CN1980958A - 抗突触泡蛋白的特异结合成员 - Google Patents

Abstract

本发明提供了结合突触泡蛋白的特异结合成员，其包括：抗体VH区，其选自C1－3 VH区(SEQ ID NO.2)和包含具有SEQ ID NO.12氨基酸序列的VH CDR3和任选的一个或多个VH CDR′s的VH区，所述的VH CDR′s具有选自SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11氨基酸序列；和/或抗体VL区，其选自C1－3 VL区(SEQ ID NO.4)和包含一个或多个VL CDR′s的VL区，所述的VL CDR′s具有选自SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的氨基酸序列。本发明还提供了相关材料，例如核酸、试剂盒和组合物，也提供了使用结合成员的方法，例如将实体靶向与肝纤维化有关的肝星形细胞。

Description

抗突触泡蛋白的特异结合成员

技术领域

本发明涉及定向结合突触泡蛋白(synaptophysin)的特异结合成员。本发明优选的实施方案采用本文中称为C1-3的scFv片段的抗体VH和/或VL结构域。又一个优选的实施方案利用C1-3重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或多个互补决定区(CDRs)，尤其是在其它抗体骨架区中的VH C1-3。本发明人已经鉴定了许多具有有利性质(尤其是靶向肝星形细胞外表面的能力)的抗体分子。

肝纤维化(liver fibrosis)是一个可逆的过程，其特征在于发展成肝硬化(cirrhosis)和肝功能衰竭(liver failure)之前肝脏中细胞外基质蛋白的积累(Friedman S.L.J Biol Chem 2000；275：2247-50；Bataller R.等，Semin Liver Dis2001；21：437-51)。许多条件能引起肝损坏而导致纤维化，包括病毒感染(如丙型肝炎(Hepatitis C))和酒精滥用(alcohol misuse)。多年来仍然不能检测纤维化，并且其可造成有时是致命的严重损害。尽管全世界可能可能超过2亿人忍受着肝纤维化，但临床医生没有有效的可选治疗方法来治疗这种病症。

对慢性肝损伤应答的肝星形细胞(HSC)引起了肝纤维化。HSC在肝纤维化的发展和分解(resolution)中起到了重要的决定性作用。HSC以静止状态存在于正常的肝脏中，其功能在于贮存维生素A(Geerts A.Semin Liver Dis 2001；21：311-35)。在对于慢性肝损伤的应答中，静态型HSC“活化”为肌成纤维细胞样(myofibroblast-like)表型。活化的HSCs增殖，据信其表达了构成了肝纤维化中所观测到的瘢痕(scarring)的多数的细胞外基质蛋白质。有力的证据显示活化的HSC和纤维发生是对任何原因的慢性肝损伤的有害应答，而活化的HSC凋亡的增加可分解纤维化并增强肝脏对慢性损伤的应答(Iredale J.P.等，J Clin Invest 1998；102：538-49；Wright M.C.等.Gastroenterology 2001；121：685-98；Orr J.G.等，Hepatology 2004；40：232-42；Issa R.等，Gut 2001；48：548-57)。

过去许多可能的抗纤维化的主要问题是药物不能在肝星形细胞内达到治疗性浓度，可能是因为起代谢外来化合物作用的肝细胞的邻近。这些药物包括许多具有体内和体外抗炎活性并可抑制星形细胞活化作用的试剂。这些试剂包括皮质类固醇(corticosteroid)、对TNFα的拮抗剂、抗氧化剂、细胞因子(γ-干扰素)和肝细胞生长因子(HGF)、PPARγ配体(噻唑烷二酮(thiazolidinedione))、内皮素-1拮抗剂、溴氯哌喹酮(halofuginone)(抗球虫药)和基因治疗(在动物模型中通过基因治疗施用金属蛋白酶mRNA)。所述药物的不成功说明在肝脏中将任何抗纤维化疗法靶向肝星形细胞是有用的。

最近Polestra和同事已经证明：在纤维化期间，甘露糖6-磷酸/胰岛素样生长因子II(M6P/IGF-II)受体在活化的肝星形细胞中以高水平表达，并且当以在肝星形细胞中存在的内部肝剂量的70％施用于小鼠(摩尔比M6P∶SA是28∶1)时，用甘露糖6-磷酸(M6P)修饰的血清白蛋白(SA)分布在肝中(Beljaars等，Hepatology 1999：29：1486-93)。静脉注射后用识别胶原VI型受体的10环肽部分(moiety)(C^*GRGDSPC^*，其中C^*表示环化半胱氨酸残基)修饰的SA在10分钟内也可产生在大鼠肝中的优选分布(Beljaars等，J Biol Chem2000；275：12743-51)。在纤维化肝脏中，肽修饰的白蛋白的70％肝剂量结合活化的肝星形细胞。然而，在人的肝组织灌注中，肝巨噬细胞(kupffer cell)(涉及去除大分子量分子和外来粒子的肝细胞类型)而不是星形细胞吸收了这些试剂。

突触泡蛋白是一种仅在神经细胞和肝星形细胞中表达的蛋白质(Cassiman D.等，Am J Pathol1999；155：1831-1839；Bargou R.C.等，Gene 1991；99：197-204)。它是一种膜结合蛋白，但它在功能的纯化形式中是不可用的。尽管有这个显著的局限，申请人还是成功地分离第一种特异于肝星形细胞上突触泡蛋白的细胞外区域的人单克隆抗体全长片段。利用由英国剑桥的医学研究理事会(MRC，Cambridge，UK)得到的噬菌体呈现和人抗体库技术分离了该抗体。该抗体用肽免疫而且它是在星形细胞膜中自然证实识别整个天然突触泡蛋白质的抗肽抗体。识别并结合突触泡蛋白的抗体具有潜力来首次提供适于许多如下所述的治疗应用中的试剂。

附图简述

图1

突触泡蛋白的示意图。人的突触泡蛋白的理论分子量为33.8kDa，如图所示预测其跨细胞质膜。据报道该蛋白是糖基化的，具有实验分子量为～38-40kDa(Eastwood S.L.等，Brain Res Bull 2001；55：569-78)。

图2

利用靶肽-BSA的亲合力分离和扩增(多克隆)噬菌体抗体。在生物淘选(bio-panning)过程中用ELISA来评价识别目标肽-BSA抗原的(多克隆)噬菌体抗体的富集。测定由每轮筛选拯救的多克隆噬菌体抗体(～1×10¹⁰)与靶肽-BSA结合物的结合。用在方法部分中概述的HRP标记的抗M13抗体(Pharmacia)来检测结合噬菌体。表示了每轮筛选的噬菌体效价(---□---)。

图3

如图2所示，测定了C1-噬菌体抗体克隆(单克隆的)与靶肽-BSA的结合。

图4

pIMS 147载体中C1-3 scAb的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO 7和SEQID NO 8序列)。粗体的部分代表组成抗原结合位点的超可变互补决定区(CDRs)。下划线(______)的部分是连接H链和L链的柔性氨基酸接头(Gly₄，Ser)₃。还显示了骨架区(FW)起点和人的恒定kappa区(C_κ)的起点。用下划线(______)指示了克隆位点并在氨基酸序列上面标出了相应的限制性酶。HuCk恒定区的起始部分和6个组氨酸纯化标签是所示的全长氨基酸序列：

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES

VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGESHHHHHH

图5

在XL-1blue细胞中诱导C1-3 scAb的表达和通过Ni亲合层析纯化。如图所示，上条带是经过蛋白质上样的SDS-PAGE之后考马斯蓝染色的样品；下条带是用抗人Cκ轻链抗体进行Western分析的样品。

图6

C1-3 scAb的抗人Cκ轻链捕获ELISA定量。将羊抗人Cκ轻链抗体涂覆于96孔板表面。在单孔中温育人IgG或C1-3 scAb制剂的稀释物。充分洗涤后如方法部分中所述，将捕获的IgG(-□-)或scAb(-o-)定量。数据是通常7次独立制备过程中的3次独立测定的平均值和标准偏差。

图7

利用抗BSA-靶肽scAb，通过ELISA测试表达的scAb与肽YPFRLHQVYFDAPSC(SEQ ID NO：9)的相互作用的能力。用BSA-靶肽或BSA涂覆96孔板的孔，然后与C1-3 scAb(灰色条)或对照scAb温育缓冲液(空白条)来温育，随后充分洗涤。如方法部分所述，用HRP偶联的抗人Cκ轻链抗体来检测结合的scAb并定量。数据是3次独立测定的平均值和标准偏差。‘BSA-肽2’是所述的靶肽。

图8

Western印迹显示C1-3 scAb与靶肽的结合。用细胞提取物(5μg/泳道)进行Western印迹分析，并将膜用C1-3 scAb探针杂交，随后与HRP偶联抗人Cκ轻链抗体温育，并用ECL试剂检测。rHSCs-大鼠肝星形细胞；hHSCs-人星形细胞(AH4＝匿名患者编号)；rHCs-大鼠肝细胞；B13-大鼠胰腺干细胞；B13-H-转分化(trans-differentiation)为肝细胞后的大鼠胰腺干细胞。

