ES2380367T3

ES2380367T3 - Anticuerpos diseñados racionalmente

Info

Publication number: ES2380367T3
Application number: ES05076105T
Authority: ES
Inventors: Katherine S. Bowdish; Shana Frederickson; Mark Renshaw
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2012-05-11
Anticipated expiration: 2021-12-05
Also published as: EP1370589A2; US20100041012A1; WO2002046238A3; US7482435B2; DK1642910T3; EP1642910B1; DE60136656D1; EP1370589B1; CA2436671C; ES2258558T3; EP1498429A2; EP1589034A2; ES2316919T3; ATE544785T1; CA2436671A1; EP1589034A3; WO2002046238A2; US20150004700A1; AU3400102A; EP1589034B1

Abstract

Anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento comprende un Fab, un F (ab') 2, un scFv, un Fv, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo, que comprende una región i) en la que los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos una parte de un región determinante de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido biológicamente activo, o ii) en la que un péptido biológicamente activo es insertado en una CDR, en el que el péptido biológicamente activo es un péptido mimético.

Description

Anticuerpos diseñados racionalmente.

Campo técnico

La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpo y a péptidos biológicamente activos como reactivos diagnósticos y terapéuticos.

Antecedentes de la técnica relacionada

Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B y constituyen una defensa frente a las infecciones. Los anticuerpos se producen en millones de formas, cada una de las cuales presenta una secuencia aminoácida diferente. Las moléculas de anticuerpo están compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y de dos cadenas pesadas idénticas. Cuando se digieren con el enzima papaína, se generan dos fragmentos Fab idénticos junto con un fragmento Fc. Cuando se digieren con el enzima pepsina, se produce un fragmento F(ab')2. Las cadenas ligeras y pesadas constan de regiones constantes y de regiones variables. Dentro de las regiones variables existen regiones hipervariables (también conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR)) que forman el sitio de unión al antígeno. Las partes restantes de las regiones variables se denominan regiones de marco.

Algunas funciones biológicas importantes, tales como la unión de receptores, la activación y la actividad enzimática, con frecuencia pueden atribuirse a regiones discretas de moléculas de proteína más grandes, que comprenden un número limitado de residuos aminoácidos. También se han descubierto péptidos que muestran actividades de unión, de activación o enzimáticas mediante el cribado de bibliotecas de péptidos generadas mediante la unión aleatoria de residuos aminoácidos. Estos péptidos pueden no corresponder a una disposición lineal de los aminoácidos en una molécula de proteína más grande que muestra una actividad biológica similar y se hace referencia a ellos como epítopos o mimótopos peptídicos discontinuos. Se han descrito y clonado determinados péptidos miméticos. Ver, por ejemplo, la patente US nº 6.083.913 (mimético de la trombopoyetina (TPO)), la patente US nº 5.835.382 (mimético de la eritropoyetina (EPO)), la patente US nº 5.830.851 (mimético de la EPO) y Wrighton et al., Science 273:458-63, (1996). Los epítopos y mimótopo de péptidos, debido a sus dimensiones reducidas resultan potencialmente ventajosos respecto a las moléculas de proteína de gran tamaño para la utilización como reactivos terapéuticos. Sin embargo, los resultados con estos péptidos como compuestos terapéuticos con frecuencia pueden resultar insatisfactorios. Una desventaja de la utilización de los péptidos como reactivos terapéuticos es que generalmente son inestables in vivo, es decir, sus tasas de eliminación del suero pueden ser bastante rápidas. Además, resulta difícil predecir la actividad, terapéutica u otra, de un péptido si se fusiona con una molécula mayor debido a que los cambios de conformación y otras fuerzas moleculares pueden interferir con la actividad del péptido o bloquearla totalmente.

Se han llevado a cabo intentos para introducir determinados polipéptidos en regiones CDR de los anticuerpos. Ver, por ejemplo, la solicitud PCT WO 94/18221. Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, debido a los cambios de conformación que pueden provocar los aminoácidos flanqueantes, la actividad biológica de los polipéptidos activos puede resultar disminuida o anulada. Por lo tanto, un objetivo en la presente memoria consiste en proporcionar anticuerpos diseñados racionalmente, o fragmentos de los mismos, que incluyan péptidos biológicamente activos para la utilización como reactivos diagnósticos y terapéuticos.

El documento WO 99/45110 da a conocer la sustitución de las estructuras en bucle CDR en el interior de los dominios similares a V de los ligandos no de anticuerpo tales como CTLA-4.

Sumario

Se proporcionan en la presente memoria anticuerpos recombinantes biológicamente activos y sus fragmentos que imitan la actividad de los péptidos biológicamente activos, procedimientos para preparar estos anticuerpos y procedimientos para su utilización en la terapia y el diagnóstico. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos no adolecen de algunas de las desventajas de los péptidos aislados, debido a que los anticuerpos presentan naturalmente vidas medias séricas prolongadas y son altamente específicos en la unión a su diana. Inesperadamente se ha descubierto que la incorporación de aminoácidos particulares flanqueando un péptido diana que se ha insertado en una molécula de anticuerpo incrementa finalmente la actividad biológica del péptido.

Los anticuerpos o sus fragmentos presentan un péptido de interés insertado en una región determinante de complementariedad (CDR) de una molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo sirve como estructura para la presentación del péptido y proporciona al péptido una mayor estabilidad. El péptido sustituye opcionalmente todos los aminoácidos de una región CDR, o puede añadirse a una CDR existente, de manera que se altere la especificidad del antígeno original, de manera que la región CDR se define mediante cualquiera de los dos esquemas aceptados (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologics Interest, 5ª edición (1991), NIH Publication 91-3242, y Chothia et al., J. Mol. Bio. (227):776-98, (1992)). Además, pueden introducirse aleatoriamente aminoácidos adicionales flanqueando el péptido y que permitan el cribado para una presentación óptima del péptido

en el marco del anticuerpo. Inesperadamente se ha descubierto que en determinados casos una prolina que flanquee el péptido da lugar a un incremento de la actividad biológica.

En formas de realización particulares, una molécula de anticuerpo o fragmento presenta residuos aminoácidos que corresponden a una región determinante de complementariedad (CDR) que han sido sustituidos por residuos aminoácidos que comprenden un péptido trombopoyético biológicamente activo. En otra forma de realización particular, los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) han sido, cada una de ellas, sustituidas por residuos aminoácidos que comprenden dicho péptido biológicamente activo. En una sola molécula de anticuerpo o su fragmento pueden sustituirse una o más regiones determinantes de complementariedad por un péptido; por ejemplo, CDR3 de una cadena pesada, CDR3 de una cadena ligera, CDR3 de una cadena pesada y de una cadena ligera, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada, o CDR2 y CDR3 de una cadena ligera. Resultan posibles otras combinaciones de sustituciones de regiones CDR, incluyendo la sustitución de CDR1. Además, en lugar de sustituir una CDR, podría añadirse el péptido a una CDR nativa sin sustituir de hecho ningún residuo aminoácido y todavía alterar la especificidad original de antígeno.

De esta manera, en un aspecto se proporciona un péptido biológicamente activo con actividad mejorada mediante la adición de una prolina en su extremo carboxi con el fin de formar un péptido biológicamente activo extendido con prolina que se utiliza para sustituir o añadir por lo menos una parte de por lo menos una región CDR en una molécula de anticuerpo o su fragmento. En otro aspecto, se proporciona una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta un péptido mimético de TPO como sustitución para por lo menos una región CDR nativa. En este aspecto, el péptido mimético de TPO puede extenderse opcionalmente con prolina, tal como se describe en la presente memoria.

En las formas de realización particulares adicionales, la molécula de anticuerpo o su fragmento es un Fab, un ScFv, una región variable de cadena pesada, una cadena ligera o una molécula completa de IgG. La molécula de anticuerpo o su fragmento también puede presentar un dominio de dimerización, de manera que permita que las moléculas de anticuerpo en las que únicamente una CDR ha sido sustituida por un péptido, se dimericen y de esta manera activen los receptores que requieren la dimerización para su activación.

En determinadas formas de realización, el péptido biológicamente activo puede ser un epítopo de péptido lineal o un epítopo de péptido discontinuo. Además, el péptido biológicamente activo, cuando se sustituye por una región CDR, puede presentar, además de la prolina, dos o más residuos aminoácidos flanqueantes adicionales en posición proximal a los extremo aminoterminal y/o carboxi-terminal del péptido, que se sitúan entre el péptido y los residuos de la región marco de la inmunoglobulina (es decir, en lo que anteriormente era la unión entre la CDR y el marco contiguo). Los residuos aminoácidos flanqueantes típicamente no se encuentran presentes en el péptido activo. Si ya son conocidos los residuos aminoácidos flanqueantes preferentes, éstos se encuentran codificados por codones que designan aquellos residuos aminoácidos específicos. Sin embargo, mediante la utilización inicial de codones, tales como NNK, NNY, NNR, NNS y similares, que designan múltiples residuos aminoácidos, se genera una colección de péptidos que difieren entre sí simplemente por los residuos flanqueantes. Los residuos aminoácidos flanqueantes pueden determinar la presentación del péptido en la molécula de anticuerpo o su fragmento y de esta manera pueden influir sobre la unión y/o actividad biológica mostrada por el péptido. Esta colección aleatoria de aminoácidos flanqueantes permite la selección del contexto óptimo de expresión de la secuencia peptídica dentro del marco del anticuerpo que resulte en la unión específica a la molécula diana y la expresión óptima de la actividad biológica. El cribado de bibliotecas de anticuerpos que presentan un péptido común pero diferentes residuos aminoácidos flanqueantes puede llevarse a cabo utilizando ensayos de unión, de crecimiento y de activación conocidos por los expertos en la materia y tal como se describe en la presente memoria.

El péptido que sustituye los residuos aminoácidos que comprenden una CDR puede ser cualquier péptido que se una específicamente a una molécula diana y cuya utilidad podría ser alterada mediante la incorporación en un marco de anticuerpo. El péptido podría asimismo presentar una actividad específica (por ejemplo, agonista, antagonista, enzimática, etc.). En una forma de realización particular el péptido es un agonista o un antagonista para un receptor de superficie celular. Por ejemplo, el receptor de superficie celular puede ser una citocina, un factor de crecimiento, o un inhibidor de crecimiento.

En las formas de realización particularmente útiles, la sustitución de por lo menos una parte de una CDR con un péptido proporciona un anticuerpo que actúa como antagonista. El péptido utilizado para sustituir por lo menos una parte de una CDR puede presentar por sí mismo propiedades agonistas. Alternativamente, el péptido (aunque se une específicamente a un receptor) puede no presentar actividad agonista. Más bien, la actividad agonista podría mostrarse únicamente cuando el péptido es sustituido para por lo menos una parte de una CDR y por lo tanto se encuentra presente en el cuerpo modificado mediante ingeniería genética. En dichas formas de realización, la presencia o ausencia de prolina que flanquee el péptido no resulta crítica, pero puede, en algunos casos, resultar preferida.

De esta manera, en un aspecto la presente exposición proporciona un anticuerpo agonista que comprende un marco de anticuerpo manipulado para que contenga por lo menos un péptido biológicamente activo que es un mimético de trombopoyetina (TPO) insertado o en sustitución de por lo menos una parte de una o más CDR. El péptido

biológicamente activo puede o no puede mostrar una actividad agonista previamente a la inserción en el marco del anticuerpo. En determinadas formas de realización, el marco del anticuerpo se manipula para que contenga dos péptidos capaces de dimerizarse entre sí.

En todavía otro aspecto, la presente exposición proporciona una molécula de anticuerpo o su fragmento que comprende una región en la que los residuos aminoácidos correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante de complementariedad (CDR) son sustituidos por un péptido biológicamente activo, de manera que la molécula de anticuerpo o su fragmento muestra actividad agonista. El péptido biológicamente activo puede mostrar o no actividad agonista previamente a la inserción en el marco del anticuerpo. En formas de realización particularmente útiles, la molécula de inmunoglobulina muestra actividad agonista de cMpI.

Todavía en otro aspecto, la presente exposición proporciona una molécula de anticuerpo o su fragmento que comprende un péptido biológicamente activo insertado en una región determinante de la complementariedad (CDR), presentando la molécula de anticuerpo o su fragmento una actividad agonista.

Todavía en otro aspecto, la presente exposición proporciona una molécula de anticuerpo o su fragmento que comprende una región en la que los residuos aminoácidos correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante de la complementariedad (CDR) son sustituidos por un péptido biológicamente activo, presentando la molécula de anticuerpo o su fragmento una actividad agonista c-mpl.

En otras formas de realización particulares, el péptido que sustituye los aminoácidos de una CDR es un péptido agonista mimético de TPO. Uno de estos péptidos agonistas presenta por lo menos la secuencia IEGPTLRQWLAARA (SEC. ID nº 1). Otras secuencias resultan posibles para los péptidos agonistas miméticos de TPO que pueden encontrarse mediante ensayos de unión, de crecimiento y de activación conocidos por los expertos en la materia y tal como se describe en la presente memoria. Los péptidos agonistas miméticos de TPO, cuando se sitúan en regiones CDR pueden presentar uno o más residuos aminoácidos adicionales en los extremos aminoterminal y/o carboxi-terminal del péptido, que se unen covalentemente a los residuos de marco de la inmunoglobulina. Uno de estos péptidos miméticos de TPO presenta un residuo adicional de prolina añadido en el extremo carboxilo; IEGPTLRQWLAARAP (SEC. ID nº 2). Otras moléculas de anticuerpo o sus fragmentos presentan una región CDR sustituida por los péptidos miméticos de TPO, que comprende la secuencia aminoácida de las SEC. ID nº: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49 (ver la fig. 5).

Otro péptido biológicamente activo puede ser sustituido por los residuos aminoácidos de una CDR es un péptido mimético de EPO agonista. Dicho péptido agonista de EPO presenta como su secuencia aminoácida DYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEC ID nº: 3). Otras secuencias aminoácidas resultan posibles para los péptidos miméticos agonistas de EPO, que pueden ser descubiertos utilizando los ensayos de activación, de crecimiento y de unión conocidos por los expertos en la materia y como se ha descrito en la presente memoria. Cuando los péptidos miméticos de EPO agonistas están ubicados en las regiones CDR pueden presentar uno o más residuos aminoácidos adicionales en los extremos amino-terminal y/o carboxilo-terminal del péptido que resultan enlazados de manera covalente a los residuos de inmunoglobulina.

De esta manera, en las formas de realización particulares proporcionadas en la presente memoria, se encuentran moléculas de anticuerpos o fragmentos de las mismas (por ejemplo Fab, scFv, cadenas pesadas o ligeras) que presentan una región CDR sustituida por un péptido mimético de TPO o EPO. Por ejemplo, el péptido TPO puede incluir por lo menos la secuencia IEGPTLRQWLAARA (SEC. ID nº 1) y opcionalmente puede presentar una prolina adicional en la posición inmediatamente corriente abajo. El mimético de EPO comprende por lo menos la secuencia DYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEC ID nº: 3). Asimismo, puede presentar opcionalmente una prolina adicional en la posición corriente abajo inmediata.

Cualquier anticuerpo o fragmento del mismo potencialmente podría proporcionar el marco y presentar una sustitución de la CDR por un péptido según la presente invención. Para la utilización terapéutica o diagnóstica in vivo resulta preferente que el anticuerpo sea de origen humano o se encuentre humanizado, tal como una inmunoglobulina antitoxoide de tétano. Además, independientemente o conjuntamente con la presencia de aminoácidos flanqueantes adicionales unidos al péptido, puede alterarse uno o más residuos aminoácidos en otras regiones del anticuerpo, en otra región o regiones CDR y/o en otras regiones marco con el fin de modificar la unión, la actividad y/o la expresión del péptido en el contexto de la molécula de anticuerpo.

Se contempla que, tras la construcción de anticuerpos recombinantes biológicamente activos y/o sus fragmentos, dichos recombinantes puedan someterse a procedimientos de aleatorización conocidos de la técnica para introducir mutaciones en uno o más puntos en la secuencia con el fin de alterar la actividad biológica de los anticuerpos. Tras la generación de estos mutantes mediante la utilización de procedimientos de aleatorización, tales como los descritos en la presente memoria, los recombinantes resultantes pueden someterse a ensayo para actividad utilizando ensayos de unión, de crecimiento, de expresión y de activación.

Se proporcionan asimismo moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de anticuerpo o sus fragmentos que presentan los aminoácidos de una o más regiones CDR sustituidas por un péptido biológicamente activo. Estas

moléculas de ácido nucleico pueden encontrarse presentes en un vector de expresión que puede introducirse (transfectarse) en una célula huésped recombinante para la expresión de estas moléculas. También se proporcionan procedimientos para la producción de un anticuerpo o fragmento del mismo que contiene un péptido biológicamente activo, que comprende cultivar una célula huésped recombinante bajo condiciones tales que el ácido nucleico contenido dentro de la célula se exprese.

También se proporcionan composiciones que comprenden una molécula de anticuerpo o fragmento del mismo, que presenta residuos aminoácidos correspondientes a una CDR sustituida por residuos aminoácidos, que comprende un péptido mimético de TPO y un portador farmacéuticamente aceptable.

Están previstos además unos péptidos miméticos de EPO con residuos flanqueantes adicionales que resultan adecuados para la sustitución de las CDR. Están asimismo previstas unas moléculas de ácido nucleico que codifican estos péptidos.

También se proporcionan procedimientos de manipulación de las moléculas de anticuerpo o sus fragmentos para que muestren una actividad agonista en la que un péptido biológicamente activo que es un mimético de TPO, sustituya por lo menos una parte de una o más regiones CDR de cadenas ligeras y/o pesadas. Los procedimientos incluyen insertar una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo que es un mimético de TPO en el lugar de por lo menos una región CDR de una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, o añadir la molécula a la secuencia CDR nativa y después expresar la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina junto con su dominio complementario de región variable, de manera que se asocien los dos dominios.

Además, se proporcionan procedimientos de manipulación de moléculas de anticuerpo o sus fragmentos para que muestren una actividad (propiedad) de un péptido TPO biológicamente activo, en los que un péptido biológicamente activo sustituye una o más regiones CDR de cadenas ligeras y/o pesadas. Los procedimientos incluyen insertar una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo en el lugar de por lo menos una parte de una región CDR de una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina o añadir la molécula a la secuencia CDR nativa y expresar la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina junto con su dominio complementario de región variable, de manera que se asocien las dos cadenas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción en un polipéptido de un sitio de unión capaz de unirse a un agente preseleccionado, incluyendo el procedimiento las etapas de introducir una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de residuos aminoácidos que define dicho sitio de unión en una región CDR de un ácido nucleico que comprende un gen de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina mediante la amplificación de la región CDR del gen de inmunoglobulina, presentando la secuencia nucleótida introducida la fórmula Xa-Y-Xb, en la que X es igual o diferente en cada aparición y representa un trinucleótido de aleatorización, la suma de a y b es 4 o menos, e Y es una secuencia nucleótida que codifica un dominio de reconocimiento mínimo de dicho sitio de unión. En las formas de realización particularmente útiles, la amplificación se consigue utilizando PCR de solapamiento, sin embargo, puede utilizarse cualquier técnica de amplificación conocida, tal como, por ejemplo, los procedimientos dados a conocer en la patente WO nº 94/18221, cuya exposición se incorpora en la presente memoria como referencia.

