CN106432495A - 抗肿瘤抗原抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文涉及抗肿瘤抗原抗体及其使用方法。本文公开了结合肿瘤相关抗原CD44或肿瘤相关抗原EphA2的抗体，以及相关组合物及使用方法。使用方法包括癌症疗法、诊断和筛选方法。

Description

抗肿瘤抗原抗体及其使用方法
本申请是申请日为2011年07月22日、中国申请号为201180044968.9、发明名称为“抗肿瘤抗原抗体及其使用方法”的发明申请的分案申请。
交叉引用
本申请要求于2010年7月22日提交的美国临时专利申请No.61/366,823，该申请通过引用整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的第CA058207号拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。
引言
癌症转录模式的广泛研究已导致发现区分恶性与良性癌症以及区分最具侵略性的癌症与侵略性较差的癌症的分子靶标。癌症通常过表达许多蛋白质，包括某些细胞表面抗原，例如细胞表面受体。结合此类过表达的细胞表面抗原的抗体可促进此类癌症的检测和治疗。已利用许多方法来产生可用作潜在治疗剂的癌细胞表面受体的抗体。对过表达的细胞表面受体和结合它们的抗体的鉴定提供了开发癌症治疗的路径，尤其提供了具有较差预后和对传统疗法具有抗性的那些癌症亚型。CD44和EphA2是两种此类过表达的细胞表面受体，并且由转录特征识别和蛋白质组分析为人们所知，在基底乳腺癌中过表达。
对在许多癌症上过表达的细胞表面受体特异的抗体已被用于开发靶向的免疫治疗剂。例如，HER2、CD20和EGFR在许多肿瘤上过表达并且已开发识别这些受体的抗体来治疗转移性乳腺癌(曲妥珠单抗(trastuzamab))、淋巴瘤(利妥昔单抗(rituximab))和结直肠瘤(西妥昔单抗(cetuximab))。数种治疗方法(包括抗体-药物缀合物、免疫毒素和靶向核酸递送)需要不仅结合受体而且在结合时内化到细胞中的抗体。
简述
本文公开了结合肿瘤相关抗原CD44或肿瘤相关抗原EphA2的抗体，以及相关组合物及使用方法。使用方法包括癌症疗法、诊断和筛选方法。在某些实施方案中，抗体结合哺乳动物细胞表面抗原(例如，酵母展示的哺乳动物细胞表面抗原)，在其他实施方案中，它们在与哺乳动物细胞结合后被胞吞。
在一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体F2-1A6特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1A6竞争结合CD44。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞(被细胞)。在一个实施方案中，所述抗体包含F2-1A6的VH CDR1、F2-1A6的VH CDR2和F2-1A6的VH CDR3。在另一个实施方案中，所述抗体包含F2-1A6的VLCDR1、F2-1A6的VL CDR2和F2-1A6的VL CDR3。在又一个实施方案中，所述抗体与包含F2-1A6的全长VH和F2-1A6的全长VL的抗体竞争结合CD44表位。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体F2-1H9特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1H9竞争结合CD44。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞。在一个实施方案中，所述抗体包含F2-1H9的VH CDR1、F2-1H9的VH CDR2和F2-1H9的VHCDR3。在另一个实施方案中，所述抗体包含F2-1H9的VL CDR1、F2-1H9的VL CDR2和F2-1H9的VL CDR3。在又一个实施方案中，所述抗体包含F2-1H9的全长VH和F2-1H9的全长VL。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体特异性结合的CD44表位；或与选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体竞争结合CD44。在一个实施方案中，所述抗体包含：E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VH CDR1；E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VHCDR2；和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VH CDR3。在另一个实施方案中，所述抗体包含：E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR1；E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR2；和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR3。在另一个实施方案中，所述抗体包含：E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全长VH；和E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全长VL。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体2D6特异性结合的EphA2表位或与抗体2D6竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体D2-1A7特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A7竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体D2-1A9特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A9竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
在另一方面，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体D2-1B1特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1B1竞争结合EphA2。所述抗体可以当与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其特异性结合被选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体特异性结合的EphA2表位或与选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体竞争结合EphA2。在一个实施方案中，所述抗体包含：A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VH CDR1；A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VH CDR2；和A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VH CDR3。在另一个实施方案中，所述抗体包含：A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR1；A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR2；和A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR3。
在某些实施方案中，任一种前述单克隆抗体是单链Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab’)2或(scFv’)2。任一种所述抗体可被标记和/或与抗癌剂缀合。
在一个实施方案中，提供了包含表面和内部空间的脂类纳米粒子，所述内部空间包含抗癌剂，其中前述分离的抗体中的任一种或多种与所述脂类纳米粒子的表面连接。在一个实施方案中，当脂类纳米粒子与表达细胞表面EphA2或细胞表面CD44的细胞接触时，所述抗体与细胞表面EphA2或细胞表面CD44结合并且脂类纳米粒子被胞吞。
在一个实施方案中，提供了组合物，其包含药学上可接受的载体和任何一种前述抗体或任何一种前述脂类纳米粒子。所述组合物可被配制用于胃肠外施用。可选地，所述组合物可被配制用于静脉内、鞘内或室内施用或用于增强传送的递送。在一个实施方案中，提供了包含该组合物的试剂盒。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的任何一种前述抗体或任何一种前述脂类纳米粒子，其中所述量足以延缓癌症的发展。在一个实施方案中，所述抗体被内化到癌细胞中。
在一个实施方案中，提供了检测受试者的癌细胞的方法，包括使任何一种前述抗体的抗体与疑似为癌性的所述受试者细胞接触并且检测与所述细胞结合的所述抗体。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸，包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：包含克隆F2-1A6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；包含克隆F2-1A6的抗体的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；包含克隆F2-1H9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；包含克隆F2-1H9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；或包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一个实施方案中，所述核酸包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：包含克隆F2-1A6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH和包含克隆F2-1A6的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；包含克隆F2-1H9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH和包含克隆F2-1H9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的VL；或包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH和包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸，其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：包含克隆2D6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH、包含克隆2D6的抗体的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL、包含克隆D2-1A7的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH、包含克隆D2-1A7的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL、包含克隆D2-1A9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH、包含克隆D2-1A9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL、包含克隆D2-1B1的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH、包含克隆D2-1B1的抗体的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL；包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的VL；或分离的核酸，其包含编码1)和2)；3)和4)；5)和6)；7)和8)；或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供了表达载体，其包含任一种前述核酸。在另一个实施方案中，提供了重组宿主细胞(“基因修饰的宿主细胞”)，其包含所述载体。在一个实施方案中，该细胞表达抗-EphA2抗体或抗-CD44抗体。
本申请涉及下述实施方案。
1.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体F2-1A6特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1A6竞争结合CD44。
2.根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体，当其与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞。
3.根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)F2-1A6的VH CDR1；
b)F2-1A6的VH CDR2；和
c)F2-1A6的VH CDR3。
4.根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)F2-1A6的VL CDR1；
b)F2-1A6的VL CDR2；和
c)F2-1A6的VL CDR3。
5.根据实施方案1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)F2-1A6的全长VH；和
b)F2-1A6的全长VL。
6.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体F2-1H9特异性结合的CD44表位或与抗体F2-1H9竞争结合CD44。
7.根据实施方案6所述的分离的单克隆抗体，当其与活哺乳动物细胞的表面上的CD44结合时被胞吞。
8.根据实施方案6所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)F2-1H9的VH CDR1；
b)F2-1H9的VH CDR2；和
c)F2-1H9的VH CDR3。
9.根据实施方案6所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)F2-1H9的VL CDR1；
b)F2-1H9的VL CDR2；和
c)F2-1H9的VL CDR3。
10.根据实施方案6所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)F2-1H9的全长VH；和
b)F2-1H9的全长VL。
11.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体特异性结合的CD44表位；或与选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体竞争结合CD44。
12.根据实施方案11所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VH CDR1；
b)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VH CDR2；和
c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VH CDR3。
13.根据实施方案11所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR1；
b)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR2；和
c)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR3。
14.根据实施方案11所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全长VH；和
b)E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全长VL。
15.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体2D6特异性结合的EphA2表位或与抗体2D6竞争结合EphA2。
16.根据实施方案15所述的分离的抗体，当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
17.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体D2-1A7特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A7竞争结合EphA2。
18.根据实施方案17所述的分离的抗体，当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
19.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体D2-1A9特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1A9竞争结合EphA2。
20.根据实施方案19所述的分离的抗体，当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
