DE60118023T2

DE60118023T2 - Rationell entworfene antikörper

Info

Publication number: DE60118023T2
Application number: DE60118023T
Authority: DE
Inventors: S. Katherine Del Mar BOWDISH; Shana Solana Beach BARBAS-FREDERICKSON; Mark San Diego RENSHAW
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2021-12-06
Also published as: EP1498429A2; US8771932B2; PT1642910E; ATE544785T1; EP1642910A1; CY1112639T1; DE60136656D1; DE60118023D1; EP1370589B1; ES2316919T3; EP1370589A2; US7482435B2; ATE320450T1; AU2002234001B2; CA2436671C; CA2436671A1; US9409964B2; DK1642910T3; EP1642910B1; WO2002046238A2

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/251,448, eingereicht am 5. Dezember 2000, und der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/288,889, eingereicht am 4. Mai 2001, und der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/294,068, eingereicht am 29. Mai 2001.
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörpermoleküle und biologisch aktive Peptide als diagnostische und therapeutische Reagenzien.
HINTERGRUND DES BETREFFENDEN GEBIETES
Antikörper werden von B-Lymphozyten produziert und führen eine Verteidigung gegen Infektion durch. Antikörper werden in Millionen von Formen produziert, jede mit einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz. Antikörpermoleküle sind aus zwei identischen leichten Ketten und zwei identischen schweren Ketten zusammengesetzt. Wenn sie von dem Enzym Papain verdaut werden, werden zwei identische Fab-Fragmente zusammen mit einem Fc-Fragment produziert. Wenn sie mit dem Enzym Pepsin verdaut werden, wird ein F(ab')₂-Fragment produziert. Leichte und schwere Ketten bestehen aus konstanten und variablen Regionen. Innerhalb der variablen Regionen gibt es hypervariable Regionen (aka-Komplementarität bestimmende Regionen (CDR)), welche die Antigen-Bindungsstelle bilden. Die übrigen Teile der variablen Regionen werden als Gerüstregionen bezeichnet.
Wichtige biologische Funktionen, wie beispielsweise Rezeptorbindung, Aktivierung und enzymatische Aktivität, können häufig diskreten Bereichen größerer Proteinmoleküle zugeordnet werden, die eine begrenzte Anzahl von Aminosäureresten umfassen. Es wurden auch Peptide entdeckt, die Bindung, Aktivierung oder enzymatische Aktivität zeigen, indem Bibliotheken von Peptiden, die durch die zufällige Verknüpfung von Aminosäureresten erzeugt waren, durchmustert wurden. Diese Peptide können nicht einer linearen Anordnung von Aminosäuren in einem größeren Proteinmolekül, das ähnliche biologische Aktivität zeigt, entsprechen und werden als diskontinuierliche Peptidepitope oder Mimotope bezeichnet. Verschiedene Peptidmimetika wurden beschrieben und kloniert. Siehe z. B. US-Patent Nr. 6,083,913 (Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum), US-Patent Nr. 5,835,382 (Erythropoietin (EPO)-Mimetikum), US-Patent Nr. 5,830,851 (EPO-Mimetikum) und Wrighton et al., Science, (1996) 273:458-63. Peptidepitope und Mimotope sind aufgrund ihrer geringen Größe für eine Verwendung als therapeutische Reagenzien potentiell vorteilhaft gegenüber großen Proteinmolekülen. Jedoch können die Ergebnisse mit diesen Peptiden als Therapeutika häufig unbefriedigend sein. Ein Nachteil der Verwendung von Peptiden als therapeutische Reagenzien ist, daß sie in vivo im allgemeinen instabil sind, d.h., ihre Klärungsgeschwindigkeiten aus Serum können ziemlich schnell sein.
Darüber hinaus ist es schwierig, die therapeutische oder anderweitige Aktivität eines Peptids vorherzusagen, wenn es in ein größeres Molekül aufgenommen ist, da Konformationsveränderungen und andere molekulare Kräfte die Aktivität des Peptids stören oder vollständig ausräumen können.
Die WO 96/40189 und die WO 00/24782 beschreiben TPO-Peptidmimetikasequenzen. Die WO 99/10494 beschreibt Antikörper, die selbst TPO-Mimetika sind und die durch Phagen-Display selektiert wurden. Monfardini Christina et al., Band 270, Nr. 12, 1995, Seiten 6626-6638 beschreiben einen Antikörper, welcher GM-CSF nachahmt. Cook et al., Vaccine, Butterworth Scientific, Guildford, Band 13, Nr. 18, 1995, Seiten 1770-1778 beschreiben rekombinante Antikörper mit CDR-Einschüben und beschreiben auch deren Eignung für die Präsentation von Epitopen.
Es wurden Versuche unternommen, verschiedene Polypeptide in die CDR-Regionen von Antikörpern einzuführen. Siehe z. B. PCT-Anmeldung WO 94/18221. Wie es zuvor erwähnt wurde, kann jedoch die biologische Aktivität von aktiven Polypeptiden aufgrund von Konformationsveränderungen, welche durch umgebende Aminosäuren verursacht werden kann, vermindert oder ausgeräumt werden. Daher ist es hierin eine Aufgabe, rational entworfene Antikörper oder Fragmente davon bereitzustellen, die biologisch aktive Peptide umfassen, für die Verwendung als diagnostische und therapeutische Reagenzien.
ZUSAMMENFASSUNG
Hierin werden biologisch aktive rekombinante Antikörper bereitgestellt, welche die Aktivität von biologisch aktiven Peptiden nachahmen, Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und Verfahren für deren Verwendung in der Therapie und Diagnose. Diese Antikörper leiden nicht unter einigen der Nachteile von isolierten Peptiden, da Antikörper natürlicherweise lange Serumhalbwertszeiten haben und hinsichtlich der Bindung ihres Ziels hochgradig spezifisch sind. Es wurde überraschenderweise herausgefunden, daß die Aufnahme von bestimmten Aminosäuren, die ein Zielpeptid umgeben, das in ein Antikörpermolekül aufgenommen wurde, die biologische Aktivität des Peptids tatsächlich erhöht.
Immunglobuline weisen ein interessierendes Peptid in eine Komplementarität bestimmende Region (CDR) eines Antikörpermoleküls eingesetzt auf. Das Antikörpermolekül dient als ein Gerüst für die Präsentation des Peptides und verleiht dem Peptid erhöhte Stabilität. Das Peptids ersetzt wahlweise sämtliche der Aminosäuren einer CDR-Region oder kann zu einer vorhandenen CDR hinzugefügt sein, wobei die ursprüngliche Antigenspezifität zerstört wird, wobei die CDR-Region durch eines der zwei anerkannten Schemen definiert ist (siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologics Interest, 5. Auflage (1991), NIH-Veröffentlichung und Chothia et al. J. Mol. Bio (1992) (227) 776-98). Des weiteren können zusätzliche Aminosäuren, welche das Peptid flankieren und die Durchmusterung hinsichtlich optimaler Peptidpräsentation in dem Antikörpergerüst erlauben, in zufälliger Weise eingeführt werden. Es wurde überraschenderweise herausgefunden, daß in bestimmten Fällen ein Prolin, welches das Peptid flankiert, eine Erhöhung der biologischen Aktivität liefert.
In bestimmten Ausführungsformen sind in einem Immunglobulinmolekül Aminosäurereste, die einer die Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch Aminosäurereste, die ein biologisch aktives thrombopoietisches Peptid umfassen, ersetzt. In einer weiteren bestimmten Ausführungsform sind Aminosäurereste, die wenigstens zwei Komplementarität bestimmenden Regionen (CDR) entsprechen, jeweils durch Aminosäurereste, die solch ein biologisch aktives Peptid umfassen, ersetzt. In einem einzelnen Immunglobulinmolekül kann eine oder können mehrere Komplementarität bestimmende Regionen durch ein Peptid ersetzt sein; z. B. CDR3 einer schweren Kette, CDR3 einer leichten Kette, CDR3 von sowohl einer schweren als auch einer leichten Kette, CDR2 und CDR3 einer schweren Kette oder CDR2 und CDR3 einer leichten Kette. Andere Kombinationen von ersetzten CDR-Regionen sind möglich, einschließlich dem Austausch von CDR1. Darüber hinaus könnte man anstelle des Austauschs einer CDR das Peptid zu einer nativen CDR ohne einen tatsächlichen Austausch von Aminosäureresten hinzufügen, während nach wie vor die ursprüngliche Antigenspezifität zerstört wird.
Daher wird in einem Aspekt ein biologisch aktives Peptid mit verbesserter Aktivität bereitgestellt, indem man ein Prolin an dessen Carboxyterminus anfügt unter Bildung eines durch Prolin verlängerten biologisch aktiven Peptides, welches dazu verwendet wird, wenigstens einen Teil von wenigstens einer CDR-Region in einem Immunglobulinmolekül zu ersetzen oder an dieses anzufügen. In einem weiteren Aspekt wird ein Immunglobulinmolekül bereitgestellt, das im Austausch gegen wenigstens eine native CDR-Region ein TPO-Mimetikum-Peptid aufweist. In diesem Aspekt kann das TPO-Mimetikum-Peptid wahlweise durch Prolin verlängert sein, wie es hierin beschrieben ist.
In weiteren speziellen Ausführungsformen ist das Immunglobulinmolekül ein Fab, ein ScFv, eine variable Region einer schweren Kette, eine leichte Kette oder ein vollständiges IgG-Molekül. Das Immunglobulinmolekül kann auch eine Dimerisierungsdomäne aufweisen, um die Immunglobulinmoleküle, die nur eine CDR durch ein Peptid ersetzt haben, zur Dimerisierung zu befähigen und somit Rezeptoren, die zur Aktivierung eine Dimerisierung erfordern, zu aktivieren.
In bestimmten Ausführungsformen kann das biologisch aktive Peptid ein lineares Peptidepitop oder ein diskontinuierliches Peptidepitop sein. Darüber hinaus kann das biologisch aktive Peptid, wenn es hinsichtlich einer CDR-Region substituiert ist, zusätzlich zu Prolin einen, zwei oder mehrere zusätzliche flankierende Aminosäurereste unmittelbar an den Amino- und/oder den Carboxytermini des Peptids aufweisen, welche zwischen den Resten des Peptids und des Immunglobulingerüstbereiches positioniert sind (d.h. dort wo der Übergang zwischen einer CDR und dem angrenzenden Gerüst liegt). Die flankierenden Aminosäurereste sind in dem aktiven Peptid nicht typischerweise vorhanden. Wenn bevorzugte flankierende Aminosäurereste bereits bekannt sind, werden die flankierenden Aminosäurereste von Kodons codiert, welche diese speziellen Aminosäurereste bestimmen. Jedoch wird durch anfängliche Verwendung von Kodons, wie beispielsweise NNK, NNY, NNR, NNS und ähnliche, welche vielfältige Aminosäurereste bezeichnen, eine Ansammlung von Peptiden erzeugt, die sich untereinander bloß durch die flankierenden Reste unterscheiden. Die flankierenden Aminosäurereste können die Präsentation des Peptides in dem Immunglobulinmolekül bestimmen und können somit die Bindung und/oder biologische Aktivität, die das Peptid aufweist, beeinflussen.
Diese zufällige Ansammlung von flankierenden Aminosäuren erlaubt die Selektion der besten Umgebung für eine Präsentation der Peptidsequenz innerhalb des Antikörpergerüsts, das zu spezifischer Bindung an das Zielmolekül und das Ausüben optimaler biologischer Aktivität führt. Eine Durchmusterung von Bibliotheken von Immunglobulinen mit einem gemeinsamen Peptid, aber verschiedenen flankierenden Aminosäureresten kann unter Verwendung von Bindungs-, Wachstums- und Aktivierungstests durchgeführt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und die hierin beschrieben werden.
Daher liefert die vorliegende Offenbarung in einem Aspekt einen Agonisten-Antikörper, der ein Antikörpergerüst umfaßt, das so gebaut ist, daß es wenigstens ein biologisch aktives Peptid, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, bei oder anstelle von wenigstens einem Teil von einem oder mehreren CDR enthält. Das biologisch aktive Peptid weist vor dem Einfügen in das Antikörpergerüst Agonistenaktivität auf. In bestimmten Ausführungsformen ist das Antikörpergerüst so aufgebaut, daß es zwei Peptide enthält, die in der Lage sind, miteinander zu dimerisieren.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Immunglobulinmolekül bereit, das eine Region umfaßt, in der Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch ein biologisch aktives Peptid, welches ein TPO-Mimetikum ist, ersetzt sind, wobei das Immunglobulinmolekül Agonistenaktivität aufweist. Das biologisch aktive Peptid weist vor dem Einfügen in das Antikörpergerüst Agonistenaktivität auf. In besonders nützlichen Ausführungsformen weist das Immunglobulinmolekül c-mpl-Agonistenaktivität auf.
Das Peptid, welches die Aminosäuren einer CDR ersetzt, ist ein agonistisches TPO-Mimetikum-Peptid. Ein solches agonistisches Peptid besitzt wenigstens die Sequenz IEGPTLRQW-LAARA (SEQ ID NO: 1). Für TPO-Agonisten-Mimetikum-Peptide sind andere Sequenzen möglich, die man unter Verwendung von Bindungs-, Wachstums- und Aktivierungstests auffinden kann, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und wie sie hierin beschrieben werden. Agonistische TPO-Mimetikum-Peptide können, wenn sie in CDR-Regionen positioniert sind, einen oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste an den Amino- und/oder Carboxytermini des Peptides aufweisen, die an Reste des Immunglobulingerüsts kovalent gebunden werden. Ein solches TPO-Mimetikum-Peptid hat einen zusätzlichen Prolinrest an den Carboxyterminus angefügt; IEGPTLRQWLAARAP (SEQ ID NO: 2). Bei anderen Immunglobulinmolekülen oder Fragmenten davon ist eine CDR-Region durch die TPO-Mimetikum-Peptide ersetzt, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 und 49 umfassen (siehe 5).
Daher gibt es unter bestimmten Ausführungsformen, die hierin bereitgestellt werden, Immunglobulinmoleküle (IgG) oder Fragmente (z. B. Fab, scFv, schwere oder leichte Ketten), bei denen eine CDR-Region durch ein TPO-Mimetikum-Peptid ersetzt ist. Z. B. kann das TPO-Peptid wenigstens die Sequenz IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1) umfassen und kann weiterhin wahlweise ein zusätzliches Prolin an der unmittelbar abstromig gelegenen Position aufweisen.
Jedes Immunglobulinmolekül (Antikörper) oder Fragment davon könnte potentiell ein Gerüst bereitstellen und eine gegen ein Peptid gemäß der vorliegenden Offenbarung ersetzte CDR aufwei sen. Für eine therapeutische Anwendung oder eine diagnostische Anwendung in vivo ist es bevorzugt, daß der Antikörper menschlichen Ursprungs oder humanisiert ist, wie beispielsweise ein Anti-Tetanustoxoid-Immunglobulin. Weiterhin können unabhängig von oder in Verbindung mit dem Vorhandensein von zusätzlichen flankierenden Aminosäuren, die an das Peptid gebunden sind, eine oder mehrere Aminosäurereste in anderen Regionen des Immunglobulins, einer anderen oder anderen CDR-Regionen) und/oder den Gerüstregionen verändert sein, um die Bindung, Aktivität und/oder Expression, die das Peptid in dem Umfeld des Immunglobulinmoleküls aufweist, zu modifizieren.
Es wird in Erwägung gezogen, daß nach dem Aufbau von biologisch aktiven rekombinanten Antikörpern diese Rekombinanten Randomisierungsverfahren unterzogen werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, um zur Veränderung der biologischen Aktivität der Antikörper an einem oder mehreren Punkten in der Sequenz Mutationen einzuführen. Nach der Erzeugung von solchen Mutanten unter Verwendung von Randomisierungsverfahren, wie solchen, die hierin beschrieben werden, können die resultierenden Rekombinanten unter Verwendung von Bindungs-, Wachstums-, Expressions- und Aktivierungstests hinsichtlicht Aktivität untersucht werden.
Es werden weiterhin Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die Immunglobulinmoleküle codieren, bei denen die Aminosäuren von einer oder mehreren CDR-Regionen durch ein biologisch aktives Peptid ersetzt sind. Diese Nukleinsäuremoleküle können in einem Expressionsvektor vorhanden sein, der für eine Expression dieser Moleküle in eine rekombinante Wirtszelle eingeführt (transfiziert) werden kann. Es werden auch Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulinmoleküls oder eines Fragmentes davon, das ein biologisch aktives Peptid enthält, bereitgestellt, welche das Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, so daß die in der Zelle enthaltene Nukleinsäure exprimiert wird, umfassen.
Es werden auch Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein Immunglobulinmolekül oder ein Fragment davon, bei dem einer CDR entsprechende Aminosäurereste durch Aminosäurereste, die einem TPO-Mimetikum-Peptid entsprechen, ersetzt sind, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Weiterhin werden Verfahren zum Aufbauen von Immunglobulinmolekülen bereitgestellt, so daß diese eine Agonistenaktivität aufweisen, in denen ein biologisch aktives Peptid, welches ein TPO-Mimetikum ist, wenigstens einen Teil von einer oder mehreren CDR-Regionen von leichten und/oder schweren Ketten ersetzt. Die Verfahren umfassen das Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls, das ein biologisch aktives Peptid codiert, welches ein TPO-Mimetikum ist, anstelle von wenigstens einer CDR-Region eines Nukleinsäuremoleküls, das eine schwere oder leichte Kette eines Immunglobulins codiert, oder das Hinzufügen des Moleküls zu der nativen CDR-Sequenz und anschließendes Exprimieren des Nukleinsäuremoleküls, welches die variable Domäne der schweren oder leichten Kette von Immunglobulin codiert, zusammen mit der Domäne Ihrer komplementären variablen Region, so daß die zwei Domänen miteinander assoziieren.
Des weiteren werden Verfahren zum Aufbau von Immunglobulinmolekülen bereitgestellt, so daß diese eine Aktivität (Eigenschaft) eines biologisch aktiven TPO-Peptides aufweisen, in denen ein biologisch aktives Peptid eine oder mehrere CDR-Regionen von leichten und/oder schweren Ketten ersetzt. Die Verfahren umfassen das Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls, das ein biologisch aktives Peptid codiert, anstelle von wenigstens einem Bereich einer CDR-Region eines Nukleinsäuremoleküls, das eine schwere oder leichte Kette von Immunglobulin codiert, oder das Hinzufügen des Moleküls zu der nativen CDR-Sequenz, und das Exprimieren des Nukleinsäuremoleküls, das die variable Domäne der schweren oder leichten Kette von Immunglobulin codiert, zusammen mit der Domäne Ihrer komplementären variablen Region, so daß die zwei Ketten miteinander assoziieren.
In einem weiteren Aspekt liefert diese Offenbarung ein Verfahren zur Erzeugung einer Bindungsstelle in einem Polypeptid, die in der Lage ist, einen zuvor ausgewählten Stoff zu binden, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man eine Nukleotidsequenz, welche eine diese Bindungsstelle definierende Aminosäurerestesequenz codiert, in eine CDR-Region einer Nukleinsäure, die ein Gen für die schwere oder leichte Kette von Immunglobulin umfaßt, einbringt, indem man die CDR-Region des Immunglobulingens vervielfältigt, wobei die eingeführte Nukleotidsequenz die Formel X_a-Y-X_b aufweist, worin X bei jedem Auftreten das gleiche oder verschieden ist und ein randomisiertes Trinukleotid repräsentiert, die Summe von a und b 4 oder weniger ist und Y eine Nukleotidsequenz ist, die eine minimale Erkennungsdomäne von dieser Bindungsstelle ist. In besonders nützlichen Ausführungsformen wird die Vervielfältigung unter Verwendung von überlappender PCR erzielt, jedoch könnte jede bekannte Vervielfältigungstechnik verwendet werde, wie beispielsweise die Verfahren, die in der WO 94/18221 beschrieben sind, deren Offenbarung durch Bezugnahme darauf hierin aufgenommen sind.
In noch einem weiteren Aspekt liefert diese Offenbarung Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek von monoklonalen Antikörpern, die hinsichtlich einer gewünschten Aktivität durchmustert werden können. Diese Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek umfassen die Stufen, in denen man ein Nukleinsäuremolekül, das ein biologisch aktives Peptid codiert, in eine oder mehrere CDR-Regionen oder anstelle von wenigstens einem Teil von einer oder mehreren CDR-Regionen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine schwere oder leichte Kette von Immunglobulin codiert, einfügt, an jeder Seite des eingefügten Nukleinsäuremoleküls bis zu einem Paar von randomisierenden Trinukleotiden bereitstellt und eine Bibliothek von monoklonalen Antikörpern exprimiert. In besonders nützlichen Ausführungsformen wird auf beiden Seiten des eingefügten Nukleinsäuremoleküls ein Paar von randomisierenden Trinukleotiden bereitgestellt. Die so hergestellte Bibliothek von monoklonalen Antikörpern kann dann hinsichtlich einer gewünschten Aktivität durchmustert werden.
In einer speziellen Ausführungsform besitzen Antikörper verschiedene Aminosäuren, die das Peptid an den Amino- und Caboxyltermini flankieren, wo das Peptid an das Antikörpergerüst gebunden wird. Dies führt zu einer Population von Antikörpermolekülen, die sich in der Präsentation des Peptids unterscheiden können. Die Population wird hinsichtlich solcher Antikörper durchmustert, die die biologische Aktivität des Peptids aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die unmittelbar an das Peptid angrenzende Aminosäure ein Prolin.
Wenn die Aktivität des biologisch aktiven Peptides darin besteht, ein Zielmolekül zu aktivieren, kann dies eine Dimerisierung von zwei Zielmolekülen erfordern (z. B. Rezeptoren in den hämatopoietischen Superfamilien). Damit eine Dimerisierung stattfindet, müssen zwei Peptide so positioniert werden, daß jedes ein Zielmolekül so bindet, daß sich die zwei gebundenen Zielmoleküle anschließend in geeigneter Weise zusammenlagern können. Dies kann dadurch erreicht werden, daß zwei Peptide auf dem gleichen Antikörper vorhanden sind oder daß man erwirkt, daß zwei Antikörpermoleküle, von denen jedes ein Peptid enthält, aneinander binden. Daher kann z. B. ein einzelnes Molekül in wenigstens einen Teil einer CDR eingefügt oder gegen diese ersetzt werden und anschließend als ein Immunglobulin oder ein F(ab')₂-Fragment exprimiert werden. Als ein weiteres Beispiel können zwei Peptide in wenigstens einen Teil von einer oder mehreren CDR eingefügt oder gegen diese ersetzt und als irgendein Antikörper oder Antikörper-Fragment exprimiert werden.