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para la creación de una biblioteca de anticuerpos monoclonales que pueden cribarse para una actividad deseada. Estos procedimientos para la preparación de una biblioteca incluyen las etapas de insertar una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo en, o en el lugar de, por lo menos una parte de una o más regiones CDR de una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, proporcionando hasta un par de trinucleótidos de aleatorización en cada lado de la molécula de ácido nucleico insertada y expresando una biblioteca de anticuerpos monoclonales. En las formas de realización particularmente útiles, se proporciona un par de trinucleótidos de aleatorización en ambos lados de las moléculas insertadas de ácido nucleico. La biblioteca de anticuerpos monoclonales producida de esta manera puede cribarse a continuación para una actividad deseada.

En una forma de realización específica, los anticuerpos o sus fragmentos presentan diferentes aminoácidos flanqueando el péptido en los extremos amino y carboxilo donde el péptido se une a la estructura del anticuerpo. Ello resulta en una población de moléculas de anticuerpo o sus fragmentos que puede ser diferente respecto a la presentación del péptido. La población se criba para estos anticuerpos que muestran la actividad biológica del péptido. En una forma de realización preferente, el aminoácido inmediatamente contiguo al péptido es una prolina.

Si la actividad del péptido biológicamente activo es activar una molécula diana, ello puede requerir la dimerización de dos moléculas diana (por ejemplo los receptores en las superfamilias hematopoyéticas). Para que se produzca la dimerización, deben situarse dos péptidos para que cada uno se una a una molécula diana de manera que las dos moléculas diana unidas puedan asociarse a continuación de manera apropiada. Ello puede conseguirse con la presencia de dos péptidos en el mismo anticuerpo o fragmento del mismo o causando que dos moléculas de anticuerpo, cada una de las cuales contiene un péptido, se unan entre sí. De esta manera, por ejemplo, puede insertarse o sustituirse un solo péptido por como mínimo una parte de una CDR y después expresarse como una inmunoglobulina o como un fragmento F(ab')2. A título de ejemplo adicional, pueden insertarse dos péptidos o sustituirse por como mínimo una parte de una o más CDR y expresarse como cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

5 El cribado de anticuerpos o sus fragmentos puede conseguirse mediante separación por panning con células que presentan moléculas de superficie a las que se une específicamente el péptido. También puede utilizarse la unión a fase sólida con moléculas diana purificadas o sus fragmentos. La unión también puede llevarse a cabo en solución utilizando moléculas diana marcadas. Además, pueden cribarse anticuerpos o sus fragmentos mediante la utilización

10 de ensayos biológicos para actividad agonista o antagonista del péptido.

Se proporcionan asimismo bibliotecas de diferentes moléculas de anticuerpo o sus fragmentos, en las que los residuos aminoácidos correspondientes a una región determinante de complementariedad (CDR) se sustituyen por residuos aminoácidos que comprenden un péptido biológicamente activo que presenta por lo menos un residuo

15 aminoácido adicional en el extremo amino o carboxilo y en las que las moléculas de anticuerpo o sus fragmentos difieren en el residuo aminoácido adicional del péptido.

En las formas de realización específicas, el péptido biológicamente activo es un mimético de TPO o un mimético de EPO. Los anticuerpos de la biblioteca se expresan en un fago.

20 Se dan a conocer en la presente memoria unos procedimientos de estimulación de la proliferación, la diferenciación

o el crecimiento de las células, que comprenden poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta una o más CDR sustituidas con un péptido biológicamente activo que se une a un receptor sobre la superficie de las células. En las formas de realización específicas el péptido

25 biológicamente activo es un mimético de TPO o un mimético de EPO.

Se da a conocer en la presente memoria un procedimiento de estimulación de la proliferación, la diferenciación o el crecimiento de los megacariocitos poniendo en contacto los megacariocitos con una cantidad eficaz de una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta una o más CDR sustituidas con un péptido mimético de TPO. Se da

30 asimismo a conocer un procedimiento de aumento de la producción de plaquetas, que implica la puesta en contacto de los megacariocitos con una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta la sustitución de una o más regiones CDR por un péptido mimético de TPO. Se da asimismo a conocer un procedimiento de estimulación de los megacariocitos y/o aumento de la producción de las plaquetas en un paciente, en el que se administra a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo o su

35 fragmento que presenta la sustitución de una o más regiones CDR por un péptido mimético de TPO. La molécula de anticuerpo y los megacariocitos también pueden ponerse en contacto in vitro e introducirse las células resultantes en el paciente. Además, puede administrarse a un sujeto que pretende donar plaquetas, un anticuerpo o fragmento del mismo que presenta por lo menos un péptido mimético de TPO incorporado al mismo, incrementando de esta manera la capacidad del donante de generar plaquetas con el fin de proporcionar una fuente más robusta de las

40 mismas.

Se da a conocer asimismo un procedimiento de estimulación de la proliferación, la diferenciación o el crecimiento de las células hematopoyéticas, que comprende poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta una o más CDR sustituidas con un péptido mimético de EPO.

45 Se da a conocer asimismo en la presente memoria un procedimiento para activar una proteína receptora homodimérica mediante la puesta en contacto del receptor con una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta una región CDR sustituida por un péptido biológicamente activo que se une específicamente al receptor y que ha sido dimerizada. En una forma de realización adicional el receptor es un receptor de trombopoyetina.

Descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación diagramática del vector pRL4.

55 Las figuras 2A y 2B muestran la secuencia de marco de las cadenas pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo humano del toxoide de tétano.

La figura 3 es un diagrama que ilustra el injerto del péptido mimético de TPO, AF12505, en la región CDR3 de cadena pesada del anticuerpo marco del toxoide de tétano. XX representa los aminoácidos aleatorios flanqueantes.

60 La figura 4 es un diagrama de la construcción de un péptido clonado en la región CDR3 de cadena pesada.

La figura 5 representa las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos que codifican el péptido mimético de TPO, AF1205, con diferentes residuos flanqueantes aleatorios.

Las figuras 6A-C ilustran la secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pRL8 (SEC ID nº 60). pRL8 es una versión modificada de pRL4 (pRL4 también se conoce como pComb 3X). Se modificó pRL4 entre los sitios de restricción SpeI y el SfiI contiguo (mostrado en subrayado) para que incluyese un linker flexible (región de bisagra kappa murina) seguido de un dominio de Jun de dimerización de cremallera de leucina.

La figura 7 es una ilustración esquemática de una parte del plásmido pRL8.

La figura 8 ilustra la secuencia de ácidos nucleicos de una parte del plásmido pRL8 (SEC ID nº 52) junto con las secuencias aminoácidas correspondientes a determinadas secuencias identificadas de ácidos nucleicos (SEC ID nº 53).

La figura 9 es una tabla que muestra las secuencias de determinados clones positivos para TPO en la presente memoria.

La figura 10 es un histograma que muestra la actividad de determinados clones de Fab que contienen 2 péptidos miméticos de TPO.

La figura 11 es un histograma que muestra la actividad de determinados clones de Fab que contienen 2 ó 3 péptidos miméticos de TPO.

La figura 12 ilustra gráficamente la actividad del clon 59 según indica la actividad de luciferasa.

La figura 13A ilustra la secuencia aminoácida y la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena pesada de 5G1.1-TPO (SEC ID nº 67 y nº 68, respectivamente).

La figura 13B ilustra la secuencia aminoácida y la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena ligera de 5G1.1 (SEC ID nº 69 y 70, respectivamente).

La figura 14 es un histograma que muestra el análisis FACS de la unión del receptor cMpI de 5G1.1 purificado + péptido mimético de TPO en comparación con el anticuerpo 5G1.1 parental.

La figura 15 es un histograma que muestra la actividad comparativa de anticuerpo 5G1.1 que contiene el péptido mimético de TPO en células transfectadas con un vector de control que no contiene cMpI-R y en células transfectadas con un vector que contiene cMpI-R.

La figura 16 muestra la secuencia del clon 429/Xb4 (SEC ID nº 116).

La figura 17 es un diagrama de flujo que muestra las etapas iniciales para preparar el vector pRL5-Kappa.

La figura 18 es un diagrama de flujo que muestra etapas adicionales para preparar el vector pRL5-Kappa.

La figura 19 es un mapa del vector pRL5.

La figura 20 es un esquema el vector pRL5-Kappa.

La figura 21A-I muestra la secuencia de ácidos nucleicos del vector pRL5-Kappa.

Descripción detallada

Tal como se utiliza en la presente memoria, "inmunoglobulina" se refiere a una o más moléculas completas de inmunoglobulina que contienen partes inmunológicamente activas de moléculas completas de inmunoglobulina, e incluye Fab, F(ab')2, scFv, Fv, regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera. Los términos inmunoglobulina y anticuerpo se utilizan de manera intercambiable en la presente memoria.

Cualquier péptido que muestre una propiedad útil resulta adecuado para la inserción en un anticuerpo que sirve de marco. Entre las actividades y usos de péptidos se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la unión a un receptor, la unión de una molécula de superficie unida a membrana, la unión a un ligando, la unión a un enzima o a una proteína estructural, la activación o la inhibición de un receptor, la administración dirigida de fármacos, o cualquier actividad enzimática. Habitualmente se seleccionan aquellos péptidos cuya utilidad puede incrementarse a partir de la mayor estabilidad adquirida cuando se presentan en el contexto de una molécula de inmunoglobulina. Debe entenderse que "actividad biológica" tal como se utiliza en la presente memoria incluye cualquier actividad asociada con una molécula que presenta actividad en un sistema biológico, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, la actividad estimulante o inhibitoria desencadenada por interacciones proteína-proteína, así como la cinética referida a estas interacciones, incluyendo la estabilidad de un complejo proteína-proteína. En la presente memoria potenciar o incrementar la "actividad biológica" pretende incluir un incremento de la actividad global o un incremento en cualquier componente de la actividad global. Debe entenderse que un péptido puede mostrar una actividad biológica

(tal como, por ejemplo, unirse simplemente a una diana) antes de la inserción en el marco de anticuerpo, y una actividad biológica diferente o incrementada (tal como, por ejemplo, una actividad agonista) tras la inserción en el marco del anticuerpo.

Los expertos en la materia han identificado y conocen muchos péptidos que podrían resultar beneficiados de su expresión en el contexto de una inmunoglobulina, por ejemplo los péptidos miméticos de TPO y EPO. Entre otros ejemplos se incluyen péptidos que se unen a receptores que resultan activados por la homodimerización inducida por ligando, incluyendo fragmentos activos que muestran actividad de G-CSF, actividad de GHR y actividad de prolactina, tal como describen Whitty y Borysenko, Chem. Biol. 6(4):R107-18 (abril 1999); entre otros ejemplos de péptidos adecuados se incluyen un mimético del factor de crecimiento nervioso procedente del asa CD, tal como se describe en Zaccaro et al., Med. Chem. 43(19):3530-40 (2000); un mimético de IL-2, tal como describen Eckenberg et al., J. Immunol. 165(8):4312-8 (2000); péptido 1 similar a glucagón, tal como describen Evans et al., Drugs R.D. 2(2):75-94 (1999); tetrapéptido I (D-lisina-L-asparaginil-L-prolil-L-tirosina), que estimula la proliferación de las células B activadas por mitógeno, tal como describen Gagnon et al., Vaccine 18(18):1886-92 (2000). También se contemplan los péptidos que muestran actividad antagonista de receptor. Por ejemplo, el péptido N-terminal de vMIP-II como antagonista de CXCR4 para la terapia anti-VIH, tal como se describe en Luo et al., Biochemistry 39(44):13545-50 (2000); ligando de péptido antagonista (AFLARAA) del receptor de la trombina para la terapia antitrombótica, tal como se describe en Pakala et al., Thromb. Res. 100(1):89-96 (2000); el antagonista CGRP (8-37) del receptor del péptido CGRP para atenuar la tolerancia a los narcóticos, tal como se describe en Powell et al., Br.

J. Pharmacol. 131(5):875-84 (2000); el antagonista del receptor (PTH)-1 de la hormona paratiroidea, conocido como péptido tuberoinfundibular (7-39), tal como se describe en Hoare et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 295(2):761-70 (2000); el factor de crecimiento opiáceo, tal como describen Zagon et al., Int. J. Oncol. 17(5):1053-61 (2000); los antagonistas de afinidad elevada de los receptores de tipo I de la interleuquina 1, tal como dan a conocer Yanofsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, páginas 7381-7386, julio de 1996, y Vigers et al., J. Biol. Chem. vol. 275, nº 47, páginas 36927-36933, 2000; y el péptido de unión ácido de factor de crecimiento fibroblástico, tal como se describe en Fan et al., IUBMB Life 49(6):545-48 (2000). También pueden descubrirse péptidos utilizando procedimientos que resultan familiares para los expertos en la materia. Con el fin de identificar una región de una proteína que se encuentra implicada en una función biológica específica, un reconocimiento de los fragmentos peptídicos más cortos que constituyen la proteína puede revelar el epítopo de péptido lineal responsable. Alternativamente, mediante el reconocimiento de bibliotecas de péptidos aleatorios puede descubrirse un péptido que represente un epítopo lineal óptimo o un epítopo discontinuo que imite la actividad de la proteína natural. Un procedimiento para la selección se denomina expresión peptídica en fago. En este enfoque, se genera una biblioteca de péptidos epítopos aleatorios de manera que los péptidos se encuentren presentes sobre la superficie de una partícula de bacteriófago. Estas colecciones o bibliotecas de péptidos pueden a continuación analizarse con el fin de identificar aquellas capaces de unirse a una proteína diana inmovilizada específica (Pasqualini, R. et al., J. Cell Biol. 130:1189-1196 (1995); Wrighton, N.C. et al., Science 273, páginas 458-463, 1996; Cwirla, S.E. et al., Science 276, páginas 1696-1699, 1997; Koivunen et al., J. Biol. Chem. 268, páginas 20205-20210, 1993; Koivunen et al., Bio/Technol, 13, 1995, páginas 265-270; Healy et al., Biochem. 34, páginas 3948-3955, 1995; Pasqualini et al., J. Cell Biol. 130, páginas 1189-1196, 1995). Resultan asimismo posible sistemas alternativos de selección de péptidos, incluyendo la expresión en superficie celular y la expresión ribosómica.

Los péptidos miméticos utilizados de acuerdo con la presente descripción presentan generalmente un número igual

o inferior al número de residuos aminoácidos que constituyen una región CDR, aunque podrían ser más largos.

Cualquier anticuerpo puede servir de secuencia estructural, sin embargo típicamente se seleccionan los anticuerpos humanos debido a que la terapia en humanos es uno de los objetivos finales. Los anticuerpos humanos o humanizados es menos probable que provoquen respuestas inmunológicas adversas en un paciente humano. El criterio principal de selección de un anticuerpo que sirva como estructura para la inserción de un péptido es que la sustitución de una o más CDR del anticuerpo con el péptido debe cambiar la especificidad de antígeno. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento Fab, scFv o F(ab')2 o parte de los mismos.

Alternativamente, una biblioteca de anticuerpos puede presentar una o más CDR de cadena pesada y/o ligera sustituidas con un péptido deseado. A continuación, la biblioteca resultante puede cribarse con el fin de identificar anticuerpos que presenten una actividad deseada. Debe entenderse que puede proporcionarse asimismo la aleatorización del péptido sustituido con el fin de generar una biblioteca de anticuerpos.

Un anticuerpo útil es el Fab antitoxoide del tétano (TT), debido a que es humano y debido a que la modificación del HCDR3 resulta suficiente para cambiar la especificidad de antígeno del anticuerpo (Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116, páginas 2161-2162, 1994, y Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, páginas 2529-2533, 1995).

La injertación de la secuencia de ADN del péptido de elección en un anticuerpo de manera que sustituya los CDR de un anticuerpo con la secuencia peptídica se lleva a cabo mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante conocidas por los expertos en la materia.

Entre los ejemplos de procedimientos que pueden utilizarse para injertar un péptido deseado que presenta actividad biológica en lugar de una región CDR se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la PCR por solapamiento, la

clonación de sitios de enzimas de restricción, la mutagénesis sitio-específica y medios completamente sintéticos. Para una descripción de las técnicas que implican PCR por solapamiento, ver, por ejemplo, el Ejemplo 1 en la presente memoria. La mutagénesis sitio-específica puede conseguirse de varias maneras. Una se basa en la mutagénesis Kunkel dut/ung (Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. vol. 82, páginas 488-92, (1985)). El kit de mutagénesis in vitro Muta-Gene se encuentra disponible de BioRad y se basa en dicha metodología (nº de cat. 1703581 o nº de cat. 170-3580). También se encuentran disponibles comercialmente varias herramientas de mutagénesis basadas en la amplificación por PCR, tales como el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuickChange de Stratagene y el kit de mutagénesis sitio-dirigida basado en PCR de ExSite. Se encuentra disponible otro procedimiento no PCR de Promega: el sistema de mutagénesis sitio-dirigida in vitro GeneEditor. También son bien conocidos, y se encuentran bien descritos, medios completamente sintéticos, por ejemplo en Deng et al., Methods Mol Biol. 51:329-42, (1995); Kutemeier et al., Biotechniques 17(2):242-246, (1994); Shi et al., PCR Methods Appl. 3(1):46-53, 1993, y Knuppik et al., J. Mol. Biol. 11:296(1):571-86, 2000. Además, los procedimientos indicados anteriormente utilizados para sustituir la totalidad o una parte de por lo menos una secuencia CDR pueden utilizarse para injertar un péptido deseado en el interior o contiguamente a por lo menos una secuencia nativa de CDR sin sustituir la secuencia CDR original. De esta manera, se forma un constructo de fusión CDR/péptido mimético biológicamente activo.

Se contempla que puedan añadirse secuencias flanqueantes a los extremos terminales carboxilo y/o amino del péptido biológicamente activo. Las secuencias flanqueantes pueden resultar útiles para reducir las restricciones estructurales sobre el péptido injertado con el fin de permitir que adopte más fácilmente una conformación necesaria para la actividad biológica. En una forma de realización preferente, una región flanqueante que incluye una prolina se une covalentemente al extremo carboxi-terminal del péptido biológicamente activo con el fin de crear un péptido biológicamente activo extendido con prolina.

En una forma de realización, puede generarse una región flanqueante mediante la aleatorización de dos posiciones aminoácidas en cada lado del injerto peptídico con el fin de determinar la mejor secuencia. De esta manera, puede generarse una biblioteca que presente miembros con múltiples secuencias variadas. Los constructos resultantes seguidamente se someten a ensayo para su actividad biológica, tal como se indica posteriormente, mediante, por ejemplo, técnicas de panning. Pueden generarse proteínas recombinantes que presenten aminoácidos aleatorios en posiciones específicas. Ello puede conseguirse modificando el ADN codificante. Al introducir aleatorización en una posición específica de codón de aminoácido, una estrategia de dopado preferente de desoxirribonucleótido es (NNK)x, con el fin de cubrir la totalidad de los 20 aminoácidos y de minimizar el número de codones de parada que se codifican. De acuerdo con ello, N puede ser A, C, G o T (nominalmente equimolares), K es G o T (nominalmente equimolares) y x típicamente es de aproximadamente hasta 5, 6, 7 u 8 o más, produciendo de esta manera bibliotecas de monopéptidos, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos, hexapéptidos, heptapéptidos y octapéptidos o más. La tercera posición también puede ser G o C, denominándose "S". De esta manera, NNK o NNS, (i) codifican todos los aminoácidos, (ii) codifican únicamente un codón de parada, y (iii) reducen el intervalo de preferencia codónica de 6:1 a 3:1. Existen 32 codones posibles resultantes del motivo NNK: 1 por cada 12 aminoácidos, 2 por cada 5 aminoácidos, 3 por cada 3 aminoácidos, y únicamente uno de los tres codones de parada. Entre otras alternativas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas:

(NNN)x, que podría proporcionar todos los posibles aminoácidos y todas las paradas;

(NNY)x, que elimina todas las paradas y todavía cubre 14 de los 20 aminoácidos;

(NNR)x, que cubre 14 de los 20 aminoácidos; y

(NNS)x, que cubre todos los 20 aminoácidos y únicamente una parada.

