PT1545597E

PT1545597E - Composições imunoestimulantes e métodos de estimulação de uma resposta imunológica

Info

Publication number: PT1545597E
Application number: PT03808061T
Authority: PT
Inventors: Ross M Kedl; George W Griesgraber; Isidro Angelo E Zarraga
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 2002-08-15
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2010-12-29
Also published as: CA2495570A1; JP4860923B2; EP2269632B1; WO2004032829A3; MXPA05001647A; EP2269632A2; DK1545597T3; KR101088615B1; AU2003299863A1; ES2355819T3; JP5491364B2; CA2495570C; KR20050026709A; AU2003299863A2; NZ538812A; US7427629B2; US20040091491A1; CN1671412B; JP2011057699A; CN1671412A

Description

1

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES IMUNOESTIMULANTES E MÉTODOS DE ESTIMULAÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA"

Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório de Patente U.S. n° 60/403, 846, depositado em 15 de Agosto de 2002.

Os modificadores da resposta imunológica ("IRMs") incluem compostos que possuem uma potente actividade de imunomodulação, incluindo mas não se limitando a actividade antiviral e antitumoral. Determinados IRMs modulam a produção e a secreção de citoquinas. Por exemplo, determinados compostos IRM induzem a produção e a secreção de citoquinas como, por exemplo, interferões de Tipo I, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, MIP-1 e/ou MCP-1. Como outro exemplo, determinados compostos IRM podem inibir a produção e a secreção de determinadas citoquinas de TH-2, como as IL-4 e IL-5. Além disso, alguns compostos IRM são referidos como suprimindo os IL-1 e TNF (Patente U.S. n° 6,518, 265).

Determinados IRMs são moléculas orgânicas pequenas (por exemplo, massa molecular inferior a cerca de 1000 Daltons, em certos casos inferior a cerca de 500 Daltons, por oposição às grandes proteínas ou péptidos biológicos), como os divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. n‘ 4,929,624; 5,266,575; 5, 389, 640; 5,741,908; 6, 110,929; 4,988,815; 5,268,376; 5,395,937; 5,756,747; 6,194,425; 5,037,986; 5, 346, 905; 5,446,153; 5,939,090; 6,245,776; 5,175,296; 5,352,784; 5,482,936; 6,039,969; 6,331,539; 4,689,338; 5,238,944; 5,367,076; 5,693,811; 6,083,505; 6,376,669; 6,451,810; 6,525,064; 6,545,016; 6,545,017; 6,558,951; 2 6,573,273; Patente Europeia 0 394 026; Publicação de Patente U.S. n° 2002/0055517; e Publicações Internacionais de Patente n° WO 01/74343; WO 02/46188; WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; WO 02/46749 WO 02/102377; WO 03/020889; WO 03/043572 e WO 03/045391.

Exemplos adicionais de IRMs de molécula pequena incluem determinados derivados de purina (como os descritos nas Patentes U.S. n° 6,376,501 e 6,028,076), determinados derivados de amida de imidazoquinolina (como os descritos na Patente U.S. n° 6,069,149), determinados derivados de benzimidazole (como os descritos na Patente U.S. n° 6,387,938) e determinados derivados de uma 4-aminopirimidina fundida com um anel heterociclico de cinco membros contendo azoto (como os derivados de adenina descritos nas Patentes U.S. n° 6,376,501; 6,028,076 e 6,329,381; e na WO 02/08595).

Outros IRMs incluem moléculas biológicas grandes, como as sequências de oligonucleótidos. Algumas sequências de oligonucleótidos IRM contêm dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) e são descritas, por exemplo, na Patente U.S. n° 6,194,388; 6,207,646; 6,239,116; 6,339,068; e 6,406,705. Alguns oligonucleótidos contendo CpG podem incluir motivos estruturais imunomoduladores sintéticos como os descritos, por exemplo, na Patente U.S. n° 6,426,334 e 6,476,000. Outras sequências de nucleótidos IRM carecem de CpG e são descritas, por exemplo, na Publicação Internacional de Patente n° WO 00/75304.

Determinados IRMs podem actuar como agonistas do receptor do tipo Toll (TLR). Alguns IRMs de moléculas pequenas podem 3 actuar através de um ou mais dos TLRs 2, 4, 6, 7 e 8. 0 CpG pode actuar através do TLR 9.

Ao estimular determinados aspectos do sistema imunitário, bem como aos suprimir outros aspectos (ver, por exemplo, Patentes U.S. n° 6,039,969 e 6,200,592), os IRMs podem ser utilizados para tratar muitas doenças. Por exemplo, o IRM de molécula pequena imiquimod é útil para o tratamento de verrugas genitais e perianais externas provocadas pelo papilomavirus humano [ver, por exemplo, Tomai et al., Antiviral Research 28(3): 253-64 (1995)]. Exemplos de outras doenças que podem ser tratadas utilizando IRMs incluem, mas não se limitam a, carcinoma de células basais, eczema, trombocitemia essencial, hepatite B, esclerose múltipla, doenças neoplásicas, psoriase, artrite reumatóide, herpes simplex de tipo I e herpes simplex de tipo II.

Os compostos IRM também podem modular a imunidade humoral mediante a estimulação da produção de anticorpos pelas células B. Além disso, vários IRMs têm mostrado ser úteis como adjuvantes de vacinas (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 6,083,505 e 6,406,705). A WO 00/40228 descreve determinados compostos IRM para o tratamento de condições nas superfícies mucosas ou por baixo destas.

Constatou-se agora que os IRMs, especialmente os IRMs de molécula pequena e agonistas de TLR 2, 4, 6, 7 e 8 são surpreendentemente eficazes na estimulação de uma resposta imunológica quando emparelhados química ou fisicamente com um antigénio para formar uma composição imunoestimulante. O efeito imunoestimulante de uma composição particular pode 4 ser maior do que o efeito imunoestimulante do mesmo antigénio e do mesmo ou de um IRM comparável como os presentes na composição, mas administrados numa forma não emparelhada. A presente invenção proporciona uma composição imunoestimulante que inclui uma porção modificadora da resposta imunológica (IRM) emparelhada com uma porção antigénica, pelo que a difusão independente da porção modificadora da resposta imunológica em relação à porção antigénica está limitada, em que a porção modificadora da resposta imunológica é um composto da fórmula:

em que:

Ri é um grupo de ligação; R2 é seleccionado do grupo consistindo de: -hidrogénio; -alquilo; -alcenilo; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -alquil-O-alquilo; -alquil-S-alquilo; -alquil-O-arilo; -alquil-S-arilo; -alquil-O-alcenilo; -alquil-S-alcenilo; e -alquilo ou alcenilo substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: 5 -OH; -halogéneo; -N(R5)2; -CO-N (R5) 2; -CS-N (R5) 2; -so2-n (R5) 2; -NR5-CO-alquilo C1-10; -NR5-CS-alquilo C1-10; -NR5-S02-alquilo C1-10; -CO-alquilo Ci_i0; -CO-O-alquilo C1-10; -N3; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -heterociclilo; -heterociclilo substituído; -CO-arilo; -C0-(arilo substituído); -CO-heteroarilo; e -CO-(heteroarilo substituído); R3 e R4 são cada um independentemente: -hidrogénio; -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -n(r5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um grupo arilo ou heteroarilo fundido que está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: 6 -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N(R5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um anel saturado de 5 a 7 membros fundido, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos e opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N(R5)2; e cada R5 é independentemente hidrogénio ou alquilo C1-10.