图9

用FITC标记C1-3 scFv并通过SDS-PAGE进行确定。将Ni²⁺填充的、用IMAC Fast Flow Sepharose树脂纯化的C1-3 acAb进行透析，然后用centriconYM-3离心浓缩器进行浓缩。然后将浓缩的C1-3 scAb用FITC标记，并将每个级分的等分试样(约0.1μg/泳道)进行SDS-PAGE，随后进行凝胶的考马斯蓝(总蛋白)染色。

图10

不与(UPPER PANEL)或与(LOWER PANEL)一级抗体-即FITC-C13 scAb(FITC)和α-平滑肌肌动蛋白(αsma-APC)的小鼠单克隆抗体一起温育人的HSC的FACS分析。如方法部分所述，用生物素偶联的二级抗体来检测抗α平滑肌肌动蛋白抗体，随后用荧光团-抗生蛋白链菌素(streptavidin)的结合物温育。图表示在每个四分之一区中细胞的百分数。数据是通常的3个独立的细胞制备物。

图11

在培养中通过人HSC吸收C1-3 scAb和C1-3-结合物。将接种于24孔板中的HSCs在含5μg scAb的0.3ml培养基中进行温育。在指定的时间里采集培养液样品，并用HRP-结合的抗人Cκ轻链抗体(UPPER PANEL)和作为上样对照的血清白蛋白(LOWER PANEL)来进行Western印迹以检测scAb。显示通常的4次独立实验的结果。

图12

scAb温育对HSC成活率的影响。将接种干24孔板中的HSCs在含5μgscAb的0.3ml培养基或指出的化学品中进行温育。将细胞温育3小时后，然后除去培养基并用1×PBS洗涤。在培养孔中用直接蛋白测定法来测定连接(attachment)(作为生存力的量度单位)。数值是同一实验、通常是3次独立试验的3个单独孔的平均值和标准偏差。^*表示使用Student T检测(双尾)P＞95％，显著不同于对照。

图13

突触泡蛋白肽和莫能菌素(monensin)对FITC-C1-3 scAb结合人HSCs的作用。洗涤接种于24孔板中的人HSCs，在每孔500μl的Hepes/HBSS中温育1小时，其中包含以下任意一种：10μg C1-3 scAb；10μg FITC-C1-3 scAb；10μgFITC-C1-3 scAb和0.25纳摩尔靶肽；10μg FITC-C1-3 scAb和2.5纳摩尔靶肽；10μgFITC-C1-3 scAb和25纳摩尔靶肽；10μg FITC-C1-3 scAb和25纳摩尔肽P1；10μg FITC-C1-3 scAb和2.5μM莫能菌素；10μg FITC-C1-3 scAb和15μM莫能菌素；10μg FITC-3A8 scAb(微囊藻素(microcystin)免疫产生的scAb并预期不与HSCs结合)。将细胞与莫能菌素预温育10分钟。在加入scAb之前，更换培养液并用莫能菌素再次给药细胞。图片显示从20个随机挑选的视野中，荧光细胞平均百分率/视野±标准偏差的定量分析。Bar＝50μm。Monen＝莫能菌素；P1＝ATDPENIIKEMPMC肽；P2＝靶肽。

图14

HSC生存力。用500μl的培养基来处理24孔板培养物中的人HSCs，所述培养基中包括以下任意一种：DMSO载体；1.5μM胶霉毒素(750pmol)；20μl浓度为1mg/ml的C1-3scAb(20μg C1-3 scAb)；或20μl 0.5mg/ml的C1-3-胶霉毒素结合物(10μg C1-3 scAb-250pmol C1-3 scAb^*/1000pmol胶霉毒素)。^*0.5mg C1-3蛋白质/ml储液＝12.5μM＝12.5nmol/ml＝12.5pmol/μl

本文公开以下序列：

SEQ ID NO：1：C1-3VH编码核苷酸序列。

SEQ ID NO：2：C1-3VH氨基酸序列。

SEQ ID NO：3：C1-3VL编码核苷酸序列。

SEQ ID NO：4：C1-3VL氨基酸序列。

SEQ ID NO：5：C1-3接头编码核苷酸序列。

SEQ ID NO：6：C1-3接头氨基酸序列。

SEQ ID NO：7：C1-3编码核苷酸序列。

SEQ ID NO：8：C1-3氨基酸序列。

SEQ ID NO：9：C1-3抗原

SEQ ID NO：10：在VH氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的C1-3 VH CDR1。

SEQ ID NO：11：在VH氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的C1-3 VH CDR2。

SEQ ID NO：12：在VH氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的C1-3 VH CDR3。

SEQ ID NO：13：在VL氨基酸序列(SEQ ID NO：4)中的C1-3 VL CDR1。

SEQ ID NO：14：在VL氨基酸序列(SEQ ID NO：4)中的C1-3 VL CDR2。

SEQ ID NO：15：在VL氨基酸序列(SEQ ID NO：4)中的C1-3 VL CDR3。

SEQ ID NO：16：人恒定κ区(Hu C_κ)和6个组氨酸残基纯化标签的全长氨基酸序列(单个字母代码)-在NotI位点末端轻链骨架4(LFW4)结束而Hu C_κ起始。

SEQ ID NO：17：C1-3VL编码核苷酸序列的早期方案(earlier version)。

SEQ ID NO：18：C1-3VL氨基酸序列的早期方案。

SEQ ID NO：19：C1-3编码核苷酸序列的早期方案。

SEQ ID NO：20：C1-3氨基酸序列的早期方案。

如图4所示，在上述序列中，粗体部分是组成抗原结合位点的超可变互补决定区(CDRs)。下划线(______)部分是连接H链和L链的柔性氨基酸接头(Gly₄，Ser)₃。也指出了骨架区(FW)起点和人的恒定kappa区(C_κ)的起点。用下划线(______)指示了克隆位点，并在氨基酸序列上面标出了相应的限制性酶。

在一个方面中，本发明提供了结合突触泡蛋白并包含C1-3VH区域(SEQID NO：2)和/或C1-3VL区域(SEQ ID NO：4)的特异结合成员。

尽管如以下进一步所讨论的，单独的VH区可用来结合抗原，但通常将VH区和VL区配对来提供抗体抗原结合位点。在一个优选的实施方案中，将C1-3VH区(SEQ ID NO：2)与C1-3VL区(SEQ ID NO：4)配对，以便形成含有C1-3VH和VL区的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，将C1-3VH与除C1-3VL之外的VL区配对。在本领域中有效地确定了轻链的混杂(promiscuity)。

可从C1-3VH或VL区取出一个或多个CDR’s，并掺入适宜骨架中。这在下面进一步讨论。SEQ ID Nos 10、11和12分别显示了C1-3VH CDR’s 1、2和3。SEQ ID Nos 13、14和15分别显示了C1-3 VL CDR’s 1、2和3。

通过序列改变或突变和筛选的方法，可获得本文所述序列的和可用于突触泡蛋白的特异结合成员的VH和VL区的变体。本发明也提供了所述的方法。

根据本发明所述，可使用本文所具体公开序列的VH和VL区中任何的可变区氨基酸序列变体。具体的变体可包括一个或多个的氨基酸序列改变(添加、缺失、取代和/或插入氨基酸残基)，可少于约20个改变、少于约15个改变、少于约10个改变或少于约5、4、3、2或者1个改变。在一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR’s中可发生改变。

根据本发明的特异结合成员可以是与任何既结合抗原又包含特异结合成员，即本文公开的VH和/或VL区、或本文公开的VH CDR3、或它们的任何变体的特异结合成员竞争结合抗原的成员。体外能容易地检测到结合成员之间的竞争，例如用ELISA和/或通过将特异报告分子标记到一个在其它未标记的结合成员的存在下可被检测的结合成员，来鉴定结合相同的表位或重叠表位的特异结合成员。

因而，本发明另外一个方面提供了含有与C1-3竞争结合突触泡蛋白的人抗体抗原结合位点的特异结合成员。

本领域中可利用多种方法来获得抗突触泡蛋白的、以及与C1-3竞争结合突触泡蛋白的抗体。

在另外一个方面中，本发明提供了获得一种或多种能结合抗原的特异结合成员的方法，该方法包括将根据本发明的特异结合成员文库与所述抗原接触，并筛选能结合所述抗原的文库中的一种或多种特异结合成员。

在优选的实施方案中，特异结合成员结合在氨基酸序列YPFRLHQVYFDAPSC(SEQ ID NO：9)中的表位。

可在噬菌体颗粒表面展示文库，每个颗粒包含其表面上所展示的编码抗体VH可变区的核酸，和任选地也包括展示的VL区，如果存在的话。

选择能结合抗原的并在噬菌体颗粒上展示的特异结合成员后，可从展示所述选择的特异结合成员的噬菌体颗粒提取核酸。通过表达具有从展示所述选择的特异结合成员的噬菌体颗粒中提取的核酸序列的核酸，所述的核酸可用于随后生产特异结合成员或抗体VH可变区(任选的抗体VL可变区)。