La tercera posición nucleótida en el codón puede construirse a medida utilizando cualquiera de las mezclas degeneradas conocidas. Sin embargo, el grupo NNK, NNN, NNY, NNR, NNS cubre las estrategias de dopaje utilizadas más frecuentemente y las utilizadas en la presente memoria.

La colección de anticuerpos construidos que se crean a lo largo de este procedimiento pueden cribarse para identificar aquellos que muestran propiedades del péptido, tales como, por ejemplo, anticuerpos expresados por fagos, esencialmente como han descrito Barbas, C.F., III, Kang, A.S., Lerner, R.A. y Benkovic, S.J., Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, páginas 79787982, 1991. Esta tecnología permite expresar anticuerpos recombinantes (como anticuerpos completos, Fab, F(ab')2

o scFv) sobre la superficie de un bacteriófago filamentoso. El mismo fago presentará en su interior los genes que codifican dicho anticuerpo específico.

Se contempla que pueda utilizarse en la presente memoria cualquier otro procedimiento conocido para introducir aleatorización en una secuencia. Por ejemplo, la PCR con predisposición a cometer errores puede introducir mutaciones aleatorias en las secuencias de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226(3):889-96, (1992)). En resumen, se realiza la PCR bajo condiciones que comprometen la fidelidad de la replicación, introduciendo de esta manera mutaciones aleatorias en secuencias, tal como conseguirían los expertos

en la materia. Tras la generación de estos mutantes aleatorios, pueden introducirse en formatos de expresión fágica, separarse por panning y de esta manera evaluarse para su actividad. De manera similar, pueden utilizarse bacterias particulares que se conoce proporcionan mutaciones aleatorias de los genes, tales como células competentes de Epicurian coli® XL-1-Red (comercializadas por Stratagene, La Jolla, CA), que producen dichas mutaciones durante la replicación de plásmido, con el fin de proporcionar mutantes aleatorios que se criban a continuación para actividad biológica según la presente invención.

Se contempla asimismo que pueda introducirse aleatorización en cualquier punto en la secuencia nucleótida tras la incorporación de un péptido activo en el anticuerpo o fragmento del mismo con el fin de alterar la actividad biológica global del mismo. De esta manera, no sólo pueden llevarse a cabo alteraciones de la actividad biológica de un péptido mimético causando mutaciones en la secuencia del péptido, sino que pueden incorporarse mutaciones en la estructura circundante, sometiendo a ensayo los constructos resultantes para alteraciones en la actividad biológica o en la expresión. En efecto, se contempla que puedan generarse y someterse a ensayo bibliotecas que presentan repertorios de múltiples constructos resultantes de dicha aleatorización.

Pueden utilizarse bibliotecas de cadenas únicas según la presente invención debido a que un polipéptido contiene un dominio de unión completo. La región variable de cadena ligera se separa de la región variable de cadena pesada mediante una región linker. La utilización de linkers cortos (<11 aminoácidos) favorece la formación de un complejo dimérico, en el que la VH de un ScFv se asocia con la VL de otra molécula ScFv y viceversa, estas moléculas se denominan diacuerpos (Kortt, A.A., Malky, R.L., Caldwell, J.B., Gruen, L.C., Ivanci, N., Lawrence, M.G. et al., Eur. J. Biochem. 221:151-157, 1994). Ello se debe a que el plegado del ScFv monomérico resulta alterado por los linkers de <11 aminoácidos (Alfthan, K., Takkinen, K., Sizman, D., Soderlund, H. y Teeri, T.T., Protein-Eng. 8:725-731, 1995). Los linkers más largos (>11 aminoácidos) favorecen el plegamiento del ScFv monomérico en un solo dominio de unión de antígeno, impidiendo de esta manera la formación de un dímero.

Un vector de expresión fágica útil es pRL4, también conocido como pComb 3X (ver la fig. 1). Este vector permite la expresión de productos quiméricos de expresión sobre la superficie de las partículas fagémidas empaquetadas. pRL4 es una versión modificada de pComb3H (Barbas, C.F. III y Burton, D.R., Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries, Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1994; Burton, D.R.; Barbas, C.F. III, Advances in Immunology 57:191-280, 1994; Lang, I.M., Chuang, T.L., Barbas, C.F. 30, Schleef, R.R., J. Biol. Chem. 271:30126-30135, 1996; Rader y Barbas, Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000. El diseño de pRL4 permite la dimerización de los dominios de unión de antígeno de scFv en la superficie del fago y en forma soluble, tal como se detalla posteriormente. Cuando el plásmido se transforma en un huésped bacteriano supE, tal como ER2537 (F' Sup E, New England Biolabs, Beverly, MA), la mutación ámbar se suprime en aproximadamente el cincuenta por ciento de las ocasiones. De esta manera, la mitad de los scFvs expresados se fusionan con la proteína del gen III del fago filamentoso (aminoácidos nº 230 a nº 406) y la otra mitad se termina inmediatamente antes del gen III para producir scFv soluble. Tanto el producto de fusión scFv-pIII como el scFv soluble presentan la secuencia de señal OmpA y resultarán transportados al periplasma, donde podrán formar complejos diméricos de scFv, denominados diacuerpos (Kortt, A.A., Malby, R.L., Caldwell, J.B., Gruen, L.C., Ivanci, N., Lawrence, M.C. et al., Eur. J. Biochem. 221:151-157, 1994). Los diacuerpos se espera que se plieguen de manera que la VH de un scFv se aparee con la VL de un segundo scFv-pIII, resultando en fragmentos divalentes de anticuerpo. En un huésped no supE, tal como TOP1OF' (InVitrogen, Carlsbad, CA), se reconoce el codón de parada ámbar, rindiendo diacuerpos de scFv soluble.

En el constructo final de expresión de cadena única en pRL4, los fragmentos de anticuerpo de cadena única se clonan corriente abajo del promotor lacZ de E. coli, del sitio de unión ribosómica y de la secuencia líder ompA. Estos elementos permiten la inducción de la expresión con IPTG, y la secreción hacia el exterior de la célula mediante la secuencia líder ompA cuando se expresan en la cepa supresora ER2537. Los fragmentos de cadena única se fusionan dentro del marco de lectura con las secuencias del gen III (gIII) del fago filamentoso (aminoácidos nº 230 a nº 406). El producto proteico de gIII es una proteína menor de cubierta que resulta necesaria para la infectividad. Con la inducción del promotor por IPTG, se sintetiza y se transporta la fusión anticuerpo-pIII de cadena única hasta el espacio periplasmático bacteriano. En el espacio periplasmático, se insertan en la membrana las proteínas de fusión scFv-genIII. Con la sobreinfección con fago ayudante, estos fragmentos se exportan fuera de la célula sobre la superficie del fago en forma de fragmentos pIII-anticuerpo. Entre otras proteínas posibles a utilizar para la fusión sobre la superficie de los fagémidos se incluyen la proteína filamentosa de cubierta pVIII y otras proteínas de cubierta.

Las bibliotecas de fragmento Fab, que mantienen el sitio nativo de reconocimiento de antígeno, resultan útiles para garantizar el mantenimiento de la afinidad.

En el constructo final de expresión Fab híbrido en pRL4, se clonan las cadenas ligera y pesada como un solo fragmento Sfil. De esta manera, se clonan los fragmentos de cadena ligera corriente abajo del promotor lacZ de E. coli, del sitio de unión ribosómica y de la secuencia líder ompA. Estos elementos permiten la inducción de la expresión con IPTG, y la secreción hacia el exterior de la célula mediante la secuencia líder ompA. Después de los fragmentos de cadena ligera se encuentra un codón de parada, un segundo sitio de unión ribosómica, la secuencia líder pelB de E. coli y la cadena pesada. Los genes híbridos de cadena pesada se encuentran fusionados dentro del

marco de lectura con secuencias del gen III (gIII) de fago filamentoso (aminoácidos nº 230 a nº 406). Se encuentra presente un codón de parada ámbar en el punto de fusión. En un huésped bacteriano supE, tal como ER2357 (New England Biolabs, Beverly, MA), se suprime la mutación ámbar. Al inducirse el promotor, se transcribe un solo mensaje policistrónico y se traduce como dos polipéptidos, una proteína de fusión de gen III de una cadena ligera y una cadena pesada. Tras la síntesis, los polipéptidos son transportados al espacio periplasmático bacteriano, dirigidos por las secuencias líder. En el espacio periplasmático, las proteínas de fusión cadena pesada-pIII se insertan en la membrana, y las cadenas ligera y pesada se asocian covalentemente mediante enlaces disulfuro, formando los sitios de unión a antígeno. Las secuencias humanas de región constante de CH1 y de CL incluyen las cisteínas que forman el enlace disulfuro entre las cadenas pesada y ligera. Tras las sobreinfección con fago ayudante, estos fragmentos se exportan hacia el exterior de la célula sobre la superficie del fago en forma de fusión Fab-cpIII. En un huésped no supE, tal como TOP1OF' (InVitrogen, Carlsbad, CA), se reconoce el codón de parada ámbar, rindiendo fragmentos Fab solubles. Entre las características importantes del sistema de expresión fágica pRL4 que se utiliza se incluyen una etiqueta His6 para la purificación, una etiqueta epítopo HA tras la cadena pesada, así como un codón de parada ámbar suprimible que se encuentra situado entre la cadena pesada y el gen fágico III. La etiqueta HA resulta reconocida por el anticuerpo HA.11 (Babco, Berkeley, CA) y por el anticuerpo 12CA5 (Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, Ind.). La etiqueta His6 permite la purificación por afinidad de los fragmentos de anticuerpo mediante cromatografía de níquel-quelato (Qiagen, Valencia, CA). El codón de parada ámbar permite, al suprimir la parada, la conversión rápida del producto de fusión Fab-cpIII (para la incorporación sobre la cubierta fágica) en Fab soluble, que se produce en un huésped bacteriano no supresor.

La selección implica aislar de la biblioteca los mejores candidatos que se unen específicamente a la molécula diana de los péptidos y expresar actividad biológica.

Puede producirse y concentrarse el fago que expresa los fragmentos de anticuerpo sobre su superficie de manera que pueda permitirse la unión a la molécula diana de todos los miembros de una biblioteca. La molécula diana puede inmovilizarse sobre una placa de microtitulación, sobre células completas, sobre las membranas de células completas, o presentarse en solución. Se eliminan por lavado los fagos Ab no específicos, y se liberan del antígeno las partículas fágicas unidas, con frecuencia mediante la utilización de un pH bajo. Los fagos Ab recuperados son infecciosos y por lo tanto pueden amplificarse en un huésped bacteriano. Típicamente, se llevan a cabo múltiples rondas de este tipo de selección. A continuación, pueden analizarse los clones individuales de fragmentos de anticuerpos, tales como Fabs o scFvs solubles, para la identificación de aquellos que reconocen específicamente la molécula diana.

Previamente a ninguna estrategia de selección, las bibliotecas iniciales se introducen por electroporación en las células huésped, tales como ER2537. Se cultivan bibliotecas hasta la etapa logarítmica y se sobreinfectan con fago ayudante, tal como VCSM13, un fago ayudante disponible comercialmente (Stratagene, La Jolla, CA). La sobreinfección proporciona los componentes fágicos restantes que resultan necesarios para empaquetar los plásmidos en partículas fagémidas. Alternativamente, puede utilizarse la expresión fágica sin la utilización de fago ayudante. Tras el cultivo durante la noche, los fagémidos presentes en el sobrenadante del cultivo se precipitan con polietilenglicol (PEG). Los fagos precipitados con PEG se utilizan en la separación por panning (fase sólidasuperficie celular, internalización y membrana), separación por FACS o separación magnética con el fin de purificar los anticuerpos de unión específica de los ligantes no específicos.

En el panning de base celular, se incuban las bibliotecas de anticuerpo-fago con las células diana, y se eliminan los fagos no adherentes mediante lavados múltiples. Un protocolo de panning típico es el siguiente:

1.: Bloqueo de partículas fágicas con PBS + BSA al 1% o FBS al 10% + leche en polvo al 4% + NaN3 (excepto cuando se someten a ensayo anticuerpos internalizados).

2.: Adición de células diana a los fagos bloqueados (aproximadamente 5 x 106 células).

3.: Mezcla y rotación lenta a 4ºC o a 37ºC.

4.: Lavado dos veces de las células con 1 ml de PBS/BSA al 1%/NaN3 helado o PBS/BSA al 1%/NaN3 a temperatura ambiente.

5.: Los anticuerpos específicos-fagos unidos a células pueden eluirse con un pH bajo, por ejemplo con ácido cítrico 76 mM, pH 2,5, en PBS durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente.

6.: Neutralización de los fagos eluídos con Tris-HCl 1 M, pH 7,4.

7.: Tras la neutralización, pueden utilizarse los anticuerpos-fagos para infectar bacterias ER2537 y amplificarlos en cultivo durante la noche para la siguiente ronda de panning.

Generalmente se llevan a cabo 3 ó 4 rondas de panning sobre cada biblioteca. Tras cada ronda de panning pueden llevarse a cabo ELISAs fágicas utilizando anticuerpo secundario disponible comercialmente (anticuerpo-HRP anti

M13 de oveja) o ELISAs de anticuerpos solubles utilizando un anticuerpo HA.11 disponible comercialmente (Babco, Berkeley, CA) que diferencia la etiqueta HA incorporada en cada anticuerpo de las secuencias PRL4, con el fin de obtener estimaciones del enriquecimiento en anticuerpos ligantes respecto a los no ligantes. Tras la última ronda de panning, pueden recolectarse los anticuerpos-fagos como colonias separadas en placas de ágar, cultivarse como anticuerpo monoclonal-fago y cribarse mediante ELISA para la identificación de ligantes específicos. También puede utilizarse el análisis FACS. Específicamente se infectan los anticuerpos-fagos en bacterias Top10F' y se siembran en placas para obtener colonias individuales. Las colonias individuales se recogen de las placas de ágar, se cultivan y se inducen con IPTG. Los anticuerpos solubles se criban mediante ELISA para la identificación de ligantes específicos. El cribado puede llevarse a cabo contra células vivas, contra células diana intactas levemente fijadas, o contra una o más proteínas recombinantes.

Los procedimientos para el panning de células completas se han descrito con anterioridad (Siegel, D.L., Chang, T.Y., Russell, S.L. y Bunya, V.Y., J. Immunol. Methods 206:73-85, 1997). Entre otras técnicas para la selección que pueden aplicarse se incluyen la separación celular activada por fluorescencia (FACS). Entre los procedimientos alternativos para la selección en bibliotecas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la expresión ribosómica y la hibridación de placas con un antígeno marcado.

Tras el panning para aislar los anticuerpos ligantes de afinidad elevada, pueden llevarse a cabo bioensayos para identificar cribados funcionales de anticuerpos agonistas. Con frecuencia la dimerización es un requisito para la activación de muchos receptores y, de esta manera, los bioensayos se centran en los anticuerpos agonistas que estimulan receptores a través de la estimulación de la dimerización. Tal como se ha indicado anteriormente, en el diseño de linkers se tiende a la multivalencia de las cadenas únicas. La multivalencia de los fragmentos Fab puede alcanzarse de varias maneras. Recientemente se ha informado en la literatura en varias ocasiones de éxito en la formación de fragmentos diméricos de anticuerpo aplicables a la expresión en fagos (DeKruif, J. y Logtenberg, T., J. Biol. Chem. 271:7630-7634, 1996; Pack, P. y Pluckthun, A. Biochemistry 31:1579-1584, 1992, y Holliger, P. y Winter, G., Current Opin. Biotech. 4:446-449, 1993). Los Fabs divalentes pueden crearse por lo menos de dos maneras. En un enfoque, la dimerización se consigue mediante la adición de un dominio de dimerización a pRL4, formando pRL8 (ver las figs. 6A-6C, 7 y 8). Existen varios dominios de dimerización (lexA, dedos de Zn, fos, jun, etc.) que pueden utilizarse en estos vectores para obtener la multivalencia de los fragmentos Fab. Se seleccionan los dominios de dimerización a partir de los siguientes, aunque sin limitarse a ellos: jun (DeKruif, J. y Logtenberg, T., J. Biol. Chem. 271:7630-7634, 1996; Kostelny, S.A., Cole, M.S. y Tso, J.Y., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992), la región LexA de dimerización (Kim, B. y Little, J.W., Science 255:203-206, 1992), el dominio de dimerización GCN4 de la levadura (van Heeckeren, W.J., Sellers, J.W., Struhl, K., Nucleic Acids Res. 20:3721-3724, 1992), la invertasa Gin del bacteriófago Mu (Spaeny-Dekking, L., Schlicher, E., Franken, K., van de Putte, P., Goosen, N., J. Bacteriol. 34:17791786, 1995), el dominio de dimerización de la proteína NTRC de E. coli (Klose, K.E., North, A.K., Stedman, K.M., Kustu, S., J. Mol. Biol. 241:233-245, 1994) y el dominio de dimerización ICP4 de HSV-1 (Gallinari, P., Wiebauer, K., Nardi, M.C., Jiricny, J., J. Virol. 68:3809-3820, 1994). Además, puede utilizarse un dominio dímero de temperatura elevada procedente de organismos térmicos (MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D., Biochemistry 37:100062-73, 1998, y MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D., Science 279:1958-61, 1998). Éstos son dominios funcionales que, cuando se incorporan en una molécula, permiten que se produzca la dimerización. Además, la dimerización puede conseguirse en células mediante la utilización de vectores IgG completos, o dominios de dimerización, tales como los dominios de dimerización CH3. Estos y otros dominios de dimerización, y su utilización para dimerizar proteínas, resultarán familiares a los expertos en la materia.

Son conocidos procedimientos adicionales que pueden utilizarse para generar constructos de anticuerpos que contienen por lo menos dos sitios de unión. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo creados mediante cada uno de estos enfoques podría utilizarse para someter a ensayo la actividad de anticuerpo agonista, tal como se describe en el Ejemplo 1 posteriormente para IgG completos producidos en células de mamífero. Entre estos procedimientos se incluye la dimerización química de Fab, la pegilación de Fab, la producción de Fab'2, la generación de IgG completos en células bacterianas, y la utilización de diacuerpos (scFvs). Resulta importante señalar que podría utilizarse como el producto terapéutico final cualquiera de las formas de anticuerpo generadas para el análisis de la actividad agonista.