Nalgumas formas de realização, a porção de IRM pode ser, ou ser derivada de, um agonista do receptor de tipo Toll 2, receptor de tipo Toll 4, receptor de tipo Toll 6, receptor de tipo Toll 7 ou receptor de tipo Toll 8. Noutras formas de realização, a porção de IRM pode incluir, ou ser derivada de, uma amina de imidazoquinolina; uma amina de tetra-hidroimidazoquinolina; uma amina de imidazopiridina; uma amina de imidazopiridina substituída com éter de arilo; uma amina de imidazoquinolina ligada 1,2 em ponte; uma amina de cicloalquilimidazopiridina fundida em 6,7; uma amina de imidazonaftiridina; uma amina de tetra- hidroimidazonaftiridina; uma amina de oxazoloquinolina; uma amina de tiazoloquinolina; uma amina de oxazolopiridina; uma amina de tiazolopiridina; uma amina de oxazolonaftiridina; ou uma amina de tiazolonaftiridina. 7

Ainda noutras formas de realização, a porção de IRM pode incluir, ou ser derivada de, uma unidade orgânica que tem uma massa molecular inferior a cerca de 1000 Daltons. A porção antigénica pode incluir uma sequência de aminoácidos, uma sequência de nucleótidos, um lipopolissacárido, um prião, uma bactéria, um vírus ou um fungo.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um conjugado imunoestimulante da fórmula:

em que:

Ri é um grupo de ligação; R2 é seleccionado do grupo consistindo de: -hidrogénio; -alquilo; -alcenilo; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -alquil-O-alquilo; -alquil-S-alquilo; -alquil-O-arilo; -alquil-S-arilo; -alquil-O-alcenilo; -alquil-S-alcenilo; e 8 -alquilo ou alcenilo substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -OH; -halogéneo; -N(R5)2; -CO-N (R5) 2; -CS-N (R5) 2; -so2-n (R5) 2; -NR5-CO-alquilo Ci_i0; -NR5-CS-alquilo Ci_i0; -NR5-S02-alquilo C1-10; -CO-alquilo C1-10; -CO-O-alquilo C1-10; -n3; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -heterociclilo; -heterociclilo substituído; -CO-arilo; -C0-(arilo substituído); -CO-heteroarilo; e -C0-(heteroarilo substituído); R3 e R4 são cada um independentemente: -hidrogénio; -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -n(r5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um grupo arilo ou heteroarilo fundido que está opcionalmente 9 substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N(R5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um anel saturado de 5 a 7 membros fundido, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos e opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N (R5) 2; e cada R5 é independentemente hidrogénio ou alquilo C1-10; e n é 1 a 10; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para estimular as células T de um doente. O método inclui proporcionar uma composição imunoestimulante de acordo com a reivindicação 1; permitir que a composição imunoestimulante se ligue às células que apresentam o antigénio, activando deste modo as células apresentadoras de antigénio; e permitir que as células apresentadoras de antigénio activadas estimulem as células T do doente. As células T do doente podem ser estimulados in vivo ou in vitro. 10

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para estimular células produtoras de anticorpo in vitro. O método inclui proporcionar uma composição imunoestimulante de acordo com a reivindicação 1; e permitir que a composição imunoestimulante se ligue às células produtoras de anticorpos. Várias outras caracteristicas e vantagens da presente invenção tornar-se-ão prontamente evidentes com referência à seguinte descrição detalhada, exemplos, reivindicações e desenhos apensos. Em vários locais ao longo da descrição é proporcionada orientação através de listas de exemplos. Em cada caso, a referida lista serve apenas como um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva. A Figura 1 mostra a percentagem de células T CD8+ activadas especificas para ovalbumina geradas por ratos imunizados com ovalbumina, como se descreve no Exemplo 4. A Figura 2 mostra a percentagem de células T CD8+ activadas especificas para ovalbumina geradas por ratos imunizados por via subcutânea com um conjugado IRM-ovalbumina, como se descreve no Exemplo 4. A Figura 3 mostra a percentagem de células T CD8+ activadas especificas para ovalbumina geradas por ratos imunizados por via intraperitoneal com um conjugado de IRM-ovalbumina, como se descreve no Exemplo 4. A Figura 4 mostra a produção de interferão-γ induzida por ratos imunizados com ovalbumina, como se descreve no Exemplo 5. 11 A Figura 5 mostra a produção de interferão-γ induzida por ratos imunizados por via subcutânea com um conjugado de IRM-ovalbumina, como se descreve no Exemplo 5. A Figura 6 mostra a produção de interferão-γ induzida por ratos imunizados por via intraperitoneal com um conjugado de IRM-ovalbumina, como se descreve no Exemplo 5. A Figura 7 mostra um aumento na resposta imunológica especifica para o antigénio após se proporcionar uma imunização secundária com um conjugado de IRM-ovalbumina, como se descreve no Exemplo 6. A Figura 8 mostra a redução do tamanho do tumor após imunização com um conjugado de IRM-antigénio especifico para o tumor, como se descreve no Exemplo 7. A Figura 9 mostra a expansão de células T CD8+ activadas especificas para o antigénio do tumor, no baço após imunização com conjugado de IRM-antigénio do tumor, como se descreve no Exemplo 8. A Figura 10 mostra a expansão de células T CD8+ activadas especificas para o antigénio do tumor, no tumor após imunização com conjugado de IRM-antigénio do tumor, como se descreve no Exemplo 8. A Figura 11 mostra a percentagem de células apresentadoras de antigénio que apresentam Kb/SIINFEKL após imunização com ovalbumina, como se descreve no Exemplo 9. A Figura 12 a percentagem de células apresentadoras de antigénio que apresentam Kb/SIINFEKL após imunização com 12 ovalbumina mais IRM não conjugado, como se descreve no Exemplo 9. A Figura 13 a percentagem de células apresentadoras de antigénio que apresentam Kb/SIINFEKL após imunização com conjugado de IRM-ovalbumina, como se descreve no Exemplo 9. A Figura 14 mostra as taxas de sobrevivência de ratos imunizados com ovalbumina ou um conjugado de IRM-ovalbumina após estimulo com células tumorais que expressam ovalbumina, como se descreve no Exemplo 10. A Figura 15 mostra a expansão de células T CD8+ especificas para o antigénio após imunização com ovalbumina, como se descreve no Exemplo 11. A Figura 16 mostra a expansão de células T CD8+ especificas para o antigénio num indivíduo após imunização com uma suspensão coloidal de IRM e de ovalbumina, como se descreve no Exemplo 11. A Figura 17 mostra a expansão de células T CD8+ específicas para o antigénio num segundo indivíduo após imunização com uma suspensão coloidal de IRM e de ovalbumina, como se descreve no Exemplo 11. A Figura 18 mostra a expansão de células T CD8+ específicas para o antigénio como resultado da imunização com conjugados de IRM-antigénio utilizando dois IRMs diferentes. A Figura 19 mostra o número de vezes de expansão de células T CD8+ em ratos imunizados com várias composições 13 imunoestimulante em relação à imunização com ovalbumina sozinha. A presente invenção proporciona composições imunoestimulantes (ISCs), métodos de preparação de composições imunoestimulantes, métodos de induzir uma resposta imunológica utilizando composições imunoestimulante e métodos de aumentar a actividade imunoestimulante de um IRM emparelhando o IRM com outro componente imunoestimulante (por exemplo, um antigénio). As ISCs podem ser concebidas para desencadear uma resposta imunológica mediada por células, uma resposta imunológica humoral ou ambas.

Como assinalado acima, muitos IRMs podem ser utilizados como um adjuvante de vacina para aumentar a resposta imunológica gerada contra um ou mais antigénios também apresentados na vacina. Surpreendentemente, determinadas ISCs de acordo com a presente invenção podem proporcionar uma resposta imunológica ainda maior do que uma vacina contendo o mesmo ou um IRM comparável e o mesmo antigénio, mas numa forma não emparelhada. Num caso, uma ISC proporcionou uma resposta imunológica cerca de cinco vezes maior do que a resposta imunológica gerada por uma vacina que incluía o mesmo antigénio e Um IRM comparável.