可以以分离形式提供所述选择的特异结合成员的具有抗体VH可变区的氨基酸序列的抗体VH可变区，可作为含有所述VH区的特异结合成员。

可以进一步检测结合突触泡蛋白的能力及与C1-3竞争结合突触泡蛋白的能力。如下面进一步讨论的，检测突触泡蛋白的拮抗作用能力。

根据本发明的特异结合成员可结合具有C1-3亲合力的突触泡蛋白。特异结合成员优选结合突触泡蛋白的表位YPFRLHQVYFDAPSC。

特异结合成员可结合小鼠(murine)、大鼠和/或人突触泡蛋白。特异结合成员优选结合人突触泡蛋白。

在适当的条件下，可比较不同特异结合成员的结合亲合力和中合作用力。

除了抗体序列外，根据本发明的特异结合成员可包括其它氨基酸，如，形成肽或多肽，例如折叠域，或者赋予分子除了结合抗原的能力之外的其它功能特征。

本发明特异结合成员可携带可检测的标记，或可以与毒素或酶连接(如，通过肽键或接头)。

本领域的技术人员清楚许多将分子与蛋白质化学连接的方法。当特异结合成员用于药物用途时，优选连接键在循环中是稳定的，但一旦所述连接在细胞内被鳌合，该连接键就易发生变化。

在本发明的优选实施方案中，特异结合成员可连接于可检测的、荧光标记荧光素异硫氰酸盐(FITC)。

在另外方面，本发明提供包含编码特异结合成员(本发明的VH区和/或VL区)序列的分离的核酸，以及提供制备特异结合成员(本发明的VH区和/或VL区)的方法，其包括在能产生所述特异结合成员(VH区和/或VL区)的条件下表达所述的核酸，并将其回收。

根据本发明的特异结合成员可用于人或动物体的治疗和诊断方法中，如在人患者中治疗(其包括预防性治疗)疾病或病症的方法，其包括对所述的患者施用有效量的本发明的特异结合成员。根据本发明的的治疗的条件包括本文在其它地方所讨论的条件。

根据本发明的特异结合成员可用于成像方法中，例如，检测特异结合成员所结合的细胞的存在或位置。

在另外的方面中，本发明提供了含有根据本发明的特异结合成员的诊断试剂盒和一种或多种测定特异结合成员与抗原结合的试剂。

本发明的另外方面提供了通常是分离的核酸，其编码本文公开的抗体VH可变区(SEQ ID NO：1)和/或VL可变区(SEQ ID NO：3)。

本发明的另一方面提供了通常是分离的核酸，其编码本文公开的VHCDR或VL CDR序列，特别是选自SEQ ID Nos 10、11和12的VH CDR或选自SEQ ID Nos 13、14和15的VL CDR，最优选C1-3 VH CDR3(SEQ IDNO：12)。

本发明另一方面提供了用本发明核酸转化的宿主细胞。

本发明另一方面还提供了生产抗体VH可变区的方法，该方法包括从编码核酸引起表达。所述的方法可包括在产生所述的抗体VH可变区的条件下培养宿主细胞。

本发明另外方面提供了产生VL可变区和包括VH和/或VL区的特异结合成员的相类似的方法。

产生方法可包括产物的分离和/或纯化步骤。

产生方法可包括将产物配制到含有至少一个附加成分(例如可药用的赋形剂)的组合物。

以下进一步详细描述了本发明的这些和其它方面。

术语

特异结合成员

这描述了相互间具有结合特异性的分子对的成员。特异结合配对的成员可以是天然得到的或者是全部或部分人工合成的。分子对的一个成员在其表面具有与其特定结合的区域或空穴(cavity)，因此可与分子对的其它成员具体的空间和极性结构互补。因此分子对成员具有相互间特异结合的特性。特异结合配对类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白(avidin)、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。这种应用与抗原-抗体型反应有关。

抗体分子

这描述天然产生的或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。此术语也包括含有抗体结合区的任何多肽或蛋白质。包含抗原结合区的抗体片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双抗体(diabody)。

可使用单克隆和其它抗体以及使用重组DNA技术来产生保留原抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。所述的技术可以包括将抗体中编码免疫球蛋白可变区、或互补决定区(CDRs)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加骨架区(constant regions plus framework regions)。例如参见EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。生产抗体的杂交瘤或其它细胞可以进行基因突变或其它变化，其可以或不可改变所产生的抗体的结合特异性。

当可用许多方法修饰抗体时，术语“抗体分子”应该理解为包括任何具有抗体抗原结合区及期望特异性的特异结合成员或物质。因此，该术语包括抗体片段和衍生物，其包括任何含有免疫球蛋白结合区的多肽，无论是天然的或者全部或部分合成的。因此也包括融合于另一个多肽的、包含免疫球蛋白结合区域的嵌合分子和等价物。EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。

已显示，完整抗体的片段可实施结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1区组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1区组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH区组成的Fv片段；(iv)由VH区组成的dAb片段(Ward，E.S.等，Nature341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH区和VL区通过肽接头进行连接，所述肽接头可使两个区结合以形成抗原结合位点(Bird等，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚物(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”，其为通过基因融合构建的多价或多特异性片段(W094/13804；P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444-6448，1993)。通过掺入连接VH和VL区的二硫桥可稳定Fv、scFv或双抗体分子(Y.Reiter等，Nature Biotech，14，1239-1245，1996)。也可制备包含与CH3区连接的scFv的微型抗体(minibody)(S.Hu等，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。

待使用的双特异性抗体是常规的双特异性抗体，其可用多种方法来产生(Holliger，P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如，以化学方法制备或从杂交瘤制备，或者可为上述的双特异性抗体片段的任何一种。仅利用可变区可构建无Fc区域的双抗体和scFv，可能降低抗独特型反应(anti-idiotypic reaction)的效果。

相对于完整的双特异性抗体，双特异性双抗体也是特别有用的，因为它们可在大肠杆菌(E.coli)中容易地构建和表达。使用噬菌体展示(WO94/13804)可容易地从文库中筛选具有适当的结合特异性的双抗体(和许多其它多肽，例如抗体片段)。例如，如果双抗体的一个臂能保持恒定的定向抗突触泡蛋白的特异性，那么可制备其中另一臂变化的文库并选择具有合适特异性的抗体。可用突起进入孔洞(knobs-into-hole)工程技术来制备双特异性完整抗体(J.B.B.Ridgeway等，Protein Eng.，9，616-621，1996)。

抗原结合区

这描述了包含与其特异结合并互补于部分或全部抗原的区域的抗体分子部分。抗原较大时，抗体可仅结合于抗原的具体部分，该部分称为表位。由一个或多个抗体可变区(如由VH区组成的所谓Fd抗体片段)可提供抗原结合区。优选地，抗原结合区包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

特异的

这可用来指特异结合配对中的一个成员除了它的特异结合配对物之外，不显示任何与其它分子显著结合的情况。该术语也可应用于，例如抗原结合区特异于由许多抗原携带的特殊表位，在这种情况下携带抗原结合区的特异结合成员能结合携带表位的各种抗原。

通常，根据结合测试法(binding assay)如利用抗原板的ELISA来测定特异性。根据本发明的特异结合成员可识别肝星形细胞上而非神经细胞上的突触泡蛋白。

包括

通常用于“包括，包含”的含义，也就是说允许存在一个或多个特征或成分。

分离的

这指本发明的特异结合成员或编码所述结合成员核酸的状态，通常与本发明一致。

当通过重组DNA技术在体外或体内实施所述的制备时，成员和核酸没有或基本上没有与它们天然结合的物质，例如在它们的天然环境中或在制备它们的环境(如细胞培养物)中存在的其它多肽或核酸。可以用稀释剂或佐剂来配制成员和核酸，并仍为了分离的实用目的，例如如果用于涂覆微孔板以用于免疫实验，成员通常与凝胶(gelatin)或其它载体混合；或当用于诊断或治疗时，可与可药用的载体或稀释剂混合。可将特异结合成员天然地或通过异源真核细胞(如，CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)的系统进行糖基化，或它们可以是(例如如果通过在原核细胞中的表达产生)非糖基化的。

“基本上公开的“，指的是本发明相关的CDR或VH或VL区与本文公开序列的特定区域相同或高度相似。“高度相似”，是预期在CDR和/或VH或VL区发生1到5、优选1到4例如1到3或1或2、或3或4个氨基酸取代。

携带本发明CDR的结构通常是抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中CDR定位于与自然存在的由重排的免疫球蛋白基因编码的VH和VL抗体可变区的CDR相应的位置。确定免疫球蛋白可变区的结构和位置可参考以下文献(Kabat，E A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human Services.1987，及其更新，现在可在互联网上获得(http://immuno.bme.nwu.edu，或者使用任何搜索引擎检索″Kabat″)。

本发明中使用的可变区可由任何种系(germ-line)或重排的人可变区获得，或可为基于已知的人可变区的共有序列合成的可变区。用重组DNA技术可将本发明的CDR序列(如CDR3)导入缺失CDR(例如CDR3)的可变区库(repertoire)。

例如Marks等(Bio/Technology，1992，10：779-783)描述了产生抗体可变区库的方法，其中使用定向或邻近可变区域的5′端的共有引物联合人VH基因第三骨架区的共有引物一起来提供缺失CDR3的VH可变区库。Marks等另外描述了这种库如何结合特定抗体的CDR3。用相似的技术，用缺乏CDR3的VH或VL区库来改组(shuffle)本发明的CDR3-衍生序列，而改组的完整VH或VL区结合同源VL或VH区来提供本发明的特异结合成员。然后可将库展示在合适的宿主系统，例如WO92/01047的噬菌体展示系统中，以便选择合适的特异结合成员。库可由10⁴以上的单个成员，例如10⁶-10⁸或10¹⁰个成员组成。

