da actividade biológica óptima. 0 rastreio de bibliotecas de anticorpos tendo um péptido comum mas resíduos de aminoácidos flanqueantes diferentes pode ser efectuado utilizando ensaios de ligação, crescimento e activação conhecidos dos especialistas na técnica e como aqui descritos. 0 péptido substituindo os resíduos de aminoácidos compreendendo uma CDR pode ser qualquer péptido que se ligue especificamente a uma molécula alvo e cuja utilidade poderia ser alterada por incorporação numa estrutura de anticorpo. 0 péptido também poderia exibir uma actividade especifica (e. g., agonista, antagonista, enzimática, etc.). Numa forma de realização particular, o péptido é um agonista ou um antagonista para um receptor de superfície celular. Por exemplo, o receptor de superfície celular pode ser para uma citocina, um factor de crescimento ou um inibidor de crescimento. 6

Em formas de realização particularmente úteis, a substituição de, pelo menos, uma porção de uma CDR com um péptido proporciona um anticorpo que actua como um agonista. 0 péptido utilizado para substituir, pelo menos, uma porção de uma CDR pode ele próprio ter propriedades agonistas. Alternativamente, o péptido (embora ligando-se especificamente a um receptor) pode não exibir actividade agonista. Em vez disso, a actividade agonista poderá ser apenas exibida quando o péptido for substituído com, pelo menos, uma porção de uma CDR e está, deste modo, presente no anticorpo manipulado. Nessas formas de realização, a presença ou ausência de prolina flanqueando o péptido não é crítica mas pode, em alguns casos, ser preferida.

Assim, num aspecto, a presente divulgação proporciona um anticorpo agonista, compreendendo uma estrutura de anticorpo manipulada para conter, pelo menos, um péptido biologicamente activo inserido em, ou no lugar de, pelo menos, uma porção de uma ou mais CDR. 0 péptido biologicamente activo pode ou não exibir actividade agonista antes da inserção na estrutura de anticorpo. Em determinadas formas de realização, a estrutura de anticorpo é manipulada para conter dois péptidos capazes de se dimerizarem um com o outro.

Ainda noutro aspecto, a presente divulgação proporciona uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, compreendendo uma região onde os resíduos de aminoácidos correspondendo a, pelo menos, uma porção de uma região determinante de complementaridade (CDR) são substituídos com um péptido biologicamente activo, pelo que a molécula de anticorpo ou o seu fragmento exibe actividade agonista. 0 péptido biologicamente activo pode ou não exibir actividade agonista antes da inserção na estrutura de anticorpo. Em formas de realização 7 particularmente úteis, a molécula de anticorpo ou o seu fragmento exibe actividade agonista de c-mpl.

Ainda noutro aspecto, a presente divulgação proporciona uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, compreendendo um péptido biologicamente activo inserido numa região determinante de complementaridade (CDR), pelo que a molécula de anticorpo ou o seu fragmento exibe actividade agonista.

Ainda noutro aspecto, a presente divulgação proporciona uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, compreendendo uma região onde os residuos de aminoácidos correspondendo a, pelo menos, uma porção de uma região determinante de complementaridade (CDR) são substituídos com um péptido biologicamente activo, pelo que a molécula de anticorpo ou o seu fragmento exibe actividade agonista de c-mpl.

Em formas de realização particulares adicionais, o péptido substituindo os aminoácidos de uma CDR é um péptido mimético de TPO agonista. Um desses péptidos agonistas tem, pelo menos, a sequência IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° 1). Para os péptidos miméticos agonistas de TPO são possíveis outras sequências, que podem ser verificadas utilizando ensaios de ligação, crescimento e activação conhecidos pelos especialistas na técnica e como aqui descrito. Os péptidos miméticos de TPO agonistas, quando posicionados em regiões de CDR, podem ter um ou mais residuos de aminoácidos adicionais nos terminais amino e/ou carboxilo do péptido que se torna covalentemente ligado aos resíduos de estrutura da imunoglobulina. Um desses péptidos miméticos de TPO tem um resíduo adicional de prolina adicionado ao terminal carboxilo; IEGPTLRQWLAARAP (SEQ ID N° 2). Outras moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos têm uma região de CDR 8 substituída pelos péptidos miméticos de TPO, compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N° 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 e 49 (ver a Fig. 5).

Outro péptido biologicamente activo que pode substituir os resíduos de aminoácidos de uma CDR é um péptido mimético de EPO agonista. Um desses péptidos agonistas de EPO tem como a sua sequência de aminoácidos DYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID N° 3) . Para os péptidos miméticos de EPO agonistas são possíveis outras sequências de aminoácidos, que podem ser verificadas utilizando ensaios de ligação, crescimento e activação conhecidos pelos especialistas na técnica e como aqui descritos. Os péptidos miméticos de EPO agonistas, quando localizados em regiões de CDR, também podem ter um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais nas terminações amino e/ou carboxilo do péptido que se torna covalentemente ligado aos resíduos de imunoglobulina. Deste modo, em formas de realização particulares aqui proporcionadas, estão as moléculas de anticorpo (IgG) ou fragmentos (e. g. , Fab, scFv, cadeias pesadas ou leves) que têm uma região de CDR substituída com um péptido mimético de TPO ou EPO. Por exemplo, o péptido de TPO pode incluir, pelo menos, a sequência IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° 1) e pode adicionalmente, opcionalmente, ter uma prolina adicional na posição a jusante imediata. 0 mimético de EPO abrange, pelo menos, a sequência DYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID N° 3) . Do mesmo modo, pode ter, opcionalmente, uma prolina adicional na posição a jusante imediata.

Qualquer anticorpo ou o seu fragmento poderia potencialmente proporcionar a estrutura e ter uma CDR substituída com um péptido de acordo com a presente divulgação. Para utilização terapêutica ou de diagnóstico in vivo é 9 preferido que o anticorpo seja de origem humana ou humanizado, tal como uma imunoglobulina de toxóide antitetânico. Além disso, independentemente ou em conjunto com a presença de aminoácidos flanqueantes adicionais ligados ao péptido, um ou mais resíduos de aminoácidos noutras regiões do anticorpo, outra região ou regiões de CDR e/ou regiões de estrutura, podem ser alteradas para modificar a ligação, actividade e/ou expressão apresentadas pelo péptido no contexto da molécula de anticorpo.

Está contemplado que, após construção dos anticorpos e/ou os seus fragmentos recombinantes biologicamente activos, esses recombinantes podem ser submetidos a métodos de aleatorização conhecidos na técnica, para introduzir mutações num ou mais pontos na sequência, para alterar a actividade biológica dos anticorpos. Após produção desses mutantes utilizando métodos de aleatorização, tal como os aqui descritos, os recombinantes resultantes podem ser ensaiados para actividade utilizando ensaios de ligação, crescimento, expressão e activação. São adicionalmente proporcionadas moléculas de ácidos nucleicos codificando moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos que têm os aminoácidos de uma ou mais regiões de CDR substituídas com um péptido biologicamente activo. Estas moléculas de ácidos nucleicos podem estar presentes num vector de expressão, que pode ser introduzido (transfectado) numa célula hospedeira recombinante para expressão destas moléculas. São também proporcionados métodos de produção de uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento contendo um péptido biologicamente activo, compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira recombinante, sob condições de modo a que seja expresso o ácido nucleico contido na célula. 10 São também proporcionadas composições, compreendendo uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento que tem residuos de aminoácidos correspondendo a uma CDR substituída com resíduos de aminoácidos compreendendo um péptido mimético de TPO ou EPO e um veículo farmaceuticamente aceitável. São adicionalmente proporcionados péptidos miméticos de EPO com residuos flanqueantes adicionais que são adequados para substituição da CDR. Também são proporcionadas moléculas de ácidos nucleicos codificando estes péptidos. São adicionalmente proporcionados métodos de manipulação de moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos para exibir uma actividade agonista, na qual um péptido biologicamente activo substitui, pelo menos, uma porção de uma ou mais regiões de CDR de cadeias leves e/ou pesadas. Os métodos abrangem a inserção de uma molécula de ácido nucleico codificando um péptido biologicamente activo no lugar de, pelo menos, uma região de CDR de uma molécula de ácido nucleico codificando uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina ou a adição da molécula à sequência de CDR nativa e, depois, a expressão da molécula de ácido nucleico codificando o domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, juntamente com o seu domínio de região variável complementar, de modo a que os dois domínios se associem. São adicionalmente proporcionados métodos de manipulação de moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos para exibir uma actividade (propriedade) de um péptido de TPO ou EPO biologicamente activo, na qual um péptido biologicamente activo substitui uma ou mais regiões de CDR de cadeias leves e/ou pesadas. Os métodos abrangem a inserção de uma molécula de ácido nucleico codificando um péptido biologicamente activo no lugar 11 de, pelo menos, uma porção de uma região de CDR de uma molécula de ácido nucleico codificando uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina ou a adição da molécula à sequência de CDR nativa e a expressão da molécula de ácido nucleico codificando o domínio variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, juntamente com o seu domínio de região variável de complementaridade, de modo a que as duas cadeias se associem.

Noutro aspecto, esta divulgação proporciona um método para produzir, num polipéptido, de um sitio de ligação capaz de ligação a um agente pré-seleccionado, o método incluindo as etapas de introdução de uma sequência nucleotidica que codifica para uma sequência de resíduos de aminoácidos definindo o referido sítio de ligação numa região de CDR de um ácido nucleico compreendendo um gene de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, através da amplificação da região de CDR do gene de imunoglobulina, a sequência nucleotidica introduzida tendo a fórmula —Xa-Y-Xb, na qual X é o mesmo ou diferente em cada ocorrência e representa um trinucleótido de aleatorização, a soma de a e b é 4 ou menos e Y é uma sequência nucleotidica que codifica um domínio mínimo de reconhecimento do referido sítio de ligação. Em formas de realização particularmente úteis, a amplificação é alcançada utilizando PCR de sobreposição, contudo, poderia ser empregue qualquer técnica de amplificação conhecida, tal como, por exemplo, os métodos divulgados no documento WO, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

Ainda noutro aspecto, esta divulgação proporciona métodos para a criação de uma biblioteca de anticorpos monoclonais que pode ser rastreada para uma actividade desejada. Estes métodos de preparação de uma biblioteca incluem as etapas de inserção de uma molécula de ácido nucleico codificando um péptido 12 biologicamente activo em, ou no lugar de, pelo menos, uma porção de, uma ou mais regiões de CDR de uma molécula de ácido nucleico codificando uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, proporcionando até um par de trinucleótidos de aleatorização de cada lado da molécula de ácido nucleico inserida e a expressão de uma biblioteca de anticorpos monoclonais. Em formas de realização particularmente úteis, é proporcionado um par de trinucleótidos de aleatorização em ambos os lados das moléculas de ácidos nucleicos inseridas. A biblioteca de anticorpos monoclonais deste modo produzida pode ser, depois, rastreada para uma actividade desejada.

Numa forma de realização específica, os anticorpos e os seus fragmentos têm diferentes aminoácidos flanqueando o péptido nos terminais amino e carboxilo onde o péptido fica ligado ao esqueleto de anticorpo. Isto resulta numa população de moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos que podem diferir na apresentação do péptido. A população é rastreada para os anticorpos que exibem a actividade biológica do péptido. Numa forma de realização preferida, o aminoácido imediatamente adjacente ao péptido é uma prolina.

Se a actividade do péptido biologicamente activo for a de activar uma molécula alvo, esta pode requerer a dimerização de duas moléculas alvo (e. g. , receptores nas superfamílias hematopoiéticas). Para que a dimerização ocorra, os dois péptidos devem estar posicionados para que cada se ligue a uma molécula alvo, de modo a que as duas moléculas alvo ligadas possam, depois, associar-se convenientemente. Isto pode ser alcançado tendo dois péptidos presentes no mesmo anticorpo ou no seu fragmento ou fazendo com que duas moléculas de anticorpo, cada contendo um péptido, se liguem uma à outra. Deste modo, por 13 exemplo, um único péptido pode ser inserido em, ou substituído com, pelo menos, uma porção de uma CDR e, depois, expresso como uma imunoglobulina ou um fragmento de F(ab')2· Como outro exemplo, dois péptidos podem ser inseridos em, ou substituídos com, pelo menos, uma porção de uma ou mais CDR e expressos como qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo. 0 rastreio de anticorpos ou os seus fragmentos pode ser alcançado através de enriquecimento com células que tenham moléculas de superfície às quais o péptido se liga especificamente. Também pode ser utilizada a ligação de fase sólida utilizando moléculas alvo ou os seus fragmentos purificados. A ligação também pode ser efectuada em solução utilizando moléculas alvo marcadas. Além disso, os anticorpos ou os seus fragmentos podem ser rastreados através da utilização de ensaios biológicos para actividade agonista ou antagonista do péptido.

Também são proporcionadas bibliotecas de diferentes moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo a uma região determinante de complementaridade (CDR) são substituídos com resíduos de aminoácidos compreendendo um péptido biologicamente activo que tenha, pelo menos, um resíduo de aminoácido adicional nos terminais amino ou carboxilo e as moléculas de anticorpo ou os seus fragmentos diferem no resíduo de aminoácido adicional do péptido.

Em formas de realização específicas, o péptido biologicamente activo é um mimético de TPO ou um mimético de EPO. Os anticorpos da biblioteca são apresentados no fago. 14 São aqui divulgados métodos de estimulação da proliferação, diferenciação ou crescimento de células, que incluem a colocação em contacto das células com uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, tendo uma ou mais CDR substituídas com um péptido biologicamente activo que se liga a um receptor na superfície das células. Em formas de realização específicas, o péptido biologicamente activo é um mimético de TPO ou um mimético de EPO. É aqui divulgado um método de estimulação da proliferação, diferenciação ou crescimento de megacariócitos através da colocação em contacto dos megacariócitos com uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, tendo uma ou mais CDR substituídas com um péptido mimético de TPO. Também é divulgado um método de aumento da produção de plaquetas, que envolve a colocação em contacto de megacariócitos com uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, tendo uma ou mais regiões de CDR substituídas com um péptido mimético de TPO. Também é divulgado um método de estimulação megacariócitos e/ou aumento da produção de plaquetas num doente, no qual uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, tendo uma ou mais CDR substituídas com um péptido mimético de TPO, é administrada a um doente que dela necessita. A molécula de anticorpo e os megacariócitos também podem ser colocados em contacto in vitro e as células resultantes podem ser introduzidas no doente. Além disso, um anticorpo ou o seu fragmento tendo, pelo menos, um péptido mimético de TPO nele incorporado pode ser administrado a um indivíduo que pretenda doar plaquetas aumentando, deste modo, a capacidade de um dador produzir plaquetas para proporcionar uma fonte mais robusta dessas plaquetas. 15

Também é aqui divulgado um método estimulação da proliferação, diferenciação ou crescimento de células hematopoiéticas, compreendendo a colocação em contacto das células com uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, tendo uma ou mais CDR substituídas com um péptido mimético de EPO.

Também é aqui divulgado um método de activação de uma proteína de receptor homodimérico, através da colocação em contacto do receptor com uma molécula de anticorpo ou o seu fragmento, tendo uma região de CDR substituída com um péptido biologicamente activo que se liga especificamente ao receptor e que foi dimerizado. Numa forma de realização adicional, o receptor é um receptor de trombopoietina.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação esquemática do vector pRL4.

As Figuras 2A e B mostram a sequência da estrutura do anticorpo do toxóide tetânico humano, cadeias leve e pesada, respectivamente. A Figura 3 é um diagrama representando o enxerto do péptido AF12505 mimético de TPO na região CDR3 de cadeia pesada do anticorpo de estrutura de toxóide tetânico. XX representa aminoácidos aleatórios flanqueantes. A Figura 4 é um diagrama da construção de um péptido clonado na região CDR3 de cadeia pesada. A Figura 5 representa as sequências de aminoácidos e nucleotídicas de clones que codificam o péptido AF1205 mimético de TPO com diferentes resíduos flanqueantes aleatórios. 16 A Figura 6A-C representa a sequência de ácidos nucleicos do plasmideo pRL8 (SEQ ID N° 60). O pRL8 é uma versão modificada do pRL4 (o pRL4 também é conhecido como pComb 3X). O pRL4 foi modificado entre os sítios de restrição Spe I e Sfi I limítrofe (mostrados pelo sublinhado) para incluir um adaptador flexível (região de articulação capa murina), seguido de um domínio de dimerização de fecho-éclair de leucina Jun. A Figura 7 é uma representação esquemática de uma porção do plasmideo pRL8. A Figura 8 representa a sequência de ácidos nucleicos de uma porção do plasmideo pRL8 (SEQ ID N° 52), juntamente com as sequências de aminoácidos correspondendo a determinadas sequências de ácidos nucleicos delineadas (SEQ ID N° 53). A Figura 9 é um quadro mostrando as presentes sequências de determinados clones positivos para TPO. A Figura 10 é um gráfico de barras mostrando a actividade de determinados clones de Fab contendo 2 péptidos miméticos de TPO. A Figura 11 é um gráfico de barras mostrando a actividade de determinados clones de Fab contendo 2 ou 3 péptidos miméticos de TPO. A Figura 12 representa graficamente a actividade do Clone 59 como reflectida por indução de actividade de luciferase. A Figura 13A representa a sequência de aminoácidos e sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada de 5G1.1-TP0 (SEQ ID N° 67 e 68, respectivamente). A Figura 13B representa a sequência de aminoácidos e sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve de 5G1.1 (SEQ ID N° 69 e 70, respectivamente). A Figura 14 é um gráfico de barras mostrando a análise de FACS da ligação do receptor cMpl do péptido mimético 17 5G1.1 + TPO purificado, em comparação com o anticorpo 5G1.1 parental. A Figura 15 é um gráfico de barras mostrando a actividade comparativa do anticorpo 5G1.1 contendo o péptido mimético de TPO, com respeito a células transfectadas com um vector de controlo não contendo cMpl-R e células transfectadas com um vector contendo cMpl-R. A Figura 16 mostra a sequência do clone 429/Xb4 (SEQ ID N° 116) . A Figura 17 é um fluxograma mostrando as etapas iniciais para a preparação do vector pRL5-Capa. A Figura 18 é um fluxograma mostrando as etapas adicionais para a preparação do vector pRL5-Capa. A Figura 19 é um mapa do vector pRL5. A Figura 20 é um esquema do vector pRL5-Capa. A Figura 21A-I mostra a sequência de ácidos nucleicos do vector pRL5-Capa.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Como aqui utilizado, "imunoglobulina", refere-se a uma molécula ou moléculas de imunoglobulina integral que contém porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina intactas e inclui Fab, F(ab')2, scFv, Fv, regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve. Os termos imunoglobulina e anticorpo são aqui utilizados com o mesmo significado.