21.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被抗体D2-1B1特异性结合的EphA2表位或与抗体D2-1B1竞争结合EphA2。
22.根据实施方案21所述的分离的单克隆抗体，当其与活哺乳动物细胞的表面上的EphA2结合时被胞吞。
23.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体特异性结合的EphA2表位或与选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体竞争结合EphA2。
24.根据实施方案23所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VH CDR1；
b)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VH CDR2；和
c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VH CDR3。
25.根据实施方案23所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
a)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR1；
b)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR2；和
c)A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR3。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是单链Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab’)2或(scFv’)2。
27.根据实施方案1-25中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体被标记。
28.根据实施方案1-25中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体与抗癌剂缀合。
29.一种包含表面和内部空间的脂类纳米粒子，所述内部空间包含抗癌剂，其中根据实施方案1-28中任一项所述的分离的抗体与所述脂类纳米粒子的表面连接。
30.根据实施方案29所述的脂类纳米粒子，其中当所述脂类纳米粒子与表达细胞表面EphA2或细胞表面CD44的细胞接触时，所述抗体与细胞表面EphA2或细胞表面CD44结合并且所述脂类纳米粒子被胞吞。
31.一种组合物，其包含：
药学上可接受的载体；和
根据实施方案1-28中任一项所述的分离的抗体或根据实施方案29或实施方案30所述的脂类纳米粒子。
32.根据实施方案31所述的组合物，其中所述组合物被配制用于胃肠外施用。
33.根据实施方案32所述的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内、鞘内或室内施用或用于增强传送的递送。
34.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：
向所述受试者施用一定量的根据实施方案1-28中任一项所述的抗体或根据实施方案29或实施方案30所述的脂类纳米粒子，其中所述量足以延缓所述癌症的发展。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述抗体被内化到癌细胞中。
36.一种检测受试者的癌细胞的方法，其包括：
将根据实施方案1-28中任一项所述的抗体与疑似为癌性的所述受试者细胞接触；和
检测与所述细胞结合的所述抗体。
37.一种分离的核酸，其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
包含克隆F2-1A6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；
包含克隆F2-1A6的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
包含克隆F2-1H9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；
包含克隆F2-1H9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；或
包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。
38.根据实施方案37所述的分离的核酸，其中所述核酸包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
包含克隆F2-1A6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH和包含克隆F2-1A6的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
包含克隆F2-1H9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH和包含克隆F2-1H9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；或
包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH和包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。
39.一种分离的核酸，其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
1)包含克隆2D6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
2)包含克隆2D6的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL，
3)包含克隆D2-1A7的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
4)包含克隆D2-1A7的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL，
5)包含克隆D2-1A9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
6)包含克隆D2-1A9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL，
7)包含克隆D2-1B1的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
8)包含克隆D2-1B1的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
9)包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；或
10)包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL
或；
一种分离的核酸，其包含编码1)和2)；3)和4)；5)和6)；7)和8)；或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。
40.一种表达载体，其包含根据实施方案37、38或39所述的核酸。
41.一种重组宿主细胞，其包含根据实施方案40所述的载体。
42.根据实施方案40所述的重组宿主细胞，其中所述细胞表达抗-EphA2抗体或抗-CD44抗体。
43.一种试剂盒，其包含根据实施方案31所述的组合物。
附图简述
图1.抗原结构域在酵母表面上的展示。图A，受体EphA2的胞外结构域(ECD)在酵母表面上展示并且被抗-EphA2抗体和重组小鼠肝配蛋白A1(R&D，Minneapolis)识别，如通过流式细胞术分析来测定。图B，CD44的连接结构域(结构域1，或D1)在酵母表面上展示并且被抗-CD44兔单克隆抗体识别，如通过流式细胞术分析来测定。两种抗-EphA2和抗-CD44抗体不识别在酵母表面上展示的无关蛋白。
图2.噬菌体抗体从酵母展示的抗原中的回收率。图A，已知结合EphA2(2D6)的噬菌体抗体从展示EphA2ECD的酵母(Y-EphA2)中的回收率与从展示无关蛋白的酵母(Y-CON)中的回收率的比较。用酵母展示的抗原中的每一种孵育总计1011个抗-EphA2噬菌体抗体2D6。图B，洗脱缓冲液对从展示EphA2ECD的酵母的表面洗脱的EphA2噬菌体抗体的效价的影响。在洗脱之前用酵母展示的抗原蛋白质中的每一种孵育总计1011个抗-EphA2噬菌体抗体2D6。图C，输入噬菌体效价对洗脱的噬菌体效价的影响。用酵母展示的EphA2ECD或无关酵母展示的蛋白质孵育指示效价的抗-EphA2噬菌体抗体2D6并且测定洗脱的噬菌体的效价。
图3.选择内化抗原特异性噬菌体抗体的策略。图A，在基底乳腺癌细胞系MDAMB231上的内化的两轮选择后，用无关对照酵母第一次孵育噬菌体抗体库以除去任何酵母结合抗体，然后对展示EphA2ECD或CD44结构域1的酵母进行淘选。图B，通过使用流式细胞术来测量2轮淘选后多克隆噬菌体抗体库与EphA2ECD或CD44结构域1的结合信号。用未选择的噬菌体抗体文库(R0)、第1轮(R1)和第2轮(R2)多克隆噬菌体染色无关对照酵母。图C，对酵母展示的抗原的1轮和2轮选择后抗原特异性噬菌体抗体的频率。通过分析96个随机挑选的与酵母展示的抗原结合的噬菌体抗体用流式细胞术来测定结合频率。用未选择的噬菌体文库(R0)以及分别来自R1和R2的多克隆噬菌体染色所诱导的展示无关蛋白、EphA2-ECD或CD44结构域1的酵母细胞。未诱导的酵母细胞(仅酵母)、无关噬菌体抗体(噬菌体对照)和未选择的噬菌体抗体文库用作对照。
图4.来自酵母抗原生物淘选的单克隆噬菌体抗体的结合特异性。图A，通过流式细胞术测定的单克隆噬菌体抗体与酵母展示的抗原结构域的结合。用从Y-EphA2和Y-CD44D1选择分离的单克隆噬菌体抗体染色所诱导的展示无关蛋白(Y-CON)、EphA2-ECD(Y-EphA2ECD)、CD44连接结构域(Y-CD44 ECD D1)和CD44全长ECD(Y-CD44ECD)的酵母细胞。图B显示通过流式细胞术测定的单克隆噬菌体抗体与MDAMB231细胞的结合。图C显示单克隆噬菌体抗体与包括鲁米那乳腺癌细胞系SUM52PE和MCF7的乳腺癌细胞系，以及基底乳腺癌细胞系MDAMB231的差异结合。
图5.通过蛋白质印迹和流式细胞术对scFv抗体的表征。图A，使用抗-EphA2scFv2D6或D2-1A7和抗-CD44scFv F2-1A6来免疫沉淀来自MDAMB231细胞的其靶抗原。通过蛋白质印迹使用抗-EphA2抗体D7(Upstate Biotech,Billerica)或抗-CD44抗体Ab-4(NeoMarkers,Fremont)来检测抗原。图B，EphA2抗体D2-1A7、D2-1A9和2D6与肝配蛋白A1竞争结合MDAMB231细胞。通过流式细胞术来测定噬菌体抗体D2-1A7、D2-1A9和2D6在递增浓度的EphA2配体肝配蛋白A1的存在下与MDAMB231细胞结合的能力。
图6.对EphA2和CD44特异的噬菌体抗体被MDAMB231细胞胞吞。在37℃用无关噬菌体(图A)、抗-EphA2噬菌体D2-1A7(图B)和D2-1A9(图C)、抗-CD44噬菌体F2-1A6(图D和E)孵育经培养的细胞3小时，然后甘氨酸缓冲液洗涤。通过用抗-fd抗体检测胞内噬菌体、并且通过共焦显微镜分析来测定胞吞作用。
图7.对来自各种克隆的CD44特异的抗体的全长VH和VL的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。
图8.对来自各种克隆的EphA2特异的抗体的全长VH和VL的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。
图9A和9B.来自克隆2D6的全长抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。
图10A和10B.来自克隆D2-1A7的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。
图11A和11B.来自克隆D2-1A9的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。
图12A和12B.来自克隆D2-1B1的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。
图13A和13B.来自克隆F2-1A6的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。
图14A和14B.来自克隆F2-1H9的全长scFv抗体的氨基酸序列和编码核酸序列。
图15A和15B.来自克隆E8H11的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:19)和编码核酸(SEQ ID NO:20)序列。
图16A和16B.来自克隆E8H7的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:58)和编码核酸(SEQ ID NO:59)序列。
图17A和17B.来自克隆E8G12的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:60)和编码核酸(SEQ ID NO:61)序列。
图18A和18B.来自克隆E8F11的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:63)和编码核酸(SEQ ID NO:64)序列。
图19A和19B.来自克隆E8C9的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:72)和编码核酸(SEQ ID NO:73)序列。
图20A和20B.来自克隆D6G9的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:85)和编码核酸(SEQ ID NO:86)序列。
图21A和21B.来自克隆D6D3的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:127)和编码核酸(SEQ ID NO:128)序列。
图22A和22B.来自克隆A3H9的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:129)和编码核酸(SEQ ID NO:130)序列。
图23A和23B.来自克隆A3G3的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:138)和编码核酸(SEQ ID NO:139)序列。
图24A和24B.来自克隆A3D10的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:140)和编码核酸(SEQ ID NO:141)序列。
图25A和25B.来自克隆A3D1的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:310)和编码核酸(SEQ ID NO:311)序列。
图26A和26B.来自克隆A3C8的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:312)和编码核酸(SEQ ID NO:313)序列。
图27A和27B.来自克隆1A3的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:314)和编码核酸(SEQ ID NO:315)序列。
图28A和28B.来自克隆1A5的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:316)和编码核酸(SEQ ID NO:317)序列。
图29A和29B.来自克隆1A8的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:318)和编码核酸(SEQ ID NO:319)序列。
图30A和30B.来自克隆1A12的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:320)和编码核酸(SEQ ID NO:321)序列。
图31A和31B.来自克隆1B2的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:322)和编码核酸(SEQ ID NO:323)序列。
图32A和32B.来自克隆1C2的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:324)和编码核酸(SEQ ID NO:325)序列。
图33A和33B.来自克隆1C7的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:326)和编码核酸(SEQ ID NO:327)序列。
图34A和34B.来自克隆1D8的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:328)和编码核酸(SEQ ID NO:329)序列。
图35A和35B.来自克隆15H11的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:330)和编码核酸(SEQ ID NO:331)序列。
图36A和36B.来自克隆D1C5的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:332)和编码核酸(SEQ ID NO:333)序列。
图37A和37B.来自克隆D1D1的全长scFv抗体的氨基酸(SEQ ID NO:334)和编码核酸(SEQ ID NO:335)序列。
图38A和38B.来自克隆H1B8(在本文也称为“HB8”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQID NO:336)和编码核酸(SEQ ID NO:337)序列。