Como aqui utilizado, o termo "emparelhado" e suas variações refere-se a componentes associados em qualquer forma química ou física, de modo que os componentes não se podem dispersar livremente um do outro. Por exemplo, dois componentes podem ser ligados de forma covalente um ao outro, pelo que os dois componentes são incapazes de se dispersar ou difundir separadamente. 0 emparelhamento também pode ser alcançado, por exemplo, através de ligação 14 de afinidade não covalente, ligação iónica, afinidade hidrófila ou hidrófoba, ou retenção fisica. O emparelhamento distingue-se explicitamente de uma mistura simples de antigénio e de adjuvante numa vacina convencional. Numa mistura simples, os componentes podem ser livres de se dispersar independentemente no ambiente vacinado. Como usado aqui, "emparelhado" e suas variações confere uma compreensão de que os componentes emparelhados mantêm uma associação química ou física após imunização. A porção modificadora da resposta imunológica pode ser, ou ser derivada de, qualquer IRM adequado. Os IRMs adequados incluem moléculas orgânicas pequenas, isto é, moléculas com uma massa molecular inferior a cerca de 1000 Daltons, embora em algumas formas de realização o IRM possa ter uma massa molecular inferior a cerca de 700 Daltons e, nalguns casos, o IRM possa ter uma massa molecular de cerca de 500 Daltons a cerca de 700 Daltons. Os IRMs adequados também incluem agonistas de um ou mais dos TLRs 2, 4, 6, 7, 8 e 9. Nalgumas formas de realização, os IRMs adequados incluem, mas não se limitam aos compostos IRM de molécula pequena descritos acima e seus derivados. Os IRMs de molécula pequena adequados, possuindo uma 2-aminopiridina fundida com um anel heterocíclico de cinco membros contendo azoto incluem, mas não se limitam a, aminas de imidazoquinolina incluindo mas não se limitando a, aminas de imidazoquinolina substituídas com amida, aminas de imidazoquinolina substituídas com sulfonamida, aminas de imidazoquinolina substituídas com ureia, aminas de imidazoquinolina substituídas com éter de arilo, aminas de imidazoquinolina substituídas com éter heterocíclico, aminas de imidazoquinolina substituídas com amido éter, aminas de imidazoquinolina substituídas com sulfonamido éter, éteres de imidazoquinolina substituídos com ureia e 15 aminas de imidazoquinolina substituídas com tioéter; aminas de tetra-hidroimidazoquinolina, incluindo mas não se limitando a aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com amida, aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com sulfonamida, aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com ureia, aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com éter de arilo, aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com éter heterocíclico, aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com amido éter, aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com sulfonamido éter, éteres de tetra-hidroimidazoquinolina substituídos com ureia, e aminas de tetra-hidroimidazoquinolina substituídas com tioéter; aminas de imidazopiridina, incluindo, mas não se limitando a, aminas de imidazopiridina substituídas com amida, aminas de imidazopiridina substituídas com sulfonamido, aminas de imidazopiridina substituídas com ureia; aminas de imidazopiridina substituídas com éter de arilo, aminas de imidazopiridina substituídas com éter heterocíclico, aminas de imidazopiridina substituídas com amido éter, aminas de imidazopiridina substituídas com sulfonamido éter, éteres de imidazopiridina substituídos com ureia e aminas de imidazopiridina substituídas com tioéter; aminas de imidazoquinolina com ligação em ponte 1,2; aminas de cicloalquilimidazopiridina fundidas em 6,7; aminas de imidazonaftiridina; aminas de tetra- hidroimidazonaftiridina; aminas de oxazoloquinolina; aminas de tiazoloquinolina; aminas de oxazolopiridina; aminas de tiazolopiridina; aminas de oxazolonaftiridina; e aminas de tiazolonaftiridina.

Outros IRMs de molécula pequena adequados incluem determinados derivados de purina, determinados derivados de 16 amida de imidazoquinolina, determinados derivados de benzimidazole e determinados derivados de 4-aminopirimidina fundida com um anel heterocíclico de cinco membros contendo azoto (por exemplo, derivados de adenina) descritos acima.

Outros IRMs adequados incluem CpGs e outras sequências de nucleótidos IRM que carecem de CpG descritos acima. A porção antigénica pode incluir qualquer material que suscite uma resposta imunológica mediada por células, uma resposta imunológica humoral ou ambas. Os materiais antigénicos adequados incluem, mas não se limitam a péptidos; polipéptidos; lípidos; glicolípidos; polissacáridos; hidratos de carbono; polinucleótidos; priões; bactérias, virus ou fungos vivos ou inactivados; e imunogénios, toxinas ou toxóides bacterianos, virais, fúngicos, protozoários, provenientes de tumor ou provenientes de organismo.

As doenças para as quais as composições imunoestimulantes da presente invenção podem ser utilizados como tratamentos incluem, mas não se limitam a: (a) doenças virais, como as verrugas genitais, verrugas vulgares, verrugas plantares, hepatite B, hepatite c, virus herpes simplex de tipo I e tipo II, molusco contagioso, varíola, HIV, CMV, VZV, rinovírus, adenovírus, coronavírus, influenza, para-influenza; (b) doenças bacterianas, como as tuberculose e tuberculose aviária, lepra; (c) outras doenças infecciosas, como as doenças provocadas por fungos, clamídia, cândida, aspergillus, meningite criptocócica, pneumocystis carinii, 17 criptosporidiose, histoplasmose, toxoplasmose, infecção com tripanossoma, leishmaniose; (d) doenças neoplásicas, como as neoplasias intra-epiteliais, displasia cervical, ceratose actinica, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas, leucemia de células ciliadas, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinoma das células renais, leucemia mielógena, mieloma múltiplo, linfoma de não Hodgkin, linfoma das células T cutâneas e outros cancros; (e) doenças mediadas por TH-2, atópicas e autoimunes, como a dermatite atópica ou eczema, eosinofilia, asma, alergia, rinite alérgica, lúpus eritematoso sistémico, trombocitemia essencial, esclerose múltipla, síndrome de Ommen; lúpus discóide, alopecia areata, inibição da formação de quelóides e outros tipos de formação de cicatrizes, e melhoramento da cicatrização de feridas, incluindo feridas crónicas; e (f) como um adjuvante de vacina para serem utilizados conjuntamente com qualquer material que suscite uma resposta imunológica humoral e/ou mediada por células, como imunogénios virais e bacterianos vivos e imunogénios, toxóides, toxinas, polissacáridos, proteínas, glicoproteínas, péptidos, vacinas celulares, vacinas de ADN, proteínas recombinantes, glicoproteínas e péptidos virais, derivados de tumor, protozoários, derivados de organismo, fúngicos e bacterianos inactivados, para serem utilizados conjuntamente com, por exemplo, BCG, cólera, peste, tifoide, hepatite A, B e C, gripe A e B, para-influenza, poliomielite, raiva, sarampo, papeira, rubéola, febre-amarela, tétano, difteria, hemophilus influenza B, tuberculose, vacinas meningocóccicas e pneumocócicas, adenovírus, HIV, varicela, citomegalovírus, dengue, leucemia felina, peste das galinhas, HSV- 1 e HSV-2, cólera 18 suína, encefalite Japonesa, vírus sincicial respiratório, rotavírus, vírus de papiloma e febre-amarela.

As composições imunoestimulantes da invenção incluem uma quantidade eficaz de actividade biológica de ambas, a porção modificadora da resposta imunológica e a porção antigénica. Uma quantidade eficaz de actividade biológica da porção de resposta imunológica ("actividade IRM") inclui uma ou mais dos seguintes: um aumento na produção de citoquinas pelas células T, activação de células T específicos para um antigénio e a activação de células dendríticas. Uma quantidade eficaz de actividade biológica da porção antigénica ("actividade antigénica") inclui uma ou mais dos seguintes: geração de anticorpos específicos para o antigénio por células B e produção de células apresentadoras de antigénio que apresentam o antigénio. As composições imunoestimulante da presente invenção podem ser combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável, um ou mais excipientes, ou alguma combinação dos anteriores, de modo a formar uma composição farmacêutica.