Qualquer péptido que exiba uma propriedade útil é adequado para inserção numa estrutura de anticorpo. As actividades e utilizações peptídicas incluem mas não estão limitadas a ligação 18 de um receptor, ligação de uma molécula de superfície membranar, ligação de um ligando, ligação de uma enzima ou proteína estrutural, activação ou inibição de um receptor, distribuição direccionada de fármacos ou qualquer actividade enzimática. Os péptidos cuja utilidade possa ser aumentada a partir da estabilidade melhorada que lhes foi conferida, quando apresentados no contexto de uma molécula de imunoglobulina, são seleccionados de modo habitual. Deve ser compreendido que "actividade biológica", como aqui utilizado, inclui qualquer actividade associada a uma molécula tendo actividade num sistema biológico, incluindo mas não limitada à actividade estimulatória ou inibitória provocada por interacções proteína-proteína, assim como a cinética circundando essas interacções, incluindo a estabilidade de um complexo proteína-proteína. Melhorando ou aumentando a "actividade biológica" significa, aqui, incluir um aumento na actividade global ou um aumento em qualquer componente de actividade global. Deve ser compreendido que um péptido pode exibir uma actividade biológica (tal como, e. g., simplesmente a ligação a um alvo) antes da inserção na estrutura de anticorpo e uma actividade biológica diferente ou melhorada (tal como, e. g. , actividade agonista) após inserção na estrutura de anticorpo.

Foram identificados muitos péptidos que poderiam beneficiar da apresentação no contexto de uma imunoglobulina e são conhecidos dos que praticam a técnica, e. g., péptidos miméticos de EPO e TPO. Outros exemplos incluem péptidos que se ligam a receptores que são activados por homo-dimerização induzida por ligando, incluindo fragmentos activos apresentando actividade de G-CSF, actividade de GHR e actividade de prolactina, como descrito em Whitty and Borysenko, Chem Biol., (1999) Abril 6(4):R107-18; outros exemplos de péptidos adequados incluem um 19 mimético do factor de crescimento nervoso do gancho de CD, como descrito em Zaccaro et ai., Med. Chem. (2000) 43(19); 3530-40; um mimético de IL-2, como descrito em Eckenberg, et ai., J. Immunol. (2000) 165(8):4312-8; péptido semelhante ao glucagom, como descrito em Evans et ai., Drugs R.D. (1999) 2(2) : 75-94; tetrapéptido I (D-lisina-L-asparaginil-L-prolil-L-tirosina) que estimula a proliferação de células B activada por mitogénio, como descrito em Gagnon et ai., Vaccine (2000) 18(18):1886-92.

Também estão contemplados os péptidos que exibem actividade antagónica de receptor. Por exemplo, o péptido N-terminal de vMIP-II, como um antagonista de CXCR4 para terapia de VIH, como descrito em Luo et ai., Bíochemistry (2000) 39 (44):13545-50; ligando peptídico antagonista (AFLARAA) do receptor de trombina para terapia antitrombótica, como descrito em Pakala et ai., Thromb. Res. (2000) 100(1): 89-96; antagonista CGRP do receptor do péptido CGRP (8-37) para atenuação da tolerância aos narcóticos, como descrito em Powell et ai., Br. J. Pharmacol. (2000) 131 (5): 875-84; antagonista do receptor (PTH)-l da hormona paratiróide, conhecido como péptido tuberoinfundibular (7-39), como descrito em Hoare et ai., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2000) 295(2):761-70; factor de crescimento opióide, como descrito em Zagon et ai., Int. J. Oncol. (2000) 17(5): 1053-61; antagonistas do receptor de interleucina 1 do tipo I de elevada afinidade, como divulgados em Yanofsky, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 93, p. 7381-7386, Julho de 1996 e Vigers, et ai., J. Biol. Chem., Vol 275, N° 47, páginas 36927-36933, 2000 e péptido de ligação do factor de crescimento do fibroblasto ácido, como descrito em Fan et al., IUBMB Life (2000) 49 (6) 545-48. Os péptidos também podem ser identificados utilizando métodos familiares dos especialistas na técnica. De modo a identificar uma região de uma proteína que esteja envolvida numa função biológica específica, uma pesquisa dos 20 fragmentos peptídicos mais curtos constituindo essa proteína pode revelar o epitopo peptídico linear responsável. Alternativamente, através da pesquisa de bibliotecas de péptidos aleatórios, pode ser identificado um péptido que represente um epitopo linear óptimo ou um epitopo descontínuo que mimetize a actividade da proteína natural. Um método para selecção é designado por apresentação de fago de péptidos. Nesta abordagem, é produzida uma biblioteca de epitopos aleatórios, de modo a que os péptidos estejam presentes na superfície de uma partícula de bacteriófago. Estas colecções, ou bibliotecas, de péptidos podem ser, depois, pesquisadas para os que são capazes de se ligar a uma proteína alvo específica imobilizada. (Pasqualini, R. et ai., j. Cell Biol., 130, 1995, 1189-1196; Wrighton, N.C., et ai., Science, 273, 1996, páginas 458-463; Cwirla, S.E., et ai., Science, 276, 1997, páginas 1696-1699; Koivunen et ai., J. Biol, Chem. , 268, 1993, página s20205-20210; Koivunen et ai., Bio/Technol., 13, 1995, páginas 265-270; Healy et ai., Biochem., 34, 1995, páginas 3948-3955; Pasqualini et ai., J. Cell Biol., 130, 1995, páginas 1189-1196). Também são possíveis sistemas de selecção peptídica alternativos, incluindo apresentação na superfície celular e apresentação ribossómica.

Os miméticos peptídicos utilizados de acordo com esta descrição são, em geral, inferiores ou iguais ao número de resíduos de aminoácidos que constituem uma região de CDR, embora possam ser mais compridos.

Qualquer anticorpo pode servir como uma sequência esqueleto, contudo são escolhidos anticorpos tipicamente humanos, visto que a terapêutica humana é um dos derradeiros objectivos. Os anticorpos humanos ou humanizados são menos susceptíveis de causarem uma resposta imunitária adversa num 21 doente humano. Os principais critérios na selecção de um anticorpo para servir como uma estrutura para a inserção de um péptido, é que a substituição de uma ou mais CDR do anticorpo com o péptido deve alterar a especificidade de antigénio. 0 anticorpo pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de Fab, scFv ou F(ab')2 ou uma sua porção.

Alternativamente, uma biblioteca de anticorpos pode ter uma ou mais CDR de cadeia pesada e/ou leve substituída com um péptido desejado. A biblioteca resultante pode ser, depois, rastreada para identificar anticorpos tendo uma actividade desejada. Deve ser compreendido que também pode ser proporcionada a aleatorização no péptido substituído para produzir uma biblioteca de anticorpos.

Um anticorpo útil é o Fab do toxóide antitetânico (TT) , visto que é humano e porque a modificação da HCDR3 é suficiente para alterar a especificidade de antigénio do anticorpo (Barbas et al. , J. Am. Chem. Soc., 116, 1994, páginas 2161-2162 e Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 1995, páginas 2529-2533). 0 enxerto da sequência de ADN do péptido de escolha num anticorpo, de forma a substituir a(s) CDR de um anticorpo com a sequência peptidica, é efectuado utilizando técnicas de ADN recombinante conhecidas pelos especialistas na técnica.

Os exemplos de métodos que podem ser utilizados para enxertar um péptido desejado tendo actividade biológica no lugar de uma região de CDR incluem mas não estão limitados a sobreposição de PCR, clonagem de sitio de restrição enzimática, mutagénese especifica pontual e meios completamente sintéticos. 22

Para uma descrição das técnicas envolvendo o PCR de sobreposição, ver, e. g., o presente Exemplo 1. A mutagénese especifica pontual pode ser alcançada de diversos modos. Um baseia-se na mutagénese de dut/ung Kunkel (Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sei. (1985) vol. 82, p. 488-92). 0 kit Muta-Gene in Vitro está disponível a partir da BioRad, baseado nesta metodologia (N° cat. 170-3581 ou 170-3580). Também estão comercialmente disponíveis várias abordagens de mutagénese baseadas na amplificação por PCR, tais como o kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis da Stratagene e o kit ExSite PCR-based Site-Directed Mutagenesis. Outro método de não PCR está disponível a partir da Promega, como o GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System. Os meios completamente sintéticos também são bem conhecidos e descritos, e. g., em

Deng, et al., Methods Mol. Bíol. (1995) 51:329-42; Kutemeler

et al. , Biotechniques, (1994) 17(2): 242-246; Shi et ai., PCR

Methods Appl. , (1993) 3(1): 46-53 e Knuppik et al. , J. Mol.

Biol. , (2000) 11 : 296(1): 571-86. Além disso, os métodos acima utilizados para a substituição da totalidade ou de uma porção de, pelo menos, uma sequência de CDR podem ser utilizados para enxertar um péptido desejado em ou adjacente a, pelo menos, uma sequência de CDR nativa, sem substituição da sequência de CDR original. Deste modo, é formada uma construção de fusão de CDR/mimético peptídico biologicamente activo.

Está contemplado que as sequências flanqueantes podem ser adicionadas às extremidades carboxilo e/ou amino terminais do péptido biologicamente activo. As sequências flanqueantes podem ser úteis para reduzir os constrangimentos estruturais no péptido enxertado, para permitir que adopte mais facilmente uma conformação necessária para a actividade biológica. Numa forma de realização preferida, uma região flanqueante incluindo uma 23 prolina é covalentemente conjugada ao terminal carboxilo do péptido biologicamente activo, para criar um péptido biologicamente activo prolongado com prolina.

Numa forma de realização, uma região flanqueante pode ser produzida através da aleatorização de duas posições de aminoácido em cada lado do enxerto peptidico, de modo a determinar a melhor sequência. Deste modo, pode ser produzida uma biblioteca tendo membros com múltiplas sequências variadas. As construções resultantes são, depois, testadas para actividade biológica, como descrito abaixo por, e. g., técnicas de enriquecimento. Podem ser produzidas proteínas recombinantes que tenham aminoácidos aleatórios em posições específicas. Isto pode ser alcançado através da modificação do ADN codificante. Quando se introduz aleatorização numa posição de codão de aminoácido especifica, uma "estratégia de dopagem" de desoxirribonucleótido preferida é (NNK)X, de modo a abranger todos os 20 aminoácidos e minimizar o número de codões de terminação codificados. Consequentemente, N pode ser A, C, G ou T (nominalmente equimolar) , K é G ou T (nominalmente equimolar) e x é, tipicamente, até cerca de 5, 6, 7 ou 8 ou mais produzindo, desse modo, bibliotecas de mono-, di-, tri-, quadra-, penta-, hexa-, hepta- e octa-péptidos ou mais. A terceira posição também pode ser G ou C, designada "S". Deste modo, NNK ou NNS (i) codificam para todos os aminoácidos, (ii) codifica para apenas um codão de terminação e (iii) reduz a gama de distorção de codão de 6:1 para 3:1. Há 32 possíveis codões resultantes do motivo NNK: 1 para cada dos 12 aminoácidos, 2 para cada dos 5 aminoácidos, 3 para cada dos 3 aminoácidos e apenas um dos três codões de terminação. Outras alternativas incluem mas não estão limitadas (ΝΝΝ)χ que proporcionaria todos os possíveis aminoácidos e todas as terminações; (NNY)χ elimina todas as terminações e ainda abrange 14 dos 20 aminoácidos; (NNR) x abrange 14 dos 20 aminoácidos e (NNS) X abrange todos os 20 aminoácidos e apenas uma terminação. A terceira posição de nucleótido no codão pode ser manipulada à medida, utilizando qualquer das misturas degeneradas conhecidas. Contudo, o grupo NNK, NNN, NNY, NNR, NNS abrange as estratégias de dopagem mais geralmente utilizadas e as aqui utilizadas. A colecção de anticorpos manipulados que é criada durante este processo pode ser pesquisada para os que exibem as propriedades do péptido como, e. g. , anticorpos apresentados em fago, essencialmente como foi descrito em Barbas, C.F., III, Kang, A.S., Lerner R.A. e Benkovic, S.J., Agrupamento de bibliotecas de anticorpo combinatoriais na superfície do fago: o sítio do gene III, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 1991, páginas 7978-7982. Esta tecnologia permite que os anticorpos recombinantes (como anticorpos completos, Fab F(ab')2 ou scFv) sejam expressos na superfície de um bacteriófago filamentoso. O mesmo fago terá dentro de si os genes codificando esse anticorpo específico.

Está contemplado que pode ser aqui utilizado qualquer outro método conhecido de introdução de aleatorização numa sequência. Por exemplo, o PCR propenso a erros pode introduzir mutações aleatórias nas sequências de ácidos nucleicos (Ver, e. g. , Hawkins et ai., J. Mol. Biol, (1992) 226(3): 889-96). 25

Resumidamente, o PCR é corrido sob condições que comprometem a fidelidade de replicação introduzindo, deste modo, mutações aleatórias em sequências como os especialistas na técnica as concretizariam. Após a produção desses mutantes aleatórios, podem ser colocados em formatos de apresentação fágica, enriquecidos e, deste modo, avaliados para actividade. Do mesmo modo, as particulares bactérias, conhecidas por proporcionarem mutações aleatórias de genes, tal como células Epicurian Coli® XLl-Red Competent (comercialmente disponíveis a partir da Stratagen, La Jolla, CA.), que assim fazem durante a replicação plasmídica, podem ser utilizadas para proporcionar mutantes aleatórios que são, depois, rastreados para actividade biológica de acordo com a presente divulgação.

Também está contemplado que a aleatorização pode ser introduzida em qualquer ponto na sequência nucleotídica, após incorporação de um péptido activo num anticorpo ou o seu fragmento, para alterar a actividade biológica global do anticorpo. Deste modo, podem ser realizadas não apenas alterações na actividade biológica de um mimético peptídico, causando mutações na sequência peptídica, mas as mutações no esqueleto circundante podem ser incorporadas com as construções resultantes sendo ensaiadas para alterações na actividade ou expressão biológica. De facto, está contemplado que podem ser produzidas e ensaiadas bibliotecas tendo repertórios de múltiplas construções resultantes dessa aleatorização.

As bibliotecas de cadeia única podem ser utilizadas de acordo com a presente divulgação porque um domínio de ligação integral está contido num polipéptido. A região variável de cadeia leve está separada da região variável de cadeia pesada por uma região adaptadora. A utilização de adaptadores curtos 26 (< 11 aminoácidos) favorece um complexo dimérico, onde a VH de um ScFv se associa com a VL de outra molécula de ScFv e vice-versa, estas moléculas são designadas diacorpos (Kortt, A.A., Malky, R.L., Caldwell, J.B., Gruen, L.C., Ivanci, N., Lawrence, M.G. et ai., Eur. J. Biochem. 221:151-157, 1994). Isto acontece porque, com adaptadores < 11 aminoácidos, o enrolamento do ScFv monomérico fica comprometido (Alfthan, K., Takkinen, K., Sizman, D., Soderlund, H., e Teeri, T.T. Protein-Eng. 8:725-731, 1995). Os adaptadores mais compridos (> 11 aminoácidos) favorecem o enrolamento do ScFv monomérico num único domínio de ligação do antigénio evitando, deste modo, a formação do dímero.

Um vector de apresentação fágica útil é o pRL4 que também é conhecido como pComb 3X (ver a Fig. 1) . Este vector possibilita a apresentação de produtos de expressão quiméricos na superfície de partículas fagemídicas empacotadas. 0 pRL4 é uma versão modificada do pComb3H (Barbas, C.F. III e Burton, D.R. 1994. Anticorpos Monoclonais de Bibliotecas Combinatórias. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor, N.I.; Burton, D.R.; Barbas, C.F. III. Advances in Immunology 57:191-280, 1994; Lang, I.M., Chuang, T.L., Barbas, C.F. 3a, Schleef, R.R. J. Biol. Chem. 271: 30126-30135, 1996; Rader e Barbas, Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2000)). A concepção do pRL4 permite a dimerização dos domínios de ligação de antigénio do scFv na superfície do fago e na forma solúvel, como detalhado abaixo. Quando o plasmídeo é transformado num hospedeiro bacteriano supE, tal como ER2537 (F' Sup E, New England Biolabs, Beverly, MA), a mutação âmbar é suprimida, aproximadamente, cinquenta por cento das vezes. Deste modo, metade dos scFv expressos estão fundidos com a proteína do gene III do fago filamentoso (aminoácidos 230-406) e a outra metade 27 será terminada imediatamente antes do gene III para produzir scFv solúvel. Os produtos da fusão scFv-pIII e scFv solúvel têm a sequência sinal Omp A e serão transportados para o periplasma, onde serão capazes de formar complexos de scFv diméricos, designados diacorpos (Kortt, A.A., Malby, R.L., Caldwell, J.B., Gruen, L.C., lvanci, N., Lawrence, M.C. et ai., Eur. J. Biochem. 221: 151-157, 1994). Espera-se que os diacorpos se enrolem, de modo a que a VH de um scFv se emparelhe com a VL de um segundo scFv-pIII, resultando em fragmentos de anticorpo divalentes. Num hospedeiro não sup E, tal como T0P10F' (InVitrogen, Carlsbad, CA), o codão de terminação âmbar é reconhecido, produzindo diacorpos de scFv solúveis.

Na construção de expressão de cadeia única final no pRL4, os fragmentos de anticorpo de cadeia única são clonados a jusante do promotor lacZ de E. coli, sitio de ligação ribossómica e sequência condutora omp A. Quando expressos na estirpe supressora ER2537, estes elementos permitem a indução da expressão por IPTG e a secreção para o exterior da célula por meio da sequência condutora omp A. Os fragmentos de cadeia única são fundidos, em fase, com sequências (aminoácidos 230-406) do gene III (glll) do fago filamentoso. 0 produto da proteína glll, pIII, é uma proteína de revestimento menor necessária para a infecciosidade. Após indução do promotor por IPTG, a fusão anticorpo de cadeia única-pIII é sintetizada e transportada para espaço periplasmático bacteriano. No espaço periplasmático, as proteínas de fusão scFv-gene III são inseridas dentro da membrana. Após superinfecção com fago auxiliar, estes fragmentos são exportados para o exterior da célula na superfície do fago como fragmentos de anticorpo de pIII. Outras possíveis proteínas a utilizar para fusão na superfície dos fagemídeos incluem a 28 proteína pVIII de revestimento filamentosa e outras proteínas de revestimento.

As bibliotecas do fragmento de Fab, que mantêm o sítio de reconhecimento antigénio nativo, são úteis para garantir que a afinidade é mantida.

