ES2258558T3 - Anticuerpos diseñados racionalmente. - Google Patents
Anticuerpos diseñados racionalmente.Info
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Abstract
Molécula de inmunoglobulina que comprende una región en la que los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos una parte de una región determinante de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido mimético que es un mimético de la trombopoyetina (TPO), o en la que el péptido mimético que es un mimético de trombopoyetina se inserta en una CDR.
Description
Anticuerpos diseñados racionalmente.
La presente solicitud reivindica prioridad a la
solicitud provisional de patente US nº 60/251.448, presentada el 5
de diciembre de 2000, y de la solicitud provisional de patente US nº
60/288.889, presentada el 4 de mayo de 2001, y de la solicitud
provisional de patente US nº 60/294.068, presentada el 29 de mayo de
2001.
La presente invención se refiere a moléculas de
anticuerpo y a péptidos biológicamente activos como reactivos
diagnósticos y terapéuticos.
Los anticuerpos son producidos por los
linfocitos B y constituyen una defensa frente a las infecciones. Los
anticuerpos se producen en millones de formas, cada una de las
cuales presenta una secuencia aminoácida diferente. Las moléculas de
anticuerpo están compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y de
dos cadenas pesadas idénticas. Cuando se digieren con el enzima
papaína, se generan dos fragmentos Fab idénticos junto con un
fragmento Fc. Cuando se digieren con el enzima pepsina, se produce
un fragmento F(ab')_{2}. Las cadenas ligeras y pesadas
constan de regiones constantes y de regiones variables. Dentro de
las regiones variables existen regiones hipervariables (también
conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR))
que forman el sitio de unión al antígeno. Las partes restantes de
las regiones variables se denominan regiones de marco.
Algunas funciones biológicas importantes, tales
como la unión de receptores, la activación y la actividad
enzimática, con frecuencia pueden atribuirse a regiones discretas de
moléculas de proteína más grandes, que comprenden un número limitado
de residuos aminoácidos. También se han descubierto péptidos que
muestran actividades de unión, de activación o enzimáticas mediante
el cribado de bibliotecas de péptidos generadas mediante la unión
aleatoria de residuos aminoácidos. Estos péptidos pueden no
corresponder a una disposición lineal de los aminoácidos en una
molécula de proteína más grande que muestra una actividad biológica
similar y se hace referencia a ellos como epítopos o mimótopos
peptídicos discontinuos. Se han descrito y clonado determinados
péptidos miméticos. Ver, por ejemplo, la patente US nº 6.083.913
(mimético de la trombopoyetina (TPO)), la patente US nº 5.835.382
(mimético de la eritropoyetina (EPO)), la patente US nº 5.830.851
(mimético de la EPO) y Wrighton et al., Science
273:458-63, (1996). Los epítopos y mimótopo de
péptidos, debido a sus dimensiones reducidas resultan potencialmente
ventajosos respecto a las moléculas de proteína de gran tamaño para
la utilización como reactivos terapéuticos. Sin embargo, los
resultados con estos péptidos como compuestos terapéuticos con
frecuencia pueden resultar insatisfactorios. Una desventaja de la
utilización de los péptidos como reactivos terapéuticos es que
generalmente son inestables in vivo, es decir, sus tasas de
eliminación del suero pueden ser bastante rápidas. Además, resulta
difícil predecir la actividad, terapéutica u otra, de un péptido si
se fusiona con una molécula mayor debido a que los cambios de
conformación y otras fuerzas moleculares pueden interferir con la
actividad del péptido o bloquearla totalmente.
Los documentos WO-96/40189 y
WO-00/24782 describen secuencias de mimético del
péptido TPO.
El documento WO-99/10494
describe anticuerpos que son ellos mismos miméticos de TPO y que se
han seleccionado mediante expresión en fago. Monfardini Cristina
et al., vol. 270, nº 12, 1995, páginas
6626-6638 describen un anticuerpo que imita a
GM-CSF. Cook et al., Vaccine, Butterworth
Scientific, Guildford, vol. 13, nº 18, 1995, páginas
1770-1778, describe anticuerpos recombinantes que
presentan inserciones de CDR y también describe su conveniencia para
la presentación de epítopos.
Se han llevado a cabo intentos para introducir
determinados polipéptidos en regiones CDR de los anticuerpos. Ver,
por ejemplo, la solicitud PCT WO 94/18221. Sin embargo, tal como se
ha indicado anteriormente, debido a los cambios de conformación que
pueden provocar los aminoácidos flanqueantes, la actividad biológica
de los polipéptidos activos puede resultar disminuida o anulada. Por
lo tanto, un objetivo en la presente memoria consiste en
proporcionar anticuerpos diseñados racionalmente, o fragmentos de
los mismos, que incluyan péptidos biológicamente activos para la
utilización como reactivos diagnósticos y terapéuticos.
Se proporcionan en la presente memoria
anticuerpos recombinantes biológicamente activos que imitan la
actividad de los péptidos biológicamente activos, procedimientos
para preparar estos anticuerpos y procedimientos para su utilización
en la terapia y el diagnóstico. Estos anticuerpos no adolecen de
algunas de las desventajas de los péptidos aislados, debido a que
los anticuerpos presentan naturalmente vidas medias séricas
prolongadas y son altamente específicos en la unión a su diana.
Inesperadamente se ha descubierto que la incorporación de
aminoácidos particulares flanqueando un péptido diana que se ha
insertado en una molécula de anticuerpo incrementa finalmente la
actividad biológica del péptido.
Las inmunoglobulinas presentan un péptido de
interés insertado en una región determinante de complementariedad
(CDR) de una molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo sirve
como estructura para la presentación del péptido y proporciona al
péptido una mayor estabilidad. El péptido sustituye opcionalmente
todos los aminoácidos de una región CDR, o puede añadirse a una CDR
existente, de manera que se altere la especificidad del antígeno
original, de manera que la región CDR se define mediante cualquiera
de los dos esquemas aceptados (ver Kabat et al., Sequences of
Proteins of Immunologics Interest, 5ª edición (1991), NIH
Publication 91-3242, y Chothia et al., J.
Mol. Bio. (227):776-98, (1992)). Además, pueden
introducirse aleatoriamente aminoácidos adicionales flanqueando el
péptido y que permitan el cribado para una presentación óptima del
péptido en el marco del anticuerpo. Inesperadamente se ha
descubierto que en determinados casos una prolina que flanquee el
péptido da lugar a un incremento de la actividad biológica.
En formas de realización particulares, una
molécula de inmunoglobulina presenta residuos aminoácidos que
corresponden a una región determinante de complementariedad (CDR)
que han sido sustituidos por residuos aminoácidos que comprenden un
péptido trombopoyético biológicamente activo. En otra forma de
realización particular, los residuos aminoácidos que corresponden a
por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR)
han sido, cada una de ellas, sustituidas por residuos aminoácidos
que comprenden dicho péptido biológicamente activo. En una sola
molécula de inmunoglobulina pueden sustituirse una o más regiones
determinantes de complementariedad por un péptido; por ejemplo, CDR3
de una cadena pesada, CDR3 de una cadena ligera, CDR3 de una cadena
pesada y de una cadena ligera, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada, o
CDR2 y CDR3 de una cadena ligera. Resultan posibles otras
combinaciones de sustituciones de regiones CDR, incluyendo la
sustitución de CDR1. Además, en lugar de sustituir una CDR, podría
añadirse el péptido a una CDR nativa sin sustituir de hecho ningún
residuo aminoácido y todavía alterar la especificidad original de
antígeno.
De esta manera, en un aspecto se proporciona un
péptido biológicamente activo con actividad mejorada mediante la
adición de una prolina en su extremo carboxi con el fin de formar un
péptido biológicamente activo extendido con prolina que se utiliza
para sustituir o añadir por lo menos una parte de por lo menos una
región CDR en una molécula de inmunoglobulina. En otro aspecto, se
proporciona una molécula de inmunoglobulina que presenta un péptido
mimético de TPO como sustitución para por lo menos una región CDR
nativa. En este aspecto, el péptido mimético de TPO puede extenderse
opcionalmente con prolina, tal como se describe en la presente
memoria.
En las formas de realización particulares
adicionales, la molécula de inmunoglobulina es un Fab, un ScFv, una
región variable de cadena pesada, una cadena ligera o una molécula
completa de IgG. La molécula de inmunoglobulina también puede
presentar un dominio de dimerización, de manera que permita que las
moléculas de inmunoglobulina en las que únicamente una CDR ha sido
sustituida por un péptido, se dimericen y de esta manera activen los
receptores que requieren la dimerización para su activación.
En determinadas formas de realización, el
péptido biológicamente activo puede ser un epítopo de péptido lineal
o un epítopo de péptido discontinuo. Además, el péptido
biológicamente activo, cuando se sustituye por una región CDR, puede
presentar, además de la prolina, dos o más residuos aminoácidos
flanqueantes adicionales en posición proximal a los extremo
aminoterminal y/o carboxi-terminal del péptido, que
se sitúan entre el péptido y los residuos de la región marco de la
inmunoglobulina (es decir, en lo que anteriormente era la unión
entre la CDR y el marco contiguo). Los residuos aminoácidos
flanqueantes típicamente no se encuentran presentes en el péptido
activo. Si ya son conocidos los residuos aminoácidos flanqueantes
preferentes, éstos se encuentran codificados por codones que
designan aquellos residuos aminoácidos específicos. Sin embargo,
mediante la utilización inicial de codones, tales como NNK, NNY,
NNR, NNS y similares, que designan múltiples residuos aminoácidos,
se genera una colección de péptidos que difieren entre sí
simplemente por los residuos flanqueantes. Los residuos aminoácidos
flanqueantes pueden determinar la presentación del péptido en la
molécula de inmunoglobulina y de esta manera pueden influir sobre la
unión y/o actividad biológica mostrada por el péptido. Esta
colección aleatoria de aminoácidos flanqueantes permite la selección
del contexto óptimo de expresión de la secuencia peptídica dentro
del marco del anticuerpo que resulte en la unión específica a la
molécula diana y la expresión óptima de la actividad biológica. El
cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas que presentan un péptido
común pero diferentes residuos aminoácidos flanqueantes puede
llevarse a cabo utilizando ensayos de unión, de crecimiento y de
activación conocidos por los expertos en la materia y tal como se
describe en la presente memoria.
De esta manera, en un aspecto la presente
invención proporciona un anticuerpo agonista que comprende un marco
de anticuerpo manipulado para que contenga por lo menos un péptido
biológicamente activo que es un mimético de trombopoyetina (TPO)
insertado o en sustitución de por lo menos una parte de una o más
CDR. El péptido biológicamente activo muestra actividad agonista
previamente a la inserción en el marco del anticuerpo. En
determinadas formas de realización, el marco del anticuerpo se
manipula para que contenga dos péptidos capaces de dimerizarse entre
sí.
En todavía otro aspecto, la presente invención
proporciona una molécula de inmunoglobulina que comprende una región
en la que los residuos aminoácidos correspondientes a por lo menos
una parte de una región determinante de complementariedad (CDR) son
sustituidos por un péptido biológicamente activo que es un mimético
de TPO, de manera que la molécula de inmunoglobulina muestra
actividad agonista. El péptido biológicamente activo muestra
actividad agonista previamente a la inserción en el marco del
anticuerpo. En formas de realización particularmente útiles, la
molécula de inmunoglobulina muestra actividad agonista de cMpI.
El péptido que sustituye los aminoácidos de una
CDR es un péptido agonista mimético de TPO. Uno de estos péptidos
agonistas presenta por lo menos la secuencia IEGPTLRQWLAARA (SEC. ID
nº 1). Otras secuencias resultan posibles para los péptidos
agonistas miméticos de TPO que pueden encontrarse mediante ensayos
de unión, de crecimiento y de activación conocidos por los expertos
en la materia y tal como se describe en la presente memoria. Los
péptidos agonistas miméticos de TPO, cuando se sitúan en regiones
CDR pueden presentar uno o más residuos aminoácidos adicionales en
los extremos amino-terminal y/o
carboxi-terminal del péptido, que se unen
covalentemente a los residuos de marco de la inmunoglobulina. Uno de
estos péptidos miméticos de TPO presenta un residuo adicional de
prolina añadido en el extremo carboxilo; IEGPTLRQWLAARAP (SEC. ID nº
2). Otras moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas
presentan una región CDR sustituida por los péptidos miméticos de
TPO, que comprende la secuencia aminoácida de las SEC. ID nº: 25,
27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49 (ver la fig. 5).
De esta manera, en formas de realización
particulares proporcionadas en la presente memoria, se encuentran
moléculas de inmunoglobulina (IgG) o fragmentos de las mismas (por
ejemplo Fab, scFv, cadenas pesadas o ligeras) que presentan una
región CDR sustituida por un péptido mimético de TPO. Por ejemplo,
el péptido TPO puede incluir por lo menos la secuencia
IEGPTLRQWLAARA (SEC. ID nº 1) y opcionalmente puede presentar una
prolina adicional en la posición inmediatamente corriente abajo.
Cualquier molécula de inmunoglobulina
(anticuerpo) o fragmento de la misma potencialmente podría
proporcionar el marco y presentar una sustitución de la CDR por un
péptido según la presente invención. Para la utilización terapéutica
o diagnóstica in vivo resulta preferente que el anticuerpo
sea de origen humano o se encuentre humanizado, tal como una
inmunoglobulina antitoxoide de tétano. Además, independientemente o
conjuntamente con la presencia de aminoácidos flanqueantes
adicionales unidos al péptido, puede alterarse uno o más residuos
aminoácidos en otras regiones de la inmunoglobulina, en otra región
o regiones CDR y/o en otras regiones marco con el fin de modificar
la unión, la actividad y/o la expresión del péptido en el contexto
de la molécula de inmunoglobulina.
Se contempla que, tras la construcción de
anticuerpos recombinantes biológicamente activos, dichos
recombinantes puedan someterse a procedimientos de aleatorización
conocidos de la técnica para introducir mutaciones en uno o más
puntos en la secuencia con el fin de alterar la actividad biológica
de los anticuerpos. Tras la generación de estos mutantes mediante la
utilización de procedimientos de aleatorización, tales como los
descritos en la presente memoria, los recombinantes resultantes
pueden someterse a ensayo para actividad utilizando ensayos de
unión, de crecimiento, de expresión y de activación.
Se proporcionan asimismo moléculas de ácido
nucleico que codifican moléculas de inmunoglobulina que presentan
los aminoácidos de una o más regiones CDR sustituidas por un péptido
biológicamente activo. Estas moléculas de ácido nucleico pueden
encontrarse presentes en un vector de expresión que puede
introducirse (transfectarse) en una célula huésped recombinante para
la expresión de estas moléculas. También se proporcionan
procedimientos para la producción de una molécula de inmunoglobulina
o fragmento de la misma que contiene un péptido biológicamente
activo, que comprende cultivar una célula huésped recombinante bajo
condiciones tales que el ácido nucleico contenido dentro de la
célula se exprese.
También se proporcionan composiciones que
comprenden una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de la
misma, que presenta residuos aminoácidos correspondientes a una CDR
sustituida por residuos aminoácidos, que comprende un péptido
mimético de TPO y un portador farmacéuticamente aceptable.
También se proporcionan procedimientos de
manipulación de las moléculas de inmunoglobulina para que muestren
una actividad agonista en la que un péptido biológicamente activo
que es un mimético de TPO, sustituya por lo menos una parte de una o
más regiones CDR de cadenas ligeras y/o pesadas. Los procedimientos
incluyen insertar una molécula de ácido nucleico que codifica un
péptido biológicamente activo que es un mimético de TPO en el lugar
de por lo menos una región CDR de una molécula de ácido nucleico que
codifica una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, o añadir la
molécula a la secuencia CDR nativa y después expresar la molécula de
ácido nucleico que codifica el dominio variable de cadena pesada o
ligera de inmunoglobulina junto con su dominio complementario de
región variable, de manera que se asocien los dos dominios.
Además, se proporcionan procedimientos de
manipulación de moléculas de inmunoglobulina para que muestren una
actividad (propiedad) de un péptido TPO biológicamente activo, en
los que un péptido biológicamente activo sustituye una o más
regiones CDR de cadenas ligeras y/o pesadas. Los procedimientos
incluyen insertar una molécula de ácido nucleico que codifica un
péptido biológicamente activo en el lugar de por lo menos una parte
de una región CDR de una molécula de ácido nucleico que codifica una
cadena pesada o ligera de inmunoglobulina o añadir la molécula a la
secuencia CDR nativa y expresar la molécula de ácido nucleico que
codifica el dominio variable de cadena pesada o ligera de
inmunoglobulina junto con su dominio complementario de región
variable, de manera que se asocien las dos cadenas.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para la producción en un polipéptido de
un sitio de unión capaz de unirse a un agente preseleccionado,
incluyendo el procedimiento las etapas de introducir una secuencia
nucleotídica que codifica una secuencia de residuos aminoácidos que
define dicho sitio de unión en una región CDR de un ácido nucleico
que comprende un gen de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina
mediante la amplificación de la región CDR del gen de
inmunoglobulina, presentando la secuencia nucleótida introducida la
fórmula X_{a}-Y-X_{b}, en la que
X es igual o diferente en cada aparición y representa un
trinucleótido de aleatorización, la suma de a y b es 4 o menos, e Y
es una secuencia nucleótida que codifica un dominio de
reconocimiento mínimo de dicho sitio de unión. En las formas de
realización particularmente útiles, la amplificación se consigue
utilizando PCR de solapamiento, sin embargo, puede utilizarse
cualquier técnica de amplificación conocida, tal como, por ejemplo,
los procedimientos dados a conocer en la patente WO nº 94/18221,
cuya exposición se incorpora en la presente memoria como
referencia.
En todavía otro aspecto, la presente invención
proporciona procedimientos para la creación de una biblioteca de
anticuerpos monoclonales que pueden cribarse para una actividad
deseada. Estos procedimientos para la preparación de una biblioteca
incluyen las etapas de insertar una molécula de ácido nucleico que
codifica un péptido biológicamente activo en, o en el lugar de, por
lo menos una parte de una o más regiones CDR de una molécula de
ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera de
inmunoglobulina, proporcionando hasta un par de trinucleótidos de
aleatorización en cada lado de la molécula de ácido nucleico
insertada y expresando una biblioteca de anticuerpos monoclonales.
En las formas de realización particularmente útiles, se proporciona
un par de trinucleótidos de aleatorización en ambos lados de las
moléculas insertadas de ácido nucleico. La biblioteca de anticuerpos
monoclonales producida de esta manera puede cribarse a continuación
para una actividad deseada.
En una forma de realización específica, los
anticuerpos presentan diferentes aminoácidos flanqueando el péptido
en los extremos amino y carboxilo donde el péptido se une a la
estructura del anticuerpo. Ello resulta en una población de
moléculas de anticuerpo que puede ser diferente respecto a la
presentación del péptido. La población se criba para estos
anticuerpos que muestran la actividad biológica del péptido. En una
forma de realización preferente, el aminoácido inmediatamente
contiguo al péptido es una prolina.
Si la actividad del péptido biológicamente
activo es activar una molécula diana, ello puede requerir la
dimerización de dos moléculas diana (por ejemplo los receptores en
las superfamilias hematopoyéticas). Para que se produzca la
dimerización, deben situarse dos péptidos para que cada uno se una a
una molécula diana de manera que las dos moléculas diana unidas
puedan asociarse a continuación de manera apropiada. Ello puede
conseguirse con la presencia de dos péptidos en el mismo anticuerpo
o causando que dos moléculas de anticuerpo, cada una de las cuales
contiene un péptido, se unan entre sí. De esta manera, por ejemplo,
puede insertarse o sustituirse un solo péptido por como mínimo una
parte de una CDR y después expresarse como una inmunoglobulina o
como un fragmento F(ab')_{2}. A título de ejemplo
adicional, pueden insertarse dos péptidos o sustituirse por como
mínimo una parte de una o más CDR y expresarse como cualquier
anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
El cribado de anticuerpos puede conseguirse
mediante separación por panning con células que presentan
moléculas de superficie a las que se une específicamente el péptido.
También puede utilizarse la unión a fase sólida con moléculas diana
purificadas. La unión también puede llevarse a cabo en solución
utilizando moléculas diana marcadas. Además, pueden cribarse
anticuerpos mediante la utilización de ensayos biológicos para
actividad agonista o antagonista del péptido.
Se proporcionan asimismo bibliotecas de
diferentes moléculas de inmunoglobulina, en las que los residuos
aminoácidos correspondientes a una región determinante de
complementariedad (CDR) se sustituyen por residuos aminoácidos que
comprenden un péptido biológicamente activo que presenta por lo
menos un residuo aminoácido adicional en el extremo amino o
carboxilo y en las que las moléculas de inmunoglobulina difieren en
el residuo aminoácido adicional del péptido.
En las formas de realización específicas, el
péptido biológicamente activo es un mimético de TPO. Los anticuerpos
de la biblioteca se expresan en un fago.
Adicionalmente se dan a conocer usos de
medicamentos que comprenden moléculas de inmunoglobulina de la
presente invención que estimulan la proliferación, diferenciación o
crecimiento de las células, que incluyen poner en contacto las
células con una cantidad efectiva de una molécula de inmunoglobulina
que presenta la sustitución de una o más CDR por un péptido
biológicamente activo que es un mimético de TPO.