图39A和39B.来自克隆H1C2(在本文也称为“HC2”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQID NO:338)和编码核酸(SEQ ID NO:339)序列。
图40A和40B.来自克隆H1C4(在本文也称为“HC4”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQID NO:340)和编码核酸(SEQ ID NO:341)序列。
图41A和41B.来自克隆H1E3(在本文也称为“HE3”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQID NO:342)和编码核酸(SEQ ID NO:343)序列。
图42A和42B.来自克隆H1F1(在本文也称为“HF1”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQID NO:344)和编码核酸(SEQ ID NO:345)序列。
图43A和43B.来自克隆H1H3(在本文也称为“HH3”)的全长scFv抗体的氨基酸(SEQID NO:346)和编码核酸(SEQ ID NO:347)序列。
图44.对来自各种克隆的CD44特异的抗体的全长VH和VL的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供E8H11(SEQ ID NO:348)；E8H7(SEQ ID NO:349)；E8G12(SEQ ID NO:350)；E8F11(SEQ ID NO:351)；E8C9(SEQ ID NO:352)；D6G9(SEQID NO:353)；和D6D3(SEQ ID NO:354)的VH序列。提供E8H11(SEQ ID NO:355)；E8H7(SEQ IDNO:356)；E8G12(SEQ ID NO:357)；E8F11(SEQ ID NO:358)；E8C9(SEQ ID NO:359)；D6G9(SEQ ID NO:360)；和D6D3(SEQ ID NO:361)的VL序列。
图45A和45B.对来自各种克隆的CD44特异的抗体的全长VH和VL的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供D1C5(SEQ ID NO:362)；D1D1(SEQID NO:363)；HB8(SEQ ID NO:364)；HC2(SEQ ID NO:365)；HC4(SEQ ID NO:366)；HE3(SEQID NO:367)；HF1(SEQ ID NO:368)；和HH3(SEQ ID NO:369)的VH序列。提供D1C5(SEQ IDNO:370)；D1D1(SEQ ID NO:371)；HB8(SEQ ID NO:372)；HC2(SEQ ID NO:373)；HC4(SEQ IDNO:374)；HE3(SEQ ID NO:375)；HF1(SEQ ID NO:376)；和HH3(SEQ ID NO:377)的VL序列。
图46.对来自各种克隆的EphA2特异的抗体的全长VH和VL的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供A3H9(SEQ ID NO:378)；A3G3(SEQ IDNO:379)；A3D10(SEQ ID NO:380)；A3D1(SEQ ID NO:381)；和A3C8(SEQ ID NO:382)的VH序列。提供A3H9(SEQ ID NO:383)；A3G3(SEQ ID NO:384)；A3D10(SEQ ID NO:385)；A3D1(SEQID NO:386)；和A3C8(SEQ ID NO:387)的VL序列。
图47.对来自各种克隆的EphA2特异的抗体的全长VH和VL的氨基酸序列。也指示框架和互补决定区。SEQ ID NO是指全长可变区。提供1A3(SEQ ID NO:388)；1A5(SEQ ID NO:389)；1A8(SEQ ID NO:390)；1A12(SEQ ID NO:391)；1B2(SEQ ID NO:392)；1C2(SEQ ID NO:393)；1C7(SEQ ID NO:394)；和1D8(SEQ ID NO:395)的VH序列。提供1A3(SEQ ID NO:396)；1A5(SEQ ID NO:397)；1A8(SEQ ID NO:398)；1A12(SEQ ID NO:399)；1B2(SEQ ID NO:400)；1C2(SEQ ID NO:401)；1C7(SEQ ID NO:402)；和1D8(SEQ ID NO:403)的VL序列。
定义
下列缩写可在本文使用：CDR，互补决定区；Fab，具有可变结构域和第一恒定结构域的免疫球蛋白的抗原结合片段；FACS，荧光活化细胞分选；IgG，免疫球蛋白G；KD，解离平衡常数；kon，缔合速率常数；koff，解离速率常数；mAb，单克隆抗体；MFI，平均荧光强度；PBS，磷酸盐缓冲盐水；PCR，聚合酶链反应；scFv，单链形式的抗体可变区；VH，重链可变区；VL，轻链可变区；TAA，肿瘤相关抗原；EGFR，表皮生长因子受体；ECD，胞外结构域；IMAC，固定化金属亲和色谱；IL，免疫脂质体；IPTG，异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷；2-MEA，2-巯基乙胺；DTT，二硫苏糖醇；TEA，三乙胺；TBS-T，Tris-缓冲盐水Tween-20；Ni-NTA，镍-次氮基三乙酸；PE，藻红蛋白；HMEC，人乳腺上皮细胞，
如本文所用的，“EphA2”是指可结合肝配蛋白A配体的受体酪氨酸激酶家族的成员，并且也可被称为“上皮细胞激酶(ECK)”。术语“EphA2”可以是指任何天然存在同种型的EphA2。EphA2的氨基酸序列是已知的并且可以作为GenBank登录号NP_004422.2被发现。
如本文所用的，“CD44”是指透明质酸(HA)的受体，并且也可以被称为“吞噬细胞糖蛋白I”、“透明质酸盐受体”或“CD44抗原”。例如，术语“CD44”可以是指任何一种天然存在同种型的CD44。CD44的氨基酸序列是已知的并且最长同种型的CD44可以作为GenBank登录号NP_000601.3被发现。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可在本文交换地使用，指通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接到一起的一系列线性氨基酸残基。此外，除了20个“标准”遗传上可编码的氨基酸之外，氨基酸还包括氨基酸类似物。而且，应当指出，在氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号，表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键，或与羧基或羟基末端基团的共价键。然而，缺少破折号不应是指羧基或羟基末端基团的此类肽键或共价键不存在，因为表示氨基酸序列时省略破折号是约定俗成的。
“抗体”涵盖组合物，其包含单独或作为包含其多个的制备物的抗原-结合蛋白，具有一种或多种可以由免疫球蛋白基因、或免疫球蛋白基因的片段遗传上编码或包含获自或源自免疫球蛋白的CDR并且结合目标抗原的多肽。轻链被分为κ或λ。重链可被分为γ、μ、α、δ或ε，其分别定义免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体的实例是具有由两对多肽链(每对多肽链具有一条“轻”链和一条“重”链)组成的四聚体的结构单元的抗体。每条链的N-端部分定义介导抗原结合的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指轻链和重链。
“抗体”还涵盖含有连接在一起作为单一多肽的重链和轻链的单链抗体，尽管如此这种连接的重链或轻链中的每条在本文被称为重链或轻链。抗体还可以是指仅有重链的抗体例如重链抗体或HCAb。
如上所述，“抗体”涵盖完整的免疫球蛋白以及抗体的抗原-结合片段。因此，本文所用的术语“抗体”还包括抗体的抗原结合部分，其可通过全抗体的修饰来制备或重新使用重组DNA方法来合成。实例包括但不限于Fab’、Fab'2、scFv、纳米抗体、单抗体(unibody)和双链抗体。“纳米抗体”是指单链抗体的最小抗原-结合片段，也被称为VHH或单结构域抗体(dAb)。
“单克隆抗体”是指包含一个或多个抗体的组合物，所述抗体获自大体上均质的抗体的群体，即，除可以以少量存在的任何天然存在的突变之外其单独抗体是相同的群体。单克隆抗体针对单一抗原位点并且一般针对抗原上的单一表位是高度特异性的。修饰词“单克隆”是指获自大体上均质的抗体群体的抗体的字符，并且不要求抗体由任何特定方法产生或为组合物中的唯一抗体。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其可由包括直接连结或通过肽-编码连接体连结的VH-和VL-编码序列的核酸表达(Huston,等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)。许多结构可用于将来自抗体V区的多肽轻链和重链转化成scFv分子，scFv分子将折叠成大体上类似于抗原-结合位点的结构的三维结构。除为双链抗体外，scFvs还可以三链抗体或四链抗体存在。
应当指出，尽管各种抗体片段根据完整抗体的消化来定义，但是本领域技术人员将理解此类片段可用化学方法或通过利用重组DNA方法来重新合成。
术语“抗体”涵盖多克隆和单克隆抗体，并且进一步涵盖任何类别(例如，IgM、IgG及其子类)的抗体。“抗体”还涵盖杂交抗体、双特异性抗体、异种抗体、嵌合抗体、人源化抗体和其保留抗原结合的功能片段。“双特异性抗体”可类似单一抗体(或抗体片段)但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。异种抗体是指两个或更多个连接在一起的抗体或抗体结合片段(例如，Fab)，每个抗体或片段具有不同的特异性。抗体可与其它部分缀合，和/或可结合至支架(例如，固体支架)例如聚苯乙烯板或珠、测试条等。
免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高可变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)截断的“框架”区(FR)组成。框架区和CDR的范围可基于本领域已知的数据库被定义。参见，例如，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”E.Kabat等人，Sequencesof proteins of immunological interest,第4版U.S.Dept.Health and HumanServices,Public Health Services,Bethesda,MD(1987),Lefranc等人IMGT,theinternational ImMunoGeneTics informationNucl.Acids Res.,2005,33:D593-D597(www.imgt.org/textes/IMGTScientificChart/)和/或在vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/的V Base)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(其为组成型轻链和重链的组合框架区)用于定位并对齐CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。除非另有指示，否则由本公开提供的所有CDR和框架根据Kabat等人(同上)来定义。
“抗-EphA2抗体”或″抗-CD44抗体″是指优选以高亲和性与EphA2或CD44特异性结合的抗体。对EphA2或CD44特异的抗体未显示相对于EphA2或CD44的结合，与EphA2或CD44无关的其他抗原相当的结合。
术语“高亲和性”当针对抗体使用时是指特异性结合(“识别”)其靶的亲和性(KD)值小于或等于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、优选小于10-9M、小于10-10M或小于10-11M的抗体。较低KD值对应于较高的结合亲和性(即，较强的结合)以使10-7的KD值指示比10-6的KD值高的结合亲和性。
“抗原-结合位点”或“结合部分”是指参与免疫反应性抗原结合的抗体分子的部分(例如免疫球蛋白分子或scFv的片段)。抗原结合位点通过重(“H”)链和/或轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度发散的延伸部分被称为“高可变区”，其插入在称为“框架区”或“FR”的更保守侧翼延伸部分之间。因此，术语“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高可变区之间和与高可变区相邻的氨基酸序列。在三聚体抗体分子中，轻链的三个高可变区和重链的三个高可变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。重链和/或轻链中的每个链的三个高可变区被称为“互补决定区”或“CDR”并且例如基于Kabat等人(同上)来测定。
″F2-1A6抗体”是指由克隆F2-1A6表达的抗体或以其它方式合成但是具有与由克隆F2-1A6表达的抗体相同的CDR并且任选地具有相同的框架区，并且具有大体上相同的抗原结合特异性的抗体。类似地，抗体2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1H9等(例如，抗体E8H11、E8H7、E8G12、E8F11和E8C9；抗体D6G9和D6D3；抗体D1C5和D1D1；抗体HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3；抗体A3H9、A3G3、A3D10、A3D1和A3C8；抗体1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7和1D8；以及抗体15H11)是指由相应克隆表达的抗体和/或以其它方式合成但是具有与参考抗体相同的CDR并且任选地具有相同的框架区，并且具有大体上相同的抗原结合特异性的抗体。这些抗体的CDR通过Kabat等人(同上)来定义，如图7、8和44-47以及下表所示。
“表位”是抗体所结合的抗原上的位点(例如EphA2胞外结构域(ECD)上的位点)。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白的折叠(例如，三级折叠)而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位暴露于变性溶剂后通常仍保持，然而通过折叠形成的表位用变性溶剂的处理后通常丧失。在线性或空间构象中，表位通常包括至少3个、更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如，x-射线结晶学和2维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,GlennE.Morris编辑(1996)。数个商业实验室提供表位作图服务。通过与膜相关抗原具有免疫反应性的抗体结合的表位可位于细胞的表面(例如跨膜蛋白的胞外区中)，以使此类表位被认为是细胞表面可及的，溶剂可及的和/或细胞表面暴露的。
“分离的”是指在与实体可天然出现的环境不同的环境中的目标实体(例如蛋白，如抗体)。“分离的”实体从本质上伴随其的所有或一些组分分离并且可以是大体上富集的。“分离的”也是指从在生成(例如，化学合成、重组表达、培养基等)过程中伴随其的所有或一些组分分离的实体的状态。主题抗体可以是大体上纯的。“大体上纯的”可以是指其中至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或多于99％的总组合物是目标实体(例如，主题抗体)的组合物。
当提及抗体时，短语“特异性结合”、“对…特异”、“免疫反应性”和“免疫反应性”和“抗原结合特异性”是指与抗原的结合反应，其对抗原或其片段具有高优先性，以使在抗原的异质群体(例如，蛋白和群体生物制品，例如在组织中)存在下确定抗原的存在。因此，在特定的免疫测定条件下，指定的抗体与特定抗原结合并且不以显著量与存在于样品中的其他抗原结合。在此类条件下与抗原的特异性结合可需要因其对特定抗原的特异性而被选择的抗体。例如，抗-CD44抗体可以与CD44特异性结合，并且不展示与存在于组织样品中的其他蛋白相当的结合(例如，不展示可检测的结合)。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York，用于描述可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件。
详述
本文公开了与肿瘤相关抗原CD44特异性结合的抗体和与肿瘤相关抗原EphA2特异性结合的抗体，以及相关组合物及使用方法。使用方法包括癌症治疗、诊断和筛选方法。
当抗体对CD44特异时，抗体含有克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3(例如，通过其表达而获得)的抗体的VH的至少一个、两个或所有三个CDR。抗体还涵盖含有克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗体的VL的至少一个、两个或所有三个CDR的抗体。抗体还涵盖含有独立地选自克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗体的VL和VH中的每个的至少一个、两个或所有三个CDR的抗体。可选地，抗体与克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗体(例如，结合与其相同的表位)竞争结合CD44。
当抗体对EphA2特异时，抗体含有克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的至少一个、两个或所有三个重链(VH)互补决定区(CDR)。抗体还涵盖含有克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的至少一个、两个或所有三个轻链(VL)互补决定区(CDR)的抗体。抗体还涵盖含有独立地选自克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的VL和VH中的每个的至少一个、两个或所有三个CDR的抗体。可选地，抗体与克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体(例如，结合与其相同的表位)竞争结合EphA2。