Na construção de expressão de Fab hibrida final no pRL4, as cadeias leve e pesada são clonadas como um único fragmento de Sfi I. Deste modo, os fragmentos de cadeia leve são clonados a jusante do promotor lacZ de E. coli, sítio de ligaçao ribossómica e sequência condutora omp A. Estes elementos permitem a indução da expressão por IPTG e a secreção para o exterior da célula por meio da sequência condutora omp A. Os fragmentos de cadeia leve são seguidos de um codão de terminação, um segundo sítio de ligação ribossómica, a sequência condutora pel B de E. coli e cadeia pesada. Os genes de cadeia pesada híbridos são fundidos, em fase, com sequências (aminoácidos 230-406) do gene III (glll) do fago filamentoso. Um codão de terminação âmbar está presente na junção de fusão. Num hospedeiro bacteriano sup Er tal como ER2357 (New England Biolabs, Beverly, MA), a mutação âmbar está suprimida. Após indução do promotor, uma única mensagem policistrónica é transcrita e traduzida como dois polipéptidos, uma cadeia leve e uma proteína de fusão cadeia pesada-gene III. Após a síntese, os polipéptidos são transportados para o espaço periplasmático bacteriano como direccionado pela sequência condutora. No espaço periplasmático, as proteínas de fusão cadeia pesada-pIII são inseridas dentro da membrana e as cadeias leve e pesada são associadas covalentemente através de ligações dissulfureto, formando os sítios de ligação de antigénio. As sequências CHI e CL da região constante humana incluem as cisteínas que formam a 29 ligação dissulfureto entre as cadeias pesadas e leves. Após superinfecção com fago auxiliar, estes fragmentos são exportados para o exterior da célula na superfície do fago como a fusão

Fab-cpIII. Num hospedeiro não sup E, tal como T0P10F' (InVitrogen, Carlsbad, CA), o codão de terminação âmbar é reconhecido, produzindo fragmentos de Fab solúveis. As características importantes do sistema de apresentação fágica de pRL4 utilizado incluem uma cauda His 6 de purificação, uma cauda do epitopo HA a seguir à cadeia pesada, assim como um codão de terminação âmbar suprimível que se localiza entre a cadeia pesada e o gene III do fago. A cauda HA é reconhecida pelo anticorpo HA.11 (Babco, Berkeley, CA) e anticorpo 12CA5 (Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, Ind.). A cauda His6 permite a purificação de afinidade dos fragmentos de anticorpo por cromatograma de quelato de Niquel (Qiagen, Valência, CA). A terminação âmbar permite uma rápida conversão no Fab solúvel a partir de um produto de fusão Fab-cpIII (para incorporação no revestimento do fago), quando a terminação é suprimida, a qual é realizada num hospedeiro bacteriano não supressor. A selecção envolve o isolamento a partir da biblioteca dos melhores candidatos que se ligam especificamente à molécula alvo dos péptidos e apresentam actividade biológica.

0 fago expressando fragmentos de anticorpo na sua superfície pode ser produzido e concentrado, de modo a que se possam deixar ligar à molécula alvo todos os membros de uma biblioteca. A molécula alvo pode ser imobilizada numa placa de microtitulação, em células intactas, nas membranas de células intactas ou presente em solução. 0 Ab-fago não específico é removido por lavagem e as partículas de fago ligadas são libertadas do antigénio, frequentemente pela utilização de pH 30 assim, ser baixo. 0 Ab-fago recuperado é infeccioso e pode, amplificado num hospedeiro bacteriano. Tipicamente, são realizadas múltiplas séries deste género de selecção. Os clones de fragmentos de anticorpo individuais podem ser, depois, analisados como Fab ou scFv solúveis para identificação dos que reconhecem especificamente a molécula alvo.

Antes de qualquer estratégia de selecção, as bibliotecas iniciais são electroporadas para dentro de células hospedeiras, tal como ER2537. As culturas de bibliotecas são cultivadas até à fase log e superinf ectadas com fago auxiliar, tal como VCSM13, um fago auxiliar comercialmente disponível (Stratagene, La Jolla, CA). A superinfecção proporciona os restantes componentes do fago, necessários para o empacotamento de plasmídeos dentro das partículas do fago. Alternativamente, pode ser utilizada a apresentação fágica sem a utilização de fago auxiliar. Após crescimento, de um dia para o outro, os fagemídeos no sobrenadante de cultura são precipitados com polietilenoglicol (PEG) . Os fagos precipitados com PEG são utilizados em enriquecimento (fase sólida, superfície celular, internalização e membrana), triagem de FACS ou triagem magnética para purificar anticorpos de ligação específica de ligantes não específicos.

No enriquecimento de base celular, as bibliotecas de fago de anticorpo são incubadas com células alvo e os fagos não aderentes são removidos com múltiplas lavagens. Um protocolo de enriquecimento típico é como se segue: 1. Bloquear partículas de fago com PBS + BSA a 1% ou FBS a 10% + leite em pó a 4% + NaN3, (excepto quando são ensaiados anticorpos internalizados). 31 2. Adicionar células alvo a fagos bloqueados (aproximadamente 5 X 106 células). 3. Misturar e submeter a rotação, lentamente, a 4 °C ou 37 °C. 4. Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS/BSA a l%/NaN3 gelado ou PBS/BSA a l%/NaN3 à temperatura ambiente. 5. 0 fago de anticorpo especifico ligado às células pode ser eluído por pH baixo, por exemplo com ácido cítrico a 76 mM, pH 2,5, em PBS, durante 5 a 10 minutos, à temperatura ambiente. 6. Neutralizar o fago eluído com Tris-HCl a 1 M, pH 7,4. 7. Após neutralização, o fago de anticorpo pode ser utilizado para infectar bactérias ER2537 e amplificação durante crescimento de um dia para o outro para a série de enriquecimento seguinte.

Em geral, são realizadas 3-4 séries de enriquecimento em cada biblioteca. Os ELISA de fago utilizando anticorpo secundário comercialmente disponível (anticorpo-HRP anti-M13 de ovelha) ou os ELISA de anticorpo solúvel utilizando um anticorpo HA. 11 comercialmente disponível (Babco, Berkeley, CA) que reconhece a cauda HA incorporada em cada anticorpo das sequências PRL4, podem ser realizados após cada série de enriquecimento, para permitir a estimativa do enriquecimento de anticorpos de ligação em relação a não ligantes. Após a última série de enriquecimento, o fago de anticorpo pode ser recolhido como colónias únicas a partir de placas de ágar, cultivado como fago de anticorpo monoclonal e rastreado por ELISA para identificação de ligantes específicos. A análise de FACS também pode ser utilizada. Especificamente, os fagos de anticorpo são infectados em bactérias ToplOF' e plaqueados para colónias únicas. As colónias únicas são recolhidas de placas de ágar, 32 cultivadas e induzidas com IPTG. O anticorpo solúvel é rastreado por ELISA para identificação de ligantes específicos. 0 rastreio pode ser feito contra células vivas, contra células alvo intactas, suavemente fixas ou proteína(s) recombinante(s).

Os métodos para enriquecimento de células intactas foram anteriormente descritos (Siegel, D.L., Chang, T.Y., Russell, S.L. e Bunya, V.Y. 1997. J. Immunol. Methods 206:73-85). Outras técnicas que podem ser aplicadas para selecção incluem a triagem celular de activação fluorescente (FAC). Os métodos alternativos para selecção utilizando bibliotecas incluem mas não estão limitados a apresentação ribossómica e hibridação de placa para um antigénio marcado.

Após o enriquecimento para isolar ligantes de anticorpo de elevada afinidade, podem ser efectuados bioensaios para rastreios funcionais de anticorpos agonistas. A dimerização é, frequentemente, um pré-requisito para activação de muitos receptores e, deste modo, os bioensaios centram-se em anticorpos agonistas que estimulam receptores por meio de promoção da dimerização. Como anteriormente descrito, a multivalência de cadeia única é abordada na concepção de adaptador. A multivalência do fragmento de Fab pode ser abordada de diversos modos. Um número de referências recentes na literatura mostrou sucesso na formação de fragmento de anticorpo dimérico que é aplicável à apresentação fágica (DeKruif, J., e Logtenberg, T. 1996. J. Biol. Chem. 271:7630-7634, Pack, P. e Pluckthun, A. 1992. Biochemistry 31:1579-1584 e Holliger, P. e Winter, G. 1993. Current Opin. Biotech. 4:446-449). Os Fab divalentes podem ser criados em, pelo menos, dois modos. Numa abordagem, a dimerização é alcançada por adição de um domínio de dimerização a pRL4, formando pRL8 (Ver as Fig. 6A-C, 7 e 8). Há um número de 33 domínios de dimerização (lexA, dedos de Zn, fos, jun, etc.) que pode ser utilizado nestes vectores para se obter a multivalência dos fragmentos de Fab. Os domínios de dimerização são seleccionados do, mas não limitados ao, seguinte: jun (DeKruif, J. e Logtenberg, T. J. Biol. Chem. 271:7630-7634, 1996; Kostelny, S.A., Cole, M.S. e Tso, J.Y. J.Immunol. 148:1547-1553, 1992), a região de dimerização LexA (Kim, B. e Little, J.W. Science 255:203-206, 1992), o domínio de dimerização GCN4 de levedura (van Heeckeren, W.J., Sellers, J.W., Struhl, K. Nucleic Acids Res. 20:3721-3724, 1992), A invertase Gin do bacteriófago Mu (Spaeny-Dekking, L., Schlicher, E., Franken, K., van de Putte, P., Goosen, N. J. Bacteriol. 34:1779-1786, 1995), domínio de dimerização da proteína NTRC de E. coli (Klose, K.E., North, A.K., Stedman, K.M., Kustu, S. J. Mol. Biol. 241:233-245, 1994) e domínio de dimerização ICP4 de HSV-1 (Gallinari, P., Wiebauer, K. , Nardi, M.C., Jiricny, J. J. Virol. 68:3809-3820, 1994).

Também pode ser utilizado um domínio de dímero de elevada temperatura de organismos thermus (MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D., Biochemistry 37:100062-73, 1998 e MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D., Science 279:1958-61, 1998). Estes são domínios funcionais que, quando incorporados dentro de uma molécula, permitem que a dimerização ocorra. Além disso, a dimerização pode ser alcançada em células através da utilização de vectores de IgG completa ou domínios de dimerização, tal como os domínios de dimerização CH3. Alguém com conhecimentos gerais na técnica está familiarizado com estes e outros domínios de dimerização e a sua utilização para dimerizar proteínas.

Os métodos adicionais que podem ser utilizados para produzir construções de anticorpos que contêm, pelo menos, dois sítios de ligação são conhecidos. O anticorpo ou fragmentos de 34 anticorpo criados por cada destas abordagens poderiam ser utilizados para testagem de actividade agonistica de anticorpo, como descrito no Exemplo 1 abaixo para a IgG intacta produzida em células mamíferas. Estes métodos incluem a dimerização química de Fab, pegilação de Fab, produção de Fab'2, produção de IgG intacta em células bacterianas e utilização de diacorpos (scFv). Facto importante, qualquer das formas de anticorpo produzidas para análise de actividade agonistica poderia ser utilizada como produto terapêutico final. A dimerização química também pode ser alcançada utilizando uma variedade de reagentes de reticulação química. Por exemplo, o SMCC (Succinimidil trans-4 (maleimidilmetil) ciclo-hexano-l-carboxilato) da Molecular Probes (Eugene,

Oregon), N° Cat S-1534. Este reagente modificará grupos amino primários no anticorpo. Após incubação do anticorpo com o SMCC à temperatura ambiente, a reacção é realizada numa coluna PD-10. Este Fab derivatizado com maleimido pode ser adicionado a um segundo Fab ou a uma cultura em descontinuo separada do mesmo Fab que tenha sido tratada com TCEP [(Tris (2-carboxietil) fosfina, cloridrato): Molecular Probes N° Cat T-2556] para reduzir os grupos tiol a SH. A reacção de redução é efectuada no escuro, durante 15 minutos. A conjugação do Fab de maleimido e o Fab com tiol reduzido ocorre a uma razão 1:1. Os dímeros são isolados através da passagem da reacção sobre uma coluna de filtração em gel sephadex 200. Outros adaptadores químicos conhecidos pelos especialistas na técnica podem ser utilizados para dimerização. A produção de um Fab' que tem uma resíduo extra de cisteína manipulado na região de articulação foi descrita, e. g. , na Patente U. S . 5677425 e Cárter, et al. , BioTechnology, Vol 10, Fev. de 1992, páginas 163 -167. Esse sítio tiol pode ser utilizado para conjugação a fracçoes, tal como 35 polietilenoglicol (PEG). A tecnologia de pegilação é conhecida, por exemplo, ver Koumenis et al. , Int. J. Pharm. (2000) 198 (1): 83-95, que torna possível ligar duas moléculas de Fab' em conjunto utilizando a ligação com PEG. A tecnologia para a produção bacteriana de Fab'2 envolve a clonagem da região de articulação de IgG humana e, opcionalmente, parte do CH2, como parte do Fd, que inclui cisteínas adicionais e é descrita, e. g. , em Better, et al. , PNAS USA (1993) 90(2) : 457-61. Os grupos tiol adicionais na articulação de Fd podem interagir e fazer com que duas moléculas de Fab' dimerizem, criando um Fab'2. O Fab'2 pode ser purificado directamente a partir de células bacterianas. Adicionalmente, o Fab' não dimerizado das bactérias pode ser isolado e quimicamente convertido em Fab'2.

Como descrito anteriormente, as regiões variáveis do anticorpo podem ser clonadas como uma cadeia única, em que a leve variável (VL) é conectada à pesada variável (VH) por uma região adaptadora. Se essa região adaptadora for curta (por exemplo 5-7 aminoácidos) , o enrolamento do scFv favorecerá a associação de dois scFv, onde a VL de um scFv emparelha com a VH do segundo scFv. Deste modo, são apresentados no diacorpo dois sítios de ligação de antigénio.

As construções de anticorpos que contêm dois sítios de ligação podem ser produzidas utilizando qualquer destes métodos, de modo a testar a actividade agonista e/ou serem utilizadas como o produto terapêutico final.

Após as etapas de enriquecimento ou triagem de bibliotecas de Fab, a biblioteca de moléculas enriquecidas é restringida com 36

Sac I e Spe I e clonada no pRL8. A subclonagem no vector pRL8, individualmente ou en masse, após triagem ou enriquecimento de FACS, permite a expressão de Fab de ligação solúveis diméricos para análise em bioensaios. No pRL8, os fragmentos de anticorpo são transportados para o espaço periplasmático e formam ai dimeros. A vantagem desta abordagem é que permite o enriquecimento dos fragmentos de Fab monoméricos, favorecendo Fab de elevada afinidade.

Outra abordagem utiliza um anticorpo secundário. 0 pRL4 tem uma cauda decapeptidica de hemaglutinina reconhecida pelo anticorpo HA.11 comercialmente disponível (Babco, Berkeley, CA). Os Fab identificados na triagem ou enriquecimento de FACS a serem testados em bioensaios são pré-incubados com HA.11 que promoverá a dimerização, antes da adição aos bioensaios.

Uma vez identificados os scFv ou Fab de ligação por enriquecimento ou outro método de selecção, os clones individuais, cada expressando um fragmento de anticorpo dimerizado único na superfície do fago, são testados para efeitos de proliferação, diferenciação, activação ou sobrevivência nas células alvo. Além disso, os anticorpos dimerizados solúveis são examinados em bioensaios. 37

Ensaios Biológicos para Rastreio para Actividade Semelhante

a TPO 1. Ensaios de formação de colónias - Colónias de megacariócitos de medula óssea (kit Megacult C da Stem Cell Technologies Inc., Vancouver BC, Canadá). 2. Ensaios de proliferação - proliferação de células Ba/F3 (Cwirla et ai., 1997, Science, Vol. 276 páginas 1696-1699). A linha celular Ba/F3-mpl foi estabelecida (F. de Sauvage et al., Nature, 369:533 (1994)) por introdução do ADNc codificando o receptor cMpl integral dentro da linha celular Ba/F3 linfoblastóide murina dependente de IL-3. A estimulação da proliferação de células Ba/F3-mpl em resposta a diversas concentrações de anticorpos ou TPO foi medida pela quantidade de incorporação de 3H-timidina, como anteriormente descrito (F. de Sauvage et ai., supra). 3. Ensaios de fosforilação - fosforilação de JAK2 (Drachman et ai., J. Biol. Chem. , (1999), Vol. 274, páginas 13480-13484). 4. Ensaios de base transcricional - O receptor cMpl de comprimento completo co-transfectado de modo transiente com a construção repórter de luciferase do promotor c-Fos. 24 horas após transfecção, submeter as células a inanição em FCS a 0,5%, durante 24 horas. Estimular as células, recolher após 6 horas e registar as leituras de luciferase (ver também o Exemplo 1, secção Ensaios Biológicos). 38

Ensaios Biológicos para Rastreio para Actividade Semelhante

a EPO 1. Formação de colónias eritróides de medula óssea em Metilcelulose (Wrighton et al. , Science, 1996, Vol. 273, páginas 458-463) . 2. Proliferação de células TF-1 (Linha celular de eritroleucemia humana). As células TF-1 expressam uma forma de comprimento completo e uma truncada da Epo-R. (J.Cell Physiol., 1989, Vol 140, páginas 323-334). 3. 0 receptor de EPO liga-se directamente à cinase JAK2 para induzir a fosforilação da tirosina. A Epo induz o cFos em células TF-1. Activação transcricional de c-Fos. (Witthuhn et al., Cell, (1993), Vol. 74, páginas 227-236).

Pode ser utilizado um número de bioensaios no rastreio de alta capacidade. Alguém com conhecimentos gerais na técnica está familiarizado com estes e outros bioensaios adequados. Foram desenvolvidos vários ensaios não radioactivos, nos quais pode ser analisada a síntese de ADN ou a actividade enzimática. Por exemplo, pode ser utilizado um ensaio de proliferação celular MTT (Promega Corporation, Madison, WI) que se baseia num ensaio descrito por Mosmann (Mossman, T. 1983. J. Immunol. Methods 65:55-57) . Este protocolo é rápido e fácil. No ensaio, o MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio), um sal de tetrazólio, é convertido num produto de formazano azul, por actividade de desidrogenase mitocondrial em células vivas. O teor de desidrogenase e, por conseguinte, a quantidade de produto colorido produzido, é proporcional ao número de células. O produto colorido é detectável num leitor de placas de ELISA a 570 nm. Os ensaios são realizados em triplicado, en masse, em placas de microtitulação de 96 poços. 39

Resumidamente, as células alvo são plaqueadas em aliquotas de 100 pL, em meio de cultura, em placas de 96 poços. Após a adição de diversas concentrações de anticorpos, as células são incubadas, durante 48-72 horas, a 37 °C e CO2 a 5%, numa atmosfera totalmente humidificada. 0 MTT é adicionado a cada poço e a proliferação monitorizada por meio de leitor de placas de ELISA.