También puede conseguirse la dimerización química utilizando una diversidad de reactivos químicos de reticulación. Por ejemplo, SMCC (succinimidil trans-4 (maleimidilmetil) ciclohexano-1-carboxilato), de Molecular Probes (Eugene, Oregon), nº de cat. S-1534. Este reactivo modifica los grupos amino primarios en el anticuerpo. Tras incubar el anticuerpo con SMCC a temperatura ambiente, se pasa la reacción por una columna PD-10. Este Fab derivatizado con maleimida puede añadirse a un segundo Fab o a un lote separado del mismo Fab tratado con TCEP [(Tris(2carboxietil)fosfina, hidrocloruro): Molecular Probes, nº de cat. T-2556] para reducir los grupos tiol a SH. La reacción de reducción se lleva a cabo en la oscuridad durante 15 minutos. La conjugación del Fab-maleimida y el Fab tiolreducido se produce a una proporción de 1:1. Se aíslan los dímeros pasando la reacción por una columna de filtración en gel sephadex 200. Para la dimerización pueden utilizarse otros linkers químicos conocidos por los expertos en la materia. Se ha descrito la producción de un Fab' que presenta un residuo cisteína adicional introducido en la región de bisagra, por ejemplo en la patente US nº 5.677.425 y en Carter et al., BioTechnology, vol. 10, febrero de 1992, páginas 163-167. El sitio tiol puede utilizarse para la conjugación a grupos, tal como el

polietilenglicol (PEG). Es conocida la tecnología de la pegilación, por ejemplo ver Koumenis et al., Int. J. Pharm. 198(1):83-95 (2000), lo que permite unir las dos moléculas Fab' entre sí utilizando el acoplamiento a PEG.

La tecnología para la producción bacteriana de Fab'2 implica la clonación de la región bisagra del IgG humano y opcionalmente parte de CH2, de manera que formen parte del Fd, que incluye cisteínas adicionales, y se describe, por ejemplo, en Better et al., PNAS USA 90(2):457-61, (1993). Los grupos tiol adicionales en la bisagra Fd pueden interaccionar y causar la dimerización de dos moléculas de Fab', creando una Fab'2. Fab'2 puede purificarse directamente a partir de las células bacterianas. Además, el Fab' no dimerizado de la bacteria puede aislarse y convertirse químicamente en Fab'2.

Tal como se ha indicado anteriormente, las regiones variables del anticuerpo pueden clonarse en forma de una sola cadena en la que la cadena ligera variable (VL) se encuentra conectada a la cadena pesada variable (VH) por una región linker. Si esta región linker es corta (por ejemplo de 5 a 7 aminoácidos), el plegamiento de scFv favorecerá la asociación de dos scFv en los que la VL de un scFv se aparea con la VH del segundo scFv. De esta manera, en el diacuerpo existen dos sitios de unión a antígeno.

Los constructos de anticuerpo que contienen dos sitios de unión pueden generarse utilizando cualquiera de dichos procedimientos con el fin de someter a ensayo la actividad agonista y/o utilizarse como el producto terapéutico final.

Tras las etapas de panning y de separación de las bibliotecas de Fab, se corta la biblioteca de moléculas sometidas a panning con SacI y SpeI y se clonan en pRL8. La subclonación en el vector pRL8, sea individualmente o en masa, tras la separación por FACS o panning permite la expresión de Fabs diméricos solubles ligantes para su análisis en bioensayos. Los fragmentos de anticuerpo son transportados en pRL8 hasta el espacio periplasmático, donde forman dímeros. La ventaja de este enfoque es que permite el panning de fragmentos de Fab monomérico, favoreciendo los Fabs de afinidad elevada.

Otro enfoque utiliza un anticuerpo secundario. pRL4 presenta la etiqueta decapéptido de la hemaglutinina que resulta reconocida por el anticuerpo HA.11, que se encuentra disponible comercialmente (Babco, Berkeley, CA). Los Fabs identificados en la separación FACS o en el panning a analizar en bioensayo se preincuban con HA.11, que promueve la dimerización, previamente a la adición a los bioensayos.

Tras la identificación de los scFvs o Fabs ligantes mediante panning u otro procedimiento de selección, los clones individuales, cada uno de los cuales expresa un fragmento único de anticuerpo dimerizado sobre la superficie fágica, se someten a ensayo para los efectos sobre la proliferación, la diferenciación, la activación o la supervivencia de las células diana. Además, se examinan los anticuerpos dimerizados solubles en bioensayo.

Ensayos biológicos para el cribado de actividad similar a TPO

1.: Ensayos de formación de colonias. Colonias megacariocíticas procedentes de médula ósea (kit Megacult C, de Stem Cell Technologies Inc., Vancouver BC, Canadá).

2.: Ensayos de proliferación. Proliferación de células Ba/F3 (Cwirla et al., Science vol. 276, páginas 1696-1699, 1997). Se estableció la línea celular Ba/F3-mpl (F. de Sauvage et al., Nature 369:533, (1994) mediante la introducción del ADNc que codifica el receptor cMpI completo en la línea celular Ba/F3 linfoblastoide murina dependiente de IL-3. La estimulación de la proliferación de las células Ba/F3-mpl en respuesta a diversas concentraciones de anticuerpos o de TPO se midió por la cantidad de 3H-timidina incorporada, tal como se ha descrito con anterioridad (F. de Sauvage et al., supra).

3.: Ensayos de fosforilación: fosforilación de JAK2 (Drachman et al., J. Biol. Chem. vol. 274, páginas 1348013484, (1999)).

4.: Ensayos basados en la transcripción: cotransfección transitoria del receptor cMpI de longitud completa con constructo de promotor de c-Fos-informador luciferasa. 24 horas tras la transfección, las células se sometieron a ayuno en FCS al 0,5% durante 24 horas. Se estimularon las células, se recolectaron tras 6 horas y se obtuvieron las lecturas de luciferasa (ver también el Ejemplo 1, sección de Ensayos biológicos).

Ensayos biológicos para el cribado de actividad similar a EPO

1.: Formación en metilcelulosa de colonias eritroides de médula ósea (Wrighton et al., Science vol. 273, páginas 458-463, 1996).

2.: Proliferación de células TF-1 (línea celular de la eritroleucemia humana). Las células TF-1 expresan tanto la forma de longitud completa como una forma truncada de Epo-R (J. Cell Physiol. vol. 140, páginas 323-334, 1989).

3.: El receptor EPO se acopla directamente a la JAK2 quinasa con el fin de inducir la fosforilación de la tirosina.

EPO induce cFos en las células TF-1. Activación transcripcional de c-Fos (Witthuhn et al., Cell vol. 74, páginas 227-236, (1993)).

Pueden utilizarse varios bioensayos en el cribado de alto rendimiento. A los expertos ordinarios en la materia les resultarán familiares estos ensayos y otros bioensayos adecuados. Se han desarrollado varios ensayos no radioactivos en los que puede analizarse la síntesis de ADN o la actividad enzimática. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de proliferación celular con MTT (Promega Corporation, Madison, WI), basado en un ensayo descrito por Mosmann (Mossmann, T., J. Immunol. Methods 65:55-57, 1983). Este protocolo es rápido y sencillo. En el ensayo, MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio), una sal de tetrazolio, se convierte en un producto formazán de color azul por la actividad deshidrogenasa mitocondrial en las células vivas. El contenido de deshidrogenasa, y por lo tanto la cantidad de producto de color que se produce, es proporcional al número de células. El producto de color es detectable en un lector de placas ELISA a 570 nm. Los ensayos se llevan a cabo por triplicado, en masa en placas de microtitulación de 96 pocillos. En resumen, se siembran las células diana en placas en alícuotas de 100 μl en medio de cultivo en las placas de 96 pocillos. Tras la adición de diversas concentraciones de anticuerpos, las células se incuban durante 48 a 72 horas a 37ºC y con 5% de CO2 en una atmósfera completamente humidificada. Se añade MTT a cada pocillo y se realiza un seguimiento de la proliferación utilizando el lector de placas ELISA.

Por ejemplo, en ensayos de proliferación con las células TF-1, las células bacterianas que contienen fagémidos que expresan anticuerpos se cultivan durante la noche a 37ºC en placas de 96 pocillos deep en 1 ml de un medio que es una mezcla de medio de células de mamífero y medio bacteriano (en el caso de las células TF-1, RPMI 2,7/SB 0,3/Carb. 100 μg/ml). Las células TF-1 constituyen una línea celular de la eritroleucemia de la médula ósea humana que responde a múltiples citoquinas (Kitamura, T., Tange, T., Terasawa, T., Chiba, S., Kuwaki, T., Miyagawa, K., Piao, Y.F., Miyazono, K., Urabe, A., Takaku, F., Cell Physiol. 140:323-334, 1989; Kitamura, T., Tojo, A., Kuwaki, T., Chiba, S., Miyazono, K., Urabe, A., Takaku, F., Blood 73:375-380, 1989; Kitamura, T., Takaku, F., Miyajima, A., Int. Immunol. 3:571-577, 1991). Al día siguiente, se subcultivaron los cultivos a 1/10 en placas nuevas durante la noche y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Tras la inducción con IPTG a 37ºC durante 4 horas, las placas se centrifugaron a 2000 rpm/15' a temperatura ambiente. Se filtraron 50 μl de cada sobrenadante de cultivo en bandejas-filtro de 96 pocillos (Millipore) introduciéndolos en placas de ensayo de 96 pocillos. Las células de mamífero se lavaron previamente para eliminar el factor de crecimiento y se resuspendieron a una concentración de 1 x 105 células/ml. Se añadieron 50 μl de células a cada pocillo. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC/incubador de 5% de CO2 durante 72 horas. A las 72 horas, se revelaron las bandejas mediante la adición de 40 μl de medio/MTS/PMS por pocillo. El MTS es una versión mejorada más soluble de MTT. Ambos ensayos se basan en la conversión celular de la sal de tetrazolio. Puede adquirirse un kit con MTS de ensayo de proliferación (número de catálogo G5421) de Promega, Inc. (Madison, WI). Las placas se mantuvieron a 37ºC/incubador de CO2 y se leyeron a DO490 tras 1 hora, tras 4 horas y tras 8 horas con un lector de microplacas.

Con frecuencia, las actividades de las citoquinas son sinérgicas. La sinergia puede manifestarse a través de la unión de ligandos a dos receptores diferentes que envían a continuación la señal correcta, o a través de un efecto de iniciación, en el que la interacción de ligando-receptor prepara a la célula a que responda a una segunda citoquina. Además, las citoquinas que actúan tempranamente en el desarrollo del linaje es más frecuente que sean sinérgicas que las citoquinas que actúan en etapas posteriores en una ruta de desarrollo. Por lo tanto, pueden utilizarse concentraciones subóptimas de factores de crecimiento en estos bioensayos con el fin de examinar la sinergia. Las condiciones para las concentraciones subóptimas se determinan para cada ensayo. Ello se lleva a cabo mediante la adición de diluciones seriadas de factores de crecimiento, individualmente y como mezcla, a los ensayos, y determinando los niveles por debajo de los cuales un solo factor no promueve una respuesta en comparación con la mezcla, y el nivel por debajo del cual la mezcla no promueve una respuesta en el bioensayo. También pueden añadirse a los bioensayos células estromales de médula ósea con el fin de proporcionar otros factores necesarios que podrían desempeñar un papel en una respuesta sinérgica.

Además, la proliferación celular puede examinarse mediante el seguimiento de la síntesis del ADN. Puede llevarse a cabo un ensayo colorimétrico no radioactivo que examina la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en formato de placa de microtitulación. En ésta, las células se cultivan en placas de 96 pocillos y se incuban con BrdU y concentraciones subóptimas de citoquinas. La cantidad de BrdU se determina tras el marcaje con un anticuerpo anti-BrdU marcado con peroxidasa. Los resultados finales se analizan utilizando un lector de placas ELISA a 405 nm.

También puede utilizarse un ensayo radioactivo de mitogénesis que mide la tasa de síntesis de ADN como indicación de la proliferación (Raines y Ross, Methods of Enzymol. 109:749-773, 1985). En estos ensayos, se examinan los cambios en la tasa de incorporación de [3H]-timidina en células diana. Nuevamente estos ensayos permiten el cribado simultáneo y rápido de muchos fragmentos de anticuerpo. Se han utilizado ampliamente como procedimiento conveniente para evaluar los efectos de estimulación y de inhibición del crecimiento de muchas células diferentes. Las células se cultivan en suspensión hasta que alcanzan una tasa de crecimiento exponencial. A continuación, se lavan las células del medio en el que se han cultivado, y se siembran nuevamente en placas con medio fresco. Se introducen alícuotas de las células en placas de 96 pocillos en un volumen total de 100 μl a una concentración de aproximadamente 1-2 x 105 células/ml. Se añaden las diluciones de sobrenadante de fago,

anticuerpos de Fab o ScFv dimerizado soluble y las células se incuban durante 18 a 48 horas en un incubador con gas CO2 a una temperatura de 37ºC. Tras la incubación, se añade a cada pocillo [3H]-timidina (937 kBq) y se incuban durante 4 horas más. A continuación se extraen las células del incubador y se cuentan directamente en un contador de centelleo de microplacas de laboratorio, tal como Packard Top Count NXT Instrument (Packard, Meriden, CT). Alternativamente, las células pueden transferirse seriadamente a filtros GF/C en un recolector Millipore de células (Millipore, Bedford, MA) o aparato similar. Seguidamente se determina la radioactividad asociada al material insoluble en ácido retenido sobre el filtro. Se aplican diluciones de factores de crecimiento disponibles comercialmente a los pocillos de control positivo. Los controles negativos incluirían sobrenadantes de células que portan plásmidos sin inserción o anticuerpos irrelevantes tratados de manera similar. Las actividades estimuladoras relativas de crecimiento del estándar y de los diluyentes de los sobrenadantes fágicos a ensayo se compararon con el fin de cuantificar la actividad estimuladora de crecimiento de la muestra.

La activación puede analizarse sometiendo a ensayo segundos mensajeros o mediante ensayos transcripcionales.

La supervivencia puede analizarse, por ejemplo, realizando un seguimiento de la apoptosis utilizando ensayos tales como los ensayos túnel o mediante otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

Entre otros ensayos útiles para analizar la transducción celular de señales, la actividad de las quinasas y fosfatasas y en última instancia las actividades celulares como resultado de la actividad agonista, se incluyen la medición de la producción de segundos mensajeros, por ejemplo de AMPc, Ca++, diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). La medición de los picos en la concentración intracelular del calcio, del pH intracelular y del potencial de membrana en ensayos de cribado de alto rendimiento puede llevarse a cabo utilizando instrumentos tales como el FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se encuentran disponibles varias sondas fluorescentes para el examen de las concentraciones de los segundos mensajeros (Molecular Probes, Eugene OR). La medición de las concentraciones de segundos mensajeros también puede llevarse a cabo a nivel de células individuales (DeBernardi, M.A. y Brooker, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4577-4582, 1996). Además, resultaran útiles los ensayos que examinan otros sucesos de señalización, tales como la fosforilación, la apoptosis o los niveles de ARN o de proteína de genes específicos. Por ejemplo, se ha demostrado que la mayoría de las citoquinas activan el enzima PI-3K (revisado en Silvennoinen, O., Ihle, J.N., Signaling by the Hematopoietic Cytokine Receptors, R.G. Landes company, Austin, TX, 1996). Además, la familia Jak de tirosina quinasas se ha demostrado que está constituida por mediadores cruciales para la señalización por receptores de citoquina (Ihle, J.N., Witthuhn, B.A., Quelle, F.W., Annu. Rev. Immunol. 13:369-398, 1995). Además, se activan varias otras tirosina quinasas, por ejemplo los miembros de la familia Src, en respuesta a determinados estímulos de citoquina. El ARN o las proteínas, por ejemplo c-Jun y c-Fos, resultan regulados rápida y transitoriamente positivamente tras la estimulación por las citoquinas, mientras que la inducción de c-Myc es más lenta. Estas proteínas resultan necesarias para la transición G1 y la proliferación (revisadas en Silvennoinen, O., Ihle, J.N., Signaling by Hematopoietic Cytokine Receptors, R.G., Landes Company, Austin, TX, 1996). Podrían utilizarse cribados de alto rendimiento que detectan incrementos de estos transcritos.

En los ensayos transcripcionales, se observan los cambios en la transcripción de genes específicos tras la exposición de las células a un factor de crecimiento o a un mimético del mismo (anticuerpo agonista o inhibidor). Por ejemplo, en un ensayo de lectura de myc, las células, tales como la línea celular mixta de FDCP dependiente de IL3, se somete a ayuno de factor de crecimiento IL-3 durante 8 horas, seguido de la exposición a miméticos de factor de crecimiento o a factores de crecimiento nativos durante 2 horas a 37ºC. Transcurrido este tiempo, se recolectan las células. Se aísla el ARN, y se llevan a cabo reacciones en cadena de transcriptasa inversa-polimerasa (RT-PCR) con cebadores específicos para el gen myc. Las reacciones de RT-PCR se someten a electroforesis en geles horizontales de agarosa para la cuantificación del producto de PCR. En este caso, se está realizando el seguimiento de la expresión de un solo gen.

Alternativamente, puede llevarse a cabo el seguimiento de los cambios en la expresión de los genes utilizando tecnología CHIP, pueden identificarse anticuerpos agonistas bajo condiciones de elevada sensibilidad de las sondas y en un intervalo dinámico. De esta manera, pueden analizarse hasta 10.000 o más para cambios de expresión. Entre los genes deseados que podrían seguirse se incluyen c-myc, c-jun, NF-KB, entre otros. Estos genes se encuentran situados corriente abajo de diversas rutas de transducción de señales y su expresión debería cambiar con la respuesta mitogénica. En un tipo de CHIP disponible comercialmente (Affymetrix, Santa Clara, CA), pueden imprimirse sobre una superficie de vidrio los oligonucleótidos de los genes de ensayo deseados. Se exponen las células diana para analizar los anticuerpos agonistas. El ARN se aísla de las células expuestas a los anticuerpos agonistas de ensayo, se copia a ADNc y se transcribe in vitro en presencia de biotina. Se utiliza la hibridación del ARNm biotinilado transcrito in vitro como sonda en las series. A continuación, se escanean los chips para determinar los genes que muestran incrementos de la transcripción al exponerlos a anticuerpos agonistas de ensayo. En otra versión de la tecnología CHIP (Incyte, Palo Alto, CA), la cantidad de ADN no se normaliza sobre el vidrio, por lo tanto se prepara una hibridación competitiva. Se aísla el ARN de las células antes y después de la exposición al agonista. Se prepara ADNc a partir de cada muestra, de manera que una reacción de ADNc incorpora un marcaje, por ejemplo Cy-3, y la otra población de ADNc incorpora un marcaje diferente, por ejemplo Cy-5. Las señales se detectan y se comparan en un escáner láser dual para la obtención de imágenes.

También pueden utilizarse ensayos visuales, tales como los ensayos tradicionales de formación de colonias en metilcelulosa (Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canadá). En estos ensayos, se registra el crecimiento de colonias y los cambios morfológicos con un microscopio óptico. El examen visual de los efectos de proliferación o de diferenciación en cultivos de ágar semisólido o en metilcelulosa puede llevarse a cabo utilizando la línea celular apropiada (Williams Hematology 5, editores E. Beutler, M.A. Lichtman, B.S. Coller, L.T.J. Kipps, McGraw-Hill Inc., páginas L22-L26, 1995). La adición de metilcelulosa permite que la progenie clónica de una sola célula progenitora se mantenga junta y facilita el reconocimiento y la enumeración de colonias separadas. Se añaden todos los componentes necesarios a un medio básico de metilcelulosa (tal como MDM de Iscove, BSA, (-mercaptoetanol, Lglutamina) excepto los suplementos de factor estimulante de colonias y los anticuerpos de ensayo (sobrenadantes fágicos, anticuerpos solubles)) con el fin de observar si pueden sustituir los factores de crecimiento. Las células en el cultivo en metilcelulosa se incuban durante 10 a 12 días tras la adición de anticuerpos en una atmósfera humidificada a 37ºC de 5% de CO2 en aire. Tras 10 a 12 días de incubación, se cuentan las colonias con un microscopio invertido. Tras otros 8 a 10 días, se cuentan las colonias nuevamente. Se llevan a cabo comparaciones entre los medios que contienen anticuerpos y los controles con factores de crecimiento y sin ellos. Además, pueden recolectarse colonias de la metilcelulosa y examinarse células individuales citológicamente utilizando la tinción de Wright (ver Atlas of Hematological Cytology, F.G.J. Hayhoe y R.J. Flemans, Wiley-InterScience, 1970).