本公开的抗体也可以含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的所有VHCDR和/或VL CDR。抗体可以含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的全长VH链。抗体也可以或可选地含有克隆F2-1A6、F2-1H9、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体的全长VL链。
抗体可以是全长抗体(即，包含至少一个全长VH序列和至少一个全长VL序列的抗体)或片段例如单链Fv(scFv)、Fab、(Fab’)2、(ScFv)2等。抗体可以是IgG(例如，IgG2)或任何其他同种型，或可以是双特异性抗体。
抗体可以例如与抗癌药物、标记、或与改善或提升血清半衰期(例如聚(乙二醇)(PEG))、胞吞、或另一种生物功能或特征的部分缀合。抗体也可以在包含药学上可接受的赋形剂的组合物中，例如，适用于注射的组合物(例如，在单位剂量制剂中)。本公开还提供包括一个或多个抗体的组合物，所述抗体选自本文所述的抗体和/或包含一个或多个来自这些抗体的CDR的抗体，和/或包含这些抗体的突变体或衍生物的一个或多个抗体。组合物可以包括一种或多种抗体，例如F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11。
本公开的方法包括提供以有效治疗患有表达由一个或多个主题抗体特异性结合的抗原的癌症的受试者的量施用一个或多个本文公开的主题抗体的方法。由本公开提供的抗体也可以用于诊断/预后癌症或使癌症成像。
本文提供的核酸编码本文描述的一个或多个抗体。本文还提供含有此类核酸的宿主细胞，以及生成主题抗体(例如通过分泌)的宿主细胞。还提供用于制备含有主题抗体的组合物或用于进行主题方法的试剂盒。
抗体
优选的抗体对肿瘤相关抗原(TAA)、EphA2或CD44中的一个或多个具有高亲和性(例如，显示10-7M或更低的KD值)，在至少一些部分的细胞周期中细胞表面暴露于癌细胞上。还设想对EphA2或CD44具有较低亲和性(例如，具有10-5M至10-6M的KD值)的抗体。癌细胞例如包括源自乳腺癌细胞(例如MDAMB231)等等的癌细胞。主题抗体包括在与抗原例如活哺乳动物细胞的表面上的抗原结合时，例如通过胞吞、例如受体介导的胞吞内化到细胞中的那些。
主题抗体包括与克隆F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的抗体竞争性结合CD44表位的那些。抗体还涵盖与克隆2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的抗体竞争性结合EphA2上的表位的抗体。特定抗体识别与另一抗体相同的表位的能力可通过一个抗体竞争性抑制第二抗体(例如，竞争性结合)与抗原的结合来测定(例如，通过竞争性结合测定例如美国专利公布No.20090291085中公开的那些来测定)。结合的竞争性抑制也可以被称为抗体的交叉反应性。
许多竞争性结合测定的任一种可用于测量两个抗体对相同抗原的竞争。例如，夹心ELISA测定可以用于该目的。交叉反应性的测定方法为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Dowbenko等人(1988)J.Virol.62:4703-4711)。
如果在第一抗体存在下第二抗体与抗原的结合减少至少30％、通常至少约40％、50％、60％或75％、常常至少约90％(使用任一种用于评估竞争性结合的测定)，则抗体被认为竞争性抑制第二抗体与抗原的结合。
这可以通过提供连接至固体支架的一个或多个分离的靶TAA、EphA2和/或CD44并且测定抗体结合靶TAA或与本文所述的抗体竞争结合靶TAA的能力(例如使用表面等离子体共振)来确定。
如上所述，主题抗体涵盖与下列抗体中的一种或多种竞争的那些：2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11。此外，抗体对EphA2或CD44可以具有结合亲和性，与约1x10-6M相当或大于约1x10-6M(即，抗体可显示低于10-6M，例如约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M的KD值或甚至更高的结合亲和性例如约10-11M或10-12M的KD值)。
在相关实施方案中，主题抗体涵盖结合与F2-1A6或F2-1H9相同的表位，或结合2D6、D2-1A7、D2-1A9或D2-1B1的表位，或结合E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的表位，或结合A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的表位的那些。表位作图可使用导致接近饱和及至少100相对单位(RU)的所结合抗体的浓度的抗体对来执行。测定一对中每个成员的所结合抗体的量，然后将两个抗体混合在一起以得到等于用于测量各个抗体的浓度的最终浓度。识别不同表位的抗体显示一起注入时所结合的RU的实质累积增加，尽管识别相同表位的抗体仅显示RU的最小增加。据信抗体可以是交叉反应性的，如果当一起“注入”时它们显示实质累积增加(例如增加至少约1.4倍、增加至少约1.6倍、或增加至少约1.8或2倍)。
抗体的表位也可通过许多其它标准技术(参见，例如，Geysen等人(1987)J.Immunol.Meth 102:259-274)来测定。该技术包括大量EphA2或CD44的重叠肽的合成。然后针对一个或多个原型抗体(例如，2D6等)筛选合成肽并且由这些抗体特异性结合的特征表位可以通过结合特异性和亲和性来鉴定。由此得以鉴定的表位可适宜地用于本文所述的竞争性测定以鉴定交叉反应抗体。
用于表位作图的肽可适宜地使用“Multipin”肽合成技术来制备(参见，例如，Geysen等人(1987)Science 235：1184-1190)。使用一个或多个EphA2和/或CD44的已知序列，重叠多肽序列可在一个或多个96-孔显微检验板的阵列中的胶针上以相继方式逐一合成。
抗-CD44
本公开的抗体包括特异性结合CD44的抗体。抗-CD44抗体涵盖与F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3竞争性结合CD44的表位(例如在结构域1中)的那些。由抗-CD44抗体结合的表位存在于来自残基位置21-169的CD44的连续氨基酸序列，如下所列出。
QIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIY(SEQID NO：1)
CD44的残基位置数基于GenBank登录号NP_000601.3或UniProt登录号P16070中列出的序列来测定。
共享与CD44类似的表位的抗原也可以是主题抗体的结合靶。当与CD44结合时，主题抗体可以被表达CD44蛋白的细胞内化。
抗-CD44抗体对其具有亲和性的表位在很多癌细胞上，特别在细胞质膜上是细胞表面暴露的并且溶剂可及的。当细胞活着时，表位对于主题抗体可以是可及的。例如，表位可以在源自乳腺癌、结肠癌、腺癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、前列腺癌、胰腺癌等的癌细胞上存在。抗-CD44抗体对其具有亲和性的癌细胞也可以来自任何转移性癌症和/或具有转移潜力。
主题抗体的附加实例涵盖具有相同结合特异性并且包含至少两个CDR的那些，每个CDR各自独立地与图7、44和45A和45B和下表中所示的抗体的VH CDR(例如F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VH CDR1)的氨基酸序列共有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。主题抗体还可包括来自图7、44和45A和45B中所示的每个抗体的任何VH CDR的所有三个CDR，以使主题抗体中的每个VH CDR选自图7、44和45A和45B或下表(例如，表1)中所示的单一抗体并且每个VH CDR独立地与图7、44或45A和45B或下表(例如，表1)中所示的抗体的VH CDR的氨基酸序列共有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主题抗体的重链可含有F2-1A6的两个VH CDR或所有三个VH CDR。可选地，重链可含有F2-1H9的两个VH CDR或所有三个VH CDR。作为进一步的实例，主题抗体的重链可含有任何一种E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的两个VH CDR或所有三个VH CDR。
同样对于轻链，主题抗体将具有相同结合特异性并且可含有至少两个CDR，每个CDR各自独立地与图7、44和45A和45B或下表中所示的每个抗体的VL CDR(例如F2-1A6的VLCDR1；例如，E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的VL CDR1)的氨基酸序列具有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。主题抗体也可以或可选地包括来自图7、44和45A和45B或下表(例如，表2)中所示的任一种抗体的所有三个VL CDR并且每个VL CDR独立地与图7、44或45A和45B或下表中所示的抗体的VLCDR的氨基酸序列共有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主题抗体的轻链可含有F2-1A6的两个VL CDR或所有三个VL CDR。可选地，轻链可含有F2-1H9的两个VL CDR或所有三个VLCDR。作为进一步的实例，主题抗体的轻链可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的两个VL CDR或所有三个VL CDR。
任选地，抗体可含有与图7、44和45A和45B或下表(例如，下表1和2)中提供的重链或轻链的任一种相应框架序列相同(即100％同一性)、类似或不同的框架序列(FR)，只要大体上维持结合特异性。在框架序列类似时，框架可以与图7、44和45A和45B或下表(例如，下表1和2)中所示的任一种抗体的相应框架序列具有至少约85％、至少约86％、至少约90％、至少约93％、至少约96％、至少约98％或最高100％同一性。
本公开的抗体因此可含有与图7、44或45A和45B或下表中所示的全长VH或VL序列具有至少80％同一性、至少85％、至少90％、至少95％、最高100％氨基酸序列同一性的全长VH和/或全长VL序列。例如，主题抗体可含有F2-1A6的全长VH和/或全长VL。可选地，主题抗体可含有F2-1H9的全长VH和/或全长VL。作为进一步的实例，主题抗体可含有E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3的全长VH和/或全长VL。与CD44结合的本公开的抗体的实例列于下表(例如，表1和2)中。
表1.特异性结合CD44的抗体的重链FR和CDR
表2.特异性结合CD44的抗体的轻链FR和CDR
抗-EphA2
本公开的抗体包括特异性结合EphA2的抗体。抗-EphA2抗体涵盖与2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11竞争性结合EphA2的表位(例如在胞外结构域上)的那些。由抗-EphA2抗体结合的表位存在于来自残基位置25至534的EphA2的连续氨基酸序列，如下所列出。
QGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGN(SEQ ID NO：26)
EphA2的残基位置号基于GenBank登录号NP_004422.2或UniProt登录号P29317中列出的序列来确定。
抗-EphA2抗体还涵盖竞争性结合EphA2的配体结合位点的那些。例如，抗体2D6、D2-1A7和D2-1A9与肝配蛋白A1(EphA2的天然配体)竞争结合EphA2。因此，主题抗体也可与肝配蛋白A1竞争结合EphA2表位。
包含与EphA2的表位类似的表位的抗原也可以是主题抗体的结合靶。当与细胞表面上的抗原(例如EphA2)结合时，某些主题抗体将被细胞内化。
抗-EphA2抗体对其具有亲和性的表位在很多癌细胞上，特别在细胞质膜上是细胞表面暴露的并且溶剂可及的。当细胞活着时，表位对于主题抗体可以是可及的。癌细胞可以包括源自上皮细胞组织的癌细胞。例如，表位可以在源自乳腺癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、肺癌、前列腺癌、结肠癌和/或卵巢癌的癌细胞上存在。抗-EphA2抗体对其具有亲和性的其他癌细胞可以是例如肝癌、食道鳞状细胞癌、表皮癌、胰腺癌、胶质母细胞癌、神经母细胞癌和/或其他神经癌。
主题抗体的另外实例涵盖具有相同结合特异性并且含有至少两个CDR的那些，每个CDR独立地与图8、46和47和下表中所示的抗体的VH CDR(例如2D6的VH CDR1；或A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VHCDR1)的氨基酸序列共有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。主题抗体还可包括来自图8、46和47中所示的任何抗体的任何VH的所有三个CDR，以使主题抗体中的每个VH CDR选自图8、46或47或下表(例如，表3)中所示的单一抗体并且每个VHCDR独立地与图8、46和47或下表中所示的抗体的相应VH CDR的氨基酸序列共有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主题抗体的重链可含有2D6的至少两个VH CDR或所有三个VH CDR。可选地，重链可含有D2-1A7的至少两个VH CDR或所有三个VH CDR。其他实例包括包含D2-1A9的至少两个VH CDR或所有三个VH CDR的重链和包含D2-1B1的至少两个VH CDR或所有三个VH CDR的重链。作为进一步的实例，主题抗体的重链可含有A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的至少两个VH CDR或所有三个VH CDR。
同样对于轻链，主题抗体可含有至少两个CDR，每个CDR独立地与图8、46或47或下表(例如2D6的VL CDR1；或A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的VL CDR1)中所示的抗体的VL CDR的氨基酸序列具有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。主题抗体也可以或可选地包括来自图8、46和47或下表(例如，表4)中所示的任一种抗体的所有三个VL CDR并且每个VL CDR独立地与图8、46或47或下表中所示的抗体的VL CDR的氨基酸序列共有至少约80％、至少约87％、至少约93％、至少约94％或最高100％氨基酸序列同一性。例如，主题抗体的轻链可含有2D6的两个VL CDR或所有三个VL CDR。可选地，轻链可含有D2-1A7的两个VL CDR或所有三个VL CDR。其他实例包括包含D2-1A9的两个VL CDR或所有三个VL CDR的轻链和包含D2-1B1的两个VL CDR或所有三个VL CDR的轻链。作为进一步的实例，主题抗体的轻链可含有A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的两个VL CDR或所有三个VL CDR。
任选地，抗体可含有与图8、46和47或下表(例如，表3和4)中提供的重链或轻链的任一种相应框架序列完全相同(即100％同一性)、类似或不同的框架序列(FR)。在框架序列类似时，框架可以与图8、46和47或下表中所示的任一种抗体的相应框架序列具有至少约85％、至少约86％、至少约90％、至少约93％、至少约96％、至少约98％或最高100％同一性。
本公开的抗体因此可含有与图8、46或47或下表中所示的全长VH或VL序列具有至少80％同一性、至少85％、至少90％、至少95％、最高100％氨基酸序列同一性的全长VH和/或全长VL序列。例如，主题抗体可含有2D6的全长VH和/或全长VL。可选地，主题抗体可含有D2-1A7的全长VH和/或全长VL。其他实例包括含有D2-1A9的全长VH和/或全长VL的抗体和含有D2-1B1的全长VH和/或全长VL的抗体。进一步实例包括含有A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11的全长VH和/或全长VL的抗体。与EphA2结合的本公开的抗体的实例列于下表。
表3.特异性结合EphA2的抗体的重链FR和CDR
表4.特异性结合EphA2的抗体的轻链FR和CDR
应理解，CDR的氨基酸序列也可使用备选系统来定义，该备选系统将对于普通技术人员是显而易见的并且由普通技术人员应用(参见，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”E.Kabat等人，U.S.Department of Health and HumanServices,(1991和Lefranc等人IMGT,the international ImMunoGeneTics informationsystem.Nucl.Acids Res.,2005,33,D593-D597))。在万维网(World Wide Web)的www(dot)imgt.cines.fr/textes/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTnumberingsTable.html提供IMGTS系统的详细论述(包括如何阐述IMGTS系统和如何将其与其他系统比较)。除非另有指出，否则本公开中CDR的所有氨基酸序列根据Kabat等人(同上)来定义。
本文公开的可变链可直接或通过连接体(例如，(Gly4Ser)3,SEQ ID NO:1)连结以形成单链抗体。下面随后论述关于连接体的细节。