Stemmer(Nature，1994，370：389-391)也公开了类似的改组或组合技术，他描述了涉及β-内酰氨酶基因的方法但观测到该方法可用于产生抗体。

又一个替换方案是利用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机诱变以在完整的可变区产生突变，从而产生携带本发明的CDR-衍生序列的新VH或VL区。Gram等(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，89：3576-3580)描述了该技术，其使用了易错PCR(error-prone PCR)。

可使用的另一种方法是对VH或VL基因CDR区进行定向突变。Barbas等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，91：3809-3813)和Schier等(1996，J.Mol.Biol.263：551-567)公开了所述的方法。

所有上述所描述的技术是本领域公知的，并且它们本身不成为本发明的部分。利用本领域常规方法，技术人员能使用所述的技术来提供本发明的特异结合成员。

本发明的另外一个方面提供了获得特异于突触泡蛋白表位YPFRLHQVYFDAPSC的抗体抗原-结合区的方法，该方法包括：在本文公开的VH区的氨基酸序列中通过添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，来提供其为所述VH区的氨基酸序列变体的VH区；任选地将所提供的VH区与一个或多个VL区组合；以及测试VH区或VH/VL组合，来用于鉴定特异结合成员或特异于突触泡蛋白的抗体-抗原结合区。所述的VL区可具有在本文中基本上公开的氨基酸序列。

可使用相似的方法，其中将本文公开的VL区的一个或多个序列变体与一个或多个VH区组合。

本发明的另外一个方面提供了制备特异于突触泡蛋白的特异结合成员的方法，该方法包括：

(a)提供编码VH区的核酸的起始库，所述VH区包括可被取代的CDR3或缺乏CDR3编码区；

(b)将所述的库与编码本文中基本上公开的VH CDR3的氨基酸序列的供体核酸结合，使得将所述供体核酸插入库中的CDR3区，以至于提供编码VH区的核酸的产物库；

(c)表达所述产物库的核酸；

(d)选择特异于突触泡蛋白的特异结合成员；和

(e)回收所述的特异结合成员或其编码核酸。

此外，也可采用相似的方法，其中将本发明的VL CDR3与编码VL区的核酸库组合，所述的VL区包括可被取代的CDR3或缺乏CDR3编码区。

同样地，将一个或多个或所有的3个CDR移植到筛选特异结合成员或特异于突触泡蛋白的特异结合成员的VH或VL区的库中。

免疫球蛋白可变区的基本部分包括至少三个CDR区以及它们插入的骨架区。优选地，这部分也包括至少约50％的第一和第四骨架区的任意一个或两者，包括50％的第一骨架区的C末端和50％的第四骨架区的N末端。在可变区基本部分的N末端或C末端的附加残基可为那些通常不与天然存在的可变区结合的残基。例如，通过重组DNA技术构建本发明的特异结合成员，可导致引入由引入的接头编码的N或C末端残基，以促进克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括引入接头来将本发明的可变区连接到另外的蛋白质序列，所述蛋白质序列包括免疫球蛋白重链、其它可变区(例如在双抗体的生产中)或如下详细讨论的蛋白质标记。

尽管在本发明的优选方面中优选含有VH和VL区配对物的特异结合成员，但基于VH或VL区序列的单个结合区构成本发明的另外方面。众所周知，单个免疫球蛋白区，尤其是VH区，能以特异方式结合靶抗原。

在任何一个单链特异结合区的情况下，这些结构域可用于筛选能形成可结合突触泡蛋白的两结构域特异结合成员的互补区。

使用如在WO92/01047中公开的所谓分级的双重组合方法(hierarchicaldual combinatorial approach)，通过噬菌体展示筛选方法来完成上述过程，其中将含有H链克隆或L链克隆的单个集落用于感染编码其它链(L或H)的克隆的完整文库，并根据例如参考文献中描述的噬菌体展示技术来选择所得的双链特异结合成员。同上，Marks等也公开了该技术。

本发明的特异结合成员可另外包括抗体恒定区或其部分。例如，可将VL区的C-末端连接到抗体轻链恒定区，所述恒定区包括人Cκ或Cλ链，优选Cκ链。同样地，可将基于VH区的特异结合成员的C-末端连接到所有或部分的免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链来源于任何抗体同种型(如IgG、IgA、IgM)和任何同种型亚类抗体。可利用在WO99/58572中公开的Fc区，例如Δnab和Δnac。

用可检测的或功能性标记物来标记本发明的特异结合成员。可检测的标记物包括放射性标记物例如¹³¹I或⁹⁹Tc，其可用抗体成像领域中常规化学方法连接到本发明的抗体。标记物也包括酶标记物如辣根过氧化物酶。另外标记物包括化学部分(moiety)，例如生物素，其可通过结合可检测的特异同源物部分(如标记的抗生物素蛋白)而被检测。标记物优选包括荧光标记物，例如FITC。

本发明的特异结合成员设计用于诊断或治疗人或动物受试者，优选人的方法。

因此，本发明的另外方面提供了诊断方法，其包括将所提供的特异结合成员与一种或多种试剂如与可检测的标记(例如FITC)结合的试剂一起施用。所提供的特异结合成员可用于开发快速可靠地检测用于来自活检组织的肝纤维化细胞。

本发明的另外方面提供了治疗方法，其包括施用所提供的特异结合成员、施用包含所述特异结合成员的药物组合物，以及所述特异结合成员在制备施用的药物中的用途，例如在制备药物或含有将特异结合成员与可药用的赋形剂配制的药物组合物的方法中的用途。

肝星形细胞抗体的临床指标(indication)可用于提供治疗益处，其包括肝纤维化具有病理结果的情况，例如在肝的病症中，如病毒感染，例如肝炎和滥用酒精。通过人抗-星形抗体或抗体类似结构的被动免疫，所提供的特异结合成员也可用于直接治疗肝纤维化。

根据本发明的抗-纤维化治疗可用于给肝纤维化患者提供彻底的疗效。可以通过注射(例如静脉内)或通过局部递送方法来实现抗纤维化治疗。所提供的特异结合成员可用于指导将药物组合物递送到靶肝星形细胞。

可选择的制剂策略提供了适于口服或栓剂途径的制剂。可根据疗法的物理化学特性及对疾病的特殊考虑来确定给药途径，以优化疗效或使副作用最小化。

根据本发明，可将所提供的组合物施用于个体。优选以“治疗有效量”进行施用，这足以对病人显示出益处。所述的益处至少可为改善至少一个症状。实际的施用量和施用的速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。例如确定剂量等的治疗处方在普通医师和其它医生的职责内。适当的抗体剂量是本领域熟知的；参见Ledermann J.A.等，(1991)Int.J.Cancer 47：659-664；Bagshawe K.D.等，(1991)Antibody，Immunoconjugates andRadiopharrnaceuticals 4：915-922。

准确剂量取决于多种因素，包括抗体是用于诊断还是用于治疗、治疗区域的大小和位置、抗体的准确特性(如完整抗体，片段或双抗体)以及连接抗体的任何可检测标记物或其它分子的性质。典型的抗体剂量在0.5mg-1.0g的范围内，并可以静脉内作为大丸剂(bolus)进行施用。其它施用方式包括几小时以上的静脉输液来完成类似的总累积剂量。这是成人患者的单次治疗的剂量，对于儿童和婴儿可以按比例调节，也可与分子量成比例地调节其它抗体形式。根据医师的判断，治疗可以每日重复一次、每周两次、间隔每月或每周重复一次。

给药的另一个方式是使用留置装置(indwelling device)的预涂层(precoating)或以别的方式掺入留置装置，其中通过合适的试验来确定抗体的最佳用量。

在本发明的某些优选实施方案中，抗体分子是单体片段，如F(ab)或scFv。所述的抗体片段可具有相对较短半衰期的优点。

通常以药物组合物的形式施用本发明的特异结合成员，所述的组合物除特异结合成员之外可包括至少一种成分。

因而根据本发明并根据本发明进行使用的药物组合物，除了活性成分外，可包括可药用的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。所述的材料应该是无毒的并且不应妨碍活性成分的功效。载体或其它材料的准确特性将取决于施用途径，其可为口服，或通过注射，如静脉内注射。

用于口服的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可包括固体载体例如凝胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐溶液、葡萄糖或其它糖类溶液或二醇(glycol)，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

针对静脉注射或痛点注射，活性成分可为胃肠外可接受的水性溶液的形式，所述水性溶液是无热原的(pyrogen-free)并具有适当的pH、等渗性(isotonicity)和稳定性。例如，使用等渗载体(例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格注射液)，本领域相关技术人员能很好地制备适宜的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

根据待治疗的病症，可单独或与其它疗法组合，同时或顺序地施用组合物。其它的疗法可包括施用适当剂量的止痛药，例如非类固醇消炎药(如阿斯匹林(asprin)、布洛芬(ibuprofen)或酮洛芬(ketoprofen))，或阿片制剂类例如吗啡，或止吐药。