En otras formas de realización específicas, se
da a conocer la utilización de un medicamento según la presente
invención que estimula la proliferación, diferenciación o
crecimiento de los megacariocitos mediante el contacto de éstos con
una cantidad efectiva de una molécula de inmunoglobulina que
presenta la sustitución de una o más CDR por un péptido mimético de
TPO. Se dan a conocer asimismo usos de un medicamento de la
invención que incrementan la producción de plaquetas, que implican
la puesta en contacto de los megacariocitos con una cantidad
efectiva de una molécula de inmunoglobulina que presenta la
sustitución de una o más regiones CDR por un péptido mimético de
TPO. También se dan a conocer usos de un medicamento de la invención
en la estimulación de los megacariocitos y/o en el incremento de la
producción de plaquetas en un paciente, en los que se administra a
un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de una molécula de
inmunoglobulina que presenta la sustitución de una o más regiones
CDR por un péptido mimético de TPO. La molécula de inmunoglobulina y
los megacariocitos también pueden ponerse en contacto in
vitro e introducirse las células resultantes en el paciente.
Además, puede administrarse a un sujeto que pretende donar
plaquetas, un anticuerpo que presenta por lo menos un péptido
mimético de TPO incorporado al mismo, incrementando de esta manera
la capacidad del donante de generar plaquetas con el fin de
proporcionar una fuente más robusta de las mismas.
En la presente memoria se proporciona asimismo
un procedimiento para activar una proteína receptora homodimérica
mediante la puesta en contacto del receptor con una molécula de
inmunoglobulina que presenta una región CDR sustituida por un
péptido biológicamente activo que se une específicamente al receptor
y que ha sido dimerizada. En una forma de realización adicional el
receptor es un receptor de trombopoyetina.
La figura 1 es una representación diagramática
del vector pRL4.
Las figuras 2A y 2B muestran la secuencia de
marco de las cadenas pesada y ligera, respectivamente, del
anticuerpo humano del toxoide de tétano.
La figura 3 es un diagrama que ilustra el
injerto del péptido mimético de TPO, AF12505, en la región CDR3 de
cadena pesada del anticuerpo marco del toxoide de tétano. XX
representa los aminoácidos aleatorios flanqueantes.
La figura 4 es un diagrama de la construcción de
un péptido clonado en la región CDR3 de cadena pesada.
La figura 5 representa las secuencias de
aminoácidos y de nucleótidos que codifican el péptido mimético de
TPO, AF1205, con diferentes residuos flanqueantes aleatorios.
Las figuras 6A-C ilustran la
secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pRL8 (SEC ID nº 60). pRL8
es una versión modificada de pRL4 (pRL4 también se conoce como pComb
3X). Se modificó pRL4 entre los sitios de restricción SpeI y el SfiI
contiguo (mostrado en subrayado) para que incluyese un linker
flexible (región de bisagra kappa murina) seguido de un dominio de
Jun de dimerización de cremallera de leucina.
La figura 7 es una ilustración esquemática de
una parte del plásmido pRL8.
La figura 8 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos de una parte del plásmido pRL8 (SEC ID nº 52) junto con
las secuencias aminoácidas correspondientes a determinadas
secuencias identificadas de ácidos nucleicos (SEC ID nº 53).
La figura 9 es una tabla que muestra las
secuencias de determinados clones positivos para TPO en la presente
memoria.
La figura 10 es un histograma que muestra la
actividad de determinados clones de Fab que contienen 2 péptidos
miméticos de TPO.
La figura 11 es un histograma que muestra la
actividad de determinados clones de Fab que contienen 2 ó 3 péptidos
miméticos de TPO.
La figura 12 ilustra gráficamente la actividad
del clon 59 según indica la actividad de luciferasa.
La figura 13A ilustra la secuencia aminoácida y
la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena pesada de
5G1.1-TPO (SEC ID nº 67 y nº 68,
respectivamente).
La figura 13B ilustra la secuencia aminoácida y
la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena ligera de 5G1.1 (SEC
ID nº 69 y 70, respectivamente).
La figura 14 es un histograma que muestra el
análisis FACS de la unión del receptor cMpI de 5G1.1 purificado +
péptido mimético de TPO en comparación con el anticuerpo 5G1.1
parental.
La figura 15 es un histograma que muestra la
actividad comparativa de anticuerpo 5G1.1 que contiene el péptido
mimético de TPO en células transfectadas con un vector de control
que no contiene cMpI-R y en células transfectadas
con un vector que contiene cMpI-R.
La figura 16 muestra la secuencia del clon
429/Xb4 (SEC ID nº 116).
La figura 17 es un diagrama de flujo que muestra
las etapas iniciales para preparar el vector
pRL5-Kappa.
La figura 18 es un diagrama de flujo que muestra
etapas adicionales para preparar el vector
pRL5-Kappa.
La figura 19 es un mapa del vector pRL5.
La figura 20 es un esquema el vector
pRL5-Kappa.
La figura 21A-I muestra la
secuencia de ácidos nucleicos del vector
pRL5-Kappa.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"inmunoglobulina" se refiere a una o más moléculas completas de
inmunoglobulina que contienen partes inmunológicamente activas de
moléculas completas de inmunoglobulina, e incluye Fab,
F(ab')_{2}, scFv, Fv, regiones variables de cadena pesada y
regiones variables de cadena ligera. Los términos inmunoglobulina y
anticuerpo se utilizan de manera intercambiable en la presente
memoria.
Cualquier péptido que muestre una propiedad útil
resulta adecuado para la inserción en un anticuerpo que sirve de
marco. Entre las actividades y usos de péptidos se incluyen, aunque
sin limitarse a ellas, la unión a un receptor, la unión de una
molécula de superficie unida a membrana, la unión a un ligando, la
unión a un enzima o a una proteína estructural, la activación o la
inhibición de un receptor, la administración dirigida de fármacos, o
cualquier actividad enzimática. Habitualmente se seleccionan
aquellos péptidos cuya utilidad puede incrementarse a partir de la
mayor estabilidad adquirida cuando se presentan en el contexto de
una molécula de inmunoglobulina. Debe entenderse que "actividad
biológica" tal como se utiliza en la presente memoria incluye
cualquier actividad asociada con una molécula que presenta actividad
en un sistema biológico, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas,
la actividad estimulante o inhibitoria desencadenada por
interacciones proteína-proteína, así como la
cinética referida a estas interacciones, incluyendo la estabilidad
de un complejo proteína-proteína. En la presente
memoria potenciar o incrementar la "actividad biológica"
pretende incluir un incremento de la actividad global o un
incremento en cualquier componente de la actividad global. Debe
entenderse que un péptido puede mostrar una actividad biológica (tal
como, por ejemplo, unirse simplemente a una diana) antes de la
inserción en el marco de anticuerpo, y una actividad biológica
diferente o incrementada (tal como, por ejemplo, una actividad
agonista) tras la inserción en el marco del anticuerpo.
Los expertos en la materia han identificado y
conocen muchos péptidos que podrían resultar beneficiados de su
expresión en el contexto de una inmunoglobulina, por ejemplo los
péptidos miméticos de TPO. Entre otros ejemplos se incluyen péptidos
que se unen a receptores que resultan activados por la
homodimerización inducida por ligando, incluyendo fragmentos activos
que muestran actividad de G-CSF, actividad de GHR y
actividad de prolactina, tal como describen Whitty y Borysenko,
Chem. Biol. 6(4):R107-18 (abril 1999);
entre otros ejemplos de péptidos adecuados se incluyen un mimético
del factor de crecimiento nervioso procedente del asa CD, tal como
se describe en Zaccaro et al., Med. Chem.
43(19):3530-40 (2000); un mimético de
IL-2, tal como describen Eckenberg et al., J.
Immunol. 165(8):4312-8 (2000); péptido 1
similar a glucagón, tal como describen Evans et al., Drugs
R.D. 2(2):75-94 (1999); tetrapéptido I
(D-lisina-L-asparaginil-L-prolil-L-tirosina),
que estimula la proliferación de las células B activadas por
mitógeno, tal como describen Gagnon et al., Vaccine
18(18):1886-92 (2000). También se contemplan
los péptidos que muestran actividad antagonista de receptor. Por
ejemplo, el péptido N-terminal de
vMIP-II como antagonista de CXCR4 para la terapia
anti-VIH, tal como se describe en Luo et al.,
Biochemistry 39(44):13545-50 (2000);
ligando de péptido antagonista (AFLARAA) del receptor de la trombina
para la terapia antitrombótica, tal como se describe en Pakala et
al., Thromb. Res. 100(1):89-96 (2000); el
antagonista CGRP (8-37) del receptor del péptido
CGRP para atenuar la tolerancia a los narcóticos, tal como se
describe en Powell et al., Br. J. Pharmacol.
131(5):875-84 (2000); el antagonista del
receptor (PTH)-1 de la hormona paratiroidea,
conocido como péptido tuberoinfundibular (7-39), tal
como se describe en Hoare et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.
295(2):761-70 (2000); el factor de
crecimiento opiáceo, tal como describen Zagon et al., Int.
J. Oncol. 17(5):1053-61 (2000); los
antagonistas de afinidad elevada de los receptores de tipo I de la
interleuquina 1, tal como dan a conocer Yanofsky et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, páginas
7381-7386, julio de 1996, y Vigers et al., J.
Biol. Chem. vol. 275, nº 47, páginas 36927-36933,
2000; y el péptido de unión ácido de factor de crecimiento
fibroblástico, tal como se describe en Fan et al., IUBMB Life
49(6):545-48 (2000). También pueden
descubrirse péptidos utilizando procedimientos que resultan
familiares para los expertos en la materia. Con el fin de
identificar una región de una proteína que se encuentra implicada en
una función biológica específica, un reconocimiento de los
fragmentos peptídicos más cortos que constituyen la proteína puede
revelar el epítopo de péptido lineal responsable. Alternativamente,
mediante el reconocimiento de bibliotecas de péptidos aleatorios
puede descubrirse un péptido que represente un epítopo lineal óptimo
o un epítopo discontinuo que imite la actividad de la proteína
natural. Un procedimiento para la selección se denomina expresión
peptídica en fago. En este enfoque, se genera una biblioteca de
péptidos epítopos aleatorios de manera que los péptidos se
encuentren presentes sobre la superficie de una partícula de
bacteriófago. Estas colecciones o bibliotecas de péptidos pueden a
continuación analizarse con el fin de identificar aquellas capaces
de unirse a una proteína diana inmovilizada específica (Pasqualini,
R. et al., J. Cell Biol. 130:1189-1196
(1995); Wrighton, N.C. et al., Science 273, páginas
458-463, 1996; Cwirla, S.E. et al., Science
276, páginas 1696-1699, 1997; Koivunen et
al., J. Biol. Chem. 268, páginas 20205-20210,
1993; Koivunen et al., Bio/Technol, 13, 1995, páginas
265-270; Healy et al., Biochem. 34, páginas
3948-3955, 1995; Pasqualini et al., J. Cell
Biol. 130, páginas 1189-1196, 1995). Resultan
asimismo posible sistemas alternativos de selección de péptidos,
incluyendo la expresión en superficie celular y la expresión
ribosómica.
Los péptidos miméticos utilizados de acuerdo con
la presente descripción presentan generalmente un número igual o
inferior al número de residuos aminoácidos que constituyen una
región CDR, aunque podrían ser más largos.
Cualquier anticuerpo puede servir de secuencia
estructural, sin embargo típicamente se seleccionan los anticuerpos
humanos debido a que la terapia en humanos es uno de los objetivos
finales. Los anticuerpos humanos o humanizados es menos probable que
provoquen respuestas inmunológicas adversas en un paciente humano.
El criterio principal de selección de un anticuerpo que sirva como
estructura para la inserción de un péptido es que la sustitución de
una o más CDR del anticuerpo con el péptido debe cambiar la
especificidad de antígeno. El anticuerpo puede ser un anticuerpo
completo o un fragmento Fab, scFv o F(ab')_{2} o parte de
los mismos.
Alternativamente, una biblioteca de anticuerpos
puede presentar una o más CDR de cadena pesada y/o ligera
sustituidas con un péptido deseado. A continuación, la biblioteca
resultante puede cribarse con el fin de identificar anticuerpos que
presenten una actividad deseada. Debe entenderse que puede
proporcionarse asimismo la aleatorización del péptido sustituido con
el fin de generar una biblioteca de anticuerpos.
Un anticuerpo útil es el Fab antitoxoide del
tétano (TT), debido a que es humano y debido a que la modificación
del HCDR3 resulta suficiente para cambiar la especificidad de
antígeno del anticuerpo (Barbas et al., J. Am. Chem. Soc.
116, páginas 2161-2162, 1994, y Barbas et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, páginas
2529-2533, 1995).
La injertación de la secuencia de ADN del
péptido de elección en un anticuerpo de manera que sustituya los CDR
de un anticuerpo con la secuencia peptídica se lleva a cabo mediante
la utilización de técnicas de ADN recombinante conocidas por los
expertos en la materia.
Entre los ejemplos de procedimientos que pueden
utilizarse para injertar un péptido deseado que presenta actividad
biológica en lugar de una región CDR se incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, la PCR por solapamiento, la clonación de sitios
de enzimas de restricción, la mutagénesis
sitio-específica y medios completamente sintéticos.
Para una descripción de las técnicas que implican PCR por
solapamiento, ver, por ejemplo, el Ejemplo 1 en la presente memoria.
La mutagénesis sitio-específica puede conseguirse de
varias maneras. Una se basa en la mutagénesis Kunkel dut/ung
(Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. vol. 82, páginas
488-92, (1985)). El kit de mutagénesis in
vitro Muta-Gene se encuentra disponible de
BioRad y se basa en dicha metodología (nº de cat.
170-3581 o nº de cat. 170-3580).
También se encuentran disponibles comercialmente varias herramientas
de mutagénesis basadas en la amplificación por PCR, tales como el
kit de mutagénesis sitio-dirigida QuickChange de
Stratagene y el kit de mutagénesis sitio-dirigida
basado en PCR de ExSite. Se encuentra disponible otro procedimiento
no PCR de Promega: el sistema de mutagénesis
sitio-dirigida in vitro GeneEditor. También
son bien conocidos, y se encuentran bien descritos, medios
completamente sintéticos, por ejemplo en Deng et al., Methods Mol
Biol. 51:329-42, (1995); Kutemeier et al.,
Biotechniques 17(2):242-246, (1994); Shi
et al., PCR Methods Appl. 3(1):46-53,
1993, y Knuppik et al., J. Mol. Biol.
11:296(1):571-86, 2000, cada uno de los
cuales se incorpora como referencia en la presente memoria en su
totalidad. Además, los procedimientos indicados anteriormente
utilizados para sustituir la totalidad o una parte de por lo menos
una secuencia CDR pueden utilizarse para injertar un péptido deseado
en el interior o contiguamente a por lo menos una secuencia nativa
de CDR sin sustituir la secuencia CDR original. De esta manera, se
forma un constructo de fusión CDR/péptido mimético biológicamente
activo.
Se contempla que puedan añadirse secuencias
flanqueantes a los extremos terminales carboxilo y/o amino del
péptido biológicamente activo. Las secuencias flanqueantes pueden
resultar útiles para reducir las restricciones estructurales sobre
el péptido injertado con el fin de permitir que adopte más
fácilmente una conformación necesaria para la actividad biológica.
En una forma de realización preferente, una región flanqueante que
incluye una prolina se une covalentemente al extremo
carboxi-terminal del péptido biológicamente activo
con el fin de crear un péptido biológicamente activo extendido con
prolina.
En una forma de realización, puede generarse una
región flanqueante mediante la aleatorización de dos posiciones
aminoácidas en cada lado del injerto peptídico con el fin de
determinar la mejor secuencia. De esta manera, puede generarse una
biblioteca que presente miembros con múltiples secuencias variadas.
Los constructos resultantes seguidamente se someten a ensayo para su
actividad biológica, tal como se indica posteriormente, mediante,
por ejemplo, técnicas de panning. Pueden generarse proteínas
recombinantes que presenten aminoácidos aleatorios en posiciones
específicas. Ello puede conseguirse modificando el ADN codificante.
Al introducir aleatorización en una posición específica de codón de
aminoácido, una estrategia de dopado preferente de
desoxirribonucleótido es (NNK)_{x}, con el fin de cubrir la
totalidad de los 20 aminoácidos y de minimizar el número de codones
de parada que se codifican. De acuerdo con ello, N puede ser A, C, G
o T (nominalmente equimolares), K es G o T (nominalmente
equimolares) y x típicamente es de aproximadamente hasta 5, 6, 7 u 8
o más, produciendo de esta manera bibliotecas de monopéptidos,
dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos, hexapéptidos,
heptapéptidos y octapéptidos o más. La tercera posición también
puede ser G o C, denominándose "S". De esta manera, NNK o NNS,
(i) codifican todos los aminoácidos, (ii) codifican únicamente un
codón de parada, y (iii) reducen el intervalo de preferencia
codónica de 6:1 a 3:1. Existen 32 codones posibles resultantes del
motivo NNK: 1 por cada 12 aminoácidos, 2 por cada 5 aminoácidos, 3
por cada 3 aminoácidos, y únicamente uno de los tres codones de
parada. Entre otras alternativas se incluyen, aunque sin limitarse a
ellas:
(NNN)_{x}, que podría proporcionar
todos los posibles aminoácidos y todas las paradas;
(NNY)_{x}, que elimina todas las
paradas y todavía cubre 14 de los 20 aminoácidos;
(NNR)_{x}, que cubre 14 de los 20
aminoácidos; y
(NNS)_{x}, que cubre todos los 20
aminoácidos y únicamente una parada.
La tercera posición nucleótida en el codón puede
construirse a medida utilizando cualquiera de las mezclas
degeneradas conocidas. Sin embargo, el grupo NNK, NNN, NNY, NNR, NNS
cubre las estrategias de dopaje utilizadas más frecuentemente y las
utilizadas en la presente memoria.
La colección de anticuerpos construidos que se
crean a lo largo de este procedimiento pueden cribarse para
identificar aquellos que muestran propiedades del péptido, tales
como, por ejemplo, anticuerpos expresados por fagos, esencialmente
como han descrito Barbas, C.F., III, Kang, A.S., Lerner, R.A. y
Benkovic, S.J., Assembly of combinatorial antibody libraries on
phage surfaces: the gene III site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, páginas 7978-7982, 1991, las cuales son
incorporadas en la presente memoria como referencia. Esta tecnología
permite expresar anticuerpos recombinantes (como anticuerpos
completos, Fab, F(ab')_{2} o scFv) sobre la superficie de
un bacteriófago filamentoso. El mismo fago presentará en su interior
los genes que codifican dicho anticuerpo específico.
Se contempla que pueda utilizarse en la presente
memoria cualquier otro procedimiento conocido para introducir
aleatorización en una secuencia. Por ejemplo, la PCR con
predisposición a cometer errores puede introducir mutaciones
aleatorias en las secuencias de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo,
Hawkins et al., J. Mol. Biol.
226(3):889-96, (1992)). En resumen, se
realiza la PCR bajo condiciones que comprometen la fidelidad de la
replicación, introduciendo de esta manera mutaciones aleatorias en
secuencias, tal como conseguirían los expertos en la materia. Tras
la generación de estos mutantes aleatorios, pueden introducirse en
formatos de expresión fágica, separarse por panning y de esta
manera evaluarse para su actividad. De manera similar, pueden
utilizarse bacterias particulares que se conoce proporcionan
mutaciones aleatorias de los genes, tales como células competentes
de Epicurian coli® XL-1-Red
(comercializadas por Stratagene, La Jolla, CA), que producen dichas
mutaciones durante la replicación de plásmido, con el fin de
proporcionar mutantes aleatorios que se criban a continuación para
actividad biológica según la presente invención.
Se contempla asimismo que pueda introducirse
aleatorización en cualquier punto en la secuencia nucleótida tras la
incorporación de un péptido activo en el anticuerpo con el fin de
alterar la actividad biológica global del mismo. De esta manera, no
sólo pueden llevarse a cabo alteraciones de la actividad biológica
de un péptido mimético causando mutaciones en la secuencia del
péptido, sino que pueden incorporarse mutaciones en la estructura
circundante, sometiendo a ensayo los constructos resultantes para
alteraciones en la actividad biológica o en la expresión. En efecto,
se contempla que puedan generarse y someterse a ensayo bibliotecas
que presentan repertorios de múltiples constructos resultantes de
dicha aleatorización.
Pueden utilizarse bibliotecas de cadenas únicas
según la presente invención debido a que un polipéptido contiene un
dominio de unión completo. La región variable de cadena ligera se
separa de la región variable de cadena pesada mediante una región
linker. La utilización de linkers cortos (<11 aminoácidos)
favorece la formación de un complejo dimérico, en el que la V_{H}
de un ScFv se asocia con la V_{L} de otra molécula ScFv y
viceversa, estas moléculas se denominan diacuerpos (Kortt, A.A.,
Malky, R.L., Caldwell, J.B., Gruen, L.C., Ivanci, N., Lawrence, M.G.
et al., Eur. J. Biochem. 221:151-157, 1994).
Ello se debe a que el plegado del ScFv monomérico resulta alterado
por los linkers de <11 aminoácidos (Alfthan, K., Takkinen, K.,
Sizman, D., Soderlund, H. y Teeri, T.T.,
Protein-Eng. 8:725-731, 1995). Los
linkers más largos (>11 aminoácidos) favorecen el plegamiento del
ScFv monomérico en un solo dominio de unión de antígeno, impidiendo
de esta manera la formación de un dímero.
Un vector de expresión fágica útil es pRL4,
también conocido como pComb 3X (ver la fig. 1). Este vector permite
la expresión de productos quiméricos de expresión sobre la
superficie de las partículas fagémidas empaquetadas. pRL4 es una
versión modificada de pComb3H (Barbas, C.F. III y Burton, D.R.,
Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries, Cold Spring
Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1994;
Burton, D.R.; Barbas, C.F. III, Advances in Immunology
57:191-280, 1994; Lang, I.M., Chuang, T.L., Barbas,
C.F. 30, Schleef, R.R., J. Biol. Chem.