Die Durchmusterung von Antikörpern kann durch Schwenken mit Zellen, die Oberflächenmoleküle aufweisen, an welche das Peptid spezifisch bindet, durchgeführt werden. Es kann auch Festphasenbindung unter Verwendung gereinigter Zielmoleküle verwendet werden. Eine Bindung kann auch in Lösung unter Verwendung markierter Zielmoleküle durchgeführt werden. Darüber hinaus können Antikörper unter Verwendung biologischer Tests hinsichtlich Agonisten- oder Antagonistenaktivität des Peptides durchmustert werden.
Es werden auch Bibliotheken von verschiedenen Immunglobulinmolekülen bereitgestellt, in denen Aminosäurereste, die einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch Aminosäurereste ersetzt sind, die ein biologisch aktives Peptid umfassen, welches wenigstens einen zusätzlichen Aminosäurerest an dem Amino- oder dem Carboxyterminus aufweist, und die Immunglobulinmoleküle unterscheiden sich durch den zusätzlichen Aminosäurerest des Peptids.
In speziellen Ausführungsformen ist das biologisch aktive Peptid ein TPO-Mimetikum. Die Antikörper der Bibliothek werden auf einem Phagen präsentiert.
Des weiteren werden Verwendungen von Medikamenten, welche Immunglobulinmoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten, zur Stimulierung von Proliferation, Differenzierung oder Wachstum von Zellen bereitgestellt, welche ein Inkontaktbringen der Zellen mit einer wirksamen Menge eines Immunglobulinmoleküls, bei dem eine oder mehrere CDR durch ein biologisch aktives Peptid, welches ein TPO-Mimetikum ist, ersetzt sind, umfaßt.
In anderen speziellen Ausführungsformen wird die Verwendung eines Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Stimulierung von Proliferation, Differenzierung oder Wachstum von Megakaryozyten durch Inkontaktbringen von Megakaryozyten mit einer wirksamen Menge eines Immunglobulinmoleküls, bei dem eine oder mehrere CDR durch ein TPO-Mimetikum-Peptid ersetzt sind, bereitgestellt. Es werden auch die Verwendungen eines Medikamentes der Erfindung zur Erhöhung der Blutplättchenproduktion bereitgestellt, welche das Inkontaktbringen von Megakaryozyten mit einer wirksamen Menge eines Immunglobulinmoleküls, bei dem eine oder mehrere CDR-Regionen durch ein TPO-Mimetikum-Peptid ersetzt sind, umfassen. Es werden auch Medikamente der Erfindung zur Stimulierung von Megakaryozyten und/oder zur Erhöhung der Blutplättchenproduktion in einem Patienten bereitgestellt, in welchen eine wirksame Menge eines Immunglobulinmo leküls, bei dem eine oder mehrere CDR durch ein TPO-Mimetikum-Peptid ersetzt sind, einem Patienten verabreicht wird, der dieses benötigt. Das Immunglobulinmolekül und die Megakaryozyten können auch in vitro in Kontakt gebracht werden, und die resultierenden Zellen können in den Patienten eingebracht werden. Darüber hinaus kann ein Antikörper, der wenigstens ein TPO-Mimetikum-Peptid darin enthalten aufweist, einem Subjekt verabreicht werden, welches beabsichtigt, Blutplättchen zu spenden, wodurch die Kapazität eines Donors zur Erzeugung von Blutplättchen zur Bereitstellung einer robusteren Quelle für solche Blutplättchen erhöht wird.
Eine Ausführungsform hierin ist auch ein Verfahren zur Aktivierung eines homodimeren Rezeptorproteins durch Inkontaktbringen des Rezeptors mit einem Immunglobulinmolekül, bei dem eine CDR-Region durch ein biologisch aktives Peptid ersetzt ist, welches den Rezeptor spezifisch bindet und welches dimerisiert wurde. In einer weiteren Ausführungsform ist der Rezeptor ein Thrombopoietin-Rezeptor.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung des Vektors pRL4.
2A und 2B zeigen die Sequenz der leichten bzw. schweren Ketten des Gerüsts von humanem Tetanustoxoid-Antikörper.
3 ist ein Diagramm, welches das Einbringen des TPO-Mimetikum-Peptids AF12505 in die CDR3-Region der schweren Kette des Tetanustoxoid-Gerüstantikörpers zeigt. XX repräsentiert die flankierenden zufälligen Aminosäuren.
4 ist ein Diagramm der Konstruktion eines Peptides, das in die CDR3-Region der schweren Kette kloniert ist.
5 gibt die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von Klonen wieder, die das TPO-Mimetikum-Peptid AF12505 mit verschiedenen zufälligen flankierenden Resten codieren.
6A-C zeigen die Nukleinsäuresequenz des Plasmides pRL8 (SEQ ID NO: 60). pRL8 ist eine modifizierte Version von pRL4 (pRL4 ist auch bekannt als pComb 3X). Das pRL4 wurde zwischen der Spe I- und der benachbarten Sfi I-Restriktionsschnittstelle modifiziert (gezeigt durch Unterstreichung), so daß ein flexibler Linker (Kappa-Gelenkregion der Maus), gefolgt von einer Jun-Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne, enthalten ist.
7 ist eine schematische Darstellung eines Abschnitts des Plasmides pRL8.
8 zeigt die Nukleinsäuresequenz eines Abschnitts des Plasmides pRL8 (SEQ ID NO: 52) zusammen mit Aminosäuresequenzen, die verschiedenen beschriebenen Nukleinsäuresequenzen entsprechen (SEQ ID NO: 53).
9 ist eine Tabelle, die Sequenzen von verschiedenen TPO-positiven Klonen hierin zeigt.
10 ist ein Balkendiagramm, das die Aktivität von verschiedenen Fab-Klonen, die zwei TPO-Mimetikum-Peptide enthalten, zeigt.
11 ist ein Balkendiagramm, das die Aktivität von verschiedenen Fab-Klonen, die zwei oder drei TPO-Mimetikum-Peptide enthalten, zeigt.
12 stellt graphisch die Aktivität von Klon 59 dar, wiedergegeben durch die Induzierung von Luciferaseaktivität.
13A zeigt die Aminosäuresequenz und die Nukleinsäuresequenz der schweren Kette von 5G1.1-TPO (SEQ ID NO: 67 bzw. 68).
13B zeigt die Aminosäuresequenz und die Nukleinsäuresequenz der leichten Kette von 5G1.1 (SEQ ID NO: 69 bzw. 70).
14 ist ein Balkendiagramm, das eine FACS-Analyse der cMpl-Rezeptorbindung des gereinigten TPO-Mimetikum-Peptides 5G1.1+ im Vergleich mit dem elterlichen 5G1.1-Antikörper zeigt.
15 ist ein Balkendiagramm, das im Vergleich die Aktivität von 5G1.1-Antikörper, der das TPO-Mimetikum-Peptid enthält, in Verbindung mit Zellen, die mit einem Kontrollvektor transfiziert sind, der kein cMpl-R enthält, und Zellen, die mit einem Vektor transfiziert sind, der cMpl-R enthält, zeigt.
16 zeigt die Sequenz des Klons 429/Xb4 (SEQ ID NO: 116).
17 ist ein Flußdiagramm, das die anfänglichen Stufen der Herstellung des Vektors pRL5-Kappa zeigt.
18 ist ein Flußdiagramm, das die weiteren Stufen der Herstellung des Vektors pRLS-Kappa zeigt.
19 ist eine Karte des Vektors pRL5.
20 ist eine schematische Darstellung des Vektors pRL5-Kappa.
21A-I zeigen die Nukleinsäuresequenz des Vektors pRL5-Kappa.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Immunglobulin" auf ein ganzes Immunglobulinmolekül oder auf Moleküle, die immunologisch aktive Anteile von ganzen Immunglobulinmolekülen enthalten, und umfaßt Fab, F(ab')₂, scFv, Fv, variable Regionen der schweren Kette und variable Regionen der leichten Kette. Die Begriffe Immunglobulin und Antikörper werden hierin austauschbar verwendet.
Jedes Peptid, das eine nützliche Eigenschaft aufweist, ist für das Einbringen in ein Antikörpergerüst geeignet. Peptidaktivitäten und -verwendungen umfassen Bindung eines Rezeptors, Bindung eines membrangebundenen Oberflächenmoleküls, Bindung eines Liganden, Bindung eines Enzyms oder eines Strukturproteins, Aktivierung oder Hemmung eines Rezeptors, zielgerichtete Arzneimittelauslieferung oder jede enzymatische Aktivität, sind aber darauf nicht beschränkt. Es werden üblicherweise diejenigen Peptide ausgewählt, deren Brauchbarkeit aufgrund der erhöhten Stabilität, die ihnen verliehen wird, wenn sie in dem Umfeld eines Immunglobulinmoleküls präsentiert werden, verbessert werden kann. Es sollte klar sein, daß „biologische Aktivität", wie sie hierin verwendet wird, jede Aktivität umfaßt, die mit einem Molekül assoziiert ist, das Aktivität in einem biologischen System besitzt, einschließlich der stimulierenden oder hemmenden Aktivität, die durch Protein-Protein-Wechselwirkungen sowie den Kinetiken, die diese Wechselwirkungen umgeben, einschließlich der Stabilität eines Protein-Protein-Komplexes, ausgelöst werden. Ein Verbessern oder Erhöhen der „biologischen Aktivität" soll hierin eine Erhöhung der Gesamtaktivität oder eine Erhöhung in irgendeinem Anteil der Gesamtaktivität bedeuten. Es sollte klar sein, daß ein Peptid vor dem Einbringen in das Antikörpergerüst eine biologische Aktivität aufweisen kann (wie beispielsweise einfach das Binden an ein Ziel) und eine andere oder verbesserte biologische Aktivität (wie beispielsweise Agonistenaktivität) nach dem Einbringen in das Antikörpergerüst.
Viele Peptide, die von einer Darbietung in dem Umfeld eines Immunglobulins profitieren könnten, wurden identifiziert und sie sind denjenigen, die auf dem Gebiet tätig sind, bekannt, z. B. TPO-Mimetikum-Peptide. Andere Beispiele umfassen Peptide die an Rezeptoren binden, welche durch Liganden-induzierte Homodimerisierung aktiviert werden, einschließlich aktive Fragmente, die G-CSF-Aktivität, GHR-Aktivität und Prolactin-Aktivität zeigen, wie es in Whitty und Borysenko, Chem Biol, (1999) 6. April: R 107-18 beschrieben ist; andere Beispiele für geeignete Peptide umfassen ein Nervenwachstumsfaktor-Mimetikum von der CD-Schleife, wie es in Zaccaro et al., Med. Chem. (2000) 43(19), 3530-40 beschrieben ist, ein IL-2-Mimetikum, wie es in Eckenberg et al., J. Immunol. (2000) 165(8):4312-8 beschrieben ist, Glucagon-artiges Peptid-1, wie es in Evans et al., Drugs R.D. (1999) 2(2):75-94 beschrieben ist, Tetrapeptid I (D-Lysin-L-Asparaginyl-L-Prolyl-L-Tyrosin), welches Mitogen-aktivierte B-Zell-Proliferation stimuliert, wie es bei Gagnon et al., Vaccine (2000) 18(18):1886:92 beschrieben ist. Peptide, die Rezeptorantagonistenaktivität aufweisen, werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Z. B. N-terminales Peptid von vMIP-II als ein Antangonist von CXCR4 für die HIV-Therapie, wie es bei Luo et al., Biochemistry (2000) 39(44):13545-50 beschrieben ist, Antagonistenpeptid-Ligand (AFLARAA) des Thrombin-Rezeptors für antithrombotische Therapie, wie er bei Pakala et al., Thromb. Res. (2000) 100(1):89-96 beschrieben ist, Peptid-CGRP-Rezeptor-Antagonist CGRP (8-37) zur Dämpfung der Toleranz gegenüber Narkotika, wie er bei Powell et al., Br. J. Pharmacol. (2000) 131(5):875-84 beschrieben ist, Parathyroid-Hormon (PTH)-1-Rezeptor-Antagonist, bekannt als Tuberoinfundibularpeptid (7-39), wie er bei Hoare et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2000) 295(2):761-70 beschrieben ist, Opioid-Wachstumsfaktor, wie er bei Zagon et al., Int. J. Oncol. (2000) 17(5):1053-61 beschrieben ist, Rezeptorantagonisten von hochaffinem Typ I-Interleukin 1, wie sie bei Yanofsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 93, Seiten 7381-7386, Juli 1996 und Vigers et al., J. Biol. Chem, Band 275, Nr. 47, Seiten 36927-36933, 2000 beschrieben sind, und saures Fibroblastenwachstumsfaktor-Bindungspeptid, wie es bei Fan et al., IUBMB Life (2000) 49 (6) 545-48 beschrieben ist. Peptide können auch unter Verwendung von Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet geläufig sind, entdeckt werden. Um eine Region eines Proteins zu identifizieren, die an einer speziellen biologischen Funktion beteiligt ist, kann eine Prüfung der kürzeren Peptidfragmente, aus denen das Protein aufgebaut ist, das verantwortliche lineare Peptidepitop aufdecken. Alternativ kann durch Überprüfung von Bibliotheken von zufälligen Peptiden ein Peptid, das ein optimales lineares Epitop oder ein diskontinuierliches Epitop repräsentiert, entdeckt werden, welches die Aktivität des natürlichen Proteins nachahmt. Ein Verfahren für Selektion wird als Peptid-Phagen-Display bezeichnet. Bei diesem Ansatz wird eine zufällige Peptid-Epitop-Bibliothek erzeugt, so daß Peptide auf der Oberfläche eines Bakteriophagenpartikels präsentiert werden. Diese Sammlungen oder Bibliotheken von Peptiden können dann hinsichtlich solcher, die in der Lage sind, an ein spezifisches immobilisiertes Zielprotein zu binden, überprüft werden (Pasqualini, R. et al., j. Cell Biol., 130, 1995, 1189-1196, Wrighton, N.C. et al., Science, 273, 1996, Seiten 458-463, Cwirla, S.E. et al, Science, 276, 1997, Seiten 1696-1699, Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268, 1993, Seiten 20205-20210, Koivunen et al., Bio/Technol., 13, 1995, Seiten 265-270, Healy et al., Biochem., 34, 1995, Seiten 3948-3955, Pasqualini et al., J. Cell Biol., 130, 1995, Seiten 1189-1196). Alternative Peptid-Selektionssysteme sind ebenfalls möglich und umfassen Zelloberflächendarbietung und ribosomale Darbietung.
Peptidmimetika, die gemäß dieser Beschreibung verwendet werden, haben im allgemeinen eine kleinere oder gleiche Anzahl von Aminosäureresten, die eine CDR-Region bilden, obwohl sie auch länger sein können.
Jeder Antikörper kann als eine Gerüstsequenz dienen, jedoch werden typischerweise humane Antikörper ausgewählt, da humane Therapeutika eines der ultimativen Ziele sind. Bei humanen oder humanisierten Antikörpern ist es weniger wahrscheinlich, daß sie eine ungünstige Immunantwort in einem menschlichen Patienten verursachen. Ein Hauptkriterium bei der Auswahl eines Antikörpers, der als ein Gerüst für das Einbringen eines Peptids dienen soll, ist, daß der Ersatz von einer oder mehreren CDR des Antikörpers gegen das Peptid die Antikörperspezifität verändern muß. Der Antikörper kann ein vollständiger Antikörper oder ein Fab-, scFv- oder F(ab')₂-Fragment oder ein Teil davon sein.
Alternativ kann in einer Bibliothek von Antikörpern eine oder mehrere der CDR der schweren und/oder leichten Kette durch ein gewünschtes Peptid ersetzt sein. Die resultierende Bibliothek kann dann zur Identifizierung von Antikörper mit einer gewünschten Aktivität durchmustert werden. Es sollte klar sein, daß auch eine Randomisierung in dem substituierten Peptid bereitgestellt werden kann, um eine Antikörperbibliothek zu erzeugen.
Ein geeigneter Antikörper ist das Anti-Tetanustoxoid (TT)-Fab, da es human ist und weil eine Modifikation der HCDR3 ausreicht, um die Antigenspezifität des Antikörpers zu verändern (Barbas et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 1994, Seiten 2161-2162 und Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1995, Seiten 2529-2533).
Das Einfügen der DNA-Sequenz des Peptides der Wahl in einen Antikörper, so daß die CDR eines Antikörpers durch die Peptidsequenz ersetzt wird/werden, wird unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken durchgeführt, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Beispiele für Verfahren, die zum Einfügen eines gewünschten Peptides mit biologischer Aktivität anstelle einer CDR-Region verwendet werden können, umfassen PCR-Überlappung, Restriktionsenzymstellenklonierung, ortsspezifische Mutagenese und vollständig synthetische Wege, sind darauf aber nicht beschränkt. Für eine Beschreibung von Techniken, die überlappende PCR umfassen, siehe z. B. Beispiel 1 hierin. Ortsspezifische Mutagenese kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Einer beruht auf dut/ung-Kunkel-Mutagenese (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) Band 82, Seiten 488-92). Das Muta-Gene in vitro-Mutagenese-Kit ist von BioRad erhältlich und basiert auf diesem Verfahren (Katalog Nr. 170-3581 oder 170-3580). Es sind auch mehrere auf PCR-Vervielfältigung beruhende Mutagenese-Ansätze kommerziell erhältlich, wie beispielsweise der QuickChange Site-Directed Mutagenesis-Kit und der ExSite PCR-based Site-Directed Mutagenesis-Kit von Stratagene. Ein weiteres nicht-PCR-Verfahren ist von Promega als das GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System erhältlich. Vollständig synthetische Mittel sind ebenfalls gut bekannt und beschrieben, z. B. in Deng et al., Methods Mol. Biol., (1995) 51:329-42, Kutemeler et al., Biotechniques, (1994) 17(2):242-246, Shi et al., PCR Methods Appl., (1993) 3(1):46-53 und Knuppik et al., J. Mol. Biol., (2000) 11:296(1):571-86, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Darüber hinaus können die oben genannten Verfahren, die zum Ersatz der gesamten oder eines Teils von wenigstens einer CDR-Sequenz eingesetzt werden, dazu verwendet werden, ein gewünschtes Peptid in wenigstens eine native CDR-Sequenz oder angrenzend dazu einzufügen, ohne die ursprüngliche CDR-Sequenz zu ersetzen. Auf diese Weise wird ein Fusionskonstrukt aus CDR und biologisch aktivem Peptidmimetikum gebildet.
Es wird in Erwägung gezogen, daß flankierende Sequenzen an die carboxyl- und/oder aminoterminalen Enden des biologisch aktiven Peptids hinzugefügt werden können. Flankierende Sequenzen können zur Reduzierung struktureller Einschränkungen an dem angefügten Peptid nützlich sein, um ihm zu ermöglichen, daß es leichter eine Konformation annehmen kann, die für biologische Aktivität notwendig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine flankierende Region, die ein Prolin umfaßt, kovalent an den Carboxyterminus des biologisch aktiven Peptides angebunden, um ein mit Prolin verlängertes biologisch aktives Peptid zu erzeugen.
In einer Ausführungsform kann eine flankierende Region durch Randomisieren von zwei Aminosäurepositionen an jeder Seite der Peptidanfügung erzeugt werden, um die beste Sequenz zu bestimmen. Auf diese Art und Weise kann eine Bibliothek erzeugt werden, die Mitglieder mit vielen variierten Sequenzen aufweist. Die resultierenden Konstrukte werden dann hinsichtlich biologischer Aktivität getestet, wie es unten beschrieben wird, z. B. Schwenktechniken. Es können rekombinante Proteine erzeugt werden, die an speziellen Positionen zufällige Aminosäuren aufweisen. Dies kann durch Modifizieren der codierenden DNA erreicht werden. Wenn man an einer spezifischen Kodonposition für eine Aminosäure eine Randomisierung einführt, ist eine bevorzugte Desoxyribonukleotid-„Dotierungsstrategie" (NNK)_x, um alle 20 Aminosäuren abzudecken und um die Anzahl codierter Stop-Kodons zu minimieren. N kann dementsprechend A, C, G oder T (nominell equimolar) sein, K ist G oder T (nominell equimolar), und x ist typischerweise bis zu etwa 5, 6, 7 oder 8 oder mehr, wobei Bibliotheken von Mono-, Di-, Tri-, Quadra-, Penta-, Hexa-, Hepta- und Octapeptiden oder höheren erzeugt werden. Die dritte Position kann auch G oder C sein, was als „S" bezeichnet wird. Somit codieren NNK oder NNS (i) sämtliche der Aminosäuren, (ii) nur ein Stop-Kodon und (iii) reduzieren den Bereich der Kodon-Ausrichtung von 6:1 auf 3:1. Es gibt 32 mögliche Kodons, die aus dem NNK-Motiv resultieren: 1 für jede von 12 Aminosäuren, 2 für jede von 5 Aminosäuren, 3 für jede von 3 Aminosäuren und nur eines der drei Stop-Kodons. Andere Alternativen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
(NNN)_x, was alle möglichen Aminosäuren und alle Stops liefern würde;
(NNY)_x, was alle Stops eliminiert und nach wie vor 14 von 20 Aminosäuren abdeckt;
(NNR)_x, was 14 von 20 Aminosäuren abdeckt; und
(NNS)_x, was alle 20 Aminosäuren und nur einen Stop abdeckt.
Die dritte Nukleotidposition in dem Kodon kann unter Verwendung jedes der bekannten degenerierten Gemische maßgeschneidert ausgeführt werden. Jedoch deckt die Gruppe NNK, NNN, NNY, NNR, NNS die meisten der allgemein verwendeten Dotierungsstrategien und die hierin verwendeten ab.