本发明提供了包括引起或允许如本文提供的特异结合成员结合突触泡蛋白的方法。如本文指出的，所述的结合可发生在体内，如在施用特异结合成员或施用编码特异结合成员的核酸后，或者所述的结合可发生在体外，例如在ELISA、Western印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀或亲合色谱中。

可以确定特异结合成员与突触泡蛋白结合的量。定量结果可与待测样品中抗原的量有关，其可具有诊断意义。

用任何适当的方法可确定抗体对样品的反应性(reactivity)。放射免疫测定(RIA)是一种可能的方法。放射性标记的抗原与未标记的抗原(待测样品)混合并允许与抗体结合。用物理方法分离未结合的抗原和结合的抗原，并确定与抗体结合的放射性抗原的量。在待检样品中抗原越多则越少的放射性抗原与抗体结合。使用抗原或与报道分子连接的类似物，也可以无放射性抗原使用竞争性结合试验。报道分子可为具有光谱分离的吸收或发射特性的荧光染料(fluorochrome)、磷光体(phosphor)或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素(fluorescein)、罗丹明(rhodamine)、藻红蛋白(phycoerythrin)和德克萨斯红(TexasRed)。合适的生色染料包括二氨基联苯胺(diaminobenzidine)。

其它报道子包括大分子的胶粒或微粒材料，例如着色的、磁性的或顺磁的胶乳珠，和可直接或间接产生目测的、电子检测的或其它形式记录的可检测信号的生物或化学活性试剂。例如，这些分子可为催化显影或改变颜色或引起电学性质改变的反应的酶。它们可为分子可激发的，以至能态之间的电子跃迁产生特征光谱吸收或发散。它们可包括用于连接生物传感器的化学个体(chemical entity)。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)和碱性磷酸酶检测系统。

通过单个抗体-报道子结合物产生的信号可用于得到样品(正常和待测)中相关抗体结合的绝对定量或相对定量的数据。

本发明也提供了上述特异结合成员在竞争性分析中测量抗原水平的用途，即，在竞争性分析中通过利用本发明提供的特异结合成员测量样品中抗原水平的方法。其中该方法不需要由未结合的抗原来物理分离结合的抗原。一种可能性是：将报道分子连接特异结合成员以至于在结合中发生物理变化或光学变化。报道分子可以直接或间接地产生可检测的(优选可测量的)信号。报道分子的连接可为直接或间接的、共价(如通过肽键)或非共价的。经由肽键的连接可为编码抗体和报道分子的融合基因的重组表达的结果。

本发明也提供了例如在生物传感器中利用根据本发明的特异结合成员来直接测量抗原水平。

确定结合方式不是本发明的特征，本领域技术人员可根据他们的选择和常规知识来选择合适的方式。

本发明还扩展到与任何特异结合成员一起竞争结合突触泡蛋白的特异结合成员，其既结合抗原又包含含有CDR(其具有基本如本文公开的氨基酸序列)的V区或包含具有基本如本文公开的氨基酸序列的V区。体外可容易地测试结合成员之间的竞争，例如通过将特异报道分子标记到一种在存在其它未标记的结合成员时可被检测的结合成员，从而能识别结合相同表位或重叠表位的特异结合成员。例如使用ELISA或流式细胞仪(flow cytometry)，可测定竞争。

在检测竞争的过程中，可以用抗原的肽片段，特别是包含目的表位的肽。可使用在任一末端具有表位序列加上一个或多个氨基酸的肽。所述的肽据称是“基本上”由指定序列“组成的”。根据本发明的特异结合成员可为它们对抗原的结合被具有或包含所述序列的肽抑制的成员。在对此检测过程中，可使用具有任一序列加上一个或多个氨基酸的肽。

例如使用肽通过淘选法从噬菌体展示文库中分离结合特异肽的特异结合成员。

本发明另外提供了编码本发明的特异结合成员的分离核酸。核酸包括DNA和RNA。在优选的方面中，本发明提供了编码如上定义的本发明的CDR、VH或VL区的核酸。

本发明也以质粒、载体、以及包含至少上述一种多核苷酸的转录盒或表达盒(cassettes)的形式提供构建体。

本发明也提供了包含一种或多种上述构建体的重组宿主细胞。编码任何CDR、VH或VL区、或本身所提供的特异结合成员的核酸构成了本发明的一个方面，同样作为生产编码产物的方法，该方法包括从其编码核酸中表达。通过在合适的条件下培养包含核酸的重组宿主细胞，可方便地完成表达。在通过表达生产之后，使用任何合适的技术来分离和/或纯化VH或VL区或特异结合成员，然后适当地使用。

以分离和/或纯化的形式，提供本发明的特异结合成员、VH和/或VL区以及编码核酸分子和载体，例如在它们的天然环境中以基本上纯的或均质形态，或者就核酸而言，没有或基本上没有除了编码具有所需功能的多肽的序列之外的核酸或基因来源。根据本发明的核酸可包括DNA或RNA，并可为全部或部分合成的。除非上下文另外要求，本文公开的相关核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并包括具有特定序列的RNA分子，其中在RNA中U代替了T。

用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒(baculovirus)系统。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞和许多其它细胞。常见优选的细菌宿主是大肠杆菌。

本领域中已经有效建立了在原核细胞(如大肠杆菌)中表达抗体和抗体片段。出于参考，参见例如Plückthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。本领域技术人员可以选择利用在真核细胞培养中的表达来产生特异结合成员。请参见最近的综述，例如Ref，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.等(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。

可选择或构建合适的载体，其包含适宜的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它适宜的序列。适当地，载体可以是质粒、病毒，如噬菌体、噬菌粒。Molecular Cloning：aLaboratory Manual：第3版，Sambrook and Russell，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press。在Current Protocols in Molecular Biology第2版，Ausubel等，eds.，John Wiley & Sons，1992中详细描述了操作核酸的许多已知技术和实施方案，例如制备核酸构建体、诱变、序列测定、将DNA引入细胞和基因表达，和蛋白质分析。

因此，本发明的另外方面提供了包含本文公开核酸的宿主细胞。另外一个方面还提供了将这样的核酸引入宿主细胞的方法。引入可采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用反转录病毒或其它病毒(如牛痘)的转导，或对于昆虫细胞，使用杆状病毒。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和用噬菌体转染。

导入后接着引起或容许由核酸表达，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。

在一个实施方案中，将本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组(如染色体)中。根据标准技术，通过包含促进基因组重组的序列来促进整合。

本发明也提供了包括在表达系统中使用上述的构建体来表达上述特异结合成员或多肽的方法。

现在通过参考下列实验方法的实施例来阐明本发明的方面和实施方案。

所有在说明书中引用的文献并入作为参考。

材料和方法

肽和牛血清白蛋白的连接

使用Fmoc化学法(Proteomics Group，University of Aberdeen)合成与突触泡蛋白(图1)外质面(exoplasmic side)上存在的氨基酸相对应的肽YPFRLHQVYFDAPSC，并用HPLC鉴定纯度。用质谱分析来检测肽的分子量(数据未公开)。用3-马来酰亚胺乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(maleimidoaceticacid N-hydroxysuccinimide)(MBS)化学将肽与牛血清白蛋白(BSA)连接(LeelV.等，Biochem Biophys Res Commun 2004；316：872-7)。SDS-PAGE和质谱分析(MALDI-TOF，Applied Biosystems Voyager-DESTR)证实肽已经与BSA连接-通常平均每分子白蛋白4个肽分子(数据未公开)。

噬菌体展示产生结合肽序列的可溶性单链抗体片段(scAb)

将人单折叠(single-fold)scFv噬菌粒(pIT2)文库(Tomlinson I+J，MRC，英国)用于筛选具有特异于Leel V.等(Biochem Biophys Res Commun 2004；316：872-7)基本上如所概述的肽序列的噬菌体抗体。针对肽序列进行总共三轮淘选。在含2％(w/v)奶粉(MPBS)和2mg/ml BSA的4ml PBS(137mM NaCl，02.7mM KCl，10mM磷酸盐，pH 7.4)中进行淘选，来增加具有肽特异性噬菌体抗体与BSA的比值。

抗肽噬菌体-抗体ELISA

使用以2μg/孔的蛋白(肽-BSA或BAS)在PBS中4℃过夜涂覆的平底96孔Immulon-4微量滴定板(Dynex，Sussex，UK)，通过ELISA来检测富集肽的结合物(binder)的纯化多克隆噬菌体。通过与100μl/孔的连接了抗-M13抗体(Amersham Pharmacia)的辣根过氧化物酶(HRP)一起温育1小时，洗涤，和与100μl/孔的四甲基联苯胺二盐酸化物溶液(KPL Laboratories，Gaithersburg，MD)一起温育，可检测结合的噬菌体。用50μl/孔的1M H₂SO₄终止反应，并用微孔板读数仪读取450nm的吸光度。