271:30126-30135, 1996; Rader y Barbas, Phage
Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 2000. El diseño de pRL4 permite la
dimerización de los dominios de unión de antígeno de scFv en la
superficie del fago y en forma soluble, tal como se detalla
posteriormente. Cuando el plásmido se transforma en un huésped
bacteriano supE, tal como ER2537 (F' Sup E, New England Biolabs,
Beverly, MA), la mutación ámbar se suprime en aproximadamente el
cincuenta por ciento de las ocasiones. De esta manera, la mitad de
los scFvs expresados se fusionan con la proteína del gen III del
fago filamentoso (aminoácidos nº 230 a nº 406) y la otra mitad se
termina inmediatamente antes del gen III para producir scFv
soluble. Tanto el producto de fusión scFv-pIII como
el scFv soluble presentan la secuencia de señal OmpA y resultarán
transportados al periplasma, donde podrán formar complejos diméricos
de scFv, denominados diacuerpos (Kortt, A.A., Malby, R.L., Caldwell,
J.B., Gruen, L.C., Ivanci, N., Lawrence, M.C. et al., Eur. J.
Biochem. 221:151-157, 1994). Los diacuerpos se
espera que se plieguen de manera que la V_{H} de un scFv se aparee
con la V_{L} de un segundo scFv-pIII, resultando
en fragmentos divalentes de anticuerpo. En un huésped no supE, tal
como TOP1OF' (InVitrogen, Carlsbad, CA), se reconoce el codón de
parada ámbar, rindiendo diacuerpos de scFv soluble.
En el constructo final de expresión de cadena
única en pRL4, los fragmentos de anticuerpo de cadena única se
clonan corriente abajo del promotor lacZ de E. coli, del
sitio de unión ribosómica y de la secuencia líder ompA. Estos
elementos permiten la inducción de la expresión con IPTG, y la
secreción hacia el exterior de la célula mediante la secuencia líder
ompA cuando se expresan en la cepa supresora ER2537. Los
fragmentos de cadena única se fusionan dentro del marco de lectura
con las secuencias del gen III (gIII) del fago filamentoso
(aminoácidos nº 230 a nº 406). El producto proteico de gIII es una
proteína menor de cubierta que resulta necesaria para la
infectividad. Con la inducción del promotor por IPTG, se sintetiza y
se transporta la fusión anticuerpo-pIII de cadena
única hasta el espacio periplasmático bacteriano. En el espacio
periplasmático, se insertan en la membrana las proteínas de fusión
scFv-genIII. Con la sobreinfección con fago
ayudante, estos fragmentos se exportan fuera de la célula sobre la
superficie del fago en forma de fragmentos
pIII-anticuerpo. Entre otras proteínas posibles a
utilizar para la fusión sobre la superficie de los fagémidos se
incluyen la proteína filamentosa de cubierta pVIII y otras proteínas
de cubierta.
Las bibliotecas de fragmento Fab, que mantienen
el sitio nativo de reconocimiento de antígeno, resultan útiles para
garantizar el mantenimiento de la afinidad.
En el constructo final de expresión Fab híbrido
en pRL4, se clonan las cadenas ligera y pesada como un solo
fragmento Sfil. De esta manera, se clonan los fragmentos de cadena
ligera corriente abajo del promotor lacZ de E. coli, del
sitio de unión ribosómica y de la secuencia líder ompA. Estos
elementos permiten la inducción de la expresión con IPTG, y la
secreción hacia el exterior de la célula mediante la secuencia líder
ompA. Después de los fragmentos de cadena ligera se encuentra
un codón de parada, un segundo sitio de unión ribosómica, la
secuencia líder pelB de E. coli y la cadena pesada. Los genes
híbridos de cadena pesada se encuentran fusionados dentro del marco
de lectura con secuencias del gen III (gIII) de fago filamentoso
(aminoácidos nº 230 a nº 406). Se encuentra presente un codón de
parada ámbar en el punto de fusión. En un huésped bacteriano supE,
tal como ER2357 (New England Biolabs, Beverly, MA), se suprime la
mutación ámbar. Al inducirse el promotor, se transcribe un solo
mensaje policistrónico y se traduce como dos polipéptidos, una
proteína de fusión de gen III de una cadena ligera y una cadena
pesada. Tras la síntesis, los polipéptidos son transportados al
espacio periplasmático bacteriano, dirigidos por las secuencias
líder. En el espacio periplasmático, las proteínas de fusión cadena
pesada-pIII se insertan en la membrana, y las
cadenas ligera y pesada se asocian covalentemente mediante enlaces
disulfuro, formando los sitios de unión a antígeno. Las secuencias
humanas de región constante de CH1 y de C_{L} incluyen las
cisteínas que forman el enlace disulfuro entre las cadenas pesada y
ligera. Tras las sobreinfección con fago ayudante, estos fragmentos
se exportan hacia el exterior de la célula sobre la superficie del
fago en forma de fusión Fab-cpIII. En un huésped no
supE, tal como TOP1OF' (InVitrogen, Carlsbad, CA), se reconoce el
codón de parada ámbar, rindiendo fragmentos Fab solubles. Entre las
características importantes del sistema de expresión fágica pRL4
que se utiliza se incluyen una etiqueta His6 para la purificación,
una etiqueta epítopo HA tras la cadena pesada, así como un codón de
parada ámbar suprimible que se encuentra situado entre la cadena
pesada y el gen fágico III. La etiqueta HA resulta reconocida por el
anticuerpo HA.11 (Babco, Berkeley, CA) y por el anticuerpo 12CA5
(Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, Ind.). La etiqueta His6
permite la purificación por afinidad de los fragmentos de anticuerpo
mediante cromatografía de níquel-quelato (Qiagen,
Valencia, CA). El codón de parada ámbar permite, al suprimir la
parada, la conversión rápida del producto de fusión
Fab-cpIII (para la incorporación sobre la cubierta
fágica) en Fab soluble, que se produce en un huésped bacteriano no
supresor.
La selección implica aislar de la biblioteca los
mejores candidatos que se unen específicamente a la molécula diana
de los péptidos y expresar actividad biológica.
Puede producirse y concentrarse el fago que
expresa los fragmentos de anticuerpo sobre su superficie de manera
que pueda permitirse la unión a la molécula diana de todos los
miembros de una biblioteca. La molécula diana puede inmovilizarse
sobre una placa de microtitulación, sobre células completas, sobre
las membranas de células completas, o presentarse en solución. Se
eliminan por lavado los fagos Ab no específicos, y se liberan del
antígeno las partículas fágicas unidas, con frecuencia mediante la
utilización de un pH bajo. Los fagos Ab recuperados son infecciosos
y por lo tanto pueden amplificarse en un huésped bacteriano.
Típicamente, se llevan a cabo múltiples rondas de este tipo de
selección. A continuación, pueden analizarse los clones individuales
de fragmentos de anticuerpos, tales como Fabs o scFvs solubles, para
la identificación de aquellos que reconocen específicamente la
molécula diana.
Previamente a ninguna estrategia de selección,
las bibliotecas iniciales se introducen por electroporación en las
células huésped, tales como ER2537. Se cultivan bibliotecas hasta la
etapa logarítmica y se sobreinfectan con fago ayudante, tal como
VCSM13, un fago ayudante disponible comercialmente (Stratagene, La
Jolla, CA). La sobreinfección proporciona los componentes fágicos
restantes que resultan necesarios para empaquetar los plásmidos en
partículas fagémidas. Alternativamente, puede utilizarse la
expresión fágica sin la utilización de fago ayudante. Tras el
cultivo durante la noche, los fagémidos presentes en el sobrenadante
del cultivo se precipitan con polietilenglicol (PEG). Los fagos
precipitados con PEG se utilizan en la separación por
panning (fase sólida-superficie celular,
internalización y membrana), separación por FACS o separación
magnética con el fin de purificar los anticuerpos de unión
específica de los ligantes no específicos.
En el panning de base celular, se incuban
las bibliotecas de anticuerpo-fago con las células
diana, y se eliminan los fagos no adherentes mediante lavados
múltiples. Un protocolo de panning típico es el
siguiente:
- 1.
- Bloqueo de partículas fágicas con PBS + BSA al 1% o FBS al 10% + leche en polvo al 4% + NaN_{3} (excepto cuando se someten a ensayo anticuerpos internalizados).
- 2.
- Adición de células diana a los fagos bloqueados (aproximadamente 5 x 10^{6} células).
- 3.
- Mezcla y rotación lenta a 4ºC o a 37ºC.
- 4.
- Lavado dos veces de las células con 1 ml de PBS/BSA al 1%/NaN_{3} helado o PBS/BSA al 1%/NaN_{3} a temperatura ambiente.
- 5.
- Los anticuerpos específicos-fagos unidos a células pueden eluirse con un pH bajo, por ejemplo con ácido cítrico 76 mM, pH 2,5, en PBS durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente.
- 6.
- Neutralización de los fagos eluídos con Tris-HCl 1 M, pH 7,4.
- 7.
- Tras la neutralización, pueden utilizarse los anticuerpos-fagos para infectar bacterias ER2537 y amplificarlos en cultivo durante la noche para la siguiente ronda de panning.
Generalmente se llevan a cabo 3 ó 4 rondas de
panning sobre cada biblioteca. Tras cada ronda de
panning pueden llevarse a cabo ELISAs fágicas utilizando
anticuerpo secundario disponible comercialmente
(anticuerpo-HRP anti-M13 de oveja) o
ELISAs de anticuerpos solubles utilizando un anticuerpo HA.11
disponible comercialmente (Babco, Berkeley, CA) que diferencia la
etiqueta HA incorporada en cada anticuerpo de las secuencias PRL4,
con el fin de obtener estimaciones del enriquecimiento en
anticuerpos ligantes respecto a los no ligantes. Tras la última
ronda de panning, pueden recolectarse los
anticuerpos-fagos como colonias separadas en placas
de ágar, cultivarse como anticuerpo monoclonal-fago
y cribarse mediante ELISA para la identificación de ligantes
específicos. También puede utilizarse el análisis FACS.
Específicamente se infectan los anticuerpos-fagos en
bacterias Top10F' y se siembran en placas para obtener colonias
individuales. Las colonias individuales se recogen de las placas de
ágar, se cultivan y se inducen con IPTG. Los anticuerpos solubles se
criban mediante ELISA para la identificación de ligantes
específicos. El cribado puede llevarse a cabo contra células vivas,
contra células diana intactas levemente fijadas, o contra una o más
proteínas recombinantes.
Los procedimientos para el panning de
células completas se han descrito con anterioridad (Siegel, D.L.,
Chang, T.Y., Russell, S.L. y Bunya, V.Y., J. Immunol. Methods
206:73-85, 1997, incorporada en la presente memoria
como referencia). Entre otras técnicas para la selección que pueden
aplicarse se incluyen la separación celular activada por
fluorescencia (FACS). Entre los procedimientos alternativos para la
selección en bibliotecas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas,
la expresión ribosómica y la hibridación de placas con un antígeno
marcado.
Tras el panning para aislar los
anticuerpos ligantes de afinidad elevada, pueden llevarse a cabo
bioensayos para identificar cribados funcionales de anticuerpos
agonistas. Con frecuencia la dimerización es un requisito para la
activación de muchos receptores y, de esta manera, los bioensayos se
centran en los anticuerpos agonistas que estimulan receptores a
través de la estimulación de la dimerización. Tal como se ha
indicado anteriormente, en el diseño de linkers se tiende a la
multivalencia de las cadenas únicas. La multivalencia de los
fragmentos Fab puede alcanzarse de varias maneras. Recientemente se
ha informado en la literatura en varias ocasiones de éxito en la
formación de fragmentos diméricos de anticuerpo aplicables a la
expresión en fagos (DeKruif, J. y Logtenberg, T., J. Biol.
Chem. 271:7630-7634, 1996; Pack, P. y Pluckthun,
A. Biochemistry 31:1579-1584, 1992, y
Holliger, P. y Winter, G., Current Opin. Biotech.
4:446-449, 1993). Los Fabs divalentes pueden crearse
por lo menos de dos maneras. En un enfoque, la dimerización se
consigue mediante la adición de un dominio de dimerización a pRL4,
formando pRL8 (ver las figs. 6A-6C, 7 y 8). Existen
varios dominios de dimerización (lexA, dedos de Zn, fos, jun, etc.)
que pueden utilizarse en estos vectores para obtener la
multivalencia de los fragmentos Fab. Se seleccionan los dominios de
dimerización a partir de los siguientes, aunque sin limitarse a
ellos: jun (DeKruif, J. y Logtenberg, T., J. Biol. Chem.
271:7630-7634, 1996; Kostelny, S.A., Cole, M.S. y
Tso, J.Y., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992),
la región LexA de dimerización (Kim, B. y Little, J.W.,
Science 255:203-206, 1992), el dominio de
dimerización GCN4 de la levadura (van Heeckeren, W.J., Sellers,
J.W., Struhl, K., Nucleic Acids Res.
20:3721-3724, 1992), la invertasa Gin del
bacteriófago Mu (Spaeny-Dekking, L., Schlicher, E.,
Franken, K., van de Putte, P., Goosen, N., J. Bacteriol.
34:1779-1786, 1995), el dominio de dimerización de
la proteína NTRC de E. coli (Klose, K.E., North, A.K.,
Stedman, K.M., Kustu, S., J. Mol. Biol. 241:233-245,
1994) y el dominio de dimerización ICP4 de HSV-1
(Gallinari, P., Wiebauer, K., Nardi, M.C., Jiricny, J., J. Virol.
68:3809-3820, 1994), las cuales se incorporan en la
presente memoria en su totalidad como referencia. Además, puede
utilizarse un dominio dímero de temperatura elevada procedente de
organismos térmicos (MacBeath, G., Kast, P., Hilvert, D.,
Biochemistry 37:100062-73, 1998, y MacBeath,
G., Kast, P., Hilvert, D., Science
279:1958-61, 1998). Éstos son dominios funcionales
que, cuando se incorporan en una molécula, permiten que se produzca
la dimerización. Además, la dimerización puede conseguirse en
células mediante la utilización de vectores IgG completos, o
dominios de dimerización, tales como los dominios de dimerización
CH_{3}. Estos y otros dominios de dimerización, y su utilización
para dimerizar proteínas, resultarán familiares a los expertos en
la
materia.
materia.
Son conocidos procedimientos adicionales que
pueden utilizarse para generar constructos de anticuerpos que
contienen por lo menos dos sitios de unión. El anticuerpo creado
mediante cada uno de estos enfoques podría utilizarse para someter a
ensayo la actividad de anticuerpo agonista, tal como se describe en
el Ejemplo 1 posteriormente para IgG completos producidos en células
de mamífero. Entre estos procedimientos se incluye la dimerización
química de Fab, la pegilación de Fab, la producción de Fab'_{2},
la generación de IgG completos en células bacterianas, y la
utilización de diacuerpos (scFvs). Resulta importante señalar que
podría utilizarse como el producto terapéutico final cualquiera de
las formas de anticuerpo generadas para el análisis de la actividad
agonista.
También puede conseguirse la dimerización
química utilizando una diversidad de reactivos químicos de
reticulación. Por ejemplo, SMCC (succinimidil
trans-4 (maleimidilmetil)
ciclohexano-1-carboxilato), de
Molecular Probes (Eugene, Oregon), nº de cat.
S-1534. Este reactivo modifica los grupos amino
primarios en el anticuerpo. Tras incubar el anticuerpo con SMCC a
temperatura ambiente, se pasa la reacción por una columna
PD-10. Este Fab derivatizado con maleimida puede
añadirse a un segundo Fab o a un lote separado del mismo Fab tratado
con TCEP [(Tris(2-carboxietil)fosfina,
hidrocloruro): Molecular Probes, nº de cat. T-2556]
para reducir los grupos tiol a SH. La reacción de reducción se lleva
a cabo en la oscuridad durante 15 minutos. La conjugación del
Fab-maleimida y el Fab tiol-reducido
se produce a una proporción de 1:1. Se aíslan los dímeros pasando la
reacción por una columna de filtración en gel sephadex 200. Para la
dimerización pueden utilizarse otros linkers químicos conocidos por
los expertos en la materia. Se ha descrito la producción de un Fab'
que presenta un residuo cisteína adicional introducido en la región
de bisagra, por ejemplo en la patente US nº 5.677.425 y en Carter
et al., BioTechnology, vol. 10, febrero de 1992, páginas
163-167, cuyas descripciones se incorporan en la
presente memoria como referencia. El sitio tiol puede utilizarse
para la conjugación a grupos, tal como el polietilenglicol (PEG). Es
conocida la tecnología de la pegilación, por ejemplo ver Koumenis
et al., Int. J. Pharm. 198(1):83-95
(2000), incorporada en la presente memoria como referencia, lo que
permite unir las dos moléculas Fab' entre sí utilizando el
acoplamiento a PEG.
La tecnología para la producción bacteriana de
Fab'_{2} implica la clonación de la región bisagra del IgG humano
y opcionalmente parte de CH_{2}, de manera que formen parte del
Fd, que incluye cisteínas adicionales, y se describe, por ejemplo,
en Better et al., PNAS USA
90(2):457-61, (1993), incorporada en la
presente memoria como referencia. Los grupos tiol adicionales en la
bisagra Fd pueden interaccionar y causar la dimerización de dos
moléculas de Fab', creando una Fab'_{2}. Fab'_{2} puede
purificarse directamente a partir de las células bacterianas.
Además, el Fab' no dimerizado de la bacteria puede aislarse y
convertirse químicamente en Fab'_{2}.
Tal como se ha indicado anteriormente, las
regiones variables del anticuerpo pueden clonarse en forma de una
sola cadena en la que la cadena ligera variable (V_{L}) se
encuentra conectada a la cadena pesada variable (V_{H}) por una
región linker. Si esta región linker es corta (por ejemplo de 5 a 7
aminoácidos), el plegamiento de scFv favorecerá la asociación de dos
scFv en los que la V_{L} de un scFv se aparea con la V_{H} del
segundo scFv. De esta manera, en el diacuerpo existen dos sitios de
unión a antígeno.
Los constructos de anticuerpo que contienen dos
sitios de unión pueden generarse utilizando cualquiera de dichos
procedimientos con el fin de someter a ensayo la actividad agonista
y/o utilizarse como el producto terapéutico final.
Tras las etapas de panning y de
separación de las bibliotecas de Fab, se corta la biblioteca de
moléculas sometidas a panning con SacI y SpeI y se clonan en
pRL8. La subclonación en el vector pRL8, sea individualmente o en
masa, tras la separación por FACS o panning permite la
expresión de Fabs diméricos solubles ligantes para su análisis en
bioensayos. Los fragmentos de anticuerpo son transportados en pRL8
hasta el espacio periplasmático, donde forman dímeros. La ventaja de
este enfoque es que permite el panning de fragmentos de Fab
monomérico, favoreciendo los Fabs de afinidad elevada.
Otro enfoque utiliza un anticuerpo secundario.
pRL4 presenta la etiqueta decapéptido de la hemaglutinina que
resulta reconocida por el anticuerpo HA.11, que se encuentra
disponible comercialmente (Babco, Berkeley, CA). Los Fabs
identificados en la separación FACS o en el panning a
analizar en bioensayo se preincuban con HA.11, que promueve la
dimerización, previamente a la adición a los bioensayos.
Tras la identificación de los scFvs o Fabs
ligantes mediante panning u otro procedimiento de selección,
los clones individuales, cada uno de los cuales expresa un fragmento
único de anticuerpo dimerizado sobre la superficie fágica, se
someten a ensayo para los efectos sobre la proliferación, la
diferenciación, la activación o la supervivencia de las células
diana. Además, se examinan los anticuerpos dimerizados solubles en
bioensayo.
- 1.
- Ensayos de formación de colonias. Colonias megacariocíticas procedentes de médula ósea (kit Megacult C, de Stem Cell Technologies Inc., Vancouver BC, Canadá).
- 2.
- Ensayos de proliferación. Proliferación de células Ba/F3 (Cwirla et al., Science vol. 276, páginas 1696-1699, 1997). Se estableció la línea celular Ba/F3-mpl (F. de Sauvage et al., Nature 369:533, (1994) mediante la introducción del ADNc que codifica el receptor cMpI completo en la línea celular Ba/F3 linfoblastoide murina dependiente de IL-3. La estimulación de la proliferación de las células Ba/F3-mpl en respuesta a diversas concentraciones de anticuerpos o de TPO se midió por la cantidad de ^{3}H-timidina incorporada, tal como se ha descrito con anterioridad (F. de Sauvage et al., supra).
- 3.
- Ensayos de fosforilación: fosforilación de JAK2 (Drachman et al., J. Biol. Chem. vol. 274, páginas 13480-13484, (1999)).
- 4.
- Ensayos basados en la transcripción: cotransfección transitoria del receptor cMpI de longitud completa con constructo de promotor de c-Fos-informador luciferasa. 24 horas tras la transfección, las células se sometieron a ayuno en FCS al 0,5% durante 24 horas. Se estimularon las células, se recolectaron tras 6 horas y se obtuvieron las lecturas de luciferasa (ver también el Ejemplo 1, sección de Ensayos biológicos).
- 1.
- Formación en metilcelulosa de colonias eritroides de médula ósea (Wrighton et al., Science vol. 273, páginas 458-463, 1996).
- 2.
- Proliferación de células TF-1 (línea celular de la eritroleucemia humana). Las células TF-1 expresan tanto la forma de longitud completa como una forma truncada de Epo-R (J. Cell Physiol. vol. 140, páginas 323-334, 1989).