Die Sammlung von hergestellten Antikörpern, die bei diesem Verfahren erzeugt werden, kann hinsichtlich solcher untersucht werden, die Eigenschaften des Peptids aufweisen, z. B. durch von Phagen präsentierte Antikörper, wie es im wesentlichen beschrieben wurde in Barbas, C. F., III, Kang, A. S., Lerner R. A., und Benkovic, S. J., Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfacese: the gene III site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, Seiten 7978-1982, welche hierin durch Bezugnahem aufgenommen sind. Diese Technologie erlaubt es, daß rekombinante Antikörper (wie beispielsweise vollständige Antikörper, Fab, F(ab')₂ oder ScFv) auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exprimiert werden. Dieser gleiche Phage wird die Gene, die den spezifischen Antikörper codieren, in sich tragen.
Es wird in Erwägung gezogen, daß hierin jedes andere bekannte Verfahren zum Einführen einer Randomisierung in eine Sequenz verwendet werden kann. Z. B. kann fehleranfällige PCR zufällige Mutationen in Nukleinsäuresequenzen einführen (siehe z. B. Hawkins et al., J. Mol. Biol, (1992) 226(3):889-96). Zusammengefaßt wird PCR unter Bedingungen ablaufen gelassen, welche die Genauigkeit der Replikation beeinträchtigen, wodurch zufällige Mutationen in Sequenzen eingeführt werden, wie es der Fachmann auf dem Gebiet durchführen würde. Nach der Erzeugung solcher zufälliger Mutanten können diese in Phagen-Display-Formate gebracht, geschwenkt und somit hinsichtlich Aktivität bewertet werden. In gleicher Weise können bestimmte Bakterien, die dafür bekannt sind, daß sie zufällige Mutationen von Genen liefern, wie beispielsweise Epicurian Coli^® XL1-Red kompetente Zellen (kommerziell erhältlich von Strategene, La Jolla, CA.), welche dieses während der Plasmidreplikation durchführen, zur Bereitstellung zufälliger Mutanten verwendet werden, die dann hinsichtlich biologischer Aktivität gemäß der vorliegenden Offenbarung durchmustert werden.
Es wird auch in Erwägung gezogen, daß eine Randomisierung an irgendeinem Punkt in der Nukleotidsequenz nach Aufnahme eines aktiven Peptids in den Antikörper eingeführt werden kann, um die gesamte biologische Aktivität des Antikörpers zu verändern. Auf diese Art und Weise können nicht nur Veränderungen in der biologischen Aktivität eines Peptidmimetikums durch Verursachung von Mutationen innerhalb der Sequenz des Peptids erzeugt werden, sondern es können auch Mutationen in das umgebende Gerüst eingebracht werden, wobei die resultierenden Konstrukte hinsichtlich Veränderungen der biologischen Aktivität oder der Expression untersucht werden. Es wird tatsächlich in Erwägung gezogen, daß Bibliotheken mit Repertoires von vielen Konstrukten, die aus einer solchen Randomisierung resultieren, erzeugt und getestet werden können.
Gemäß der vorliegenden Offenbarung können Einzelketten-Bibliotheken verwendet werden, weil auf einem Polypeptid eine gesamte Bindungsdomäne enthalten ist. Die variable Region der leichten Kette ist von der variablen Region der schweren Kette durch eine Linker-Region getrennt. Die Verwendung von kurzen Linkern (< 11 Aminosäuren) favorisiert einen dimeren Komplex, bei dem V_H von einem ScFv-Molekül mit V_L von einem anderen ScFv-Molekül assoziiert und umgekehrt, und diese Moleküle werden als Diabodies bzw. Diakörper bezeichnet (Kortt, A. A., Malky, R. L., Caldwell, J. B., Gruen, L. C., Ivanci, N., Lawrence, M. G. et al. Eur. J. Biochem. 221:151-157, 1994). Dies liegt daran, daß eine Faltung von monomerem ScFv mit Linkern < 11 Aminosäuren beeinträchtigt wird (Alfthan, K., Takkinen, K., Sizman, D., Soderlund, H. und Teeri, T. T. Protein-Eng. 8:725-731, 1995). Längere Linker (> 11 Aminosäuren) favorisieren eine Faltung von monomerem ScFv zu einer einzelnen Antigen-Bindungsdomäne, wodurch eine Dimerbildung ausgeschlossen wird.
Ein nützlicher Phagen-Display-Vektor ist pRL4, der auch als pComb 3X bekannt ist (siehe 1). Dieser Vektor erlaubt eine Präsentation von chimeren Expressionsprodukten auf der Oberfläche von gepackten Phagemidpartikeln. pRL4 ist eine modifizierte Version von pComb3H (Barbas, C. F. III und Burton, D. R. 1994. Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., Burton, D. R., Barbas, C. F. III. Advances in Immunology 57:191-280, 1994, Lang, I. M., Chuang, T. L., Barbas, C. F. III, Schleef, R. R. J. Biol. Chem. 271:30126-30135, 1996, Rader und Barbas, Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000). Die Ausgestaltung von pRL4 erlaubt eine Dimerisierung von scFv-Antigen-Bindungsdomänen auf der Phagenoberfläche und in löslicher Form, wie es nachfolgend ausführlich beschrieben wird. Wenn das Plasmid in einen supE-Bakterienwirt transformiert wird, wie beispielsweise ER2537 (F' Sup E, New England Biolabs, Beverly, MA), wird die Amber-Mutation für etwa 50 % der Zeit unterdrückt. Auf diese Weise wird die Hälfte der exprimierten scFv mit dem Gen III-Protein von filamentösem Phagen (Aminosäuren 230-406) fusioniert, und die andere Hälfte wird unmittelbar bevor das Gen III lösliches scFv produziert, beendet. Sowohl die scFv-pIII-Fusion als auch lösliche scFv-Produkte haben die Omp A-Signalsequenz und werden in das Periplasma transportiert, wo sie in der Lage sein werden, dimere scFv-Komplexe zu bilden, die als Diabodies bzw. Diakörper bezeichnet werden (Kortt, A. A., Malby, R. L., Caldwell, J. B., Gruen, L. C., Ivanci, N., Lawrence, M. C. et al. Eur. J. Biochem. 221:151-157, 1994). Von Diabodies wird erwartet, daß sie sich so falten, daß sich die V_H von einem scFv mit der V_L eines zweiten scFv-pIII paaren wird, was zu divalenten Antikörperfragmenten führt. In einem nicht-sup E-Wirt, wie beispielsweise TOP1OF' (In Vitrogen, Carlsbad, CA), wird das Amber-Stop-Kodon erkannt, was lösliche scFv-Diabodies liefert.
In dem fertigen Einzelketttenexpressionskonstrukt in pRL4 sind die Einzelketten-Antikörperfragmente abstromig zu dem E. coli-lacZ-Promotor, der Ribosomenbindungsstelle und der omp A-Führungssequenz kloniert. Diese Elemente erlauben eine Induzierung der Expression durch IPTG und die Ausscheidung aus der Zelle über die omp A-Führungssequenz, wenn sie in dem Suppressor-Stamm ER2537 exprimiert werden. Die Einzelkettenfragmente sind im Raster mit Gen III (gIII)-Sequenzen (Aminosäuren 230 bis 406) von filamentösem Phagen fusioniert. Das gIII-Proteinprodukt pIII ist ein kleineres Hüllenprotein, das für die Infektiösität notwendig ist. Nach der Promtorinduzierung durch IPTG wird die Einzelkettenantikörper-pIII-Fusion synthetisiert und in den bakteriellen periplasmatischen Raum transportiert. In dem periplasmatischen Raum werden die scFv-Gen III-Fusionsproteine in die Membran eingeführt. Bei Überinfektion mit Helferphage werden diese Fragmente aus der Zelle auf die Oberfläche von Phagen als pIII-Antikörper-Fragmente exportiert. Andere mögliche Proteine, die für eine Fusion auf der Oberfläche von Phagemiden verwendet werden können, umfassen filamentöses Hüllenprotein pVIII und andere Hüllenproteine.
Fab-Fragment-Bibliotheken, welche die native Antigenerkennungsstelle behalten, sind nützlich, um sicher zu stellen, daß die Affinität beibehalten wird.
In dem fertigen Hybrid-Fab-Expressionskonstrukt in pRL4 sind die leichten und schweren Ketten als ein einzelnes Sfi I-Fragment kloniert. Auf diese Weise sind die Fragmente der leichten Kette abstromig zu dem E. coli lacZ-Promotor, der Ribosomenbindungsstelle und der omp A-Führungssequenz kloniert. Diese Element erlauben eine Induzierung der Expression durch IPTG und eine Ausscheidung aus der Zelle über die omp A-Führungssequenz. Den Fragmenten der leichten Kette folgt ein Stop-Kodon, eine zweite Ribosomenbindungsstelle, die E. coli pel B-Führungssequenz und die schwere Kette. Hybridgene der schweren Kette sind im Raster mit Gen III (gIII)-Sequenzen (Aminosäuren 230 bis 406) von filamentösem Phagen fusioniert. An dem Fusionsübergang ist ein Amber-Stop-Kodon vorhanden. In einem sup E-Bakterienwirt, wie beispielsweise ER2357 (New England Biolabs, Beverly, MA) ist die Amber-Mutation unterdrückt. Bei Promotorinduzierung wird eine einzelne polycistronische Botschaft als zwei Polypeptide, ein Leichte Kette- und ein Schwere Kette-Gen III-Fusionsprotein, transkribiert und translatiert. Nach der Synthese werden die Polypeptide, gesteuert durch die Führungssequenzen, in den bakteriellen periplasmatischen Raum transportiert. In dem periplasmatischen Raum werden die Schwere Kette-p III-Fusionsproteine in die Membran eingeführt, und die leichten und schweren Ketten werden durch Disulfidbindungen kovalent miteinander verbunden, wobei die Antigenbindungsstellen ausgebildet werden. Die humane konstante Region CH1 und C_L-Sequenzen umfassen die Cysteine, welche die Disulfidbindungen zwischen schweren und leichten Ketten bilden. Nach Überinfektion mit Helferphagen werden diese Fragmente aus der Zelle auf die Oberfläche von Phagen als Fab-cpIII-Fusion exportiert. In einem nicht-sup E-Wirt, wie beispielsweise TOP1OF' (Invitrogen, Carlsbad, CA), wird das Amber-Stop-Kodon erkannt, was zu löslichen Fab-Fragmenten führt. Wichtige Merkmale des verwendeten pRL4-Phagen-Display-Systems umfassen eine Reinigungs-His 6-Markierung, eine HA-Epitop-Markierung nach der schweren Kette sowie ein unterdrückbares Amber-Stop-Kodon, welches zwischen der schweren Kette und dem Phagen-Gen III angeordnet ist. Die HA-Markierung wird von dem HA.11-Antikörper (Babco, Berkeley, CA) und dem 12CA5-Antikörper (Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, Ind.) erkannt. Die His 6-Markierung erlaubt eine Affinitätsreinigung von Antikörperfragmenten durch Nickel-Chelat-Chromatographie (Qiagen, Valencia, CA). Der Amber-Stop erlaubt eine schnelle Umwandlung von einem Fab-cpIII-Fusionsprodukt (für eine Aufnahme an der Phagenhülle), wenn der Stop unterdrückt ist, in das lösliche Fab, welches in einem Bakterienwirt ohne Suppressor hergestellt wird.
Selektion umfaßt die Isolierung der besten Kandidaten, die spezifisch an das Zielmolekül des Peptides binden und biologische Aktivität zeigen, aus der Bibliothek.
Der Phage, der auf seiner Oberfläche Antikörperfragmente exprimiert, kann produziert und konzentriert werden, so daß es allen Mitgliedern einer Bibliothek ermöglicht werden kann, an das Zielmolekül zu binden. Das Zielmolekül kann auf einer Mikrotiterschale, auf ganzen Zellen oder den Membranen von ganzen Zellen immobilisiert sein oder in Lösung vorliegen. Unspezifische Ab-Phagen werden weggewaschen, und gebundene Phagenpartikel werden von dem Antigen freigegeben, häufig durch die Anwendung von niedrigem pH-Wert. Die gewonnenen Ab-Phagen sind infektiös und können in einem Bakterienwirt vervielfältigt werden. Typischerweise werden mehrere Runden dieser Art von Selektion durchgeführt. Einzelne Antikörperfragmentklone können dann als lösliche Fab oder scFv für eine Identifizierung von solchen, die das Zielmolekül spezifisch erkennen, analysiert werden.
Vor jeder Selektionsstrategie werden Ausgangsbibliotheken durch Elektroporation in Wirtszellen, wie beispielsweise ER2537, eingebracht. Bibliothekenkulturen werden bis zur log-Phase gezüchtet und mit Helferphagen, wie beispielsweise VCSM13, einem kommerziell erhältlichen Helferphagen (Stratagene, La Jolla, CA), überinfiziert. Überinfektion liefert die verbleibenden Phagenbestandteile, die für eine Verpackung von Plasmiden in Phagemidpartikel erforderlich sind. Alternativ kann Phagen-Display ohne die Verwendung von Helferphagen angewendet werden. Nach Züchtung über Nacht werden Phagemide in dem Kulturüberstand mit Polyethylenglycol (PEG) präzipitiert. PEG-präzipitierte Phagen werden beim Schwenken (Festphasenzelloberfläche, Internalisierung und Membran), FACS-Sortierung oder magnetischer Sortierung zur Reinigung von spezifisch bindenden Antikörpern von nicht-spezifisch bindenden verwendet.
Bei zellgestützten Schwenken werden Antikörper-Phagen-Bibliotheken mit Zielzellen inkubiert, und die nicht anhaftenden Phagen werden mit mehreren Waschschritten entfernt: Ein typisches Schwenkprotokoll ist das folgende:

1. Blockierung von Phagenpartikeln mit PBS + 1 % BSA oder 10 % FBS + 4 % Milchpulver + NaN₃ (ausgenommen, wenn internalisierte Antikörper untersucht werden).
2. Zugabe von Zielzellen zu blockierten Phagen (etwa 5 × 10⁶ Zellen).
3. Mischen und langsames Rotieren bei 4 °C oder 37 °C.
4. Zweimaliges Waschen der Zellen mit 1 ml eiskaltem PBS/1 % BSA/NaN₃ oder PBS/1 BSA/NaN₃ bei Raumtemperatur.
5. Spezifischer Antikörper-Phage, der an Zellen gebunden ist, kann durch niedrigen pH-Wert eluiert werden, z. B. mit 76 mM Zitronensäure, pH 2,5, in PBS für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Neutralisieren von eluiertem Phagen mit 1 M Tris-HCl, pH 7,4.
7. Nach der Neutralisation kann Antikörper-Phage dazu verwendet werden, ER2537-Bakterien zu infizieren und für die nächste Runde des Schwenkens bei Wachstum über Nacht zu vervielfältigen.

Im allgemeinen werden 3 bis 4 Runden des Schwenkens mit jeder Bibliothek durchgeführt. Phagen-ELISAs unter Verwendung kommerziell erhältlicher sekundärer Antikörper (Schaf-Anti-M13-Antikörper-HRP) oder ELISAs mit löslichem Antikörper unter Verwendung von kommerziell erhältli chem HA.11-Antikörper (Babco, Berkeley, CA), der die in jeden Antikörper von pRL4-Sequenzen eingeführte HA-Markierung erkennt, können nach jeder Runde des Schwenkens durchgeführt werden, um eine Bestimmung der Anreicherung von bindenden Antikörpern gegenüber nicht-bindenden zu erlauben. Nach der letzten Runde des Schwenkens kann der Antikörper-Phage als Einzelkolonien von Agarplatten abgenommen, als monoklonaler Antikörper-Phage gezüchtet und mittels ELISA zur Identifizierung von spezifisch bindenden durchmustert werden. FACS-Analyse kann ebenfalls eingesetzt werden. Speziell werden die Antikörper-Phagen in TOP1OF'-Bakterien infiziert und für Einzelkolonien ausplattiert. Einzelkolonien werden von Agarplatten abgenommen, gezüchtet und mit IPTG induziert. Löslicher Antikörper wird mittels ELISA zur Identifizierung von spezifischen Bindemolekülen durchmustert. Die Durchmusterung kann gegen lebende Zellen, gegen intakte, schwach fixierte Zielzellen oder rekombinante(s) Protein(e) durchgeführt werden.
Verfahren für das Gesamtzellschwenken wurden zuvor beschrieben (Siegel, D. L., Chang, T. Y., Russell, S. L. und Bunya, V. Y. 1997, J. Immunol. Methods 206:73-85, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). Andere Techniken für die Selektion, welche angewendet werden können, umfassen Durchflußzytometrie (FACS). Alternative Methoden für die Selektion unter Verwendung von Bibliotheken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Ribosomen-Display und Plaque-Hybridisierung an ein markiertes Antigen.
Nach dem Schwenken zur Isolierung von hochaffinen Antikörper-Bindemolekülen, können biologische Tests hinsichtlich funktionaler Raster von Agonisten-Antikörpern durchgeführt werden. Dimerisierung ist häufig eine Voraussetzung für eine Aktivierung von vielen Rezeptoren und daher richten sich biologische Tests auf Agonisten-Antikörper, die Rezeptoren über eine Förderung von Dimerisierung stimulieren. Wie zuvor beschrieben wird bei der Linker-Ausgestaltung eine Einzelketten-Multivalenz angestrebt. Einer Fab-Fragment-Multivalenz kann man sich auf viele Weisen annähern. Eine Anzahl jüngerer Berichte in der Literatur hat Erfolge bei der Bildung von dimerem Antikörperfragment gezeigt, was beim Phagen-Display anwendbar ist (DeKruif, J. und Logtenberg T. 1996, J. Biol. Chem. 271:7630-7634, Pack, P. und Pluckthun, A. 1992, Biochemistry 31:1579-1584, und Holliger, P. und Winter, G. 1993. Current Opin. Biotech. 4:446-449). Divalente Fab können auf wenigstens zwei Wegen erzeugt werden. In einem Ansatz wird eine Dimerisierung durch Hinzufügung einer Dimerisierungsdomäne zu pRL4 unter Bildung von pRL8 erreicht (siehe 6A–C, 7 und 8). Es gibt eine Anzahl von Dimerisierungsdomänen (IexA, Zn-Finger, fos, jun etc.), die in diesen Vektoren zum Erhalt von Multivalenz von Fab-Fragmenten verwendet werden können. Dimerisierungsdomänen werden unter den folgenden ausgewählt, sind aber darauf nicht beschränkt: jun (DeKruif, J. und Logtenberg, T. J. Biol. Chem. 271:7630-7634, 1996, Kostelny, S. A., Cole, M. S. und Tso, J. Y. J. Immunol. 148:1547-1553, 1992), die LexA-Dimerisierungsregion (Kim, B. und Little, J. W. Science 255:203-206, 1992), die Hefe-GCN4-Dimerisierungsdomäne (van Heeckeren, W. J., Sellers, J. W., Struhl, K. Nucleic Acids Res. 20:3721-3724, 1992), Gin-Invertase von dem Bakteriophagen Mu (Spaeny-Dekking, L., Schlicher, E., Franken, K., van de Putte, P., Goosen, N. J. Bacteriol. 34:1779-1786, 1995), E. coli NTRC-Protein-Dimerisierungsdomäne (Klose, K. E., North, A. K., Stedman, K. M., Kustu, S. J. Mol. Biol. 241:233-245, 1994) und HSV-1-ICP4-Dimersierungsdomäne (Gallinari, P., Wiebauer, K., Nardi, M. C., Jiricny, J. J. Virol. 68:3809-3820, 1994), die alle durch Bezugnahme aufgenommen sind. Es kann auch eine Hochtemperaturdimerdomäne von Thermus-Organismen verwendet werden (MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D., Biochemistry 37:100062-73, 1998 und MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D., Science 279:1958-61, 1998). Dies sind funktionale Domänen, die, wenn sie in ein Molekül aufgenommen werden, erlauben, daß eine Dimerisierung stattfindet. Darüber hinaus kann eine Dimerisierung in Zellen durch die Verwendung von Vektoren mit vollständigem IgG oder Dimerisierungsdomänen, wie beispielsweise CH3-Dimerisierungsdomänen, erreicht werden. Die Fachleute auf dem Gebiet sind mit diesen und anderen Dimerisierungsdomänen und deren Verwendung zur Dimerisierung vom Proteinen vertraut.
Zusätzliche Verfahren, die zur Erzeugung von Antikörperkonstrukten, welche wenigstens zwei Bindungsstellen enthalten, verwendet werden können, sind bekannt. Der durch jeden dieser Ansätze erzeugte Antikörper könnte zum Testen agonistischer Antikörperaktivität verwendet werden, wie es unten in Beispiel 1 für Gesamt-IgG, das in Säugerzellen hergestellt wird, beschrieben ist. Diese Methoden umfassen chemische Dimerisierung von Fab, PEGylierung von Fab, Herstellung von Fab'2, Erzeugung von Gesamt-IgG in Bakterienzellen und Verwendung von Diabodies (scFvs). Es ist wichtig, daß jede der für die Analyse von agonistischer Aktivität erzeugten Antikörperformen als das fertige therapeutische Produkt verwendet werden könnte.
Chemische Dimerisierung kann auch unter Verwendung einer Vielzahl chemischer Vernetzungsreagenzien erreicht werden. Z. B. SMCC (Succinimidyl-trans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexan-1-carboxylat) von Molecular Probes (Eugene, Oregon), Katalog Nr. S-5134. Dieses Reagenz wird primäre Aminogruppen in dem Antikörper modifizieren. Nach Inkubieren des Antikörpers mit dem SMCC beim Raumtemperatur wird die Reaktion über eine PD-10-Säule laufen gelassen. Dieses Maleimid-derivatisierte Fab kann entweder zu einem zweiten Fab oder einem separaten Ansatz des gleichen Fab, das zur Reduzierung der Thiolgruppen zu SH mit TCEP [(Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid): Molecular Probes, Katalog Nr. T-2556] behandelt wurde, hinzugefügt werden. Die Reduktionsreaktion wird in der Dunkelheit für 15 Minuten durchgeführt. Die Konjugation des Maleimid-Fab und des bezüglich Thiol reduzierten Fab findet in einem Verhältnis von 1:1 statt. Dimere werden isoliert, indem man die Reaktion über eine Sephadex 200-Gelfiltrationssäule leitet. Für die Dimerisierung können auch andere chemische Linker verwendet werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Die Herstellung eines Fab', das einen zusätzlichen Cysteinrest in die Gelenkregion eingebaut hat, wurde beschrieben z. B. in dem US-Patent 5,677,425 und bei Carter et al., BioTechnology, Band 10, Februar 1992, Seiten 163-167, deren Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme darauf aufgenommen sind. Diese Thiolstelle kann für eine Konjugation an Reste, wie beispielsweise Polyethylenglycol (PEG), verwendet werden. PE-Gylierungstechnologie ist bekannt, siehe z. B. Koumenis et al., Int. J. Pharm. (2000), 198(1):83-95, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist, was es ermöglicht, zwei Fab'-Moleküle unter Verwendung von PEG-Kopplung zu verbinden.