Embora a quantidade exacta de composto activo utilizada numa composição farmacêutica da invenção varie de acordo com factores conhecidos dos especialistas na técnica, como a natureza física e química da composição imunoestimulante, a natureza do veículo, a natureza do sistema imunitário do indivíduo (por exemplo, suprimido, comprometido, estimulado) e o regime de dosagem pretendido, antecipa-se que as composições farmacêuticas da invenção conterão uma porção do modificador de resposta imunológica suficiente para proporcionar uma dose de cerca de 100 ng/kg a cerca de 50 mg/kg, preferencialmente de cerca de 10 yg/kg a cerca de 5 mg/kg, de IRM no indivíduo. 19

Pode ser utilizada uma variedade de formas de dosagem, como comprimidos, pastilhas, cápsulas, formulações parentéricas, xaropes, cremes, pomadas, formulações de aerossol, emplastros transdérmicos ou emplastros transmucosa.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas como o único agente terapêutico num regime de tratamento, ou a composição farmacêutica pode ser administrada em combinação com outra composição farmacêutica ou com outros agentes activos, incluindo outros modificadores da resposta imunológica, antivirais, antibióticos, anticorpos, proteínas, péptidos, oligonucleótidos, etc.

Nalgumas formas de realização, a porção modificadora da resposta imunológica imunoestimulante pode ser acoplada de modo covalente à porção antigénica para formar um conjugado imunoestimulante. Como aqui utilizado, "acoplado de modo covalente" refere-se ao acoplamento, directo e indirecto, de dois componentes exclusivamente através de ligações covalentes. 0 acoplamento covalente directo pode envolver ligação covalente directa entre um átomo da porção modificadora da resposta imunológica e um átomo da porção antigénica. Alternativamente, o acoplamento covalente pode ocorrer através de um grupo de ligação ligado de um modo covalente à porção IRM, à porção antigénica, ou a ambas, que facilita a ligação covalente da porção IRM com a porção antigénica. 0 acoplamento covalente indirecto pode incluir um terceiro componente tal como, por exemplo, um suporte sólido ao qual se ligam separadamente, de modo covalente, a porção modificadora da resposta imunológica e a porção antigénica. Também, "acoplado de modo covalente" e "ligado de modo covalente" são utilizados de forma intermutável. 20

Um conjugado imunoestimulante pode incluir uma unidade modificadora da resposta imunológica como a porção IRM e uma unidade contendo antigénio como a porção antigénica. Quando se sintetiza um conjugado imunoestimulante, cada um da unidade modificadora de resposta imunológica, do grupo de ligação e da unidade contendo antigénio podem ser seleccionados de modo a gue o conjugado imunoestimulante resultante possua uma guantidade eficaz de actividade IRM e uma quantidade eficaz de actividade antigénica. O grupo de ligação pode ser qualquer grupo de ligação orgânico que permita que a unidade contendo o antigénio seja acoplada de modo covalente à unidade modificadora da resposta imunológica enquanto se mantém uma quantidade eficaz de actividade IRM e actividade antigénica. Nalgumas formas de realização, o grupo de ligação pode ser seleccionado para criar espaço suficiente entre o núcleo activo da unidade modificadora da resposta imunológica e a unidade contendo antigénio, do modo a que a unidade contendo antigénio não interfira com a interacção biologicamente eficaz entre o núcleo activo e as células T que resulta em actividade IRM, como a produção de citoquinas. O grupo de ligação inclui um grupo reactivo capaz de reagir com o antigénio para formar uma ligação covalente. Os grupos reactivos adequados incluem aqueles discutidos em Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, Capitulo 2 "The Chemistry of Reactive Functional Groups", 137-166. Por exemplo, o grupo de ligação pode reagir com uma amina primária (por exemplo, um éster de N-hidroxissuccinimidilo ou um éster N-hidroxissulfos-succinimidilo); ele pode reagir com um grupo sulfidrilo (por exemplo, uma maleimida ou um iodoacetilo), ou pode ser 21 um grupo fotorreactivo (por exemplo uma azida de fenilo, incluindo 4-azidofenilo, 2-hidroxi-4-azidofenilo, 2-nitro-4-azidofenilo e 2-nitro-3-azidofenilo) .

Um grupo quimicamente activo acessível para acoplamento covalente ao grupo de ligação inclui grupos que podem ser utilizados directamente para o acoplamento covalente ao grupo ou grupos de ligação que podem ser modificados de modo a estar disponível para acoplamento covalente ao grupo de ligação. Por exemplo, os grupos quimicamente activos adequados incluem, mas não se limitam a, aminas primárias e grupos sulfidrilo. Uma vez que determinadas unidades contendo antigénio, por exemplo, proteínas e outros péptidos, podem incluir uma multiplicidade de grupos quimicamente activos, determinadas ISCs de acordo com a presente invenção podem incluir uma multiplicidade de unidades IRM conjugadas com uma unidade contendo antigénio particular. Métodos de Preparação de Conjugados Imunoestimulantes

Os conjugados imunoestimulantes de acordo com a presente invenção podem ser geralmente preparados por reacção de um modificador da resposta imunológica com um agente de reticulação e fazendo depois reagir o intermediário resultante com um antigénio. Muitos agentes de reticulação adequados para a preparação de bioconjugados são conhecidos e muitos encontram-se comercialmente disponíveis. Ver, por exemplo, Hermanson, G. (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press.

Os conjugados imunoestimulantes de acordo com a presente invenção também podem ser preparados, por exemplo, segundo o método ilustrado no Esquema Reaccional I, no qual a unidade contendo antigénio é ligada à unidade IRM através 22 de Ri. No passo (1) do Esquema Reaccional I um composto de fórmula III é feito reagir com um agente de reticulaçâo heterobifuncional de Fórmula IV para proporcionar um composto de II. RA e RB contêm, cada um, um grupo funcional que é seleccionado para reagir com o outro. Por exemplo, se Ra contém uma amina primária, então pode ser seleccionado um agente de reticulaçâo heterobifuncional no qual RB contém um grupo funcional reactivo com amina, como um éster N-hidroxissulfossuccinimidilo. RA e RB podem ser seleccionados de modo a que eles reajam para proporcionar o grupo de ligação desejado no conjugado.

Os métodos de preparação de compostos de Fórmula III em que Ra contém um grupo funcional são conhecidos. Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 4,689,338; 4,929,624; Patente U.S. n° 5,268,376; 5,389,640; 5,352,784; 5,494,916; 4,988,815; 5,367,076; 5,175,296; 5,395,937; 5,741,908; 5,693,811; 6,069,149; 6,194,425; e Patente U.S. 6,331,539 e Publicações Internacionais WO 00/76505; WO 00/76518; WO 02/46188, WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; e WO 02/46194.