- 3.
- El receptor EPO se acopla directamente a la JAK2 quinasa con el fin de inducir la fosforilación de la tirosina. EPO induce cFos en las células TF-1. Activación transcripcional de c-Fos (Witthuhn et al., Cell vol. 74, páginas 227-236, (1993)).
Pueden utilizarse varios bioensayos en el
cribado de alto rendimiento. A los expertos ordinarios en la materia
les resultarán familiares estos ensayos y otros bioensayos
adecuados. Se han desarrollado varios ensayos no radioactivos en los
que puede analizarse la síntesis de ADN o la actividad enzimática.
Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de proliferación celular con
MTT (Promega Corporation, Madison, WI), basado en un ensayo descrito
por Mosmann (Mossmann, T., J. Immunol. Methods
65:55-57, 1983, incorporado en la presente memoria
como referencia). Este protocolo es rápido y sencillo. En el ensayo,
MTT (bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio),
una sal de tetrazolio, se convierte en un producto formazán de color
azul por la actividad deshidrogenasa mitocondrial en las células
vivas. El contenido de deshidrogenasa, y por lo tanto la cantidad de
producto de color que se produce, es proporcional al número de
células. El producto de color es detectable en un lector de placas
ELISA a 570 nm. Los ensayos se llevan a cabo por triplicado, en masa
en placas de microtitulación de 96 pocillos. En resumen, se siembran
las células diana en placas en alícuotas de 100 \mul en medio de
cultivo en las placas de 96 pocillos. Tras la adición de diversas
concentraciones de anticuerpos, las células se incuban durante 48 a
72 horas a 37ºC y con 5% de CO_{2} en una atmósfera completamente
humidificada. Se añade MTT a cada pocillo y se realiza un
seguimiento de la proliferación utilizando el lector de placas
ELISA.
Por ejemplo, en ensayos de proliferación con las
células TF-1, las células bacterianas que contienen
fagémidos que expresan anticuerpos se cultivan durante la noche a
37ºC en placas de 96 pocillos deep en 1 ml de un medio que es una
mezcla de medio de células de mamífero y medio bacteriano (en el
caso de las células TF-1, RPMI 2,7/SB 0,3/Carb. 100
\mug/ml). Las células TF-1 constituyen una línea
celular de la eritroleucemia de la médula ósea humana que responde a
múltiples citoquinas (Kitamura, T., Tange, T., Terasawa, T., Chiba,
S., Kuwaki, T., Miyagawa, K., Piao, Y.F., Miyazono, K., Urabe, A.,
Takaku, F., Cell Physiol. 140:323-334, 1989;
Kitamura, T., Tojo, A., Kuwaki, T., Chiba, S., Miyazono, K., Urabe,
A., Takaku, F., Blood 73:375-380, 1989; Kitamura,
T., Takaku, F., Miyajima, A., Int. Immunol.
3:571-577, 1991). Al día siguiente, se subcultivaron
los cultivos a 1/10 en placas nuevas durante la noche y se incubaron
a 37ºC durante 2 horas. Tras la inducción con IPTG a 37ºC durante 4
horas, las placas se centrifugaron a 2000 rpm/15' a temperatura
ambiente. Se filtraron 50 \mul de cada sobrenadante de cultivo en
bandejas-filtro de 96 pocillos (Millipore)
introduciéndolos en placas de ensayo de 96 pocillos. Las células de
mamífero se lavaron previamente para eliminar el factor de
crecimiento y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10^{5}
células/ml. Se añadieron 50 \mul de células a cada pocillo. Las
placas de ensayo se incubaron a 37ºC/incubador de 5% de CO_{2}
durante 72 horas. A las 72 horas, se revelaron las bandejas mediante
la adición de 40 \mul de medio/MTS/PMS por pocillo. El MTS es una
versión mejorada más soluble de MTT. Ambos ensayos se basan en la
conversión celular de la sal de tetrazolio. Puede adquirirse un kit
con MTS de ensayo de proliferación (número de catálogo G5421) de
Promega, Inc. (Madison, WI). Las placas se mantuvieron a
37ºC/incubador de CO_{2} y se leyeron a DO_{490} tras 1 hora,
tras 4 horas y tras 8 horas con un lector de microplacas.
Con frecuencia, las actividades de las
citoquinas son sinérgicas. La sinergia puede manifestarse a través
de la unión de ligandos a dos receptores diferentes que envían a
continuación la señal correcta, o a través de un efecto de
iniciación, en el que la interacción de
ligando-receptor prepara a la célula a que responda
a una segunda citoquina. Además, las citoquinas que actúan
tempranamente en el desarrollo del linaje es más frecuente que sean
sinérgicas que las citoquinas que actúan en etapas posteriores en
una ruta de desarrollo. Por lo tanto, pueden utilizarse
concentraciones subóptimas de factores de crecimiento en estos
bioensayos con el fin de examinar la sinergia. Las condiciones para
las concentraciones subóptimas se determinan para cada ensayo. Ello
se lleva a cabo mediante la adición de diluciones seriadas de
factores de crecimiento, individualmente y como mezcla, a los
ensayos, y determinando los niveles por debajo de los cuales un solo
factor no promueve una respuesta en comparación con la mezcla, y el
nivel por debajo del cual la mezcla no promueve una respuesta en el
bioensayo. También pueden añadirse a los bioensayos células
estromales de médula ósea con el fin de proporcionar otros factores
necesarios que podrían desempeñar un papel en una respuesta
sinérgica.
Además, la proliferación celular puede
examinarse mediante el seguimiento de la síntesis del ADN. Puede
llevarse a cabo un ensayo colorimétrico no radioactivo que examina
la incorporación de
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en formato
de placa de microtitulación. En ésta, las células se cultivan en
placas de 96 pocillos y se incuban con BrdU y concentraciones
subóptimas de citoquinas. La cantidad de BrdU se determina tras el
marcaje con un anticuerpo anti-BrdU marcado con
peroxidasa. Los resultados finales se analizan utilizando un lector
de placas ELISA a 405 nm.
También puede utilizarse un ensayo radioactivo
de mitogénesis que mide la tasa de síntesis de ADN como indicación
de la proliferación (Raines y Ross, Methods of Enzymol.
109:749-773, 1985). En estos ensayos, se examinan
los cambios en la tasa de incorporación de
[^{3}H]-timidina en células diana. Nuevamente
estos ensayos permiten el cribado simultáneo y rápido de muchos
fragmentos de anticuerpo. Se han utilizado ampliamente como
procedimiento conveniente para evaluar los efectos de estimulación y
de inhibición del crecimiento de muchas células diferentes. Las
células se cultivan en suspensión hasta que alcanzan una tasa de
crecimiento exponencial. A continuación, se lavan las células del
medio en el que se han cultivado, y se siembran nuevamente en placas
con medio fresco. Se introducen alícuotas de las células en placas
de 96 pocillos en un volumen total de 100 \mul a una concentración
de aproximadamente 1-2 x 10^{5} células/ml. Se
añaden las diluciones de sobrenadante de fago, anticuerpos de Fab o
ScFv dimerizado soluble y las células se incuban durante 18 a 48
horas en un incubador con gas CO_{2} a una temperatura de 37ºC.
Tras la incubación, se añade a cada pocillo
[^{3}H]-timidina (937 kBq) y se incuban durante 4
horas más. A continuación se extraen las células del incubador y se
cuentan directamente en un contador de centelleo de microplacas de
laboratorio, tal como Packard Top Count NXT Instrument (Packard,
Meriden, CT). Alternativamente, las células pueden transferirse
seriadamente a filtros GF/C en un recolector Millipore de células
(Millipore, Bedford, MA) o aparato similar. Seguidamente se
determina la radioactividad asociada al material insoluble en ácido
retenido sobre el filtro. Se aplican diluciones de factores de
crecimiento disponibles comercialmente a los pocillos de control
positivo. Los controles negativos incluirían sobrenadantes de
células que portan plásmidos sin inserción o anticuerpos
irrelevantes tratados de manera similar. Las actividades
estimuladoras relativas de crecimiento del estándar y de los
diluyentes de los sobrenadantes fágicos a ensayo se compararon con
el fin de cuantificar la actividad estimuladora de crecimiento de la
muestra.
La activación puede analizarse sometiendo a
ensayo segundos mensajeros o mediante ensayos transcripcionales.
La supervivencia puede analizarse, por ejemplo,
realizando un seguimiento de la apoptosis utilizando ensayos tales
como los ensayos túnel o mediante otros procedimientos conocidos por
los expertos en la materia.
Entre otros ensayos útiles para analizar la
transducción celular de señales, la actividad de las quinasas y
fosfatasas y en última instancia las actividades celulares como
resultado de la actividad agonista, se incluyen la medición de la
producción de segundos mensajeros, por ejemplo de AMPc, Ca^{++},
diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato
(IP3). La medición de los picos en la concentración intracelular del
calcio, del pH intracelular y del potencial de membrana en ensayos
de cribado de alto rendimiento puede llevarse a cabo utilizando
instrumentos tales como el FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader
System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se encuentran disponibles
varias sondas fluorescentes para el examen de las concentraciones de
los segundos mensajeros (Molecular Probes, Eugene OR). La medición
de las concentraciones de segundos mensajeros también puede llevarse
a cabo a nivel de células individuales (DeBernardi, M.A. y Brooker,
G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4577-4582,
1996). Además, resultaran útiles los ensayos que examinan otros
sucesos de señalización, tales como la fosforilación, la apoptosis o
los niveles de ARN o de proteína de genes específicos. Por ejemplo,
se ha demostrado que la mayoría de las citoquinas activan el enzima
PI-3K (revisado en Silvennoinen, O., Ihle, J.N.,
Signaling by the Hematopoietic Cytokine Receptors, R.G. Landes
company, Austin, TX, 1996). Además, la familia Jak de tirosina
quinasas se ha demostrado que está constituida por mediadores
cruciales para la señalización por receptores de citoquina (Ihle,
J.N., Witthuhn, B.A., Quelle, F.W., Annu. Rev. Immunol.
13:369-398, 1995). Además, se activan varias otras
tirosina quinasas, por ejemplo los miembros de la familia Src, en
respuesta a determinados estímulos de citoquina. El ARN o las
proteínas, por ejemplo c-Jun y
c-Fos, resultan regulados rápida y transitoriamente
positivamente tras la estimulación por las citoquinas, mientras que
la inducción de c-Myc es más lenta. Estas proteínas
resultan necesarias para la transición G1 y la proliferación
(revisadas en Silvennoinen, O., Ihle, J.N., Signaling by
Hematopoietic Cytokine Receptors, R.G., Landes Company, Austin, TX,
1996). Podrían utilizarse cribados de alto rendimiento que detectan
incrementos de estos transcritos.
En los ensayos transcripcionales, se observan
los cambios en la transcripción de genes específicos tras la
exposición de las células a un factor de crecimiento o a un mimético
del mismo (anticuerpo agonista o inhibidor). Por ejemplo, en un
ensayo de lectura de myc, las células, tales como la línea celular
mixta de FDCP dependiente de IL-3, se somete a ayuno
de factor de crecimiento IL-3 durante 8 horas,
seguido de la exposición a miméticos de factor de crecimiento o a
factores de crecimiento nativos durante 2 horas a 37ºC. Transcurrido
este tiempo, se recolectan las células. Se aísla el ARN, y se llevan
a cabo reacciones en cadena de transcriptasa
inversa-polimerasa (RT-PCR) con
cebadores específicos para el gen myc. Las reacciones de
RT-PCR se someten a electroforesis en geles
horizontales de agarosa para la cuantificación del producto de PCR.
En este caso, se está realizando el seguimiento de la expresión de
un solo gen.
Alternativamente, puede llevarse a cabo el
seguimiento de los cambios en la expresión de los genes utilizando
tecnología CHIP, pueden identificarse anticuerpos agonistas bajo
condiciones de elevada sensibilidad de las sondas y en un intervalo
dinámico. De esta manera, pueden analizarse hasta 10.000 o más para
cambios de expresión. Entre los genes deseados que podrían seguirse
se incluyen c-myc, c-jun,
NF-\kappaB, entre otros. Estos genes se encuentran
situados corriente abajo de diversas rutas de transducción de
señales y su expresión debería cambiar con la respuesta mitogénica.
En un tipo de CHIP disponible comercialmente (Affymetrix, Santa
Clara, CA), pueden imprimirse sobre una superficie de vidrio los
oligonucleótidos de los genes de ensayo deseados. Se exponen las
células diana para analizar los anticuerpos agonistas. El ARN se
aísla de las células expuestas a los anticuerpos agonistas de
ensayo, se copia a ADNc y se transcribe in vitro en presencia
de biotina. Se utiliza la hibridación del ARNm biotinilado
transcrito in vitro como sonda en las series. A continuación,
se escanean los chips para determinar los genes que muestran
incrementos de la transcripción al exponerlos a anticuerpos
agonistas de ensayo. En otra versión de la tecnología CHIP (Incyte,
Palo Alto, CA), la cantidad de ADN no se normaliza sobre el vidrio,
por lo tanto se prepara una hibridación competitiva. Se aísla el ARN
de las células antes y después de la exposición al agonista. Se
prepara ADNc a partir de cada muestra, de manera que una reacción de
ADNc incorpora un marcaje, por ejemplo Cy-3, y la
otra población de ADNc incorpora un marcaje diferente, por ejemplo
Cy-5. Las señales se detectan y se comparan en un
escáner láser dual para la obtención de imágenes.
También pueden utilizarse ensayos visuales,
tales como los ensayos tradicionales de formación de colonias en
metilcelulosa (Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canadá). En
estos ensayos, se registra el crecimiento de colonias y los cambios
morfológicos con un microscopio óptico. El examen visual de los
efectos de proliferación o de diferenciación en cultivos de ágar
semisólido o en metilcelulosa puede llevarse a cabo utilizando la
línea celular apropiada (Williams Hematology 5, editores E. Beutler,
M.A. Lichtman, B.S. Coller, L.T.J. Kipps,
McGraw-Hill Inc., páginas L22-L26,
1995). La adición de metilcelulosa permite que la progenie clónica
de una sola célula progenitora se mantenga junta y facilita el
reconocimiento y la enumeración de colonias separadas. Se añaden
todos los componentes necesarios a un medio básico de metilcelulosa
(tal como MDM de Iscove, BSA, (-mercaptoetanol,
L-glutamina) excepto los suplementos de factor
estimulante de colonias y los anticuerpos de ensayo (sobrenadantes
fágicos, anticuerpos solubles)) con el fin de observar si pueden
sustituir los factores de crecimiento. Las células en el cultivo en
metilcelulosa se incuban durante 10 a 12 días tras la adición de
anticuerpos en una atmósfera humidificada a 37ºC de 5% de CO_{2}
en aire. Tras 10 a 12 días de incubación, se cuentan las colonias
con un microscopio invertido. Tras otros 8 a 10 días, se cuentan las
colonias nuevamente. Se llevan a cabo comparaciones entre los medios
que contienen anticuerpos y los controles con factores de
crecimiento y sin ellos. Además, pueden recolectarse colonias de la
metilcelulosa y examinarse células individuales citológicamente
utilizando la tinción de Wright (ver Atlas of Hematological
Cytology, F.G.J. Hayhoe y R.J. Flemans,
Wiley-InterScience, 1970).
Pueden calcularse las afinidades de unión de los
receptores (Lfas y Johnson, 1990) a partir de la asociación de las
constantes de tasas de asociación y disociación medidas utilizando
un sistema de resonancia de plasmón superficial BIACORE (Pharmacia
Biosensor). Se activa un chip biosensor para el acoplamiento
covalente del receptor gD-mpI utilizando
hidrocloruro de
N-etil-N'''-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (Pharmacia Biosensor). Se
intercambia el tampón del gD-mpI a tampón de acetato
sódico 10 mM (pH 4,5) y se diluye hasta aproximadamente 30
\mug/ml. Se inyecta una alícuota (5 \mul) a un caudal de 1
\mul/min con el fin de conseguir aproximadamente 400 unidades de
respuesta (RU) de proteína unida. Finalmente, se inyecta etanolamina
1 M como agente de bloqueo. Para las mediciones de cinética, se
inyectan 1,5 diluciones seriadas de anticuerpo en tampón PBS/Tween
(0,05% Tween-20 en solución salina tamponada con
fosfato) a 25ºC a un caudal de 20 \mul/min. Las constantes de
equilibrio de disociación, K_{d} S, de las mediciones de SPR se
calculan como k_{off}/k_{on}. Las desviaciones estándar,
s_{on} para k_{on} y s_{off} para k_{off}, típicamente se
obtienen a partir de mediciones con >4 concentraciones de
proteína (k_{on}) o con >7 concentraciones de proteína
(k_{off}). Los datos de disociación se ajustan a un modelo simple
AB\rightarrowA+B con el fin de obtener k_{off} \pm s.e. (error
estándar de las mediciones). Se calcula la constante de
pseudo-primer orden (k_{s}) para cada curva de
asociación y se grafica como función de la concentración de proteína
con el fin de obtener k_{on} \pm s.e. (error estándar del
ajuste).
Para la conversión de los clones de anticuerpo
en IgG completos, las regiones codificantes para las cadenas ligera
y pesada, o los fragmentos de las mismas, pueden clonarse
separadamente desde un vector bacteriano e introducirse en uno o más
vectores de mamífero. Puede utilizarse un solo sistema de vector,
tal como pDR1 o sus derivados, para clonar los cassettes de tanto
cadena ligera como pesada en el mismo plásmido. Alternativamente,
pueden utilizarse vectores de expresión dual en los que las cadenas
pesada y ligera se producen en plásmidos separados. Resulta
necesario que las secuencias de señal de mamífero ya se encuentren
presentes en el vector o vectores finales o unidos al extremo 5' de
las inserciones de cadena ligera o pesada de ADN. Ello puede
conseguirse mediante la transferencia inicial de las cadenas en un
vector o vectores lanzadera que contengan las secuencias líder de
mamífero apropiadas. Tras la digestión con enzimas de restricción,
se introducen las regiones de cadena ligera o de cadena pesada, o
los fragmentos de las mismas, en el vector o vectores finales en los
que se proporcionan las regiones constantes restantes para IgG1 con
o sin intrones. En algunos casos en los que se utilizan intrones, el
diseño de cebador para la amplificación por PCR de las regiones
variables de cadena ligera y pesada desde pRL4 pueden exigir la
inclusión de sitios donadores de corte de exones con el fin de
obtener el corte y empalme apropiados y la producción de los
anticuerpos en las células de mamífero.
Con cualquiera de los sistemas de expresión de
vectores (plásmido único o dual), puede regularse la producción de
cadenas pesada y ligera de anticuerpo con promotores que funcionan
en las células de mamífero, tales como, aunque sin limitarse a
ellos, los promotores de CMV, de SV40 o de IgG. Además, el vector o
vectores contendrá un marcador seleccionable de crecimiento en
bacterias (tal como, aunque sin limitarse a ellos, resistencia a la
ampicilina, al cloranfenicol, a la canamicina o a la zeocina).
También pueden encontrarse presentes en el vector o vectores IgG,
marcadores seleccionables para células de mamífero (tales como,
aunque sin limitarse a ellos, DHFR, GS, gpt, resistencia a la
neomicina o a la higromicina), o pueden proporcionarse en un
plásmido separado mediante cotransfección.
Los expertos en la materia mediante técnicas
conocidas serán capaces de sintetizar anticuerpos en otros
organismos, tales como levaduras, mamíferos, insectos y plantas
(Carlson, J.R. y Weissman, I.L., Mol. Cell. Biol.
8:2647-2650, 1988; Trill, J.J., Shatzman, A.R.,
Ganguly, S., Curr. Opin. Biotechnol.
6:553-560, 1995; Hiatt, A., Cafferkey, R., Bowdish,
K., Nature 342:76-78, 1989).
Tal como se ha indicado anteriormente, los
anticuerpos preparados de acuerdo con la invención en la presente
memoria proporcionan una vida media incrementada (duración de
acción) a la actividad de los péptidos o miméticos de péptidos de
tamaño reducido, tales como el mimético de TPO indicado en la
presente memoria. En otro aspecto, la vida media en suero misma de
un anticuerpo puede prolongarse preparando derivados que se
encuentren pegilados. Ver, por ejemplo, Lee et al., Bioconjug.
Chem. 10(6):973-81, (1999), incorporada
en la presente memoria como referencia. Otra ventaja, por ejemplo,
del anticuerpo de mimético de TPO indicado en la presente memoria es
que el tratamiento normal con TPO puede resultar en la generación
de anticuerpos neutralizantes de TPO en los pacientes que
interfieren con la actividad del TPO presente naturalmente en los
mismos. El presente anticuerpo de mimético de TPO reduce
sustancialmente la probabilidad de que se produzca una respuesta
inmunológica perjudicial contra el TPO nativo debido a que presenta
una secuencia aminoácida diferente.
Las moléculas dentro del alcance de las
reivindicaciones pueden utilizarse en procedimientos diagnósticos en
los que los anticuerpos o fragmentos de los mismos se encuentran
conjugados con marcadores detectables o en los que se utilizan como
anticuerpos primarios junto con anticuerpos secundarios que se
encuentran conjugados con marcadores detectables. Entre los
marcadores detectables se incluyen los marcajes radioactivos y no
radioactivos y son bien conocidos por los expertos en la materia.