Eine Technologie für die bakterielle Herstellung von Fab'2 umfaßt die Klonierung der humanen IgG-Gelenkregion und optional einen Teil des CH2 als Teil des Fd, welcher zusätzliche Cysteine umfaßt, und ist z. B. bei Better et al., PNAS USA (1993) 90(2):457-61 beschrieben, was durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Die zusätzlichen Thiolgruppen an dem Fd-Gelenk können Wechselwirken und verursachen, daß zwei Fab'-Moleküle unter Erzeugung eines Fab'2 dimerisieren. Fab'2 kann direkt aus den Bakterienzellen gereinigt werden. Zusätzlich kann nicht-dimerisiertes Fab' aus den Bakterien isoliert und chemisch in Fab'2 umgewandelt werden.
Wie es früher beschrieben wurde, können die variablen Regionen des Antikörpers als eine einzelne Kette kloniert werden, in der die variable leichte (VL) mit der variablen schweren (VH) durch eine Linker-Region verbunden ist. Wenn diese Linker-Region kurz ist (z. B. 5 bis 7 Aminosäuren), wird die Faltung des scFv eine Zusammenlagerung von zwei scFv favorisieren, wobei sich die VL von einem scFv mit der VH des zweiten scFv paaren wird. Auf diese Art und Weise werden auf dem Diabody zwei Antigenbindungsstellen präsentiert.
Antikörperkonstrukte, die zwei Bindungsstellen enthalten, können unter Anwendung jeder dieser Methoden erzeugt werden, um Agonistenaktivität zu testen und/oder als das fertige therapeutische Produkt verwendet zu werden.
Nach den Schwenk- oder Sortierstufen der Fab-Bibliotheken, wir die Bibliothek von geschwenkten Molekülen mit Sac I und Spe I verdaut und in pRL8 kloniert. Subklonierung in dem pRL8-Vektor einzeln oder in der Masse nach FACS-Sortierung oder Schwenken erlaubt eine Expression von dimeren löslichen, bindenden Fab für die Analyse in biologischen Tests. In pRL8 werden die Antikörperfragmente in den periplasmatischen Raum transportiert und bilden dort Dimere. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, daß er ein Schwenken von monomeren Fab-Fragmenten erlaubt, wobei Fab mit hoher Affinität favorisiert werden.
Ein weiterer Ansatz verwendet einen sekundären Antikörper. pRL4 weist die Hämagglutinin-Decapeptid-Markierung auf, die von dem kommerziell erhältlichen Antikörper HA. 11 (Babco, Berkeley, CA) erkannt wird. In einem biologischen Test zu testende Fab, die in der FACS-Sortierung oder beim Schwenken identifiziert wurden, werden mit HA. 11 vorinkubiert, der eine Dimerisierung fördert, bevor sie biologischen Tests zugeführt werden.
Sobald bindende scFv oder Fab durch Schwenken oder ein anderes Selektionsverfahren identifiziert sind, werden die einzelnen Klone, von denen jeder ein einzigartiges dimerisiertes Antikörperfragment auf der Phagenoberfläche exprimiert, hinsichtlich Proliferation, Differenzierung, Aktivierung oder Überlebenseffekte an Zielzellen getestet. Darüber hinaus wird löslicher, dimerisierter Antikörper in biologischen Tests untersucht.
Biologische Tests zur Durchmusterung hinsichtlich TPO-artiger Aktivität

1. Koloniebildungstests – Megakaryozytenkolonien von Knochenmark (Megacult C Kit von Stem Cell Technologies Inc., Vancouver BC, Kanada).
2. Proliferationstests – Proliferation von Ba/F3-Zellen (Cwirla et al. 1997, Science, Band 276 Seiten 1696-1699). Die Ba/F3-mpl-Zellinie wurde etabliert (F. de Sauvage et al., Nature, 369:533 (1994)) durch Einbringen der cDNA, die den gesamten cMpl-Rezeptor codiert, in die IL-3-abhängige Lymphoblastenzellinie Ba/F3 der Maus. Eine Stimulation von Proliferation von Ba/F3-mpl-Zellen als Reaktion auf verschiedene Konzentrationen von Antikörpern oder TPO wurde anhand der Menge der Aufnahme von ³H-Thymidin gemessen, wie es zuvor beschrieben wurde (F. de Sauvage et al., supra).
3. Phosphorylierungstests – Phosphorylierung von JAK2 (Drachmann et al., J. Biol. Chem., (1999), Band 274, Seiten 13480-13484).
4-Transient co-transfi. Auf Transkription beruhende Testszierter cMpl-Rezeptor der vollen Länge mit c-Fos-Promotor-Luciferasereporter-Konstrukt. 24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen in 0,5 % FCS für 24 Stunden hungern gelassen. Die Zellen werden stimuliert, nach 6 Stunden geerntet und Luciferase gemessen (siehe auch Beispiel 1, Abschnitt Biologische Tests).

Biologische Tests zur Durchmusterung hinsichtlich EPO-artiger Aktivität

1. Knochenmarkerythroid-Koloniebildung in Methylcellulose (Wrighton et al., Science, 1996, Band 273 Seiten 458-463).
2. Proliferation von TF-1-Zellen (humane Erythroleukämie-Zellinie). TF-1-Zellen exprimieren Epo-R der vollen Länge als auch eine verkürzte Form (J. Cell Physiol., 1989, Band 140, Seiten 323-334).
3. Der EPO-Rezeptor koppelt direkt an JAK2-Kinase zur Induzierung von Tyrosinphosphorylierung. Epo induziert cFos in TF-1-Zellen. c-Fos-Transkriptionsaktivierung (Witthuhn et al., Cell, (1993), Band 74, Seiten 227-236).

Es kann eine Anzahl von biologischen Tests in einer Durchmusterung mit hohem Durchsatz eingesetzt werden. Die Fachleute auf dem Gebiet sind mit diesen und anderen geeigneten biologischen Tests vertraut. Es wurden mehrere nicht-radioaktive Tests entwickelt, in denen entweder DNA-Synthese oder Enzymaktivität analysiert werden kann. Z. B. kann ein MTT-Zellproliferationstest (Promega Corporation, Madison, WI), der auf einem von Mosmann beschriebenen Test beruht (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55-57, was durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist), verwendet werden. Dieses Protokoll ist schnell und einfach. In dem Test wird MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid), ein Tetrazoliumsalz, in ein blaues Formazanprodukt durch Mitochondrien-Dehydrogenaseaktivität in lebenden Zellen umgewandelt. Der Dehydrogenaseanteil und daher die Menge an produziertem gefärbtem Produkt ist proportional zu der Zellzahl. Das gefärbte Produkt ist in einem ELISA-Plattenlesegerät bei 570 nm detektierbar. Tests werden in 3-facher Ausführung massenweise in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Kurz gefaßt werden Zielzellen in aliquoten Teilen von 100 μl in Kulturmedium in 96-Well-Platten ausgesät. Nach der Zugabe verschiedener Konzentrationen von Antikörpern werden die Zellen für 48 bis 72 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer vollständig befeuchteten Atmosphäre inkubiert. Zu jedem Well wird MTT hinzugefügt und Proliferation über ein ELISA-Plattenlesegerät überwacht.
Z. B. werden in Proliferationstests, die TF-1-Zellen verwenden, Bakterienzellen, die Antikörper exprimierende Phagemide enthalten, in 96-Well-Platten mit tiefen Wells in 1 ml Medium, das ein Gemisch aus Säugerzellmedium und Bakterienmedium ist (im Falle von TF-1-Zellen: RPMI 2,7/SB 0,3/Carb 100 μg/ml), gezüchtet. TF-1-Zellen sind eine humane Knochenmarkserythroleukämie- Zellinie, die auf mehrere Cytokine anspricht (Kitamura, T., Tange, TI, Terasawa, T., Chiba, S., Kuwaki, T., Miyagawa, K., Piao, Y. F., Miyazono, K., Urabe, A., Takaku, F., Cell Physiol. 140:323-334, 1989, Kitamura, T., Tojo, A., Kuwaki., Chiba, S., Miyazono, K., Urabe, A., Takaku, F., Blood 73:375-380, 1989, Kitamura, T., Takaku, F., Miyajima, A., Int. Immunol. 3:571-577, 1991). Am folgenden Tag werden die Übernachtkulturen 1/10 auf frische Träger subkultiviert und für 2 Stunden auf 37 °C gestellt. Nach der Induzierung mit IPTG bei 37 °C für 4 Stunden werden die Platten bei 2000 U.p.M. für 15' bei Raumtemperatur zentrifugiert. 50 μl jedes Kulturüberstands werden in 96-Well-Filterträgern (Millipore) auf sterile 96-Well-Testplatten filtriert. Säugerzellen werden vorgewaschen, um Wachstumsfaktor zu entfernen, und bei einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml resuspendiert. 50 μl Zellen werden zu jedem Well hinzugefügt. Die Testplatten werden in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ für 72 Stunden inkubiert. Nach 72 Stunden werden die Träger durch Hinzufügung von 40 μl Medium/MTS/PMS pro Well entwickelt. MTS ist eine verbesserte, löslichere Version von MTT. Beide Tests beruhen auf der zellulären Umwandlung von Tetrazoliumsalz. Ein MTS-Proliferationstest-Kit (Katalog Nr. G5421) kann von Promega, Inc. (Madison, WI) bezogen werden. Die Platten werden im Inkubator bei 37 °C und CO₂ gehalten und nach 1 Stunde, 4 Stunden, 8 Stunden mit einem Mikroplattenlesegerät bei einer OD₄₉₀ gelesen.
Die Aktivitäten von Cytokinen sind häufig synergistisch. Synergie könnte durch die Bindung von Liganden an zwei verschiedene Rezeptoren, was dann das korrekte Signal sendet, bestätigt werden oder über einen Initiierungseffekt, wobei eine Wechselwirkung von Ligand/Rezeptor die Zelle initiiert, auf ein zweites Cytokin zu reagieren. Darüber hinaus sind Cytokine, die früh in der Fortpflanzungsentwicklung wirken, häufiger synergistisch als Cytokine, die in späteren Stadien in einem Entwicklungsweg wirken. Daher können zur Untersuchung von Synergismus suboptimale Konzentrationen von Wachstumsfaktoren in diesen biologischen Tests eingesetzt werden. Bedingungen für suboptimale Konzentrationen werden für jeden Test bestimmt. Dies wird durchgeführt, indem man Reihenverdünnungen von Wachstumsfaktoren einzeln und als ein Gemisch zu den Tests hinzufügt und die Niveaus bestimmt, unterhalb der ein einzelner Faktor im Vergleich zu dem Gemisch eine Reaktion nicht fördert, und das Niveau, unterhalb dessen das Gemisch eine Reaktion in dem biologischen Test nicht fördert. Knochenmarkstromazellen können ebenfalls in biologische Tests zugegeben werden, um andere notwendige Faktoren bereitzustellen, die eine Rolle in einer synergistischen Reaktion spielen könnten.
Darüber hinaus kann Zellproliferation durch Überwachung von DNA-Synthese untersucht werden. Ein nicht-radioaktiver, colorimetrischer Test, der 5-Brom-2'-desoxyuridin-(BrdU-)-Einbau (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) untersucht, kann in Mikrotiterplattenformat durchgeführt werden. Darin werden Zellen in 96-Well-Platten kultiviert und mit BrdU und suboptimalen Konzentrationen von Cytokinen inkubiert. Die Menge an BrdU wird nach Markierung mit einem mit Peroxidase markierten Anti-BrdU-Antikörper bestimmt. Endergebnisse werden mit einem ELISA-Plattenlesegerät bei 405 nm analysiert.
Es kann auch ein radioaktiver Mitogenesetest verwendet werden, der die Rate der DNA-Synthese als eine Anzeige für Proliferation mißt (Raines und Ross, Methods of Enzymol. 109:749- 773, 1985). In diesen Tests werden Veränderungen der Einbaurate von [³H]-Thymidin in Zielzellen untersucht. Wiederum erlauben diese Tests eine gleichzeitige und schnelle Durchmusterung vieler Antikörperfragmente. Sie wurden in breitem Maße als ein bequemes Verfahren zur Untersuchung der stimulierenden und hemmenden Wirkungen auf das Wachstum vieler verschiedener Zellen verwendet. Zellen werden in Suspension kultiviert, bis sie exponentielle Wachstumsgeschwindigkeit erreichen. Die Zellen werden dann von dem Medium, in dem sie kultiviert wurden, freigewaschen und in frischem Medium erneut ausgesät. Die Zellen werden in aliquoten Teilen in 96-Well-Platten in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einer Konzentration von etwa 1-2 × 10⁵ Zellen/ml verteilt. Verdünnungen von Phagenüberstand, löslichen dimerisierten Fab- oder ScFv-Antikörpern werden hinzugefügt, und die Zellen werden für 18 bis 48 Stunden in einem begasten CO₂-Inkubator bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird [³H]-Thymidin (937 kBq) zu jedem Well hinzugefügt und für weitere vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden dann aus dem Inkubator entfernt und direkt in einem Labor-Mikroplatten-Scintillationszähler, wie beispielsweise dem Packard Top Count NXT Instrument (Packard, Meriden, CT) ausgezählt. Alternativ können die Zellen nacheinander auf GF/C-Filter auf einem Millipore-Zellernter (Millipore, Bedford, MA) oder einem ähnlichen Apparat überführt werden. Radioaktivität, die mit säureunlöslichem Material verbunden ist, das auf dem Filter zurückgehalten wird, wird dann bestimmt. Verdünnungen von kommerziell erhältlichen Wachstumsfaktoren werden auf Wells von Positivkontrollen angewendet. Negativkontrollen würden Überstände von Zellen umfassen, die Plasmide tragen, die kein Insert enthalten, oder ähnlich behandelte irrelevante Antikörper. Die relativen wachstumsfördernden Aktivitäten des Standards und der Verdünnungen der Phagenüberstände in dem Test werden verglichen, um die wachstumsfördernde Aktivität in der Probe zu quantifizieren.
Eine Aktivierung kann durch Untersuchung der Zweitboten bzw. Second Messenger oder durch Transkriptionsauslesetests getestet werden.
Überleben kann z. B. durch Überwachung von Apoptose unter Verwendung von Tests, wie beispielsweise Tunneltests, oder durch andere Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, getestet werden.
Andere geeignete Tests zur Analyse von zellulärer Signalübertragung, der Aktivität von Kinasen und Phospatasen und schließlich von zellulären Aktivitäten als eine Folge von Agonistenaktivität umfassen eine Messung der Erzeugung von Zweitboten bzw. Second Messenger, z. B. cAMP, Ca⁺⁺, Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3). Eine Messung von Spitzen der intrazellulären Calciumkonzentration, des intrazellulären pH-Wertes und des Membranpotentials in Durchmusterungstests mit hohem Durchsatz kann unter Verwendung von Instrumenten, wie beispielsweise dem FLIPR Fluormetric Imaging Plate Reader System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) durchgeführt werden. Es ist eine Anzahl von Fluoreszenzsonden zur Untersuchung von Zweitbotenkonzentrationen verfügbar (Molecular Probes, Eugene, OR). Die Messung der Konzentrationen von Zweitboten kann auch auf dem Einzelzellniveau durchgeführt werden (DeBernard, M. A. und Brooker, G. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:4577-4582, 1996). Darüber hinaus wären Tests, die andere Signalereignisse untersuchen, wie beispielsweise Phosphorylierung, Apoptose oder die Mengen von RNA oder Protein von spezifischen Genen nützlich. Z. B. wurde von den meisten Cytokinen gezeigt, daß sie das Enzym PI 3-K aktivieren (beschrieben in Silvennoinen, O., Ihle, J. N. Signaling by the Hematopoietic Cytokine Receptors, R. G. Landes company, Austin, TX 1996). Darüber hinaus wurde von der Jak-Familie von Tyrosinkinasen gezeigt, daß sie zentrale Vermittler für die Cytokin-Rezeptor-Signalisierung sind (Ihle, J. N., Witthuhn, B. A., Quelle, F. W. Annu. Rev. Immunol. 13:369-398, 1995). Darüber hinaus werden mehrere andere Tyrosinkinasen, z. B. Mitglieder der Src-Familie als Reaktion auf bestimmte Cytokinstimulationen aktiviert. Im Falle von RNA oder Proteinen werden z. B. c-Jun und c-Fos bei Cytokinstimulation schnell und transient heraufreguliert, während die c-Myc-Induzierung langsamer ist. Diese Proteine sind für den G1-Übergang und Proliferation erforderlich (beschrieben in Silvennoinen, O., Ihle, J. N., Signaling by Hematopoietic Cytokine Receptors, R. G. Landes Company, Austin, TX 1996). Es könnten Durchmusterungen mit hohem Durchsatz, die Anstiege in diesen Transkripten feststellen, verwendet werden.
In Transikriptionsauslesetests werden Veränderungen in der Transkription spezieller Gene nach dem Aussetzen von Zellen an einen Wachstumsfaktor oder ein Wachstumsfaktor-Mimetikum (Agonist oder hemmender Antikörper) beobachtet. Z. B. werden in einem myc-Auslesetest Zellen, wie beispielsweise die IL-3-abhängige FDCP-Mischzellinie, für 8 Stunden von IL-3-Wachstumsfaktor hungern gelassen, gefolgt von Aussetzen an Wachstumsfaktor-Mimetika oder nativen Wachstumsfaktoren für 2 Stunden bei 37 °C. Nach dieser Zeit werden die Zellen geerntet, RNA wird isoliert, und Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-PCR) werden mit Primern, die für das myc-Gen spezifisch sind, durchgeführt. Die RT-PCR-Reaktionen werden zur Quantifizierung von PCR-Produkten Elektrophorese in horizontalen Agarosegelen untergezogen. In diesem Fall wird die Expression eines einzelnen Gens überwacht.
Alternativ können in einem Test auch Veränderungen in der Expression von Genen unter Verwendung von CHIP-Technologie Agonisten-Antikörper unter Bedingungen hoher Sondenempfindlichkeit und eines dynamischen Bereiches identifiziert werden. Auf diese Weise könnten 10.000 oder mehr hinsichtlich Veränderungen in der Expression analysiert werden. Gewünschte Gene, die überwacht werden könnten, könnten u.a. c-myc, c-jun, NF-κB umfassen. Diese Gene liegen abstromig zu verschiedenen Signalübertragungswegen und ihre Expression sollte sich bei einer mitogenen Reaktion verändern. Bei einem Typ von kommerziell erhältlichem CHIP (Affymetrix, Santa Clara, CA) können Oligonukleotide von gewünschten Testgenen auf eine Glasoberfläche aufgedruckt werden. Zielzellen werden Test-Agonisten-Antikörpern ausgesetzt. RNA wird aus den Zellen, die Test-Agonisten-Antikörpern ausgesetzt sind, isoliert, in cDNA kopiert und in vitro transkribiert in der Gegenwart von Biotin. Hybridisierung von in vitro transkribierter, biotinylierter mRNA wird in den Anordnungen als Sonde verwendet. Die Chips werden dann durchmustert, um Gene zu bestimmen, die beim Aussetzen an Test-Agonisten-Antikörper eine Erhöhung in der Transkription zeigen. In einer weiteren Version der CHIP-Technologie (Incyte, Palo Alto, CA) wird die Menge an DNA auf dem Glas nicht normalisiert, statt dessen würde man eine kompetitive Hybridisierung ansetzen. RNA wird vor und nach dem Aussetzen an den Agonisten aus den Zellen isoliert. Aus jeder Probe wird cDNA hergestellt, wobei bei einer cDNA-Reaktion eine Markierung, z. B. Cy-3, aufgenommen wird, und die andere cDNA-Population hat eine andere Markierung, z. B. Cy-5, aufgenommen. Signale werden mit einer Doppellaserabtastung detektiert und verglichen, um Bilder zu sammeln.
Visuelle Tests, wie beispielsweise traditionelle Methylcellulose-Koloniebildungstests (Stern Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) können auch verwendet werden. In diesen Tests werden Koloniewachstum und morphologische Veränderungen durch ein Lichtmikroskop bewertet. Visuelle Untersuchung hinsichtlich Proliferations- oder Differenzierungseffekten in Kulturen in halbfestem Agar oder Methylcellulose können unter Verwendung der geeigneten Zellinie durchgeführt werden. Williams Hermatology 5 (Herausgeber E. Beutler, M. A. Lichtman, B. S. Coller L T. J. Kipps), McGraw-Hill, Inc., Seiten L22-L26, 1995). Die Zugabe von Methylcellulose ermöglicht es, daß die Nachkommenklone einer einzelnen Vorläuferzelle zusammenbleiben, und erleichtert die Erkennung und Zählung von unterschiedlichen Kolonien. Alle notwendigen Komponenten werden zu einem basischen Methylcellulose-Medium (wie beispielsweise Iscove's MDM, BSA, Mercaptoethanol, L-Glutamin) hinzugefügt, ausgenommen Ergänzungen von koloniestimulierendem Faktor, und Testantikörper (Phagenüberstände, lösliche Antikörper) werden hinzugefügt, um zu sehen, ob sie Wachstumsfaktoren ersetzen können. Zellen in Methylcellulose-Kultur werden für 10 bis 12 Tage nach der Zugabe von Antikörpern in einer feuchten Atmosphäre von 5 % CO₂ in Luft bei 37 °C inkubiert. Nach 10 bis 12 Tagen der Inkubation werden Kolonien unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops gezählt. Nach weiteren 8 bis 10 Tagen werden die Kolonien erneut gezählt. Es werden Vergleiche zwischen Medien, die Antikörper und Kontrollen mit und ohne Wachstumsfaktoren enthalten, durchgeführt. Darüber hinaus können Kolonien von Methylcellulose abgenommen und einzelne Zellen zytologisch durch Färbung mit Wrights Färbemittel untersucht werden (siehe Atlas der Hämatologischen Zytologie, F. G. J. Hayhoe und R. J. Flemans, Wiley-InterScience 1970).