Pueden calcularse las afinidades de unión de los receptores (Lfas y Johnson, 1990) a partir de la asociación de las constantes de tasas de asociación y disociación medidas utilizando un sistema de resonancia de plasmón superficial BIACORE (Pharmacia Biosensor). Se activa un chip biosensor para el acoplamiento covalente del receptor gD-mpI utilizando hidrocloruro de N-etil-N'''-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia Biosensor). Se intercambia el tampón del gD-mpI a tampón de acetato sódico 10 mM (pH 4,5) y se diluye hasta aproximadamente 30 μg/ml. Se inyecta una alícuota (5 μl) a un caudal de 1 μl/min con el fin de conseguir aproximadamente 400 unidades de respuesta (RU) de proteína unida. Finalmente, se inyecta etanolamina 1 M como agente de bloqueo. Para las mediciones de cinética, se inyectan 1,5 diluciones seriadas de anticuerpo en tampón PBS/Tween (0,05% Tween-20 en solución salina tamponada con fosfato) a 25ºC a un caudal de 20 μl/min. Las constantes de equilibrio de disociación, Kd S, de las mediciones de SPR se calculan como koff/kon. Las desviaciones estándar, son para kon y soff para koff, típicamente se obtienen a partir de mediciones con >4 concentraciones de proteína (kon) o con >7 concentraciones de proteína (koff). Los datos de disociación se ajustan a un modelo simple AB-A+B con el fin de obtener koff ± s.e. (error estándar de las mediciones). Se calcula la constante de pseudo-primer orden (ks) para cada curva de asociación y se grafica como función de la concentración de proteína con el fin de obtener kon ± s.e. (error estándar del ajuste).

Para la conversión de los clones de anticuerpo en IgG completos, las regiones codificantes para las cadenas ligera y pesada, o los fragmentos de las mismas, pueden clonarse separadamente desde un vector bacteriano e introducirse en uno o más vectores de mamífero. Puede utilizarse un solo sistema de vector, tal como pDR1 o sus derivados, para clonar los cassettes de tanto cadena ligera como pesada en el mismo plásmido. Alternativamente, pueden utilizarse vectores de expresión dual en los que las cadenas pesada y ligera se producen en plásmidos separados. Resulta necesario que las secuencias de señal de mamífero ya se encuentren presentes en el vector o vectores finales o unidos al extremo 5' de las inserciones de cadena ligera o pesada de ADN. Ello puede conseguirse mediante la transferencia inicial de las cadenas en un vector o vectores lanzadera que contengan las secuencias líder de mamífero apropiadas. Tras la digestión con enzimas de restricción, se introducen las regiones de cadena ligera o de cadena pesada, o los fragmentos de las mismas, en el vector o vectores finales en los que se proporcionan las regiones constantes restantes para IgG1 con o sin intrones. En algunos casos en los que se utilizan intrones, el diseño de cebador para la amplificación por PCR de las regiones variables de cadena ligera y pesada desde pRL4 pueden exigir la inclusión de sitios donadores de corte de exones con el fin de obtener el corte y empalme apropiados y la producción de los anticuerpos en las células de mamífero.

Con cualquiera de los sistemas de expresión de vectores (plásmido único o dual), puede regularse la producción de cadenas pesada y ligera de anticuerpo con promotores que funcionan en las células de mamífero, tales como, aunque sin limitarse a ellos, los promotores de CMV, de SV40 o de IgG. Además, el vector o vectores contendrá un marcador seleccionable de crecimiento en bacterias (tal como, aunque sin limitarse a ellos, resistencia a la ampicilina, al cloranfenicol, a la canamicina o a la zeocina). También pueden encontrarse presentes en el vector o vectores IgG, marcadores seleccionables para células de mamífero (tales como, aunque sin limitarse a ellos, DHFR, GS, gpt, resistencia a la neomicina o a la higromicina), o pueden proporcionarse en un plásmido separado mediante cotransfección.

Los expertos en la materia mediante técnicas conocidas serán capaces de sintetizar anticuerpos en otros organismos, tales como levaduras, mamíferos, insectos y plantas (Carlson, J.R. y Weissman, I.L., Mol. Cell. Biol. 8:2647-2650, 1988; Trill, J.J., Shatzman, A.R., Ganguly, S., Curr. Opin. Biotechnol. 6:553-560, 1995; Hiatt, A., Cafferkey, R., Bowdish, K., Nature 342:76-78, 1989).

Tal como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos preparados de acuerdo con la invención en la presente memoria proporcionan una vida media incrementada (duración de acción) a la actividad de los péptidos o miméticos de péptidos de tamaño reducido, tales como el mimético de TPO indicado en la presente memoria. En otro aspecto, la vida media en suero misma de un anticuerpo puede prolongarse preparando derivados que se encuentren

pegilados. Ver, por ejemplo, Lee et al., Bioconjug. Chem. 10(6):973-81, (1999). Otra ventaja, por ejemplo, del anticuerpo de mimético de TPO indicado en la presente memoria es que el tratamiento normal con TPO puede resultar en la generación de anticuerpos neutralizantes de TPO en los pacientes que interfieren con la actividad del TPO presente naturalmente en los mismos. El presente anticuerpo de mimético de TPO reduce sustancialmente la probabilidad de que se produzca una respuesta inmunológica perjudicial contra el TPO nativo debido a que presenta una secuencia aminoácida diferente.

Las moléculas dentro del alcance de las reivindicaciones pueden utilizarse en procedimientos diagnósticos en los que los anticuerpos o fragmentos de los mismos se encuentran conjugados con marcadores detectables o en los que se utilizan como anticuerpos primarios junto con anticuerpos secundarios que se encuentran conjugados con marcadores detectables. Entre los marcadores detectables se incluyen los marcajes radioactivos y no radioactivos y son bien conocidos por los expertos en la materia. Los marcajes no radioactivos comunes incluyen los enzimas detectables, tales como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina y las moléculas fluorescentes. Las moléculas fluorescentes absorben luz a una longitud de onda y la emiten a una longitud de onda diferente, permitiendo de esta manera la visualización utilizando, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia. Los espectrofotómetros, microscopios de fluorescencia, lectores de placa fluorescentes y los separadores de flujo son bien conocidos y con frecuencia se utilizan para detectar moléculas específicas que se han convertido en fluorescentes mediante su unión covalente con un pigmento fluorescente. Los fluorocromos, tales como la proteína fluorescente verde, los mutantes desplazados al rojo de la proteína fluorescente verde, el amino ácido acético coumarina (AMCA), el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el isotiocianato de tetrametilcodamina (TRITC), rojo de Texas, Cy3.0 y Cy5.0 son ejemplos de marcajes útiles.

Las moléculas pueden utilizarse en estrategias de aislamiento celular, tales como la separación celular activada por fluorescencia (FACS) si se utilizan marcadores fluorescentes. En la separación celular activada por fluorescencia se separan electrónicamente células etiquetadas con moléculas fluorescentes en un citómetro de flujo, tal como un citómetro FACS IV de Becton-Dickinson (San Jose, California) o en un instrumento equivalente. Las moléculas fluorescentes son anticuerpos que reconocen antígenos de superficie celular específicos. Los anticuerpos se encuentran conjugados con marcadores fluorescentes, tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la ficoeritrina (PE).

También resulta posible la separación magnética. En los procedimientos de separación magnética, el anticuerpo se une directa o indirectamente a microperlas magnéticas. Las células se recubren previamente con anticuerpos que reconocen las moléculas de superficie celular, por ejemplo receptores implicados en la proliferación, diferenciación, activación o supervivencia. Los anticuerpos se unen a perlas magnéticas conjugadas con una inmunoglobulina secundaria que se une al anticuerpo primario que expresa el péptido, tal como a la etiqueta molecular HA introducida en cada anticuerpo. A continuación se retirar las células con un imán. La separación magnética puede ser una selección positiva, en la que las células de interés se encuentran unidas al anticuerpo y por lo tanto al imán, o una selección negativa, en la que las células no deseadas se aíslan sobre el imán.

Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos marcados radioactivamente con fines diagnósticos.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos dados a conocer en la presente memoria resultan útiles para la amplificación de una diversidad de tipos celulares clínicamente relevantes. El tratamiento puede ser in vivo o ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos agonistas resultan útiles para tratar pacientes que padecen una deficiencia en una población de células provocada por una enfermedad, un trastorno o un tratamiento relacionado con, por ejemplo, la supresión de la hematopoyesis, en el que se encuentra presente un número inferior al normal de células de una linaje o linajes determinados. La descripción siguiente representa únicamente algunos ejemplos de las condiciones que pueden tratarse con los anticuerpos que contienen péptidos biológicamente activos dados a conocer en la presenta memoria, los expertos en la materia serán capaces de identificar otras enfermedades y condiciones que se beneficiarían de este tratamiento. Por ejemplo, los pacientes infectados por VIH, los pacientes sometidos a quimioterapia, los pacientes de trasplante de médula ósea, los pacientes de trasplante de células madre, y los pacientes que padecen trastornos mieloproliferativos, muestran niveles inferiores a los normales de linajes hematopoyéticos específicos.

La trombocitopenia puede ser un resultado de la quimioterapia, del trasplante de médula ósea o de una enfermedad crónica, tal como la trombocitopenia idiopática (ITP), todos los cuales resultan en niveles reducidos de plaquetas. Los presentes anticuerpos miméticos de TPO pueden utilizarse para tratar estos pacientes.

Los pacientes sometidos a diálisis renal con frecuencia padecen de anemia relacionada con el tratamiento, con niveles inferiores a los normales de glóbulos rojos. En la anemia aplásica, la supresión de la médula ósea puede provocar pancitopenia o puede afectar únicamente a los glóbulos rojos, a los glóbulos blancos o a las plaquetas. Los anticuerpos que se dan a conocer incrementan el armamento de agentes terapéuticos para éstas y otras enfermedades y trastornos caracterizados por deficiencias en poblaciones celulares específicas, tales como las células hematopoyéticas.

Las moléculas dentro del alcance de la invención que se reivindica también pueden utilizarse para la proliferación y diferenciación ex vivo de células. Ello resulta útil con fines de terapia génica, por ejemplo para enfoques tradicionales con vectores víricos, y para los trasplantes autólogos de médula ósea.

Además, determinados anticuerpos según la presente invención pueden marcarse radioactivamente para la radioinmunoterapia o conjugarse con toxinas con el fin de administrar las toxinas a tipos celulares específicos, resultando en la eliminación de estas células.

Puede utilizarse un anticuerpo agonista c-mpl biológicamente activo capaz de estimular la proliferación, diferenciación y maduración de las células hematopoyéticas en una preparación o formulación farmacéutica estéril con el fin de estimular la actividad megacariocitopoyética o trombopoyética en pacientes que padecen de trombocitopenia debido a una producción alterada, al secuestro o al incremento de la destrucción de las plaquetas. La hipoplasia de la médula ósea asociada a trombocitopenia (por ejemplo la anemia aplásica secundaria a quimioterapia o al trasplante de médula ósea) puede tratarse con efectividad con los anticuerpos dados a conocer, así como trastornos tales como la coagulación intravascular diseminada (DIC), la trombocitopenia inmunológica (incluyendo la ITP inducida por VIH y la ITP no inducida por VIH), la trombocitopenia idiopática crónica, la trombocitopenia congénita, la mielodisplasia y la trombocitopenia trombótica.

Los anticuerpos agonistas c-mpl biológicamente activos dados a conocer en la presente memoria que contienen el péptido mimético de TPO pueden utilizarse de la misma manera y para las mismas indicaciones que la trombopoyetina (TPO). La trombopoyetina (TPO) estimula la megacariocitopoyesis y la producción de plaquetas. Estos anticuerpos es previsible que presenten una vida media más prolongada que la TPO nativa o pegilada y de esta manera se utilizan en indicaciones en las que se requiere una vida media más larga.

Un ejemplo de un ensayo que resulta útil para determinar la actividad de los miméticos de TPO es el ensayo de trombocitosis de rebote, que implica la administración a ratones de una sola inyección de suero de plaquetas de cabra antirratón con el fin de inducir trombocitopenia aguda (día 0). En los días 5 y 6, los ratones se inyectan con las muestras de ensayo. En el día 8, se realizan recuentos de plaquetas (incorporación de 35S en las plaquetas).

Los anticuerpos miméticos de EPO en la presente memoria estimulan la hematopoyesis de una manera similar a la EPO natural. Dicha terapia resulta útil en el tratamiento de afecciones en las que la producción de glóbulos rojos está comprometida tal como la insuficiencia renal crónica. La actividad biológica de los anticuerpos miméticos de EPO puede ser determinada utilizando los ensayos in vitro o in vivo.

Un ensayo in vitro mide el efecto de los anticuerpos miméticos de la eritropoyetina sobre la eritropoyesis en las células esplénicas de ratón intactas según el procedimiento de Krystal, G., Exp. Hematol. 11:649-660 (1983). Para cribar varias formas de realización de los anticuerpos miméticos de EPO para la actividad, por ejemplo, in vivo o in vitro, los anticuerpos miméticos de EPO pueden ser evaluados para el grado de eritropoyesis o unión al receptor. Las pruebas para determinar la actividad biológica son bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la actividad biológica de la eritropoyetina puede ser medida como se describe, por ejemplo, en la patente US nº

5.614.184 y la patente US nº 5.580.853.

La vía de administración del anticuerpo está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo la inyección

o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, subcutánea, intraocular, intraarterial, intratecal, por inhalación o intralesional, tópica o mediante sistemas de liberación sostenida, tal como se indica posteriormente. El anticuerpo se administra preferentemente continuamente mediante infusión o mediante inyección en bolo. Pueden administrar los anticuerpos de manera local o sistémica.

Los anticuerpos de la invención pueden prepararse en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Pueden encontrarse técnicas para la formulación y para la administración de los compuestos de la solicitud instantánea en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Esta composición terapéutica puede administrarse intravenosamente o a través de la nariz o por los pulmones, preferentemente como un aerosol líquido o en polvo (liofilizado). La composición puede asimismo administrarse parenteral o subcutáneamente según se desee. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica debe ser estéril, encontrarse libre de pirógenos y en una solución parenteralmente aceptable, con atención a pH, isotonicidad y estabilidad. Estas condiciones son conocidas por los expertos en la materia.

En resumen, las formulaciones de dosificación de los compuestos de la presente invención se preparan para el almacenamiento o administración mediante mezcla del compuesto que presenta el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables. Estos materiales no son tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones utilizadas, y pueden incluir tampones, tales como Tris HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes, tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), tales como poliarginina, proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de

azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones, tales como sodio y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.

Cuando se utilizan para la administración in vivo, la formulación de anticuerpo debe ser estéril y puede formularse de acuerdo a la práctica farmacéutica convencional. Ello se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, previamente o posteriormente a la liofilización y reconstitución. El anticuerpo se almacenará habitualmente en forma liofilizada o en solución. Pueden desearse otros vehículos, tales como los aceites vegetales de origen natural, tales como el aceite de sésamo, de cacahuete, o el aceite de semilla de algodón

o un vehículo graso sintético, tal como oleato de etilo o similar. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y similares de acuerdo a la práctica farmacéutica aceptada.

Las composiciones farmacéuticas que resultan adecuadas para la utilización incluyen composiciones en las que se encuentran contenidos uno o más anticuerpos diseñados racionalmente en una cantidad que resulta efectiva para conseguir el fin pretendido. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad de anticuerpo que resulta efectiva para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de la enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto bajo tratamiento. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva se encuentra completamente dentro de los conocimientos de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la descripción detallada que se proporciona en la presente memoria. Las dosis terapéuticamente efectivas pueden determinarse mediante la utilización de procedimientos in vitro e in vivo.

La cantidad efectiva de anticuerpo que debe utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del paciente. Además, el médico responsable toma en consideración diversos factores conocidos con el fin de modificar la acción de los fármacos, incluyendo la severidad y tipo de enfermedad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento y vía de administración, otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. De acuerdo con ello, resultará necesario para el terapeuta titular la dosis y modificar la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente el médico administrará el anticuerpo hasta alcanzar una dosis que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se sigue fácilmente utilizando ensayos convencionales.

Para cualquier anticuerpo que contenga un péptido, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluya la EC50 según se determine en cultivo celular (por ejemplo la concentración de la molécula de ensayo que estimule o inhiba la proliferación o diferenciación celular). Esta información puede utilizarse para determinar con mayor exactitud las dosis útiles en el ser humano.

Puede determinarse la toxicidad y eficacia terapéutica de las moléculas de anticuerpo indicadas en la presente memoria mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y los efectos terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción entre la LD50 y la ED50. Las moléculas que muestran índices terapéuticos elevados resultan preferentes. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y de los estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis para la utilización en el ser humano. Las dosis de estas moléculas se encuentra preferentemente dentro de un intervalo que concentraciones circulantes que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y de la vía de administración utilizada. El médico individual puede seleccionar la formulación exacta, la vía de administración y la dosis en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1, 1975).

La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma del anticuerpo que resulten suficientes para estimular o inhibir la proliferación o diferenciación celulares o concentración efectiva mínima (MEC). La MEC varía para cada anticuerpo pero puede estimarse a partir de datos in vitro utilizando ensayos descritos. Las dosis necesarias para conseguir la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Sin embargo, pueden realizarse ensayos de HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma.

También pueden determinarse los intervalos de dosificación utilizando el valor de MEC. Las moléculas de anticuerpo deben administrarse utilizando un régimen que mantenga los niveles en plasma por encima de la MEC durante el 10 a 90% del tiempo, preferentemente durante 30 a 90% del tiempo, y todavía más preferentemente entre el 50 y el 90% del tiempo.

En los casos de administración local o de incorporación selectiva, la concentración local efectiva del anticuerpo puede no estar relacionada con la concentración en plasma.

Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 μg/kg y 1.000 mg/kg o más, dependiendo de los factores indicados anteriormente. Típicamente el médico administrará la molécula hasta que se

alcance una dosis que consiga el efecto deseado. El seguimiento del progreso de esta terapia se realiza fácilmente mediante ensayos convencionales.

Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis candidata inicial para la administración en el paciente puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 0,001 mg/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 0,01 mg y 100 mg/kg, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,010 y 20 mg/kg del anticuerpo agonista, dependiendo, por ejemplo, de si se administra en una o más ocasiones separadas o mediante infusión continua. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días

o más tiempo, dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad o se consigue la mejora deseada en la condición del paciente. Sin embargo, también pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se incluyen únicamente a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Construcción de biblioteca de secuencias miméticas de TPO injertadas en una región marco de un anticuerpo humano

Se injertó un péptido agonista mimético de TPO, IEGPTLRQWLAARA (SEC ID nº 1) en la CDR3 de cadena pesada (HCDR3) del Fab antitoxoide del tétano (TT), en sustitución de la secuencia HCDR3 completa GCTIFGVTMGYYAMDV (SEC ID nº 4). La figura 2A muestra la secuencia del anticuerpo humano del toxoide del tétano utilizado. Se adoptaron dos enfoques para la injertación. En el primer enfoque, el péptido agonista se insertó en la región HCDR3 con dos glicinas flanqueantes a cada lado. Ello con el fin de reducir las restricciones estructurales sobre el péptido injertado de manera que pudiese adoptar más fácilmente la conformación necesaria. En el segundo enfoque, se aleatorizaron dos posiciones aminoácidas en cada lado del péptido injertado con el fin de que se pudiese conseguir la mejor presentación del péptido (figura 3). Se adoptaron estos dos enfoques con el fin de determinar si el péptido resultaba suficiente por sí solo o si se requerían residuos específicos para la presentación apropiada del péptido agonista en la estructura del anticuerpo, proporcionando de esta manera su actividad al anticuerpo.

La figura 4 ilustra de manera general el procedimiento de construcción de una biblioteca. En resumen, el Fab antitoxoide del tétano se amplificó como dos fragmentos. El fragmento A se amplificó utilizando un cebador directo (N-Omp: 5' TAT CGC GAT TGC AGT GGC ACT GGC 3') (SEC ID nº 5) que se apareó con el líder OmpA de la cadena ligera en combinación con un cebador backward (TPO-CDR3-B: 5' GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT YNN YNN TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEC ID nº 6) que se apareó en el extremo de la región marco (FR) 3 de la cadena pesada. El cebador reverso contenía una cola que codificaba el nuevo CDR3. El fragmento B se generó utilizando un cebador directo (TPO-CDR3-F: 5' CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG NNY NNY TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEC ID nº 7) que se apareó en FR4 y el cebador reverso Seq-G3Rev (5' TCA AAA TCA CCG GAA CCA GAG C 3') (SEC ID nº 8) que se apareó en la región del gen III del plásmido, corriente abajo de la señal de parada de la cadena pesada. El cebador TPO-CDR3-F también presentaba una cola de bases que codificaba la nueva región CDR3. Se utilizó la Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer) en el siguiente programa de PCR: 94ºC durante 30 segundos, a continuación 30 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 15 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, seguido de un periodo de extensión a 72ºC durante 10 minutos, y mantenimiento a 4ºC. Tras la generación de los fragmentos mediante PCR y la purificación en gel, se combinaron para una PCR de extensión por solapamiento. Las nuevas regiones CDR3 codificadas por el cebador eran complementarias y proporcionaban 23 bases de solapamiento. Los cebadores N-Omp y SeqG3Rev se utilizaron en el protocolo de PCR por solapamiento para generar el producto completo de ADN del Fab. Se utilizó la Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer) en el siguiente programa de PCR: 94ºC durante 30'', seguidamente 20 ciclos de 94ºC durante 30'', 56ºC durante 30'' y 72ºC durante 3'15'', a continuación un periodo de extensión de 72ºC durante 15', seguido de mantenimiento a 4ºC. Tras la purificación en gel del producto Fab, se llevó a cabo una digestión con Sfi1 a 50ºC durante 5 horas. Se ligaron durante la noche las inserciones en el vector pRL4 digerido con Sfi1. Los productos de la ligación se precipitaron con etanol, se resuspendieron en H2O y después se sometieron a electroporación en bacterias ER2537 competentes (cepa supresora, New England Biolabs). Tras una hora de agitación en 5 ml de SOC, se añadió un volumen igual de SB. Se añadió carbenicilina a 20 μg/ml y el cultivo se agitó durante una hora a 37ºC, seguido de una hora a 37ºC en 50 μg/ml de carbenicilina. Se transfirió el cultivo de biblioteca a un matraz que contenía 100 ml de SB fresco, 50 μg/ml de carbenicilina y 1012 fagos ayudantes M13 VCS. Tras dos horas a 37ºC, se añadió canamicina para seleccionar aquellas bacterias que habían sido infectadas por fagos ayudantes. Al día siguiente, los cultivos de la noche se centrifugaron y el fago en el sobrenadante se precipitó en hielo utilizando PEG al 4%/NaCl 0,5 M. Tras concentrar el fago por centrifugación, se resuspendió el pellet resultante en BSA al 1%/PBS, se filtró y se dializó frente a PBS. La biblioteca de fagos se almacenó a 4ºC.

Se llevó a cabo la construcción de Fabs que contenían el péptido unido no aleatoriamente, tal como se ha descrito anteriormente, mediante la sustitución de los cebadores TPO-CDR3-B y TPO-CDR3-F con cebadores específicos alternativos. Para el anticuerpo injertado con PP-(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEC ID nº 25), los cebadores utilizados fueron: TPO-CDR3g-B (5' GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NGG NGG TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEC ID nº 9) y TPO-CDR3g-F (5' CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEC ID nº 10). Para el anticuerpo injertado con GG(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEC ID nº 29), los cebadores utilizados fueron: TPO-CDR3-ggB (5' GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NCC NCC TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEC ID nº 11) y TPO-CDR3g-F (5' CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEC ID nº 12).

Selección de la biblioteca de CDR3 de cadena pesada del péptido mimético de TPO

Con el fin de seleccionar la expresión óptima del péptido, se llevó a cabo un panning de plaquetas humanas. Debido a que las plaquetas expresan aproximadamente 1.800 receptores de TPO por célula sobre su superficie (receptores cMpI), representan una buena diana celular. Además, las plaquetas se encuentran fácilmente disponibles en un banco local de sangre. A 1 ml de plaquetas humanas concentradas envejecidas procedentes del banco de sangre, se añadieron 50 μl de Fab-fago recién preparados en un tubo cónico de 15 ml con 0,1% de NaN3. Se agitó el tubo a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. Típicamente se añadieron 10 ml de 50% de suero humano (obtenido de las plaquetas restantes) + 50% {IMDM/FBS al 10%/azida al 0,1%/EDTA 2 mM} a los fagos/células. Se concentraron las plaquetas por centrifugación a 5.500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante y se dejó reposar el pellet bajo ~500 μl de la solución de lavado durante 20 minutos. Las plaquetas se resuspendieron muy suavemente y se añadieron a continuación 10 ml de 25% suero humano (obtenido de las plaquetas restantes) + 75% {IMDM/FBS al 10%/azida al 0,1%/EDTA 2 mM} a los fagos/células. Se repitió la centrifugación, reposo del pellet y resuspensión de las plaquetas. En las rondas de panning 3 y 4, se llevó a cabo un tercer lavado. Los fagos/células lavados se transfirieron a un tubo de eppendorf y se centrifugaron a 5.200 x g. Los fagos se eluyeron de las plaquetas a los 10 minutos a temperatura ambiente utilizando tampón ácido de elución (HCl 0,1 M, BSA 1 mg/ml y glicina hasta pH 2,2). Se concentraron las plaquetas por centrifugación a velocidad máxima y los fagos eluídos se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml, se neutralizaron con base Tris 2 M. A continuación, se dejó que los fagos infectasen bacterias ER2537 frescas durante 15 minutos a temperatura ambiente y se amplificaron durante la noche tal como se ha descrito anteriormente. Se llevaron a cabo cuatro rondas de panning de las plaquetas.

Tras la cuarta ronda de panning, se sometieron a ensayo mediante FACS los grupos de 3 clones de Fab expresados como proteínas solubles en la cepa bacteriana no supresora TOP10F' (InVitrogen, Carlsbad, CA) para la unión a las plaquetas utilizando la etiqueta epítopo HA de Fab con anti-HA de rata de afinidad elevada seguido de FITC antirrata (Sigma, St. Louis, Missouri). Se incubaron 25 μl de plaquetas humanas concentradas envejecidas (lavadas una vez con PBS/EDTA 5 mM/FBS al 2%) con 100 μl de sobrenadante bacteriano (se preincubaron 60 μl de sobrenadante bacteriano procedente de tres clones agrupados de Fab con 40 μl de leche al 5%/PSS a 4ºC durante 15 minutos) a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se añadió 1 ml de tampón FACS (PBS/FBS al 2%/EDTA 5 mM) y las células se concentraron por centrifugación a 5.200 x g durante 5 minutos. Las células centrifugadas se resuspendieron en 50 μl de 2º anticuerpo anti-HA diluido 1:10 (en PBS/BSA al 1%/NaN3 al 0,1%) [clon de elevada afinidad 3F10 de IgG anti-HA de rata (Roche Molecular Biochemicals)]. Tras 30 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS tal como anteriormente. Tras la centrifugación, las células se resuspendieron en 100 μl de 3º anticuerpo IgG-FITC antirrata (Sigma) diluido 1:160 (en PBS/BSA al 1%/NaN3 al 0,1%) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS, después se resuspendieron en 200 μl de tampón FACS para el análisis. Como control positivo se utilizó un Ab anti-IIb/IIIa de oveja disponible comercialmente, seguido de FITC antioveja. Muchos grupos de Fab eran claramente positivos para la unión a plaquetas según FACS. A continuación se llevó a cabo un análisis FACS de seguimiento con el fin de identificar los clones individuales que se unían a las plaquetas.

Examen de los candidatos individuales según actividad ligante

Se sometieron a ensayo varios Fab, en sobrenadantes bacterianos, para su reactividad frente al toxoide original de antígeno tetánico con el fin de determinar si se conservaba dicha especificidad de unión. El Fab anti-TT de las regiones estructurales del anticuerpo se unía a su antígeno TT pero no a BSA. Sin embargo, cuatro clones de Fab injertados con péptido mimético de TPO no mostraron un nivel significativo de unión a TT o a BSA. Tal como se ha observado en experimentos anteriores, la sustitución de la HCDR3 del Fab anti-TT resultó suficiente para cambiar la especificidad del anticuerpo.

Con el fin de examinar adicionalmente las capacidades de unión de los Fab, se llevó a cabo un análisis FACS en células CMK, una línea celular megacariocítica (procedente de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) que también expresa el receptor cMpI. Los clones de Fab que se unían a las células CMK se analizaron a continuación para verificar que la unión de plaquetas y células CMK se producía mediante el receptor cMpI. Para este experimento, se transfectaron células 293 EBNA con o sin cMpI-R, que había sido clonado en células Tf-1 mediante RT-PCR. Se incubaron 1 x 106 células transfectadas con sobrenadante bacteriano de cada clon de Fab

(prebloqueado tal como se ha descrito anteriormente) durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Se concentraron las células por centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos. El pellet de células se resuspendió en 90 μl de tampón FACS (PBS/FBS al 2%/EDTA 1 mM), después se añadieron 10 μl de 2º anticuerpo anti-HA [clon 3F10 de afinidad elevada de IgG anti-HA de rata (Boehringer Mannheim Biochemicals)] para una dilución final de 1:10. Tras 20 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS. Tras la centrifugación, las células se resuspendieron en 100 μl de 3º anticuerpo IgG-PE antirrata diluido 1:50 (en PBS/BSA al 1%/NaN3 al 0,1%) (Research Diagnostics Incorporated, RDI) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS, después se resuspendieron en 200 μl de tampón FACS para el análisis. Los Fab seleccionados durante el panning demostraron una fuerte unión a las células transfectadas con cMpl-R pero no a las células transfectadas con vector de control que carecía de cMpI-R. Ello indica que la unión de superficie celular se producía específicamente mediante el receptor cMpI. El Fab anti-TT no se unía al vector de control o a las células 293 transfectadas con cMpI-R. Sin embargo, el clon X1c de Fab mostraba un cambio desde el 3% de unión a células transfectadas de control (sin receptor cMpI) al 95% de unión de las células que expresaban cMpI-R.

Examen de los candidatos individuales según secuencia

El análisis de secuencias de los clones de Fab que se unían específicamente al receptor cMpI (ver la fig. 5) reveló la selección de aminoácidos preferentes en el sitio de unión situado corriente abajo. Se analizaron los datos de secuenciación del ADN, y a continuación se proporcionan las secuencias aminoácidas y de ADN:

Clon: Propiedad ligante SEC ID nº Secuencia

X1a: débil 25 Pro Pro (péptido de 14 aa) Gly Gly

X1a-11: débil 27 Gly Gly (péptido de 14 aa) Gly Gly

X1a-13: débil 29 Gly Gly (péptido de 14 aa) Gly Gly

X1c: fuerte 31 Trp Leu (péptido de 14 aa*) Pro Val

X2c: débil 33 Met Ile (péptido de 14 aa) Val Gly

X3a: fuerte 35 Val Val (péptido de 14 aa) Pro Val

X3b: fuerte 37 Gly Pro (péptido de 14 aa) Pro Asp

X4b: fuerte 39 Leu Pro (péptido de 14 aa) Pro Val

X4c: fuerte 41 Ser Leu (péptido de 14 aa) Pro Ile

X5a: fuerte 43 Thr Met (péptido de 14 aa) Pro Val

X5c: fuerte 45 Trp Leu (péptido de 14 aa) Pro Val

X7a: débil 47 Thr Arg (péptido de 14 aa*) Cys Ser

X7b: débil mutante por deleción, este clon ha perdido el péptido

X7c: fuerte 49 Gln Thr (péptido de 14 aa) Pro Asp

La totalidad de los clones demostraron una unión fuerte, se descubrió que contenían una prolina inmediatamente corriente abajo del péptido mimético de TPO de 14 aminoácidos. La selección mediante panning de una prolina en la posición de enlace corriente abajo representa la determinación de una elección inesperada de aminoácido que proporciona características mejoradas de unión al péptido injertado mimético de TPO. Los ligantes débiles no contenían esta prolina, aunque todavía contenían el péptido mimético de TPO. Debe indicarse que el clon X7a presentaba una mutación silenciosa en este péptido (GCG a GCA, conservando la Ala en la posición 11 del péptido) y que el clon X2c presenta una mutación en este péptido que intercambiaba un Thr por Ala en la posición 11 del péptido.

Ensayos biológicos

Los clones se sometieron a ensayo para actividad agonista utilizando un ensayo transcripcional midiendo la actividad de luciferasa controlada por el promotor c-Fos. La dimerización del receptor cMpI activa Jak, que estimula la ruta de la MAP quinasa. De esta manera, la activación puede medirse mediante el ensayo de la producción de luciferasa y la actividad estimulada por la MAP quinasa mediante el promotor cFos. Debido a que la dimerización del receptor cMpI resulta necesaria para la activación, podrían utilizarse IgG completos o fragmentos Fab dimerizados capaces de dimerizar el receptor, con el fin de estimular la actividad de receptor cMpI. Los Fab producidos en bacterias se dimerizaron mediante la etiqueta HA utilizando el anticuerpo anti-HA 12CA5. Se añadieron cantidades crecientes de 12CA5 a los Fab bacterianos para dimerizar los clones de Fab con el fin de que a su vez pudiesen dimerizarse y activar el receptor cMpI. Para la medición de las actividades agonistas, se aplicó una mezcla de 12CA5 y sobrenadantes bacterianos que contenían Fab (2 ml) a células NIH3T3 que habían sido contransfectadas con un vector de control o con el receptor cMpI y el constructo de promotor Fos/informador luciferasa. Las cotransfecciones de las células 3T3 se llevaron a cabo sembrando en placa células NIH 3T3 a 3 x 105 células por placa de 6 cm y después transfectando al día siguiente. Las células NIH 3T3 se transfectaron utilizando el reactivo de lipofección Effectine (Qiagen), transfectando cada placa con 0,1 μg de pEGFP (un trazador para medir la eficiencia de transfección), 0,2 μg del constructo promotor Fos/luciferasa y 0,7 μg del vector de control vacío o el plásmido que expresa el receptor cMpI. Se introdujeron las células 3T3 en suero al 0,5% 24 horas después de la transfección y se incubaron durante 24 horas adicionales en este medio pobre en suero con el fin de reducir la activación de fondo del promotor Fos. A continuación, se aplicaron los sobrenadantes de anticuerpo a estas células durante 6 horas. Se recolectaron las células y se llevaron a cabo ensayos de luciferasa utilizando 50 μg de lisado celular. Los anticuerpos no estimularon ninguna activación en ausencia de expresión del receptor cMpI. Sin embargo, se observó actividad agonista en las células 3T3 cotransfectadas con receptor cMpI. Ello permitió que los presentes inventores demostrasen que la actividad agonista observada se producía por el receptor cMpI y su interacción con el anticuerpo. Los datos son los siguientes:

Sobrenadantes bacterianos con 12CA5

Tratamiento celular: Factor de incremento de la actividad de luciferasa

Transfectadas con cMpI-R: Transfectadas de control

Sin tratar:: 1,0 1,0

+ FCS al 10%: 3,43 3,0

+ TPA: 2,3 2,42

+ TPO: 2,32 0,76

+ X4c Sup (solo): 1,03 0,94

+ X4c + 60 μl a-HA: 1,97 0,84

+ X4c + 30 μl a-HA: 1,52 0,87

+ X4c + 10 μl a-HA: 1,22 0,86

+ X4c + 3 μl a-HA: 0,94 0,68

+ X4c + 1 μl a-HA: 0,91 1,05

+ X4c + 0,3 μl a-HA: 1,01 0,95

10 La activación del receptor cMpI puede someterse a ensayo de una manera similar utilizando IgG completos (convertidos a partir de Fab, tal como se describe en la presente memoria) producidos mediante transfección transitoria o estable de células de mamífero y no por Fabs de producción bacteriana dimerizados por 12CA5 anti-HA. La transfección experimentalmente transitoria puede llevarse a cabo esencialmente tal como se describe en la presente memoria. Para las transfecciones, se sembraron 2 x 106 células (tales como las 293 EBNA) en placas de 6

15 cm para cada muestra de ensayo. Al día siguiente, cada placa se transfectó con 2,5 μg de ADN total (2 μg en total de plásmido o plásmidos de cadena ligera y de cadena pesada, 0,25 μg de pAdVAntage (Promega, Madison, Wisconsin) y 0,25 μg de pEGFP) utilizando el reactivo Effectine (Qiagen). Las células 293 se introdujeron en suero al 0,5% 24 horas después de la transfección y se incubaron durante 24 horas adicionales en el medio pobre en suero con el fin de obtener IgG completos. El efecto de estimulación de los receptores por parte de los factores de

20 crecimiento residuales era despreciable en este medio, tal como se observó en los experimentos de control. Tras 24 horas, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron durante 5 minutos a 3.000 rpm con el fin de eliminar cualquier célula residual. Para la medición de las actividades agonistas de los IgG completos, se aplicaron 3 ml de los sobrenadantes acondicionados de células 293 a las células NIH3T3, tal como se ha descrito anteriormente.

25 Ejemplo 2

Bibliotecas adicionales que contienen secuencias miméticas de TPO injertadas en un marco de anticuerpo humano

30 Otro enfoque en la unión de dos péptidos agonistas entre sí en un marco de anticuerpo consiste en insertar el péptido agonista en más de una posición dentro de un solo fragmento Fab. Con el fin de llevar esto a cabo, se construyeron bibliotecas adicionales que contenían secuencias miméticas de TPO injertadas en un marco de anticuerpo humano. Tras la selección de los péptidos apropiadamente presentados en el contexto de CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena ligera, o CDR2 de cadena pesada, se combinaron las secuencias de unión en una sola molécula

35 Fab, por ejemplo tal como se indica en la Tabla 1 a continuación, y se analizaron para identificar incrementos de actividad.