Los marcajes no radioactivos comunes incluyen los enzimas
detectables, tales como la peroxidasa de rábano picante, la
fosfatasa alcalina y las moléculas fluorescentes. Las moléculas
fluorescentes absorben luz a una longitud de onda y la emiten a una
longitud de onda diferente, permitiendo de esta manera la
visualización utilizando, por ejemplo, un microscopio de
fluorescencia. Los espectrofotómetros, microscopios de
fluorescencia, lectores de placa fluorescentes y los separadores de
flujo son bien conocidos y con frecuencia se utilizan para detectar
moléculas específicas que se han convertido en fluorescentes
mediante su unión covalente con un pigmento fluorescente. Los
fluorocromos, tales como la proteína fluorescente verde, los
mutantes desplazados al rojo de la proteína fluorescente verde, el
amino ácido acético coumarina (AMCA), el isotiocianato de
fluoresceína (FITC), el isotiocianato de tetrametilcodamina
(TRITC), rojo de Texas, Cy3.0 y Cy5.0 son ejemplos de marcajes
útiles.
Las moléculas pueden utilizarse en estrategias
de aislamiento celular, tales como la separación celular activada
por fluorescencia (FACS) si se utilizan marcadores fluorescentes. En
la separación celular activada por fluorescencia se separan
electrónicamente células etiquetadas con moléculas fluorescentes en
un citómetro de flujo, tal como un citómetro FACS IV de
Becton-Dickinson (San Jose, California) o en un
instrumento equivalente. Las moléculas fluorescentes son anticuerpos
que reconocen antígenos de superficie celular específicos. Los
anticuerpos se encuentran conjugados con marcadores fluorescentes,
tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la ficoeritrina
(PE).
También resulta posible la separación magnética.
En los procedimientos de separación magnética, el anticuerpo se une
directa o indirectamente a microperlas magnéticas. Las células se
recubren previamente con anticuerpos que reconocen las moléculas de
superficie celular, por ejemplo receptores implicados en la
proliferación, diferenciación, activación o supervivencia. Los
anticuerpos se unen a perlas magnéticas conjugadas con una
inmunoglobulina secundaria que se une al anticuerpo primario que
expresa el péptido, tal como a la etiqueta molecular HA introducida
en cada anticuerpo. A continuación se retirar las células con un
imán. La separación magnética puede ser una selección positiva, en
la que las células de interés se encuentran unidas al anticuerpo y
por lo tanto al imán, o una selección negativa, en la que las
células no deseadas se aíslan sobre el imán.
Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos
marcados radioactivamente con fines diagnósticos.
Los anticuerpos dados a conocer en la presente
memoria resultan útiles para la amplificación de una diversidad de
tipos celulares clínicamente relevantes. El tratamiento puede ser
in vivo o ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos
agonistas resultan útiles para tratar pacientes que padecen una
deficiencia en una población de células provocada por una
enfermedad, un trastorno o un tratamiento relacionado con, por
ejemplo, la supresión de la hematopoyesis, en el que se encuentra
presente un número inferior al normal de células de una linaje o
linajes determinados. La descripción siguiente representa
únicamente algunos ejemplos de las condiciones que pueden tratarse
con los anticuerpos que contienen péptidos biológicamente activos
dados a conocer en la presenta memoria, los expertos en la materia
serán capaces de identificar otras enfermedades y condiciones que se
beneficiarían de este tratamiento. Por ejemplo, los pacientes
infectados por VIH, los pacientes sometidos a quimioterapia, los
pacientes de trasplante de médula ósea, los pacientes de trasplante
de células madre, y los pacientes que padecen trastornos
mieloproliferativos, muestran niveles inferiores a los normales de
linajes hematopoyéticos específicos.
La trombocitopenia puede ser un resultado de la
quimioterapia, del trasplante de médula ósea o de una enfermedad
crónica, tal como la trombocitopenia idiopática (ITP), todos los
cuales resultan en niveles reducidos de plaquetas. Los presentes
anticuerpos miméticos de TPO pueden utilizarse para tratar estos
pacientes.
Los pacientes sometidos a diálisis renal con
frecuencia padecen de anemia relacionada con el tratamiento, con
niveles inferiores a los normales de glóbulos rojos. En la anemia
aplásica, la supresión de la médula ósea puede provocar pancitopenia
o puede afectar únicamente a los glóbulos rojos, a los glóbulos
blancos o a las plaquetas. Los anticuerpos que se dan a conocer
incrementan el armamento de agentes terapéuticos para éstas y otras
enfermedades y trastornos caracterizados por deficiencias en
poblaciones celulares específicas, tales como las células
hematopoyéticas.
Las moléculas dentro del alcance de la invención
que se reivindica también pueden utilizarse para la proliferación y
diferenciación ex vivo de células. Ello resulta útil con
fines de terapia génica, por ejemplo para enfoques tradicionales con
vectores víricos, y para los trasplantes autólogos de médula
ósea.
Además, determinados anticuerpos según la
presente invención pueden marcarse radioactivamente para la
radioinmunoterapia o conjugarse con toxinas con el fin de
administrar las toxinas a tipos celulares específicos, resultando en
la eliminación de estas células.
Puede utilizarse un anticuerpo agonista
c-mpl biológicamente activo capaz de estimular la
proliferación, diferenciación y maduración de las células
hematopoyéticas en una preparación o formulación farmacéutica
estéril con el fin de estimular la actividad megacariocitopoyética o
trombopoyética en pacientes que padecen de trombocitopenia debido a
una producción alterada, al secuestro o al incremento de la
destrucción de las plaquetas. La hipoplasia de la médula ósea
asociada a trombocitopenia (por ejemplo la anemia aplásica
secundaria a quimioterapia o al trasplante de médula ósea) puede
tratarse con efectividad con los anticuerpos dados a conocer, así
como trastornos tales como la coagulación intravascular diseminada
(DIC), la trombocitopenia inmunológica (incluyendo la ITP inducida
por VIH y la ITP no inducida por VIH), la trombocitopenia idiopática
crónica, la trombocitopenia congénita, la mielodisplasia y la
trombocitopenia trombótica.
Los anticuerpos agonistas c-mpl
biológicamente activos dados a conocer en la presente memoria que
contienen el péptido mimético de TPO pueden utilizarse de la misma
manera y para las mismas indicaciones que la trombopoyetina (TPO).
La trombopoyetina (TPO) estimula la megacariocitopoyesis y la
producción de plaquetas. Estos anticuerpos es previsible que
presenten una vida media más prolongada que la TPO nativa o pegilada
y de esta manera se utilizan en indicaciones en las que se requiere
una vida media más larga.
Un ejemplo de un ensayo que resulta útil para
determinar la actividad de los miméticos de TPO es el ensayo de
trombocitosis de rebote, que implica la administración a ratones de
una sola inyección de suero de plaquetas de cabra antirratón con el
fin de inducir trombocitopenia aguda (día 0). En los días 5 y 6, los
ratones se inyectan con las muestras de ensayo. En el día 8, se
realizan recuentos de plaquetas (incorporación de ^{35}S en las
plaquetas).
La vía de administración del anticuerpo está de
acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo la inyección o
infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral,
intramuscular, subcutánea, intraocular, intraarterial, intratecal,
por inhalación o intralesional, tópica o mediante sistemas de
liberación sostenida, tal como se indica posteriormente. El
anticuerpo se administra preferentemente continuamente mediante
infusión o mediante inyección en bolo. Pueden administrar los
anticuerpos de manera local o sistémica.
Los anticuerpos de la invención pueden
prepararse en una mezcla con un portador farmacéuticamente
aceptable. Pueden encontrarse técnicas para la formulación y para la
administración de los compuestos de la solicitud instantánea en
"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co.,
Easton, PA, última edición. Esta composición terapéutica puede
administrarse intravenosamente o a través de la nariz o por los
pulmones, preferentemente como un aerosol líquido o en polvo
(liofilizado). La composición puede asimismo administrarse
parenteral o subcutáneamente según se desee. Cuando se administra
sistémicamente, la composición terapéutica debe ser estéril,
encontrarse libre de pirógenos y en una solución parenteralmente
aceptable, con atención a pH, isotonicidad y estabilidad. Estas
condiciones son conocidas por los expertos en la materia.
En resumen, las formulaciones de dosificación de
los compuestos de la presente invención se preparan para el
almacenamiento o administración mediante mezcla del compuesto que
presenta el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o
estabilizantes fisiológicamente aceptables. Estos materiales no son
tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones
utilizadas, y pueden incluir tampones, tales como Tris HCl, fosfato,
citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes,
tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos
de aproximadamente diez residuos), tales como poliarginina,
proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas;
polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidinona;
aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o
arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos,
incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas;
agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales
como manitol o sorbitol; contraiones, tales como sodio y/o
surfactantes no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS o
poli-
etilenglicol.
etilenglicol.
Cuando se utilizan para la administración in
vivo, la formulación de anticuerpo debe ser estéril y puede
formularse de acuerdo a la práctica farmacéutica convencional. Ello
se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de
filtración estériles, previamente o posteriormente a la
liofilización y reconstitución. El anticuerpo se almacenará
habitualmente en forma liofilizada o en solución. Pueden desearse
otros vehículos, tales como los aceites vegetales de origen natural,
tales como el aceite de sésamo, de cacahuete, o el aceite de
semilla de algodón o un vehículo graso sintético, tal como oleato de
etilo o similar. Pueden incorporarse tampones, conservantes,
antioxidantes y similares de acuerdo a la práctica farmacéutica
aceptada.
Las composiciones farmacéuticas que resultan
adecuadas para la utilización incluyen composiciones en las que se
encuentran contenidos uno o más anticuerpos diseñados racionalmente
en una cantidad que resulta efectiva para conseguir el fin
pretendido. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente
efectiva se refiere a una cantidad de anticuerpo que resulta
efectiva para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de la
enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto bajo
tratamiento. La determinación de una cantidad terapéuticamente
efectiva se encuentra completamente dentro de los conocimientos de
los expertos en la materia, especialmente a la luz de la descripción
detallada que se proporciona en la presente memoria. Las dosis
terapéuticamente efectivas pueden determinarse mediante la
utilización de procedimientos in vitro e in vivo.
La cantidad efectiva de anticuerpo que debe
utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos
terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del
paciente. Además, el médico responsable toma en consideración
diversos factores conocidos con el fin de modificar la acción de los
fármacos, incluyendo la severidad y tipo de enfermedad, el peso
corporal, el sexo, la dieta, el momento y vía de administración,
otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. De acuerdo
con ello, resultará necesario para el terapeuta titular la dosis y
modificar la vía de administración según se requiera para obtener el
efecto terapéutico óptimo. Típicamente el médico administrará el
anticuerpo hasta alcanzar una dosis que consiga el efecto deseado.
El progreso de esta terapia se sigue fácilmente utilizando ensayos
convencionales.
Para cualquier anticuerpo que contenga un
péptido, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse
inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo,
puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un
intervalo de concentración circulante que incluya la EC_{50} según
se determine en cultivo celular (por ejemplo la concentración de la
molécula de ensayo que estimule o inhiba la proliferación o
diferenciación celular). Esta información puede utilizarse para
determinar con mayor exactitud las dosis útiles en el ser
humano.
Puede determinarse la toxicidad y eficacia
terapéutica de las moléculas de anticuerpo indicadas en la presente
memoria mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos
celulares o en animales experimentales, por ejemplo para determinar
la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la
ED_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la
población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y los
efectos terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse
como la proporción entre la LD_{50} y la ED_{50}. Las moléculas
que muestran índices terapéuticos elevados resultan preferentes. Los
datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y de los
estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de
dosis para la utilización en el ser humano. Las dosis de estas
moléculas se encuentra preferentemente dentro de un intervalo que
concentraciones circulantes que incluye la ED_{50} con poca o
ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo
dependiendo de la forma de dosificación utilizada y de la vía de
administración utilizada. El médico individual puede seleccionar la
formulación exacta, la vía de administración y la dosis en vista de
la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingl et al.,
The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1,
1975).
La cantidad y el intervalo de dosificación
pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma
del anticuerpo que resulten suficientes para estimular o inhibir la
proliferación o diferenciación celulares o concentración efectiva
mínima (MEC). La MEC varía para cada anticuerpo pero puede estimarse
a partir de datos in vitro utilizando ensayos descritos. Las
dosis necesarias para conseguir la MEC dependerán de las
características individuales y de la vía de administración. Sin
embargo, pueden realizarse ensayos de HPLC o bioensayos para
determinar las concentraciones en plasma.
También pueden determinarse los intervalos de
dosificación utilizando el valor de MEC. Las moléculas de anticuerpo
deben administrarse utilizando un régimen que mantenga los niveles
en plasma por encima de la MEC durante el 10 a 90% del tiempo,
preferentemente durante 30 a 90% del tiempo, y todavía más
preferentemente entre el 50 y el 90% del tiempo.
En los casos de administración local o de
incorporación selectiva, la concentración local efectiva del
anticuerpo puede no estar relacionada con la concentración en
plasma.
Una dosis diaria típica puede encontrarse
comprendida entre aproximadamente 1 \mug/kg y 1.000 mg/kg o más,
dependiendo de los factores indicados anteriormente. Típicamente el
médico administrará la molécula hasta que se alcance una dosis que
consiga el efecto deseado. El seguimiento del progreso de esta
terapia se realiza fácilmente mediante ensayos convencionales.
Dependiendo del tipo y severidad de la
enfermedad, una dosis candidata inicial para la administración en el
paciente puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 0,001
mg/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg, más preferentemente entre
aproximadamente 0,01 mg y 100 mg/kg, todavía más preferentemente
entre aproximadamente 0,010 y 20 mg/kg del anticuerpo agonista,
dependiendo, por ejemplo, de si se administra en una o más ocasiones
separadas o mediante infusión continua. Para las administraciones
repetidas a lo largo de varios días o más tiempo, dependiendo de la
condición, se repite el tratamiento hasta que se produce una
supresión deseada de los síntomas de la enfermedad o se consigue la
mejora deseada en la condición del paciente. Sin embargo, también
pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación.
Los ejemplos siguientes se incluyen únicamente a
título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.
Se injertó un péptido agonista mimético de TPO,
IEGPTLRQWLAARA (SEC ID nº 1) en la CDR3 de cadena pesada (HCDR3) del
Fab antitoxoide del tétano (TT), en sustitución de la secuencia
HCDR3 completa GCTIF
GVTMGYYAMDV (SEC ID nº 4). La figura 2A muestra la secuencia del anticuerpo humano del toxoide del tétano utilizado. Se adoptaron dos enfoques para la injertación. En el primer enfoque, el péptido agonista se insertó en la región HCDR3 con dos glicinas flanqueantes a cada lado. Ello con el fin de reducir las restricciones estructurales sobre el péptido injertado de manera que pudiese adoptar más fácilmente la conformación necesaria. En el segundo enfoque, se aleatorizaron dos posiciones aminoácidas en cada lado del péptido injertado con el fin de que se pudiese conseguir la mejor presentación del péptido (figura 3). Se adoptaron estos dos enfoques con el fin de determinar si el péptido resultaba suficiente por sí solo o si se requerían residuos específicos para la presentación apropiada del péptido agonista en la estructura del anticuerpo, proporcionando de esta manera su actividad al anti-
cuerpo.
GVTMGYYAMDV (SEC ID nº 4). La figura 2A muestra la secuencia del anticuerpo humano del toxoide del tétano utilizado. Se adoptaron dos enfoques para la injertación. En el primer enfoque, el péptido agonista se insertó en la región HCDR3 con dos glicinas flanqueantes a cada lado. Ello con el fin de reducir las restricciones estructurales sobre el péptido injertado de manera que pudiese adoptar más fácilmente la conformación necesaria. En el segundo enfoque, se aleatorizaron dos posiciones aminoácidas en cada lado del péptido injertado con el fin de que se pudiese conseguir la mejor presentación del péptido (figura 3). Se adoptaron estos dos enfoques con el fin de determinar si el péptido resultaba suficiente por sí solo o si se requerían residuos específicos para la presentación apropiada del péptido agonista en la estructura del anticuerpo, proporcionando de esta manera su actividad al anti-
cuerpo.
La figura 4 ilustra de manera general el
procedimiento de construcción de una biblioteca. En resumen, el Fab
antitoxoide del tétano se amplificó como dos fragmentos. El
fragmento A se amplificó utilizando un cebador directo
(N-Omp: 5' TAT CGC GAT TGC AGT GGC ACT GGC 3') (SEC
ID nº 5) que se apareó con el líder OmpA de la cadena ligera en
combinación con un cebador backward
(TPO-CDR3-B: 5' GC CAG CCA TTG CCG
CAG CGT CGG CCC TTC AAT YNN YNN TCT CGC ACA ATA ATA TAT GGC 3') (SEC
ID nº 6) que se apareó en el extremo de la región marco (FR) 3 de la
cadena pesada. El cebador reverso contenía una cola que codificaba
el nuevo CDR3. El fragmento B se generó utilizando un cebador
directo (TPO-CDR3-F: 5' CCG ACG CTG
CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG NNY NNY TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT
3') (SEC ID nº 7) que se apareó en FR4 y el cebador reverso
Seq-G3Rev (5' TCA AAA TCA CCG GAA CCA GAG C 3') (SEC
ID nº 8) que se apareó en la región del gen III del plásmido,
corriente abajo de la señal de parada de la cadena pesada. El
cebador TPO-CDR3-F también
presentaba una cola de bases que codificaba la nueva región CDR3. Se
utilizó la Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer) en el siguiente
programa de PCR: 94ºC durante 30 segundos, a continuación 30 ciclos
de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 15 segundos, y 72ºC
durante 90 segundos, seguido de un periodo de extensión a 72ºC
durante 10 minutos, y mantenimiento a 4ºC. Tras la generación de
los fragmentos mediante PCR y la purificación en gel, se combinaron
para una PCR de extensión por solapamiento. Las nuevas regiones CDR3
codificadas por el cebador eran complementarias y proporcionaban 23
bases de solapamiento. Los cebadores N-Omp y
SeqG3Rev se utilizaron en el protocolo de PCR por solapamiento para
generar el producto completo de ADN del Fab. Se utilizó la Taq ADN
polimerasa (Perkin Elmer) en el siguiente programa de PCR: 94ºC
durante 30'', seguidamente 20 ciclos de 94ºC durante 30'', 56ºC
durante 30'' y 72ºC durante 3'15'', a continuación un periodo de
extensión de 72ºC durante 15', seguido de mantenimiento a 4ºC. Tras
la purificación en gel del producto Fab, se llevó a cabo una
digestión con Sfi1 a 50ºC durante 5 horas. Se ligaron durante la
noche las inserciones en el vector pRL4 digerido con Sfi1. Los
productos de la ligación se precipitaron con etanol, se
resuspendieron en H_{2}O y después se sometieron a electroporación
en bacterias ER2537 competentes (cepa supresora, New England
Biolabs). Tras una hora de agitación en 5 ml de SOC, se añadió un
volumen igual de SB. Se añadió carbenicilina a 20 \mug/ml y el
cultivo se agitó durante una hora a 37ºC, seguido de una hora a 37ºC
en 50 \mug/ml de carbenicilina. Se transfirió el cultivo de
biblioteca a un matraz que contenía 100 ml de SB fresco, 50
\mug/ml de carbenicilina y 10^{12} fagos ayudantes M13 VCS. Tras
dos horas a 37ºC, se añadió canamicina para seleccionar aquellas
bacterias que habían sido infectadas por fagos ayudantes. Al día
siguiente, los cultivos de la noche se centrifugaron y el fago en el
sobrenadante se precipitó en hielo utilizando PEG al 4%/NaCl 0,5 M.
Tras concentrar el fago por centrifugación, se resuspendió el pellet
resultante en BSA al 1%/PBS, se filtró y se dializó frente a PBS. La
biblioteca de fagos se almacenó a 4ºC.
Se llevó a cabo la construcción de Fabs que
contenían el péptido unido no aleatoriamente, tal como se ha
descrito anteriormente, mediante la sustitución de los cebadores
TPO-CDR3-B y
TPO-CDR3-F con cebadores específicos
alternativos. Para el anticuerpo injertado con
PP-(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEC ID nº 25), los cebadores
utilizados fueron: TPO-CDR3g-B (5'
GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NGG NGG TCT CGC ACA ATA
ATA TAT GGC 3') (SEC ID nº 9) y
TPO-CDR3g-F (5' CCG ACG CTG CGG CAA
TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEC
ID nº 10). Para el anticuerpo injertado con
GG-(IEGPTLRQWLAARA)-GG (SEC ID nº 29), los cebadores
utilizados fueron: TPO-CDR3-ggB (5'
GC CAG CCA TTG CCG CAG CGT CGG CCC TTC AAT NCC NCC TCT CGC ACA ATA
ATA TAT GGC 3') (SEC ID nº 11) y
TPO-CDR3g-F (5' CCG ACG CTG CGG CAA
TGG CTG GCG GCG CGC GCG GGN GGN TGG GGC CAA GGG ACC ACC GT 3') (SEC
ID nº 12).
Con el fin de seleccionar la expresión óptima
del péptido, se llevó a cabo un panning de plaquetas humanas.
Debido a que las plaquetas expresan aproximadamente 1.800 receptores
de TPO por célula sobre su superficie (receptores cMpI), representan
una buena diana celular. Además, las plaquetas se encuentran
fácilmente disponibles en un banco local de sangre. A 1 ml de
plaquetas humanas concentradas envejecidas procedentes del banco de
sangre, se añadieron 50 \mul de Fab-fago recién
preparados en un tubo cónico de 15 ml con 0,1% de NaN_{3}. Se
agitó el tubo a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas.