Conhece-se muitos agentes de reticulaçâo heterobifuncionais e muitos encontram-se comercialmente disponíveis. Ver por exemplo, Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, Capítulo 5 "Heterobifunctional Croos-Linkers", 229-285. A reacção pode ser geralmente realizada por combinação de uma solução do composto de Fórmula III num solvente adequado como N,N-dimetilformamida com uma solução do agente de reticulaçâo heterobifuncional de Fórmula IV num solvente adequado como N,N-dimetilformamida. A reacção pode ser realizada à temperatura ambiente. O produto de Fórmula II pode ser então isolado usando técnicas convencionais. 23

No passo (2) do Esquema Reaccional I, um composto de Fórmula II que contém o grupo reactivo ZA é feito reagir com o antigénio para proporcionar o conjugado imunoestimulante de Fórmula I. A reacção pode ser geralmente realizada combinando uma solução do composto de Fórmula II num solvente adequado, como dimetilsulfóxido com uma solução do antigénio num tampão adequado, como PBS. A reacção pode ser realizada à temperatura ambiente ou a uma temperatura reduzida (~4°C). Se ZA é um grupo fotorreactivo, como uma azida de fenilo, a mistura reaccional será então exposta a luz UV de comprimento de onda longo durante um intervalo de tempo adequado para efectuar a reticulação (por exemplo, 10-20 minutos). O número médio de unidades modificadoras de resposta imunológica por cada unidade de antigénio pode ser controlado ajustando a quantidade de composto de Fórmula II utilizado na reacção. O conjugado de resposta imunológica de Fórmula I pode ser isolado e purificado usando técnicas convencionais.

Esquema Reaccional I

'4 III IV II

I 24

Alternativamente, um composto de Fórmula II pode ser sintetizado sem utilizar um agente de reticulaçâo heterobifuncional. Desde que o composto de Fórmula II contenha o grupo reactivo ZA, este pode ser feito reagir com o antigénio utilizando o método do passo (2) acima, para proporcionar um conjugado imunoestimulante.

Como aqui utilizado, os termos "alquilo", "alcenilo" e o prefixo "alqu-" inclui grupos de cadeia linear, de cadeia ramificada e cíclicos, isto é, cicloalquilo e cicloalcenilo. A menos que especificado em contrário, estes grupos contêm desde 1 a 20 átomos de carbono, com os grupos alcenilo a conter de 2 a 20 átomos de carbono. Os grupos preferidos têm um total de até 10 átomos de carbono. Os grupos cíclicos podem ser monocíclicos ou policíclicos e têm preferencialmente desde 3 a 10 átomos de carbono no anel. Exemplos de grupos cíclicos incluem ciclopropilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclopropilmetilo e adamantilo. O termo "haloalquilo" é abrangente de grupos que estão substituídos com um ou mais átomos de halogéneo, incluindo grupos perfluorados. Isto também se aplica aos grupos que compreendem o prefixo "halo-". Exemplos de grupos haloalquilo apropriados são o clorometilo e trifluorometilo. O termo "arilo" como aqui utilizado inclui anéis ou sistemas anelares carbocíclicos aromáticos. Exemplos de grupos arilo incluem fenilo, naftilo, bifenilo, fluorenilo e indenilo. O termo "heteroarilo " inclui anéis aromáticos ou sistemas anelares que contêm pelo menos um heteroátomo no anel (por exemplo, O, S, N) . Os grupos heteroarilo adequados incluem furilo, tienilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, isoindolilo, triazolilo, 25 pirrolilo, tetrazolilo, imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, carbazolilo, benzoxazolilo, pirimidinilo, benzimidazolilo, quinoxalinilo, benzotiazolilo, naftiridinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, purinilo e quinazolinilo. "Heterociclilo" inclui anéis ou sistemas anelares não-aromáticos que contêm pelo menos um heteroátomo no anel (por exemplo, 0, S, N) e inclui todos os derivados completamente saturados e parcialmente insaturados dos grupos heteroarilo mencionados acima. Os exemplos de grupos heterocíclicos incluem pirrolidinilo, tetra-hidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo e imidazolidinilo.

Os grupos arilo, heteroarilo e heterociclico podem estar não substituídos ou substituídos com um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo constituído de alquilo, alcoxilo, metilenodioxilo, etilenodioxilo, alquiltio, haloalquilo, haloalcoxilo, haloalquiltio, halogéneo, nitro, hidroxilo, mercapto, ciano, carboxilo, formilo, arilo, ariloxilo, ariltio, arilalcoxilo, arilalquiltio, heteroarilo, heteroariloxilo, heteroariltio, heteroarilalcoxilo, heteroarilalquiltio, amino, alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, heterocicloalquilo, alquilcarbonilo, alcenilcarbonilo, alcoxicarbonilo, haloalquilcarbonilo, haloalcoxicarbonilo, alquiltiocarbonilo, arilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, ariltiocarbonilo, heteroariltiocarbonilo, alcanoiloxilo, alcanoiltio, alcanoilamino, arilcarboniloxilo, arilcarboniltio, alquilaminossulfonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, arildiazinilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, arilalquilsulfonilamino, 26 26 alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, alquilsulfonilamino, ari1sulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilaminocarbonilamino, arilaminocarbonilamino, alcenilcarbonilamino, arilalquilcarbonilamino, heteroarilalquilcarbonilamino, alcenilsulfonilamino, arilalquilsulfonilamino, heteroarilalquilsulfonilamino, alcenilaminocarbonilamino, arilalquilaminocarbonilamino, heteroarilaminocarbonilamino, heteroarilalquilaminocarbonilamino e, no caso de heterociclilo, oxo. Se outros grupos são descritos como sendo "substituídos" ou "opcionalmente substituídos", então esses grupos também podem estar substituídos com um ou mais dos substituintes acima enumerados.

Determinados substituintes são geralmente preferidos. Por exemplo, os grupos R2 preferidos incluem hidrogénio, grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono (isto é, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo e ciclopropilmetilo) e grupos alcoxialquilo (por exemplo, metoxietilo e etoximetilo). Preferencialmente, R3 e R4 são independentemente hidrogénio ou metilo ou R3 e R4 ligam-se em conjunto para formar um anel benzeno, um anel de piridina, um anel saturado de 6 membros ou um anel saturado de 6 membros contendo um átomo de azoto. Um ou mais destes substituintes preferidos, se presentes, podem estar presentes nos compostos da invenção em qualquer combinação.

Nalgumas formas de realização, os conjugados imunoestimulante podem incluir uma estrutura de suporte sólido à qual são ligadas a porção antigénica e a porção IRM. Nalgumas formas de realização, a porção IRM, porção antigénica, ou ambas, podem estar ligadas de modo covalente 27 ao suporte sólido utilizando um grupo de ligação como os descritos acima. 0 suporte sólido pode incluir, por exemplo, esferas de agarose ou partículas de ouro. 0 suporte sólido pode ser então utilizado para co-administrar a porção IRM e a porção antigénica ligadas à população apropriada de células alvo. Os métodos para fixar as biomoléculas nos suportes sólidos são conhecidos na técnica. Os protocolos para imobilizar biomoléculas em suportes sólidos são bem conhecidos na técnica e os reagentes adequados estão disponíveis a partir de fontes comerciais.

As composições imunoestimulante de acordo com a presente invenção podem conter associações químicas entre a porção IRM e a porção antigénica diferente do acoplamento covalente. Por exemplo, uma ISC pode incluir uma interacção de afinidade entre a porção antigénica e a porção IRM. A afinidade avidina-biotina representa um exemplo de uma interacção não covalente que pode ser utilizada para emparelhar uma porção antigénica com uma porção IRM. Uma molécula de biotina pode ser quimicamente ligada a um antigénio por intermédio de um de um certo número de grupos funcionais presentes em aminoácidos, por exemplo, num antigénio proteico (por exemplo, grupos amina primária ou sulfidrilo) . Uma porção IRM pode ser conjugada com uma molécula de avidina por meios químicos semelhantes. A porção IRM e a porção antigénica podem ser então emparelhadas por interacção de afinidade avidina-biotina. Os métodos para a biotinação de proteínas e ligação de grupos químicos à avidina são bem conhecidos de um especialista na técnica. Interacções de afinidade alternativas que podem ser úteis para preparar ISCs incluem, por exemplo, interacções antigénio/anticorpo, interacções glicoproteína/lectina. 28

As composições imunoestimulante também podem ser preparadas por interacções iónicas entre uma porção IRM e uma porção antigénica. Por exemplo, uma porção IRM, uma porção antigénica, ou ambas, podem ser quimicamente modificadas para conter componentes de carga oposta. A porção IRM e porção antigénica com carga oposta podem ser então incubadas em conjunto para permitir a interacção iónica entre as duas entidades. A ISC resultante pode ser então administrada a um indivíduo ou a uma população de células, resultando na co-administração de ambos, o IRM e o antigénio, às células alvo.