Por exemplo, em ensaios de proliferação utilizando células TF-1, as células bacterianas contendo fagemideos expressando anticorpos são cultivadas, de um dia para o outro, a 37 °C, em placas de poços fundos de 96 poços, em 1 mL de um meio que é uma mistura de meios de células mamíferas e meios bacterianos (no caso das células TF-1: RPMI 2,7/SB 0,3/Carb 100 pg/mL). As células TF-1 são uma linha celular de eritroleucemia de medula óssea humana que responde a múltiplas citocinas (Kitamura, T.,

Tange, T., Terasawa, T., Chiba, S., Kuwaki, T., Miyagawa, K., Piao, Y.F., Miyazono, K., Urabe, A., Takaku, F., Cell Physiol. 140:323-334, 1989; Kitamura, T., Tojo, A., Kuwaki, T., Chiba, S., Miyazono, K., Urabe, A., Takaku, F., Blood 73:375-380, 1989;

Kitamura, T., Takaku, F., Miyajima, A., Int. Immunol. 3:571-577, 1991) . No dia seguinte, as culturas de um dia para o outro são subcultivadas 1/10 para tabuleiros novos e colocadas a 37 °C, durante 2 horas. Após a indução com IPTG a 37 °C, durante 4 horas, as placas são centrifugadas a 2000 rpm/15', à temperatura ambiente. 50 pL de cada sobrenadante de cultura são filtrados em tabuleiros de filtro de 96 poços (Millipore) para placas de ensaio de 96 poços estéreis. As células de mamífero são pré-lavadas para remover factor de crescimento e ressuspensas a uma concentração de 1 X 105 células/mL. São adicionados a cada poço 50 pL de células. As placas de ensaio são incubadas numa incubadora a 37 °C/C02 a 5%, durante 20 horas. 40 Às 72 horas, os tabuleiros são desenvolvidos através da adição de 40 pL de meios/MTS/PMS por poço. O MTS é uma versão mais solúvel melhorada de MTT. Ambos os ensaios são baseados na conversão celular do sal de tetrazólio. Um kit de ensaio de proliferação de MTS (catálogo número G5421) pode ser adquirido à Promega, Inc. (Madison, WI) . As placas são mantidas a 37°/incubadora de C02 e lidas a OD490 às 1 hora, 4 horas, 8 horas com leitor de microplacas.

As actividades das citocinas são, frequentemente, sinérgicas. A sinergia poderia manifestar-se através da ligação dos ligandos a dois receptores diferentes que, depois, enviam o sinal correcto, ou por meio de um efeito de iniciação, pelo que a interacção do ligando/receptor inicia a célula a responder a uma segunda citocina. Além disso, as citocinas que actuam precocemente no desenvolvimento da linhagem são mais frequentemente sinérgicas do que as citocinas que actuam em estádios mais tardios numa via do desenvolvimento. Por conseguinte, as concentrações suboptimais de factores de crescimento podem ser utilizadas nestes bioensaios para examinar o sinergismo. As condições para concentrações suboptimais são determinadas para cada ensaio. Isto é feito através da adição de diluições em série de factores de crescimento, individualmente e como uma mistura, aos ensaios e a determinação dos níveis abaixo dos quais um único factor não promove uma resposta, em comparação com a mistura e o nível abaixo do qual a mistura não promove uma resposta no bioensaio. As células do estroma de medula óssea também podem ser adicionadas em bioensaios para proporcionar outros factores necessários que podem desempenhar uma função numa resposta sinérgica. 41

Além disso, a proliferação celular pode ser examinada através da monitorização da síntese de ADN. Um ensaio não radioactivo, colorimétrico, que examina a incorporação de 5-bromo-2'-desoxi-uridina (BrdU) (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) pode ser realizado no formato de placa de microtitulação. Aqui, as células são cultivadas em placas de 96 poços e incubadas com BrdU e concentrações suboptimais de citocinas. A quantidade de BrdU é determinada após marcação com um anticorpo anti-BrdU marcado com peroxidase. Os resultados finais são analisados por leitor de placas de ELISA a 405 nm.

Também pode ser utilizado um ensaio radioactivo de mitogénese que mede a taxa de síntese de ADN como uma indicação de proliferação (Raines e Ross, Methods of Enzymol. 109: 749-773, 1985). Nestes ensaios, são examinadas as alterações na taxa de incorporação de [3H]-timidina em células alvo. Novamente, estes ensaios permitem o rastreio concomitante e rápido de muitos fragmentos de anticorpo. Têm sido largamente utilizados como um método conveniente de avaliação dos efeitos inibitórios e estimulatórios no crescimento de muitas células diferentes. As células são cultivadas em suspensão até atingirem a taxa de crescimento exponencial. As células são, depois, lavadas do meio no qual foram cultivadas e replaqueadas em meio fresco. As células são aliquotadas em placas de 96 poços, num volume total de 100 pL, a uma concentração de cerca de 1-2 x 105 células/mL. As diluições de sobrenadante de fago, anticorpos de Fab ou ScFv dimerizados solúveis são adicionadas e as células são incubadas, durante 18-48 horas, numa incubadora com gás CO2, a uma temp. de 37 °C. Após a incubação, é adicionada [3H]timidina (937 kBq) a cada poço e incubada durante 4 horas adicionais. As células são, depois, removidas da incubadora e contadas directamente num contador de cintilação de microplacas de 42 bancada, tal como o Packard Top Count NXT Instrument (Packard, Meriden, CT) . Alternativamente, as células podem ser transferidas serialmente para filtros GF/C num colector celular Millipore (Millipore, Bedford, MA) ou aparelho semelhante. A radioactividade associada a material insolúvel em ácido retido no filtro é, depois, determinada. As diluições de factores de crescimento comercialmente disponíveis são aplicadas a poços de controlo positivo. Os controlos negativos incluiriam sobrenadantes de células transportando plasmídeos não contendo insertos ou anticorpos irrelevantes tratados de modo semelhante. As actividades promovendo o crescimento relativo do padrão e dos diluentes dos sobrenadantes de fago sob teste são comparadas para quantificar a actividade promovendo o crescimento na amostra. A activação pode ser testada através do ensaio de segundos mensageiros ou por ensaios de leitura transcricional. A sobrevivência pode ser ensaiada, por exemplo, através da monitorização da apoptose utilizando ensaios, tal como ensaios de túnel, ou por outros métodos conhecidos dos que praticam a técnica.

Outros ensaios úteis para analisar a transdução de sinal celular, a actividade de cinases e fosfatases e, em última análise, as actividades celulares como resultado da actividade agonista, incluem a medição da produção de segundos mensageiros, e. g., cAMP, Ca++, diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). A medição de picos na concentração de cálcio intracelular, pH intracelular e potencial de membrana em ensaios de rastreio de alta capacidade pode ser realizada utilizando instrumentos, tal como o FLIPR Fluormetric Imaging 43

Plate Reader System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Está disponível um número de sondas fluorescentes para examinação de concentrações de segundo mensageiro (Molecular Probes, Eugene OR) . A medição de concentrações de segundos mensageiros também pode ser feita ao nível de célula única (DeBernardi, M.A. e Brooker, G. Proc. Natl. Acad. Sei USA 93:4577-4582, 1996). Além disso, seriam úteis ensaios que examinassem outros eventos de sinalização, tais como fosforilação, apoptose ou níveis de ARN ou proteína de genes específicos. Por exemplo, mostrou-se que a maioria das citocinas activa a enzima PI 3-K (revisto em

Silvennoinen, 0., Ihle, J.N. Signaling by the Hematopoietic

Cytokine Receptors, R.G. Landes company, Austin, TX 1996). Além disso, mostrou-se que a família Jak de tirosinas cinases são mediadores centrais para a sinalização do receptor de citocina (Ihle, J.N., Witthuhn, B.A., Quelle, F. W. Annu. Rev. Immunol. 13:369-398, 1995) . Além disso, várias outras tirosinas cinases, e. g. , membros da família Src, são activadas em resposta a estimulações de determinadas citocinas. No caso de ARN ou proteínas, e. g. , c-Jun e c-Fos, são rapidamente e de forma transiente reguladas positivamente após estimulação de citocina, ao passo que a indução de c-Myc é mais lenta. Estas proteínas são requeridas para a transição G1 e proliferação (revisto em Silvennoinen, 0., Ihle, J.N. Signaling by Hematopoietic Cytokine Receptors, R.G. Landes Company, Austin, TX 1996) . Poderiam ser utilizados rastreios de alta capacidade que detectam aumentos nestes transcritos.

Em ensaios de leituras transcricionais, as alterações na transcrição de genes específicos são observadas após exposição de células a um factor de crescimento ou mimético de factor de crescimento (anticorpo agonista ou inibitório). Por exemplo, num ensaio de leitura de myc, as células, tal como a linha celular 44 FDCP-mix dependente de IL-3, são submetidas a inanição do factor de crescimento IL-3, durante 8 horas, seguida de exposição aos miméticos do factor de crescimento, ou factores de crescimento nativos, durante 2 horas, a 37 °C. Neste momento, as células são recolhidas, o ARN é isolado e são realizadas reacções de polimerização em cadeia de transcritase reversa (RT-PCR), com iniciadores específicos para o gene myc. As reacções de RT-PCR são submetidas a electroforese em géis de agarose horizontais para quantificação do produto de PCR. Neste caso, está a ser monitorizada a expressão de um único gene.

Alternativamente, o ensaio para alterações na expressão de genes pode ser monitorizado utilizando a tecnologia CHIP, os anticorpos agonistas poderiam ser identificados sob condições de elevada sensibilidade de sonda e uma gama dinâmica. Deste modo, até 10000 ou mais poderiam ser analisados para alterações na expressão. Os genes desejados que poderiam ser monitorizados poderiam incluir c-myc, c-jun, NF-κΒ, entre outros. Estes genes estão a jusante de diversas vias de transdução de sinal e a sua expressão deverá alterar-se após uma resposta mitogénica. Num tipo de CHIP comercialmente disponível (Affymetrix, Santa Clara, CA) , os oligonucleótidos de genes de teste desejados podem ser impressos sobre superfície de vidro. As células alvo são expostas a anticorpos agonistas de teste. O ARN é isolado das células expostas a anticorpos agonistas de teste, copiado para ADNc e transcrito in vitro na presença de biotina. A hibridação de ARNm biotinilado, transcrito in vitro, é utilizada como sonda nas matrizes. Os chips são, depois, sondados para determinar genes que mostrem aumentos em transcrição após exposição a anticorpos agonistas de teste. Noutra versão da tecnologia CHIP (Incyte, Paio Alto, CA), a quantidade de ADN não é normalizada no vidro, por conseguinte, pode implementar-se uma hibridação 45 competitiva. 0 ARN é isolado das células antes e após exposição ao agonista. 0 ADNc é preparado a partir de cada amostra, pelo que uma reacção de ADNc tem um marcador incorporado, por exemplo, Cy-3 e a outra população de ADNc tem um marcador diferente incorporado, por exemplo Cy-5. Os sinais são detectados e comparados num rastreio de duplo laser para recolher imagens.

Também podem ser utilizados ensaios visuais, tal como os ensaios de formação de colónias de metilcelulose tradicionais (Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canadá). Nestes ensaios, o crescimento das colónias e as alterações morfológicas são pontuados por meio de microscópio óptico. A examinação visual pode ser realizada para efeitos de proliferação ou diferenciação em culturas de ágar semi-sólidas ou metilcelulose, utilizando a linha celular apropriada. Williams Hematology 5 (eds. E. Beutler, M.A. Lichtman, B.S. Coller L T.J. Kipps), McGraw-Hill, Inc., p. L22-L26, 1995) . A adição de metilcelulose permite que a progénie clonal de uma única célula progenitora fique junta e facilite o reconhecimento e enumeração de colónias distintas. Todos os componentes necessários são adicionados a meio básico de metilcelulose (tais como o MDM de Iscove, BSA, (-mercaptoetanol, L-glutamina)), excepto suplementos de factor de estimulação de colónias e os anticorpos de teste (sobrenadantes de fago, anticorpos solúveis) são adicionados para ver se podem substituir factores de crescimento. As células em cultura de metilcelulose são incubadas, durante 10-12 dias, após a adição de anticorpos numa atmosfera humidificada, a 37 °C, de CO2 a 5% em ar. Após 10-12 dias de incubação, as colónias são contadas utilizando um microscópio invertido. Após outros 8-10 dias, as colónias são contadas de novo. As comparações são realizadas entre meios contendo anticorpos e 46 controlos, com e sem factores de crescimento. Além disso, as colónias podem ser recolhidas de metilcelulose e as células individuais examinadas citologicamente através de coloração com o corante de Wright (ver Atlas of Hematological Cytology, F.G.J. Hayhoe e R.J. Flemans, Wiley-InterScience 1970).

As afinidades de ligação do receptor de fragmentos de anticorpo podem ser calculadas (Lfas & Johnson, 1990) a partir das constantes de velocidade de associação e dissociação, medidas utilizando um sistema de ressonância de plasmónio de superfície BIACORE (Pharmacia Biosensor) . Um chip biossensor é activado para ligação covalente do receptor gD-mpl utilizando cloridrato de N-etil-N'''-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor (Pharmacia Biosensor). O tampão de gD-mpl é trocado para tampão de acetato de sódio a 10 mM (pH 4,5) e diluído para, aproximadamente, 30 pg/mL. Uma alíquota (5 pL) é injectada a um caudal de 1 pL/min para alcançar, aproximadamente, 400 unidades de resposta (RU) de proteína ligada. Finalmente, é injectada etanolamina a 1 M como um agente de bloqueio. Para medições de cinética, 1,5 diluições em série de anticorpo são injectadas em tampão de PBS/Tween (Tween-20 a 0,05%, em solução salina tamponada com fosfatos), a 25 °C, utilizando um caudal de 20 pL/min. As constantes de dissociação de equilíbrio, Kd, das medições de SPR são calculadas como koff/kon· Os desvios -padrão, son para kon e s0ff para ^off f são tipicamente obtidos de medições com concentrações de proteína > 4 (kon) ou com concentrações de proteína > 7 (koff) . Os dados de dissociação são ajustados para um modelo AB->A+B simples para se obter koff + /- s.d. (desvio-padrão das medições). As constantes de velocidade (ks) de pseudo-primeira ordem são calculadas para cada curva de associação e representadas 47 graficamente em função da concentração de proteína para se obter k0n +/- s.e. (erro-padrão do ajuste).

Para a conversão de clones de anticorpo em IgG completas, as regiões codificantes para as cadeias leve e pesada ou os seus fragmentos, podem ser clonadas separadamente de um vector bacteriano e em vector(es) de mamífero (s) . Um sistema vector único, tal como pDRl ou seus derivados, pode ser utilizado para clonar cassetes de cadeias leve e pesada no mesmo plasmídeo. Alternativamente, podem ser utilizados vectores de expressão dual, onde as cadeias pesadas e leves são produzidas por plasmídeos separados. As sequências sinal mamíferas não necessitam de estar já presentes no vector ou vectores finais (finais) ou anexos à extremidade 5' dos insertos de ADN de cadeia leve e pesada. Isto pode ser alcançado por transferência inicial das cadeias para os vectores vaivém contendo as sequências condutoras mamíferas convenientes. Após a digestão de restrição enzimática, as regiões de cadeia leve e cadeia pesada, ou os seus fragmentos, são introduzidas no vector ou vectores finais, onde as restantes regiões constantes para IgGl são proporcionadas com ou sem intrões. Em alguns casos, onde são utilizados intrões, a concepção de iniciadores para amplificar por PCR as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada a partir de pRL4 pode necessitar de incluir sítios dadores de excisão de exão, de modo a obter-se uma excisão e produção conveniente dos anticorpos em células mamíferas.

Com qualquer dos sistemas vectores de expressão (plasmídeo único ou duplo), a produção de cadeias pesadas e leves de anticorpos pode ser dirigida por promotores que funcionam em células mamíferas, tais como mas não limitadas a CMV, SV40 ou promotores de IgG. Adicionalmente, o vector ou vectores conterão 48 um marcador seleccionável para crescimento em bactérias (tais como mas não limitados a resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou zeocina) . Os marcadores seleccionáveis para células mamíferas (tais como mas não limitados a resistência a DHFR, GS, gpt, Neomicina ou higromicina) também podem estar presentes no(s) vector(es) de IgG, ou poderiam ser proporcionados num plasmídeo separado por co-transfecção.

Alguém com conhecimentos gerais na técnica, utilizando técnicas conhecidas, seria capaz de sintetizar anticorpos em outros organismos, tais como leveduras, mamíferos, insectos e plantas (Carlson, J.R. e Weissman, I.L., Mol. Cell. Biol., 8:2647-2650, 1988; Trill, J.J., Shatzman, A.R., Ganguly, S. Curr. Opin. Biotechnol. 6:553-560, 1995; Hiatt, A., Cafferkey, R. Bowdish, K. Nature 342: 76-78, 1989).

Como referido anteriormente, os anticorpos preparados de acordo com a presente divulgação proporcionam meia-vida (duração da acção) aumentada em relação à actividade de pequenos péptidos ou miméticos peptídicos, tal como o mimético de TPO aqui descrito. Noutro aspecto, a meia-vida sérica de um anticorpo pode ser ela própria prolongada através da preparação de derivados que sejam pegilado. Ver, e. g. , Lee, et ai., Bioconjug. Chem (1999) 10(6): 973-81. Outra vantagem, e. g. , do anticorpo mimético de TPO aqui descrito, é que o tratamento com TPO normal pode resultar na produção de anticorpos neutralizantes de TPO em doentes que interferem com a actividade do TPO de ocorrência natural de um doente. O presente anticorpo mimético de TPO reduz substancialmente a probabilidade de que seja produzida uma resposta imunitária prejudicial para o TPO nativo, porque tem uma sequência de aminoácidos diferente. 49

As moléculas abrangidas pelas reivindicações podem ser utilizadas em diagnóstico, onde os anticorpos ou os seus fragmentos estejam conjugados a marcadores detectáveis, ou utilizadas como anticorpos primários com anticorpos secundários que estejam conjugados a marcadores detectáveis. Os marcadores detectáveis incluem marcadores radioactivos e não radioactivos e são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Os marcadores não radioactivos comuns incluem enzimas detectáveis, tais como peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e moléculas fluorescentes. As moléculas fluorescentes absorvem a luz a um comprimento de onda e emitem-no a outro permitindo, deste modo, a visualização com, e. g., um microscópio fluorescente. Os espectrofotómetros, microscópios de fluorescência, leitores de placas fluorescentes e triadores de fluxo são bem conhecidos e são, frequentemente, utilizados para detectar moléculas especificas tornadas fluorescentes através da sua ligação covalente a um corante fluorescente. Os fluorocromos, tais como proteina verde flurorescente, mutantes com desvio para o vermelho da proteina verde fluorescente, ácido acético de aminocoumarina (AMCA), isotiocianato de fluoresceina (FITC), isotiocianato de tetrametilcodamina (TRITC), Vermelho de Texas, Cy3.0 e Cy5.0 são exemplos de marcadores úteis.

As moléculas podem ser utilizadas em estratégias de isolamento de células, tal como a triagem celular de activação fluorescente (FACS), se forem utilizados marcadores fluorescentes. Na triagem celular de activação fluorescente, as células marcadas com moléculas fluorescentes são triadas electronicamente num citómetro de fluxo, tal como um citómetro FACS IV, da Becton-Dickinson (San Jose, Califórnia), ou instrumento equivalente. As moléculas fluorescentes são anticorpos que reconhecem antigénios específicos de superfície 50 celular. Os anticorpos são conjugados a marcadores fluorescentes, tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou Ficoeritrina (PE) . A triagem magnética também é possivel. Em processos de triagem magnética, o anticorpo está ligado directamente ou indirectamente a microesferas magnéticas. As células são pré-revestidas com anticorpos que reconhecem moléculas de superfície celular, e. g. , receptores envolvidos na proliferação, diferenciação, activação ou sobrevivência. Os anticorpos são conjugados a esferas magnéticas, conjugadas com uma imunoglobulina secundária, que se liga ao anticorpo primário apresentando o péptido, tal como à cauda molecular HA manipulada em cada anticorpo. As células são, depois, removidas com um iman. A triagem magnética pode ser selecção positiva, onde as células de interesse estão ligadas pelo anticorpo e, por este motivo, ao iman, ou selecção negativa, onde as células não desejadas são isoladas sobre o iman.