抗体生成的方法
使用本文提供的信息，利用本领域技术人员熟知的标准技术制备本公开的抗-CD44和抗-EphA2抗体。
例如，图9A和9B中提供的核酸序列可用于表达主题抗体。可选地，本文提供的多肽序列(参见，例如上表和/或图7、8、9A和9B和44-47)可用于确定编码抗体的适当核酸序列并且核酸序列然后用于表达一个或多个对EphA2或CD44特异的抗体。可以根据本领域技术人员熟知的标准方法最优化核酸序列，以反映各种表达系统的特定密码子“偏好性”。
使用提供的序列信息，可以根据本领域技术人员熟知的许多标准方法来合成核酸。寡核苷酸合成优选在市售可得的固相寡核苷酸合成仪上进行(Needham-VanDevanter等人(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-6168)或使用例如由Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862所述的固相亚磷酰胺三酯方法来手动合成。
一旦合成了编码主题抗体的核酸，其就可根据标准方法来扩增和/或克隆。实现这些目的的分子克隆技术在本领域中是已知的。适用于构建重组核酸的多种克隆和体外扩增方法为本领域技术人员所已知的并且为许多教科书和实验室手册的主题。
编码本公开的抗体的天然或合成核酸的表达可通过将编码抗体的核酸可操作地连接到启动子(其为组成型或可诱导型)并且将构建体整合到表达载体中以产生重组表达载体来实现。载体可适用于原核生物、真核生物或两者生物中的复制和整合。典型克隆载体含有功能上适当取向的转录和翻译终止子、初始序列和用于调节编码抗体的核酸的表达的启动子。载体任选地含有基因表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许该表达盒在真核生物和原核生物中的复制(例如，如在穿梭载体中发现的)的序列，以及原核生物和真核生物系统两者的选择标记。
为了获得高水平的克隆核酸的表达，通常构建表达质粒，而质粒通常含有指导转录的强启动子、翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子，每个彼此以及与蛋白编码序列进行功能取向。大肠杆菌中适用于该目的的调节区的实例是，大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵基因区、噬菌体λ(PL)的左侧启动子和L-阿拉伯糖(araBAD)操纵子。在转化进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记，也是有用的。此类标记的实例包括赋予对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。使用例如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillussp.)和沙门菌属(Salmonella)可以得到用于表达抗体的表达系统，也可以使用大肠杆菌系统。
抗体基因也可以被亚克隆进表达载体中，从而允许在抗体(例如scFv)的C-末端或N-末端添加标签(例如，FLAG、六聚组氨酸等)以促进纯化。在哺乳动物细胞中转染和表达基因的方法在本领域是已知的。用核酸转导细胞可包括，例如，用细胞孵育含有核酸的脂类微粒或用在载体的宿主范围之内的细胞孵育含有核酸的病毒载体。用于本公开的细胞的培养物(包括来自组织(例如，肿瘤)或血样的细胞系和培养的细胞)在本领域是已知的。
一旦分离和克隆编码主题抗体的核酸，就可在多种本领域技术人员已知的重组工程化细胞中表达核酸。此类细胞的实例包括细菌、酵母、丝状真菌、昆虫(例如采用杆状病毒属载体的那些)以及哺乳动物细胞。
主题抗体的分离和纯化可根据本领域已知的方法来实现。例如，蛋白可以通过免疫亲和性纯化(或使用Protein L或A来纯化)从经基因修饰以组成性表达蛋白的细胞的溶解产物和/或在诱导时，或从合成反应混合物分离，洗涤以除去非-特异性结合材料并且洗脱特异性结合的抗体。分离的抗体可以通过透析和通常用于蛋白纯化的方法的其他方法来进一步纯化。在一个实施方案中，抗体可使用金属螯合物色谱方法来分离。本公开的抗体可以含有修饰以促进分离，如上论述。
主题抗体可以基本上以纯的或分离的形式(例如，不含其他多肽)制备。蛋白质可存在于相对于可存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主细胞组分)富集多肽的组合物中。可以提供纯化抗体以使抗体存在于基本上不含其他表达蛋白的组合物中，例如少于90％、通常少于60％且更通常少于50％的组合物由其他表达蛋白构成。
由原核细胞生成的抗体可需要暴露于离液剂以用于适当折叠。在从大肠杆菌纯化的过程中，例如，可任选地使表达蛋白变性，然后复性。这可以例如通过在离液剂例如盐酸胍中增溶由细菌生成的抗体来实现。然后通过缓慢透析或通过凝胶过滤使抗体复性。可选地，编码抗体的核酸可操作地连接至分泌信号序列例如pelB以使抗体以正确折叠的形式分泌进周质中。
本公开还提供了生成主题抗体的细胞，其中适合的细胞包括真核细胞例如哺乳动物细胞。细胞可以是杂交细胞或“杂交瘤”，其能够体外再生成抗体(例如单克隆抗体，如IgG)。例如，本公开提供了重组宿主细胞(在本文也称为“基因修饰的宿主细胞”)，其用一个或多个包含编码主题抗体的核苷酸序列的核酸进行基因修饰。
本文还涵盖用于创立抗体分子的抗原-结合区的重组DNA形式的技术(其绕过杂交瘤的产生)。例如将DNA克隆进细菌(例如，噬菌体)、酵母(例如酵母菌属或毕赤酵母属)昆虫或哺乳动物表达系统。适合的技术的一个实例使用具有前导序列的细菌噬菌体λ载体系统，其引起表达抗体(例如Fab或scFv)迁移至周质间隔(在细菌细胞膜和细胞壁之间)或待分泌。可快速产生结合肿瘤相关抗原的大量功能片段(例如scFv)。
修饰
本公开涵盖抗体和核酸，它们经修饰以提供所需特征，例如，促进向受试者中特定类型的组织和/或细胞的递送，增加血清半衰期，补充抗癌活性等。本公开的抗体可以提供有或没有修饰，并且包括人抗体人源化抗体和嵌合抗体。修饰主题抗体的一种方法是在N-和/或C-末端缀合(例如连接)一个或多个额外元件或缀合抗体的任何氨基酸(包括内在氨基酸)，其中此类额外元件包括例如，另一种蛋白和/或药物或载体分子。
用一个或多个额外元件修饰的主题抗体保留所需的结合特异性，同时利用一个或多个额外元件的性质赋予额外的所需特征。例如，主题抗体可与第二分子缀合，第二分子在以下方面有帮助：溶解度、贮存或其他处理性质、细胞渗透率、半衰期、免疫原性减少、控制释放和/或分布(例如通过靶向特定细胞(例如，神经元、白血球、肿瘤细胞等)或细胞位置(例如，溶酶体、核内体、线粒体等)、组织或其他身体位置(例如，血液、神经组织、特定器官等))。其他实例包括染料、荧光团或其他用于测定、追踪、成像等的可检测标记或报导分子。更具体来说，主题抗体可缀合于第二分子例如肽、多肽、染料、荧光团、核酸、碳水化合物、抗癌剂、脂质、放射性核素等(例如，在还原端或非还原端)，例如脂质部分的连接，包括N-脂肪酰基例如N-月桂酰基、N-油酰基、脂肪胺例如月桂基胺、油酰基胺等。
例如，对于可内化到细胞中的抗体，本公开的抗体或核酸可进一步被修饰以增加或减少进入细胞的递送效率。本文也可涵盖基因递送方法来递送指导蛋白(例如，主题抗体或其他蛋白)在细胞中表达的核酸。抗体的细胞摄取(例如胞吞)的效率可以通过连接于肽或蛋白而增加或减少。例如，给定抗体可以连接于更易通过胞吞机理被吞没的靶受体或大分子(例如另一抗体)的配体，其中此类抗体为“抗体缀合物”。当胞吞小泡与溶酶体融合时，缀合物有效载荷(例如，配体)也可被酸水解或酶活性释放。为了改变细胞摄取，缀合物可包括在细胞表面上保留抗体的配体，其可用作(例如，为了减少)细胞摄取的控制(例如，为了减少)，或在一些实例下减少在一种细胞类型中的摄取同时增加其在其他细胞类型中的摄取。
当抗体连接于另一抗体时，抗体可以是双特异性的。如上所述，双特异性抗体是指对可能是或可能不是相同抗原的两个不同表位特异的抗体。
缀合抗体的其他特征可以包括其中缀合物相对于未缀合抗体而减少毒性的特征。另一特征为缀合物可以比未缀合抗体更有效地靶向细胞或器官的类型(例如癌细胞或癌组织)。
另外实例包括与一个或多个分子缀合的抗体，所述分子补充、增强、增加与抗体的连接或可另外协同运作。抗体可具有连接的抗癌药物，例如，用于递送至癌症位点以进一步促进细胞死亡或清除，例如抗增殖部分(例如，VEGF拮抗物，如抗-VEGF抗体)、毒素(例如，蓖麻毒素、假单胞菌外毒素A等)、放射性核素(例如用于硼中子捕获的90Y、131I、177L、10B等)、抗癌剂(参见下表5)和/或寡核苷酸(例如siRNA)。
例如，抗体可以通过共价或非共价修饰而配制于脂类纳米粒子(例如，脂质体)中。例如，抗体可经由Fc区直接连接于脂类纳米粒子的表面。抗体也可经由连接体共价连接于移植在或插入到脂类纳米粒子的表面的聚合物的末端。此类缀合的脂类纳米粒子可在本文称为“免疫脂质体”。免疫脂质体中的主题抗体可充当能使免疫脂质体与癌细胞表面上的CD44和/或EphA2特异性结合的靶向部分。免疫脂质体可载荷有一种或多种抗癌剂，例如小分子、肽和/或核酸(例如siRNA)或下表5中所列出的那些。制备和载荷脂类纳米粒子例如脂质体和免疫脂质体的方法在本领域是已知的，例如US 20100068255、US 20100008978、US20090171077、US 20090155272、US 20070116753、US 20070110798、US 20070031484、US20060147513、US 20050112065、US 20040037874、US 20040209366、US 20030003143、US 7,135,177、US 7,022,336、US 6,803,053、US 6,528,087、US 6,214,388、US 6,210,707、US6,110,491、US 5,980,935、US 5,380,531、US 7,507,407、US 7,479,276和US 7,462,603。
下表列出可用于修饰主题抗体(例如通过将药物与抗体共价或非共价地连接)的抗癌剂的一些实例。如下文论述，下面列出的任何药物也可与主题抗体配制于组合物或在主题方法中以组合疗法施用。
表5：抗癌剂
本公开的抗体可任选地被修饰以提供改善的药动学特征(例如，通过聚乙二醇化、高糖基化等)。可增强血清半衰期的修饰是所关注的。主题抗体可以被“聚乙二醇化”，如含有一个或多个聚(乙二醇)(PEG)部分。适用于蛋白质的聚乙二醇化的方法和试剂在本领域中是熟知的并且可以在美国专利No.5,849,860中发现。适用于缀合于蛋白的PEG通常在室温下可溶于水，并且具有与通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基例如烷基或烷醇基团，并且其中n是1至1000的整数。其中R是保护基，其通常具有1至8个碳。
与主题蛋白缀合的PEG可以是直链的。与主题蛋白缀合的PEG也可以是支链的。支链PEG衍生物例如在美国专利No.5,643,575中描述的那些(“星形-PEG”)和多臂PEG例如在Shearwater Polymers,Inc.目录“Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998”中描述的那些。星形PEG在本领域(包括例如，在美国专利No.6,046,305)中描述。
当主题抗体从来源中待分离时，主题蛋白可与促进纯化的部分，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)、凝集素等缀合。主题蛋白也可以结合于(例如，固定于其上)固体支架，包括但不限于聚苯乙烯板或珠、磁珠、测试条、膜等。
当在测定中待检测抗体时，主题蛋白也可以含有可检测标记，例如放射性同位素(例如，125I；35S等)、产生可检测产物的酶(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光蛋白、发色蛋白、染料(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白等)；通过金属螯合基团例如EDTA连接于蛋白的荧光发射金属，例如152Eu或其他镧系元素；化学发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、吖啶盐等；生物发光化合物，例如荧光素；荧光蛋白质等。间接标记包括对主题蛋白特异的抗体，其中抗体可通过第二抗体；和特异性结合对的成员，例如生物素-抗生物素蛋白等来检测。
用于修饰主题抗体的任何上述元件可经由连接体(例如挠性连接体)连接于抗体。如果存在，则连接体分子通常具有足以允许抗体和连接载体在抗体与载体之间的一些挠性运动的长度。连接体分子通常为约6-50个原子长度。连接体分子也可以是例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚体、二胺、二酸、氨基酸或其组合。
当连接体为肽时，连接体可以具有任一种适合的不同长度，例如1个氨基酸(例如，Gly)至20或更多个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
挠性连接体包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:2)和GGGSn(SEQ ID NO:3)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它挠性连接体。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物，其中相对未构建的氨基酸是所关注的，并且可以用作组分之间的天然系链。挠性连接体的实例包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:4)、GGSGG(SEQ ID NO:5)、GSGSG(SEQ IDNO:6)、GSGGG(SEQ ID NO:7)、GGGSG(SEQ ID NO:8)、GSSSG(SEQ ID NO:9)等。普通技术人员会识别，对与上文所述的任何元件缀合的肽的设计可以包括全部或部分挠性的连接体，以使连接体可以包括挠性连接体以及一个或多个提供较低挠性的结构的部分。
人工程化抗体
当结合CD44或EphA2的本公开的抗体不是人的时，抗体可以被人源化。如本文所用的，人源化抗体是源自非人(例如，啮齿类动物)抗体并且已经被修饰以含有人抗体的框架和/或恒定区的至少一部分的重组多肽。
人源化抗体还涵盖其中各个区域可源自不同种类的嵌合抗体和CDR-移植抗体。嵌合抗体可以是包括来自与人恒定区连接的任何来源的可变区的抗体。因此，在嵌合抗体中，可变区可以是非人的，并且恒定区是人的。CDR-移植抗体是包括来自与人“受体”抗体的框架区连接的非人“供体”抗体的CDR的抗体。例如，scFV形式的本公开的抗体可以连接于人恒定区(例如Fc区)而变成人免疫球蛋白。
Fc区
结合CD44或EphA2的本公开的抗体可以含有Fc区。Fc区可以是在人或其他动物中发现的天然存在的同种型(例如源自任何类或子类的免疫球蛋白)中的任一种并且可以任选地被进一步修饰具有改变的功能。例如，Fc区可以在一个或多个氨基酸残基位置被修饰以具有增加的效应子功能，例如引发细胞介导的细胞毒性或激活补体活性(例如C1q结合或补体依赖性细胞毒性)、下调细胞表面受体等。可用作本公开的抗体的Fc变体的细节可以发现于例如，US7,416,727、US7,371,826、US7,335,742、US7,355,008、US7,521,542和US7,632,497中。
组合物
主题组合物提供抗体和/或编码其的核酸，其中抗体结合癌细胞并且被癌细胞内化。本公开的组合物可用于治疗患有癌症的受试者(例如，人)，并且可适用于在该疾病任何阶段的治疗。含有一个、两个或更多个不同抗体的组合物可以药物组合物形式提供并且向需要其的哺乳动物(例如，向人)施用。
本文涵盖的组合物可以含有一个、两个、三个或更多个不同的本公开抗体(和/或编码其的核酸)。例如，组合物可含有下列中的一个或多个：F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11。组合物可任选地进一步包括含有一个或多个来自这些抗体的CDR的抗体，和/或一个或多个含有这些抗体的突变体或衍生物的抗体。
本公开的组合物的实例可以包括任一种上述的组合或者图7、8或9A和9B或图44-47中公开的一个或多个抗体。当组合物包含两个或更多个抗体时，每个抗体可以对相同或不同表位或不同抗原上的表位具有特异性。例如，组合物可以含有至少一个对CD44或EphA2的表位特异的抗体和另一个对另一个细胞表面抗原例如EGFR特异的抗体。组合物也可以含有双重特异性、多特异性抗体或编码其的核酸。
本公开的抗体可单独使用和/或彼此组合(例如以形成双特异性或多特异性抗体)、和/或与其他已知的抗癌剂(例如用于癌症治疗的抗体)组合使用。例如，组合物如脂质体可以包含两个或更多个抗体，其中至少一个抗体为本公开的抗体。如上述，脂质体可以含有一个或多个与主题抗体不同的抗体。此类脂质体可以是双重特异性、多特异性等，以使脂质体对除主题抗体的表位之外的另外表位(例如EGFR或HER2中的表位)特异。
组合可以在单一制剂中提供或可以单独制剂形式在试剂盒中提供，其中单独制剂可以含有单一抗体或两个抗体。试剂盒的此类单独制剂可在施用之前组合或通过单独注射来施用。
主题药物组合物可以在药学上可接受的赋形剂中提供，其可以是溶液例如水溶液，例如盐水溶液，或可以以粉末形式提供。主题组合物可以包含其他组分，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。组合物可以含有按需要接近生理条件的药学上可接受的辅助物质例如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
主题抗体(例如呈药学上可接受的盐的形式)可以配制成用于随后下文所述的方法的口服、局部或胃肠外施用形式。在某些实施方案中，例如当抗体以可注射(例如，适用于静脉内注射)液体形式施用时，抗体制剂可以是包含盐(例如，以调节张度)缓冲剂、防腐剂、氨基酸和其他药学上可接受的载体和赋形剂的无菌、非热源水溶液，并且可以作为即用型剂型或作为由药学上可接受的载体和赋形剂组成的可重建的贮藏稳定的粉末或液体提供。增强传送的递送的制剂可以在例如US 20090208422中描述。