Típicamente se añadieron 10 ml de 50% de suero humano (obtenido de
las plaquetas restantes) + 50% {IMDM/FBS al 10%/azida al 0,1%/EDTA
2 mM} a los fagos/células. Se concentraron las plaquetas por
centrifugación a 5.500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Se decantó el sobrenadante y se dejó reposar el pellet bajo
\sim500 \mul de la solución de lavado durante 20 minutos. Las
plaquetas se resuspendieron muy suavemente y se añadieron a
continuación 10 ml de 25% suero humano (obtenido de las plaquetas
restantes) + 75% {IMDM/FBS al 10%/azida al 0,1%/EDTA 2 mM} a los
fagos/células. Se repitió la centrifugación, reposo del pellet y
resuspensión de las plaquetas. En las rondas de panning 3 y
4, se llevó a cabo un tercer lavado. Los fagos/células lavados se
transfirieron a un tubo de eppendorf y se centrifugaron a 5.200 x g.
Los fagos se eluyeron de las plaquetas a los 10 minutos a
temperatura ambiente utilizando tampón ácido de elución (HCl 0,1 M,
BSA 1 mg/ml y glicina hasta pH 2,2). Se concentraron las plaquetas
por centrifugación a velocidad máxima y los fagos eluídos se
transfirieron a un tubo cónico de 50 ml, se neutralizaron con base
Tris 2 M. A continuación, se dejó que los fagos infectasen bacterias
ER2537 frescas durante 15 minutos a temperatura ambiente y se
amplificaron durante la noche tal como se ha descrito anteriormente.
Se llevaron a cabo cuatro rondas de panning de las
plaquetas.
Tras la cuarta ronda de panning, se
sometieron a ensayo mediante FACS los grupos de 3 clones de Fab
expresados como proteínas solubles en la cepa bacteriana no
supresora TOP10F' (InVitrogen, Carlsbad, CA) para la unión a las
plaquetas utilizando la etiqueta epítopo HA de Fab con
anti-HA de rata de afinidad elevada seguido de FITC
antirrata (Sigma, St. Louis, Missouri). Se incubaron 25 \mul de
plaquetas humanas concentradas envejecidas (lavadas una vez con
PBS/EDTA 5 mM/FBS al 2%) con 100 \mul de sobrenadante bacteriano
(se preincubaron 60 \mul de sobrenadante bacteriano procedente de
tres clones agrupados de Fab con 40 \mul de leche al 5%/PSS a 4ºC
durante 15 minutos) a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.
Se añadió 1 ml de tampón FACS (PBS/FBS al 2%/EDTA 5 mM) y las
células se concentraron por centrifugación a 5.200 x g durante 5
minutos. Las células centrifugadas se resuspendieron en 50 \mul de
2º anticuerpo anti-HA diluido 1:10 (en PBS/BSA al
1%/NaN_{3} al 0,1%) [clon de elevada afinidad 3F10 de IgG
anti-HA de rata (Roche Molecular Biochemicals)].
Tras 30 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron con 1
ml de tampón FACS tal como anteriormente. Tras la centrifugación,
las células se resuspendieron en 100 \mul de 3º anticuerpo
IgG-FITC antirrata (Sigma) diluido 1:160 (en PBS/BSA
al 1%/NaN_{3} al 0,1%) y se incubaron durante 20 minutos a
temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se lavaron con 1
ml de tampón FACS, después se resuspendieron en 200 \mul de tampón
FACS para el análisis. Como control positivo se utilizó un Ab
anti-IIb/IIIa de oveja disponible comercialmente,
seguido de FITC antioveja. Muchos grupos de Fab eran claramente
positivos para la unión a plaquetas según FACS. A continuación se
llevó a cabo un análisis FACS de seguimiento con el fin de
identificar los clones individuales que se unían a las
plaquetas.
Se sometieron a ensayo varios Fab, en
sobrenadantes bacterianos, para su reactividad frente al toxoide
original de antígeno tetánico con el fin de determinar si se
conservaba dicha especificidad de unión. El Fab
anti-TT de las regiones estructurales del anticuerpo
se unía a su antígeno TT pero no a BSA. Sin embargo, cuatro clones
de Fab injertados con péptido mimético de TPO no mostraron un nivel
significativo de unión a TT o a BSA. Tal como se ha observado en
experimentos anteriores, la sustitución de la HCDR3 del Fab
anti-TT resultó suficiente para cambiar la
especificidad del anticuerpo.
Con el fin de examinar adicionalmente las
capacidades de unión de los Fab, se llevó a cabo un análisis FACS en
células CMK, una línea celular megacariocítica (procedente de la
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) que también
expresa el receptor cMpI. Los clones de Fab que se unían a las
células CMK se analizaron a continuación para verificar que la unión
de plaquetas y células CMK se producía mediante el receptor cMpI.
Para este experimento, se transfectaron células 293 EBNA con o sin
cMpI-R, que había sido clonado en células
Tf-1 mediante RT-PCR. Se incubaron 1
x 10^{6} células transfectadas con sobrenadante bacteriano de cada
clon de Fab (prebloqueado tal como se ha descrito anteriormente)
durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Se concentraron las
células por centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos. El pellet
de células se resuspendió en 90 \mul de tampón FACS (PBS/FBS al
2%/EDTA 1 mM), después se añadieron 10 \mul de 2º anticuerpo
anti-HA [clon 3F10 de afinidad elevada de IgG
anti-HA de rata (Boehringer Mannheim Biochemicals)]
para una dilución final de 1:10. Tras 20 minutos a temperatura
ambiente, las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS. Tras la
centrifugación, las células se resuspendieron en 100 \mul de 3º
anticuerpo IgG-PE antirrata diluido 1:50 (en PBS/BSA
al 1%/NaN_{3} al 0,1%) (Research Diagnostics Incorporated, RDI) y
se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad. Las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS, después
se resuspendieron en 200 \mul de tampón FACS para el análisis. Los
Fab seleccionados durante el panning demostraron una fuerte
unión a las células transfectadas con cMpl-R pero no
a las células transfectadas con vector de control que carecía de
cMpI-R. Ello indica que la unión de superficie
celular se producía específicamente mediante el receptor cMpI. El
Fab anti-TT no se unía al vector de control o a las
células 293 transfectadas con cMpI-R. Sin embargo,
el clon X1c de Fab mostraba un cambio desde el 3% de unión a células
transfectadas de control (sin receptor cMpI) al 95% de unión de las
células que expresaban
cMpI-R.
cMpI-R.
El análisis de secuencias de los clones de Fab
que se unían específicamente al receptor cMpI (ver la fig. 5) reveló
la selección de aminoácidos preferentes en el sitio de unión situado
corriente abajo. Se analizaron los datos de secuenciación del ADN, y
a continuación se proporcionan las secuencias aminoácidas y de
ADN:
\vskip1.000000\baselineskip
Clon | Propiedad ligante | SEC ID nº | Secuencia |
X1a | débil | 25 | Pro Pro (péptido de 14 aa) Gly Gly |
X1a-11 | débil | 27 | Gly Gly (péptido de 14 aa) Gly Gly |
X1a-13 | débil | 29 | Gly Gly (péptido de 14 aa) Gly Gly |
X1c | fuerte | 31 | Trp Leu (péptido de 14 aa*) Pro Val |
X2c | débil | 33 | Met Ile (péptido de 14 aa) Val Gly |
X3a | fuerte | 35 | Val Val (péptido de 14 aa) Pro Val |
X3b | fuerte | 37 | Gly Pro (péptido de 14 aa) Pro Asp |
(Continuación)
Clon | Propiedad ligante | SEC ID nº | Secuencia |
X4b | fuerte | 39 | Leu Pro (péptido de 14 aa) Pro Val |
X4c | fuerte | 41 | Ser Leu (péptido de 14 aa) Pro Ile |
X5a | fuerte | 43 | Thr Met (péptido de 14 aa) Pro Val |
X5c | fuerte | 45 | Trp Leu (péptido de 14 aa) Pro Val |
X7a | débil | 47 | Thr Arg (péptido de 14 aa*) Cys Ser |
X7b | débil | mutante por deleción, este clon ha perdido el péptido | |
X7c | fuerte | 49 | Gln Thr (péptido de 14 aa) Pro Asp |
La totalidad de los clones demostraron una unión
fuerte, se descubrió que contenían una prolina inmediatamente
corriente abajo del péptido mimético de TPO de 14 aminoácidos. La
selección mediante panning de una prolina en la posición de
enlace corriente abajo representa la determinación de una elección
inesperada de aminoácido que proporciona características mejoradas
de unión al péptido injertado mimético de TPO. Los ligantes débiles
no contenían esta prolina, aunque todavía contenían el péptido
mimético de TPO. Debe indicarse que el clon X7a presentaba una
mutación silenciosa en este péptido (GCG a GCA, conservando la Ala
en la posición 11 del péptido) y que el clon X2c presenta una
mutación en este péptido que intercambiaba un Thr por Ala en la
posición 11 del péptido.
Los clones se sometieron a ensayo para actividad
agonista utilizando un ensayo transcripcional midiendo la actividad
de luciferasa controlada por el promotor c-Fos. La
dimerización del receptor cMpI activa Jak, que estimula la ruta de
la MAP quinasa. De esta manera, la activación puede medirse mediante
el ensayo de la producción de luciferasa y la actividad estimulada
por la MAP quinasa mediante el promotor cFos. Debido a que la
dimerización del receptor cMpI resulta necesaria para la activación,
podrían utilizarse IgG completos o fragmentos Fab dimerizados
capaces de dimerizar el receptor, con el fin de estimular la
actividad de receptor cMpI. Los Fab producidos en bacterias se
dimerizaron mediante la etiqueta HA utilizando el anticuerpo
anti-HA 12CA5. Se añadieron cantidades crecientes de
12CA5 a los Fab bacterianos para dimerizar los clones de Fab con el
fin de que a su vez pudiesen dimerizarse y activar el receptor cMpI.
Para la medición de las actividades agonistas, se aplicó una mezcla
de 12CA5 y sobrenadantes bacterianos que contenían Fab (2 ml) a
células NIH3T3 que habían sido contransfectadas con un vector de
control o con el receptor cMpI y el constructo de promotor
Fos/informador luciferasa. Las cotransfecciones de las células 3T3
se llevaron a cabo sembrando en placa células NIH 3T3 a 3 x 10^{5}
células por placa de 6 cm y después transfectando al día siguiente.
Las células NIH 3T3 se transfectaron utilizando el reactivo de
lipofección Effectine (Qiagen), transfectando cada placa con 0,1
\mug de pEGFP (un trazador para medir la eficiencia de
transfección), 0,2 \mug del constructo promotor Fos/luciferasa y
0,7 \mug del vector de control vacío o el plásmido que expresa el
receptor cMpI. Se introdujeron las células 3T3 en suero al 0,5% 24
horas después de la transfección y se incubaron durante 24 horas
adicionales en este medio pobre en suero con el fin de reducir la
activación de fondo del promotor Fos. A continuación, se aplicaron
los sobrenadantes de anticuerpo a estas células durante 6 horas. Se
recolectaron las células y se llevaron a cabo ensayos de luciferasa
utilizando 50 \mug de lisado celular. Los anticuerpos no
estimularon ninguna activación en ausencia de expresión del receptor
cMpI. Sin embargo, se observó actividad agonista en las células 3T3
cotransfectadas con receptor cMpI. Ello permitió que los presentes
inventores demostrasen que la actividad agonista observada se
producía por el receptor cMpI y su interacción con el anticuerpo.
Los datos son los siguientes:
Sobrenadantes bacterianos con 12CA5 | ||
Tratamiento celular | Factor de incremento de la actividad de luciferasa | |
Transfectadas con cMpI-R | Transfectadas de control | |
Sin tratar: | 1,0 | 1,0 |
+ FCS al 10% | 3,43 | 3,0 |
+ TPA | 2,3 | 2,42 |
+ TPO | 2,32 | 0,76 |
(Continuación)
Tratamiento celular | Factor de incremento de la actividad de luciferasa | |
Transfectadas con cMpI-R | Transfectadas de control | |
+ X4c Sup (solo) | 1,03 | 0,94 |
+ X4c + 60 \mul \alpha-HA | 1,97 | 0,84 |
+ X4c + 30 \mul \alpha-HA | 1,52 | 0,87 |
+ X4c + 10 \mul \alpha-HA | 1,22 | 0,86 |
+ X4c + 3 \mul \alpha-HA | 0,94 | 0,68 |
+ X4c + 1 \mul \alpha-HA | 0,91 | 1,05 |
+ X4c + 0,3 \mul \alpha-HA | 1,01 | 0,95 |
La activación del receptor cMpI puede someterse
a ensayo de una manera similar utilizando IgG completos (convertidos
a partir de Fab, tal como se describe en la presente memoria)
producidos mediante transfección transitoria o estable de células de
mamífero y no por Fabs de producción bacteriana dimerizados por
12CA5 anti-HA. La transfección experimentalmente
transitoria puede llevarse a cabo esencialmente tal como se describe
en la presente memoria. Para las transfecciones, se sembraron 2 x
10^{6} células (tales como las 293 EBNA) en placas de 6 cm para
cada muestra de ensayo. Al día siguiente, cada placa se transfectó
con 2,5 \mug de ADN total (2 \mug en total de plásmido o
plásmidos de cadena ligera y de cadena pesada, 0,25 \mug de
pAdVAntage (Promega, Madison, Wisconsin) y 0,25 \mug de pEGFP)
utilizando el reactivo Effectine (Qiagen). Las células 293 se
introdujeron en suero al 0,5% 24 horas después de la transfección y
se incubaron durante 24 horas adicionales en el medio pobre en suero
con el fin de obtener IgG completos. El efecto de estimulación de
los receptores por parte de los factores de crecimiento residuales
era despreciable en este medio, tal como se observó en los
experimentos de control. Tras 24 horas, se recogieron los
sobrenadantes y se centrifugaron durante 5 minutos a 3.000 rpm con
el fin de eliminar cualquier célula residual. Para la medición de
las actividades agonistas de los IgG completos, se aplicaron 3 ml de
los sobrenadantes acondicionados de células 293 a las células
NIH3T3, tal como se ha descrito anteriormente.
Otro enfoque en la unión de dos péptidos
agonistas entre sí en un marco de anticuerpo consiste en insertar el
péptido agonista en más de una posición dentro de un solo fragmento
Fab. Con el fin de llevar esto a cabo, se construyeron bibliotecas
adicionales que contenían secuencias miméticas de TPO injertadas en
un marco de anticuerpo humano. Tras la selección de los péptidos
apropiadamente presentados en el contexto de CDR1, CDR2 o CDR3 de
cadena ligera, o CDR2 de cadena pesada, se combinaron las secuencias
de unión en una sola molécula Fab, por ejemplo tal como se indica en
la Tabla 1 a continuación, y se analizaron para identificar
incrementos de actividad.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ Péptido 1 \+ \hskip2cm \+ Péptido 2\cr \+\+\cr H - CDR3 \+ \+ H - CDR2\cr H - CDR3 \+ \+ L - CDR1\cr H - CDR3 \+ \+ L - CDR2\cr H - CDR3 \+ \+ L - CDR3\cr \+\+\cr H - CDR2 \+ \+ L - CDR2\cr H - CDR2 \+ \+ L - CDR3\cr \+\+\cr L - CDR3 \+ \+ L - CDR2\cr}
Se construyeron cuatro bibliotecas adicionales
sustituyendo separadamente la CDR2 de cadena pesada, así como las
CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, con el péptido mimético de TPO
flanqueado por 2 aminoácidos aleatorios utilizando una estrategia de
dopaje NNK. La generación de las bibliotecas se llevó a cabo de
manera similar a la descrita para la biblioteca de CDR3 de cadena
pesada-péptido TPO, excepto en que para formar una
biblioteca únicamente se amplificó por PCR y se utilizó como
inserción la cadena (pesada o ligera) que se estaba modificando. Se
llevó a cabo PCR utilizando el sistema Expand High Fidelity PCR
System (Roche), que contiene una mezcla de polimerasas Taq y Pwo.
La primera ronda de PCR se llevó a cabo utilizando el programa
siguiente: 94ºC durante 30'', después 30 ciclos de 94ºC durante
15'', 56ºC durante 30'' y 72ºC durante 2', seguido del alargamiento
durante 10' a 72ºC y mantenimiento a 4ºC. Se llevó a cabo PCR por
solapamiento durante 10 ciclos sin cebadores utilizando el programa
indicado anteriormente con el fin de permitir la generación del
molde completo de ADN por las polimerasas. A continuación, se
añadieron los cebadores a los tubos de reacción de PCR durante 20
ciclos del mismo programa para la amplificación.
Para la biblioteca HCDR2, se creó el fragmento A
utilizando el cebador directo lead VH (5' GCT GCC CAA CCA GCC ATG
GCC 3') (SEC ID nº 13), que se hibrida en la señal líder pelB
situada enfrente de la cadena pesada, y el cebador reverso HR2 CMPL
ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN TCC CAT
CCA CTC AAG CCC TTG 3') (SEC ID nº 51), que se hibrida en el extremo
de la cadena pesada FR2. El cebador reverso contenía una cola que
codificaba la nueva CDR2. El fragmento B se creó utilizando el
cebador directo HR2 cMpI CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT
GCT CGC GCT NNK NNK AGA GTC ACC ATT ACC GCG GAC 3') (SEC ID nº 14),
que se hibrida en FR3 de la cadena pesada, y el cebador reverso
N-dp (5' AGC GTA GTC CGG AAC GTC GTA CGG 3') (SEC
ID nº 15), que se hibrida en la región de etiqueta epítopo HA del
plásmido, corriente abajo de la región constante de cadena pesada.
El cebador HR2 cMpI CODE también presentaba una cola de bases que
codificaba la nueva región CDR2. Tras la generación de los
fragmentos mediante PCR y la purificación en gel, se combinaron para
una PCR de extensión por solapamiento. Las nuevas regiones CDR2
codificadas por el cebador eran complementarias y proporcionaban 24
bases de solapamiento. Los cebadores VH lead y Ndp se utilizaron en
el protocolo de PCR por solapamiento para generar el producto de
cadena pesada de ADN completo. Tras la purificación en gel del
producto de cadena pesada, se llevó a cabo una digestión XhoI/SpeI a
37ºC durante 3 horas. Las inserciones se purificaron en gel y
después se ligaron en un vector pRL4 digerido con XhoI/SpeI que
contenía la cadena ligera anti-TT. Los productos de
ligación se precipitaron y se sometieron a electroporación en
bacterias ER2537, tal como se ha descrito anteriormente para la
generación de la biblioteca fágica de Fab.
La biblioteca de CDR3 de cadena ligera se
preparó de manera similar utilizando los cebadores para el fragmento
A, cebador directo N-omp y cebador reverso LR3 cMpI
ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC TTC GAT MNN MNN ACA GTA
GTA CAC TGC AAA ATC 3') (SEC ID nº 16) y para el fragmento B,
cebador directo LR3 cMpI CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT
GCT CGC GCT NNK NNK TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG 3') (SEC ID nº 17) y
cebador reverso líder de B (5' GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC 3') (SEC
ID nº 18). El cebador líder de B se hibridó con la secuencia líder
pelB situada antes de V_{H}. Los cebadores reverso LR3 cMpI ANTI y
directo LR3 cMpI CODE se hibridaron con FR3 y FR4 de la cadena
ligera anti-TT, respectivamente. Ambos cebadores LR3
cMpI contenían una cola de nucleótidos que codificaba la nueva
biblioteca de péptidos CDR3, que proporciona la región de
solapamiento de 24 pares de bases para la PCR de fusión del
fragmento A y el fragmento B. Tras la purificación de los productos
de PCR de cadena ligera, se llevó a cabo una digestión con SacI/XbaI
a 37ºC durante 3 horas. A continuación, se ligaron los fragmentos de
cadena ligera en pRL4 digerido con SacI/XbaI que contenía la cadena
pesada anti-TT, durante la noche a temperatura
ambiente. Los productos de ligación se precipitaron y se sometieron
a electroporación en bacterias ER2537 tal como se ha descrito
anteriormente para la generación de la biblioteca fágica de Fab.
La construcción de la biblioteca de CDR2 de
cadena ligera se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente
para la biblioteca de CDR3 de cadena ligera, con la excepción de que
se utilizaron en lugar de los cebadores LR3 cMpI, los cebadores
específicos LR2 cMpI ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG GCC
TTC GAT MNN MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC 3') (SEC ID nº 19), que
se hibrida en el extremo de FR2 de cadena ligera, y el cebador LR2
cMpI CODE (5' CCA ACC CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK
GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT 3') (SEC ID nº 20), que se hibrida en el
inicio de la región FR3 de cadena ligera.
También se llevó a cabo la construcción de la
biblioteca CDR1 de cadena ligera, tal como se ha descrito
anteriormente para la biblioteca CDR3 de cadena ligera, con la
excepción de que se utilizaron en lugar de los cebadores LR3 cMpI,
los cebadores específicos TPO-LR1CODE (5' CCA ACC
CTG CGC CAG TGG CTG GCT GCT CGC GCT NNK NNK TGG TAC CAG CAG AAA CCT
GGC 3') (SEC ID nº 58) que se hibrida en el inicio del FR2 de cadena
ligera, y el cebador TPOLR1ANTI (5' AGC CAG CCA CTG GCG CAG GGT TGG
GCC TTC GAT MNN MNN GCA GGA GAG GGT GGC TCT TTC 3') (SEC ID nº 59),
que se hibrida en el inicio del FR1 de cadena ligera.