Alternativamente, os anticorpos marcados radioactivamente podem ser utilizados para efeitos de diagnóstico.

Os anticorpos e os seus fragmentos aqui divulgados são úteis para a amplificação de uma variedade de tipos de células clinicamente relevantes. 0 tratamento pode ser in vivo ou ex vivo. Por exemplo, os anticorpos agonistas são úteis para tratar doentes sofrendo de uma deficiência numa população celular causada por doença, distúrbio ou tratamento relacionado com, por exemplo, supressão de hematopoiese, onde está presente num doente um número inferior ao normal de células de uma dada linhagem ou linhagens. 0 seguinte representa apenas alguns exemplos dos estados que podem ser tratados com os anticorpos 51 contendo os péptidos biologicamente activos aqui divulgados, os que praticam a técnica seriam capazes de identificar outras doenças e estados que beneficiariam desse tratamento. Por exemplo, doentes infectados com o VIH, doentes sujeitos a quimioterapia, doentes com transplante de medula óssea, doentes com transplante de células estaminais e doentes sofrendo de distúrbios mieloproliferativos mostram níveis subnormais de linhagens hematopoiéticas específicas. A trombocitopenia pode ser um resultado de quimioterapia, transplantação de medula óssea ou doença crónica, tal como a trombocitopenia idiopática (ITP), que resultam todas em níveis baixos de plaquetas. Os presentes anticorpos miméticos de TPO podem ser utilizados para tratar esses doentes.

Os doentes sujeitos a diálise renal sofrem, frequentemente, de anemia relacionada com o tratamento, com níveis subnormais de glóbulos vermelhos. Na anemia aplástica, a supressão de medula óssea pode causar pancitopenia ou pode afectar apenas os glóbulos vermelhos, os glóbulos brancos ou as plaquetas. Os anticorpos divulgados aumentarão o armamentário dos agentes terapêuticos para estas e outras doenças e distúrbios, caracterizados por deficiências em populações celulares específicas, tal como células hematopoiéticas.

As moléculas abrangidas pela invenção reivindicada também podem ser utilizadas para proliferação e diferenciação de células ex vivo. Isto é útil para efeitos de terapia génica, por exemplo para abordagens de vector virai tradicionais e para transplantes autólogos de medula óssea. 52

Além disso, determinados anticorpos de acordo com a presente divulgação podem ser marcados radioactivamente para radioimunoterapia ou conjugados a toxinas para distribuir essas toxinas a tipos específicos de células e resultam na morte dessas células.

Um anticorpo agonista de c-mpl biologicamente activo, capaz de estimular a proliferação, diferenciação e maturação de células hematopoiéticas, pode ser utilizado numa preparação ou formulação farmacêutica estéril para estimular a actividade megacariocitopoiética ou trombopoiética em doentes sofrendo de trombocitopenia, devido a deficiente produção, sequestração ou destruição aumentada de plaquetas. A hipoplasia da medula óssea associada a trombocitopenia (e. g. , anemia aplástica após quimioterapia ou transplante de medula óssea) pode ser eficazmente tratada com os anticorpos divulgados, assim como distúrbios, tais como coagulação intravascular disseminada (DIC), trombocitopenia imunitária (incluindo IIP induzida por VIH e ITP não induzida por VIH), trombocitopenia idiopática crónica, trombocitopenia congénita, mielodisplasia e trombocitopenia trombótica.

Os anticorpos agonistas de c-mpl biologicamente activos aqui divulgados contendo o péptido mimético de TPO podem ser utilizados do mesmo modo e para as mesmas indicações que a trombopoietina (TPO). A trombopoietina (TPO) estimula a megacariocitopoiese e produção de plaquetas. Espera-se que estes anticorpos tenham uma meia-vida mais longa do que a TPO nativa ou pegilada e, deste modo, sejam utilizados em indicações onde seja indicada uma meia-vida mais longa. 53

Um exemplo de um ensaio útil para determinar a actividade de miméticos de TPO é o ensaio de recrudescência de trombocitose, que envolve administrar uma única injecção de soro de plaquetas anti-murganho de cabra a murganhos para induzir a trombocitopenia aguda (dia 0) . Nos dias 5 e 6, os murganhos são injectados com amostras de teste. No dia 8 são determinadas as contagens de plaquetas (incorporação de 35S em plaquetas).

Os presentes anticorpos miméticos de EPO estimulam a hematopoiese num modo semelhante à EPO de ocorrência natural. Essa terapia é útil no tratamento de estados onde a produção de glóbulos vermelhos esteja comprometida, tal como na insuficiência renal crónica. A actividade biológica dos anticorpos miméticos de EPO pode ser determinada utilizando ensaios in vitro ou in vivo.

Um ensaio in vitro mede o efeito dos anticorpos miméticos de eritropoetina na eritropoiese em células intactas de baço de murganho, de acordo com o processo de Krystal, G., Exp. Hematol. 11:649-660 (1983) . Para rastrear diversas formas de realização dos anticorpos miméticos de EPO para actividade, por exemplo, in vitro ou in vivo, o anticorpo mimético de EPO pode ser avaliado quanto à extensão da eritropoiese ou ligação de receptor. Os testes para determinar a actividade biológica são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, a actividade biológica da eritropoetina pode ser medida como descrito, e. g., na Pat. U.S. N° 5614184 e Pat. U.S. N° 5580853. A via de administração do anticorpo está de acordo com métodos conhecidos, e. g., injecção ou infusão pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, subcutânea, intra-ocular, intra-arterial, intratecal, inalação 54 ou intralesional, tópica ou por sistemas de libertação prolongada, como notado abaixo. 0 anticorpo é, de um modo preferido, administrado continuamente por infusão ou por injecção de bólus. Os anticorpos podem ser administrados de um modo local ou sistémico.

Os anticorpos da invenção podem ser preparados numa mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável. As técnicas para formulação e administração dos compostos do presente pedido podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição. Esta composição terapêutica pode ser administrada intravenosamente ou através do nariz ou pulmão, de um modo preferido como um aerossol liquido ou em pó (liof ilizado) . A composição também pode ser administrada parentericamente ou subcutaneamente, como desejado. Quando administrada sistematicamente, a composição terapêutica deve ser estéril, apirogénica e numa solução parentericamente aceitável tendo em consideração o pH, isotonicidade e estabilidade. Estas condições são conhecidas pelos especialistas na técnica.

Resumidamente, as formulações de dosagem dos compostos da presente invenção são preparadas para armazenamento ou administração, através da mistura do composto tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis. Esses materiais são não tóxicos para o receptor às dosagens e concentrações empregues e podem incluir tampões, tais como TRIS HC1, fosfato, citrato, acetato e outros sais de ácido orgânico; antioxidantes, tal como ácido ascórbico; péptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de dez resíduos), tal como poliarginina, proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros 55 hidrófilos, tal como polivinilpirrolidinona; aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou arginina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo celulose ou seus derivados, glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões, tal como sódio e/ou surfactantes não iónicos, tais como TWEEN, PLURONICS ou polietilenoglicol.

Quando utilizada para administração in vivo, a formulação de anticorpo deve ser estéril e pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional. Tal é facilmente alcançado por filtração através de membranas de filtração estéril, antes ou após liofilização e reconstituição. Habitualmente, o anticorpo será armazenado na forma liofilizada ou em solução. Podem ser desejados outros veículos, tais como óleo vegetal de ocorrência natural, como o óleo de sésamo, amendoim ou de semente de algodoeiro ou um veículo gorduroso sintético, como o oleato de etilo ou semelhantes. Tampões, conservantes, antioxidantes e semelhantes podem ser incorporados de acordo com a prática farmacêutica aceite.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização incluem composições em que um ou mais anticorpos concebidos de modo racional estão contidos numa quantidade eficaz para alcançar o seu objectivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de anticorpo eficaz para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas da doença ou prolongar a sobrevivência do sujeito sendo tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui proporcionada. 56

As dosagens terapeuticamente eficazes podem ser determinadas através da utilização de métodos in vitro e in vivo.

Uma quantidade eficaz do anticorpo a ser empregue terapeuticamente dependerá, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, da via de administração e do estado do doente. Além disso, o médico assistente tem em consideração diversos factores conhecidos por modificarem a acção dos fármacos, incluindo a gravidade e tipo da doença, peso corporal, sexo, dieta, tempo e via de administração, outras medicações e outros factores clínicos relevantes. Consequentemente, para obter o efeito terapêutico óptimo, será necessário que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração como requerido. Tipicamente, o clínico administrará o anticorpo até ser atingida uma dosagem que alcance o efeito desejado. A progressão desta terapia é facilmente monitorizada por ensaios convencionais.

Para qualquer anticorpo contendo um péptido, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios em cultura celular. Por exemplo, pode ser formulada uma dose em modelos animais para alcançar uma gama de concentrações em circulação que inclua o EC5o como determinado em cultura celular (e. g. , a concentração da molécula de teste que promove ou inibe a proliferação ou diferenciação celular). Essa informação pode ser utilizada para determinar com mais rigor as doses úteis em humanos. A toxicidade e eficácia terapêutica das moléculas de anticorpo aqui descritas podem ser determinadas por processos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, e. g. , para determinar a LD50 (a dose letal para 57 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) . A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como uma razão entre LD5o e ED50. As moléculas que exibem índices terapêuticos elevados são preferidas. Os dados obtidos destes ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem dessas moléculas situa-se, de um modo preferido, dentro de uma gama de concentrações em circulação que inclui o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama, dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. A formulação exacta, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual, em vista do estado do doente. (Ver, e. g.r Fingi et al., 1975, em "The Pharmacological Basis of

Therapeutics", Cap. 1 p. 1). A quantidade e intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente, para proporcionar níveis plasmáticos do anticorpo que sejam suficientes para promover ou inibir a proliferação ou diferenciação celular ou a concentração mínima eficaz (MEC) . A MEC variará para cada anticorpo, mas pode ser estimada a partir dos dados in vitro utilizando os ensaios descritos. As dosagens necessárias para alcançar a MEC dependerão de características individuais e via de administração. Contudo, os ensaios de HPLC ou bioensaios podem ser utilizados para determinar as concentrações plasmáticas.

Os intervalos de dosagem também podem ser determinados utilizando o valor da MEC. As moléculas de anticorpo devem ser administradas utilizando um regime que mantenha os níveis plasmáticos acima da MEC durante 10-90% do tempo, de um 58 modo preferido entre 30-90% e, de um modo muito preferido, entre 50-90%.

Nos casos de administração local ou toma selectiva, a concentração local eficaz do anticorpo pode não estar relacionada com a concentração plasmática.

Uma dosagem diária típica poderá variar desde cerca de 1 pg/kg até 1000 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Tipicamente, o clínico administrará a molécula até ser atingida uma dosagem que alcance o efeito desejado. A progressão desta terapia é facilmente monitorizada por ensaios convencionais.

Dependendo do tipo e gravidade da doença, desde cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1000 mg/kg, de um modo mais preferido cerca de 0,01 mg a 100 mg/kg, de um modo mais preferido cerca de 0,010 a 20 mg/kg do anticorpo agonista poderá ser uma dosagem candidata inicial para administração ao doente, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Para administrações repetidas ao longo de vários dias, ou mais, dependendo do estado, o tratamento é repetido até que ocorra uma desejada supressão dos sintomas da doença ou que o melhoramento desejado no estado do doente seja alcançado. Contudo, também podem ser úteis outros regimes de dosagem.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes sao incluídos apenas para efeitos ilustrativos e não se pretende que limitem o âmbito da invenção. 59 EXEMPLO 1

Construção De Biblioteca De Sequências Miméticas De TPO Enxertadas Numa Estrutura de Anticorpo Humano

Um péptido IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° 1) mimético de TPO agonista foi enxertado dentro da CDR3 (HCDR3) de cadeia pesada de Fab do toxóide antitetânico (TT), substituindo a sequência integral de HCDR3 GDTIFGVTMGYYAMDV (SEQ ID N° 4) . A Figura 2A mostra a sequência para o anticorpo do toxóide tetânico humano empregue. Foram consideradas duas abordagens de enxertia. Na primeira abordagem, o péptido agonista foi inserido dentro da região H-CDR3 com duas glicinas flanqueando cada lado. Isto foi para reduzir os constrangimentos estruturais no péptido enxertado, de modo a que pudesse mais facilmente adoptar a conformação necessária. Na segunda abordagem, foram aleatorizadas duas posições de aminoácido em cada lado do enxerto peptidico, de modo a que pudesse ser alcançada a melhor apresentação do péptido (Figura 3). Estas duas abordagens foram consideradas, de modo a determinar se era suficiente o péptido isoladamente ou se eram requeridos resíduos específicos para apresentação conveniente do péptido agonista no esqueleto do anticorpo conferindo, desse modo, a sua actividade ao anticorpo. A Figura 4 esboça o processo de construção da biblioteca. Resumidamente, o Fab do toxóide antitetânico foi amplificado como dois fragmentos. 0 fragmento A foi amplificado utilizando um iniciador directo (N-Omp: 5' TAT CGC GAT TGC AGT GGC ACT GGC 3') (SEQ ID N° 5) que se emparelhava com o condutor Omp A para a cadeia leve, em combinação com um iniciador inverso (TP0CDR3-B: 5' GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT YNN YNN TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEQ ID N° 6) que se emparelhava na 60 extremidade da região de estrutura (FR) 3 da cadeia pesada. 0 iniciador inverso continha uma cauda codificando a nova CDR3. 0 fragmento B foi produzido utilizando um iniciador directo (TP0CDR3-F: 5' CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG NNY NNY TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEQ ID N° 7) que se emparelhava com a FR4 e iniciador inverso Seq-G3Rev (5' TCA AAA TCA CCG GAA CCA GAG C 3') (SEQ ID N° 8) que se emparelhava na região do gene III do plasmideo, a jusante do sinal de terminação da cadeia pesada. 0 iniciador TP0CDR3-F também tinha uma cauda de bases que codificava a nova região CDR3. A TAQ ADN Polimerase (Perkin Elmer) foi utilizada no seguinte programa de PCR: 30 segundos a 94°, depois, 30 ciclos de 94° durante 15 seg, 55° durante 15 segundos e 72° durante 90 segundos, seguido de um período de extensão a 72°, durante 10 minutos e uma espera a 4o. Depois de os fragmentos terem sido produzidos por PCR e purificados em gel, foram combinados para um PCR de extensão de sobreposição. As novas regiões codificadas pelo iniciador de CDR3 eram complementares e proporcionaram 23 bases de

sobreposição. Os iniciadores N-Omp e SeqG3Rev foram utilizados no protocolo de PCR de sobreposição para produzir o produto de ADN de Fab completo. A Taq ADN Polimerase (Perkin Elmer) foi utilizada no seguinte programa de PCR: 30" a 94°, depois, 20 ciclos de 30" a 94°, 30" a 56° e 3Ί5" a 72°, depois, um período de extensão de 72° durante 15', seguido de uma espera a 4o. Após purificação em gel do produto de Fab, foi realizada uma digestão com Sfi I, a 50°, durante 5 horas. Os insertos foram ligados dentro do vector pRL4 digerido com Sfi I, de um dia para o outro. Os produtos de ligação foram precipitados com etanol, ressuspensos em H20 e, depois, electroporados para bactérias competentes ER2537 (estirpe supressora, New England Biolabs). Após uma hora de agitação em 5 mL de SOC, foi adicionado um volume igual de SB. A Carbenicilina foi adicionada para 20 pg/mL 61 e a cultura agitada durante uma hora, a 37°, seguido de uma hora, a 37°, em carbenicilina a 50 pg/mL. A cultura da biblioteca foi transferida para e um frasco contendo 100 mL de SB novo, Carbenicilina a 50 pg/mL e 1012 VCS de fago auxiliar M13. Após duas horas a 37° foi adicionada canamicina para seleccionar para as bactérias que tinham sido infectadas com fago auxiliar. No dia seguinte, as culturas de um dia para o outro foram concentradas e o fago no sobrenadante foi precipitado sobre gelo utilizando PEG a 4%/NaCl a 0,5 M. Após concentração do fago, o sedimento foi ressuspenso em 1% de BSA/PBS, filtrado e dialisado contra PBS. Os fagos da biblioteca foram armazenados a 4o. A construção dos Fab, contendo o péptido ligado não aleatoriamente foi realizada como descrito acima, através da substituição dos iniciadores TPOCDR3-B e TPOCDR3-F com iniciadores específicos alternativos. Para o anticorpo enxertado com PP- (IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEQ ID N° 25), os iniciadores utilizados foram TPOCDR3g-B (5' GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NGG NGG TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3' ) (SEQ ID N° 9) e TPOCDR3g-F (5' CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3' ) (SEQ ID N° 10). Para o anticorpo enxertado com GG-(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEQ ID N° 29), os iniciadores utilizados foram TPO-CDR3-ggB (5' GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NCC NCC TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEQ ID N° 11) e TPOCDR3g-F (5' CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEQ ID N° 12). 62

Selecção da Biblioteca de CDR3 de Cadeia Pesada do Péptido Mimético de TPO

De modo a seleccionar para a apresentação de péptido óptima, o enriquecimento foi realizado em plaquetas humanas. Porque as plaquetas expressam, aproximadamente, 1800 receptores de TPO por célula na sua superfície (receptores cMpl), representavam um bom alvo celular. Além disso, as plaquetas estão facilmente disponíveis a partir de um Banco de Sangue. A 1 mL de plaquetas humanas sem data concentradas do Banco de Sangue, foram adicionados 50 pL de Fab-fago recém-preparado num tubo cónico de 15 mL com NaN3 a 0,1%. O tubo foi misturado, à temperatura ambiente, durante 1-2 horas. Tipicamente, foram adicionados ao fago/células 10 mL de soro humano a 50% (retirado das plaquetas restantes) + 50%{IMDM/FBS a 10%/azida a 0,1%/EDTA a 2 mM} . As plaquetas foram sedimentadas a 5500xg, durante 5 minutos, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi drenado e o sedimento foi deixado a repousar sob -500 pL da lavagem, durante 20 minutos. As plaquetas foram ressuspensas muito suavemente e, depois, foram adicionados ao fago/células 10 mL de soro humano a 25% (retirado das plaquetas restantes) + 75%{IMDM/FBS a 10%/azida a 0,1%/EDTA a 2 mM} . A centrifugação, repouso do sedimento e ressuspensão das plaquetas foram repetidos. Nas séries 3 e 4 de enriquecimento, foi realizada uma terceira lavagem. 0 fago/células lavados foram transferidos para um tubo eppendorf e concentrados a 5200xg. 0 fago foi eluído das plaquetas, 10 minutos à temperatura ambiente, utilizando tampão de eluição ácida (HC1 a 0,1 M, BSA a 1 mg/mL e glicina para pH 2,2). As plaquetas foram sedimentadas à velocidade máxima e o fago eluído transferido para um tubo cónico de 50 mL, neutralizado com Tris Base a 2 Μ. O fago foi, depois, deixado infectar bactérias ER2537 novas, durante 15 minutos, à 63 temperatura ambiente e amplificado, de um dia para o outro, como descrito acima. Foram realizadas quatro séries de enriquecimento de plaquetas.