本公开的组合物可以包括治疗有效量的主题抗体，以及(如需要)任何其他相容组分。所谓“治疗有效量”是指以单一剂量、作为一系列相同或不同的抗体或组合物的部分向个体施用的量有效减少癌细胞在受试者中的增殖和/或转移或者有效提供任何其他可检测的治疗益处。此类治疗有效量的抗体及其对细胞生长的影响包括与一种或多种其他疗法(例如，免疫疗法、化疗、放射疗法等)结合的协作和/或协同性抑制细胞生长。如下所示，可结合给药方案和对受试者疾患的诊断分析(例如，使用对CD44和/或EphA2特异的抗体来监测细胞表面表位是否存在)等来调节治疗有效量。
量和剂量
精确剂量将可由本领域技术人员来确定。剂量可取决于多种因素，包括所用特定化合物的强度、受试者的疾患和受试者的体重，以及疾病的严重程度和疾病的阶段。剂量的大小也将通过可能伴随特定化合物的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。如本领域所知，基于年龄、体重、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾患严重程度的调节可以是必要的并且将可由本领域技术人员在常规实验下确定。治疗有效量也可以是其中抗体或抗体片段的在治疗上有益的效应胜过任何毒性或有害的效应的量。
在本公开的上下文中向受试者例如人施用的组合物的量应该足以在合理的时帧内引起动物的预防性或治疗性响应，并且随施用目的、待治疗个体的健康和身体状况、年龄、所需的解决程度、抗体组合物的制剂、治疗临床医生对医疗局势的评估以及其他相关因素而变化。因此希望该量在相对宽的范围之内，但是可以通过受试者的各种特征(例如上述的)来常规确定。
作为一个实例，治疗或预防有效量的主题抗体的非限制性范围为约0.1mg/kg至约20mg/kg，例如约1mg/kg至约10mg/kg。
抗体在药物制剂中的浓度可按重量计低于约0.1％、通常为或至少约2％至高达20％至50％或以上变化，并且将根据所选的特定施用模式和患者的需要，主要通过考虑流体体积、粘度等来选择。所得的组合物可以呈溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、霜剂、洗剂、软膏剂、气溶胶等的形式。
此外，适合的剂量和剂量方案可通过比较已知影响所需生长抑制性或免疫抑制性响应的抗癌剂或免疫抑制剂来确定。此类剂量包括导致细胞生长的低剂量抑制而无显著副作用的剂量。在适当剂量中和在适合施用某些化合物的情况下，本公开的化合物可提供宽范围的胞内效应，例如从部分抑制细胞生长到基本上完全抑制细胞生长。剂量治疗可以是单一剂量时间表或多个剂量时间表(例如，包括斜升和维持剂量)。如下所示，主题组合物可以与其它药物结合施用，并且因此剂量和方案在本上下文中也可变化以适应受试者的需要。
组合疗法
多种癌症疗法中的任一种疗法可与主题抗体在组合物中组合。例如，化疗治疗或生物响应修饰剂治疗中所用的药物可存在于包含抗体的药物组合物例如免疫脂质体中。可用于与主题抗体组合的某些药物在上面表5中提供和/或在下文简短论述。
化疗剂是减少癌细胞增殖的非蛋白化合物，并且涵盖细胞毒性剂和细胞抑制剂。化疗剂的非限制性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物(例如，长春花)生物碱、核酸例如抑制核酸(例如siRNA)和甾类激素。
例如，抗代谢药包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂。
适合的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)可用作抗癌剂。例如，紫杉烷如紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物例如多西他赛、或紫杉烷前药例如为2'-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙酰基)-紫杉醇、7-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙酰基)-紫杉醇、2'-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙酰基)-多西他赛或7-(2-(N,N'-二乙基氨基)丙酰基)-多西他赛是适合的。
其他抗增殖细胞毒性剂是诺维本(navelbene)、CPT-11(伊立替康)、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和droloxafine。具有抗增殖活性的微管影响剂也适于应用。激素调节剂和甾类(包括合成类似物)适于应用。
诊断方法
本公开提供在受试者的生物样品或从受试者分离的样品中检测肿瘤相关抗原(例如CD44或EphA2)的方法。该方法可用于诊断和预后目的。主题方法一般包括将含有细胞的样品与本公开的抗体接触；和检测抗体与样品中的细胞的结合。该细胞可以在体外，其中细胞在从疑似具有癌细胞的受试者、正经受癌症治疗的受试者或正测试对治疗的敏感性的受试者中获得的生物样品中。细胞可以在体内，例如细胞在疑似具有癌细胞的受试者、正经受癌症治疗的受试者或正测试对治疗的敏感性的受试者中。
可通过免疫诊断技术、使用抗体在具有或疑似具有癌细胞的受试者的生物样品中检测表达CD44和/或EphA2的细胞。此类诊断可用于鉴定适于下文随后描述的疗法的患者，和/或用于监测对疗法的响应。
适当的免疫诊断技术包括但不一定限于，体外和体内(成像)方法。例如，抗-CD44或抗-EphA2抗体可以被可检测标记，向疑似具有特征在于CD44或EphA2的细胞表面表达的癌症的受试者施用，并且结合使用本领域可得的成像方法检测的可检测标记的抗体。
本文所用的短语“体内成像”是指检测抗体(例如可检测标记的2D6)在整个活哺乳动物中的存在的方法。任选可检测的蛋白例如荧光抗体和荧光素酶-缀合的抗体可通过体内成像来检测。用于使用荧光素酶对荧光素酶表达在活哺乳动物中的实时成像的方法可容易适于在本文公开的主题方法中使用(例如，Greer LF等人，Luminescence 2002,17:43-74)。荧光蛋白在活哺乳动物中的体内成像描述于例如Hoffman,Cell Death andDifferentiation 2002,9:786-789中。体内成像可用于提供哺乳动物的2-D以及3-D图像。放射性标记的抗体例如可向受试者施用并且该受试者用γ照相机成像。电荷偶联器件照相机、CMOS或3D断层摄影术可用于进行体内成像。例如，Burdette JE Journal ofMol.Endocrin.,40:253-261,2008综述了利用计算机断层摄影术、磁共振成像、超声波检查、正电子发射断层摄影术、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)等。来自很多体内成像方法的信息如上述的那些可提供关于受试者的癌细胞的信息。
当该方法在体外时，生物样品可以是其中可存在癌细胞的任何样品，包括但不限于血样(包括全血、血清等)、组织、全细胞(例如，完整细胞)、和组织或细胞提取物。例如，测定可包括检测活细胞或组织学组织样品中的细胞上的CD44和/或EphA2。特别地，可以在活细胞的胞外表面上评估检测。例如，组织样品可被固定(例如，通过福尔马林处理)并且可埋入在支架(例如，石蜡)中或冷冻在未固定组织中而提供。
测定可采用多种形式，例如竞争、直接反应或夹心型测定。测定的实例包括蛋白质印迹；凝集试验；酶标记的和介导的免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)；生物素/抗生物素蛋白型测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀等。反应一般包括与抗体缀合的可检测标记。标记包括为荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记和/或染料分子标记，或用于检测样品中的抗原与抗体或随其反应的抗体之间的复合物的形成的其他方法。
当使用固体支架时，固体支架通常在适合结合条件下首先与固相组分反应以使抗体充分地固定于支架。有时，固定于支架可通过首先将抗体与具有较好结合性质的蛋白偶联而得到增强，或者提供抗体在支架上的固定而没有抗体结合活性或特异性的显著损失。适合的偶联蛋白包括但不限于，大分子例如血清白蛋白(包括牛血清白蛋白(BSA))、匙孔戚血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和本领域技术人员已知的其他蛋白。可用于将抗体结合至支架的其他分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物等，附加条件是用于固定抗体的分子未不利地影响抗体特异性结合抗原的能力。此类分子和将这些分子与抗体偶联的方法为本领域普通技术人员所熟知的。
可以使用ELISA方法，其中微量滴定板的孔涂敷有主题抗体。然后将含有或疑似含有CD44和/或EphA2的生物样品加至涂敷的孔。在足以允许抗体结合的孵育期后，可以洗涤板以除去未结合部分并且加入可检测标记的第二结合分子。允许第二结合分子与任何捕获的抗原反应，洗涤板并且使用本领域熟知的方法来检测第二结合分子的存在与否。
如有需要，来自生物样品的结合的CD44和/或EphA2的存在与否可容易地使用包含直接针对抗体配体的抗体的第二结合剂来检测。例如，许多抗-牛免疫球蛋白(Ig)分子在本领域中是已知的，其可使用本领域技术人员已知的方法容易地与可检测的酶标记例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或脲酶缀合。然后将适当的酶底物用于产生可检测信号。在其他相关实施方案中，竞争型ELISA技术可以使用本领技术人员已知的方法来实践。
测定也可以在溶液中进行，以使在沉淀条件下抗体和抗原形成复合物。抗体涂敷的颗粒可在适合的结合条件下与疑似含有靶抗原的生物样品接触以提供颗粒-抗体-抗原复合聚集物的形成，该聚集物可以利用洗涤和/或离心从样品中沉淀并分离。可以使用多种标准方法中的任一种例如上述的那些免疫诊断方法来分析反应混合物以确定抗体-抗原复合物的存在与否。
可选地，活细胞中的细胞摄取的测定可以是积极鉴定癌细胞的另一种诊断技术。因为主题抗体被表达CD44和/或EphA2的细胞特异性内化，所以可允许细胞内化抗体并且洗涤掉未被内化的任何抗体(例如酸洗)。内化抗体可以经由其包含在细胞内的标记来检测(例如FACS、光谱仪、放射性同位素计数仪等)。如US7,045,283中所述，也可以选择内化抗体。
利用基于抗体的疗法，本文所述的诊断测定可用于确定或多或少适于疗法的受试者是否患有癌症，以及监测受试者中治疗的进展。其也可以用于评估其他组合疗法的进程。因此，诊断测定可由临床医生告知对疗法和治疗方案的选择。
上述测定试剂(包括本公开的抗体)可与适合的说明书和其他必要试剂在试剂盒中提供，以便进行如上所述的免疫测定。取决于所用的特定免疫测定，试剂盒也可含有适合的标记和其他包装的试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。标准免疫测定例如上述的那些可以使用这些试剂盒来进行。
治疗方法
主题抗体发现在多种癌症中具有治疗用途。涵盖患有、疑似患有或处于罹患癌症风险的受试者用于本文所述的疗法和诊断。
所谓“治疗”是指至少实现与折磨宿主的疾患相关的症状的改善，其中改善在宽泛意义上用于是指至少参数(例如与待治疗的疾患相关的症状)的量值减少。因此，治疗也包括其中病理状态、或至少与其相关的症状被完全抑制，例如防止其发生，或被完全停止，例如终止，以使宿主不再遭受疾患，或至少表征该疾患的症状。因此治疗包括：(i)防止，也就是说，降低临床症状发展的危险，包括导致临床症状不发展，例如防止疾病进展至有害状态；(ii)抑制，也就是说，阻止临床症状的发展或进一步发展，例如减轻或完全抑制活动性疾病，例如以便减少肿瘤载荷，其减少可以包括消除可检测的癌细胞(例如转移性癌细胞)；和/或(iii)解除，也就是说，导致临床症状的消退。
多种受试者可根据本方法来治疗。通常，此类受试者为″哺乳类″或″哺乳动物″，其中这些术语在广泛地用于描述在哺乳类动物内的生物，包括食肉目动物(例如，狗和猫)、啮齿目动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目动物(例如，人、黑猩猩和猴)。在很多实施方案中，受试者将为人。
在相关实施方案中，待治疗的受试者具有表达(例如过表达)肿瘤相关抗原、CD44和/或EphA2的细胞。抗原在癌细胞表面上表达并且经常以比相应的非癌细胞高的水平存在。这个方面可以在本公开的方法的上下文中是有益的，因为表达或呈现CD44和/或EphA2的细胞可适于利用本公开的抗体治疗。抗体可以向受试者施用，例如，其中在抗原的存在是不可检测的点引发疗法，并且因此不意在是限制性的。在疾病症状的第一预兆之前、在可能疾病的第一预兆时或者在诊断疾病之前或之后引发抗体疗法也是可能的。
也在本文所述的方法中涵盖本公开的抗体组合物的前药。此类前药一般是化合物的功能衍生物，其容易在体内转化成所需化合物。因此，在本公开的方法中，术语“施用”涵盖施用明确公开的化合物或施用可能未明确公开、但在向需要其的受试者施用后体内转化成指定化合物的化合物。用于选择和制备适合的前药衍生物的常规方法描述于例如Wermuth,“Designing Prodrugs and Bioprecursors”中，Wermuth编辑The Practice ofMedicinal Chemistry，第2版，第561-586页(Academic Press 2003)。
癌症
抗体组合物可以有利地用于抗癌疗法，特别是在癌细胞呈递胞外可及的细胞表面上的EphA2和/或CD44时。一个实例为呈递由F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1、HH3、2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11结合的表位的癌症。
本文所述的抗体组合物可以向受试者(例如人患者)施用以减少癌细胞的增殖，例如以减少肿瘤大小、减少癌症载荷、减少转移和/或改善患者中的临床结果。例如，抗体组合物可用于中断癌细胞的细胞周期，并且促进细胞进入细胞凋亡。与本文涵盖的癌症有关的方法包括，例如应用单独或与抗癌疫苗或疗法组合的抗体疗法。
特别适于抗体疗法的癌症可以通过与上述的诊断方法类似的方法和本领域已知的其他方法来鉴定。
癌症的类型
当抗癌疗法包括施用前述的抗体组合物时，抗癌疗法可以特别地定向表达细胞表面可及的和/或溶剂暴露的由主题抗体结合的表位的癌细胞，包括转移性癌症。
可通过主题方法治疗的呈递CD44的表位的癌症的实例包括乳腺癌(例如基底细胞乳腺癌)、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌等以及腺癌和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。适于治疗的其他癌症也可以是为转移性和/或具有转移潜力的任何癌症。
呈递EphA2的表位的癌症的实例包括但不限于上皮来源的癌细胞。例如，癌细胞可源自乳腺癌(例如基底细胞乳腺癌)、皮肤癌(例如黑素瘤)、肺癌、前列腺癌、结肠癌和/或卵巢癌。例如，抗-EphA2抗体对其具有亲和性的其他癌细胞可以是肝癌、食道鳞状细胞癌、表皮癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和/或其他神经癌。
应当指出，尽管EphA2或CD44可以在癌细胞上以比非癌细胞高的水平表达，但是并不是对本文公开的疗法的限制。
可通过本文公开的方法适于疗法的癌包括但不限于食道癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌形式)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌(包括移行细胞癌(膀胱的恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌、肺癌(包括肺的小细胞癌和非小细胞癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、原位导管癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、胚胎性癌肉瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、成骨性癌、上皮癌和鼻咽癌。
可通过本文公开的方法适于疗法的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。
可通过本文公开的方法适于疗法的实体瘤包括但不限于胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可通过本文公开的方法适于疗法的白血病包括但不限于a)慢性骨髓增殖性综合征(多潜能造血干细胞的肿瘤病症)；b)急性髓细胞性白血病(多潜能造血干细胞或有限谱系潜能造血细胞的肿瘤转化)；c)慢性淋巴细胞性白血病(CLL；免疫不成熟和功能不胜任的小淋巴细胞的克隆增殖)，包括B-细胞CLL、T-细胞CLL幼淋巴细胞白血病和多毛细胞白血病；和d)急性淋巴细胞性白血病(特征在于淋巴母细胞的蓄积)。可通过本文公开的方法治疗的淋巴瘤包括但不限于B-细胞淋巴瘤(例如，伯基特淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等。
可根据本文公开的方法适于治疗的其他癌症包括非典型脑膜瘤(脑)、胰岛细胞癌(胰脏)、髓样癌(甲状腺)、间叶瘤(肠)、肝细胞瘤(肝)、肝母细胞瘤(肝)、透明细胞癌(肾)和纵隔神经纤维瘤。
可使用本文公开的方法适于治疗的癌的其他实例包括但不限于上皮和神经外胚层来源的癌。上皮来源的实例包括但不限于小细胞肺癌、乳腺癌、晶状体癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌和支气管上皮癌。本公开的方法可用于治疗已知过表达CD44和/或EphA2的癌细胞。
神经外胚层来源的癌症的实例包括但不限于尤文肉瘤、脊髓肿瘤、脑肿瘤、婴儿幕上原初神经外胚层肿瘤、肾管状囊性癌、肾黏液样管状和梭形细胞癌、肾肿瘤、纵隔肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤，以及青少年和年轻成人的肉瘤。
与其他癌症疗法的组合
如上所述，该方法的另一特征是抗体可以与一种或多种其他疗法组合向受试者施用。此类疗法可以在组合物中组合或与主题抗体缀合。除与本文公开的抗体物理组合(例如，作为缀合物或以脂质体或其他脂类纳米粒子)之外，一种或多种抗癌剂例如上面表5中列出的那些可在施用本文公开的抗体同时或者之前或之后联合施用。