Die Rezeptorbindungsaffinitäten von Antikörperfragmenten können anhand von Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten, gemessen unter Verwendung eines BIACORE-Oberflächenplasmonresonanzsystems (Pharmacia Biosensor), berechnet werden. Ein Biosensorchip wird für eine kovalente Kopplung von gD-mpl-Rezeptor unter Verwendung von N-Ethyl-N'''-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (ECD) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) gemäß den Anleitungen des Herstellers (Pharmacia Biosensor) aktiviert. gD-mpl wird einem Pufferaustausch in 10 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) unterzogen und auf etwa 30 μg/ml verdünnt. Ein aliquoter Teil (5 μl) wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 μl/min injiziert, um etwa 400 Reaktionseinheiten (RU) von gekoppeltem Protein zu erzielen. Schließlich wird 1 M Ethanolamin als ein Blockierungsmittel injiziert. Für Kinetikmessungen werden 1,5-fache Reihenverdünnungen von Antikörper in PBS/Tween-Puffer (0,05 % Tween-20 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) bei 25 °C unter Anwendung einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 μl/min injiziert. Gleichgewichtsdissoziationskonstanten, K_d s, von SPR-Messungen werden als k_off/k_an berechnet. Standardabweichungen, s_on für k_on und s_off für k_off, erhält man typischerweise aus Messungen mit > 4 Proteinkonzentrationen (k_on) oder mit > 7 Proteinkonzentrationen (k_off). Dissoziationsdaten werden an ein einfaches AB -> A + B-Modell angepaßt, um k_off +/– s.d. (Standardabweichung der Messungen) zu erhalten. Ratenkonstanten pseudoerster Ordnung (ks) werden für jede Assoziationskurve berechnet und als eine Funktion der Proteinkonzentration aufgetragen, um k_on +/– s.e. (Standardfehler der Anpassung) zu erhalten.
Für eine Umwandlung von Antikörperklonen zu vollständigen IgG können die codierenden Regionen für sowohl die leichten als auch die schweren Ketten oder Fragmente davon separat aus einem bakteriellen Vektor in einen Säugervektor(en) kloniert werden. Ein einzelnes Vektorsystem, wie beispielsweise pDR1 oder dessen Derivate, kann zum Klonieren von Kassetten von sowohl leichten als auch schweren Ketten in das gleiche Plasmid verwendet werden. Alternativ können duale Expressionsvektoren verwendet werden, bei denen schweren und leichte Kette durch separate Plasmide produziert werden. Säugersignalsequenzen müssen entweder bereits in dem/den Endvektoren) vorhanden sein oder an das 5'-Ende der DNA-Inserts der leichten und schweren Ketten angehängt werden. Dies kann durch anfängliche Übertragung der Ketten in einen Shuttle-Vektor oder Shuttle-Vektoren, der/die die geeigneten Säugerführungssequenzen enthält/enthalten, erreicht werden. Nach Restriktionsenzymverdau werden die Regionen der leichten Kette und der schweren Kette oder Fragmente davon in Endvektoren) eingeführt, wo die verbleibenden konstanten Regionen für IgG1 entweder mit oder ohne Introns bereitgestellt werden. In einigen Fällen, bei denen Introns verwendet werden, kann die Primerausgestaltung für eine PCR-Vervielfältigung der variablen Regionen der leichten und schweren Ketten aus pRL4 erfordern, daß Exon-Spleiß-Donorstellen enthalten sind, um ein geeignetes Spleißen und eine Produktion der Antikörper in Säugerzellen zu bekommen.
Mit jedem Vektorexpressionssystem (Einzel- oder Dualplasmid) kann die Produktion von schweren und leichten Antikörperketten durch Promotoren gesteuert werden, die in Säugerzellen arbeiten, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf CMV-, SV40- oder IgG-Promotoren. Zusätzlich wird der Vektor oder werden die Vektoren einen selektierbaren Marker für ein Wachstum in Bakterien enthalten (wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf Ampicillin-, Chloramphenicol-, Kanamycin- oder Zeocin-Resistenz). Selektierbare Macker für Säugerzellen (wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf DHFR-, GS-, gpt-, Neomycin- oder Hygromycin-Resistenz) können ebenfalls in dem/den IgG-Vektoren) vorhanden sein oder auf einem separaten Plasmid durch Co-Transfektion bereitgestellt werden.
Die Fachleute auf dem Gebiet wären in der Lage, Antikörper in anderen Organismen zu synthetisieren, wie beispielsweise in Hefe, Säugern, Insekten und Pflanzen (Carlson, J. R. und Weissman, I. L., Mol. Cell. Biol., 8:2647-2650, 1988, Trill, J. J., Shatzman, A. R., Ganguly, S. Curr. Opin. Biotechnol. 6:553-560, 1995, Hiatt, A., Cafferkey, R. Bowdish, K. Nature 342:76-78, 1989).
Wie es zuvor erwähnt wurde, stellen Antikörper, die gemäß der Offenbarung hierin hergestellt sind, eine erhöhte Halbwertszeit (Wirkungsdauer) für die Aktivität von kleinen Peptiden oder Peptidmimetika, wie beispielsweise dem hierin beschriebenen TPO-Mimetikum, bereit. In einem weiteren Aspekt kann die Serumhalbwertszeit eines Antikörpers selbst verlängert werden, indem man Derivate herstellt, die PEGyliert sind. Siehe z. B. Lee et al., Bioconjug. Chem (1999) 10(6):973-81, was durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Ein weiterer Vorteil von beispielsweise dem hierin beschriebenen TPO-Mimetikum-Antikörper ist, daß eine Behandlung mit normalen TPO zur Erzeugung von TPO-neutralisierenden Antikörpern führen kann, welche die Aktivität von natürlich vorkommendem TPO eines Patienten stören. Der vorliegende TPO-Mimetikum-Antikörper reduziert erheblich die Wahrscheinlichkeit, daß eine verheerende Immunantwort gegen natives TPO hervorgerufen wird, da dieses eine andere Aminosäuresequenz hat.
Die von den Patentansprüchen umfaßten Moleküle können in der Diagnostik verwendet werden, bei der die Antikörper oder Fragmente davon mit detektierbaren Markern konjugiert sind, oder sie können als primäre Antikörper mit sekundären Antikörpern, die mit detektierbaren Marken konjugiert sind, verwendet werden. Detektierbare Marker umfassen radioaktive und nicht-radioaktive Markierungen und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Übliche nicht-radioaktive Markierungen umfassen detektierbare Enzyme, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und fluoreszierende Moleküle. Fluoreszierende Moleküle absorbieren Licht bei einer Wellenlänge und emittieren es bei einer anderen, wodurch sie eine Visualisierung mit beispielsweise einem Fluoreszenzmikroskop ermöglichen. Spektrophotometer, Fluoreszenzmikroskope, Fluoreszenzplattenlesegeräte und Flußsortierer sind gut bekannt und werden häufig zur Detektion spezifischer Moleküle verwendet, die fluoreszent gemacht wurden, indem sie an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt wurden. Fluorochrome, wie beispielsweise grün fluoreszierendes Protein, ins Rote verschobene Mutanten von grün fluoreszierendem Protein, Aminocoumarin-Essigsäure (AMCA), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetramethylchodaminisothiocyanat (TRITC), Texas Red, Cy3.0 und Cy5.0 sind Beispiele für geeignete Markierungen.
Die Moleküle können in Zellisolierungsstrategien eingesetzt werden, wie beispielsweise Durchflußzytometrie (FACS), wenn Fluoreszenzmarker verwendet werden. In der Durchflußzytometrie werden Zellen, die mit fluoreszierenden Molekülen markiert sind, elektronisch auf einem Flußcytometer sortiert, wie beispielsweise einem Becton-Dickinson (San Jose, Kalifornien) FACS IV-Cytometer oder einem äquivalenten Instrument. Die fluoreszierenden Moleküle sind Antikörper, die spezifische Zelloberflächenantigene erkennen. Die Antikörper sind an Fluoreszenzmarker, wie beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE), konjugiert.
Magnetische Sortierung ist ebenfalls möglich. In magnetischen Sortierungsverfahren ist der Antikörper direkt oder indirekt an magnetische Mikroperlen gebunden. Zellen werden mit Antikörpern vorbeschichtet, welche Zelloberflächenmoleküle, z. B. Rezeptoren, die an Proliferation, Differenzierung, Aktivierung oder Überleben beteiligt sind, erkennen. Die Antikörper werden an magnetische Perlen angebunden, die mit einem sekundären Immunglobulin konjugiert sind, das an den primären Antikörper bindet, der das Peptid präsentiert, wie beispielsweise an die HA-Molekülmarkierung, die in jeden Antikörper eingebaut ist. Die Zellen werden dann mit einem Magneten entfernt. Magnetische Sortierung kann eine positive Selektion sein, bei der interessierende Zellen von dem Antikörper und damit dem Magneten gebunden werden, oder negative Selektion, bei der unerwünschte Zellen an dem Magneten isoliert werden.
Alternativ können radioaktiv markierte Antikörper für diagnostische Zwecke verwendet werden.
Hierin offenbarte Antikörper sind für die Vervielfältigung einer Vielzahl klinisch relevanter Zelltypen geeignet. Eine Behandlung kann in vivo oder in ex vivo stattfinden. Z. B. sind Agonistenantikörper geeignet zur Behandlung von Patienten, die unter einem Mangel bezüglich einer Zellpopulation leiden, der durch eine Krankheit, eine Störung oder eine Behandlung, die z. B. mit einer Unterdrückung von Hämatopoiese in Verbindung steht, bei der weniger als die normale Anzahl von Zellen einer gegebenen Linie oder Linien in einem Patienten vorhanden ist, verursacht wird. Die folgenden repräsentieren nur einige Beispiele der Zustände, die mit den Antikörpern, die hierin offenbarte biologisch aktive Peptide enthalten, behandelt werden können, und diejenigen, die auf dem Gebiet praktizieren, wären in der Lage, andere Krankheiten und Zustände zu identifizieren, die von solch einer Behandlung profitieren würden. Z. B. zeigen HIV-infizierte Patienten, Patienten, die einer Chemotherapie unterzogen werden, Knochenmarkstransplantationspatienten, Stammzellentransplantationspatienten und Patienten, die unter myeloproliferativen Störungen leiden, unternormale Niveaus an spezifischen hämatopoietischen Linien.
Thrombocytopenie kann eine Folge von Chemotherapie, Knochenmarkstransplantation oder chronischer Krankheit, wie beispielsweise idiopathischer Thrombocytopenie (ITP), sein, welche alle zu niedrige Blutplättchenmengen führen. Die vorliegenden TPO-Mimetikum-Antikörper können zur Behandlung solcher Patienten verwendet werden.
Patienten, die Nierendialyse unterzogen werden, leiden häufig unter mit der Behandlung einhergehender Anämie mit unternormalen Mengen an roten Blutzellen. Bei aplastischer Anämie kann eine Knochenmarksunterdrückung Pancytopenie verursachen oder kann nur die roten Blutzellen, die weißen Zellen oder die Blutplättchen betreffen. Die offenbarten Antikörper werden das Rüstzeug therapeutischer Mittel für diese und andere Krankheiten und Störungen, die durch Mängel an speziellen Zellpopulationen, wie beispielsweise hämatopoietischen Zellen, gekennzeichnet sind, vergrößern.
Die von der beanspruchten Erfindung umfaßten Moleküle können auch für die Proliferation und Differenzierung ex vivo verwendet werden. Dies ist geeignet für Gentherapiezwecke, z. B. für traditionelle Ansätze mit viralen Vektoren, und für autologe Knochenmarkstransplantationen.
Darüber hinaus können bestimmte Antikörper gemäß der vorliegenden Offenbarung für eine Radioimmuntherapie radioaktiv markiert werden und mit Toxinen konjugiert werden, um solche Toxine an spezielle Zelltypen auszuliefern und zum Abtöten dieser Zellen zu führen.
Ein biologisch aktiver c-mpl-Agonisten-Antikörper, der in der Lage ist, Proliferation, Differenzierung und Reifung von hämatopoietischen Zellen zu stimulieren, kann in einer sterilen pharmazeutischen Präparation oder Formulierung verwendet werden, um megakaryocytopoietische oder thrombopoietische Aktivität in Patienten zu stimulieren, die aufgrund von beeinträchtigter Produktion, Sequestrierung oder erhöhter Zerstörung von Blutplättchen unter Thrombocytopenie leiden. Mit Thrombocytopenie einhergehende Knochenmarkshypoplasie (z. B. aplastische Anämie nach Chemotherapie oder Knochenmarkstransplantation) kann mit den offenbarten Antikörpern effektiv behandelt werden, wie auch Störungen, wie beispielsweise disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC), Immunthrombocytopenie (einschließlich HIV-induzierte ITP und nicht-HIV-induzierte ITP), chronische idiopathische Thrombocytopenie, kongenitale Thrombocytopenie, Myelodysplasie und thrombotische Thrombocytopenie.
Die hierin offenbarten biologisch aktiven c-mpl-Agonisten-Antikörper, die das TPO-Mimetikum-Peptid enthalten, können auf die gleiche Art und Weise und für die gleichen Indikationen verwendet werden wie Thrombopoietin (TPO). Thrombopoietin (TPO) stimuliert Megakaryocytopoiese und Blutplättchenproduktion. Von diesen Antikörpern wird erwartet, daß sie eine längere Halbwertszeit haben als natives oder PEGyliertes TPO und werden daher bei Indikationen eingesetzt, bei denen eine längere Halbwertszeit indiziert ist.
Ein Beispiel für einen Test, der für eine Bestimmung der Aktivität von TPO-Mimetika ist, ist der Rebound-Thrombocytose-Test, der die Verabreichung einer einzelnen Injektion von Ziege-Anti-Maus-Blutplättchen-Serum an Mäuse zur Induzierung von akuter Thrombocytopenie umfaßt (Tag 0). An den Tagen 5 und 6 werden den Mäusen Testproben injiziert. Am Tag 8 werden die Blutplättchenwerte bestimmt (³⁵S-Aufnahme in Blutplättchen).
Der Weg der Antikörperverabreichung erfolgt nach bekannten Verfahren, z. B. Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale, intracerebrale, intramuskuläre, subkutane, intraoculare, intraarterielle, intrathecale, Inhalations- oder intraläsionale Wege, topisch oder durch Systeme mit verzögerter Freisetzung, wie es unten ausgeführt wird. Der Antikörper wird vorzugsweise kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolusinjektion verabreicht. Man kann die Antikörper auf lokale oder systemische Art und Weise verabreichen.
Die Antikörper der Erfindung können in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger präpariert werden. Techniken für die Formulierung und Verabreichung der Komponenten der vorliegenden Anmeldung kann man in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Auflage, finden. Diese therapeutische Zusammensetzung kann intravenös oder durch die Nase oder durch die Lunge, vorzugsweise als eine Flüssigkeit oder als Pulveraerosol (lyophilisiert), verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann auch parenteral oder subkutan verabreicht werden, wenn es erwünscht ist. Wenn sie systemisch verabreicht wird, sollte die therapeutische Zusammensetzung steril, Pyrogen-frei und in einer parenteral verträglichen Lösung unter Berücksichtigung von pH-Wert, Isotonizität und Stabilität vorliegen. Diese Bedingungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Zusammengefaßt werden Dosierungsformulierungen der Komponenten der vorliegenden Erfindung für eine Lagerung oder Verabreichung hergestellt, indem man die Komponente mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch verträglichen Trägern, Bindemitteln oder Stabilisatoren mischt. Solche Materialien sind für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und können Puffer umfassen, wie beispielsweise Tris-HCl, Phosphat-, Citrat-, Acetat- und andere organische Salze, Antioxidantien, wie beispielsweise Ascorbinsäure, Peptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), wie beispielsweise Polyarginin, Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline, hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließ lich Cellulose oder deren Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine, Chelierungsmittel, wie beispielsweise EDTA, Zuckeralkohole, wie beispielsweise Mannitol oder Sorbitol, Gegenionen, wie beispielsweise Natrium, und/oder nicht-ionische Detergenzien, wie beispielsweise TWEEN, PLURONICS oder Polyethylenglycol.
Wenn sie für eine Verabreichung in vivo verwendet wird, muß die Antikörperformulierung steril sein und kann gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Praxis formuliert werden. Dies wird auf einfache Weise mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembrane vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erreicht. Der Antikörper wird üblicherweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert. Andere Träger, wie beispielsweise natürlich vorkommendes Gemüseöl, wie Sesam-, Erdnuß- oder Baumwollsamenöl, oder ein synthetischer Fettträger, wie Ethyloleat oder ähnliches, können erwünscht sein. Puffer, Konservierungsmittel, Antioxidantien und ähnliches können gemäß anerkannter pharmazeutischer Praxis einbezogen werden.
Für die Anwendung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen Zusammensetzungen, in denen ein oder mehrere vernünftig entworfene Antikörper in einer Menge enthalten sind, die zum Erzielen ihres beabsichtigten Zwecks wirksam ist. Spezieller bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge von Antikörper, die zur Verhinderung, Linderung oder Verbesserung von Symptomen einer Krankheit oder Verlängerung des Überlebens des behandelten Subjekts wirksam ist. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Fähigkeit der Fachleute auf dem Gebiet, insbesondere im Hinblick auf die hierin angegebene ausführliche Offenbarung. Therapeutisch wirksame Dosierungen können unter Anwendung von in vitro- und in vivo-Methoden bestimmt werden.
Eine wirksame Menge an therapeutisch zu verwendendem Antikörper wird z. B. von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten abhängen. Darüber hinaus berücksichtigt der beteiligte Arzt verschiedene Faktoren, die dafür bekannt sind, daß sie die Wirkung von Arzneimitteln modifizieren, einschließlich Schwere und Art der Krankheit, Körpergewicht, Geschlecht, Ernähung, Zeit und Weg der Verabreichung, andere Medikationen und andere relevante klinische Faktoren. Dementsprechend wird es für den Therapeuten notwendig sein, die Dosierung zu titrieren und den Verabreichungsweg zu modifizieren, je nachdem wie es zum Erreichen der optimalen therapeutischen Wirkung erforderlicht ist. Typischerweise wird der Klinker Antikörper verabreichen, bis eine Dosierung erreicht ist, die die gewünschte Wirkung erzielt. Der Verlauf dieser Therapie wird einfach durch herkömmliche Tests überwacht.
Für jeden Antikörper, der ein Peptid enthält, kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich anhand von Zellkulturtests abgeschätzt werden. Z. B. kann eine Dosierung in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erzielen, der den EC₅₀ umfaßt, wie er in Zellkultur bestimmt wurde (z. B. die Konzentration des Testmoleküls, welches zelluläre Proliferation oder Differenzierung fördert oder hemmt). Diese Information kann dazu verwendet werden, geeignete Dosierungen im Menschen genauer zu bestimmen.
Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der hierin beschriebenen Antikörpermoleküle kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden (z. B. zur Bestimmung der LD₅₀ (der Dosis, die für 50 % der Population letal ist) und der ED₅₀ (der Dosis, die in 50 % der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und dieser kann als das Verhältnis zwischen LD₅₀ und ED₅₀ ausgedrückt werden. Moleküle, die hohe therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs für eine Anwendung im Menschen verwendet werden. Die Dosierung dieser Moleküle liegt vorzugsweise in einem Bereich zirkulierender Konzentrationen, welche die ED₅₀ mit wenig oder ohne Toxizität umfassen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können von dem jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustands des Patienten gewählt werden (siehe z. B. Fingl et al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kapitel 1, Seite 1).
Dosierungsmenge und -intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmamengen des Antikörpers bereitzustellen, die ausreichend sind, um zelluläre Proliferation oder Differenzierung oder eine minimal wirksame Konzentration (MEC) zu fördern oder zu hemmen. Die MEC wird für jeden Antikörper variieren, kann aber anhand von in vitro-Daten unter Verwendung beschriebener Tests abgeschätzt werden. Dosierungen, die zum Erreichen der MEC erforderlich sind, werden von individuellen Eigenschaften und dem Verabreichungsweg abhängen. Es können jedoch HPLC-Tests oder biologische Tests verwendet werden, um Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Verwendung des MEC-Wertes bestimmt werden. Antikörpermoleküle sollten unter Verwendung einer Vorschrift verabreicht werden, welche die Plasmamengen für 10 bis 90 % der Zeit, vorzugsweise zwischen 30 bis 90 % und besonders bevorzugt zwischen 50 bis 90 % über der MEC hält.
In Fällen örtlicher Verabreichung oder selektiver Aufnahme kann die effektive örtliche Konzentration des Antikörpers nicht mit der Plasmakonzentration in einem Verhältnis stehen.
Eine typische tägliche Dosis kann von etwa 1 μg/kg bis zu 1.000 mg/kg oder mehr reichen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren. Typischerweise wird der Kliniker das Molekül verabreichen, bis eine Dosis erreicht ist, welche die gewünschte Wirkung erzielt. Der Verlauf dieser Therapie wird auf einfache Weise durch herkömmliche Tests überwacht.
Abhängig von der Art und Schwere der Krankheit könnten von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 1.000 mg/kg, bevorzugter etwa 0,01 mg/kg bis 100 mg/kg, besonders bevorzugt etwa 0,010 bis 20 mg/kg des Agonisten-Antikörpers eine voraussichtliche Dosierung für die Verabreichung an den Patienten darstellen, beispielsweise durch eine oder mehrere separate Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger, abhängig von dem Zustand, wird die Behandlung wiederholt, bis eine gewünschte Unterdrückung von Krankheitssymptomen eintritt oder die gewünschte Verbesserung des Zustands des Patienten erreicht ist. Jedoch können auch andere Dosierungsvorschriften geeignet sein.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind nur zu Erläuterungszwecken aufgenommen und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.