Após a quarta série de enriquecimento, os agreqados de 3 clones de Fab, expressos como proteínas solúveis na estirpe TOPIOF' bacteriana não supressora (Invitrogen, Carlsbad, CA), foram testados por Facs para ligação a plaquetas, através da utilização da cauda do epitopo HA do Fab com anti-HA de rato de elevada afinidade, seguido de FITC anti-Rato (Sigma, St. Louis, Missouri) . 25 pL de plaquetas humanas concentradas sem data (lavadas uma vez com PBS/EDTA a 5 mM/FBS a 2%) foram incubados com 100 pL de sobrenadante bacteriano (60 pL de sobrenadante bacteriano de três clones de Fab agregados foram pré-incubados com 40 pL de Leite a 5%/PSS a 4o, durante 15 minutos), à temperatura ambiente, durante 20-30 minutos. Foi adicionado 1 mL de tampão FACS (PBS/FBS a 2%/EDTA a 5 mM) e as células concentradas a 5200xg, durante 5 minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas em 50 pL de tampão diluído 1:10 (em PBS/BSA a l%/NaN3 a 0,1%) e foi adicionado o 2o anticorpo anti-HA [clone 3F10 de Elevada Afinidade anti-HA de IgG de Rato (Roche Molecular Biochemicals)]. Após 30 minutos à temperatura ambiente, as células foram lavadas com 1 mL de tampão FACS, como anteriormente. Após centrifugação, as células foram ressuspensas em 100 pL do 3o anticorpo (Sigma) anti-Rato IgG-FITC diluído 1:160 (em PBS/BSA a l%/NaN3 a 0,1%) e incubadas 20 minutos, à temperatura ambiente, no escuro. As células foram lavadas com 1 mL de tampão FACS, depois, ressuspensas em 200 pL de tampão FACS para análise. Como controlo positivo foi utilizado um Ab anti-IIb/IIIa de ovelha comercialmente disponível, seguido de FITC anti-ovelha. Muitos agregados de Fab eram claramente positivos para ligação a plaquetas por Facs. A análise de Facs 64 de aprofundamento foi, depois, realizada para identificar clones individuais que se ligam às plaquetas.

Examinaçao De Candidatos Individuais Por Actividade De Ligação Vários Fab, como sobrenadantes bacterianos, foram testados em termos de reactividade para o toxóide tetânico antigénico original, de modo a determinar se essa especificidade de ligação era retida. 0 Fab anti-TT de esqueleto de anticorpo liga-se ao seu antigénio TT, mas não a BSA. Contudo, quatro clones de Fab enxertados a péptido mimético de TPO não mostraram ligação significativa a TT ou BSA. Como observado em experiências anteriores, a substituição de HCDR3 de Fab anti-TT foi suficiente para alterar a especificidade do anticorpo.

Para examinar adicionalmente as capacidades de ligação dos Fab, a análise de Facs foi realizada em células CMK, uma linha celular Megacariocítica (da German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) que também expressa o receptor cMpl. Os clones de Fab que se ligaram às células CMK foram, depois, analisados para verificar que a ligação de plaquetas e células CMK estava a ocorrer por meio do receptor cMpl. Para essa experiência, as células 293 EBNA foram transfectadas com ou sem o cMpl-R, que tinha sido clonado por RT-PCR a partir das células Tf-1. 1 X 106 células transfectadas foram incubadas com sobrenadante bacteriano de cada clone de Fab (pré-bloqueado como descrito acima), durante 20-30 minutos, à temperatura ambiente. As células foram concentradas, a 2000 rpm, durante 5 minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas em 90 pL de tampão FACS (PBS/FBS a 2%/EDTA a 1 mM), depois foram adicionados 10 pL de 65 2o anticorpo anti-HA [clone 3F10 de Elevada Afinidade anti-HA de

IgG de Rato (Boehringer Mannheim Biochemicals) ] para uma diluição final de 1:10. Após 20 minutos à temperatura ambiente, as células foram lavadas com 1 mL de tampão FACS. Após centrifugação, as células foram ressuspensas em 100 pL do 3o anticorpo (Research Diagnostics Incorporated, RDI) IgG-PE anti-Rato diluído 1:50 (em PBS/BSA a l%/NaN3 a 0,1%) e incubadas 20 minutos, à temperatura ambiente, no escuro. As células foram lavadas com 1 mL de tampão FACS, depois, ressuspensas em 200 pL de tampão FACS para análise. Os Fab seleccionados durante o enriquecimento demonstraram forte ligação a células transfectadas com o cMpl-R mas não a células transfectadas com vector de controlo desprovido do cMpl-R. Isto indica que a ligação de superfície celular estava a ocorrer de modo especifico através do receptor cMpl. 0 Fab anti-TT não se liga ao vector de controlo ou células 293 transfectadas com cMpl-R. Contudo, o clone Xlc de Fab mostra um desvio de 3% de ligação de células transfectadas com controlo (receptor não cMpl) até 95% de ligação de células expressando o cMpl-R.

Examinaçao De Candidatos Individuais Por Sequência A análise de sequência de clones de Fab que se ligaram especificamente ao receptor cMpl (ver a Fig. 5) , revelou a selecção de aminoácidos preferidos no sitio de ligação a jusante. Os dados de sequência de ADN foram analisados e as sequências de aminoácidos e ADN são como se segue:

Clone Propriedades de Ligação SEQ ID N° Sequência Xla fracas 25 Pro Pro (péptido de 14 aa) Gly Gly Xla-11 fracas 27 Gly Gly (péptido de 14 aa) Gly Gly Xla-13 fracas 29 Gly Gly (péptido de 14 aa) Gly Gly Xlc fortes 31 Trp Leu (péptido de 14 aa) Pro Vai X2c fracas 33 Met Ile (péptido* de 14 aa) Vai Gly X3a fortes 35 Vai Vai (péptido de 14 aa) Pro Vai X3b fortes 37 Gly Pro (péptido de 14 aa) Pro Asp X4b fortes 39 Leu Pro (péptido de 14 aa) Pro Vai X4c fortes 41 Ser Leu (péptido de 14 aa) Pro Ile X5a fortes 43 Thr Met (péptido de 14 aa) Pro Vai X5c fortes 45 Trp Leu (péptido de 14 aa) Pro-Val X7a fracas 47 Thr Arg (péptido* de 14 aa) Cys Ser X7b fracas mutante de deleção, este clone perdeu o péptido Xlc fortes 49 Gin Thr (péptido de 14 aa) Pro Asp

Verificou-se que todos os clones que demonstraram forte ligação continham uma prolina imediatamente a jusante do péptido mimético de TPO de 14 aminoácidos. A selecção por enriquecimento de uma prolina na posição do adaptador a jusante representa a determinação de uma surpreendente escolha de aminoácido que confere caracteristicas de ligação melhoradas ao péptido mimético de TPO enxertado. Os ligantes fracos não continham esta prolina, embora contivessem ainda o péptido mimético de TPO. Deve ser notado que o clone X7a tinha uma mutação silenciosa neste péptido (GCG em GCA, retendo a Ala na posição 11 no péptido) e que o clone X2c tinha uma mutação neste péptido trocando uma Thr por Ala na posição 11 do péptido. 67

Ensaios Biológicos

Os clones foram testados para actividade agonista utilizando um ensaio baseado em transcrição, medindo a actividade de luciferase dirigida pelo promotor c-Fos. A dimerização do receptor cMpl activa o Jak que estimula a via da MAP cinase. Deste modo, a activação pode ser medida através do ensaio da produção e actividade de luciferase estimuladas pela MAP cinase por meio do promotor cFos. Visto que a dimerização do receptor cMpl é requerida para activação, os fragmentos de Fab de IgG, completa ou dimerizada, capazes de dimerizarem o receptor, poderiam ser utilizados para estimular a actividade do receptor cMpl. Os Fab produzidos em bactérias foram dimerizados por meio da cauda HA utilizando o anticorpo 12CA5 anti-HA. Quantidades crescentes de 12CA5 foram adicionadas aos Fab bacterianos para dimerizar os clones de Fab, de modo a que pudessem, por sua vez, dimerizar e activar o receptor cMpl. Para medição das actividades agonistas, os Fab contendo sobrenadantes bacterianos (2 mL) misturados com 12CA5 foram aplicados a células NIH3T3, que tinham sido co-transfectadas com um vector de controlo ou o receptor cMpl e a construção repórter promotor Fos/luciferase. As co-transfecções de células 3T3 foram realizadas através do plaqueamento de células NIH 3T3, a 3 x 105 células por placas de 6 cm e, depois, transfecção no dia seguinte. As células NIH 3T3 foram transfectadas utilizando o reagente de lipofecção Effectine (Qiagen), transfectando cada placa com 0,1 pg de pEGFP (um rastreador para medir a eficiência de transfecção), 0,2 pg da construção promotor Fos/luciferase e 0,7 pg de vector de controlo vazio ou do plasmídeo expressando o receptor cMpl. As células 3T3 foram colocadas em soro a 0,5%, 24 horas após transfecção e incubadas, durante 24 horas adicionais, nestes meios pobres em soro para reduzir a activação 68 de fundo do promotor Fos. Os sobrenadantes de anticorpo foram, depois, aplicados a estas células durante 6 horas. As células foram recolhidas e os ensaios de luciferase realizados utilizando 50 pg de lisado de células. Não foi estimulada activação pelos anticorpos na ausência de expressão do receptor cMpl. Contudo, foi observada actividade agonista em células 3T3 co-transfectadas com o receptor cMpl. Isto permitiu a demonstração de que a actividade agonista observada foi através do receptor cMpl e sua interacção com o anticorpo. Os dados são como se segue:

Sobrenadantes Bacterianos com 12CA5 Tratamento Celular Factor Relativo de Actividade de Luciferase Transfectado com CMpI-R Transfectado com Controlo Não tratado: 1,0 1,0 + FCS a 10% 3, 43 3, 0 + TPA 2,3 2,42 + TPO 2,32 0,76 + X4c Sup (isolado) 1, 03 0,94 + X4c + 60 pL de a-HA 1, 97 0,84 + X4c + 30 pL de a-HA 1,52 0,87 + X4c + 10 pL de a-HA 1,22 0,86 + X4c + 3 pL de a-HA 0, 94 0,68 + X4c + 1 pL de a-HA 0, 91 1,05 + X4c + 0,3 pL de a-HA 1, 01 0,95 A activação do receptor cMpl pode ser testada num modo semelhante, utilizando IgG completas (convertidas a partir de Fab, como aqui descrito) produzidas por transfecção transiente 69 ou estável de células mamíferas, em vez de Fab produzidos de modo bacteriano por 12CA5 anti-HA. A transfecção experimentalmente transiente pode ser realizada essencialmente como aqui descrito. Para as transf ecções, 2 x 106 células (tal como 293 EBNA) seriam plaqueadas em placas de 6 cm para cada amostra de teste. No dia seguinte, cada placa seria transfectada com 2,5 pg de ADN total (total de 2 pg do(s) plasmídeo(s) de cadeia leve e cadeia pesada, 0,25 pg de pAdVAntage (Promega, Madison, Wisconsin) e 0,25 pg de pEGFP) utilizando o reagente Effectine (Qiagen). As células 293 seriam colocadas em soro a 0,5%, 24 horas após a transfecção e incubadas durante 24 horas adicionais nestes meios pobres em soro, para se obter a IgG completa. Nestes meios, os factores de crescimento residuais são negligenciáveis na estimulação dos receptores, como observado em experiências de controlos. Após 24 horas, os sobrenadantes seriam recolhidos e concentrados durante 5 minutos, a 3000 rpm, para remover quaisquer células residuais. Para medição das actividades agonistas das IgG completas, 3 mL dos sobrenadantes de células 293 condicionados seriam aplicados a células NIH3T3, como descrito acima. EXEMPLO 2

Bibliotecas Adicionais Contendo Sequências Miméticas De TPO Enxertadas Numa Estrutura De Anticorpo Humano

Outra abordagem de ligação de dois péptidos agonísticos em conjunto numa estrutura de anticorpo é inserir o péptido agonista em mais de uma posição num único fragmento de Fab. De modo a concretizá-lo, foram construídas bibliotecas adicionais contendo as sequências miméticas de TPO enxertadas numa 70 estrutura de anticorpo humano. Após selecção de péptidos convenientemente apresentados no contexto de CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia leve, ou CDR2 da cadeia pesada, as sequências de ligação foram combinadas numa única molécula de Fab, por exemplo como listado na Tabela 1 abaixo e analisadas em termos de actividade melhorada. TABELA 1 Péptido 2 H-CDR2 L-CDRl L-CDR2 L-CDR3 L-CDR2 L-CDR3 L-CDR2 Péptido 1 H-CDR3 H-CDR3 H-CDR3 H-CDR3 H-CDR2 H-CDR2 L-CDR3

Foram construídas quatro bibliotecas adicionais separadamente, substituindo a CDR2 de cadeia pesada, assim como as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve com o péptido mimético de TPO, flanqueado por 2 aminoácidos aleatórios, utilizando uma estratégia de dopagem de NNK. A produção das bibliotecas foi semelhante à descrita para a biblioteca peptídica de TPO de CDR3 de cadeia pesada, excepto que apenas a cadeia (pesada ou leve) sendo modificada para formar uma biblioteca foi amplificada por PCR e utilizada como o inserto. 0 PCR foi realizado utilizando o 71

Expand High Fidelity PCR System (Roche) que contém uma mistura das Taq e Pwo Polimerases. A primeira série de PCR foi realizada utilizando o programa: 30" a 94°, depois, 30 ciclos de 15" a 94°, 30" a 56° e 2' a 72°, seguido de elongamento durante 10' a 72° e uma espera a 4o. O PCR de sobreposição foi realizado durante 10 ciclos sem iniciadores, utilizando o programa listado acima, para permitir que o molde de ADN completo fosse produzido pelas polimerases. Os iniciadores foram, depois, adicionados aos tubos de reacção de PCR durante 20 ciclos do mesmo programa para amplificação.

Para a biblioteca HCDR2, o fragmento A foi criado utilizando o iniciador directo lead VH (5' GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC 3') (SEQ ID N° 13), que se emparelhava ao sinal condutor pel B situado em frente da cadeia pesada e o iniciador inverso HR2 CMPL ΑΝΤΙ (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN TCC CAT CCA CTC AAG CCC TTG 3') (SEQ ID N° 51) que se emparelhava na extremidade da FR2 de cadeia pesada. O iniciador inverso continha uma cauda codificando a nova CDR2. O fragmento B foi criado utilizando o iniciador directo HR2 cMpl CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK AGA GTC ACC ATT ACC GCG GAC 3') (SEQ ID N° 14) que se emparelhava na FR3 de cadeia pesada e o iniciador inverso N-dp (5' AGC GTA GTC CGG AAC GTC GTA CGG 3') (SEQ ID N° 15) que se emparelhava na região da cauda do epitopo HA do plasmídeo, a jusante da região constante de cadeia pesada. O iniciador HR2 cMpl CODE também tinha uma cauda de bases que codificava a nova região CDR2. Depois de os fragmentos terem sido produzidos por PCR e purificados em gel, foram combinados para um PCR de extensão de sobreposição. As novas regiões codificadas pelo iniciador de CDR2 eram complementares e proporcionaram 24 bases de sobreposição. Os iniciadores leadVH e N-dp foram utilizados no protocolo de PCR 72 de sobreposição para produzir o produto de ADN de cadeia pesada completo. Após purificação em gel do produto de cadeia pesada, foi realizada uma digestão com Xho I/Spe I, a 37°, durante 3 horas. Os insertos foram purificados em gel e, depois, ligados dentro do vector pRL4 digerido com Xho I/Spe I contendo a cadeia leve anti-TT. Os produtos de ligação foram precipitados e electroporados para dentro de bactérias ER2537, como descrito acima para a produção da biblioteca de Fab-fago. A biblioteca de CDR3 de cadeia leve foi preparada de modo semelhante utilizando os iniciadores para o Fragmento A do iniciador directo N-omp e iniciador inverso LR3 cMpl ΑΝΤΙ (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ACA GTA GTA CAC TGC AAA ATC 3') (SEQ ID N° 16) e para o Fragmento B do iniciador directo LR3 cMpl CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG 3') (SEQ ID N° 17) e iniciador inverso leadB (5' GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC 3') (SEQ ID N° 18) . 0 iniciador leadB emparelhava-se com a sequência condutora pelB localizada antes de VH. Os iniciadores LR3 cMpl ΑΝΤΙ inverso e LR3 cMpl CODE directo emparelhavam-se com a FR3 e FR4 da cadeia leve anti-TT, respectivamente. Os iniciadores LR3 cMpl contêm uma cauda de nucleótidos codificando a nova biblioteca peptidica de CDR3, que proporciona a região de sobreposição de 24 pares de bases para o PCR de fusão do Fragmento A e Fragmento B. Após purificação dos produtos de PCR de cadeia leve, foi realizada uma digestão com Sac I/Xba I, a 37°, durante 3 horas. Os fragmentos de cadeia leve foram, depois, ligados, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, dentro do pRL4 digerido com Sac I/Xba I contendo a cadeia pesada anti-TT. Os produtos de ligação foram precipitados e electroporados para bactérias ER2537, como descrito acima para a produção da biblioteca de Fab-fago. 73 A construção da biblioteca de CDR2 de cadeia leve foi efectuada como descrito acima para a biblioteca de CDR3 de cadeia leve, com a excepção de que foram utilizados os iniciadores específicos LR2 cMpl ΑΝΤΙ (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC 3') (SEQ ID N° 19) que se emparelhava na extremidade da FR2 de cadeia leve e o iniciador LR2 cMpl CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT 3') (SEQ ID N° 20) que se emparelhava no começo da FR3 de cadeia leve, no lugar dos iniciadores LR3 cMpl. A construção da biblioteca de CDR1 de cadeia leve também foi efectuada como anteriormente descrito para a biblioteca de CDR3 de cadeia leve, com a excepção de que foram utilizados os iniciadores específicos TPOLR1 CODE (5'CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTNNKNNKTGGTACCAGCAGAAACC TGGC 3') (SEQ ID N° 58) que se emparelhava no começo da FR2 de cadeia leve e o iniciador TPOLR1ANTI (5'AGCCAGCCACTGG CGCAGGGTTGGGCCTTCGATMNNMNNGCAGGAGAGGGT GGCTCTTTC 3') (SEQ ID N° 59) que se emparelhava na extremidade da FR1 de cadeia leve, no lugar dos iniciadores LR3 cMpl.