Como no caso de ISCs ligados de modo covalente, os ISCs em que a porção IRM e a porção antigénica são emparelhadas de modo não covalente podem incluir um suporte sólido. Métodos para Desencadear Respostas Imunológicas Utilizando Conjugados imunoestimulantes

As composições imunoestimulante de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para desencadear resposta imunológicas a partir de células do sistema imunitário, in vitro ou in vivo. Assim, uma ISC de acordo com a presente invenção pode ser útil como um componente de uma vacina ou como um factor imunoestimulante utilizado em cultura celular in vitro de células T ou células B. De facto, os IRMs podem ser factores imunoestimulantes mais potentes quando administrados como parte de uma ISC de acordo com a presente invenção em comparação com a administração como um adjuvante de vacina não emparelhado. Quando utilizadas para desencadear respostas imunológicas in vitro, as células imunitárias activadas in vitro podem ser reintroduzidas num doente. Alternativamente, os factores segregados pelas células imunitárias activadas, por exemplo, anticorpos ou 29 citoquinas, podem ser recolhidos para utilização em investigação, diagnóstico e/ou terapia. A menos que especificado em contrário, um hospedeiro pode ser imunizado por via subcutânea ou por via intraperitoneal. Após um período de tempo suficiente para permitir que o hospedeiro gere uma resposta imunológica à ISC, as células imunitárias apropriadas para o sítio de imunização são recolhidas. Por exemplo, podem ser colhidos nódulos linfáticos de um hospedeiro que tenha sido imunizado por via subcutânea. Podem ser colhidas células de baço de um hospedeiro imunizado por via intraperitoneal. Para alguns hospedeiros, a colheita de células pode incluir o sacrifício dos hospedeiros. Noutros casos, a colheita de células pode incluir uma biopsia ou a remoção cirúrgica de um tecido apropriado.

Numa forma de realização, as ISCs podem ser utilizadas para induzir a proliferação de células T específicas para o antigénio. Um hospedeiro (por exemplo, um rato) pode ser imunizado com uma ISC que inclua um antigénio particular. Após incubação suficiente no hospedeiro determinadas células T (por exemplo, células T CD8+) irão transformar-se em células T específicas para o antigénio em resposta à imunização. Uma maior percentagem de células T será especifica para o antigénio em hospedeiros imunizados com ISCs, por comparação com hospedeiros imunizados apenas com antigénio (Figs. 1-3). A ISC pode ser emparelhada acoplando de forma covalente a porção IRM e a porção antigénica (Figs. 1-3) ou, alternativamente, por um emparelhamento não covalente como, por exemplo, uma suspensão coloidal (Figs. 15-17) . 30

Se o antigénio é uma proteína (por exemplo, ovalbumina), pode não ser necessário que a ISC inclua a proteína inteira. Por exemplo, um péptido imunodominante da proteína pode ser tudo o que é necessário para induzir o desenvolvimento de células T específicas para o antigénio de proteína total. Além disso, uma imunização de reforço, por exemplo, 15 dias após a imunização inicial, pode aumentar a indução de células T específicas para o antigénio (Fig. 7).

Pode utilizar-se a imunização de um hospedeiro com ISCs para desencadear uma resposta específica para o antigénio em linfócitos T citotóxicos (CTLs) CD8+. Uma tal resposta pode ser dirigida contra muitas condições, incluindo, mas não se limitando a, tumores e populações de células infectadas por vírus. As ISCs também podem ser administradas profilacticamente para proporcionar um hospedeiro com uma imunidade CTL protectora dirigida contra tumores ou infecções virais futuros.

Numa outra forma de realização, pode utilizar-se ISCs para induzir a produção de citoquinas por células T específicas para antigénio in vitro. Tecido apropriado de um hospedeiro imunizado pode ser colhido e cultivado in vitro com antigénio, induzindo desse modo a produção de uma ou mais citoquinas (por exemplo, IFN-γ, ver Fig. 4-6) . Mais uma vez, nos casos em que o antigénio é uma proteína, um péptido imunodominante da proteína antigénica pode ser tudo o que é necessário para induzir as células T específicas para o antigénio em cultura de células para produzir e segregar citoquinas.

Numa outra forma de realização, pode utilizar-se ISCs para inibir o crescimento tumoral in vivo. Hospedeiros com 31 células tumorais que exprimam um determinado antigénio podem ser imunizados com ISCs que contêm o antigénio. Nalgumas formas de realização, a imunização inicial pode ser reforçada com uma segunda imunização. Os tumores colhidos de hospedeiros imunizados com ISO contendo o antigénio foram geralmente mais pequenos do que os tumores colhidos de hospedeiros imunizados apenas com o antigénio (Fig. 8) . Além disso, a análise dos tumores revelou que os tumores colhidos a partir de hospedeiros imunizados com ISC continham uma percentagem mais elevada de células T especificas para o antigénio do que os tumores colhidos de hospedeiros imunizados apenas com o antigénio (Fig. 10).

Ainda numa outra forma de realização, pode utilizar-se ISCs para induzir células apresentadoras de antigénios (APCs, por exemplo, células dendriticas) a apresentar péptidos do antigénio nos complexos de MHC de classe I nas suas superfícies celulares. Os hospedeiros podem ser imunizados por via intravenosa para induzir este tipo de resposta. A resposta pode ser verificada colhendo e analisando as células do baço em relação a APCs que apresentam complexos antigénio/MHC de classe I (Figs. 11-13).

Numa forma de realização alternativa, pode utilizar-se ISCs para desenvolver células T específicas para o antigénio in vitro. Por exemplo, pode colher-se células de medula óssea de um doente com um tumor que expresse um antigénio particular. As células colhidas podem ser cultivadas in vitro com uma ISC contendo o antigénio expressado pelo tumor. Uma vez mais, se o antigénio é uma proteína, o ISC pode necessitar apenas de incluir um péptido imunodominante da proteína. As células T específicas para o antigénio que se desenvolvem in vitro, em resposta à incubação com a ISC podem ser reintroduzidas no doente. 32

Ainda numa outra forma de realização alternativa, pode administrar-se uma ISC a um indivíduo com um tumor para aumentar a probabilidade, duração, ou ambas, de sobrevivência. Uma ISC incluindo uma porção antigénica específica do tumor administrada a um rato desafiado com células de melanoma proporcionou uma maior sobrevivência quando comparado com ratos imunizados apenas com o antigénio do tumor (Fig. 14).

Exemplos

Os exemplos que se seguem foram seleccionados apenas para ilustrar ainda melhor as características, vantagens e outros detalhes da invenção. No entanto, deve ser expressamente compreendido que apesar dos exemplos servirem este propósito, os materiais e quantidades particulares utilizados, bem como as outras condições e pormenores não são para ser interpretados de um modo que limite indevidamente o âmbito da presente invenção.

Preparação de Compostos IRM

Composto IRM 1 (IRMl): N-[6-({2-[4-amino-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il]-1,1-dimetiletil}amino)-6-oxo-hexil]-4-azido-2-hidroxibenzamida

Parte A

Uma solução, mantida sob agitação, de 4-cloro-3-nitroquinolina (17,3 g, 83,2 mmol) em 200 mL de CH2CI2 anidro, sob N2, foi tratada com trietilamina (23,2 mL, 166,4 mmol) e 1,2-diamino-2-metilpropano (9,57 mL, 91,5 mmol) . Depois de agitar de um dia para o outro, a mistura 33 reaccional foi diluída com 800 mL de CHCI3, lavada com H20 (3 x 300 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (300 mL) . A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar 2-metil-N1-(3-nitroquinolin-4-il)propano-1,2-diamina (21,0 g) como um sólido amarelo brilhante.