BEISPIEL 1
Erstellung von Bibliotheken von TPO-Mimetikum-Sequenzen, eingebracht in ein Gerüst von humanem Antikörper
Ein Agonisten-TPO-Mimetikum-Peptid IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1) wurde in die schwere Kette von Anti-Tetanustoxoid (TT)-Fab CDR3 (HCDR3) eingebracht, wobei die gesamte HCDR3-Sequenz GDTIFGVTMGYYAMDV (SEQ ID NO: 4) ersetzt wurde. 2A zeigt die Sequenz des verwendeten humanen Tetanustoxoid-Antikörpers. Es wurden zwei Ansätze der Einfügung verwendet. In dem ersten Ansatz wurde das Agonistenpeptid in die HCDR3-Region mit zwei jede Seite flankierenden Glycinresten eingeführt. Dies wurde vorgenommen, um die strukturellen Einschränkungen an dem eingeführten Peptid zu reduzieren, so daß dieses einfacher die notwendige Konformation einnehmen konnte. In dem zweiten Ansatz wurden zwei Aminosäurepositionen an jeder Seite der Peptideinfügung randomisiert, damit die beste Präsentation des Peptides erreicht werden konnte (3). Diese zwei Ansätze wurden vorgenommen, um zu bestimmen, ob das Peptid alleine ausreichend war oder ob spezifische Reste für eine günstige Präsentation des Agonistenpeptides auf dem Antikörpergerüst erforderlich waren, um dabei dem Antikörper seine Aktivität zu verleihen.
4 erläutert das Verfahren der Konstruktion der Bibliothek. Kurz gefaßt wurde das Anti-Tetanustoxoid-Fab als zwei Fragmente vervielfältigt. Fragment A wurde unter Verwendung eines Vorwärts-Primers vervielfältigt (N-Omp:5'-TAT CGC GAT TGC AGT GGC ACT GGC-3') (SEQ ID NO: 5), der an die Omp A-Führungssequenz für die leichte Kette annealt, in Kombination mit einem Rückwärts-Primer (TPOCDR3-B:5'-GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT YNN YNN TCT OGC ACA ATA ATA TAT GGC-3') (SEQ ID NO: 6), der an das Ende der Gerüstregion 3 der schweren Kette (FR) annealte. Der Rückwärts-Primer enthielt einen Schwanz, der das neue CDR3 codierte. Fragment B wurde unter Verwendung eines Vorwärts-Primers erzeugt (TPOCDR3-F:5'-CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG NNY NNY TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT-3') (SEQ ID NO: 7), der an das FR4 annealte, und des Rückwärts-Primers Seq-G3Rev (5'-TCA AAA TCA CCG GAA CCA GAG C-3') (SEQ ID NO: 8), welcher in der Gen III-Region des Plasmides abstromig zu dem Stop-Signal der schweren Kette annealte. Der TPOCDR3-F-Primer hatte ebenfalls einen Schwanz von Basen, welche die neue CDR3-Region codierten. TAQ-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) wurde in dem folgenden PCR-Programm verwendet: 95 °C für 30 Sekunden, anschließend 30 Zyklen bei 94 °C für 15 Sekunden, 55 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden, gefolgt von einem Verlängerungszeitraum bei 72 °C für 10 Minuten und Halten bei 4 °C. Nachdem die Fragmente mit PCR erzeugt und mittels einem Gel gereinigt worden waren, wurden sie für eine Überlappungs-Verlängerungs-PCR vereinigt. Die neuen durch den CDR3-Primer codierten Regionen waren komplementär und lieferten eine Überlappung von 23 Basen. Die Primer N-Omp und SegG3Rev wurden in dem Überlappungs-PCR-Protokoll zur Erzeugung des vollständigen Fab-DNA-Produkts verwendet. Taq-DNA-Polyermase (Perkin Elmer) wurde in dem folgenden PCR-Programm verwendet: 94 °C für 30 Sekunden, dann 20 Zyklen bei 94 °C für 30 Sekunden, 56 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 3 Minuten und 15 Sekunden, dann ein Verlängerungszeitraum bei 72 °C für 15 Minuten, gefolgt von Halten bei 4 °C. Nach Gelaufreinigung des Fab-Produktes wurde ein Sfi 1-Verdau bei 50 °C für 5 Stunden durchgeführt. Inserts wurden über Nacht in mit Sfi 1 verdauten pRL4-Vektor ligiert. Die Ligationsprodukte wurden mit Ethanol präzipitiert, in H₂O resuspendiert und anschließend in kompetente ER2537-Bakterien (Suppressor-Stamm, New England Biolabs) durch Elektroporation eingebracht. Nach einer Stunde Schütteln in 5 ml SOC wurde ein gleiches Volumen SB hinzugefügt. Carbenicillin wurde mit 20 μg/ml hinzugefügt und die Kultur für eine Stunde bei 37 °C geschüttelt, gefolgt von einer Stunde bei 37 °C in 50 μg/ml Carbenicillin. Die Bibliothekskultur wurde in einen Kolben überführt, der 100 ml frisches SB, 50 μg/ml Carbenicillin und 10¹² VCS M13-Helferphagen enthielt. Nach 2 Stunden bei 37 °C wurde Kanamycin hinzugefügt, um hinsichtlich solcher Bakterien zu selektieren, die mit Helferphage infiziert waren. Am folgenden Tag wurden die Übernachtkulturen abzentrifugiert, und die Phagen in dem Überstand wurden auf Eis unter Verwendung von 4 % PEG/0,5 M NaCl präzipitiert. Nach Abzentrifugieren der Phagen wurde das Pellet in 1 % BSA/PBS resuspendiert, filtriert und gegen PBS dialysiert. Die Phagen der Bibliothek wurden bei 4 °C gelagert.
Die Konstruktion von Fab, die das nicht zufällig verknüpfte Peptid enthielten, wurde durchgeführt, wie es oben beschrieben ist, indem die Primer TPOCDR3-B und TPOCDR3-F durch alternative spezifische Primer ersetzt wurden. Für den mit der Einfügung PP-(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEQ ID NO: 25) versehenen Antikörper waren die verwendeten Primer TPOCDR3g-B (5'-GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NGG NGG TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC-3') (SEQ ID NO: 9) und TPOCDR3g-F (5'-CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT-3') (SEQ ID NO: 10). Für den mit GG-(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEQ ID NO: 29) versehenen Antikörper waren die verwendeten Primer TPO-CDR3-ggB (5'-GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NCC NCC TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC-3') (SEQ ID NO: 11) und TPOCDR3g-F (5'-CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT-3') (SEQ ID NO: 12).
Selektion der Bibliothek von CDR3 der schweren Kette von TPO-Mimetikum-Peptid
Um hinsichtlich einer optimalen Peptidpräsentation zu selektieren, wurde Schwenken an humanen Blutplättchen durchgeführt. Weil Blutplättchen etwa 1.800 TPO-Rezeptoren pro Zelle auf ihrer Oberfläche exprimieren (cMpl-Rezeptoren), repräsentierten sie ein gutes Zellziel. Darüber hinaus sind Blutplättchen von einer örtlichen Blutbank einfach erhältlich. Zu 1 ml der konzentrierten angegebenen menschlichen Blutplättchen von der Blutbank wurden 50 μl frisch hergestellte Fab-Phagen in einem konischen Röhrchen von 15 ml mit 0,1 % NaN₃ hinzugefügt. Das Röhrchen wurde bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden gemischt. Typischerweise wurden 10 ml 50 %-iges huma nes Serum (entnommen von den verbleibenden Blutplättchen) + 50 % {IMDM/10 % FBS/0,1 % Azid/2 mM EDTA} zu den Phagen/Zellen hinzugefügt. Die Blutplättchen wurden bei 5.500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde abgegossen, und das Pellet wurde unter ~ 500 μl der Waschlösung für 20 Minuten ruhen gelassen. Die Blutplättchen wurden sehr sanft resuspendiert, und anschließend wurden 10 ml aus 25% humanem Serum (entnommen von den verbleibenden Blutplättchen) + 75 % {IMDM/10 % FBS/0,1 % Azid/2 mM EDTA} zu den Phagen/Zellen hinzugefügt. Die Zentrifugation, das Ruhen des Pellets und die Resuspendierung der Blutplättchen wurden wiederholt. In den Schwenkrunden 3 und 4 wurde eine dritte Waschstufe durchgeführt. Die gewaschenen Phagen/Zellen wurden in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und bei 5.200 × g zentrifugiert. Die Phagen wurden von den Blutplättchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung von saurem Elutionspuffer (0,1 M HCl, 1 mg/ml BSA und Glycin bei einem pH-Wert von 2,2) eluiert. Die Blutplättchen wurden bei maximaler Geschwindigkeit pelletiert und die eluierten Phagen in ein konisches Röhrchen von 50 ml überführt und mit 2 M Tris-Base neutralisiert. Man ließ dann die Phagen frische ER2537-Bakterien für 15 Minuten bei Raumtemperatur infizieren und über Nacht vervielfältigen, wie es oben beschrieben ist. Es wurden 4 Runden des Blutplättchenschwenkens durchgeführt.
Nach der vierten Runde des Schwenkens wurden Pools von 3 Fab-Klonen, die als lösliche Proteine in dem Nicht-Suppressor-Bakterienstamm TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA) exprimiert wurden, durch FACS hinsichtlich Bindung an Blutplättchen durch Verwendung der Fab'-HA-Epitopmarkierung mit hochaffinem Anti-HA der Ratte, gefolgt von Anti-Ratte-FITC (Sigma, St. Louis, Missouri) getestet. 25 μl konzentrierte menschliche Blutplättchen (einmal mit PBS/5 mM EDTA/2 % FBS gewaschen) wurden mit 100 μl Bakterienüberstand (60 μl Bakterienüberstand von 3 gepoolten Fab-Klonen wurden mit 40 μl 5 % Milch/PSS bei 4 °C für 15 Minuten vorinkubiert) bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten inkubiert, 100 ml FACS-Puffer (PBS/2 % FBS/5 mM EDTA) wurde hinzugefügt und die Zellen bei 5.200 × g für 5 Minuten abzentrifugiert. Pelletierte Zellen wurden in 50 μl von 1:10 verdünntem (in PBS/1 % BSA/0,1 % NaN₃) resuspendiert. 2 % Anti-HA-Antikörper [Ratte-IgG-Anti-HA-Hochaffinitätsklon 3F10 (Roche Molecular Biochemicals)] wurde hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit 1 ml FACS-Puffer wie oben gewaschen. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in 100 μl 1:160 verdünntem (in PBS/1 % BSA/0,1 % NaN₃) 3 % Anit-Ratte-IgG-FITC-Antikörper (Sigma) verdünnt und 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert. Die Zellen wurde mit 1 ml FACS-Puffer gewaschen und anschließend in 200 μl FACS-Puffer für die Analyse resuspendiert. Als eine Positivkontrolle wurde ein kommerziell erhältlicher Schaf-Anti-IIb/IIIa-Ab, gefolgt von Anti-Schaf-FITC verwendet. Viele Pools von Fab waren klar positiv hinsichtlich Bindung an Blutplättchen mittels FACS. Eine nachfolgende FACS-Analyse wurde dann durchgeführt, um einzelne Klone zu identifizieren, welche die Blutplättchen banden.
Untersuchung von einzelnen Kandidaten anhand der Bindungsaktivität
Mehrere Fab als Bakterienüberstände wurden hinsichtlich Reaktivität mit dem ursprünglichen Antigen Tetanustoxoid getestet, um zu bestimmen, ob diese Bindungsspezifität beibehalten wurde.
Das Antikörpergerüst Anti-TT-Fab bindet an sein Antigen TT, aber nicht an BSA. Jedoch zeigten vier mit TPO-Mimetikum-Peptid versehene Fab-Klone keine signifikante Bindung an TT oder BSA. Wie man es in vorausgegangenen Experimenten gesehen hatte, war der Austausch von Anti-TT-Fab-HCDR3 ausreichend, um die Spezifität des Antikörpers zu verändern.
Um die Bindungsfähigkeiten von Fab weiter zu untersuchen, wurde eine FACS-Analyse an CMK-Zellen, einer Megakaryozytenzellinie (von der deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen), welche auch den cMpl-Rezeptor exprimiert, durchgeführt. Fab-Klone, die CMK-Zellen banden, wurden dann analysiert, um zu verifizieren, daß die Blutplättchen- und CMK-Zellbindung über den cMpl-Rezeptor stattfand. Für dieses Experiment wurden 293 EBNA-Zellen mit oder ohne cMpl-R transfiziert, welches aus Tf-1-Zellen mittels RT-PCR kloniert worden war. 1 × 10⁶ transfizierte Zellen wurden mit Bakterienüberstand von jedem Fab-Klon (vorblockiert, wie es oben beschrieben ist) für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden bei 2.000 U. p. M. für 5 Minuten abzentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden in 90 μl FACS-Puffer (PBS/2 % FBS/1 mM EDTA) resuspendiert und anschließend wurden 10 μl 2 % Anti-HA-Antikörper [Ratte-IgG-Anti-HA-Hochaffinitätsklon 3F10 (Boehringer Mannheim Biochemicals)] bis zu einer Endverdünnung von 1:10 hinzugefügt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit 1 ml FACS-Puffer gewaschen. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in 100 μl 1:50 verdünntem (in PBS/1 % BSA/0,1 NaN₃) 3 %-igem Anti-Ratte-IgG-PE-Antikörper (Research Diagnostics Incorporated, RDI) resuspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 ml FACS-Puffer gewaschen und anschließend in 200 μl FACS-Puffer für die Analyse resuspendiert. Während des Schwenkens selektierte Fab zeigten eine starke Bindung an Zellen, die mit dem cMpl-R transfiziert waren, aber nicht an mit Kontrollvektor transfizierte Zellen, denen das cMpl-R fehlte. Dies zeigt, daß Zelloberflächenbindung spezifisch durch den cMpl-Rezeptor stattfand. Anti-TT-Fab bindet nicht an mit Kontrollvektor oder mit cMpl-R transfizierte 293-Zellen. Jedoch zeigt der Fab-Klon X1c eine Verschiebung von 3 % der Bindung von mit Kontrolle (Nicht-cMpl-Rezeptor) transfizierten Zellen zu 95 % Bindung von Zellen, die den cMpl-R exprimieren.
Untersuchung von einzelnen Kandidaten anhand der Sequenz
Sequenzanalyse von Fab-Klonen, welche spezifisch an den cMpl-Rezeptor banden (siehe 5), offenbarte die Selektion von bevorzugten Aminosäuren an der abstromig gelegenen Verknüpfungsstelle. Die DNA-Sequenzdaten wurden analysiert, und die Aminosäure- und DNA-Sequenzen sind folgende:
Bei sämtlichen Klonen, die eine starke Bindung zeigten, wurde gefunden, daß sie ein Prolin unmittelbar abstromig zu dem 14 Aminosäuren langen TPO-Mimetikum-Peptid enthielten. Selektion durch Schwenken eines Prolins an der abstromig gelegenen Linker-Position repräsentiert eine Bestimmung einer überraschenden Aminosäureauswahl, welche dem eingefügten TPO-Mimetikum-Peptid verbesserte Bindungseigenschaften verleiht. Schwache Bindemoleküle enthielten dieses Prolin nicht, obwohl sie nach wie vor das TPO-Mimetikum-Peptid enthielten. Es sollte festgehalten werden, daß der Klon X7a eine stille Mutation in diesem Peptid enthielt (GCG zu GCA, wobei Ala an Position 11 in dem Peptid beibehalten wurde) und daß X2c eine Mutation in diesem Peptid hatte, die ein Thr in ein Ala an Position 11 des Peptides umänderte.
Biologische Tests
Klone wurden hinsichtlich Agonistenaktivität unter Verwendung eines auf Transkription beruhenden Tests, der die von dem c-Fos-Promotor gesteuerte Luciferaseaktivität mißt, getestet. Dimerisierung des cMpl-Rezeptors aktiviert Jak, welches den MAP-Kinase-Stoffwechselweg stimuliert. Somit kann eine Aktivierung durch Testen der Luciferaseproduktion und -aktivität, die durch MAP-Kinase über den cFos-Promotor stimuliert wird, gemessen werden. Da Dimerisierung des cMpl-Rezeptors für die Aktivierung erforderlich ist, könnten entweder vollständige IgG oder dimerisierte Fab-Fragmente, die zur Dimerisierung des Rezeptors in der Lage sind, zur Stimulierung von cMpl-Rezeptoraktivität verwendet werden. In Bakterien produzierte Fab wurden über die HA-Markierung, die den 12CA5-Anti-HA-Antikörper verwendet, dimerisiert. Steigende Mengen von 12CA5 wurden zum Dimerisieren der Fab-Klone zu den bakteriellen Fab hinzugefügt, damit diese wiederum dimensieren und den cMpl-Rezeptor aktivieren. Für die Messung von Agonistenaktivitäten wurden Fab enthaltende Bakterienüberstände (2 ml) im Gemisch mit 12CA5 auf NIH 3T3-Zellen angewendet, die mit entweder einem Kontrollvektor oder dem cMpl-Rezeptor und dem Fos-Promotor/Luciferase-Reporter-Konstrukt co-transfiziert waren. Co-Transfektionen von 3T3-Zellen wurden durch Ausplattieren von NIH 3T3-Zellen mit 3 × 10⁵ Zellen pro 6 cm-Schale und anschließendes Transfizieren am folgenden Tag durchgeführt. NIH 3T3-Zellen wurden unter Verwendung des Effectine Lipofection- Reagenz (Qiagen) transfiziert, wobei jede Platte mit 0,1 μg pEGFP (einem Tracer zur Messung der Transfektionseffizienz), 0,2 μg des Fos-Promotor/Luciferase-Konstruktes und 0,7 μg von entweder dem leeren Kontrollvektor oder dem den cMpl-Rezeptor exprimierenden Plasmid transfiziert wurde. 3T3-Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion in 0,5 % Serum gegeben und für weitere 24 Stunden in diesem Medium mit geringem Serumgehalt inkubiert, um die Hintergrundaktivierung des Fos-Promotors zu reduzieren. Antiköperüberstände wurden dann auf diese Zellen für 6 Stunden angewendet. Die Zellen wurden geerntet und Luciferase-Tests unter Verwendung von 50 μg Zellysat durchgeführt. Von den Antikörpern wurde in Abwesenheit von cMpl-Rezeptor-Expression keine Aktivierung stimuliert. Jedoch wurde Agonistenaktivität in 3T3-Zellen, die mit cMpl-Rezeptor co-transfiziert waren, beobachtet. Dies ermöglichte uns zu zeigen, daß die beobachtete Agonistenaktivität durch den cMpl-Rezeptor und dessen Wechselwirkung mit dem Antikörper erfolgte. Die Daten sind folgende:
Die Aktivierung von cMpl-Rezeptor kann in einer ähnlichen Art und Weise unter Verwendung von vollständigen IgG (umgewandelt aus Fab, wie hierin beschrieben) getestet werden, die durch transiente oder stabile Transfektion von Säugerzellen produziert wurden und nicht durch bakteriell produzierte Fab, die durch Anti-HA-12CA5 dimerisiert wurden. Experimentelle transiente Transfektion kann im wesentlichen wie es hier beschrieben ist durchgeführt werden. Für Transfektionen würde man 2 × 10⁶-Zellen (wie beispielsweise 293 EBNA) in 6 cm-Schalen für jede Testprobe aussähen. An dem folgenden Tag würde man jede Platte mit 2,5 μg Gesamt-DNA (2 μg insgesamt des/der Plasmides/Plasmide der leichten Kette und der schweren Kette, 0,25 μg pAdVAntage (Promega, Madison, Wisconsin) und 0,25 μg pEGFP) unter Verwendung des Effectine-Reagenz (Qiagen) transfizieren. Die 293-Zellen würden 24 Stunden nach der Transfektion in 0,5 % Serum gegeben und für weitere 24 Stunden in diesem Medium mit wenig Serum inkubiert werden, um vollständiges IgG zu erhalten. Restliche Wachstumsfaktoren in diesem Medium sind für die Stimulierung von Rezeptoren vernachlässigbar, wie man es in Kontrollexperimenten sieht. Nach 24 Stunden würden die Überstände gesammelt und für 5 Minuten bei 3.000 U. p. M. zentrifugiert werden, um alle restlichen Zellen zu entfernen. Für die Messung von Agonistenaktivitäten der vollständigen IgG würden 3 ml der konditionierten Überstände von 293-Zellen auf NIH 3T3-Zellen angewendet werden, wie es oben beschrieben ist.
BEISPIEL 2
Zusätzliche Bibliotheken, die TPO-Mimetikum-Sequenzen in ein humanes Antikörpergerüst eingebracht enthalten
Ein weiterer Ansatz zur Verbindung von 2 agonistischen Peptiden in einem Antikörpergerüst besteht dann, das Agonistenpeptid in mehr als einer Position innerhalb eines einzelnen Fab-Fragmentes einzusetzen. Um dies durchzuführen, wurden zusätzliche Bibliotheken konstruiert, die TPO-Mimetikum-Sequenzen in ein humanes Antikörpergerüst eingebracht enthalten. Nach der Selektion von Peptiden, die in dem Umfeld von CDR1, CDR2 oder CDR3 der leichten Kette oder CDR2 der schweren Kette in geeigneter Weise präsentiert wurden, wurden die Bindungssequenzen in einem einzelnen Fab-Molekül vereinigt, z. B. wie es in Tabelle 1 unten aufgeführt ist, und hinsichtlich verbesserter Aktivität analysiert.
TABELLE 1
Es wurden vier weitere Bibliotheken konstruiert, die separat die CDR2 der schweren Kette sowie die CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette durch das TPO-Mimetikum-Peptid, flankiert durch zwei zufällige Aminosäuren, ersetzten, wobei eine NNK-Dotierungsstrategie angewendet wurde. Die Erzeugung der Bibliotheken erfolgte in ähnlicher Weise, wie es für die CDR3-TPO-Peptidbibliothek beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß nur die Kette (schwer oder leicht), die zur Bildung einer Bibliothek modifiziert wurde, durch PCR vervielfältigt und als das Insert verwendet wurde. PCR wurde unter Verwendung des Expand High Fidelity PCR-Systems (Roche) durchgeführt, welches ein Gemisch aus Taq- und Pwo-Polymerasen enthält. Die erste Runde der PCR wur de unter Anwendung des folgenden Programms durchgeführt: 94 °C für 30 Sekunden, dann 30 Zyklen bei 94 °C für 15 Sekunden, 56 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 2 Minuten, gefolgt von einer Verlängerung für 10 Minuten bei 72 °C und Halten bei 4 °C. Überlappungs-PCR wurde für 10 Zyklen ohne Primer unter Anwendung des oben angegebenen Programms durchgeführt, um zu ermöglichen, daß die vollständige DNA-Matrize von den Polymerasen erzeugt wird. Primer wurden anschließend zu den PCR-Reaktionsröhrchen für 20 Zyklen des gleichen Programms für die Vervielfältigung hinzugefügt.