As três bibliotecas adicionais, que separadamente substituem a CDR2 de cadeia pesada e a CDR2 e CDR3 de cadeia leve com o péptido mimético de TPO flanqueado pelos 2 aminoácidos aleatórios utilizando a estratégia de dopagem de NNK, foram separadamente enriquecidas em plaquetas, como foi anteriormente descrito no Exemplo I para a biblioteca de substituição de CDR3 de cadeia pesada. Foram realizadas quatro séries de enriquecimento e os clones foram rastreados por FACS em plaquetas e células 293 transfectadas com o receptor cMpl, como anteriormente descrito. Destes rastreios foram obtidos dois 74 clones positivos. Estes clones tinham o péptido mimético de TPO na CDR2 de cadeia pesada. Ao contrário dos clones de CDR3 de cadeia pesada nenhum dos clones de CDR2 de cadeia pesada tinha uma prolina na posição a jusante. Em vez disso, verificou-se que ambos contêm uma tirosina na posição a montante (Ver a Figura 9 - clones HC-CDR2 N° 24 e N° 39) .

Durante o enriquecimento, as bibliotecas, incluindo LCDR1, foram separadamente submetidas a outra experiência de enriquecimento utilizando, em vez de plaquetas, células 293 transfectadas com o receptor cMpl. Observou-se que as células 293 transfectam, de modo reprodutível, a uma elevada eficiência e expressam na sua superfície níveis muito elevados do receptor cMpl funcional. Deste modo, estas células representavam um bom alvo celular para utilização em enriquecimento. Para estas experiências, diferentes grupos de placas de células 293 foram separadamente e sequencialmente transfectados, quatro dias seguidos. Cada grupo de placas foi, depois, sequencialmente utilizado para as quatro séries de enriquecimento separadas. Cada série de recolha das células e enriquecimento ocorreu dois dias após a transfecção. Para a recolha, as células foram removidas das placas utilizando tampão de dissociação celular, concentradas a 1500 rpm, durante 5 minutos e ressuspensas em IMDM suplementado com FCS a 10%, azida de sódio a 0,1% e EDTA a 5 mM, a uma concentração de 1 x 106 células por mL (3xl06 para LC-CDR1) . Na série um de enriquecimento, 3 x 1011 fagos de cada biblioteca foram separadamente aplicados a 2 mL de células (6xl06 para LC-CDR1 e 2 x 106 células para todos os outros) e rotacionados num tubo cónico de 15 mL, durante duas horas, à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes utilizando 10 mL do tampão IMDM/FCS a 10%/azida de sódio a 0,1%/EDTA a 5 mM. Os fagos foram 75 eluídos em ácido e amplificados como anteriormente descrito no Exemplo 1. Na série dois, foram utilizadas 4 x 106 células (6χ10δ para LC-CDR1) em 2 mL de tampão e 3 x 1011 fagos do fago eluido na série um amplificada foram combinados com 3 x 1011 fagos da biblioteca não enriquecida e adicionados às células. A lavagem, eluição e amplificação prosseguiram de modo semelhante à série um. Na série três, foram utilizadas 4 x 106 células (6xl06 para LC-CDR1) em 2 mL de tampão e foram utilizados 3 x 1011 fagos do fago eluido na série dois amplificada. As células foram lavadas três vezes antes da eluição. Na série quatro, foram novamente utilizadas 4 x 106 células (6xl06 para LC-CDR1) em 2 mL de tampão e foram utilizados 3 x 1011 fagos do fago eluido e amplificado na série três amplificada. As células foram novamente lavadas três vezes antes da eluição. Pelo menos, trinta clones individuais foram rastreados por FACS em células 293 transfectadas com receptor cMpl, como anteriormente descrito. Da biblioteca de CDR2 de cadeia pesada foram obtidos 12 clones positivos e da biblioteca de CDR2 de cadeia leve foram obtidos 25 clones positivos e da biblioteca de CDR1 de cadeia leve foram obtidos 14 clones positivos. Os clones foram adicionalmente analisados por sequência de ADN. Os resíduos de aminoácidos flanqueantes seleccionados para os clones positivos são representados na Figura 9 anexa. É de interesse notar que os Fab enxertados com a CDR2 de cadeia leve têm uma forte selecção para uma prolina (Pro) a montante do péptido mimético de TPO. 76 EXEMPLO 3

Foram produzidas as combinações dos clones de Fab enxertados com péptido mimético de TPO da Figura 9. Deste modo, um único anticorpo poderá conter múltiplas cópias do péptido mimético de TPO numa única cadeia leve ou pesada. Alternativamente, ambas as cadeias leve e pesada poderão conter enxertos peptídicos dando múltiplas cópias num único Fab. Os clones positivos seleccionados da mesma biblioteca de CDR foram agregados. As novas bibliotecas foram construídas através da combinação do agregado de uma CDR contendo péptido mimético de TPO com o agregado de outra. As combinações onde um dos péptidos miméticos de TPO está na cadeia leve e o outro está na cadeia pesada são preparadas utilizando técnicas de clonagem simples, utilizando os ADN plasmídicos agregados e os sítios de restrição únicos flanqueando as cadeias pesada (Xho I-Spel) e leve (Sac I-Xba I). Por exemplo, o ADN plasmídico para as cadeias pesadas enxertadas com o péptido H-CDR3 foi combinado e digerido por Xho I e Spe I. Os insertos de cadeia pesada purificados foram ligados no plasmídeo digerido com Xho I/Spe I contendo os enxertos L-CDR2. A biblioteca resultante continha cadeias pesadas com enxertos do péptido CDR3 e cadeias leves com os enxertos do péptido CDR2. Deve ser compreendido que, para o emparelhamento de duas CDR contendo péptidos, os clones individuais também poderiam ser combinados, em vez de se utilizarem agregados de clones. Por exemplo, um único clone de cadeia pesada com um enxerto peptídico de CDR3 foi emparelhado com vários clones individuais de CDR1 de cadeia leve, para criar Fab com múltiplas cópias de péptidos miméticos de TPO. 77

As combinações onde dois péptidos miméticos de TPO foram combinados numa dada cadeia pesada foram realizados utilizando PCR de sobreposição para produzir o fragmento para clonagem. Foram utilizados dois iniciadores de sobreposição que se ligam entre CDR2 e CDR3, e iniciadores f lanqueantes, tais como os iniciadores "N omp" e "lead B" dos iniciadores de cadeia leve e "Lead VH" e "Ndp" para a cadeia pesada. Por exemplo, para combinar H-CDR2 e H-CDR3, o primeiro PCR foi realizado utilizando lead VH (um iniciador que se emparelha no vector na sequência condutora de pelB da cadeia pesada) e um iniciador inverso emparelhando-se na FR3, utilizando o ADN plasmídico agregado de H-CDR2 como molde. A sequência desse iniciador era 5' CCA TGT AGG CTG TGC CCG TGG ATT 3' (SEQ ID N° 63). Numa reacção separada, os plasmídeos agregados contendo os enxertos de H-CDR3 foram submetidos a PCR com um iniciador directo emparelhando-se em FR3 (que é complementar ao iniciador inverso de FR3 acima) e N-dp (que se emparelha no vector numa sequência de cauda de epitopo). A sequência desse iniciador era 5' CCA CGG GCA CAG CCT ACA TGG AGC 3' (SEQ ID N° 64). Os produtos do primeiro PCR foram purificados, depois, combinados numa reacção de PCR de sobreposição, onde a fusão dos dois fragmentos ocorreu através das sequências de FR2 complementares. 0 produto de cadeia pesada completa foi clonado por Xho I/Spe I dentro de um plasmideo contendo a cadeia leve do toxóide antitetânico. No total foram criadas cinco classes de Fab contendo múltiplas cópias de péptidos miméticos de TPO, como detalhado na Tabela 2 abaixo. 78 TABELA 2 Péptido 1 H-CDR3 Péptido 2 H-CDR2 Péptido 3 H-CDR3 L-CDR2 H-CDR2 L-CDR2 H-CDR3 H-CDR2 L-CDR2 L-CDR1 H-CDR3

Foram testados 20 clones de cada biblioteca de combinação e quatro clones individuais de H-CDR3 mais L-CDR1 para actividade biológica num ensaio repórter de luciferase, como anteriormente descrito. Ver as Figuras 10 e 11. Em ambas as experiências, os controlos negativos podem incluir células não induzidas, células tratadas com um Fab irrelevante (toxóide antitetânico), células tratadas com um clone de Fab que apenas se liga fracamente ao receptor cMpl e os Fab X4b e/ou Xlc que se ligam ao receptor cMpl mas têm apenas um único domínio de ligação e, assim, não podem activar o receptor. 0 controlo positivo foi a adição de TPO. Todas as amostras restantes foram das bibliotecas de combinação formadas de novo. Como pode ser observado, vários clones têm actividade significativa como Fab. Isto indica que a incorporação de múltiplos péptidos miméticos de TPO numa única molécula de Fab é capaz de ligar dois receptores e causar a activação do receptor. 79

De facto, utilizando o Fab 59, a actividade agonista obtida pode ser tão elevada quanto a actividade de TPO nativa. 0 clone 59 contendo dois péptidos miméticos de TPO (amostra x4c de HC CDR3 e amostra 19 de LC CDR2, como identificadas na Fig. 9) e uma cauda His6 foi parcialmente purificado de uma preparação periplasmática bacteriana por FPLC, utilizando cromatografia de coluna de níquel. A actividade deste Fab foi medida e verificou ser, aproximadamente, equivalente à de TPO (ver a Figura 12), como estimado por indução específica de cMpl-R da actividade de luciferase, em comparação directa com concentrações conhecidas de TPO. Foi realizada uma transferência Western quantitativa, de modo a determinar as concentrações de anticorpo do Fab 59.

Estes Fab, ou várias outras duas combinações de CDR, poderiam ser utilizados como um produto terapêutico. Alternativamente, desde que a actividade fosse mantida, estes clones poderiam ser convertidos em sequências de linha germinal de estrutura (com ou sem optimização de codão) para utilização como um agente terapêutico. EXEMPLO 4

0 enxerto de péptido mimético de TPO no clone X4b de Fab foi transplantado para a CDR3 de cadeia pesada de outra estrutura de anticorpo, 5G1.1. A construção de 5G1.1 é descrita no Pedido U.S. com o N° de Série 08/487283, aqui incorporado por referência. A sequência foi clonada dentro de 5G1.1, de modo a substituir a CDR3 nativa com 5' ttg cca ATT GAA GGG CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG cct gtt 3' (SEQ ID N° 65). O enxerto peptídico traduzido em aminoácidos é Leu Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Pro Vai (SEQ ID 80 Ν° 66). Ο 5Gl+péptido foi produzido como um anticorpo IgG intacto (Ver as Figuras 13A e 13B). 0 anticorpo 5G1.1+péptido purificado, assim como o 5G1.1 parental, foram analisados para a sua capacidade de se ligarem ao receptor cMpl por análise de FACS. A ligação a células 293 expressando receptor e não expressando receptor foi comparada. Ver a Figura 14. A coloração de FACS foi realizada, essencialmente, como aqui descrito anteriormente, com a excepção de que a detecção foi feita utilizando o fragmento de F(ab')2 conjugado a PE de IgG de cabra anti-humano (H+L) . Os controlos negativos de apenas 3o Fab irrelevante de toxóide antitetânico e Fab XI a, que se liga fracamente ao receptor cMpl, mostraram todos muito pouca coloração. Contudo, a ligação de Fabs Xlc e X4b mostrou forte coloração, como o fez o 5G1.1+péptido. Nenhum desses clones demonstrou ligação às células não expressando receptor, indicando que a coloração celular está a ocorrer através de reconhecimento especifico do receptor cMpl. 0 5G1.1 parental, sem o péptido mimético de TPO, não mostrou coloração para qualquer das células testadas. A capacidade de o IgG intacto de 5G1.1+ péptido activar o receptor cMpl utilizando o ensaio repórter de luciferase foi determinada (ver a Figura 15) . Os presentes resultados indicam que a configuração de uma IgG intacta causa limitações estéricas na sua capacidade para juntar, de um modo produtivo, os dois receptores cMpl para activação. A actividade da construção de IgG completa de 5G1.1, contendo o péptido mimético de TPO nas posições de CDR3 de cadeia pesada, foi apenas fracamente activadora e requeria, aproximadamente, concentrações molares 100-200 vezes mais elevadas, em comparação com TPO, para estimular actividade equivalente. Como foi anteriormente 81 observado com as experiências de ligação, a activação pelo 5G1.1 contendo o péptido foi observada apenas quando o cMpl-R foi expresso na superfície celular. Não foi observada ligação ou actividade específicas de receptor com o 5G1.1 parental não contendo o péptido. Estes resultados demonstram que a ligação e actividade do péptido mimético de TPO e sequências de aminoácidos flanqueantes seleccionadas não estão limitadas ou são especificas para a estrutura de anticorpo de Toxóide Tetânico, mas podem ser aplicadas a outras estruturas de anticorpo. Deste modo, as sequências de aminoácidos flanqueantes que foram seleccionadas durante o enriquecimento são específicas para apresentação do péptido mimético de TPO numa dada posição de CDR, mas não para a sequência de aminoácidos da estrutura de anticorpo. EXEMPLO 5

Construção De Biblioteca De Sequências Miméticas De EPO Enxertadas Numa Estrutura de Anticorpo Humano

Um péptido DYHCRMGPLTWVCKPLGG mimético de EPO agonista (SEQ ID N° 3) (designado EMP2 em Wrighton et al., 1996) foi enxertado separadamente dentro da região CDR3 de cadeia pesada e leve do Fab de toxóide antitetânico, criando duas bibliotecas de anticorpos como XXDYHXRMGPLTWVXKPLGGXX (SEQ ID N° 71). As posições aleatorizadas foram produzidas utilizando uma estratégia de dopagem de NNK. Como com o péptido mimético de

TPO, dois aminoácidos flanqueando o péptido mimético de EPO foram aleatorizados, de modo a seleccionar para a apresentação óptima do péptido. Além disso, os resíduos de cisterna, que formavam uma ponte de dissulfureto no péptido cíclico original, 82 foram aleatorizados. Isto foi feito, não apenas porque a CDR já forma estruturas em gancho e, assim, a ponte de dissulfureto não era necessária para constranger o péptido, mas também porque as cisteinas poderão, de facto, dissociar as ligações dissulfureto normais do anticorpo. A CDR 3 da cadeia pesada do anticorpo anti-TT foi completamente substituída pelo enxerto de biblioteca peptídica de EPO. A produção da biblioteca foi essencialmente como descrito para a biblioteca de CDR2 de cadeia pesada de TPO. Dois iniciadores alternativos foram utilizados para a biblioteca de HCDR3: o iniciador inverso HR3 EPO ΑΝΤΙ (5' CAC CCA GGT CAG TGG GCC CAT GCG MNN ATG ATA GTC MNN MNN TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEQ ID N° 21) que se emparelhava na extremidade da FR3 de cadeia pesada e o iniciador directo HR3 EPO CODE (5' CGC ATG GGC CCA CTG ACC TGG GTG NNK AAA CCA CTG NNK NNK TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC 3') (SEQ ID N° 22) que se emparelhava na FR4 de cadeia pesada. A biblioteca peptídica da CDR3 de cadeia leve de EPO foi construída essencialmente como descrito acima para a biblioteca peptídica de TPO da CDR3 de cadeia leve utilizando o iniciador inverso LR3 EPO ΑΝΤΙ (5' CAC CCA GGT CAG TGG GCC CAT GCG MNN ATG ATA GTC MNN MNN ACA GTA GTA CAC TGC AAA ATC 3') (SEQ ID N° 23) que se emparelhava na extremidade da FR3 de cadeia leve e o iniciador directo LR3 EPO CODE (5' CGC ATG GGC CCA CTG ACC TGG GTG NNK AAA CCA CTG NNK NNK TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG 3') (SEQ ID N° 24) que se emparelhava à FR4 da cadeia leve. 83

Selecgão Da Biblioteca Da Cdr3 De Cadeia Pesada Do Péptido Mimético De Epo E Biblioteca Da Cdr3 De Cadeia Leve A selecção para a apresentação peptídica foi realizada por enriquecimento de fase sólida no receptor de EPO solúvel. Neste método, 1 pg de purificado EPO humana-solúvel R (hEPO-sR da R&D Systems, Minneapolis, MN N° de cat307-ER-050) foi imobilizado numa placa de microtitulação, de um dia para o outro, a 4o. Após remoção da hEPO-sR livre por lavagem, as placas foram bloqueadas com BSA a 1%/PBS, durante uma hora, a 37°. Os fagos, preparados como descrito acima, foram adicionados aos poços e incubados duas horas, a 37°. As lavagens foram realizadas utilizando PBS/Tween 20 a 0,5%, durante 5', à temperatura ambiente, por lavagem. Na primeira, segunda, terceira e quarta séries de enriquecimento foram realizadas 1, 5, 10, e 10 lavagens, respectivamente. Depois de completas as etapas de lavagem, os Fab-fagos ligados foram eluidos com 30 pL de tampão de eluição, durante 10', à temperatura ambiente. Os fagos eluidos foram, depois, neutralizados em ácido e amplificados como descrito no Exemplo 1. EXEMPLO 6

Foi gerada uma biblioteca pela inserção de um péptido mimético de TPO e aminoácidos flanqueantes anteriormente seleccionados (NP-IEGPTLRQWLAARA-RG) (SEQ ID N° 61) dentro de uma colecção de fragmentos do gene capa humano, neste caso a CDR2 da cadeia leve. Os stocks de cadeias leves capa humanas de múltiplos dadores de linfócitos de sangue periférico (PBL) humanos tinham sido anteriormente produzidos e clonados em 84 pBluescript II SK+. Essas construções serviram como fonte de fragmentos génicos de anticorpos.

Bancos Génicos De Anticorpos 0 ARN total de PBL humanos foi isolado utilizando o Reagente TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) seguido de purificação de ARNm com o Sistema de purificação de ARNm Oligotex (QIAGEN, Valência, CA) , de acordo com as instruções do kit. 0 ADNc de primeira cadeia foi preparado utilizando o Kit de Sintese de ADNc SuperScript RTase II (Life Technologies, Rockville, Maryland) com um iniciador oligo dT modificado. A sequência do iniciador era 5' TAGGATGCGGCCGCACAGGTC(T20) 3' (SEQ ID N° 62) . As amostras foram limpas com uma coluna de concentração de um Kit de purificação de PCR (QIAGEN, Valência, CA) de acordo com as direcções do kit. Os produtos de cadeia leve foram amplificados utilizando o iniciador inverso "Not I" e iniciadores directos que se emparelhavam na posição de estrutura 1 (FR1) de cadeias Capa no ADNc de Ia cadeia. 0 iniciador "Not I" tinha uma sequência que era idêntica à extremidade 5' do iniciador oligo dT modificado (5' TAGGATGCGGCCGCACAGGTC 3') (SEQ ID N° 72). 0 conjunto de iniciadores de FR1 Capa utilizados era: XVBVkla CACGCGCACAACACGTCTAGARACATCCAGATGACCCAG (SEQ. ID.

Ns 73) XVBVklb C ACG C G C AC AAC ACGT CTAGAG MCAT CCAGTT G ACC C AG (SEQ. ID. N2 74) XVBVklc CACGCGCACAACACGTCTAGAGCCATCCRGATGACCCAG (SEQ. ID.