除施用抗体组合物之外的疗法或治疗可在同时至施用主题抗体之前或之后多达5小时或以上，例如10小时、15小时、20小时或以上的任何一点施用。相继施用或应用主题抗体和其他治疗干预，例如其中主题抗体在另一治疗性治疗之前或之后施用。主题抗体和其他疗法同时施用，例如其中主题抗体与第二疗法在同一时间施用，例如当第二疗法为药物时其可与主题抗体一起作为两个单独制剂施用或组合到向受试者施用的单一组合物中。不管是否相继或同时施用，如上所阐述，出于本公开的目的，治疗被认为一起或组合施用。
可以或不可以与主题抗体联合施用的另外的标准抗癌治疗包括但不限于免疫疗法、化疗剂和手术(例如，如下文进一步所述的那些)。此外，主题抗体的治疗性施用也可以是利用抗癌疗法的受试者的后治疗性治疗，其中抗癌疗法是，例如手术、放射疗法、施用化疗剂等。也可以使用靶细胞的除本文公开的那些抗体之外的抗体，特别是可以提供补体介导的杀死，和/或抗体依赖性细胞细胞毒性介导的杀死的单克隆抗体。
例如，主题抗体可与一种或多种化疗剂(例如，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(CHOP))组合、和/或与放射治疗组合和/或与手术干预(例如，手术前或手术后以除去肿瘤)、放射疗法、骨髓移植、生物响应修饰剂治疗和前述的某一组合组合施用。放射疗法包括但不限于源自外部施加的来源例如波束或通过植入小放射源的X-射线或γ射线。
施用途径
在实践方法中，施用途径(将主题抗体带入受试者中的路径)可变化，其中在下文更详细地描述主题抗体的代表性施用途径。单独或以上述组合的主题抗体可以全身(例如，通过胃肠外、静脉内、肌内、鞘内、室内或皮下施用)或局部(例如，在局部肿瘤位点，例如通过肿瘤内施用(例如，施用到实体瘤中，施用到淋巴瘤或白血病中的有关淋巴结中，或通过增强传送的递送，例如施用到脑中，例如，如US 20090209937中公开的)，施用到补给实体瘤的血管中等)施用到体腔或内腔，或施用到器官中。这些不同的施用途径可通过注射或输注来进行。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与预期受者血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以在单位剂量或多剂量密封容器如安瓿和小瓶中提供，并且可以贮存于冻干(冷冻干燥的)条件下，仅需要在使用前即刻添加用于注射的无菌液体赋形剂，例如水。临时注射溶液和悬液可由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。用于制备胃肠外可施用的组合物的方法对于本领域技术人员是已知或明显的，并且在出版物如Remington's Pharmaceutical Science,第15版，Mack PublishingCompany,Easton,Pennsylvania(1980)中更详细地描述。
适用于口服施用的制剂可包括：(a)液体溶液，例如有效量的溶于稀释剂例如水、盐水或橙汁中的化合物；(b)胶囊、小袋(sachet)或片剂，各自含有预定量的活性成分，作为固体或颗粒；(c)于适当液体中的悬液；和(d)适合的乳液。片剂形式可以包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药学上相容的赋形剂。锭剂形式可包含于调味剂(通常蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中的活性成分，以及包含在惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分的软锭剂(pastille)、乳液、凝胶等，除活性成分之外还含有本领域已知的赋形剂。
本公开的制剂可制成通过吸入施用的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可被置于可接受的加压推进剂例如二氟二氯甲烷、丙烷、氮等中。它们也可以被配制成用于非加压制备例如在喷雾器或雾化器中使用的药物。
适用于局部施用的制剂可呈现为透皮组合物或透皮递送装置(“贴片”)、霜剂、凝胶、糊剂或泡沫剂，其除活性成分之外还含有如本领域已知的适当的载体。
栓剂制剂也可以通过与多种基质例如乳化基质或水溶性基质混合而提供。适用于阴道施用的制剂可呈现为阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫剂。
口服或直肠施用的单位剂型例如糖浆剂、酏剂和悬液可被提供，其中每个剂量单位例如一茶匙、一大汤匙、片剂或栓剂包含预定量的含有抗体组合物的组合物。同样地，用于注射或静脉内施用的单位剂量可包含组合物(如在无菌水、生理盐水或另一药学上可接受的载体中的溶液)中的抗体。
疗法的施用可在所需周期内重复，例如在约1天至约5天的周期内重复或在约1个月、约2个月内每数天例如约五天一次。其也可以在其他治疗干预例如手术干预之前、同时或之后施用以除去癌细胞。抗体也可以作为组合疗法的一部分施用，其中向受试者施用免疫疗法、癌症化学疗法或放射疗法中的至少一种(如上文更详细描述)。
筛选方法
本公开还提供筛选对在细胞表面上表达的抗原(例如肿瘤相关抗原)特异以及在结合细胞表面抗原时内化到哺乳动物细胞中的抗体的方法。一些此类方法是熟知的，参见，例如US 6,794,128和US 7,045,283。在一个实施方案中，公开了用于筛选结合特定抗原并且在抗原结合时内化到细胞中的抗体的抗体文库(例如，噬菌体展示文库)的方法。例如，抗体可因其与目标TAA(例如CD44和/或EphA2)和/或癌细胞的结合而进行选择。本方法包括通过若干迭代轮的文库筛选的初始内化抗体选择，包含在至少一个哺乳动物细胞系上的内化的选择。接下来,针对一个或多个抗原(例如，酵母展示的抗原，例如已知与哺乳动物细胞类型相关的抗原)选择表达内化抗体的噬菌体的集合以分离展示针对所需抗原的抗体的噬菌体。本方法可以根据下面实施例中描述的噬菌体展示、酵母展示和内化选择方法来执行。
简言之，用对照细胞任选地耗竭非免疫人scFv噬菌体文库，所述对照细胞不表达(例如，不明显表达)针对其选择的抗原以除去可与癌细胞非特异性相互作用的抗体。任选耗竭的文库用目标活癌细胞孵育。癌细胞可源自已知来源或未知来源。癌细胞也可以专有地源自一个细胞系或一个肿瘤或源自多个不同的细胞系或多个不同肿瘤。该方法选择通过允许细胞胞吞抗体并且将细胞从表面结合抗体剥离、然后从细胞回收噬菌体而内化到细胞中的抗体。在淘选和选择期间，内化噬菌体从细胞溶解产物回收并且扩增。多个连续选择轮次(例如两个或更多个)确保选择展示充当对目标癌症特异的内化抗体的多肽的噬菌体。
任选地在用酵母文库孵育之前，可以用对照酵母(例如不表达目标抗原和/或表达无关蛋白的酵母)耗竭所选噬菌体。然后用展示一个或多个目标TAA(例如EphA2的胞外结构域)的酵母孵育先前选择癌细胞内化的噬菌体。用于进一步选择的用噬菌体孵育的酵母可表达多个TAA，每个TAA为相同全长蛋白的不同肽片段和/或每个源自不同的TAA。当酵母展示多个TAA时，可以平行选择对不同TAA特异的抗体。TAA还可以涵盖已知的肿瘤相关抗原和/或其癌症关联仍待确定(例如疑似与癌症相关)的抗原。孵育后，洗脱与展示目标TAA的酵母结合的噬菌体。可以针对酵母文库进行多个连续轮次(例如两个或更多个)。
经过每个连续轮次(例如两个或更多个)，针对酵母文库的选择的严格性可增加。可以采用本领域熟知的很多技术以增加回收噬菌体的特异性。实例包括增加的洗涤时间、增加的清洁剂浓度、增加的盐浓度、和包含已知大分子抑制剂(例如BPTI、Ecotin和/或先前鉴定的抗体抑制剂)。抗体的表征可以包括ELISA和抑制测定。关于在用于选择和分离可以充当抗-TAA剂的多肽的方法中进行的测定的详细信息在本领域中是已知的。
与噬菌体展示抗原的应用相比，用于抗原展示的单一真核生物例如酵母的应用可产生更高比例的以其适当构象展示的抗原。
试剂盒和系统
还提供了用于实施上文所述的方法的试剂盒和系统。例如，试剂盒和系统可以包括一种或多种本文所述的组合物，例如抗-CD44和/或抗-EphA2抗体(例如2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8或15H11；或F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1或HH3)、编码它们的核酸(尤其编码任何上述主题抗体的重链和/或轻链的CDR的核酸)、或含有它们的细胞。试剂盒的其它任选组分包括：用于施用主题抗体和/或用于进行诊断测定的缓冲剂等。试剂盒的重组核酸也可具有限制位点、多个克隆位点、引物位点等以促进其与核酸恒定区的连接。试剂盒的各种组分可以在单独容器中提供或某些相容组分按需要可预先组合到单一容器中。
用于实施本方法的试剂盒和系统可以包括一种或多种包括本文所述的抗体组合物的药物制剂。因此，试剂盒可以包括以一个或多个单位剂量呈示的单一药物组合物。试剂盒也可包括两个或更多个单独的药物组合物。
除上述组分之外，试剂盒还可进一步包括用于实施方法的说明书。这些说明书可以多种形式在试剂盒中呈现，所述形式的一种或多种可以呈现在试剂盒中或上。这些说明书可能存在的一种形式是作为印刷的信息在适合的介质或基底上，例如信息印刷在其上的一页或多页纸，在试剂盒的包装中或上，在包装插入页中等。又一种手段将是计算机可读介质，例如磁盘、CD等，在其上已经记录信息。可存在的又一种手段是网站地址，其可以通过因特网用于在远离的位点访问信息。任何便利的手段可存在于试剂盒中。
可以提供试剂盒来用于治疗患有细胞增殖性疾病的宿主。试剂盒包括包含对EphA2或CD44特异的抗体的药物组合物，以及在通过抑制受试者中癌细胞的生长治疗患有癌症疾患的宿主的方法中有效利用药物组合物的说明书。此类说明书可以不仅包括适当的处理性质、给药方案和施用方法等，而且可进一步包括任选地筛选受试者的CD44-和/或EphA2-相关疾病的说明书。这方面可帮助试剂盒的从业者计量受试者对用本公开的抗体的治疗的潜在响应性，包括与癌症的类型和生长阶段有关的治疗的时间安排和持续时间。因此，在另一个实施方案中，试剂盒还可进一步包括用于检测癌细胞的胞外可及表面上的EphA2或CD44的表位的抗体或其他试剂。在另一个实施方案中，试剂盒包括包含与可检测标记例如荧光团缀合的抗体。
本文所用的术语″系统″是指存在于单一或完全不同的组合物中并一起用于实施本方法的目的的本文所述的抗体和一种或多种第二治疗剂的集合。例如，单独获得的对TAA特异的抗体以及放在一起并向受试者共施用的化疗剂型是根据本公开的系统。
实施例
提供下列实施例以举例说明，但不限于由本公开提供的任何实施方案。
在本实施例中使用下列方法和材料。
方法和材料
细胞系、介质、抗体和全长cDNA克隆。乳腺癌细胞系MCF7、T47D、MDAMB453、MDAMB231、人乳腺上皮细胞(HMEC)和SUM52PE获自ATCC和Clontech(HMEC)，或获自Dr.SteveEthier实验室中开发的集合(SUM52PE)。使用先前描述的条件培养细胞系(Neve RM等人(2006)Cancer Cell 10:515-27)。酵母菌株EBY100在YPD培养基中生长(CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,第13.1.2章)。在SD-CAA培养基上选择用表达载体pYD2转染的EBY100(Razai A等人(2005)J Mol Biol 351:158-69)(Current Protocols,第13章)。通过如前所述于20℃在SG-CAA培养基(与SD-CAA培养基相同，除了用半乳糖替换葡萄糖之外)中诱导24～48小时，在酵母表面上表达Aga2p抗原融合物(Feldhaus MJ等人(2003)Nat Biotechnol 21:163-70)。菌株大肠杆菌DH5α和TG1分别用于制备质粒DNA和表达可溶性scFv抗体。SV5抗体使用Protein G从杂交瘤上清液纯化并且利用由生产厂商(Invitrogen；Carlsbad,CA)提供的试剂盒用Alexa-488或Alexa-647直接标记。生物素缀合的兔抗-fd噬菌体购自Sigma并且用于检测噬菌体抗体。针对EphA2ECD的单克隆抗体D7购自Upstate Biotech，具有人Fc融合蛋白的多克隆山羊抗-EphA2和重组小鼠肝配蛋白A1购自R&D Systems，蛋白质印迹的抗-CD44抗体购自NeoMarkers，并且识别连接结构域的单克隆抗-CD44购自Abcam。EphA2和CD44的全长cDNA获自ATCC。
用于下面实施例的噬菌体文库包含非免疫人单链Fv抗体(scFv)。简言之，通过首先由人脾细胞和外周血淋巴细胞的RNA构建cDNA文库而产生文库。将重链和轻链谱系连结以形成scFV基因谱系。将来自天然噬菌粒抗体文库的单链Fv(scFv)基因谱系亚克隆到真实噬菌体载体中以产生多价展示的scFv噬菌体文库。对于详细信息，参见Sheets MD等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:6157-62和O'Connell D等人(2002)J Mol Biol 321:49-56。
在酵母表面上展示的抗原和抗原结构域。通过PCR使用Pfu聚合酶，将与抗原cDNA退火并且具有含有pYD2/NcoI-NotI-消化载体的25-mer重叠序列的引物设计用来扩增抗原结构域。在凝胶纯化后，通过缺口修复使用扩增的抗原片段和NcoI-NotI消化的pYD2载体来转化LiAc处理的EBY100细胞(Gietz RD等人(1991)Yeast 7:253-63；Orr-Weaver TL等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80:4417-21)。将转化混合物在SD-CAA中培养并传代培养，并且通过于18℃在SG-CAA培养基中培养24-48小时来诱导。为了验证抗原展示，通过流式细胞术分析抗-EphA2(R&D)和重组小鼠肝配蛋白A1(R&D)与酵母展示的EphA2ECD的结合，并且分析抗-CD44抗体(Abcam)与CD44结构域1的结合。简言之，在4℃用单克隆或多克隆抗体(1μg/ml)孵育被诱导的具有展示的特有抗原结构域的酵母细胞(106个细胞)1小时，分别使用抗-EphA2的抗-山羊PE缀合物、rEphrinA1-人Fc融合蛋白的抗-人(Fc特异性)和抗-CD44的抗-兔PE来检测，并且用SV5-Alexa-647共染色。
优化洗脱缓冲液以用于噬菌体抗体选择。评价包括磷酸盐缓冲盐水，pH7.4(PBS)、40mM 2-巯基乙胺(2-MEA)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、100mM三乙胺(TEA)和100mM甘氨酸/150mMNaCl/0.1％BSA/0.5％Tween 20的不同洗脱缓冲液从酵母表面洗脱结合的噬菌体的能力。在37℃时PBS、2-MEA和DTT的洗脱时间为1小时并且在RT时TEA和甘氨酸的洗脱时间为2分钟。对于2-MEA和DTT洗脱用10mM半胱氨酸中和，而对于TEA和甘氨酸洗脱用1/2体积的1MTris-HCl(pH 7.4)中和后，将洗脱的混合物用于感染指数生长型大肠杆菌TG1细胞，并且噬菌体的效价通过系列稀释及涂铺于四环素抗性培养基上来测定。
选择对酵母展示的抗原结构域特异的噬菌体抗体。通过在4℃用108个细胞孵育1012个噬菌体颗粒(Sheets MD等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:6157-62；Huie MA等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:2682-7)4小时，将人乳腺上皮细胞(HMEC)、鲁米那乳腺癌细胞系SUM52PE、T47D和MDAMB453用于耗竭非特异性结合剂的噬菌体文库。然后在4℃用5x106个基底乳腺癌细胞系MDAMB231细胞孵育耗竭的噬菌体文库1小时，接着用冷PBS洗涤并在37℃用37℃-预温热的培养基/10％FBS孵育30分钟以实现噬菌体颗粒的受体介导的胞吞作用。细胞表面通过用4ml甘氨酸缓冲液(150mMNaCl,0.1M甘氨酸,pH 2.5)进行三次5分钟的孵育而被剥离。然后使细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤，在4℃用1ml 100mM TEA溶解4分钟并且用0.5ml 1M Tris(pH 7.4)中和。扩增经内化的噬菌体(TEA溶解产物)用于进一步选择。
两轮对MDAMB231细胞的选择后，将多克隆噬菌体抗体用于选择对酵母展示的抗原EphA2(Y-EphA2)和CD44连接结构域(Y-CD44D1)特异的噬菌体抗体。通过在4℃用109个酵母细胞孵育2.5×1011个噬菌体颗粒2小时，将经诱导的展示无关蛋白的酵母细胞用于耗竭非特异性结合剂。然后在4℃将含有耗竭的噬菌体文库的经过滤的上清液用2×107个展示特异性抗原结构域的酵母细胞孵育1小时。酵母细胞用冷PBS洗涤10次并且通过离心沉淀。结合的噬菌体抗体通过用1ml 100mM甘氨酸/150mM NaCl/0.1％BSA/0.5％Tween 20孵育酵母细胞来洗脱，用0.5ml 1M Tris-HCl(pH 7.4)中和，并且扩增用于另一轮选择。在第二轮选择中，将2×107个酵母细胞用于两种抗原，同时将来自第一轮选择的2.1×1012个噬菌体颗粒用于CD44结构域1，比较之下将3.4×1011个噬菌体颗粒用于EphA2。进行两轮选择。
噬菌体抗体的表征。两轮选择后，单个噬菌体抗体通过使单一集落在所述的96-孔微量滴定板中生长来制备(O'Connell D等人(2002)J Mol Biol 321:49-56)。通过在圆锥96-孔微量滴定板中于4℃用稀释于FACS缓冲液(含有1mM MgCl2、0.1mM CaCl2和0.3％BSA的PBS)中的100μl噬菌体上清液孵育105个酵母细胞2小时，然后用生物素化抗-fd抗体和链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(PE)(Jackson)孵育，并且使用FACS LSRII(Becton Dickinson)分析，测定每种噬菌体抗体与酵母展示的抗原的结合。独特的噬菌体抗体的数量通过经PCR从噬菌体感染的细菌扩增的18个scFv基因的BstNI消化的模式来测定(Marks,JD等人(1991)JMol Biol 222:581-97)并且通过DNA测序证实。
对于与乳腺癌细胞结合和肝配蛋白A1竞争实验，于4℃在0至1000ng/ml的浓度的重组小鼠肝配蛋白A1(R&D)存在下用108个噬菌体抗体孵育5×104个MDAMB231细胞2小时。通过在4℃用生物素缀合的抗-fd抗体(1μg/ml)(Sigma)和链霉亲和素-PE(Jackson)孵育30分钟，然后通过流式细胞术分析来检测结合的噬菌体抗体。