Parte B

Uma solução de 2-metil-N1-(3-nitroquinolin-4-il)propano-1,2-diamina (2,60 g, 10,0 mmol) em 50 mL de tetra-hidrofurano (THF), sob N2, foi arrefecida até 0°C e tratada com 10 mL de solução de NaOH IN. Foi então adicionado dicarbonato de di-terc-butilo (2,18 g, 10,0 mmol) à solução sob agitação rápida. A mistura reaccional foi, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada dum dia para o outro. Foi adicionado mais 400 mg de dicarbonato de di-terc-butilo e a agitação foi prosseguida durante 3 dias. A reacção foi então tratada com acetato de etilo (200 mL) e lavada com H20 (2x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar um sólido amarelo que foi triturado com 10% de AcOEt/hexanos. O sólido foi isolado por filtração e seco sob vácuo dum dia para o outro para dar 1,l-dimetil-2-[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etil-carbamato de terc-butilo (2,80 g) como um pó amarelo.

Parte C

Uma solução de 1,l-dimetil-2-[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etilcarbamato de terc-butilo (3,50 g, 9,72 mmol), em 150 mL de tolueno foi tratada com 0,3 g de Pt a 5% sobre carvão e agitada sob H2 (3 atm, 3 kg/cm2) durante 6 horas. A solução foi então filtrada através de uma almofada de Celite e concentrada para dar 3,04 g de 2-[(3- 34 aminoquinolin-4-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo em bruto como uma espuma laranja clara.

Parte D

Uma solução de 2-[ (3-aminoquinolin-4-il]-1,1- dimetiletilcarbamato de terc-butilo (3,04 g, 9,21 mmol) em 50 mL de CH2CI2 foi arrefecida até 0°C e tratada com trietilamina (1,41 mL, 10,13 mmol) e cloreto de etoxiacetilo (1,02 mL, 10,17 mmol). Após 2 horas, a mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida. O xarope resultante foi retomado em 100 mL de EtOH e tratado com 4,5 mL de trietilamina. A solução foi aquecida a refluxo dum dia para o outro. A mistura reaccional foi concentrada e retomada em 100 mL de CH2CI2 e lavada com H20 (2x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada. O xarope resultante foi purificado por cromatografia em coluna (SÍO2, 80% de AcOEt/hexanos) para dar 2-[2- (etoximetil) -lff-imidazo [4,5-c]quinolin-l-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,57 g) como uma espuma cor de pêssego.

Parte E

Uma solução de 2-[2-(etoximetil)-lH-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] -1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,57 g, 3,94 mmol) em 30 mL de CH2CI2 foi tratada com ácido 3-cloroperoxibenzóico (77%, 1,01 g, 4,57 mmol). Depois de agitar durante 2 horas, a mistura reaccional foi tratada com mais 30 mL de CH2CI2 e foi lavada com solução de Na2C03 a 1% (2 x 30 mL), H20 e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi então seca sobre Na2S04 e concentrada para dar 2-[2-(2-(etoximetil)-5-oxido-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,58 g) como uma espuma castanha clara.

Parte F 35

Uma solução de 2-[2-(2-(etoximetil)-5-oxido-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il]-1,1-dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,57 g, 3,79 mmol) em 20 mL de 1,2-dicloroetano foi aquecida até 70°C e tratada com 2 mL de solução de NH4OH concentrado. À solução, mantida sob agitação rápida, foi adicionado cloreto de p-toluenossulfonilo sólido (795 mg, 4,17 mmol). A mistura reaccional foi então selada num recipiente de pressão e o aquecimento foi prosseguido durante 2 horas. A mistura reaccional foi então arrefecida e tratada com 50 mL de CHCI3. A mistura reaccional foi então lavada com H20, solução de Na2C03 a 1% (3x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar o produto como um óleo castanho claro. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em coluna (Si02, 2-5% de MeOH/CHCl3) para dar 2- [4-amino-2- (etoximetil) -lff-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] - 1.1- dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,26 g) como uma espuma amarela clara.

Parte G 2- [4-amino-2- (etoximetil) -líí-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] - 1.1- dimetiletilcarbamato de terc-butilo (1,26 g, 3,05 mmol) foi dissolvido em 10 mL de EtOH e tratado com 10 mL de HCl 2M em EtOH. Depois de aquecer a refluxo durante 2 horas, a mistura reaccional foi arrefecida e concentrada sob pressão reduzida. O sólido amarelo resultante foi dissolvido em 50 mL de H20 e extraído com CHCI3 (20 mL) . A camada orgânica foi rejeitada e a porção aquosa foi tornada básica (pH~12) pela adição de solução concentrada de NH4OH. Esta foi então extraída com CHC13 (4 x 20 mL) e as porções orgânicas combinadas foram secas com Na2S04 e concentradas para dar 1- (2-amino-2-metilpropil) -2- (etoximetil) -lfí-imidazo [4,5- c] quinolina-4-amina (808 mg) como um pó castanho claro, p.f. 161,0-162,0 °C; 36 MS m/z 314 (Μ + H) ; RMN de 3H (300 MHz, de-DMSO) δ 8,30 (d, J = 7,7 Hz, 1H) , 7,59 (dd, J= 1,2, 8,3 Hz, 1H) , 7,40 (ddd, J= 1,0, 7,2, 8,1 Hz, 1H) , 7,21 (ddd, J = 1,2, 7,0, 8,2 Hz, 1H), 6,57 (s, 2H) , 4,94 (s 1, 2H), 4,61 (s 1, 2H) , 3,52 (q, J= 7,0 Hz, 2H), 1,61 (s, 2H), 1,31 (t, J= 7,0 Hz, 3H), 1,07 (s, 6H); RMN de 13C (75 MHz, d6-DMSO) δ 152, 4, 151,1, 145, 7, 134,3, 126,8, 126,7, 121,7, 120,8, 115,7, 65,6, 65,2, 55,8, 52,5, 29,2, 15,4.

Anal. Calculado para C17H23N5O: %C, 65,15; %H, 7,40; %N, 22,35. Encontrado: %C, 65,04; %H, 7,52; %N, 22,07.

Parte H

Sob uma atmosfera de azoto, foi adicionado uma solução de (azidossalicolamido)hexanoato de N-hidroxissulfossuc-cinimidilo (100 mg, 0,204 mmol de sulfo-LC-NHS-ASA de

Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, IL, EUA) em N,N-dimetilformamida, DMF, (2-4 mL) a uma solução de 1- (2-amino-2-metilpropil) -2- (etoximetil) -li7-imidazo [4,5-c] quinolina-4-amina (63 mg, 0,201 mmol) em DMF (5 mL) . A mistura reaccional foi agitada sob atmosfera de azoto num recipiente embrulhado com folha de alumínio. Após 2 dias foi adicionado mais 50 mg de (azidossalicilamido)hexanoato de N-hidroxissulfossuccinimidilo. Após cerca de uma semana, a mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida a 55 °C. o resíduo foi partilhado entre diclorometano contendo uma pequena quantidade de metanol e água. A camada orgânica foi separada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (2 x 15 cm de S1O2 eluindo com 6% de metanol em clorofórmio) para proporcionar 53 mg de produto como um vidro incolor. O vidro foi transferido utilizando diclorometano para um balão cónico e depois concentrado para proporcionar uma espuma. A espuma foi seca dum dia para o outro sob alto 37 vácuo para proporcionar 48 mg de um sólido branco cristalino. A análise por RMN indicou a presença de diclorometano, pelo que o material foi seco dum dia para o outro sob alto vácuo e depois numa estufa de vácuo a 50 °C durante 5 horas. A análise por HPLC indicou uma pureza de o o >93