鉴定肽的多克隆噬菌体-抗体并亚克隆入表达载体pIMS147

在96孔板(Greiner)中生长从3轮淘选的单个集落并用M13 KO7拯救噬菌体-抗体。

通过ELISA测定结合肽-BSA和单独结合BSA的噬菌体上清的特异性。将阳性克隆的scFv编码区亚克隆于表达载体pIMS 147中。该载体是基于载体pIMS 100(Hayhurst A.等，Protein Expr Purif 1999；15：336-43)的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导的pUC的修饰型。通过固定的金属离子螯合物亲合层析，添加六组氨酸标签可纯化表达的scAb。将载体转入大肠杆菌TG1或XL1 blue细胞中。

scAbs的表达、纯化及鉴定

如Leel V.等(Biochem Biophys Res Commun 2004；316：872-7)所概述的，在IPTG-处理的细胞中表达scAb，并根据制造商的说明使用Ni²⁺填充的IMAC Fast Flow Sepharose树脂(Amersham Pharmacia)，通过六组氨酸C-末端标签尾部来纯化scAb。在4℃充分透析除去PBS后，在-20℃保存scAb。如Leel V.等(Biochem Biophys Res Commun 2004；316：872-7)所概述的，使用完整人IgG分析标准，通过经由人Cκ区的捕获ELISA方法将纯化的scAb定量。

表达纯化的抗-肽scAb ELISA

通过基本上如概括用于多克隆抗肽噬菌体抗体ELISA的ELISA来测试表达的scAb与肽相互作用的能力。用辣根过氧化物酶连接的抗-人Cκ轻链抗体(Sigma Chem.Co.Poole，英国)来检测结合的scAb。

SDS-PAGE和Western印迹

基本上如Wright M.C.等(Mol Pharmacol 1996；50：856-63)所述进行Western印迹。

FITC标记蛋白

根据制造商的说明书，使用Fluoroporter FITC蛋白标记试剂盒(MolecularProbes)进行荧光标记scAb。使用三丁基锡异硫氰酸盐(Aldrich Chemicals，Poole，英国)，这种方法也可用于将C1-3 scAb与三丁基锡连接。

动物和细胞制剂

从英国人组织库(UK Human Tissue Bank)(DeMontfort University，Leicester，英国)中获得人肝细胞。由从患有肿瘤的患者体内取出的正常肝组织边缘分离人HSCs。在这些研究中所用的人的组织是由Grampian地区伦理委员会(Grampian Regional Ethics Committee)批准的，并包括捐赠人完全同意。Wright M.C.等(Hum ExpToxicol 1996；15：203-4)和Harvey J.L.等(Drug MetabDispos 2000；28：96-101)中已经发表了人肝细胞培养的规程。Wright M.C.等(Gastroenterology 2001；121：685-98)和Marek C.J.等(Biochem J 2003；370：763-9)中发表了大鼠HSC和B-13细胞培养的规程。

FITC-标记的scAb与细胞的温育

通过荧光显微镜来检测FITC-C1-3 scAb与培养物中的肝星形细胞相互作用的能力。实验前将人肝星形细胞接种(每室1×10³个细胞)于腔式载玻片(Nunclon，Naperville)上的完全培养基中。在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞两次，并在包含10μg scAb或FITC-C1-3 scAb的500μl Hepes/HBSS缓冲液(0.14M NaCl、5.4mM KCl、0.34mM Na₂HPO₄、0.44mm KH₂PO₄、5.6mM葡萄糖、1mM CaCl₂、6mM HEPES、4mM NaHCO₃，pH7.4)中室温黑暗培养1小时。然后在PBS中洗涤细胞，并用包含4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield封固剂(mounting medium)(Vector laboratories，Burlingame，加拿大)固定以使细胞核染色并加盖玻片。用带有Photometrics Sensis照相机的ZeissAxeola II显微镜来进行荧光显微术，并用Smart Capture程序记录数据。将人肝细胞(UK Human Tissue Bank)先培养在胶原涂覆的24孔板(1×10⁵/孔)中，然后在补充了80单位/ml青霉素和80μg/ml的链霉素的William′s培养基E中保持。

对于共培养实验，实验前将肝星形细胞接种于肝细胞培养物(每孔1×10³个细胞)中，并培养24小时。将C1-3或FITC-C1-3 scAb如所述用于纯肝星形细胞培养物进行温育除了在1小时培养和冲洗后，通过胰蛋白酶消化并以1000转/分离心5分钟来收集细胞。然后在0.4％甲醛/10⁶个细胞中重悬浮细胞沉淀，通过细胞离心施加到载玻片上，并用含DAPI的Vectashield固定。通过前述的荧光显微术来观测玻片。

没有细胞固定的荧光显微术用于比较肽和莫能菌素对FITC-C1-3结合HSCs的影响，因为DAPI染色掩盖了核FITC-C1-3着色。用Hepes/HBSS洗涤接种于24孔板的HSCs，然后在含有10μg scAb并含有或不含有额外化合物的500μl/孔的Hepes/HBSS中于37℃温育。1小时以后，用500μlHepes/HBSS洗涤细胞3次。用使用滤光装置#9(BP 450-490nm；LP 515nm)的Axiovert 100显微镜(Zeiss，德国)来检测细胞。

FACS分析

将FITC-C1-3 scAb加入培养基(200μg/10mls)中，并与HSCs的铺满(10cm直径盘)培养物于37℃温育1小时。然后去掉培养基并在PBS中洗涤细胞。然后用细胞离散溶液(Sigma，Poole，英国)将细胞从培养物底层(substratum)不通过酶来分离，通过离心进行沉淀，并用BD细胞固定剂/破膜剂(cytofix/cytoperm)(BD Biosciences，Oxford，英国)进行固定/破膜。15分钟后，在0.5mls的1×洗涤/破膜缓冲液(BD Biosciences，Oxford，英国)中洗涤细胞，与已稀释在1×洗涤/破膜缓冲液中的小鼠抗-α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(Sigma，Poole，英国)一起温育。然后将细胞在1×洗涤/破膜缓冲液中洗涤并与生物素结合的抗小鼠IgG(1∶200，DakoCytomatron，Cambridgeshire，英国)在冰上温育30分钟，洗涤两次然后与抗生物素蛋白链菌素-别藻青素(allophycocyanin)(APC)结合物(1∶200，BD Biosciences，Oxford，英国)在冰上温育30分钟。用流式细胞仪(LSR I，BD，Oxford，英国)分析细胞。通过将细胞与同型特异性控制抗体一起温育来控制非特异性荧光。

结果

噬菌体展示技术用于从Tomlinson I+J文库利用靶肽YPFRLHQVYFDAPSC的亲合性淘选重组噬菌体抗体。图2显示，将对于靶肽具有亲合力的噬菌体抗体选择性地结合于免疫管(immunotubes)并且通过3轮单独淘选得到扩增。对于结合BSA和靶肽-BSA的噬菌体抗体，从第3轮淘选文库中单独筛选96个独立的克隆。在此次分析中，57个克隆显示对靶肽-BSA的高亲合性，没有克隆显示对BSA的任何亲合性(数据未列出)。选出在单克隆噬菌体抗体ELISA中产生最高应答的12个克隆，并对scAb编码区进行测序。

测序显示许多在scAb的编码区中含有读码框内(in-frame)终止密码子。将构建体亚克隆入pIMS147中并且转入含有抑制物tRNAs的大肠杆菌菌株(即TG-1)中。虽然这些构建体在TG-1中产生对于肽具有高亲合力的scAbs，但未得到scAb的高水平表达(数据未显示)。然而，噬菌体抗体克隆C1在scAb编码区中不包含终止密码子，并在多克隆噬菌体抗体ELISA筛选中产生良好的结合应答(图3)。将克隆C1亚克隆入pIMS147载体中并且转入XL-1 blue大肠杆菌中。克隆pIMS 147 C1-3(图4)指导在ELISA(图6)中特异识别肽的scAb的高水平表达(图5)。表达scAb的ELISA分析证实产生特异于肽YPFRLHQVYFDAPSC的scAb。图7显示与只结合BSA相比，大约8倍多的表达的scAb结合肽-BSA(即YPFRLHQVYFDAPSC-BSA)。缺乏scAb时，与肽-BSA结合或BSA结合的对照物是最少的。相对于几种不同细胞型提取物Western分析证明C1-3 scAb结合人HSC中的～32kDa蛋白，即HSC的12种非糖基化的突触泡蛋白的人抗体靶的预测大小(Eastwood S.L.等，Brain ResBull 2001：55：569-78)。有趣的是，C1-3 scAb不与大鼠HSC中的突触泡蛋白发生交叉反应(图8)。

为了确定C1-3 scAb是否能与活HSCs表面结合，用FITC标记C1-3 scAb并且用如图9所示的SDS-PAGE证实，并通过FITC-C1-3 scAb的迁移的减少来判断。C1-3 scAb在透析前后和在浓缩后具有大约40Kda的MW(分子量)。用FITC标记的C1-3 scAb具有大约45Kda的MW(分子量)。