Las tres bibliotecas adicionales, que sustituyen
separadamente la CDR2 de cadena pesada y las CDR2 y CDR3 de cadena
ligera con el péptido mimético de TPO flanqueado por 2 aminoácidos
aleatorios utilizando la estrategia de dopaje NNK, se sometieron a
panning separadamente en plaquetas, tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 1 para la biblioteca de sustitución de
CDR3 de cadena pesada. Se llevaron a cabo cuatro rondas de
panning y los clones se cribaron mediante FACS en plaquetas y
células 293 transfectadas con receptor cMpI, tal como se ha
descrito anteriormente. Se obtuvieron dos clones positivos de estos
cribados. Estos clones presentaban el péptido mimético de TPO en la
CDR2 de cadena pesada. Al contrario que con los clones de CDR3 de
cadena pesada, ninguno de los clones de CDR2 de cadena pesada
presentaba una prolina en una posición corriente abajo. Por el
contrario, se observó
que ambos contenían una tirosina en una posición corriente arriba (ver la figura 9, clones HC-CDR2 nº 24 y nº 39).
que ambos contenían una tirosina en una posición corriente arriba (ver la figura 9, clones HC-CDR2 nº 24 y nº 39).
Las bibliotecas, incluyendo LCDR1, se sometieron
separadamente a otro experimento de panning utilizando
células 293 transfectadas con receptor cMpI en lugar de plaquetas
durante el panning. Se observó que las células 293
transfectaban reproduciblemente a eficiencia elevada y expresaban
niveles muy elevados del receptor cMpI funcional sobre su
superficie. De esta manera, estas células representaban una buena
diana celular para la utilización en el panning. Para estos
experimentos, se transfectaron separada y secuencialmente en cuatro
días sucesivos diferentes grupos de placas de células 293. A
continuación, se utilizó secuencialmente cada grupo de placas para
las cuatro rondas separadas de panning. Cada ronda de
recolección de células y de panning se realizó dos días
después de la transfección. Para la recolección, las células se
eliminaron de las placas utilizando tampón de disociación celular,
se concentraron por centrifugación a 1.500 rpm durante 5 minutos y
se resuspendieron en IMDM suplementado con FCS al 10%, azida sódica
al 0,1% y EDTA 5 mM a una concentración de 1 x 10^{6} células por
ml (3 x 10^{6} células para LC-CDR1). En la
primera ronda de panning, se aplicaron separadamente 3 x
10^{11} fagos de cada biblioteca a 2 ml de células (6 x 10^{6}
células para LC-CDR1 y 2 x 10^{6} células para el
resto) y se agitaron en un tubo cónico de 15 ml durante dos horas a
temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces utilizando 10
ml de tampón IMDM/FCS al 10%/azida sódica al 0,1%/EDTA 5 mM. Los
fagos se eluyeron en ácido y se amplificaron tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 1. En la ronda dos, se utilizaron 4 x
10^{6} células (6 x 10^{6} células para LC-CDR1)
en 2 ml de tampón, y se combinaron 3 x 10^{11} fagos procedentes
de los fagos eluídos de la primera ronda, que había sido
amplificada, con 3 x 10^{11} fagos de la biblioteca no sometida a
panning y se añadieron a las células. Se realizó el lavado,
la elución y la amplificación de manera similar a la primera ronda.
En la tercera ronda, se utilizaron 4 x 10^{6} células (6 x
10^{6} células para LC-CDR1) en 2 ml de tampón y 3
x 10^{11} fagos procedentes de los fagos de la segunda ronda, que
había sido amplificada. Las células se lavaron tres veces
previamente a la elución. En la cuarta ronda, nuevamente se
utilizaron 4 x 10^{6} células (6 x 10^{6} para
LC-CDR1) en 2 ml de tampón y 3 x 10^{11} fagos
procedentes de los fagos eluídos y amplificados de la tercera ronda.
Nuevamente se lavaron las células tres veces previamente a la
elución. Se cribaron por lo menos treinta clones individuales
mediante FACS en células 293 transfectadas con receptor cMpI, tal
como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron 12 clones positivos
de la biblioteca de CDR2 de cadena pesada y 25 clones positivos de
la biblioteca de CDR2 de cadena ligera, y se obtuvieron 14 clones
positivos de la biblioteca de CDR1 de cadena ligera. Los clones se
analizaron adicionalmente mediante secuenciación del ADN. Los
residuos aminoácidos flanqueantes seleccionados para los clones
positivos se ilustran en la figura 9 adjunta. Resulta de interés
indicar que los Fabs injertados con CDR2 de cadena ligera
presentaban una fuerte selección para una prolina (Pro) corriente
arriba del péptido mimético de TPO.
Se generaron combinaciones de los clones de Fab
injertados con péptido mimético de TPO de la figura 9. De esta
manera, un solo anticuerpo podía contener múltiples copias del
péptido mimético de TPO dentro de una sola cadena ligera o pesada.
Alternativamente, ambas cadenas, ligera y pesada, pueden contener
injertos de péptidos, proporcionando múltiples copias dentro de un
solo Fab. Se agruparon los clones positivos seleccionados de la
misma biblioteca de CDR. Se construyeron nuevas bibliotecas mediante
la combinación de la agrupación de un CDR que contenía péptido
mimético de TPO con la agrupación de otro. Se prepararon
combinaciones en las que uno de los péptidos miméticos de TPO se
encontraba en la cadena ligera y el otro en la cadena pesada
utilizando técnicas simples de clonación con los ADN de plásmido
agrupados, y los sitios de restricción únicos flanqueantes de las
cadenas pesada (XhoI-SpeI) y ligera
(SacI-XbaI). Por ejemplo, el plásmido de ADN para
las cadenas pesadas injertadas con el péptido H-CDR3
se combinó y se digirió con XhoI y SpeI. Las inserciones en cadena
pesada purificadas se ligaron en el plásmido digerido con XhoI/SpeI
que contenía los injertos L-CDR2. La biblioteca
resultante contenía cadenas pesadas con los injertos de péptidos
CDR3 y cadenas ligeras con injertos de péptidos CDR2. Debe
entenderse que los clones individuales también podrían combinarse y
no utilizar agrupaciones de clones para el apareamiento de dos CDR
que contienen péptido. Por ejemplo, se apareó un solo clon de cadena
pesada con injerto de péptido CDR3 con varios clones de CDR1 de
cadena ligera con el fin de crear Fabs con múltiples copias de
péptidos miméticos de TPO.
Las combinaciones en las que se encontraban
combinados dos péptidos miméticos de TPO dentro de una cadena pesada
dada se llevaron a cabo utilizando PCR por solapamiento con el fin
de generar el fragmento para la clonación. Se utilizaron dos
cebadores solapantes que se unen entre CDR2 y CDR3, y cebadores
flanqueantes, tales como "N omp" y "lead B" en la cadena
ligera, y "lead VH" y "Ndp" en la cadena pesada. Por
ejemplo, para combinar H-CDR2 y
H-CDR3, se llevó a cabo el primer PCR utilizando
lead VH (un cebador que se hibrida en el vector en la señal líder
pelB de la cadena pesada) y un cebador reverso que se hibrida
en FR3 utilizando el ADN agrupado de H-CDR2 de
plásmido como molde. La secuencia de este cebador era 5' CCA TGT AGG
CTG TGC CCG TGG ATT 3' (SEC ID nº 63). En una reacción separada, los
plásmidos agrupados que contenían los injertos
H-CDR3 se sometieron a PCR con un cebador directo
que se hibridaba en FR3 (que es complementario al cebador reverso en
FR3 anteriormente indicado) y Ndp (que se hibrida en el vector en
una secuencia de etiqueta del epítopo). La secuencia de este cebador
era 5' CCA CGG GCA CAG CCT ACA TGG AGC 3' (SEC ID nº 64). Los
primeros productos de PCR se purificaron, seguidamente se combinaron
en una reacción de PCR por solapamiento, en la que se produjo la
fusión de los dos fragmentos a través de la complementariedad de las
secuencias FR2. Se clonó el producto de cadena pesada completo con
XhoI/SpeI en un plásmido que contenía la cadena ligera del toxoide
antitétano. En total, se crearon cinco clases de Fabs que portaban
múltiples copias de péptidos miméticos de TPO, tal como se detalla
en la
Tabla 2 siguiente.
Tabla 2 siguiente.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ Péptido 1 \+ \hskip2cm \+ Péptido 2 \+ \hskip2cm \+ Péptido 3\cr \+\+\+\+\cr H - CDR3 \+ \+ H - CDR2\+\+\cr H - CDR3 \+ \+ L - CDR2\+\+\cr \+\+\+\+\cr H - CDR2 \+ \+ L - CDR2\+\+\cr \+\+\+\+\cr H - CDR3 \+ \+ H - CDR2 \+ \+ L - CDR2\cr \+\+\+\+\cr H - CDR3 \+ \+ L - CDR1\+\+\cr}
Se sometieron a ensayo para actividad biológica
20 clones de cada biblioteca de combinación y cuatro clones
individuales de H-CDR3 más L-CDR1 en
un ensayo de informador luciferasa, tal como se ha descrito
anteriormente. Ver las figuras 10 y 11. En ambos experimentos, los
controles negativos podían incluir células no inducidas, células
tratadas con Fab irrelevante (toxoide antitétano), células tratadas
con un clon de Fab que sólo se une débilmente con el receptor cMpI,
y Fabs X4b y/o X1c que se unen al receptor cMpI pero que sólo
presentan un solo dominio de unión y por lo tanto no pueden activar
el receptor. El control positivo era la adición de TPO. Todas las
muestras restantes procedían de bibliotecas de combinación recién
formadas. Tal como puede observarse, varios clones presentaban
actividad significativa como Fabs. Ello indica que la incorporación
de múltiples péptidos miméticos de TPO en una sola molécula de Fab
permite unir dos receptores y provocar la activación del
receptor.
De hecho, mediante la utilización de Fab 59, la
actividad agonista obtenida puede ser tan elevada como la actividad
nativa de TPO. Se purificaron parcialmente el clon 59 que contiene
dos péptidos miméticos de TPO (CDR3-CP muestra x4c y
CDR2-CL muestra 19, según se identifican en la fig.
9) y una etiqueta His6 a partir de una preparación periplasmática
bacteriana mediante FPLC utilizando cromatografía de columna de
níquel. Se midió la actividad de este Fab y se encontró que era
aproximadamente equivalente a la actividad de la TPO (ver la figura
12), según estimación de la inducción específica de
cMpI-R de la actividad de luciferasa en comparación
directa con concentraciones conocidas de TPO. Se llevó a cabo una
transferencia western cuantitativa con el fin de determinar las
concentraciones de anticuerpo Fab 59.
Podrían utilizarse estos Fabs, o diversas otras
combinaciones de CDR, como producto terapéutico. Alternativamente,
estos clones podrían convertirse en secuencias marco de línea
germinal (con o sin optimización de codones) para la utilización
como agente terapéutico con la condición de que se mantenga su
actividad.
Se trasplantó en la estructura de otro
anticuerpo, 5G1.1, el péptido mimético de TPO injertado en el clon
Fab X4b en el CDR3 de cadena pesada. La construcción de 5G1.1 se
describe en la solicitud de patente US nº de serie 08/487.283,
incorporada en la presente memoria como referencia. La secuencia se
clonó en 5G1.1 de tal manera que sustituyese la CDR3 nativa con 5'
ttg cca ATT GAA GGG CCG ACG CTG CGG CAA TGG CTG GCG GCG CGC GCG cct
gtt 3' (SEC ID nº 65). El injerto de péptido traducido en
aminoácidos era Leu Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala
Ala Arg Ala Pro Val (SEC ID nº 66). El péptido 5G1+ se produjo como
anticuerpo IgG completo (ver las figuras 13A y 13B).
Se analizó el anticuerpo 5G1.1+péptido
purificado, así como el 5G1.1 parental, para su capacidad para
unirse al receptor cMpI mediante análisis FACS. Se comparó la unión
de células 293 que expresaban receptor y que no expresaban receptor.
Ver la figura 14. La tinción FACS se llevó a cabo esencialmente tal
como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que la
detección se realizó utilizando fragmento F(ab')_{2}
conjugado con PE de cabra anti-IgG humano (H+L). Los
controles negativos de Fab irrelevante toxoide antitétano 3º solo y
Fab X1a, que se une débilmente al receptor cMpI, mostraban muy poca
tinción. Sin embargo, los Fabs X1c y X4b ligantes mostraban una
fuerte tinción, al igual que 5G1.1+péptido. Ninguno de estos clones
demostró unión a las células que no expresaban receptor, indicando
que la tinción celular se producía a través del reconocimiento
específico del receptor cMpI. El 5G1.1 parental sin el péptido
mimético de TPO no mostró tinción en ninguna de las células
sometidas a ensayo.
Se determinó la capacidad de IgG completo
5G1.1+péptido de activar el receptor cMpI utilizando el ensayo del
informador luciferasa (ver la figura 15). Los resultados indican que
la configuración de un IgG completo provoca limitaciones estéricas
en su capacidad de reunir productivamente los dos receptores cMpI
para la activación. La actividad del constructo IgG completo 5G1.1
que contiene el péptido mimético de TPO en las posiciones CDR3 de
cadena pesada, era sólo débilmente activador y requería
concentraciones molares aproximadamente 100 a 200 veces más elevadas
en comparación con TPO para estimular una actividad equivalente. Tal
como se ha observado con anterioridad en experimentos de unión, la
activación por el 5G1.1 que contiene el péptido se observa
únicamente cuando se expresa cMpI-R sobre la
superficie celular. No se observó unión o actividad específica del
receptor en el 5G1.1 parental que no contenía el péptido. Estos
resultados demuestran que la unión y la actividad del péptido
mimético de TPO y de las secuencias aminoácidas flanqueantes
seleccionadas no se encuentran limitadas, o no son específicas, de
la estructura del anticuerpo del toxoide del tétano, sino que pueden
aplicarse a otras estructuras de anticuerpo. De esta manera, las
secuencias aminoácidas flanqueantes que se seleccionaron durante el
panning son específicas para la presentación del péptido
mimético de TPO en una posición CDR determinada, pero no para la
secuencia aminoácida de la estructura del anticuerpo.
Se generó una biblioteca mediante la inserción
de un péptido mimético de TPO y aminoácidos flanqueantes
seleccionados anteriormente
(NP-IEGPTLRQWLAARA-RG) (SEC ID nº
61) en una colección de fragmentos de gen kappa humano, en este caso
la CDR2 de cadena ligera. Anteriormente se habían generado cadenas
ligeras kappa humanas a partir de múltiples donantes de linfocitos
de sangre periférica humana (PBL) y se habían clonado en
pBluescriptII SK+. Estos constructos sirvieron como fuente de los
fragmentos génicos de anticuerpo.
Se aisló ARN total de PBLs humanos utilizando
reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) seguido de
purificación de ARNm mediante el sistema Oligotex mRNA purification
System (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del
kit. Se preparó ADNc de primera cadena utilizando el kit SuperScript
Rtase II cDNA Synthesis (Life Technologies, Rockville, Maryland) con
un cebador oligo-dT modificado. La secuencia del
cebador era 5' TAGGATGCGGCCGCACAGGTC(T_{20}) 3' (SEC ID nº
62). Las muestras se lavaron en una columna de centrifugación de un
kit de purificación PCR (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo con las
instrucciones del kit. Se amplificaron los productos de cadena
ligera utilizando el cebador reverso "Not I" y los cebadores
directo que se hibridan en la posición de marco 1 (FR1) de las
cadenas kappa en la primera cadena de ADNc. El cebador "Not I"
presentaba una secuencia que era idéntica al extremo 5' del cebador
oligo-dT modificado (5' TAGGATGCGGCCGCACAGGTC 3')
(SEC ID nº 72). El conjunto de cebadores FR1 kappa utilizados era el
siguiente:
Una reacción de amplificación típica contenía 2
\mul de reacción ADNc, dNTP, cebador reverso "Not I", uno de
los cebadores directo XVB, tampón Opti-prime nº 5
(Stratagene, La Jolla, CA) y mezcla de polimerasa Expand High
Fidelity (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Las
muestras se calentaron a 94ºC durante 2 minutos, después se pasaron
por 10 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 56ºC durante 30 segundos,
y 72ºC durante 1 minuto, seguido de 20 ciclos de 94ºC durante 15
segundos, 56ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante (1 minuto + 5
segundos/ciclo). Tras los ciclos, se llevó a cabo una incubación
prolongada a 72ºC (7 minutos) previamente al mantenimiento a 4ºC.
Los productos se precipitaron con etanol y después se purificaron en
gel. Se aislaron fragmentos de aproximadamente 850 pb y después se
digirieron con XbaI y SacI. Los productos kappa resultantes se
ligaron en pBluescriptII SK+ que de manera similar se había digerido
con XbaI y SacI. Los productos de ligación se sometieron a
electroporación en Top10F' (InVitrogen, Carlsbad, CA) y se
cultivaron durante la noche. Se utilizó el pellet bacteriano para
aislar el ADN de la biblioteca kappa utilizando el kit de
aislamiento de ADN MAXIprep de QIAGEN.
Para la construcción de la biblioteca de marco
de cadena ligera de TPO, se utilizaron cantidades iguales de cuatro
bibliotecas de cadena ligera kappa diferentes procedentes de cuatro
pacientes diferentes como el molde de inicio para las reacciones de
PCR (25 ng en total por reacción). Se incorporaron el péptido
mimético de TPO y los aminoácidos flanqueantes seleccionados en las
cadenas ligeras mediante PCR por solapamiento. En la primera ronda
de PCR, se combinaron separadamente un conjunto de cebadores
reversos (cebadores VK ANTI) que se unían a la FR2 de cadena ligera
kappa con el cebador directo T7 seq-F (5' A TTA ATA
CGA CTC ACT ATA GGG 3') (SEC ID nº 86) con el fin de sintetizar la
sección N-terminal de la cadena ligera y parte del
péptido mimético de TPO dentro de la posición CDR2 de LC. Se
combinó separadamente un segundo conjunto de cebadores directo
(cebadores VK CODE) que se unían a FR3 con el cebador reverso T3 (5'
AA TTA ACC CTC ACT AAA GGG 3') (SEC ID nº 87) con el fin de
sintetizar el resto del péptido mimético de TPO dentro de la
posición CDR2-CL y la mitad
C-terminal de la cadena ligera mediante PCR. Se
llevaron a cabo reacciones separadas para cada par de combinaciones
de cebador por duplicado.
Los fragmentos de las primeras rondas de PCR se
purificaron en gel. A continuación, se combinaron estos fragmentos
purificados, de manera específica según familia de anticuerpo, en
reacciones de PCR por solapamiento con el fin de generar la cadena
ligera completa. Las reacciones para cada familiar se llevaron a
cabo por triplicado utilizando 40 ng de las secciones
N-terminal y C-terminal de la
cadena ligera en cada reacción. Las reacciones se llevaron a cabo
durante 10 ciclos previamente a la adición de los cebadores T3 y T7
Seq-F, seguido de 25 ciclos adicionales tras la
primera adición. Los productos de fusión de PCR de CL de longitud
completa se purificaron en gel, se digirieron con SacI y con XbaI,
y se purificaron a continuación nuevamente en gel. Las inserciones
en la cadena ligera se ligaron a continuación en un vector fágico de
expresión apropiado, que de manera similar había sido digerido con
XbaI y con SacI y purificado en gel. El vector
pRL5-kappa utilizado presentaba sitios de
restricción que eran compatibles con los fragmentos de CL y
contenían la región constante Kappa restante desde el sitio SacI
hasta la Cys C-terminal. Además, se insertó la
cadena pesada del toxoide antitétano en el vector mediante XhoI y
SpeI para la producción de Fab.
La mezcla de ligación se transformó mediante
electroporación en bacterias XL-1 Blue (Stratagene,
La Jolla, CA) y se amplificó. La biblioteca se sometió a
panning en cuatro rondas en células 293 EBNA transfectadas
con cMpI-R de una manera similar a la anteriormente
descrita. Los clones obtenidos durante el panning se cribaron
para la unión mediante análisis FACS en células 293 EBNA
transfectadas con cMpI-R o sin
cMpI-R, tal como se ha descrito anteriormente. Se
obtuvieron varios clones que se unían específicamente a
cMpI-R. La huella de ADN de las cadenas ligeras
resultantes mediante digestión con BstN1 indicó que los clones
podían dividirse en 5 grupos diferentes. La secuenciación parcial de
8 de estos clones demostró que los marcos de por lo menos dos
familias diferentes de cadena ligera kappa resultaban seleccionados
durante el panning (VK1 y VK3). En un ensayo inicial, 3 de
los clones de marco de cadena ligera se combinaron con la cadena
pesada de X4b para crear un Fab con 2 péptidos miméticos de TPO.
Estos clones indujeron la activación de cMpI-R en
ensayos de luciferasa, tal como se ha descrito anteriormente. El
nivel de activación utilizando sobrenadantes bacterianos de uno de
estos clones, 429/X4b (ver la figura 16) era aproximadamente 10 a 20
veces inferior al observado con TPO, según se estimó comparando la
actividad de concentraciones conocidas de TPO y utilizando
transferencias western cuantitativas para determinar la
concentración del anticuerpo en el sobrenadante. Pueden cribarse
clones adicionales de manera similar con el fin de identificar
clones con actividad superior.
Dichos Fabs, o diversas otras CL, CP o
combinaciones intracadena de CDR, podrían utilizarse como un
producto terapéutico. Alternativamente, estos clones podrían
convertirse en secuencias marco de línea germinal (con o sin
optimización de codones) para la utilización como un agente
terapéutico con la condición de que se mantenga su actividad.
Se eliminó el sitio NotI en pAX131 digiriendo el
vector con NotI, utilizando la polimerasa klenow para rellenar los
extremos protuberantes dejados por NotI y después religar el vector.