TABLA 1

Péptido 1 Péptido 2

H-CDR3 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 H-CDR3 L-CDR2 H-CDR3 L-CDR3

H-CDR2 L-CDR2

H-CDR2 L-CDR3

L-CDR3 L-CDR2 40

Se construyeron cuatro bibliotecas adicionales sustituyendo separadamente la CDR2 de cadena pesada, así como las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, con el péptido mimético de TPO flanqueado por 2 aminoácidos aleatorios utilizando una estrategia de dopaje NNK. La generación de las bibliotecas se llevó a cabo de manera similar a la descrita para la biblioteca de CDR3 de cadena pesada-péptido TPO, excepto en que para formar una biblioteca únicamente se amplificó por PCR y se utilizó como inserción la cadena (pesada o ligera) que se estaba modificando. Se llevó a cabo PCR utilizando el sistema Expand High Fidelity PCR System (Roche), que contiene una mezcla de polimerasas Taq y Pwo. La primera ronda de PCR se llevó a cabo utilizando el programa siguiente: 94ºC durante 30'', después 30 ciclos de 94ºC durante 15'', 56ºC durante 30'' y 72ºC durante 2', seguido del alargamiento durante 10' a 72ºC y mantenimiento a 4ºC. Se llevó a cabo PCR por solapamiento durante 10 ciclos sin cebadores utilizando el programa indicado anteriormente con el fin de permitir la generación del molde completo de ADN por las polimerasas. A continuación, se añadieron los cebadores a los tubos de reacción de PCR durante 20 ciclos del mismo programa para la amplificación.

Para la biblioteca HCDR2, se creó el fragmento A utilizando el cebador directo lead VH (5' GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC 3') (SEC ID nº 13), que se hibrida en la señal líder pelB situada enfrente de la cadena pesada, y el cebador reverso HR2 CMPL ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN TCC CAT CCA CTC AAG CCC TTG 3') (SEC ID nº 51), que se hibrida en el extremo de la cadena pesada FR2. El cebador reverso contenía una cola que codificaba la nueva CDR2. El fragmento B se creó utilizando el cebador directo HR2 cMpI CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK AGA GTC ACC ATT ACC GCG GAC 3') (SEC ID nº 14), que se hibrida en FR3 de la cadena pesada, y el cebador reverso N-dp (5' AGC GTA GTC CGG AAC GTC GTA CGG 3') (SEC ID nº 15), que se hibrida en la región de etiqueta epítopo HA del plásmido, corriente abajo de la región constante de cadena pesada. El cebador HR2 cMpI CODE también presentaba una cola de bases que codificaba la nueva región CDR2. Tras la generación de los fragmentos mediante PCR y la purificación en gel, se combinaron para una PCR de extensión por solapamiento. Las nuevas regiones CDR2 codificadas por el cebador eran complementarias y proporcionaban 24 bases de solapamiento. Los cebadores VH lead y Ndp se utilizaron en el protocolo de PCR por solapamiento para generar el producto de cadena pesada de ADN completo. Tras la purificación en gel del producto de cadena pesada, se llevó a cabo una digestión XhoI/SpeI a 37ºC durante 3 horas. Las inserciones se purificaron en gel y después se ligaron en un vector pRL4 digerido con XhoI/SpeI que contenía la cadena ligera anti-TT. Los productos de ligación se precipitaron y se sometieron a electroporación en bacterias ER2537, tal como se ha descrito anteriormente para la generación de la biblioteca fágica de Fab.

La biblioteca de CDR3 de cadena ligera se preparó de manera similar utilizando los cebadores para el fragmento A, cebador directo N-omp y cebador reverso LR3 cMpI ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ACA GTA GTA CAC TGC AAA ATC 3') (SEC ID nº 16) y para el fragmento B, cebador directo LR3 cMpI CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG 3') (SEC ID nº 17) y cebador reverso líder de B (5' GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC 3') (SEC ID nº 18). El cebador líder de B se hibridó con la secuencia líder pelB situada antes de VH. Los cebadores reverso LR3 cMpI ANTI y directo LR3 cMpI CODE se hibridaron con FR3 y FR4 de la cadena ligera anti-TT, respectivamente. Ambos cebadores LR3 cMpI contenían una cola de nucleótidos que codificaba la nueva biblioteca de péptidos CDR3, que proporciona la región de solapamiento de 24 pares de bases para la PCR de fusión del fragmento A y el fragmento B. Tras la purificación de los productos de PCR de cadena ligera, se llevó a cabo una digestión con SacI/XbaI a 37ºC durante 3 horas. A continuación, se ligaron los fragmentos de cadena ligera en pRL4 digerido con SacI/XbaI que contenía la cadena pesada anti-TT, durante la noche a temperatura ambiente. Los productos de ligación se precipitaron y se sometieron a electroporación en bacterias ER2537 tal como se ha descrito anteriormente para la generación de la biblioteca fágica de Fab.

La construcción de la biblioteca de CDR2 de cadena ligera se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente para la biblioteca de CDR3 de cadena ligera, con la excepción de que se utilizaron en lugar de los cebadores LR3 cMpI, los cebadores específicos LR2 cMpI ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC 3') (SEC ID nº 19), que se hibrida en el extremo de FR2 de cadena ligera, y el cebador LR2 cMpI CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT 3') (SEC ID nº 20), que se hibrida en el inicio de la región FR3 de cadena ligera.

También se llevó a cabo la construcción de la biblioteca CDR1 de cadena ligera, tal como se ha descrito anteriormente para la biblioteca CDR3 de cadena ligera, con la excepción de que se utilizaron en lugar de los cebadores LR3 cMpI, los cebadores específicos TPO-LR1CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK TGG TAC CAG CAG AAA CCT GGC 3') (SEC ID nº 58) que se hibrida en el inicio del FR2 de cadena ligera, y el cebador TPOLR1ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN GCA GGA GAG GGT GGC TCT TTC 3') (SEC ID nº 59), que se hibrida en el inicio del FR1 de cadena ligera.

Las tres bibliotecas adicionales, que sustituyen separadamente la CDR2 de cadena pesada y las CDR2 y CDR3 de cadena ligera con el péptido mimético de TPO flanqueado por 2 aminoácidos aleatorios utilizando la estrategia de dopaje NNK, se sometieron a panning separadamente en plaquetas, tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 para la biblioteca de sustitución de CDR3 de cadena pesada. Se llevaron a cabo cuatro rondas de panning y los clones se cribaron mediante FACS en plaquetas y células 293 transfectadas con receptor cMpI, tal

como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron dos clones positivos de estos cribados. Estos clones presentaban el péptido mimético de TPO en la CDR2 de cadena pesada. Al contrario que con los clones de CDR3 de cadena pesada, ninguno de los clones de CDR2 de cadena pesada presentaba una prolina en una posición corriente abajo. Por el contrario, se observó que ambos contenían una tirosina en una posición corriente arriba (ver la figura 9, clones HC-CDR2 nº 24 y nº 39).

Las bibliotecas, incluyendo LCDR1, se sometieron separadamente a otro experimento de panning utilizando células 293 transfectadas con receptor cMpI en lugar de plaquetas durante el panning. Se observó que las células 293 transfectaban reproduciblemente a eficiencia elevada y expresaban niveles muy elevados del receptor cMpI funcional sobre su superficie. De esta manera, estas células representaban una buena diana celular para la utilización en el panning. Para estos experimentos, se transfectaron separada y secuencialmente en cuatro días sucesivos diferentes grupos de placas de células 293. A continuación, se utilizó secuencialmente cada grupo de placas para las cuatro rondas separadas de panning. Cada ronda de recolección de células y de panning se realizó dos días después de la transfección. Para la recolección, las células se eliminaron de las placas utilizando tampón de disociación celular, se concentraron por centrifugación a 1.500 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en IMDM suplementado con FCS al 10%, azida sódica al 0,1% y EDTA 5 mM a una concentración de 1 x 106 células por ml (3 x 106 células para LC-CDR1). En la primera ronda de panning, se aplicaron separadamente 3 x 1011 fagos de cada biblioteca a 2 ml de células (6 x 106 células para LC-CDR1 y 2 x 106 células para el resto) y se agitaron en un tubo cónico de 15 ml durante dos horas a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces utilizando 10 ml de tampón IMDM/FCS al 10%/azida sódica al 0,1%/EDTA 5 mM. Los fagos se eluyeron en ácido y se amplificaron tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. En la ronda dos, se utilizaron 4 x 106 células (6 x 106 células para LC-CDR1) en 2 ml de tampón, y se combinaron 3 x 1011 fagos procedentes de los fagos eluídos de la primera ronda, que había sido amplificada, con 3 x 1011 fagos de la biblioteca no sometida a panning y se añadieron a las células. Se realizó el lavado, la elución y la amplificación de manera similar a la primera ronda. En la tercera ronda, se utilizaron 4 x 106 células (6 x 106 células para LC-CDR1) en 2 ml de tampón y 3 x 1011 fagos procedentes de los fagos de la segunda ronda, que había sido amplificada. Las células se lavaron tres veces previamente a la elución. En la cuarta ronda, nuevamente se utilizaron 4 x 106 células (6 x 106 para LC-CDR1) en 2 ml de tampón y 3 x 1011 fagos procedentes de los fagos eluídos y amplificados de la tercera ronda. Nuevamente se lavaron las células tres veces previamente a la elución. Se cribaron por lo menos treinta clones individuales mediante FACS en células 293 transfectadas con receptor cMpI, tal como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron 12 clones positivos de la biblioteca de CDR2 de cadena pesada y 25 clones positivos de la biblioteca de CDR2 de cadena ligera, y se obtuvieron 14 clones positivos de la biblioteca de CDR1 de cadena ligera. Los clones se analizaron adicionalmente mediante secuenciación del ADN. Los residuos aminoácidos flanqueantes seleccionados para los clones positivos se ilustran en la figura 9 adjunta. Resulta de interés indicar que los Fabs injertados con CDR2 de cadena ligera presentaban una fuerte selección para una prolina (Pro) corriente arriba del péptido mimético de TPO.

Ejemplo 3

Se generaron combinaciones de los clones de Fab injertados con péptido mimético de TPO de la figura 9. De esta manera, un solo anticuerpo podía contener múltiples copias del péptido mimético de TPO dentro de una sola cadena ligera o pesada. Alternativamente, ambas cadenas, ligera y pesada, pueden contener injertos de péptidos, proporcionando múltiples copias dentro de un solo Fab. Se agruparon los clones positivos seleccionados de la misma biblioteca de CDR. Se construyeron nuevas bibliotecas mediante la combinación de la agrupación de un CDR que contenía péptido mimético de TPO con la agrupación de otro. Se prepararon combinaciones en las que uno de los péptidos miméticos de TPO se encontraba en la cadena ligera y el otro en la cadena pesada utilizando técnicas simples de clonación con los ADN de plásmido agrupados, y los sitios de restricción únicos flanqueantes de las cadenas pesada (XhoI-SpeI) y ligera (SacI-XbaI). Por ejemplo, el plásmido de ADN para las cadenas pesadas injertadas con el péptido H-CDR3 se combinó y se digirió con XhoI y SpeI. Las inserciones en cadena pesada purificadas se ligaron en el plásmido digerido con XhoI/SpeI que contenía los injertos L-CDR2. La biblioteca resultante contenía cadenas pesadas con los injertos de péptidos CDR3 y cadenas ligeras con injertos de péptidos CDR2. Debe entenderse que los clones individuales también podrían combinarse y no utilizar agrupaciones de clones para el apareamiento de dos CDR que contienen péptido. Por ejemplo, se apareó un solo clon de cadena pesada con injerto de péptido CDR3 con varios clones de CDR1 de cadena ligera con el fin de crear Fabs con múltiples copias de péptidos miméticos de TPO.

Las combinaciones en las que se encontraban combinados dos péptidos miméticos de TPO dentro de una cadena pesada dada se llevaron a cabo utilizando PCR por solapamiento con el fin de generar el fragmento para la clonación. Se utilizaron dos cebadores solapantes que se unen entre CDR2 y CDR3, y cebadores flanqueantes, tales como "N omp" y "lead B" en la cadena ligera, y "lead VH" y "Ndp" en la cadena pesada. Por ejemplo, para combinar H-CDR2 y H-CDR3, se llevó a cabo el primer PCR utilizando lead VH (un cebador que se hibrida en el vector en la señal líder pelB de la cadena pesada) y un cebador reverso que se hibrida en FR3 utilizando el ADN agrupado de H-CDR2 de plásmido como molde. La secuencia de este cebador era 5' CCA TGT AGG CTG TGC CCG TGG ATT 3' (SEC ID nº 63). En una reacción separada, los plásmidos agrupados que contenían los injertos H-CDR3 se sometieron a PCR con un cebador directo que se hibridaba en FR3 (que es complementario al cebador reverso en FR3 anteriormente indicado) y Ndp (que se hibrida en el vector en una secuencia de etiqueta del

epítopo). La secuencia de este cebador era 5' CCA CGG GCA CAG CCT ACA TGG AGC 3' (SEC ID nº 64). Los primeros productos de PCR se purificaron, seguidamente se combinaron en una reacción de PCR por solapamiento, en la que se produjo la fusión de los dos fragmentos a través de la complementariedad de las secuencias FR2. Se clonó el producto de cadena pesada completo con XhoI/SpeI en un plásmido que contenía la cadena ligera del toxoide antitétano. En total, se crearon cinco clases de Fabs que portaban múltiples copias de péptidos miméticos de TPO, tal como se detalla en la Tabla 2 siguiente.

TABLA 2

Péptido 1: Péptido 2 Péptido 3

H-CDR3: H-CDR2

H-CDR3: L-CDR2

H-CDR2 L-CDR2

H-CDR3 H-CDR2 L-CDR2

H-CDR3 L-CDR1

Se sometieron a ensayo para actividad biológica 20 clones de cada biblioteca de combinación y cuatro clones individuales de H-CDR3 más L-CDR1 en un ensayo de informador luciferasa, tal como se ha descrito anteriormente. Ver las figuras 10 y 11. En ambos experimentos, los controles negativos podían incluir células no inducidas, células tratadas con Fab irrelevante (toxoide antitétano), células tratadas con un clon de Fab que sólo se une débilmente con el receptor cMpI, y Fabs X4b y/o X1c que se unen al receptor cMpI pero que sólo presentan un solo dominio de unión y por lo tanto no pueden activar el receptor. El control positivo era la adición de TPO. Todas las muestras restantes procedían de bibliotecas de combinación recién formadas. Tal como puede observarse, varios clones presentaban actividad significativa como Fabs. Ello indica que la incorporación de múltiples péptidos miméticos de TPO en una sola molécula de Fab permite unir dos receptores y provocar la activación del receptor.

De hecho, mediante la utilización de Fab 59, la actividad agonista obtenida puede ser tan elevada como la actividad nativa de TPO. Se purificaron parcialmente el clon 59 que contiene dos péptidos miméticos de TPO (CDR3-CP muestra x4c y CDR2-CL muestra 19, según se identifican en la fig. 9) y una etiqueta His6 a partir de una preparación periplasmática bacteriana mediante FPLC utilizando cromatografía de columna de níquel. Se midió la actividad de este Fab y se encontró que era aproximadamente equivalente a la actividad de la TPO (ver la figura 12), según estimación de la inducción específica de cMpI-R de la actividad de luciferasa en comparación directa con concentraciones conocidas de TPO. Se llevó a cabo una transferencia western cuantitativa con el fin de determinar las concentraciones de anticuerpo Fab 59.

Podrían utilizarse estos Fabs, o diversas otras combinaciones de CDR, como producto terapéutico. Alternativamente, estos clones podrían convertirse en secuencias marco de línea germinal (con o sin optimización de codones) para la utilización como agente terapéutico con la condición de que se mantenga su actividad.

Ejemplo 4

Se trasplantó en la estructura de otro anticuerpo, 5G1.1, el péptido mimético de TPO injertado en el clon Fab X4b en el CDR3 de cadena pesada. La construcción de 5G1.1 se describe en la solicitud de patente US nº de serie 08/487.283, incorporada en la presente memoria como referencia. La secuencia se clonó en 5G1.1 de tal manera que sustituyese la CDR3 nativa con 5' ttg cca ATT GAA GGG CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG cct gtt 3' (SEC ID nº 65). El injerto de péptido traducido en aminoácidos era Leu Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Pro Val (SEC ID nº 66). El péptido 5G1+ se produjo como anticuerpo IgG completo (ver las figuras 13A y 13B).

Se analizó el anticuerpo 5G1.1+péptido purificado, así como el 5G1.1 parental, para su capacidad para unirse al receptor cMpI mediante análisis FACS. Se comparó la unión de células 293 que expresaban receptor y que no expresaban receptor. Ver la figura 14. La tinción FACS se llevó a cabo esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que la detección se realizó utilizando fragmento F(ab')2 conjugado con PE de cabra anti-IgG humano (H+L). Los controles negativos de Fab irrelevante toxoide antitétano 3º solo y Fab X1a, que se une débilmente al receptor cMpI, mostraban muy poca tinción. Sin embargo, los Fabs X1c y X4b ligantes mostraban una fuerte tinción, al igual que 5G1.1+péptido. Ninguno de estos clones demostró unión a las células que no expresaban receptor, indicando que la tinción celular se producía a través del reconocimiento específico del receptor cMpI. El 5G1.1 parental sin el péptido mimético de TPO no mostró tinción en ninguna de las células sometidas a ensayo.

Se determinó la capacidad de IgG completo 5G1.1+péptido de activar el receptor cMpI utilizando el ensayo del informador luciferasa (ver la figura 15). Los resultados indican que la configuración de un IgG completo provoca limitaciones estéricas en su capacidad de reunir productivamente los dos receptores cMpI para la activación. La actividad del constructo IgG completo 5G1.1 que contiene el péptido mimético de TPO en las posiciones CDR3 de

cadena pesada, era sólo débilmente activador y requería concentraciones molares aproximadamente 100 a 200 veces más elevadas en comparación con TPO para estimular una actividad equivalente. Tal como se ha observado con anterioridad en experimentos de unión, la activación por el 5G1.1 que contiene el péptido se observa únicamente cuando se expresa cMpI-R sobre la superficie celular. No se observó unión o actividad específica del receptor en el 5G1.1 parental que no contenía el péptido. Estos resultados demuestran que la unión y la actividad del péptido mimético de TPO y de las secuencias aminoácidas flanqueantes seleccionadas no se encuentran limitadas, o no son específicas, de la estructura del anticuerpo del toxoide del tétano, sino que pueden aplicarse a otras estructuras de anticuerpo. De esta manera, las secuencias aminoácidas flanqueantes que se seleccionaron durante el panning son específicas para la presentación del péptido mimético de TPO en una posición CDR determinada, pero no para la secuencia aminoácida de la estructura del anticuerpo.

Ejemplo 5

Construcción de la bibioteca de las secuencias miméticas de EPO injertadas en un marco de anticuerpo humano

Se injertó un péptido mimético de EPO agonista DYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEC ID nº: 3) (designado como EMP2 en Wrighton et al. 1996) por separado en la región CDR3 de cadena ligera y pesada Fab de toxoide antitetánico creando dos bibliotecas de anticuerpo como XXDYHXRMGPLTWVXKPLGGXX (SEC ID nº: 71). Las posiciones aleatorizadas son generadas utilizando una estrategia de dopado de NNK. Como con el péptido mimético de TPO, los dos aminoácidos que flanquean el péptido mimético de EPO fueron aleatorizados para la selección para una presentación óptima del péptido. Además los residuos de cisteína, que formaron un puente disulfuro en el péptido cíclico original, fueron aleatorizados. Esto se realizó no únicamente debido a que las CDR ya forman estructuras en bucle y el puente disulfuro no resulta así necesario para restringir el péptido, sino debido asimismo a que las cisteínas podrían de hecho afectar a los puentes disulfuro normales del anticuerpo.