然后将FITC-C1-3 scAb加入培养物中活化的人HSCs中。人HSC培养物的免疫细胞化学染色(未显示)和FACS分析证实细胞是专一地α-平滑肌肌动蛋白阳性，并因此是活化的HSCs和/或是肝来源的肌成纤维细胞(认为这两种细胞型都有助于纤维化发生(Ramadori G.等，Liver 2002；22：283-94)-参见图10)。固定前在天然条件下用FITC-C1-3共染色细胞来证实：与α-平滑肌肌动蛋白(图10)相比，尽管在FITC-C1-3染色强度中有较大变化，但所有细胞都结合C1-3 scAb。这暗示了存在具有高水平突触泡蛋白的α-平滑肌肌动蛋白表达细胞的亚群体，和/或更期望的FITC-C1-3 scAb吸收机理。C1-3、FITC-C1-3或三丁基-锡-结合的C1-3 scAb(TBT-C1-3)与HSCs的结合与培养基浓度的降低相关(图11)。对比通过细胞凋亡(胶霉毒素)或坏死(氯丙嗪)(参见图12)杀死HSCs的已知化合物，没有C1-3或FITC-C1-3的毒性证据。有趣的是，TBT-C1-3 scAb对HSCs是有毒的，这说明C1-3 scAb是内在化的，并可将药物连接于C1-3并保留药物药性。

荧光实验表明在培养物中，FITC-C1-3 scAb与肝星型细胞特异相互作用，因为绿色(结合荧光素的)荧光结合与FITC-C1-3 scAb一起温育的肝星型细胞。用抑制光漂白和将细胞核染成蓝色的封固剂，发现在大多数的情况下荧光位于核和细胞膜周围。染色常常呈现点状，这可能反映与局部化结构的连接。在该方面中，已知突触泡蛋白集中在神经元中的突触囊泡上，在那里它形成可变亚基数目的同源低聚体。也在细胞核膜周围观测到染色，这支持了C1-3 scAb进行细胞内积累的暗示。在与(未结合荧光素的)C1-3 scAb一起温育的肝星形细胞培养物中没有观测到可检测的绿色荧光。为了测定C1-3scAb和肝星形细胞之间相互作用的特异性，也将人肝细胞与FITC-C1-3 scAb一起温育。与C1-3 scAb或与FITC-C1-3 scAb温育的肝细胞，没有显示结合的绿色荧光，这说明C1-3 scAb抗体没有与肝细胞结合。为了进一步检验C1-3scAb区别细胞型的能力，用FITC-C1-3 scAb与肝星形细胞和肝细胞进行共培养和温育。在星形细胞上观测到荧光，而肝细胞始终没有呈现可检测水平的结合的绿色荧光。在共培养物与(未结合荧光素)C1-3 scAb温育的实验中没有观测到显著的绿色荧光。用FITC标记的BSA来检测C1-3 scAb与肝星形细胞结合作用的特异性。将人肝星形细胞和肝细胞都与BSA和FITC-BSA进行温育。当将人HSCs和肝细胞与FITC-BSA进行温育时，呈现了荧光的细胞质聚集点(cytoplasmic foci)，这说明如果C1-3 scAb不与肝细胞相互作用，则在非特异性阻止C1-3 scAb吸收到肝细胞内的蛋白质(即C1-3)上不存在荧光素。当与C1-3 scAb或C1-3 scAb-FITC进行温育时，在COS-7或HepG2细胞中未检测到荧光结合。

将检测前没有固定和DAPI共染色的荧光显微术用于比较肽或莫能菌素对FITC-C1-3 HSC结合/吸收的影响。图13显示与对照FITC-标记的3A8 scAb(预先为毒素微囊藻素制备的(McElhiney J.等，Appl Environ Microbiol 2002；68：5288-95)相比，FITC-C1-3 scAb与HSCs结合。添加与其它存在于培养物的突触泡蛋白外质侧面上的氨基酸相对应的肽ATDPENIIKEMPMC，并不能显著的抑制FITC-C1-3与HSC的结合，然而靶肽YPFRLHQVYFDAPSC以剂量依赖的方式减少FITC-C1-3与HSCs的结合。添加细胞内吞抑制物莫能菌素，不能抑制用FITC-C13染色的细胞总数，但降低如通过核FITC-C1-3染色的减少所示的吸收。

基本上如Fox等(J Microbiol Methods 2004；56：221-230)所述，将C1-3scAb以1mg/ml的浓度与胶霉毒素结合。SDS-PAGE证实已经修饰了蛋白质(数据未显示)。胶霉毒素抗体(由Fox等得到)证实了胶霉毒素已共价吸附于C1-3 scAb。MALDI-TOF分析显示蛋白质的质量(mass)已经增加到最常见的1683道尔顿。考虑到结合方法，显示大多数C1-3蛋白质与4分子胶霉毒素结合。图14显示胶霉毒素杀死人HSCs，并且与胶霉毒素结合的C1-3也杀死HSCs。该数据表明可以将药物连接于C1-3 scAb并保持靶向作用和药效。

SEQ ID NO：1

NcoI

CC ATG GCC GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA

   CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA

                       HCDR1             HFW2

   TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT

                                         HCDR2

   CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA ACT ATT GCT GCG TCG

                                                      HFW3

   GGT CCT TCT ACA GGG TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC

   ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA

   ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT

                HCDR3                    HFW4

   GCG AAA ACT ACG GCG AAG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC

   CTG GTC ACC GTC TCG AGC

SEQ ID NO：2

1   Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

15  Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

                      HCDR1               HFW2

30  Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

                                        HCDR2

45  Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala Ser

                                                    HFW3

60  Gly Pro Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

75  Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

90  Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                HCDR3                   HFW4

105 Ala Lys Thr Thr Ala Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

120 Leu Val Thr Val Ser Ser

    SEQ ID NO：3

    ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA

    TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG

         LCDR1                    LFW2

    AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG

                                            LCDR2

    AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TCT GCA TCC CGA TTG CAA

            LFW3

    AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AAT GGC AGT GGA TCT GGG ACA

    GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT

                          LCDR3

    GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG CTG CAG AGG AAG CCT ACG ACG

                                                notI

   TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG  GCG GCC GCT

   GCA

   SEQ ID NO：4

   Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

   Scr Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

        LCDR1                    LFW2

   Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

                                        LCDR2

   Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Arg Leu Gln

           LFW3

   Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly Ser Gly Ser Gly Thr

   Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

                         LCDR3

   Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gln Arg Lys Pro Thr Thr

                                                 notI

   Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg  Gly Ala Ala

   Ala

   SEQ ID NO：5

   GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG

   SEQ ID NO：6

   Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

   SEQ ID NO：7

CC ATG GCC GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA

   CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA

                     HCDR1              HFW2

   TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT

                                        HCDR2

   CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA ACT ATT GCT GCG TCG

                                                    HFW3

   GGT CCT TCT ACA GGG TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC

   ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA

   ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT

                HCDR3                    HFW4

   GCG AAA ACT ACG GCG AAG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC

   CTG GTC ACC GTC TCG AGC

                                                 接头

ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG

   TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC

                                    LCDR1

   ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT

     LFW2

   TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC

            LCDR2                   LFW3

   TAT TCT GCA TCC CGA TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC

   AAT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC

                                                     LCDR3

   AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG

   CTG CAG AGG AAG CCT ACG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG

                    notI

   GAA ATC AAA CGG  GCG GCC GCT GCA CCA

                                          C_κ-轻链+his标签

   SEQ ID NO：8

1   Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

15  Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

                       HCDR1              HFW2

30  Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

                                         HCDR2

45  Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala Ser

                                                    HFW3

60  Gly Pro Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

75  Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

90  Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                HCDR3                   HFW4

105 Ala Lys Thr Thr Ala Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

120 Leu Val Thr Val Ser Ser

                                                接头

135

Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

150 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

                                      LCDR1

165 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

180 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

195 Tyr Ser Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

210 Asn Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

225 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

240 Leu Gln Arg Lys Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

                       notI

255 Glu Ile Lys Arg  Gly Ala Ala Ala Pro

                              C_κ-轻链+his标签

   SEQ ID NO：9

   YPFRLHQVYFDAPSC

   SEQ ID NO：10

   AGC TAT GCC ATG AGC

   Ser Tyr Ala Met Ser

   SEQ ID NO：11

   ACT ATT GCT GCG TCG GGT CCT TCT ACA GGG TAC GCA GAC TCC

   Thr Ile Ala Ala Ser Gly Pro Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser

   GTG AAG GGC

   Val Lys Gly

   SEQ ID NO：12

   ACT ACG GCG AAG TTT GAG TAC

   Thr Thr Ala Lys Phe Asp Tyr

   SEQ ID NO：13

   GGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT

   Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

   SEQ ID NO：14

   TCT GCA TCC CGA TTG CAA AGT

   Ser Ala Ser Arg Leu Gln Ser

   SEQ ID NO：15

   CAA CAG CTG CAG AGG AAG CCT ACG ACG

   Gln Gln Leu Gln Arg Lys Pro Thr Thr

   SEQ ID NO：16

   AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

   YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGESHHHHHH

   SEQ ID NO：17

   ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA

   TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG

   AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG

   AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TCT GCA TCC CGA TTG CAA

   AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA

   GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT GTG CAA CCT GAA GAT TTT

   GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG CTG CAG AGG AAG CTA CGA CGT