Ne 75) 85 XVBVkld CACGCGCACAACACGTCTAGA6TCATCTGGATGACCCAG (SEQ. 1D. N2 76) XVB Vk2a CACGCGCACAACACGTCTAGAGATATTGTGATGACCCAG (SEQ. ID. m 77) XVB Vk2b CACGCGCACAACACGTCTAGAGATRTTGTGATGACTCAG (SEQ. ID. N2 78) XVB Vk3a CACGCGCACAACACGTCTAGAGAAATTGTGTTGACRCAG (SEQ. ID. N2 79) XVB Vk3b CACGCGCACAACACGTCTAGAGAAATAGTGATGACGCAG (SEQ. ID. N2 80) XVB Vk3c CACGCGCACAACACGTCTAGAGAAATTGTAATGACACAG (SEQ. ID. N2 81) XVB Vk4a CACGCGCACAACACGT CT AGAGACATCGTGATGACCCAG (SEQ. ID. N2 82) XVB Vk5a CACGCGCACAACACGT CT AG AG AA ACGAC ACT CACG CAG (SEQ. ID. N2 83) XVB Vk6a CACG CGCAC AACACGT CTAG AG AAATT GT G CT G ACT CAG (SEQ. ID. N2 84) XVB Vk6b CACGCGCACAACACGTCTAGAGATGTTGTGATGACACAG (SEQ. ID. N2 85)

Uma reacção de amplificação típica continha 2 pL de reacção de ADNc, dNTP, iniciador inverso "Not I", um dos iniciadores directos XVB, tampão N° 5 Opti-prime (Stratagene, La Jolla, CA) e mistura de polimerases Expand High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). As amostras foram aquecidas 86 até 94 °C durante 2 minutos, depois, realizados 10 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 56 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 1 minuto, seguido de 20 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 56 °C durante 30 segundos e 72 °C durante (1 minuto + 5 segundos/ciclo) . Os ciclos foram seguidos de uma incubação prolongada a 72 °C (7 minutos) antes de uma espera a 4 °C. Os produtos foram precipitados com etanol e, depois, purificados em gel. Os fragmentos de, aproximadamente, 850 pb foram isolados e, depois, digeridos com Xba I e Sac I. Os produtos capa resultantes foram ligados dentro de pBluescript II SK+ que tinha sido, do mesmo modo, digerido com Xba I e Sac I. Os produtos de ligação foram electroporados para ToplOF' (Invitrogen, Carlsbad, CA) e cultivados de um dia para o outro. O sedimento bacteriano foi utilizado para isolar o ADN de biblioteca Capa com o kit de isolamento de ADN MAXIprep da QIAGEN.

Construção Da Biblioteca De Estrutura Com O Péptido Mimético De TPO

Para a construção da biblioteca de estrutura de cadeia leve de TPO, foram utilizadas quantidades iguais de quatro bibliotecas de cadeia leve capa diferentes, de quatro doentes diferentes, como o molde de partida para as reacções de PCR (total de 25 ng por reacção) . O péptido mimético de TPO e aminoácidos flanqueantes seleccionados foram incorporados nas cadeias leves por PCR de sobreposição. Na primeira série de PCR, um conjunto de iniciadores inversos (iniciadores VK ΑΝΤΙ), que se ligaram à FR2 de cadeia leve capa, foi separadamente combinado com o iniciador directo seq-F de T7 (5'-ATTAATACGACTCACTATAGGG-3') (SEQ ID N° 86) para sintetizar o 87 pedaço N terminal da cadeia leve e parte do péptido mimético de TPO na posição LC CDR2. Um segundo conjunto de iniciadores directos (iniciadores VK CODE), que se ligavam a FR3, foi combinado separadamente com o iniciador inverso T3 (5' -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ') (SEQ ID N° 87) para sintetizar por PCR o resto do péptido mimético de TPO na posição LC CDR2 e a metade C terminal da cadeia leve. Para cada par de combinações de iniciadores foram realizadas reacções separadas, em duplicado.

VK6ANTI 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTCCTGATGAGGAGC TTTGGRG-3’(SEQ ID N2 88)

VK5ANTI 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTTTGAATAATGAAAA TAGCAG-3’ (SEQ ID N2 89) VK4ANT1 ffAGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTGTAAATGAGCARCT TAGGAG-3’ (SEQ ID N2 90)

VK3ANTI 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTATAGATGAGGAGC CTGGGMG-31 (SEQ ID N2 91)

VK2AANTI 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTATAAATTAGGCGCC TTGGAG-3' (SEQ ID N2 92) VK2BANT1 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTATAGATYAGGAGCT GTGGAG-3’ (SEQ ID N2 93)

VK1AANTI 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTATAGATCAGGAGCT TAGGA-3' (SEQ ID N2 94) 88

VK1BANTI 5’AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTRTAGATCAGGAGCT TAGGG-3’ (SEQ ID N2 95)

VK1CANTI 5'AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTATAGATCAGGGACT TAGGG-3’ (SEQ ID N2 96)

VK1DANTI 5'AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCTTCGATCGGGTTATAGATCAGGYGCT TAGGG-3' (SEQ ID N2 97)

VK6C0DE 5’CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGGGTCCCCTCGA GGTTCAG-3’ (SEQ ID N2 98)

VK5CODE 5’CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGAATCCCACCTC GATTCAG-3’ (SEQ ID N2 99)

VK4CODE 5'CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGGGTCCCTGACC GATTCAG-3' (SEQ ID N2 100)

VK3ACODE 5’CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGCATCCCAGMCA GGTTCAG-3’(SEQ ID N2 101)

VK3BCODE 5’CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGTATCCCAGCCA GGTTCAG-3’(SEQ ID N2 102)

VK2ACODE 5’CC AACCCT GCGCCAGT GGCT GGCT GCTCGCGCTCGT GGT GG AGTSCC AG AYA GGTTCAG-3’ (SEQ ID N2 103)

VK2BCODE 5’CCAACCCT GCGCCAGTGGCT GGCT GCTCGCGCTCGT GGTGGGGTCCCWGACA GRTTCAG-3’ (SEQ ID N2 104)

VK1 ACODE 5’CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGGGTCCCATCAA GGTTCAG-3’ (SEQ ID N2 105) 89

VK1BCODE 5’CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTCGTGGTGGGGTCCCATCTC GGTTCAG-3’ (SEQ ID Na 106)

Os fragmentos das primeiras séries de PCR foram purificados em gel. Esses fragmentos purificados foram, depois, combinados, de um modo especifico de família de anticorpo, em reacções de de PCR sobreposição para produzir a cadeia leve completa. As reacções para cada família foram realizadas em triplicado, utilizando 40 ng dos pedaços N-terminal e C-terminal da cadeia leve em cada reacção. As reacções foram corridas durante 10 ciclos antes da adição dos iniciadores Seq-F de T3 e T7, seguido de 25 ciclos adicionais após a adição dos iniciadores. Os produtos de PCR da fusão LC de comprimento completo foram purificados em gel, digeridos com Sac I e Xba I e, depois, novamente purificados em gel. Os insertos de cadeia leve foram, depois, ligados dentro de um vector de apresentação fágica apropriado, que tinha sido, de modo semelhante, digerido com Xba I e Sac I e purificado em gel. 0 vector pRL5-capa utilizado tinha sítios de restrição que eram compatíveis com os fragmentos de LC e continha a restante região constante Capa do sítio Sac I nativo para o Cys C-terminal. Além disso, a cadeia pesada de toxóide antitetânico foi inserida no vector por Xho I e Spe I para a produção de Fab. A mistura de ligação foi transformada por electroporação para bactérias XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA) e amplificada. A biblioteca foi submetida a quatro séries de enriquecimento em células 293 EBNA transfectadas com o cMpl-R, de um modo semelhante ao anteriormente descrito. Os clones obtidos durante o enriquecimento foram rastreados para ligação por análise de FAC em células 293 EBNA transf ectadas com ou sem o cMpl-R, como anteriormente descrito. Foi obtido um número 90 clones que se ligava especificamente ao cMpl-R. A impressão digital de ADN das cadeias leves resultantes, por digestão com Bst Nl, indicou que os clones poderiam ser divididos em 5 grupos diferentes. A sequenciação parcial de 8 destes clones mostra que as estruturas de, pelo menos, duas famílias de cadeias leves capa diferentes foram seleccionadas durante o enriquecimento (VK1 e VK3). Num teste inicial, 3 dos clones de estrutura de cadeia leve foram combinados com a cadeia pesada de X4b para criar um Fab com 2 péptidos miméticos de TPO. Estes clones induziram a activação do cMpl-R em ensaios de luciferase, como anteriormente descrito. 0 nível de activação utilizando sobrenadantes bacterianos de um desses clones 429/X4b (ver a Figura 16) foi, aproximadamente, 10-20 vezes mais baixo do que o observado com TPO, como estimado através da comparação da actividade com concentrações conhecidas de TPO e utilizando transferências de Western quantitativas para determinar a concentração do anticorpo no sobrenadante. Os clones adicionais podem ser rastreados de um modo semelhante para identificar clones com actividade maior.

Estes Fab, ou diversas outras combinações de LC, HC ou intercadeia de CDR, poderiam ser utilizados como um produto terapêutico. Alternativamente, desde que a actividade fosse mantida, estes clones poderiam ser convertidos em sequências de linha germinal de estrutura (com ou sem optimização de codão) para utilização como um agente terapêutico. 91

Modificação dos Vectores de Apresentação Fágica pAX131 e pRL5 0 sítio Not I em pAX131 foi removido através da digestão do vector com Not I, utilizando a Klenow polimerase para preencher as extremidades protuberantes de Not I e, depois, nova ligação do vector. Ver a Figura 17. A modificação adicional foi feita através da digestão de pAX131 com EcoR I e Xba I. Foi produzido um inserto que substituiu os elementos removidos por essa digestão, utilizando oligonucleótidos de sobreposição, com as seguintes alterações: conversão do sítio Sac I num novo sítio Xba I (sublinhado simples nas sequências iniciadoras abaixo), conversão do sítio Xba I original num sítio Not I (sublinhado duplo nas sequências iniciadoras abaixo) e terminando o inserto com uma extremidade protuberante de Spe I que é compatível com a extremidade protuberante produzida pela digestão do vector com Xba I. A ligação do inserto EcoR I/Spe I no vector cortado com EcoR Ι/Xba I resultou num híbrido Spe Ι/Xba I que, nesse sítio, já não cortará com Spe I ou Xba I. As sequências dos oligos utilizados eram: "EcoSpe" 5' AA TTC AAG GAG TTA ATT ATG AAA AAA ACC GCG ATT GCG ATT GCG GTG GCG CTG GCG GGC TTT GCG ACC GTG GCC CAG GCG GCC TCT AGA ATC TGC GGC CGC a 3" (SEQ ID N° 107) e "SpeEco" 5' ct agt GCG GCC GCA GAT TCT AGA GGC CGC CTG GGC CAC GGT CGC AAA GCC CGC CAG CGC CAC CGC AAT CGC AAT CGC GGT TTT TTT CAT AAT TAA CTC CTT G 3' (SEQ ID N° 108). 0 vector intermédio criado foi pAX13lXba/Not. A região constante capa humana foi inserida entre os sítios Xba I e Not I, gerando pAX131-capa (ver a Figura 18). A região constante capa humana foi amplificada por PCR a partir de ADNc humano, utilizando os iniciadores que introduziram o sítio Xba I a montante e na posição a jusante o codao de terminação TAA, 92 seguido de um sítio Not I. Os iniciadores utilizados eram CKXba I (5' GGA GTC TAG ATA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC 3') (SEQ ID N° 109) e CKNotl (5' AGG AGC GGC CGC TTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C 3') (SEQ ID N° 110).

As modificações de clonagem de cadeia leve incorporadas em pAX131-capa foram transportadas para o vector pRL5 (modificado para ter o seu sítio Not I removido, como descrito acima) através da mudança de EcoR I para o fragmento Xho I . Ver as Figuras 19 e 20. Este vector foi designado como pRL5-capa. (Ver as Figuras 21A-I). EXEMPLO 7 (biblioteca de H-CDR2 nuclear)

Foi construída uma biblioteca de HC CDR2 adicional, onde uma sequência nuclear do péptido mimético de TPO (GPTLRQWL) (SEQ ID N° 112), flanqueado por um único aminoácido aleatório em cada lado, foi inserida na cadeia pesada substituindo parcialmente a CDR2 (GXGPTLRQWLXYAQKFQG) (SEQ ID N° 113) . A construção da biblioteca, com a substituição parcial da CDR2 de cadeia pesada, também foi efectuada como anteriormente descrito para a biblioteca de CDR2 de cadeia pesada, com a excepção de que foram utilizados os iniciadores específicos 8HCR2antiO (5'CAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCMNNCCCTCCCATCC ACTCAAGCCC-3') (SEQ ID N° 114) que se emparelhava na extremidade da FR2 de cadeia pesada e o iniciador 8HCR2code (5'GGCCCAACCCTGCGCCAGTGGCTGNNKTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGA GTCACCATT-3') (SEQ ID N° 115) que se emparelhava no começo da 93 FR3 de cadeia pesada, no lugar dos iniciadores HR2 cMpl anteriormente descritos. A biblioteca com a substituição parcial da CDR2 de cadeia pesada foi submetida a quatro séries de enriquecimento em células 293 EBNA transfectadas com o cMpl-R, como anteriormente descrito. Estes clones podem ser, agora, rastreados para clones de ligação positiva por análise de FACs, como anteriormente descrito.

Lisboa, 9 de Março de 2012 94

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou o seu fragmento, em que o referido fragmento compreende um Fab, F(ab,)2, scFv, Fv, região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve do referido anticorpo, compreendendo uma região i) em que os resíduos de aminoácidos correspondendo a, pelo menos, uma porção de uma região determinante de complementaridade (CDR) são substituídos com um péptido biologicamente activo, ou ii) em que um péptido biologicamente activo é inserido numa CDR, em que o péptido biologicamente activo é um mimético peptídico.
2. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que o péptido biologicamente activo é um mimético peptídico agonista.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 compreendendo, adicionalmente, pelo menos, uma sequência flanqueante incluindo, pelo menos, um aminoácido que está covalentemente ligado a pelo menos uma extremidade do péptido biologicamente activo.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, em que a pelo menos uma sequência flanqueante inclui uma prolina que está covalentemente ligada ao péptido biologicamente activo.
5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, em que a prolina está covalentemente ligada ao terminal carboxilo do péptido biologicamente activo. 1
6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que, pelo menos, duas regiões determinantes de complementaridade (CDR) são cada substituídas com o péptido biologicamente activo.
7. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1-6, em que o péptido biologicamente activo está flanqueado no seu terminal carboxilo com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em prolina-valina, prolina-ácido aspártico, prolina-isoleucina, serina-asparagina, serina-lisina, serina-glicina, serina-arginina, leucina-histidina, leucina-ácido glutâmico, leucina-alanina, leucina-fenilalanina, valina-glutamina, valina-serina, valina-alanina, valina-asparagina, isoleucina-serina, isoleucina-tirosina, asparagina-prolina, asparagina-serina, asparagina-triptofano, asparagina-valina, fenilalanina-valina, treonina-serina, metionina-alanina, arginina-serina, arginina-glicina, arginina-treonina, arginina-leucina, arginina-valina, triptofano-arginina, triptofano-triptofano, alanina-arginina, ácido aspártico, glicina-tirosina, glutamina-arginina e glicina-lisina.
8. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1-6, em que o péptido biologicamente activo está flanqueado no seu terminal amino com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em triptofano-leucina, valina-valina, glicina-prolina, leucina-prolina, leucina-tirosina, serina-leucina, serina-isoleucina, serina-prolina, treonina-metionina, treonina-tirosina, treonina-prolina, glutamina-treonina, glutamina-ácido glutâmico, glutamina-leucina, arginina-metionina, 2 arginina-asparagina, arginina-treonina, arginina-glicina, arginina-serina, lisina-ácido glutâmico, lisina-glicina, alanina-histidina, histidina-glicina, histidina-leucina e asparagina-prolina.
9. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que o fragmento de anticorpo é seleccionado do grupo consistindo em fragmento de Fab, fragmento de F(ab')2 e fragmento de scFv.
10.
11. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é uma molécula de IgG completa. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou o seu fragmento é humano.
12. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 11, em que o anticorpo ou o seu fragmento é o toxóide antitetânico.
13. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que a CDR está localizada numa cadeia leve.
14. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que a CDR está localizada numa cadeia pesada.
15. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo a uma porção de mais do que uma CDR são substituídos. 3
16. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que as regiões CDR3 de uma cadeia pesada e uma cadeia leve são cada substituídas com o mimético peptídico.
17. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que a CDR é seleccionada do grupo consistindo numa CDR3 de uma cadeia pesada e numa CDR2 de uma cadeia leve.
18. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que a CDR é seleccionada do grupo consistindo em CDR3 de uma cadeia pesada e CDR2 de uma cadeia pesada.
19. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que a CDR é seleccionada do grupo consistindo em CDR3 de uma cadeia pesada e CDR1 de uma cadeia leve.
20. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, em que a CDR inclui CDR2 e CDR3.
21
22 . Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 20, em que a CDR está localizada numa cadeia pesada. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 20, em que a CDR está localizada numa cadeia leve.
23. Anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 6, em que as, pelo menos, duas CDR são seleccionadas do grupo consistindo em CDR3 de cadeia pesada-CDR2 de cadeia pesada, CDR3 de cadeia pesada-CDR2 de cadeia leve, CDR2 de cadeia pesada-CDR2 de cadeia leve, CDR3 de cadeia pesada-CDR2 de cadeia pesada-CDR2 de cadeia leve e CDR3 de cadeia pesada-CDRl de cadeia leve. 4
24. Ácido nucleico codificando o anticorpo ou o seu fragmento da reivindicação 1.
25. Vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 24.
26. Célula hospedeira transformada com o vector de expressão da reivindicação 25.
27. Método de produção de um anticorpo ou o seu fragmento, compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 26 sob condições adequadas para expressão da imunoglobulina ou o seu fragmento.
28. Composição compreendendo um anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
29. Método de manipulação de um anticorpo ou o seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, compreendendo: proporcionar ácido nucleico codificando um anticorpo; substituir, pelo menos, uma porção de, pelo menos, uma região codificando CDR com ácido nucleico codificando um péptido biologicamente activo ou inserir ácido nucleico codificando um péptido biologicamente activo em, pelo menos, uma região codificando CDR, em que o péptido biologicamente activo é um mimético peptídico e expressar o péptido codificado pela construção de ácido nucleico, juntamente com uma cadeia de anticorpo 5 seleccionada do grupo consistindo em cadeia pesada e cadeia leve, numa célula hospedeira adequada, de modo a que se forme um heterodímero.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o péptido biologicamente activo inclui uma prolina covalentemente conjugada ao terminal carboxilo do péptido biologicamente activo.
31. Biblioteca contendo variados anticorpos ou os seus fragmentos de acordo com a reivindicação 1, o péptido biologicamente activo tendo, pelo menos, uma sequência flanqueante que foi aleatorizada para produzir anticorpos ou os seus fragmentos tendo sequências de aminoácidos variáveis. Lisboa, 9 de Março de 2012 6