使用scFv抗体的免疫沉淀和蛋白质印迹。每个T75培养瓶使用含有0.5％NP40、50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、2mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的1ml裂解缓冲液，制备MDAMB231细胞提取物。通过将scFv基因从噬菌体载体亚克隆到表达载体pUC119mycHis(Schier R等人(1995)Immunotechnology 1:73-81)中，然后通过IMAC51使用Ni-NTA柱(Qiagen)和凝胶过滤从大肠杆菌TG1的周质部分纯化(Schier R等人(1996)J MolBiol 255:28-43)，产生在C-端具有(His)6标签的可溶性scFv抗体。在4℃用26μg/ml的scFv孵育细胞提取物2小时，然后在Ni-NTA琼脂糖上捕获免疫复合物。然后将琼脂糖捕获的免疫复合物在裂解缓冲液中洗涤5次并且在非还原蛋白载荷缓冲液中加热至94℃持续4分钟。免疫沉淀通过SDS-PAGE来离析并且通过蛋白质印迹使用抗-EphA2(Upstate)和抗-CD44(NeoMarkers)抗体来分析。
免疫荧光。将MDAMB231细胞生长在盖玻片上以在12孔板中达到70％汇合并且在37℃用1011个噬菌体抗体孵育3小时。盖玻片用PBS洗涤1次，用甘氨酸缓冲液(50mM甘氨酸(pH2.5)、150mM NaCl)进行三次5分钟的洗涤，用PEM(80mM Potassium PIPES(pH 6.8)、5mMEGTA(pH 7)、2mM MgCl2)中和，并用含有4％(W/V)多聚甲醛的PEM固定在冰上达30分钟。细胞用0.1M NH4Cl淬灭，用0.5％Triton X-100渗透，并且在4℃用TBS-T缓冲液中的5％脱脂奶粉封闭过夜。用抗生物素蛋白-生物素试剂盒(Lab Vision)封闭内源性生物素后，用生物素化抗-fd多克隆抗体(Sigma)和链霉亲和素Texas Red(Amersham)检测胞内噬菌体。将盖玻片反转在具有封固剂的载玻片上并且用Zeiss LSM 510激光扫描显微镜(Zeiss,Germany)拍摄显微图像。
实施例1：肿瘤相关抗原在酵母表面上的展示
两种TAA(CD44和EphA2)在基底乳腺癌中过表达(Hamilton SR等人(2007)J BiolChem 282:16667-80)并且被选择在酿酒酵母(Sachromyces cerevisiae)的表面上展示。对于酵母表面展示，将EphA2(aa 1-510)的全长胞外结构域(ECD)和CD44(aa 1-149)的连接结构域(结构域1)克隆到酵母展示载体pYD2中用于(C-端)与Aga2融合(Razai A等人(2005)JMol Biol 351:158-69)。将载体DNA用于转化EBY100，并且诱导细胞表面展示。将CD44和EphA2的两个胞外结构域在酵母表面上充分展示，如通过C-端表位标签的单克隆抗体来量化(图1)。与酵母展示的EphA2天然配体肝配蛋白A1的EphA2和CD44胞外结构域、以及EphA2和CD44的抗体的特异性结合表明结构域不仅可展示并且以可结合配体的形式展示，并且可被抗体特异性识别(图1)。
实施例2：抗原特异性噬菌体抗体从酵母细胞表面展示的抗原中的有效回收率
将特异性结合EphA2的scFv噬菌体抗体用于研究针对酵母展示的抗原选择噬菌体抗体的能力。用108个展示靶抗原EphA2ECD的酵母细胞(Y-EphA2)孵育展示抗-EphA2人scFv2D6的约1011个噬菌体颗粒。作为对照，用108个展示无关scFv的酵母细胞(Y-CON)孵育相同数量的抗-EphA2噬菌体抗体。抗-EphA2噬菌体抗体从展示EphA2ECD的酵母中的回收率比抗-EphA2噬菌体抗体从展示scFv的酵母中的回收率高超过104倍(图2，图A)。为了确定从酵母表面洗脱噬菌体抗体的最佳缓冲液，评价不同缓冲液(PBS、2-MEA、DTT、三乙胺(TEA)和甘氨酸)。尽管TAA的酵母表面展示因酵母表面上的Aga2与Aga1蛋白之间的二硫键引起，还原剂(包括2-MEA和DTT)通过在PBS中孵育而导致存活噬菌体抗体的回收率低于噬菌体的自发解离率(图2，图B)。相比之下，用高pH TEA缓冲液或低pH甘氨酸缓冲液的洗脱使回收的存活噬菌体的数量增加约2倍，低pH甘氨酸为那些所研究的最佳洗脱缓冲液。将这种洗脱缓冲液用于随后研究。
为了确定在可被富集且选择的文库内的特异性抗体的最低频率，噬菌体展示的抗-EphA2抗体从109至100cfu进行系列稀释，然后与109个辅助噬菌体VCSM13混合。用107个展示EphA2ECD的酵母细胞或用展示CD44结构域1的酵母孵育噬菌体混合物，然后洗涤，洗脱，并滴定回收的噬菌体。在输入102个特异噬菌体颗粒的情况下，从展示EphA2的酵母细胞中回收约12个噬菌体，同时针对CD44选择时，在噬菌体存在于输入中之前需要输入至少105个噬菌体(图2，图C)。对于特异性抗原-抗体对，噬菌体抗体的平均回收率为6.5x10-2，而对于错配对，平均回收率为6.5x10-5(表6)。与非特异性噬菌体相比，特异性噬菌体的这种高回收率表明针对酵母展示的抗原富集和选择噬菌体抗体是可能的。
表6.特异性噬菌体抗体从酵母展示的抗原中的回收率
用109个噬菌体孵育所示的酵母展示的抗原并且测定结合的噬菌体的效价。结果被表示为输出/输入噬菌体的比率。Y＝酵母展示的抗原；PhAb＝噬菌体展示的抗体。
实施例3：在展示肿瘤抗原的酵母细胞上选择抗原特异性噬菌体抗体
用于选择特异性肿瘤抗原的内化噬菌体抗体的策略示于图3中。为了确保噬菌体抗体结合的肿瘤抗原在人肿瘤细胞的表面上呈递并且可以在抗原结合时被内化，使用起始噬菌体文库。非免疫人scFv噬菌体文库的第二轮选择后的多克隆噬菌体输出(O'Connell D等人(2002)J Mol Biol 321:49-56)被选择胞吞进入MDAMB231肿瘤细胞中。基于这样的事实，即基底亚型乳腺癌细胞过表达EphA2(Neve RM等人(2006)Cancer Cell 10:515-27)和CD44(Hamilton SR等人(2007)J Biol Chem 282:16667-80)，针对基底亚型乳腺癌细胞系MDAMB231的选择的噬菌体输出独立地针对酵母展示的EphA2ECD(aa 25-534)和CD44结构域1(aa 21-169)被选择。为了除去与在酵母表面上的无关蛋白结合的噬菌体抗体，首先用1x109个展示scFv 4E17的酵母细胞(Y-CON)孵育来自MDAMB231选择的第二轮输出的2.5x1011个噬菌体。然后，用2x107个展示相关抗原(Y-Ag)的酵母细胞孵育耗竭的噬菌体文库(图3，图A)，
对于EphA2ECD和CD44结构域1选择两者，第二轮选择中从每个酵母细胞回收的噬菌体的数量与第一轮相比增加超过40倍(表7)，表明结合酵母展示的肿瘤抗原的噬菌体的富集。这通过使用多克隆噬菌体染色酵母展示的抗原来验证。根据第一轮和第二轮的选择，多克隆噬菌体抗体显示与被用于选择的抗原结构域的特异性结合，其中在第二轮选择后染色具有较强染色(图3，图B)。相比之下，在选择之前，输入噬菌体抗体文库在展示EphA2或CD44的酵母细胞上没有产生高于背景的信号。结合对酵母展示的抗原特异，因为多克隆噬菌体不结合展示无关蛋白(scFv 4E17)的酵母细胞(图3，图B)。为了确定结合噬菌体抗体的频率，挑选96个单独克隆，生成噬菌体，分析噬菌体与酵母展示的肿瘤抗原的结合。第一轮和第二轮的选择后，来自EphA2选择的31/96(32.2％)和39/96(40.6％)的克隆结合展示EphA2ECD的酵母细胞，而来自CD44选择11/96(11.7％)和21/96(21.9％)的克隆结合酵母展示的CD44(图3，图C)。
表7.针对酵母展示的抗原的噬菌体展示scFv抗体选择。
针对酵母展示的抗原的第一轮和第二轮选择期间的噬菌体输入和输出比率
实施例4：噬菌体抗体的鉴定和表征
通过scFv基因的PCR指纹法和DNA测序分析来自第二轮选择的结合酵母展示的肿瘤抗原的单独噬菌体抗体。结果示于图9A和9B中，其中示出每个分离克隆的核酸和氨基酸序列。有义链示为图9A和9B中核酸序列的上游链。根据每个抗体的Kabat数据鉴定CDR和框架区，如示于图7和8中。
鉴定了与EphA2结合的三个独特的人scFv抗体(D2-1A7、D2-1A9和D2-1B1)，并且鉴定了与CD44ECD结构域1结合的两个独特的scFv(F2-1A6和F2-1H9)。这些scFv中的每一个在酵母展示的EphA2-ECD(Y-EphA2 ECD)、CD44 ECD结构域1(Y-CD44 ECD D1)和全长ECD(Y-CD44 ECD)，以及scFv 4E17(Y-CON)中的表征显示每个scFv对其靶抗原特异(图4，图A)。还通过流式细胞术分析每个独特的噬菌体抗体结合原始选择肿瘤细胞系MDAMB231的能力。每个噬菌体抗体高度染色MDAMB231细胞(图4，图B)。由于用于靶向对基底亚型乳腺癌细胞特异的细胞表面受体的噬菌体抗体文库的初始选择，测定了所选mAb与基底和鲁米那乳腺癌细胞系的结合。与鲁米那乳腺癌细胞系相比，每个mAb对基底乳腺癌细胞系相对特异(图4，图C)。
实施例5：噬菌体抗体的结合特异性
通过从MDAMB231细胞的细胞提取物中免疫沉淀受体，随后用对EphA2和CD44特异的鼠单克隆抗体进行蛋白质印迹，也证实了经鉴定的EphA2和CD44抗体与天然抗原的结合(图5，图A)。进一步研究了EphA2mAb的特异性。评价每个EphA2mAb与天然配体肝配蛋白A1在MDAMB231细胞表面上竞争结合EphA2的能力。尽管在给定浓度下噬菌体抗体D2-1A7和D2-1A9的肝配蛋白A1的IC50相差9倍，但是1μg/ml肝配蛋白A1可完全阻断D2-1A7和D2-1A9噬菌体抗体两者的细胞结合(图5，图B)，表明这两个抗体结合与肝配蛋白A1重叠的表位。
实施例6：噬菌体抗体被MDAMB231细胞内化
由于最初针对被胞吞到MDAMB231细胞中的能力选择由酵母展示抗原生物淘选鉴定的噬菌体抗体(图3，图A)，所以预期它们将被有效地内化。为了确定D2-1A7、D2-1A9和F2-1A6噬菌体抗体是否被胞吞，在37℃用MDAMB231细胞孵育噬菌体抗体以允许受体介导的胞吞，通过用低pH缓冲液剥离而除去表面结合的噬菌体，并且内化的噬菌体用抗-fd抗体染色，然后使用共焦显微镜来观察(图6)。D2-1A7和D2-1A9抗-EphA2抗体两者给予高度胞内染色，对照噬菌体未得以染色，而F2-1A6抗-CD44抗体给予与抗-EphA2噬菌体不同的染色模式。
实施例7：对CD44或EPHA2特异的F D 噬菌体和噬菌粒抗体
为了选择抗原特异性抗体而不使用哺乳动物细胞，用酵母展示的肿瘤相关抗原(TAA)孵育非免疫人scFv噬菌体文库(Sheets,1998；Huie,2001)，而没有对癌细胞进行先验选择。具体来说，在4℃用1010个展示无关蛋白的酵母细胞孵育1012个fd-噬菌体颗粒(Huie等人(2001)同上)或1013个噬菌粒-噬菌体颗粒(Sheets等人(1998)同上)2小时以除去结合常见酵母蛋白的噬菌体抗体。然后在4℃用108个展示特异性抗原结构域的酵母细胞孵育耗竭的噬菌体文库2小时(例如EphA2或CD44)。用冷PBS洗涤酵母细胞10次，并且通过离心沉淀。结合的噬菌体抗体通过用1ml 100mM甘氨酸/150mM NaCl/0.1％BSA/0.5％Tween 20孵育酵母细胞来洗脱，用0.5ml 1M Tris-HCl(pH 7.4)中和，并且扩增用于另一轮选择。在第二轮选择中，将2×107个酵母细胞用于两种抗原，同时将来自第一轮选择的噬菌体颗粒用作输入噬菌体文库，对于fd文库为1011个噬菌体，对于噬菌粒文库为1012个噬菌体。进行两轮选择以富集对用于选择的TAA特异的噬菌体抗体。如果两轮选择未富集TAA特异性抗体，则进行第三轮选择，紧跟与第二轮选择相同的方案。
用于筛选和表征单克隆噬菌体抗体的方法与实施例4和5中所述的方法相同。
将5个fd噬菌体抗体(称为E8H11、E8H7、E8G12、E8F11和E8C9)培养至CD44连接结构域并且对CD44连接结构域特异。将2个fd噬菌体抗体(称为D6G9和D6D3)培养至CD44(标准形式)，并且对CD44特异。
将2个噬菌粒抗体(称为D1C5和D1D1)培养至CD44连接结构域，并且对CD44连接结构域特异。将6个噬菌粒抗体(称为HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3)培养至CD44，并且对CD44特异。
将5个fd噬菌体抗体(称为A3H9、A3G3、A3D10、A3D1和A3C)培养至EphA2并且对EphA2特异。将8个噬菌粒抗体(称为1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7和1D8)培养至EphA2并且对EphA2特异。
将另一fd噬菌体抗体(称为15H11)培养至EphA2并且对EphA2特异。
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅为了举例说明的目的，并且本领域技术人员将想到根据本发明的各种修正或变化，这些均包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的据此通过引用整体并入。尽管已参考其优选实施方案特别示出和描述主题抗体、方法和组合物，但是本领域技术人员应理解，在不背离由所附权利要求涵盖的本发明范围下可在其中进行各种形式和细节的变化。

Claims (10)

1.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被选自F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体特异性结合的CD44表位；或与选自F2-1A6、F2-1H9、E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体竞争结合CD44。
2.一种分离的单克隆抗体，其特异性结合被选自2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体特异性结合的EphA2表位或与选自2D6、D2-1A7、D2-1A9、D2-1B1、A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体竞争结合EphA2。
3.一种包含表面和内部空间的脂类纳米粒子，所述内部空间包含抗癌剂，其中根据权利要求1或2所述的分离的抗体与所述脂类纳米粒子的表面连接。
4.一种组合物，其包含：
药学上可接受的载体；和
根据权利要求1或2所述的分离的抗体或根据权利要求3所述的脂类纳米粒子。
5.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：
向所述受试者施用一定量的根据权利要求1或2所述的抗体或根据权利要求3所述的脂类纳米粒子，其中所述量足以延缓所述癌症的发展。
6.一种检测受试者的癌细胞的方法，其包括：
将根据权利要求1或2所述的抗体与疑似为癌性的所述受试者细胞接触；和
检测与所述细胞结合的所述抗体。
7.一种分离的核酸，其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
包含克隆F2-1A6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；
包含克隆F2-1A6的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
包含克隆F2-1H9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；
包含克隆F2-1H9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；或
包含选自E8H11、E8H7、E8G12、E8F11、E8C9、D6G9、D6D3、D1C5、D1D1、HB8、HC2、HC4、HE3、HF1和HH3的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。
8.一种分离的核酸，其包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
1)包含克隆2D6的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
2)包含克隆2D6的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL，
3)包含克隆D2-1A7的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
4)包含克隆D2-1A7的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL，
5)包含克隆D2-1A9的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
6)包含克隆D2-1A9的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL，
7)包含克隆D2-1B1的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，
8)包含克隆D2-1B1的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；
9)包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH；或
10)包含选自A3H9、A3G3、A3D10、A3D1、A3C8、1A3、1A5、1A8、1A12、1B2、1C2、1C7、1D8和15H11的抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL
或；
一种分离的核酸，其包含编码1)和2)；3)和4)；5)和6)；7)和8)；或9)和10)的氨基酸序列的核苷酸序列。
9.一种表达载体，其包含根据权利要求7或8所述的核酸。
10.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求9所述的载体。
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