Für die HCDR2-Bibliothek wurde das Fragment A unter Verwendung des Vorwärts-Primers Lead VH (5'-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC-3') (SEQ ID NO: 13), welcher an das pel B-Führungssignal annealte, das vor der schweren Kette angeordnet war, und des Rückwärts-Primers HR2 CMPL ANTI (5'-AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN TCC CAT CCA CTC AAG CCC TTG-3') (SEQ ID NO: 51), der an dem Ende des FR2 der schweren Kette annealte, erzeugt. Der Rückwärts-Primer enthielt einen Schwanz, der die neue CDR2 codierte. Fragment B wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primers HR2 cMpl CODE (5'-CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK AGA GTC ACC ATT ACC GCG GAC-3') (SEQ ID NO: 14), welcher an FR3 der schweren Kette annealte, und des Rückwärts-Primers N-dp (5'-AGC GTA GTC CGG AAC GTC GTA CGG-3') (SEQ ID NO: 15), welcher in der Region der HA-Epitop-Markierung des Plamides abstromig zu der konstanten Region der schweren Kette annealte, erzeugt. Der HR2 cMpl CODE-Primer hatte auch einen Schwanz von Basen, der die neue CDR2-Region codierte. Nachdem die Fragmente durch PCR erzeugt und mittels eines Gels gereinigt waren, wurden sie für eine Überlappungsverlängerungs-PCR vereinigt. Die von dem neuen CDR2-Primer codierten Regionen waren komplementär und lieferten eine Überlappung von 24 Basen. Die Primer Lead VH und N-dp wurden in dem Überlappungs-PCR-Protokoll zur Erzeugung des vollständigen DNA-Produkts der schweren Kette verwendet. Nach Gelaufreinigung des Produkts der schweren Kette wurde ein Xho I/Spe I-Verdau bei 37 °C für 3 Stunden durchgeführt. Die Inserts wurden mittels eines Gels gereinigt und anschließend in mit Xho I/Spe I verdautem pRL4-Vektor, der die leichte Kette von Anti-TT enthielt, ligiert. Die Ligationsprodukte wurden präzipitiert und für die Erzeugung der Fab-Phagenbibliothek durch Elektroporation in ER2537-Bakterien eingebracht, wie es oben beschrieben ist.
Die Bibliothek der leichten Kette von CDR3 wurde auf ähnliche Weise hergestellt unter Verwendung von Primern für das Fragment A aus dem Vorwärts-Primer N-omp und dem Rückwärts-Primer LR3 cMpl ANTI (5'-AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ACA GTA GTA CAC TGC AAA ATC-3') (SEQ ID NO: 16) und für Fragment B aus dem Vorwärts-Primer LR3 cMpl CODE (5'-CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG-3') (SEQ ID NO: 17) und dem Rückwärts-Primer leadB (5'-GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC-3') (SEQ ID NO: 18). Der Primer leadB annealte an die pelB-Führungssequenz, die vor der VH angeordnet ist. Die Rückwärts-Primer LR3 cMpl ANTI und Vorwärts-Primer LR3 cMpl CODE annealten an FR3 bzw. FR4 der leichten Kette von Anti-TT. Beide LR3 cMpl-Primer enthalten den die neue CDR3-Peptidbibliothek codierenden Schwanz von Nukleo tiden, welche die Überlappungsregion von 24 Basenpaaren für die Fusions-PCR von Fragment A und Fragment B liefern. Nach Reinigung der PCR-Produkte der leichten Kette wurde ein Sac I/Xba I-Verdau bei 37 °C für 3 Stunden durchgeführt. Die Fragmente der leichten Kette wurden dann in mit Sac I/Xba I verdauten pRL4, der die schwere Kette von Anti-TT enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Die Ligationsprodukte wurden präzipitiert und für die Erzeugung der Fab-Phagenbibliothek durch Elektroporation in ER2537-Bakterien eingebracht, wie es oben beschrieben ist.
Die Erstellung der Bibliothek der leichten Kette von CDR2 wurde durchgeführt, wie es oben für die Bibliothek der leichten Kette von CDR3 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die spezifischen Primer LR2 cMpl ANTI (5'-AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC-3') (SEQ ID NO: 19), welcher am Ende von FR2 der leichten Kette annealte, und der Primer LR2 cMpl CODE (5'-CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT-3') (SEQ ID NO: 20), welcher am Anfang von FR3 der leichten Kette annealte, anstelle der LR3 cMpl-Primer verwendet wurden.
Die Erstellung der Bibliothek der leichten Kette von CDR1 wurde ebenfalls durchgeführt, wie es zuvor für die Bibliothek der leichten Kette von CDR3 beschrieben wurde mit der Ausnahme, daß die spezifischen Primer TPOLR1CODE (5'-CCAACCCTGCGCCAGTGGCTGGCTGCTCGCGCTNNKNNKTGGTACCAGCAGAAACCTGGC-3') (SEQ ID NO: 58), welcher am Anfang von FR2 der leichten Kette annealte, und der Primer TPOLR1ANTI (5'-AGCCAGCCACTGGCGCAGGGTTGGCCTTCGATMNNMNNGCAGGAGAGGGTGGCTCTTTC-3') (SEQ ID NO: 59), welcher am Ende von FR1 der leichten Kette annealte, anstelle der LR3 cMpl-Primer verwendet wurden.
Die drei zusätzlichen Bibliotheken, welche separat die CDR2 der schweren Kette und die CDR2 und CDR3 der leichten Kette unter Anwendung der NNK-Dotierungsstrategie das von zwei zufälligen Aminosäuren flankierte TPO-Mimetikum-Peptid ersetzen, wurden separat mit Blutplättchen geschwenkt, wie es zuvor in Beispiel 1 für die Bibliothek, bei der CDR3 der schweren Kette ersetzt war, beschrieben wurde. Es wurden vier Runden des Schwenkens durchgeführt, und Klone wurden mittels FACS auf Blutplättchen und mit cMpl-Rezeptor transfizierten 293-Zellen durchmustert, wie zuvor beschrieben. Zwei positive Klone wurden von diesen Durchmusterungen erhalten. Diese Klone hatten das TPO-Mimetikum-Peptid in der CDR2 der schweren Kette. Anders als bei den CDR3-Klonen der schweren Kette hatte keiner der CDR2-Klone der schweren Kette ein Prolin an der abstromig gelegenen Position. Statt dessen wurde für beide gefunden, daß sie ein Tyrosin an der stromaufwärts gelegenen Position enthalten (siehe Figur 9-Klone HC-CDR2 Nr. 24 und Nr. 39).
Die Bibliotheken, einschließlich LCDR1, wurden separat einem weiteren Schwenkexperiment unter Verwendung von mit cMpl-Rezeptor transfizierten 293-Zellen anstelle von Blutplättchen während des Schwenkens unterzogen. Es wurde beobachtet, daß die 293-Zellen reproduzierbar mit einer hohen Effizienz transfiziert wurden und sehr hohe Mengen des funktionalen cMpl-Rezeptors auf ihrer Oberfläche exprimierten. Somit repräsentierten diese Zellen ein gutes Zellziel für die Ver wendung beim Schwenken. Für diese Experimente wurden verschiedene Gruppen von Platten mit 293-Zellen separat und nacheinander in vier Tagen in Folge transfiziert. Jede Gruppe von Platten wurde dann nacheinander für die vier separaten Runden des Schwenkens verwendet. Jede Runde des Erntens der Zellen und des Schwenkens fand zwei Tage nach der Transfektion statt. Für das Ernten wurden die Zellen unter Verwendung von Zellablösepuffer von den Platten entfernt, bei 1.500 U. p. M. für 5 Minuten abzentrifugiert und in IMDM, versetzt mit 10 % FCS, 0,1 % Natriumazid und 5 mM EDTA bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro ml (3 × 10⁶ für LC-CDR1), resuspendiert. In der ersten Runde des Schwenkens wurden 3 × 10¹¹ Phagen von jeder Bibliothek separat auf 2 ml Zellen (6 × 10⁶ für LD-CDR1 und 2 × 10⁶ für alle anderen) angewendet und in einem konischen Röhrchen von 15 ml für 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Die Zellen wurden zweimal unter Verwendung von 10 ml des Puffers mit IMDM/10 % FCS/0,1 % Natriumazid/5 mM EDTA gewaschen. Phagen wurden mit Säure eluiert und vervielfältigt, wie es zuvor in Beispiel 1 beschrieben wurde. In Runde 2 wurden 4 × 10⁶ Zellen (6 × 10⁶ für LC-CDR1) in 2 ml Puffer verwendet, und 3 × 10⁶ Phagen von den eluierten Phagen der vervielfältigten Runde 1 wurden mit 3 × 10¹¹ Phagen von der nicht geschwenkten Bibliothek vereinigt und zu den Zellen hinzugefügt. Waschen, Elution und Vervielfältigung erfolgten in gleicher Weise wie bei Runde 1. In Runde 3 wurden 4 × 10⁶ Zellen (6 × 10⁶ für LC-CDR1) in 2 ml Puffer verwendet und es wurden 3 × 10¹¹ Phagen von den vervielfältigten eluierten Phagen der Runde 2 verwendet. Die Zellen wurden vor der Elution dreimal gewaschen. In Runde 4 wurden 4 × 10⁶ Zellen (6 × 10⁶ für LC-CDR1) erneut in 2 ml Puffer verwendet, und es wurden 3 × 10¹¹ Phagen von den eluierten und vervielfältigten Phagen aus Runde 3 verwendet. Die Zellen wurden vor der Elution wiederum dreimal gewaschen. Es wurden wenigstens dreißig einzelne Klone mittels FACS auf mit cMpl-Rezeptor transfizierten 293-Zellen durchmustert, wie es zuvor beschrieben wurde. 12 positive Klone wurden von der Bibliothek der CDR2 der schweren Kette erhalten, und 25 positive Klone wurden von der Bibliothek der CDR2 der leichten Kette erhalten, und 14 positive Klone wurden von der Bibliothek der CDR1 der leichten Kette erhalten. Die Klone wurden weiterhin hinsichtlich der DNA-Sequenz analysiert. Die selektierten flankierenden Aminosäurereste der positiven Klone sind in der anhängenden 9 gezeigt. Es ist von Interesse festzuhalten, daß die mit CDR2 der leichten Kette versehenden Fab eine starke Selektion hinsichtlich eines Prolins (Pro) aufstromig zu dem TPO-Mimetikum-Peptid aufweisen.
BEISPIEL 3
Es wurden Kombinationen der mit TPO-Mimetikum-Peptid versehenen Fab-Klone aus 9 erzeugt. Somit könnte ein einzelner Antikörper mehrere Kopien des TPO-Mimetikum-Peptides innerhalb einer einzelnen leichten oder schweren Kette enthalten. Alternativ könnten sowohl die leichte als auch die schwere Kette Peptideinfügungen enthalten, die mehrere Kopien innerhalb eines einzelnen Fab liefern. Positive Klone, die von der gleichen CDR-Bibliothek selektiert wurden, wurden vereinigt. Durch Vereinigen des Pools von einer das TPO-Mimetikum-Peptid enthaltenden CDR mit dem Pool einer weiteren wurden neue Bibliotheken konstruiert. Kombinationen, bei denen sich eines der TPO-Mimetikum-Peptide in der leichten Kette und das andere in der schweren Kette befindet, werden unter Anwendung einfacher Klonierungstechniken unter Verwendung der gepoolten Plasmid-DNAs und der einzigartigen Restriktionsschnittstellen, welche die schwere (Xho I-Spe I) und die leichte (Sac I-Xba I) Kette flankieren. Z. B. wurde die Plasmid-DNA für die mit H-CDR3-Peptid versehenen schweren Ketten vereinigt und mit Xho I und Spe I verdaut. Die gereinigten Inserts der schweren Kette wurden in das mit Xho I/Spe I verdaute Plasmid, das die L-CDR2-Einfügungen enthielt, ligiert. Die resultierende Bibliothek enthielt schwere Ketten mit CDR3-Peptideinfügungen und leichte Ketten mit CDR2-Peptideinfügungen. Es sollte klar sein, daß für die Paarbildung von zwei Peptiden, die CDRs enthalten, anstelle von der Verwendung von Pools von Klonen auch individuelle Klone kombiniert werden könnten. Z. B. wurde ein einzelner Klon der schweren Kette mit einer CDR3-Peptideinfügung mit mehreren individuellen CDR1-Klonen der leichten Kette unter Erzeugung von Fab mit mehreren Kopien von TPO-Mimetikum-Peptiden gepaart.
Kombinationen, bei denen zwei TPO-Mimetikum-Peptide innerhalb einer vorgegebenen schweren Kette vereinigt wurden, wurden unter Verwendung von Überlappungs-PCR zur Erzeugung des Fragmentes für die Klonierung durchgeführt. Es wurden zwei überlappende Primer verwendet, die zwischen CDR2 und CDR3 binden, und flankierende Primer, wie beispielsweise die Primer „N omp" und „lead B" von der leichten Kette und die Primer „Lead VH" und „Ndp" für die schwere Kette. Z. B. wurde zum Kombinieren von H-CDR2 und H-CDR3 die erste PCR unter Verwendung von Lead VH (einem Primer, der in dem Vektor an dem pelB-Führungssignal der schweren Kette annealt) und eines Rückwärts-Primers, der bei FR3 annealt, unter Verwendung der gepoolten H-CDR2-Plasmid-DNA als die Matrize durchgeführt. Die Sequenz von diesem Primer war 5'-CCA TGT AGG CTG TGC CCG TGG ATT-3' (SEQ ID NO: 63). In einer separaten Reaktion wurden die gepoolten Plasmide, welche die H-CDR3-Einfügungen enthielten, PCR unterzogen mit einem Vorwärts-Primer, der in FR3 annealt, (welcher zu dem oben genannten FR3-Rückwärts-Primer komplementär ist) und einem N-dp (welcher in dem Vektor an einer Epitopmarkierungssequenz annealt). Die Sequenz von diesem Primer war 5'- CCA CGG GCA CAG CCT ACA TGG AGC-3' (SEQ ID NO: 64). Die ersten PCR-Produkte wurden gereinigt und anschließend in einer Überlappungs-PCR-Reaktion vereinigt, wo eine Fusion der zwei Fragmente durch die komplementären FR2-Sequenzen stattfand. Das vollständige Produkt der schweren Kette wurde durch Xho I/Spe I in einen Plasmid kloniert, das die leichte Kette von Anti-Tetanustoxoid enthielt. Insgesamt wurden fünf Klassen von Fab, die mehrere Kopien von TPO-Mimetikum-Peptiden enthielten, erzeugt, wie es in Tabelle 2 unten ausführlich angegeben ist.
TABELLE 2
20 Klone von jeder Kombinationsbibliothek und vier einzelne Klone von N-CDR3 plus L-CDR1 wurden hinsichtlich biologischer Aktivität in einem Luciferase-Reporter-Test, wie zuvor beschrieben, getestet; siehe 10 und 11. In beiden Experimenten können die Negativkontrollen nicht-induzierte Zellen, Zellen, die mit einem irrelevanten Fab behandelt sind (Anti-Tetanustoxoid), Zellen, die mit einem Fab-Klon behandelt wurden, der den cMpl-Rezeptor nur schwach bindet, und X4b- und/oder X1c-Fab, die den cMpl-Rezeptor binden, aber nur eine einzelne Bindungsdomäne haben und somit den Rezeptor nicht aktivieren können, umfassen. Die Positivkontrolle war die Zugabe von TPO. Alle übrigen Proben stammten von den neu hergestellten Kombinationsbibliotheken. Wie man beobachten kann, hatten mehrere Klone signifikante Aktivität als Fab. Dies zeigt, daß die Aufnahme mehrerer TPO-Mimetikum-Peptide in ein einzelnes Fab-Molekül in der Lage ist, zwei Rezeptoren zu binden und Rezeptoraktivierung zu bewirken.
Tatsächlich kann bei Verwendung von Fab 59 die erhaltene Agonistenaktivität so hoch sein wie native TPO-Aktivität. Klon 59, der zwei TPO-Mimetikum-Peptide (HC CDR3, Probe x4c, und LC CDR2, Probe 19, wie in 9 identifiziert) und eine His6-Markierung enthält, wurde teilweise aus einer bakteriellen Periplasmapräparation durch FPLC unter Verwendung von Nickel-Säulenchromatographie gereinigt. Die Aktivität dieses Fab wurde gemessen, und es wurde herausgefunden, daß sie etwa zu derjenigen von TPO äquivalent war (siehe 12), was durch cMpl-R-spezifische Induktion von Luciferaseaktivität in direktem Vergleich mit bekannten Konzentrationen von TPO bestimmt wurde. Ein quantitativer Western-Blot wurde durchgeführt, um die Fab 59-Antikörperkonzentrationen zu bestimmen.
Diese Fab oder verschiedene andere Kombinationen aus zwei CDR könnten als ein therapeutisches Produkt verwendet werden. Alternativ könnten diese Klone in Gerüstkeimbahnsequenzen (entweder mit oder ohne Kodonoptimierung) für eine Verwendung als ein therapeutisches Mittel, solange Aktivität beibehalten wird, umgewandelt werden.
BEISPIEL 4
Die TPO-Mimetikum-Peptideinfügung in den Fab-Klon X4b wurde in die CDR3 der schweren Kette eines weiteren Antikörpergerüsts, 5G1.1, transplantiert. Der Aufbau von 5G1.1 ist in der US-Anmeldung Seriennr. 08/487,283 beschrieben, welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Die Sequenz wurde in solch einer Weise in 5G1.1 kloniert, daß die native CDR3 durch 5'-ttg cca ATT GAA GGG CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG cct gtt-3) (SEQ ID NO: 65) ersetzt wurde. Die in Aminosäuren translatierte Peptideinfügung ist Leu Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Pro Val (SEQ ID NO: 66). Das 5G1 + Peptid wurde als ganzer IgG-Antikörper produziert (siehe 13A und 13B).
Gereinigter 5G1.1 + –Peptid-Antikörper sowie der Vorgänger 5G1.1 wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an den cMpl-Rezeptor zu binden, durch FACS-Analyse analysiert. Die Bindung von Rezeptor-exprimierenden und nicht-Rezeptor-exprmierenden 293-Zellen wurde verglichen; siehe 14. Die FACS-Färbung wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es hierin zuvor beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß die Detektion unter Verwendung von mit PE konjugiertem F(ab')2-Fragment von Ziege-Anti-Mensch-IgG (H + L) durchgeführt wurde. Die Negativkontrollen von 3 % nur irrelevantem Anti-Tetanustoxoid-Fab und Fab X1a, welches schwach an cMpl-Rezeptor bindet, zeigten alle sehr geringe Färbung. Jedoch zeigten die bindenden Fab X1c und X4b starke Färbung wie auch das 5G1.1 + –Peptid. Keiner dieser Klone zeigte eine Bindung an Zellen, die keinen Rezeptor exprimierten, was darauf hindeutet, daß die Zellfärbung durch spezifische Erkennung des cMpl-Rezeptors auftritt. Der Vorläufer 5G1.1 ohne das TPO-Mimetikum-Peptid zeigte keine Färbung bei irgendeiner der getesteten Zellen.
Die Fähigkeit des 5G1.1 + –Peptid-Gesamt-IgG, den cMpl-Rezeptor unter Verwendung des Luciferase-Reportertests zu aktivieren, wurde bestimmt (siehe 15). Die Ergebnisse hierin zeigen, daß die Konfiguration eines gesamten IgG sterische Beschränkungen bezüglich dessen Fähigkeit, die zwei cMpl-Rezeptoren für eine Aktivierung produktiv zusammenzubringen, verursacht. Die Aktivität des 5G1.1-Gesamt-IgG-Konstruktes, welches das TPO-Mimetikum-Peptid in den CDR3-Positionen der schweren Kette enthält, war nur schwach aktivierend und erforderte etwa 100- bis 200-fach höhere molare Konzentrationen im Vergleich zu TPO, um eine äquivalente Aktivität zu stimulieren. Wie es zuvor bei den Bindungsexperimenten beobachtet wurde, wurde eine Aktivierung durch 5G1.1, welches das Peptid enthielt, nur dann beobachtet, wenn cMpl-R auf der Zelloberfläche exprimiert wurde.
Es wurde keine rezeptorspezifische Bindung oder Aktivität mit dem Vorläufer 5G1.1, der das Peptid nicht enthielt, beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, daß Bindung und Aktivität des TPO-Mimetikum-Peptides und flankierender Sequenzen von ausgewählten Aminosäuren nicht beschränkt ist auf oder spezifisch ist für das Tetanustoxoid-Antikörpergerüst, sondern auf andere Antikörpergerüste angewendet werden kann. Somit sind die flankierenden Aminosäuresequenzen, die während des Schwenkes selektiert wurden, für die Präsentation des TPO-Mimetikum-Peptides innerhalb einer vorgegebenen CDR-Position spezifisch, aber nicht für Aminosäuresequenzen des Antikörpergerüstes.
BEISPIEL 6
Eine Bibliothek wurde erzeugt durch das Einfügen eines TPO-Mimetikum-Peptides und zuvor selektierter flankierender Aminosäuren (NP-IEGPTLRQWLAARA-RG) (SEQ ID NO: 61) in eine Sammlung von humanen Kappa-Genfragmenten, in diesem Falle der CDR der leichten Kette. Be stände humaner leichter Kappa-Ketten von mehreren Spendern von humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL) wurden zuvor erzeugt und in pBluescript II SK+ kloniert. Diese Konstrukte dienten als Quelle für Antikörper-Genfragmente.