                                               notI

   TCG GCC AAG GGA CCA GGT GGA AAT CAA ACG G GC GGC CGC TGC

   ACA

   SEQ ID NO：18

   Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

   Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

   Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

   Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Arg Leu Gln

   Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

   Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe

   Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gln Arg Lys Leu Arg Arg

   Ser Ala Lys Gly Pro Gly Gly Asn Gln Thr Gly Gly Arg Cys

   Thr

   SEQ ID NO：19

CC ATG GCC GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA

   CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA

   TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT

   CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA ACT ATT GCT GCG TCG

   GGT CCT TCT ACA GGG TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC

   ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA

   ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT

   GCG AAA ACT ACG GCG AAG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC

   CTG GTC ACC GTC TCG AGC

                                    接头

ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG

   TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC

   ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT

   TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC

   TAT TCT GCA TCC CGA TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC

   AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC

   AGT GTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG

   CTG CAG AGG AAG CTA CGA CGT TCG GCC AAG GGA CCA GGT GGA

                    notI

   AAT CAA ACG G GC GGC CGC TGC ACA

                           Cκ-轻链+his标签

   SEQ ID NO：20

1    Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

15   Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

30   Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

45   Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala Ser

60   Gly Pro Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

75   Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

90   Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

105  Ala Lys Thr Thr Ala Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

120  Leu Val Thr Val Ser Ser

                                  接头

135 Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

150  Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

165  Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

180  Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

195  Tyr Ser Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

210  Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

225  Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

240  Leu Gln Arg Lys Leu Arg Arg Ser Ala Lys Gly Pro Gly Gly

                       notI

255  Asn Gln Thr Gly Gly Arg Cys Thr

                                              Cκ-轻链+his标签

Claims (37)

1.一种结合突触泡蛋白的特异结合成员，其包括：

抗体VH区，其选自C1-3 VH区(SEQID NO.2)和包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.12的VH CDR3和任选的一个或多个VH CDR′s的VH区中的一种或多种，所述VH CDR′s具有选自SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的氨基酸序列；和/或

抗体VL区，其选自C1-3 VL区(SEQ ID NO.4)和包含一个或多个VLCDR′s的VL区中的一种或多种，所述VL CDR′s具有选自SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的氨基酸序列。

2.根据权利要求1中所述的特异结合成员，其包括含有VH CDR′s的抗体VH区，所述的VH CDR′s具有选自SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12的氨基酸序列，其中特异结合成员与包含C1-3 VH区(SEQ ID NO.2)和C1-3 VL区(SEQID NO.4)的抗体的突触泡蛋白结合区竞争结合突触泡蛋白。

3.根据权利要求1或权利要求2中所述的特异结合成员，其包括C1-3 VH区(SEQ ID NO.2)。

4.根据权利要求3中所述的特异结合成员，其包括C1-3 VL区(SEQ ID NO.4)。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的特异结合成员，其通过等于或强于突触泡蛋白抗原结合位点的亲合力的亲和力与突触泡蛋白结合，所述抗原结合位点由C1-3 VH区(SEQ ID NO.2)和C1-3 VL区(SEQ ID NO.4)形成，所述特异结合成员的亲合力以及抗原结合位点的亲合力在相同条件下测定。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的特异结合成员，其结合氨基酸序列YPFRLHQVYFDAPSC(SEQ ID NO：9)内的表位。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的特异结合成员，其包括scFv抗体分子。

8.根据权利要求1至6中任意一项所述的特异结合成员，其包括抗体恒定区。

9.根据权利要求8中所述的特异结合成员，其包括完整抗体。

10.根据权利要求1至9中任意一项所述的特异结合成员，其包括额外氨基酸，从而除了提供结合抗原的能力外还提供了另外的功能特性。

11.根据权利要求1至10中任意一项所述的特异结合成员，其任选通过肽键或接头与可检测的标记物、酶、或毒素连接。

12.根据权利要求11中所述的特异结合成员，其中所述毒素选自三丁基-锡和胶霉毒素。

13.根据权利要求11中所述的特异结合成员，其中可检测的标记物是FITC。

14.一种分离的核酸，其包含编码根据权利要求1至10中任意一项所述的特异结合成员或特异结合成员的抗体VH区或VL区的核苷酸序列。

15.一种用根据权利要求14中所述的核酸转化的宿主细胞。

16.一种生产特异结合成员或抗体VH或VL区的方法，该方法包括在生产所述的特异结合成员或抗体VH或VL区的条件下，培养根据权利要求15中所述的宿主细胞。

17.根据权利要求16中所述的方法，还包括分离和/或纯化所述的特异结合成员或抗体VH或VL可变区。

18.根据权利要求16或权利要求17中所述的方法，还包括将特异结合成员或抗体VH或VL可变区配制成含有至少一种附加成分的组合物。

19.一种获得结合突触泡蛋白的特异结合成员的方法，该方法包括：

在C1-3 VH区(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列中通过添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，来提供一个或多个VH区，其每个为C1-3 VH区的氨基酸序列变体；任选地将由此提供的一个或多个VH区氨基酸序列变体与一个或多个VL区组合以提供一个或多个VH/VL组合；和/或

在C1-3 VL区(SEQ ID NO.4)的氨基酸序列中通过添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供VL区，其为C1-3 VL区的氨基酸序列变体；并将由此提供的一个或多个VL区氨基酸序列变体与一个或多个VH区组合以提供一个或多个VH/VL区组合；

以及

测试VH区氨基酸序列变体或一个或多个VH/VL组合，来用于鉴定结合突触泡蛋白的特异结合成员。

20.一种获得结合突触泡蛋白的特异结合成员的方法，该方法包括：

提供编码一个或多个VH区的起始核酸，所述VH区或者包括将要被取代的CDR3或者缺乏CDR3编码区，并将所述的起始核酸与编码SEQ IDNO：12的VH CDR3氨基酸序列的供体核酸结合，使得所述供体核酸插入起始核酸的CDR3区中，以便提供编码VH区的产物核酸；或

提供编码一个或多个VL区的起始核酸，所述VL区或者包括将要被取代的CDR3或者缺乏CDR3编码区，并将所述的起始核酸与编码SEQ ID NO：15的VL CDR3氨基酸序列的供体核酸结合，使得所述供体核酸插入起始核酸的CDR3区中，以便提供编码VL区的产物核酸；

表达编码VH区的所述产物核酸的核酸，并任选地将由此产生的VH区与一个或多个VL区组合以提供VH/VL组合，和/或表达编码VL区的所述产物核酸的核酸，并将由此产生的VL区与一个或多个VL区组合以提供VH/VL组合；

选择包含结合突触泡蛋白的VH区或VH/VL组合的特异结合成员；

回收结合突触泡蛋白的所述特异结合成员和/或编码结合突触泡蛋白的特异结合成员的核酸。

21.根据权利要求19或权利要求20中所述的方法，其中结合突触泡蛋白的特异结合成员是包含VH区和VL区的抗体片段。

22.根据权利要求21中所述的方法，其中抗体片段是scFv抗体分子。

23.根据权利要求21中所述的方法，其中抗体片段是Fab抗体分子。

24.根据权利要求22或权利要求23中所述的方法，还包括提供完整抗体中抗体片段的VH区和/或VL区。

25.根据权利要求19至24中任意一项所述的方法，还包括将结合突触泡蛋白的特异结合成员或结合突触泡蛋白的特异结合成员的抗体VH或VL可变区配制到包含至少一种附加成分的组合物中。

26.根据权利要求16至25中任意一项所述的方法，还包括将结合突触泡蛋白的特异结合成员与突触泡蛋白或突触泡蛋白的片段结合。

27.一种方法，其包括将根据权利要求1到13中任意一项所述的结合突触泡蛋白的特异结合成员，与突触泡蛋白或突触泡蛋白片段结合。

28.根据权利要求26或权利要求27中所述的方法，其中所述的结合在体外发生。

29.根据权利要求26至28中任意一项所述的方法，其包括检测特异结合成员与突触泡蛋白或与突触泡蛋白片段结合的量。

30.根据权利要求16至25中任意一项所述的方法，还包括将特异结合成员用于制备治疗以肝纤维化为特征的疾病或病症的药物。

31.根据权利要求1至12中任意一项所述的特异结合成员用于制备治疗以肝纤维化为特征的疾病或病症的药物的用途。

32.一种治疗以肝纤维化为特征的疾病或病症的方法，该方法包括将根据权利要求1至12中任意一项所述的特异结合成员施用于患有所述疾病或病症或处于发展所述疾病或病症的危险的患者。

33.根据权利要求32中所述的方法，其中所述特异结合成员指导药物组合物递送到靶肝星形细胞。

34.根据权利要求1至13中任意一项所述的特异结合成员和一种或多种允许测定所述的特异结合成员结合到肝星形细胞的试剂，在制备用于检测以肝纤维化为特征的疾病或病症的诊断试剂中的用途。

35.一种诊断以肝纤维化为特征的疾病或病症的方法，该方法包括将根据权利要求1至13中任意一项所述的特异结合成员和一种或多种允许测定所述的特异结合成员与肝星形细胞结合的试剂，施用于患有所述疾病或病症或处于发展所述疾病或病症的危险的患者。

36.一种诊断试剂盒，其包括根据权利要求1至13中任意一项所述的特异结合成员和一种或多种允许测定所述的特异结合成员与肝星形细胞结合的试剂。

37.一种药物组合物，包括有效量的根据权利要求1-12所述的特异结合成员作为活性成分，连同可药用的赋形剂。

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