La CDR3 de la cadena pesada de anticuerpo anti-TT fue sustituida completamente por el injerto de biblioteca de péptido de EPO. La generación de la biblioteca fue esencialmente como se ha descrito para la biblioteca de CDR2 de cadena pesada de TPO. Fueron utilizados dos cebadores alternos para la biblioteca de HCDR3: el cebador inverso HR3 EPO ANTI (5’ CAC CCA GGT CAG TGG GCC CAT GCG MNN ATG ATA GTC MNN MNN TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3’) (SEC ID nº: 21) que se apareó en el extremo FR3 de la cadena pesada, y el cebador directo HR3 EPO CODE (5’ CGC ATG GGC CCA CTG ACC TGG GTG NNK AAA CCA CTG NNK NNK TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC 3’) (SEC ID nº: 22) que se apareó en el FR4 de la cadena pesada.

La biblioteca del péptido de EPO de CDR3 de cadena ligera fue construida como se ha descrito esencialmente anteriormente para la biblioteca del péptido de TPO de CDR3 de cadena ligera utilizando el cebador inverso LR3 EPO ANTI (5’ CAC CCA GGT CAG TGG GCC CAT GCG MNN ATG ATA GTC MNN MNN ACA GTA GTA CAC TGC AAA ATC 3’) (SEC ID nº: 23) que se apareó en el extremo FR3 de la cadena pesada y el cebador directo LR3 EPO CODE (5’ CGC ATG GGC CCA CTG ACC TGG GTG NNK AAA CCA CTG NNK NNK TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG 3’) (SEC ID nº: 24) que se apareó al FR4 de la cadena ligera.

Selección de la biblioteca de CDR3 de cadena ligera y de la biblioteca de CDR3 de cadena pesada del péptido mimético de EPO

La selección para la presentación del péptido se realizó mediante panning en fase sólida en el receptor de EPO soluble. En este procedimiento, se inmovilizó 1 Ig de R de EPO sobule (hEPO-sR de R&D Systems, Minneapolis, MN cat#307-ER-050) sobre una placa de microtitulación durante la noche a 4º. Tras el lavado de hEPO-sR libre, las placas fueron bloqueadas con BSA/PBS al 1% durante una hora a 37º. Los fagos, preparados como se ha descrito anteriormente, fueron añadidos a los pocillos y se incubaron durante dos horas a 37º. Se realizaron los lavados utilizando PBS/Tween 20 al 0,5% durante 5’ a temperatura ambiente por lavado. Los lavados 1, 5, 10 y 10 se realizaron en las primera, segunda, tercera y cuarta rondas de panning respectivamente. Una vez completadas las etapas de lavado, los fagos-Fab unidos son eluidos con 30 Ils de tampón de elución durante 10’ a temperatura ambiente. Los fagos eluidos fueron a continuación neutralizados y amplificados como se ha descrito en el ejemplo 1.

Ejemplo 6

Se generó una biblioteca mediante la inserción de un péptido mimético de TPO y aminoácidos flanqueantes seleccionados anteriormente (NP-IEGPTLRQWLAARA-RG) (SEC ID nº 61) en una colección de fragmentos de gen kappa humano, en este caso la CDR2 de cadena ligera. Anteriormente se habían generado cadenas ligeras kappa humanas a partir de múltiples donantes de linfocitos de sangre periférica humana (PBL) y se habían clonado en pBluescriptII SK+. Estos constructos sirvieron como fuente de los fragmentos génicos de anticuerpo.

Bancos de genes de anticuerpo

Se aisló ARN total de PBLs humanos utilizando reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) seguido de purificación de ARNm mediante el sistema Oligotex mRNA purification System (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del kit. Se preparó ADNc de primera cadena utilizando el kit SuperScript Rtase II cDNA Synthesis (Life Technologies, Rockville, Maryland) con un cebador oligo-dT modificado. La secuencia del cebador era 5' TAGGATGCGGCCGCACAGGTC(T20) 3' (SEC ID nº 62). Las muestras se lavaron en una columna de centrifugación de un kit de purificación PCR (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del kit. Se amplificaron los productos de cadena ligera utilizando el cebador reverso "Not I" y los cebadores directo que se hibridan en la posición de marco 1 (FR1) de las cadenas kappa en la primera cadena de ADNc. El cebador "Not I" presentaba una secuencia que era idéntica al extremo 5' del cebador oligo-dT modificado (5' TAGGATGCGGCCGCACAGGTC 3') (SEC ID nº 72). El conjunto de cebadores FR1 kappa utilizados era el siguiente:

Una reacción de amplificación típica contenía 2 μl de reacción ADNc, dNTP, cebador reverso "Not I", uno de los cebadores directo XVB, tampón Opti-prime nº 5 (Stratagene, La Jolla, CA) y mezcla de polimerasa Expand High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Las muestras se calentaron a 94ºC durante 2 minutos, después se pasaron por 10 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 56ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 15 minuto, seguido de 20 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 56ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante (1 minuto + 5 segundos/ciclo). Tras los ciclos, se llevó a cabo una incubación prolongada a 72ºC (7 minutos) previamente al mantenimiento a 4ºC. Los productos se precipitaron con etanol y después se purificaron en gel. Se aislaron fragmentos de aproximadamente 850 pb y después se digirieron con XbaI y SacI. Los productos kappa resultantes se ligaron en pBluescriptII SK+ que de manera similar se había digerido con XbaI y SacI. Los productos de ligación

20 se sometieron a electroporación en Top10F' (InVitrogen, Carlsbad, CA) y se cultivaron durante la noche. Se utilizó el pellet bacteriano para aislar el ADN de la biblioteca kappa utilizando el kit de aislamiento de ADN MAXIprep de QIAGEN.

Construcción de biblioteca de marco con péptido mimético de TPO

25 Para la construcción de la biblioteca de marco de cadena ligera de TPO, se utilizaron cantidades iguales de cuatro bibliotecas de cadena ligera kappa diferentes procedentes de cuatro pacientes diferentes como el molde de inicio para las reacciones de PCR (25 ng en total por reacción). Se incorporaron el péptido mimético de TPO y los aminoácidos flanqueantes seleccionados en las cadenas ligeras mediante PCR por solapamiento. En la primera

30 ronda de PCR, se combinaron separadamente un conjunto de cebadores reversos (cebadores VK ANTI) que se

unían a la FR2 de cadena ligera kappa con el cebador directo T7 seq-F (5' A TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG 3') (SEC ID nº 86) con el fin de sintetizar la sección N-terminal de la cadena ligera y parte del péptido mimético de TPO dentro de la posición CDR2 de LC. Se combinó separadamente un segundo conjunto de cebadores directo (cebadores VK CODE) que se unían a FR3 con el cebador reverso T3 (5' AA TTA ACC CTC ACT AAA GGG 3') (SEC ID nº 87) con el fin de sintetizar el resto del péptido mimético de TPO dentro de la posición CDR2-CL y la mitad C-terminal de la cadena ligera mediante PCR. Se llevaron a cabo reacciones separadas para cada par de combinaciones de cebador por duplicado.

Los fragmentos de las primeras rondas de PCR se purificaron en gel. A continuación, se combinaron estos fragmentos purificados, de manera específica según familia de anticuerpo, en reacciones de PCR por solapamiento con el fin de generar la cadena ligera completa. Las reacciones para cada familiar se llevaron a cabo por triplicado utilizando 40 ng de las secciones N-terminal y C-terminal de la cadena ligera en cada reacción. Las reacciones se llevaron a cabo durante 10 ciclos previamente a la adición de los cebadores T3 y T7 Seq-F, seguido de 25 ciclos adicionales tras la primera adición. Los productos de fusión de PCR de CL de longitud completa se purificaron en gel, se digirieron con SacI y con XbaI, y se purificaron a continuación nuevamente en gel. Las inserciones en la cadena ligera se ligaron a continuación en un vector fágico de expresión apropiado, que de manera similar había sido digerido con XbaI y con SacI y purificado en gel. El vector pRL5-kappa utilizado presentaba sitios de restricción que eran compatibles con los fragmentos de CL y contenían la región constante Kappa restante desde el sitio SacI hasta la Cys C-terminal. Además, se insertó la cadena pesada del toxoide antitétano en el vector mediante XhoI y SpeI para la producción de Fab.

La mezcla de ligación se transformó mediante electroporación en bacterias XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) y se amplificó. La biblioteca se sometió a panning en cuatro rondas en células 293 EBNA transfectadas con cMpI-R de una manera similar a la anteriormente descrita. Los clones obtenidos durante el panning se cribaron para la unión mediante análisis FACS en células 293 EBNA transfectadas con cMpI-R o sin cMpI-R, tal como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron varios clones que se unían específicamente a cMpI-R. La huella de ADN de las cadenas ligeras resultantes mediante digestión con BstN1 indicó que los clones podían dividirse en 5 grupos diferentes. La secuenciación parcial de 8 de estos clones demostró que los marcos de por lo menos dos familias diferentes de cadena ligera kappa resultaban seleccionados durante el panning (VK1 y VK3). En un ensayo inicial, 3 de los clones de marco de cadena ligera se combinaron con la cadena pesada de X4b para crear un Fab con 2 péptidos miméticos de TPO. Estos clones indujeron la activación de cMpI-R en ensayos de luciferasa, tal como se ha descrito anteriormente. El nivel de activación utilizando sobrenadantes bacterianos de uno de estos clones, 429/X4b (ver la figura 16) era aproximadamente 10 a 20 veces inferior al observado con TPO, según se estimó comparando la actividad de concentraciones conocidas de TPO y utilizando transferencias western cuantitativas para determinar la concentración del anticuerpo en el sobrenadante. Pueden cribarse clones adicionales de manera similar con el fin de identificar clones con actividad superior.

Dichos Fabs, o diversas otras CL, CP o combinaciones intracadena de CDR, podrían utilizarse como un producto terapéutico. Alternativamente, estos clones podrían convertirse en secuencias marco de línea germinal (con o sin optimización de codones) para la utilización como un agente terapéutico con la condición de que se mantenga su actividad.

Modificación de los vectores fágicos de expresión pAX131 y pRL5

Se eliminó el sitio NotI en pAX131 digiriendo el vector con NotI, utilizando la polimerasa klenow para rellenar los extremos protuberantes dejados por NotI y después religar el vector. Ver la figura 17. Se llevaron a cabo modificaciones adicionales mediante la digestión de pAX131 con EcoRI y con XbaI. Se generó una inserción que sustituía los elementos eliminados por esta digestión utilizando oligonucleótidos solapantes con los cambios siguientes: conversión del sitio SacI en un nuevo sitio XbaI (subrayado simple en las secuencias de cebador posteriormente), conversión del sitio XbaI original en un sitio NotI (subrayado doble en las secuencias de cebador posteriormente) y finalizando la inserción con un segmento protuberante de SpeI que es compatible con el segmento protuberante generado por la digestión con XbaI del vector. La ligación de la inserción EcoRI/SpeI en el vector cortado con EcoRI/XbaI resultó en un híbrido SpeI/XbaI que ya no se puede cortar con SpeI ni con XbaI en ese sitio. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados era la siguiente: "EcoSpe" 5' AA TTC AAG GAG TTA ATT ATG AAA AAA ACC GCG ATT GCG ATT GCG GTG GCG CTG GCG GGC TTT GCG ACC GTG GCC CAG GCG GCC TCT AGA ATC TGC GGC CGC a 3' (SEC ID nº 107), y "SpeEco" 5' ct agt GCG GCC GCA GAT TCT AGA GGC CGC CTG GGC CAC GGT CGC AAA GCC CGC CAG CGC CAC CGC AAT CGC AAT CGC GGT TTT TTT CAT AAT TAA CTC CTT G 3' (SEC ID nº 108).

El vector intermediario creado era pAX131Xba/Not. Se insertó la región constante kappa humana entre los sitios XbaI y NotI, generando pAX131-kappa (ver la figura 18). Se amplificó por PCR la región constante kappa humana a partir de ADNc humano utilizando cebadores que introdujeron el sitio XbaI corriente arriba y en la posición corriente abajo, un codón de parada TAA seguido de un sitio NotI. Los cebadores utilizados eran: CKXbaI (5' GGA GTC TAG ATA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC 3') (SEC ID nº 109) y CKNotI (5' AGG AGC GGC CGC TTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C 3') (SEC ID nº 110).

5 Las modificaciones por clonación de la cadena ligera incorporadas en pAX131-kappa se introdujeron en el vector pRL5 (modificado para eliminar su sitio NotI, tal como se ha descrito anteriormente) mediante desplazamiento del fragmento EcoRI a XhoI. Ver las figuras 19 y 20. Este vector se denominó pRL5-kappa (ver las figuras 21A-I).

Ejemplo 7

(biblioteca núcleo H-CDR2)

Se construyó una biblioteca CDR2 CP adicional en la que se había insertado en la cadena pesada una secuencia central del péptido mimético de TPO (GPTLRQWL) (SEC ID nº 112) flanqueada por un solo aminoácido aleatorio en 15 cada lado sustituyendo parcialmente la CDR2 (GXGPTLRQWLXYAQKFQG) (SEC ID nº 113). También se llevó a cabo la construcción de la biblioteca de sustitución parcial de CDR2 de cadena pesada tal como se ha descrito anteriormente para la biblioteca de CDR2 de cadena pesada con la excepción de que el cebador específico 8HCR2anti'0 (5' CAGCCACTGGCGCAGGGTTGGGCCMNNCCCTCCCATCCACTCAAGCCC 3') (SEC ID nº 114) que hibridaba en el extremo de la FR2 de cadena pesada, y el cebador 8HCR2code (5'

20 GGCCCAACCCTGCGCCAGTGGCTGNNKTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACCATT 3') (SEC ID nº 115) que hibridaba en el inicio de la FR3 de cadena pesada, se utilizaron en lugar de los cebadores HR2 cMpI anteriormente indicados. La biblioteca de sustitución parcial de CDR2 de cadena pesada se sometió a panning en cuatro rondas en células 293 EBNA transfectadas con cMpI-R, tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se cribaron estos clones para los clones ligantes positivos mediante análisis FACS, tal como se ha descrito anteriormente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento comprende un Fab, un F(ab’)2, un scFv, un Fv, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo, que comprende una

5 región i) en la que los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos una parte de un región determinante de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido biológicamente activo, o ii) en la que un péptido biológicamente activo es insertado en una CDR, en el que el péptido biológicamente activo es un péptido mimético.
2. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el péptido biológicamente activo es un 10 péptido mimético agonista.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende además por lo menos una secuencia flanqueante que comprende por lo menos un aminoácido que está unido covalentemente a por lo menos un extremo del péptido biológicamente activo.
4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el que dicha por lo menos una secuencia flanqueante comprende una prolina que está unida covalentemente al péptido biológicamente activo.
5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que la prolina está unida covalentemente al extremo carboxi-terminal 20 del péptido biológicamente activo.
6. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) están cada una sustituidas con el péptido biológicamente activo.

25 7. Anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido biológicamente activo se encuentra flanqueado en su extremo carboxi-terminal por una secuencia aminoácida seleccionada de entre el grupo constituido por prolina-valina, prolina-ácido aspártico, prolina-isoleucina, serina-asparagina, serina-lisina, serinaglicina, serina-arginina, leucina-histidina, leucina-ácido glutámico, leucina-alanina, leucina-fenilalanina, valinaglutamina, valina-serina, valina-alanina, valina-asparagina, isoleucina-serina, isoleucina-tirosina, asparagina-prolina,

30 asparagina-serina, asparagina-triptófano, asparagina-valina, fenilalanina-valina, treonina-serina, metionina-alanina, arginina-serina, arginina-glicina, arginina-treonina, arginina-leucina, arginina-valina, triptófano-arginina, triptófanotriptófano, alanina-arginina, ácido aspártico-valina, glicina-tirosina, glutamina-arginina y glicina-lisina.
8. Anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido biológicamente activo se

35 encuentra flanqueado en su extremo amino-terminal por una secuencia aminoácida seleccionada de entre el grupo constituido por triptófano-leucina, valina-valina, glicina-prolina, leucina-prolina, leucina-tirosina, serina-leucina, serina-isoleucina, serina-prolina, treonina-metionina, treonina-tirosina, treonina-prolina, glutamina-treonina, glutamina-ácido glutámico, glutamina-leucina, arginina-metionina, arginina-asparagina, arginina-treonina, argininaglicina, arginina-serina, lisina-ácido glutámico, lisina-glicina, alanina-histidina, histidina-glicina, histidina-leucina y

40 asparagina-prolina.
9. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo es seleccionado de entre el grupo constituido por fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 y fragmento scFv.

45 10. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es una molécula de IgG completa.
11. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es

humano. 50
12. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es el toxoide antitetánico.
13. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR se encuentra situada en una 55 cadena ligera.
14. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR se encuentra situada en una cadena pesada.

60 15. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que los residuos aminoácidos que corresponden a una parte de más de una CDR son sustituidos.
16. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que las regiones CDR3 de una cadena pesada

y una cadena ligera están cada una sustituidas con el péptido mimético. 65
17. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR es seleccionada de entre el grupo constituido por una CDR3 de una cadena pesada y una CDR2 de una cadena ligera.
18. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR es seleccionada de entre el grupo 5 constituido por la CDR3 de una cadena pesada y la CDR2 de una cadena pesada.
19. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR es seleccionada de entre el grupo constituido por la CDR3 de una cadena pesada y la CDR1 de una cadena ligera.

10 20. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR comprende la CDR2 y la CDR3.
21. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 20, en el que la CDR se encuentra situada en una cadena pesada.

15 22. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 20, en el que la CDR se encuentra situada en una cadena ligera.
23. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 6, en el que dichas por lo menos dos CDR son seleccionadas de entre el grupo constituido por CDR3 de cadena pesada y CDR2 de cadena pesada, CDR3 de

20 cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, CDR2 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena pesada y CDR2 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, y CDR3 de cadena pesada y CDR1 de cadena ligera.
24. �?cido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1.

25 25. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 24.
26.

Célula huésped transformada con el vector de expresión según la reivindicación 25.
27.

Procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar una célula

30 huésped según la reivindicación 26 en unas condiciones adecuadas para la expresión de la inmunoglobulina o su fragmento.
28. Composición que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1 y un portador

farmacéuticamente aceptable. 35
29. Procedimiento de manipulación por ingeniería genética de un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, que comprende:

proporcionar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo;

40 sustituir por lo menos una parte de por lo menos una región codificante de CDR con ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo, o insertar el ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo en por lo menos una región codificante de CDR, en el que el péptido biológicamente activo es un péptido mimético; y

45 expresar el péptido codificado por el constructo de ácido nucleico junto con una cadena de anticuerpo seleccionada de entre el grupo constituido por cadena pesada y cadena ligera, en una célula huésped adecuada de manera que es formado un heterodímero.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el péptido biológicamente activo comprende una prolina 50 unida de manera covalente a un extremo carboxi-terminal del péptido biológicamente activo.
31. Biblioteca que contiene anticuerpos variados o fragmentos de los mismos según la reivindicación 1, presentando el péptido biológicamente activo por lo menos una secuencia flanqueante que ha sido aleatorizada para generar anticuerpos o fragmentos de los mismos que presentan unas secuencias aminoácidas variables.