Ver la figura 17. Se llevaron a cabo modificaciones adicionales
mediante la digestión de pAX131 con EcoRI y con XbaI. Se generó una
inserción que sustituía los elementos eliminados por esta digestión
utilizando oligonucleótidos solapantes con los cambios siguientes:
conversión del sitio SacI en un nuevo sitio XbaI (subrayado simple
en las secuencias de cebador posteriormente), conversión del sitio
XbaI original en un sitio NotI (subrayado doble en las secuencias de
cebador posteriormente) y finalizando la inserción con un segmento
protuberante de SpeI que es compatible con el segmento protuberante
generado por la digestión con XbaI del vector. La ligación de la
inserción EcoRI/SpeI en el vector cortado con EcoRI/XbaI resultó en
un híbrido SpeI/XbaI que ya no se puede cortar con SpeI ni con XbaI
en ese sitio. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados era la
siguiente: "EcoSpe" 5' AA TTC AAG GAG TTA ATT ATG AAA AAA ACC
GCG ATT GCG ATT GCG GTG GCG CTG GCG GGC TTT GCG ACC GTG GCC CAG GCG
GCC TCT AGA ATC T\underline{\underbar{GC \ GGC}} CGC a 3'
(SEC ID nº 107), y "SpeEco" 5' ct agt \underline{\underbar{GCG
\ GCC \ GC}}A GAT TCT AGA GGC CGC CTG GGC CAC GGT CGC AAA
GCC CGC CAG CGC CAC CGC AAT CGC AAT CGC GGT TTT TTT CAT AAT TAA CTC
CTT G 3' (SEC ID nº 108).
El vector intermediario creado era
pAX131Xba/Not. Se insertó la región constante kappa humana entre los
sitios XbaI y NotI, generando pAX131-kappa (ver la
figura 18). Se amplificó por PCR la región constante kappa humana a
partir de ADNc humano utilizando cebadores que introdujeron el sitio
XbaI corriente arriba y en la posición corriente abajo, un codón de
parada TAA seguido de un sitio NotI. Los cebadores utilizados eran:
CKXbaI (5' GGA GTC TAG ATA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC 3') (SEC
ID nº 109) y CKNotI (5' AGG AGC GGC CGC TTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA
GCT C 3') (SEC ID nº 110).
Las modificaciones por clonación de la cadena
ligera incorporadas en pAX131-kappa se introdujeron
en el vector pRL5 (modificado para eliminar su sitio NotI, tal como
se ha descrito anteriormente) mediante desplazamiento del fragmento
EcoRI a XhoI. Ver las figuras 19 y 20. Este vector se denominó
pRL5-kappa (ver las figuras
21A-I).
Se construyó una biblioteca CDR2 CP adicional en
la que se había insertado en la cadena pesada una secuencia central
del péptido mimético de TPO (GPTLRQWL) (SEC ID nº 112) flanqueada
por un solo aminoácido aleatorio en cada lado sustituyendo
parcialmente la CDR2 (GXGPTLRQWLXYAQKFQG) (SEC ID nº 113). También
se llevó a cabo la construcción de la biblioteca de sustitución
parcial de CDR2 de cadena pesada tal como se ha descrito
anteriormente para la biblioteca de CDR2 de cadena pesada con la
excepción de que el cebador específico 8HCR2anti'0 (5'
CAGC
CACTGGCGCAGGGTTGGGCCMNNCCCTCCCATCCACTCAAGCCC 3') (SEC ID nº 114) que hibridaba en el extremo de la FR2 de cadena pesada, y el cebador 8HCR2code (5' GGCCCAACCCTGCGCCAGTGGCTGNNK
TACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACCATT 3') (SEC ID nº 115) que hibridaba en el inicio de la FR3 de cadena pesada, se utilizaron en lugar de los cebadores HR2 cMpI anteriormente indicados. La biblioteca de sustitución parcial de CDR2 de cadena pesada se sometió a panning en cuatro rondas en células 293 EBNA transfectadas con cMpI-R, tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se cribaron estos clones para los clones ligantes positivos mediante análisis FACS, tal como se ha descrito anteriormente.
CACTGGCGCAGGGTTGGGCCMNNCCCTCCCATCCACTCAAGCCC 3') (SEC ID nº 114) que hibridaba en el extremo de la FR2 de cadena pesada, y el cebador 8HCR2code (5' GGCCCAACCCTGCGCCAGTGGCTGNNK
TACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACCATT 3') (SEC ID nº 115) que hibridaba en el inicio de la FR3 de cadena pesada, se utilizaron en lugar de los cebadores HR2 cMpI anteriormente indicados. La biblioteca de sustitución parcial de CDR2 de cadena pesada se sometió a panning en cuatro rondas en células 293 EBNA transfectadas con cMpI-R, tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se cribaron estos clones para los clones ligantes positivos mediante análisis FACS, tal como se ha descrito anteriormente.
<110> Alexion Pharmaceuticals, Inc.
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<120> ANTICUERPOS DISEÑADOS
RACIONALMENTE
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<130> 1087-2 PCT
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<140> PCT/US01/47656
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<141>
2001-12-05
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/251.448
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-12-05
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/288.889
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-29
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/294.068
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-29
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<160> 118
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> TPO/péptido mimético
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<400> 1
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\sa{Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala
Ala Arg Ala}
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<210> 2
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
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<400> 2
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\sa{Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala
Ala Arg Ala Pro}
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<210> 3
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> péptido mimético de EPO
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<400> 3
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\sa{Asp Tyr His Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp
Val Cys Lys Pro Leu}
\sac{Gly Gly}
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<210> 4
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<213> humano
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\sa{Gly Asp Thr Ile Phe Gly Val Thr Met Gly Tyr
Tyr Ala Met Asp Val}
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<222> (38)..(39)
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<222> (37)..(38)
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<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
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Leu Ala Ala Arg Ala}
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill54
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<211> 18
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO co aminoácidos
flanqueantes
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
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\sa{Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
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<220>
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<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill54
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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Ala Ala Arg Ala}
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<211> 54
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctgattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc tgtc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ile Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
d TPO con aminoácidos flanqueantes
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<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgataattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcggt tggc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
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<211> 54
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
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\hfill54
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggccgattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc cgat
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgccaattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc tgtt
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcactgattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggccgg cgcgcgcgcc catc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Met Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaatgattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc cgtt
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Thr Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgaccaattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc tgtc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Arg Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Cys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacggattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgtg cagc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Thr Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica mimético
de TPO con aminoácidos flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagacaattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc tcac
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcagg ttgggccttc gatmnnmnnt cccatccact caagcccttg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> parte de vector
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> parte de polipéptido codificada por
Sec. nº 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 699
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 646
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> parte de región variable de cadena
pesada artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquiera de entre 14
aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquiera de entre 14
aminoácidos codificados por el triplete NNY, que elimina todas las
paradas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Ile Glu Gly Pro
Thr Leu Arg Gln Trp}
\sac{Leu Ala Ala Arg Ala Xaa Xaa Trp Gly Gln
Gly Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótidos que codifican CDR3
artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctnnknnkt ggtaccagca gaaacctggc
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatmnnmnng caggagaggg tggctctttc
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de TPO con aminoácidos
flanqueantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggatgcgg ccgcacaggt cttttttttt tttttttttt t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgtaggc tgtgcccgtg gatt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacgggcac agcctacatg gagc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica
secuencia flanqueante de péptido mimético de TPO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgccaattg aagggccgac gctgcggcaa tggctggcgg cgcgcgcgcc tgtt
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido mimético de TPO con
secuencia flanqueante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
Leu Ala Ala Arg Ala}
\sac{Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 472
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada de anticuerpo
humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica cadena
pesada de anticuerpo humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena ligera de anticuerpo
humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 711
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ácido nucleico que codifica cadena
ligera de anticuerpo humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> mimético de EPO con aminoácidos
flanqueantes aleatorios
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Asp Tyr His Xaa Arg Met Gly Pro Leu
Thr Trp Val Xaa Lys}
\sac{Pro Leu Gly Gly Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggatgcgg ccgcacaggt c
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag aracatccag atgacccag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agmcatccag ttgacccag
\hfill39
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agccatccrg atgacccag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agtcatctgg atgacccag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agatattgtg atgacccag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agatrttgtg atgactcag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agaaattgtg ttgacrcag
\hfill39
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agaaattgta atgacacag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agacatcgtg atgacccag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agaaacgaca ctcacgcag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agaaattgtg ctgactcag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcgcaca acacgtctag agatgttgtg atgacacag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaatacga ctcactatag gg
\hfill22
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<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaaccct cactaaaggg
\hfill20
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<210> 88
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<211> 59
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggttc ctgatgagga gctttggrg
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggttt tgaataatga aaatagcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggttg taaatgagca rcttaggag
\hfill59
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggtta tagatgagga gcctgggmg
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggtta taaattaggc gccttggag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggtta tagatyagga gctgtggag
\hfill59
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
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<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggtta tagatcagga gcttagga
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggttr tagatcagga gcttaggg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggtta tagatcaggg acttaggg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccagccac tggcgcaggg ttgggccttc gatcgggtta tagatcaggy gcttaggg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gggtcccctc gaggttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gaatcccacc tcgattcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gggtccctga ccgattcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gcatcccagm caggttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gtatcccagc caggttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gagtsccaga yaggttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gggtcccwga cagrttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gggtcccatc aaggttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaccctgc gccagtggct ggctgctcgc gctcgtggtg gggtcccatc tcggttcag
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtctaga taactgtggc tgcaccatct gtcttc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggagcggcc gcttaacact ctcccctgtt gaagctc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> parte de mimético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR2 artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Xaa
Tyr Ala Gln Lys Phe}
\sac{Gln Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagccactgg cgcagggttg ggccmnnccc tcccatccac tcaagccc
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcccaaccc tgcgccagtg gctgnnktac gcacagaaat tccagggcag agtcaccatt
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótidos que codifican región
variable de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (45)
1. Molécula de inmunoglobulina que comprende una
región en la que los residuos aminoácidos que corresponden a por lo
menos una parte de una región determinante de complementariedad
(CDR) se sustituyen por un péptido mimético que es un mimético de la
trombopoyetina (TPO), o en la que el péptido mimético que es un
mimético de trombopoyetina se inserta en una CDR.
2. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, que comprende además por lo menos una secuencia
flanqueante que incluye por lo menos un aminoácido unido
covalentemente a por lo menos un extremo del péptido mimético.
3. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 2, en la que por lo menos una secuencia flanqueante
incluye una secuencia flanqueante que presenta una prolina que se
encuentra unida covalentemente al péptido mimé-
tico.
tico.
4. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 3, en la que por lo menos una secuencia flanqueante
incluye una secuencia flanqueante que presenta una prolina que se
encuentra unida covalentemente al extremo
carboxi-terminal del péptido mimético.
5. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que por lo menos dos regiones determinantes
de complementariedad (CDR) son sustituidas por el péptido mimético o
en la que se inserta el mimético de trombopoyetina en dos CDR.
6. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que la molécula de inmunoglobulina se
selecciona de entre el grupo constituido por fragmento Fab,
fragmento F(ab')_{2} y fragmento scFv.
7. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que la molécula de inmunoglobulina es una
molécula de IgG completa.
8. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que la CDR se encuentra situada en una
cadena ligera.
9. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que los residuos aminoácidos
correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante
de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido mimético que
es un mimético de trombopoyetina (TPO) y en la que la CDR se
encuentra situada en una cadena pesada.
10. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que los residuos aminoácidos
correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante
de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido mimético que
es un mimético de trombopoyetina (TPO), en la que la CDR se
selecciona de entre el grupo constituido por una CDR3 de una cadena
pesada y una CDR2 de una cadena ligera.
11. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que los residuos aminoácidos
correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante
de complementariedad (CDR) son sustituidos por un péptido mimético
que es un mimético de trombopoyetina (TPO), en la que la CDR se
selecciona de entre el grupo constituido por CDR3 de una cadena
pesada y CDR2 de una cadena pesada.
12. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que los residuos aminoácidos
correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante
de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido mimético que
es un mimético de trombopoyetina (TPO), en la que la CDR se
selecciona de entre el grupo constituido por CDR3 de una cadena
pesada y CDR1 de una cadena ligera.
13. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que se sustituyen los residuos aminoácidos
correspondientes a una parte de más de una CDR.
14. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que los residuos aminoácidos
correspondientes a por lo menos una parte de una región determinante
de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido mimético que
es un mimético de trombopoyetina (TPO), en la que las regiones CDR3
de una cadena pesada y de una cadena ligera se sustituyen por el
péptido mimético.
15. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que el mimético de trombopoyetina se inserta
en una CDR.
16. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que por lo menos una parte de la CDR se
sustituye por un péptido mimético que es un mimético de
trombopoyetina (TPO) y en el que la CDR se selecciona de entre el
grupo constituido por la CDR2 de una cadena pesada y la CDR2 de una
cadena ligera.
17. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que por lo menos una parte de la CDR se
sustituye por un péptido mimético que es un mimético de
trombopoyetina (TPO) y en la que la CDR se selecciona de entre el
grupo constituido por CDR1 de una cadena pesada y CDR1 de una cadena
ligera.
18. Inmunoglobulina según la reivindicación 1,
en la que por lo menos una parte de la CDR se sustituye por un
péptido mimético que es un mimético de trombopoyetina (TPO) y en la
que la CDR se selecciona de entre el grupo constituido por una CDR3
de una cadena pesada y una CDR3 de una cadena ligera.
19. Inmunoglobulina según la reivindicación 1,
en la que por lo menos una parte de la CDR se sustituye por un
péptido mimético que es un mimético de trombopoyetina (TPO) y en la
que la molécula de inmunoglobulina es humana.
20. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 18, en la que la molécula de inmunoglobulina es el
toxoide antitétano.
21. Ácido nucleico que codifica una molécula de
inmunoglobulina según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
22. Vector de expresión que comprende ácidos
nucleicos según la reivindicación 21.
23. Célula huésped transformada con un vector de
expresión según la reivindicación 22.
24. Procedimiento para la producción de una
molécula de inmunoglobulina, que comprende cultivar una célula
huésped según la reivindicación 23 bajo condiciones adecuadas para
la expresión de la inmunoglobulina.
25. Composición que comprende una
inmunoglobulina según la reivindicación 1 y un portador
farmacéuticamente aceptable.
26. Procedimiento de manipulación de una
molécula de inmunoglobulina para que muestre una actividad de un
péptido biológicamente activo, que comprende: proporcionar ácidos
nucleicos que codifican una molécula de inmunoglobulina; sustituir
por lo menos una parte de por lo menos una región codificante de CDR
por ácidos nucleicos que codifican un péptido biológicamente activo
que es un mimético de trombopoyetina (TPO), o insertar ácidos
nucleicos que codifican un péptido biológicamente activo que es un
mimético de TPO en por lo menos una CDR, con el fin de formar un
constructo de ácidos nucleicos sustituido con un péptido
biológicamente activo y expresar el péptido codificado por el
constructo de ácidos nucleicos junto con una cadena de anticuerpo
seleccionada de entre el grupo constituido por cadena pesada y
cadena ligera, en una célula huésped adecuada de manera que se forma
un heterodímero.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en
el que el péptido biológicamente activo comprende una prolina unida
covalentemente a su extremo carboxi-terminal.
28. Utilización de una molécula de
inmunoglobulina que presenta una o más regiones CDR sustituidas por
un péptido mimético de trombopoyetina (TPO); o en la que el péptido
mimético de trombopoyetina se inserta en por lo menos una CDR, en la
preparación de un medicamento para estimular la proliferación, la
diferenciación o el crecimiento de promegacariocitos o
megacariocitos.
29. Utilización según la reivindicación 28, en
la que se incrementa la producción de plaquetas.
30. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 29, en la que una parte de por lo menos una
región codificante de CDR se sustituye por ácidos nucleicos que
codifican un péptido biológicamente activo y en la que el péptido
biológicamente activo se selecciona de entre el grupo constituido
por las SEC ID nº 31, nº 35, nº 37, nº 39, nº 41, nº 43, nº 45 y nº
49.
31. Molécula de inmunoglobulina que comprende
una región en la que los residuos aminoácidos correspondientes a por
lo menos una parte de una CDR se sustituyen por un péptido
biológicamente activo que es un mimético de trombopoyetina (mimético
de TPO); o en la que el péptido biológicamente activo que es un
mimético de trombopoyetina (mimético de TPO) se inserta en por lo
menos una CDR; en la que el péptido biológicamente activo se
encuentra flanqueado por una prolina en el extremo
carboxi-terminal del péptido biológicamente
activo.
32. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 31, en la que por lo menos dos regiones CDR se
sustituyen por el péptido biológicamente activo, o en la que el
péptido biológicamente activo se inserta en por lo menos dos
regiones CDR.
33. Ácido nucleico que codifica una molécula de
inmunoglobulina según la reivindicación 32.
34. Vector de expresión que comprende un ácido
nucleico según la reivindicación 33.
35. Célula huésped transformada con un vector de
expresión según la reivindicación 34.
36. Biblioteca que contiene diversas moléculas
de inmunoglobulina, en la que los residuos aminoácidos
correspondientes a por lo menos una parte de por lo menos una CDR se
sustituyen por un péptido mimético que es un mimético de
trombopoyetina (TPO), presentando el péptido mimético por lo menos
una secuencia flanqueante que ha sido aleatorizada con el fin de
generar moléculas de inmunoglobulina que presentan secuencias
aminoácidas variables.
37. Biblioteca que contiene diversas moléculas
de inmunoglobulina, en la que se inserta un péptido mimético que es
un mimético de trombopoyetina (TPO) en por lo menos una CDR y en la
que el mimético de TPO presenta por lo menos una secuencia
flanqueante que ha sido aleatorizada con el fin de generar moléculas
de inmunoglobulina que presentan secuencias aminoácidas
variables.
38. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 31, en la que el péptido biológicamente activo se
encuentra flanqueado por una prolina en sus extremos
carboxi-terminal y
amino-terminal.
39. Molécula de inmunoglobulina que comprende
una región en la que los residuos aminoácidos correspondientes a por
lo menos una parte de una CDR se sustituyen por un péptido
biológicamente activo que es un mimético de trombopoyetina (TPO), o
en la que el péptido biológicamente activo que es un mimético de
trombopoyetina (TPO) se inserta en por lo menos una CDR, en la que
el péptido biológicamente activo se encuentra flanqueado en su
extremo carboxi-terminal por una secuencia
aminoácida seleccionada de entre el grupo constituido por
prolina-valina, prolina-ácido aspártico,
prolina-isoleucina,
serina-asparagina, serina-lisina,
serina-glicina, serina-arginina,
leucina-histidina, leucina-ácido glutámico,
leucina-alanina,
leucina-fenilalanina,
valina-glutamina, valina-serina,
valina-alanina, valina-asparagina,
isoleucina-serina,
isoleucina-tirosina,
asparagina-prolina,
asparagina-serina,
asparagina-triptófano,
asparagina-valina,
fenilalanina-valina,
treonina-serina, metionina-alanina,
arginina-serina, arginina-glicina,
arginina-treonina, arginina-leucina,
arginina-valina,
triptófano-arginina,
triptófano-triptófano,
alanina-arginina, ácido
aspártico-valina, glicina-tirosina,
glutamina-arginina y
glicina-lisina.
40. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 39, en la que el péptido biológicamente activo se
encuentra flanqueado por una prolina en su extremo
amino-terminal.
41. Molécula de inmunoglobulina que comprende
una región en la que los residuos aminoácidos correspondientes a por
lo menos una parte de una CDR se sustituyen por un péptido
biológicamente activo que es un mimético de trombopoyetina (TPO) o
en la que el péptido biológicamente activo que es un mimético de
trombopoyetina (TPO) se inserta en por lo menos una CDR, en la que
el péptido biológicamente activo se encuentra flanqueado en su
extremo amino-terminal por una secuencia aminoácida
seleccionada de entre el grupo constituido por
triptófano-leucina, valina-valina,
glicina-prolina, leucina-prolina,
leucina-tirosina, serina-leucina,
serina-isoleucina, serina-prolina,
treonina-metionina,
treonina-tirosina, treonina-prolina,
glutamina-treonina, glutamina-ácido glutámico,
glutamina-leucina,
arginina-metionina,
arginina-asparagina,
arginina-treonina, arginina-glicina,
arginina-serina, lisina-ácido glutámico,
lisina-glicina, alanina-histidina,
histidina-glicina, histidina-leucina
y asparagina-prolina.
42. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 41, en la que el péptido biológicamente activo se
encuentra flanqueado por una prolina en su extremo
carboxi-terminal.
43. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 5, en la que por lo menos dos CDR se seleccionan de
entre el grupo constituido por: i) CDR3 de cadena pesada y CDR2 de
cadena pesada, ii) CDR3 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera,
iii) CDR2 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, iv) CDR3 de
cadena pesada y CDR2 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, y v)
CDR3 de cadena pesada y CDR1 de cadena ligera.
44. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 5, en la que una CDR3 de cadena pesada se sustituye
por un péptido mimético que presenta la SEC ID nº 40 y una CDR2 de
cadena ligera se sustituye por un péptido mimético que presenta la
SEC ID nº 61.
45. Molécula de inmunoglobulina según la
reivindicación 1, en la que el mimético de TPO corresponde a
cualquier secuencia indicada en el grupo constituido por las
secuencias siguientes: SEC ID nº 1, nº 2, nº 25, nº 27, nº 29, nº
31, nº 33, nº 35, nº 37, nº 39, nº 41, nº 43, nº 45, nº 47 y nº
49.
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