Antikörper-Genbanken
Gesamt-RNA von humanen PBL wurden unter Verwendung von TRI-Reagenz (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) isoliert, gefolgt von mRNA-Reinigung mit Oligotex mRNA-Reinigungssystem (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anleitungen in dem Kit. Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung des SuperScript RTase 11-cDNA-Synthesekit (Life Technologies, Rockville, Maryland) mit einem modifizierten Oligo-dT-Primer hergestellt. Die Sequenz des Primers war 5'-TAGGATGCGGCCGCACAGGTC(T₂₀)-3' (SEQ ID NO: 62). Die Proben wurden über eine PCR-Reinigungskit-Zentrifugationssäule (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anleitungen in dem Kit aufgereinigt. Produkte der leichten Kette wurden unter Verwendung des Rückwärts-Primers „Not I" und von Vorwärts-Primern, welche an der Gerüst 1(FR1)-Position von Kappa-Ketten der Erststrang-cDNA annealten, vervielfältigt. Der „Not I"-Primer hatte eine Sequenz, die zu dem 5'-Ende des modifizierten Oligo-dT-Primers identisch war (5'-TAGGATGCGGCCGCACAGGTC-3') (SEQ ID NO: 72). Der Satz von verwendeten Kappa-FR1-Primern war folgender:
Eine typische Vervielfältigungsreaktion enthielt 2 μl cDNA-Reaktion, dNTPs, Rückwärts-Primer „Not I", einen der XVB-Vorwärts-Primer, Opti-prime-Puffer #5 (Stratagene, La Jolla, CA) und Expand High Fidelity-Polymerasegemisch (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Die Proben wurden auf 94 °C für 2 Minuten erhitzt, anschließend durch 10 Zyklen bei 94 °C für 15 Sekunden, 56 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 1 Minute gebracht, gefolgt von 20 Zyklen bei 94 °C für 15 Sekunden, 56 °C für 30 Sekunden und 72 °C für (1 Minute + 5 Sekunden/Zyklus). Den Zyklen folgte eine verlängerte Inkubation bei 72 °C (7 Minuten) vor dem Halten bei 4 °C. Die Produkte wurden mit Ethanol präzipitiert und anschließend über ein Gel gereinigt. Fragmente von etwa 850 bp wurden isoliert und anschließend mit Xba I und Sac I verdaut. Die resultierenden Kappa-Produkte wurden in pBluescript II SK+, der in gleicher Weise mit Xba I und Sac I verdaut war, ligiert. Die Ligationsprodukte wurden durch Elektroporation in Top10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA) eingebracht und über Nacht gezüchtet. Das Bakterienpellet wurde zur Isolierung der Kappa-Bibliotheks-DNA mit dem MAXIprep-DNA-Isolierungskit von Qiagen verwendet.
Erstellung einer Gerüstbibliothek mit TPO-Mimetikum-Pegtid
Für den Aufbau der TPO-leichte-Kette-Gerüstbibliothek wurden gleiche Mengen von 4 verschiedenen Bibliotheken der leichten Kappa-Kette von vier verschiedenen Patienten als die Ausgangsmatrize für die PCR-Reaktionen verwendet (25 ng insgesamt pro Reaktion). Das TPO-Mimetikum-Peptid und selektierte flankierende Aminosäuren wurden in die leichten Ketten durch Überlappungs-PCR aufgenommen. In der ersten Runde der PCR wurde ein Satz von Rückwärts-Primern (VK ANTI-Primer), welche an die leichte Kappa-Kette FR2 banden, separat mit dem Vorwärts-Primer T7 seq-F (5'-ATTAATACGACTCACTATAGGG-3') (SEQ ID NO: 86) kombiniert, um das N-terminale Stück der leichten Kette mit einem Teil des TPO-Mimetikum-Peptides innerhalb der LC CDR2-Position zu synthetisieren. Ein zweiter Satz von Vorwärts-Primern (VK CODE-Primer), welche an FR3 banden, wurde separat mit dem T3-Rückwärts-Primer (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') (SEQ ID NO: 87) kombiniert, um den Rest des TPO-Mimetikum-Peptides innerhalb der LC CDR2-Position und die C-terminale Hälfte der leichten Kette durch PCR zu synthetisieren. Für jedes Paar von Primerkombinationen wurden separate Reaktionen zweifach durchgeführt.
Fragmente aus den ersten Runden der PCR wurden über ein Gel gereinigt. Diese gereinigten Fragmente wurden dann in einer hinsichtlich Antikörperfamilien spezifischen Weise in Überlappungs-PCR-Reaktionen zur Erzeugung der vollständigen leichten Kette vereinigt. Reaktionen für jede Familie wurden 3-fach durchgeführt unter Verwendung von 40 ng von sowohl dem N-terminalen als auch dem C-terminalen Stück der leichten Kette in jeder Reaktion. Die Reaktionen wurden vor der Zugabe der T3- und T7 Seq-F-Primer durch 10 Zyklen laufen gelassen, gefolgt von weiteren 25 Zyklen nach Primerzugabe. Die LC-Fusions-PCR-Produkte der vollen Länge wurden über Gel gereinigt, mit Sac I und Xba I verdaut und anschließend über ein Gel gereinigt. Die Inserts der leichte Kette wurden dann in einen geeigneten Phagen-Display-Vektor, der auf gleiche Weise mit Xba I und Sac I verdaut und über ein Gel gereinigt war, ligiert. Der verwendete pRL5-Kappa-Vektor hatte Restriktionsschnittstellen, die mit den LC-Fragmenten kompatibel waren und enthielt die restliche konstante Kappa-Region von der nativen Sac I-Stelle bis zu dem C-terminalen Cys. Darüber hinaus wurde die schwere Kette von Anti-Tetanustoxoid für die Fab-Produktion über Xho I und Spe I in den Vektor eingefügt.
Das Ligationsgemisch wurde durch Elektroporation in XL-1-Blue-Bakterien (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert und vervielfältigt. Die Bibliothek wurde für 4 Runden auf 293-EBNA-Zellen, die in einer zu der zuvor beschriebenen ähnlichen Art und Weise mit dem cMpl-R transfiziert waren, geschwenkt. Während des Schwenkens erhaltene Klone wurden hinsichtlich Bindung durch FACS-Analyse auf 293-EBNA-Zellen, die wie zuvor beschrieben mit oder ohne cMpl-R transfiziert waren, durchmustert. Es wurde eine Anzahl von Klonen erhalten, die cMpl-R spezifisch banden. DNA-Fingerprint der resultierenden leichten Ketten durch Verdau mit Bst N1 zeigte, daß die Klone in fünf verschiedene Gruppen aufgeteilt werden konnten. Partielle Sequenzierung von acht dieser Klone zeigte, daß während des Schwenkens wenigstens zwei verschiedene Familien von leichten Kappa-Ketten selektiert worden waren (VK1 und VK3). In einem anfänglichen Test wurden 3 der Gerüstklone der leichten Ketten mit der schweren Kette von X4b unter Erzeugung eines Fab mit zwei TPO-Mimetikum-Peptiden vereinigt. Diese Klone induzierten eine Aktivierung des cMpl-R in Luciferasetests, wie es zuvor beschrieben wurde. Die Höhe der Aktivierung unter Verwendung von Bakterienüberständen von einem solchen Klon 429/X4b (siehe 16) war etwa 10- bis 20-fach geringer als diejenige, die mit TPO beobachtet wurde, was durch Vergleich der Aktivität mit bekannten Konzentrationen von TPO und unter Anwendung von quantitativen Western-Blots zur Bestimmung der Konzentration des Antikörpers in dem Überstand bewertet wurde. Es können zusätzliche Klone in ähnlicher Art und Weise durchmustert werden, um Klone mit größerer Aktivität zu identifizieren.
Diese Fab oder verschiedene andere LC-, HC- oder Intra-Ketten-CDR-Kombinationen könnten als ein therapeutisches Produkt verwendet werden. Alternativ könnten diese Klone in Gerüstkeimbahnensequenzen (entweder mit oder ohne Kodonoptimierung) für eine Verwendung als ein therapeutisches Mittel, solange wie Aktivität beibehalten wird, umgewandelt werden.
Modifizierung der Phagen-Display-Vektoren pAX131 und pRL5
Die Not I-Schnittstelle in pAX131 wurde durch Verdau des Vektors mit Not I, Verwenden von Klenow-Polymerase zum Auffüllen der Not I-Überhänge und anschließendes erneutes Ligieren des Vektors entfernt; siehe 17. Eine weitere Modifikation wurde durch Verdau von pAX131 mit EcoR I und Xba I durchgeführt. Ein Insert, das die durch Verdau entfernten Elemente ersetzte, wur de unter Verwendung überlappender Oligonukleotide mit den folgenden Veränderungen erzeugt: Umwandlung der Sac I-Schnittstelle in eine neue Xba I-Schnittstelle (einfache Unterstreichung in den Primersequenzen unten), Umwandlung der ursprünglichen Xba I-Schnittstelle in eins Not I-Schnittstelle (doppelte Unterstreichung in den Primersequenzen unten) und Abschließen des Inserts mit einem Spe I-Überhang, der mit dem durch Xba I-Verdau erzeugten Überhang des Vektors kompatibel ist. Ligation des EcoR I/Spe I-Inserts in den mit EcoR I/Xba I geschnittenen Vektor führte zu einem Spe I/Xba I-Hybrid, welches nicht mehr mit Spe I oder Xba I an dieser Stelle geschnitten wird. Die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide waren folgende: „EcoSpe" 5'-AA TTC AAG GAG TTA ATT ATG AAA AAA ACC GCG ATT GCG ATT GCG GTG GCG CTG GCG GGC TTT GCG ACC GTG GCC CAG GCG GCC TCT AGA ATC TGC GGC CGC a-3' (SEQ ID NO: 107) und „SpeE-co" 5'-ct agt GCG GCC GCA GAT TCT AGA GGC CGC CTG GGC CAC GGT CGC AAA GCC CGC CAG CGC CAC CGC AAT CGC AAT CGC GGT TTT TTT CAT AAT TAA CTC CTT G-3' (SEQ ID NO: 108).
Der als Zwischenprodukt erzeugte Vektor war pAX131Xba/Not. Die humane konstante Kappa-Region wurde zwischen die Xba I- und Not I-Schnittstellen unter Erzeugung von pAX131-Kappa eingefügt (siehe 18). Die humane konstante Kappa-Region wurde mittels PCR von humaner cDNA vervielfältigt, wobei Primer verwendet wurden, welche die aufstromig gelegene Xba-I-Schnittstelle und in der abstromig gelegenen Position ein TAA-Stopkodon, gefolgt von einer Not I-Schnittstelle, einführten. Die verwendeten Primer waren CKXba I (5'-GGA GTC TAG ATA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC-3') (SEQ ID NO: 109) und CKNot I (5'-AGG AGC GGC CGC TTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3') (SEQ ID NO: 110).
Die Klonierungsmodifikationen der leichten Kette, die in pAX131-Kappa aufgenommen waren, wurden in den pRL5-Vektor (der so modifiziert war, daß seine Not-I-Schnittstelle entfernt war, wie es oben beschrieben ist) eingeführt, indem das EcoR I bis Xho I-Fragment bewegt wurde; siehe 19 und 20. Dieser Vektor wurde als pRL5-Kappa bezeichnet (siehe 21A bis I).
BEISPIEL 7
(core-H-CDR2-Bibliothek)
Es wurde eine weitere HC-CDR2-Bibliothek erstellt, bei der eine Kernsequenz des TPO-Mimetikum-Peptids (GPTLRQWL) (SEQ ID NO: 112), die auf jeder Seite von einer einzelnen zufälligen Aminosäure flankiert war, in die schwere Kette eingefügt wurde und teilweise die CDR2 (GXGPTLRQWLXYAQKFQG) (SEQ ID NO: 113) ersetzte. Der Aufbau der Bibliothek unter teilweisem CDR2-Ersatz der schweren Kette wurde ebenfalls durchgeführt, wie es zuvor für die CDR2-Bibliothek der schweren Ketten beschrieben wurde mit der Ausnahme, daß der spezifische Primer 8HCR2anti0 (5'-CAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCMNNCCCTCCCATCCACTCAAGCCC-3') (SEQ ID NO: 114), welcher an das Ende von FR2 der schweren Kette annealte, und der Primer 8HCR2code (5'-GGCCCAACCCTGCGCCAGTGGCTGNNKTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACCATT-3' ) (SEQ ID NO: 115), welcher an den Anfang von FR3 der schweren Kette annealte, anstelle der zuvor beschriebenen HR2 cMpl-Primer verwendet wurden. Die Bibliothek unter teilweisem CDR2-Ersatz der schweren Kette wurde vier Runden auf 293-EBNA-Zellen, die mit dem cMpl-R transfiziert waren, geschwenkt, wie es zuvor beschrieben wurde. Diese Klone können nun hinsichtlich positiv bindender Klone durch FACS-Analyse durchmustert werden, wie es zuvor beschrieben wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immunglobulinmolekül, das eine Region umfasst, in der Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, gegen ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind oder worin das Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin-Mimetikum ist, in eine CDR eingefügt ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, welches weiterhin wenigstens eine flankierende Sequenz umfasst, die wenigstens eine Aminosäure enthält, die mit wenigstens einem Ende des Peptidmimetikums kovalent verknüpft ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 2, wobei wenigstens eine flankierende Sequenz eine flankierende Sequenz umfasst, die ein Prolin aufweist, das mit dem Peptidmimetikum kovalent verknüpft ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 3, wobei wenigstens eine flankierende Sequenz eine flankierende Sequenz umfasst, die ein Prolin aufweist, das mit dem carboxyterminalen Ende des Peptidmimetikums kovalent verknüpft ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei wenigstens zwei Komplementarität bestimmende Regionen (CDR) durch das Peptidmimetikum ersetzt sind oder wobei das Thrombopoietin-Mimetikum in zwei CDR eingefügt ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulinmolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fab-Fragment, F(ab')2-Fragment und scFv-Fragment besteht.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei das Immunglobulinmolekül ein vollständiges IgG-Molekül ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei die CDR auf einer leichten Kette lokalisiert ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind und wobei die CDR auf einer schweren Kette lokalisiert ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind, wobei die CDR aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer CDR3 von einer schweren Kette und einer CDR2 von einer leichten Kette besteht.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind, wobei die CDR aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CDR3 von einer schweren Kette und CDR2 von einer schweren Kette besteht.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind, wobei die CDR aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CDR3 von einer schweren Kette und CDR1 von einer leichten Kette besteht.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäurereste, die einem Teil von mehr als einer CDR entsprechen, ersetzt sind.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von einer Komplementarität bestimmenden Region (CDR) entsprechen, durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind, wobei die CDR3-Regionen von einer schweren Kette und einer leichten Kette durch das Peptidmimetikum ersetzt sind.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei das Thrombopoietin-Mimetikum in eine CDR eingefügt ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Teil der CDR durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt ist und wobei die CDR aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der CDR2 von einer schweren Kette und der CDR2 von einer leichten Kette besteht.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Teil der CDR durch ein Pepditdmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt ist und wobei die CDR aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CDR1 von einer schweren Kette und CDR1 von einer leichten Kette besteht.
Immunglobulin nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Teil der CDR durch ein Peptidmimetikum, welches Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt ist und wobei die CDR aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer CDR3 von einer schweren Kette und einer CDR3 von einer leichten Kette besteht.
Immunglobulin nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Teil der CDR durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt ist und wobei das Immunglobulinmolekül ein menschliches ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 18, wobei das Immunglobulinmolekül Anti-Tetanustoxoid ist.
Nukleinsäure, die ein Immunglobulinmolekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche kodiert.
Expressionsvektor, der Nukleinsäure nach Anspruch 21 enthält.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 22 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulinmoleküls, welches das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 23 unter Bedingungen, die für eine Expression des Immunglobulins geeignet sind, umfasst.
Zusammensetzung, die ein Immunglobulin nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zum Erstellen eines Immunglobulinmoleküls, so daß es eine Aktivität von einem biologisch aktiven Peptid aufweist, welches umfasst: Bereitstellen von Nukleinsäure, die ein Immunglobulinmolekül kodiert, Ersetzen von wenigstens einem Teil von wenigstens einer CDR-kodierenden Region durch Nukleinsäure, die ein biologisch aktives Peptid kodiert, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, oder Einfügen von Nukleinsäure, die ein biologisch aktives Peptid kodiert, welches ein TPO-Mimetikum ist, in wenigstens eine CDR unter Bildung eines substituierten Nukleinsäurekonstruktes für biologisch aktives Peptid und Exprimieren des Peptides, das von dem Nukleinsäurekonstrukt kodiert wird, zusammen mit einer Antikörperkette, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus schwerer Kette und leichter Kette besteht, in einer geeigneten Wirtszelle, so daß ein Heterodimer gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das biologisch aktive Peptid ein Prolin enthält, das kovalent an dessen carboxyterminales Ende gebunden ist.
Verwendung eines Immunglobulinmoleküls, bei dem eine oder mehrere CDR-Regionen durch ein Thrombopoietin-Mimetikumpeptid ersetzt sind oder bei dem das Thrombopoietin-Mimetikumpeptid in wenigstens eine CDR eingefügt ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von Proliferation, Differenzierung oder Wachstum von Promegakaryozyten oder Megakaryozyten.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Blutplättchenproduktion erhöht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 29, wobei ein Teil von wenigstens einer CDR-kodierenden Region durch Nukleinsäure, die ein biologisch aktives Peptid kodiert, ersetzt ist und wobei das biologisch aktive Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 31, SEQ. ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 und SEQ ID NO: 49 besteht.
Immunglobulinmolekül, das eine Region umfasst, in der Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil einer CDR entsprechen, durch ein biologisch aktives Peptid, welches ein Thrombopoietin-Mimetikum (TPO-Mimetikum) ist, ersetzt sind oder in der das biologisch aktive Peptid, welches ein Thrombopoietin-Mimetikum (TPO-Mimetikum) ist, in wenigstens eine CDR eingefügt ist, wobei das biologisch aktive Peptid an dem carboxyterminalen Ende des biologisch aktiven Peptids von einem Prolin flankiert ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 31, wobei wenigstens zwei CDR-Regionen durch das biologisch aktive Peptid ersetzt sind oder wobei das biologisch aktive Peptid in wenigstens zwei CDR-Regionen eingefügt ist.
Nukleinsäure, die ein Immunglobulinmolekül nach Anspruch 32 kodiert.
Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 33 enthält.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 34 transformiert ist.
Bibliothek, die variierte Immunglobulinmoleküle enthält, in denen Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil von wenigstens einer CDR entsprechen, durch ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind, wobei das Peptidmimetikum wenigstens eine flankierende Sequenz, welche randomisiert wurde, aufweist, um Immunglobulinmoleküle mit variablen Aminosäuresequenzen zu erzeugen.
Bibliothek, die variierte Immunglobulinmoleküle enthält, in denen ein Peptidmimetikum, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, in wenigstens eine CDR eingefügt ist und wobei das TPO-Mimetikum wenigstens eine flankierende Sequenz, welche randomisiert wurde, aufweist, um Immunglobulinmoleküle mit variablen Aminosäuresequenzen zu erzeugen.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 31, wobei das biologisch aktive Peptid an sowohl seinem carboxyterminalen Ende als auch seinem aminoterminalen Ende von einem Prolin flankiert ist.
Immunglobulinmolekül, das eine Region umfasst, in der Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil einer CDR entsprechen, durch ein biologisch aktives Peptid, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind oder in der das biologisch aktive Peptid, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, in wenigstens eine CDR eingefügt ist, wobei das biologisch aktive Peptid an seinem carboxyterminalen Ende von einer Aminosäuresequenz flankiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Prolin-Valin, Prolin-Asparaginsäure, Prolin-Isoleucin, Serin-Asparagin, Serin-Lysin, Serin-Glycin, Serin-Arginin, Leucin-Histidin, Leucin-Glutaminsäure, Leucin-Alanin, Leucin-Phenylalanin, Valin-Glutamin, Valin-Serin, Valin-Alanin, Valin-Asparagin, Isoleucin-Serin, Isoleucin-Tyrosin, Asparagin-Prolin, Asparagin-Serin, Asparagin-Tryptophan, Asparagin-Valin, Phenylalanin-Valin, Threonin-Serin, Methionin-Alanin, Arginin-Serin, Arginin-Glycin, Arginin-Threonin, Arginin-Leucin, Arginin-Valin, Tryptophan-Arginin, Tryptophan-Tryptophan, Alanin-Arginin, Asparaginsäure-Valin, Glycin-Tyrosin, Glutamin-Arginin und Glycin-Lysin.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 39, wobei das biologisch aktive Peptid an seinem aminoterminalen Ende von einem Prolin flankiert ist.
Immunglobulinmolekül, das eine Region umfasst, in der Aminosäurereste, die wenigstens einem Teil einer CDR entsprechen, durch ein biologisch aktives Peptid, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, ersetzt sind oder in der das biologisch aktive Peptid, welches ein Thrombopoietin (TPO)-Mimetikum ist, in wenigstens eine CDR eingefügt ist, wobei das biologisch aktive Peptid an seinem aminoterminalen Ende von einer Aminosäuresequenz flankiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Tryptophan-Leucin, Valin-Valin, Glycin-Prolin, Leucin-Prolin, Leucin-Tyrosin, Serin-Leucin, Serin-Isoleucin, Serin-Prolin, Threonin-Methionin, Threonin-Tyrosin, Threonin-Prolin, Glutamin-Threonin, Glutamin-Glutaminsäure, Glutamin-Leucin, Arginin-Methionin, Arginin-Asparagin, Arginin-Threonin, Arginin-Glycin, Arginin-Serin, Lysin-Glutaminsäure, Lysin-Glycin, Alanin-Histidin, Histidin-Glycin, Histidin-Leucin und Asparagin-Prolin.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 41, wobei das biologisch aktive Peptid an seinem carboxyterminalen Ende von einem Prolin flankiert ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 5, wobei die wenigstens zwei CDR aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus i) CDR3 von schwerer Kette und CDR2 von schwerer Kette, ii) CDR von schwerer Kette und CDR2 von leichter Kette, iii) CDR2 von schwerer Kette und CDR2 von leichter Kette, iv) CDR3 von schwerer Kette und CDR2 von schwerer Kette und CDR2 von leichter Kette und v) CDR3 von schwerer Kette und CDR1 von leichter Kette.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 5, wobei ein CDR3 von schwerer Kette durch ein Peptidmimetikum mit SEQ ID NO: 40 ersetzt ist und ein CDR2 von leichter Kette durch ein Peptidmimetikum mit SEQ ID NO: 61 ersetzt ist.
Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, wobei das TPO-Mimetikum irgendeiner Sequenz entspricht, die in der Gruppe angegeben ist, welche aus den folgenden besteht: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 und SEQ ID NO: 49.