Composto IRM 2 (IRM2): N-{6-[(2-{2-[4-amino-2-(2- metoxietil) -lfí-imidazo [4,5-c] quinolin-1-il]etoxijetil)amino]-6-oxo-hexil}-4-azido-2-hidroxibenzamida

X

o

Parte A

Uma solução de 2-(2-aminoetoxi)etanol (29,0 g, 0,276 mol) em 180 mL de tetra-hidrofurano (THF), sob N2, foi arrefecida até 0°C e tratada com 140 mL de solução de NaOH 2N. Foi então adicionada, gota a gota durante 1 h, uma solução de dicarbonato de di-terc-butilo (60,2 g, 0,276 mol) em 180 mL de THF à solução sob agitação rápida. A mistura reaccional foi então deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada mais 18 horas. O THF foi em seguida removido sob pressão reduzida e a pasta aquosa remanescente foi levada até pH 3 pela adição de 150 mL de solução de H2SO4 1M. Esta foi, em seguida, extraída com acetato de etilo (300 mL, 100 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com H20 (2x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar 2- (2-hidroxietoxi)etilcarbamato de terc-butilo como um óleo incolor, (47,1 g). 38

Parte B

Uma solução, mantida sob agitação rápida, de 2—(2— hidroxietoxi)etilcarbamato de terc-butilo (47,1 g, 0,230 mol) em 1 L de CH2CI2 anidro foi arrefecida até 0°C sob N2 e tratada com trietilamina (48,0 mL, 0,345 mol). Foi então adicionado cloreto de metanossulfonilo (19,6 mL, 0,253 mol) gota a gota ao longo de 30 min. A mistura reaccional foi, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada durante mais 22 horas. A reacção foi desactivada pela adição de 500 mL de solução saturada de NaHC03 e a camada orgânica foi separada. A fase orgânica foi então lavada com H20 (3 x 500 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar metanossulfonato de 2-{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etoxi}etilo como um óleo castanho (63,5 g).

Parte C

Uma solução, mantida sob agitação, de metanossulfonato de 2—{2—[(terc-butoxicarbonil)amino]etoxijetilo (63,5 g, 0,224 mol) em 400 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) foi tratada com NaN3 (16,1 g, 0,247 mol) e a mistura reaccional foi aquecida até 90°C sob N2. Após 5 horas, a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente e tratada com 500 mL de H20 fria. A mistura reaccional foi então extraída com Et20 (3 x 300 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com H20 (4 x 100 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (2 x 100 mL) . A porção orgânica foi seca sobre MgS04 e concentrada para dar 52,0 g de 2-(2-azidoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo como um óleo castanho claro.

Parte D 39

Uma solução de 2-(2-azidoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo (47,0 g, 0,204 mol) em MeOH foi tratada com 4 g de Pd a 10% sobre carvão e agitada sob H2 (3 kg/cm2) durante 24 horas. A solução foi então filtrada através de uma almofada de Celite e concentrada para dar 35,3 g de 2— (2— aminoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo em bruto como um liquido incolor que foi utilizado sem mais purificação.

Parte E

Uma solução, mantida sob agitação, de 4-cloro-3- nitroquinolina (31,4 g, 0,151 mol) em 500 mL de CH2C12 anidro, sob N2, foi tratada com trietilamina (43 mL, 0,308 mol) e 2-(2-aminoetoxi)etilcarbamato de terc-butilo (0,151 mol) . Depois de agitar de um dia para o outro, a mistura reaccional foi lavada com H20 (2 x 300 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (300 mL) . A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar um sólido amarelo brilhante. A recristalização de acetato de etilo/hexanos deu 43,6 g de 2—{2—[(3-nitroquinolin-4-il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo como cristais de cor amarela brilhante.

Parte F

Uma solução de 2-{2-[(3-nitroquinolin-4- il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo (7,52 g, 20,0 mmol) em tolueno foi tratada com 1,5 g de Pt a 5% sobre carvão e agitada sob H2 (3 kg/cm2) durante 24 horas. A solução foi então filtrada através de uma almofada de Celite e concentrada para dar 6,92 g de 2—{2— [ (3— aminoquinolin-4-il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo em bruto como um xarope amarelo.

Parte 6 40

Uma solução de 2—{2—[(3-aminoquinolin-4- il)amino]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo (10,2 g, 29,5 mmol) em 250 mL de CH2CI2 anidro foi arrefecida até 0°C e tratada com trietilamina (4,18 mL, 30,0 mmol). Foi então adicionado cloreto metoxipropionilo (3,30 mL, 30,3 mmol) gota a gota ao longo de 5 min. A reacção foi então aquecida até à temperatura ambiente e a agitação foi prosseguida durante 1 hora. A mistura reaccional foi, em seguida, concentrada sob pressão reduzida para dar um sólido cor de laranja. Este foi dissolvido em 250 mL de EtOH e foram adicionados 12,5 mL de trietilamina. A mistura foi aquecida a refluxo e agitada sob N2 dum dia para o outro. A reacção foi então concentrada até à secura sob pressão reduzida e tratada com 300 mL de Et20. A mistura foi então filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um sólido castanho. O sólido foi dissolvido em 200 mL de metanol quente e tratado com carvão activado. A solução quente foi filtrada e concentrada para dar 11,1 g de 2 —{2 — [2- (2-metoxietil) -lfí-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] etoxi jetilcarbamato de terc-butilo como um xarope amarelo.

Parte H

Uma solução de 2-{2-[2-(2-metoxietil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il]etoxi}etilcarbamato de terc-butilo (10,22 g, 24,7 mmol) em 250 mL de CHCI3 foi tratada com ácido 3-cloroperbenzóico (77%, 9,12 g, 40,8 mmol). Depois de agitar durante 30 minutos, a mistura reaccional foi lavada com solução de Na2C03 a 1% (2 x 75 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi depois seca sobre Na2S04 e concentrada para dar 10,6 g de 2 — {2— [2— (2-metoxietil) -5-oxido-lií-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] etoxi}etilcarbamato de terc-butilo como uma espuma cor de laranja que foi utilizada sem mais purificação. 41

Parte I

Uma solução de 2-{2-[2-(2-metoxietil)-5-oxido-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il]etoxi]etilcarbamato de terc-butilo (10,6 g, 24,6 mmol) em 100 mL de 1,2-dicloroetano foi aquecida até 60 °C e tratada com 10 mL de solução concentrada de NH4OH. À solução sob agitação rápida foi adicionado cloreto de p-toluenossulfonilo sólido (7,05 g, 37,0 mmol) ao longo de um período de 10 minutos. A mistura reaccional foi tratada com um mais 1 mL de solução concentrada de NH4OH e em seguida selada num recipiente de pressão e o aquecimento foi prosseguido durante 2 horas. A mistura reaccional foi então arrefecida e tratada com 100 mL de CHC13. A mistura reaccional foi, em seguida, lavada com H2O, solução de Na2C03 a 1% (2x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A porção orgânica foi seca sobre Na2S04 e concentrada para dar 10,6 g de 2—{2— [4 — amino-2- (2-metoxietil) -lff-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] etoxi }etilcarbamato de terc-butilo como uma espuma castanha.

Parte J 2 - { 2-[4-Amino-2-(2-metoxietil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il] etoxi}etilcarbamato de terc-butilo (10,6 g, 24,6 mmol) foi tratado com 75 mL de HCl 2m em etanol e a mistura foi aquecida a refluxo sob agitação. Após 1,5 horas, a mistura reaccional foi arrefecida e filtrada para dar um sólido gomoso. O sólido foi lavado com etanol e Et20 e seco sob vácuo para dar o sal de cloridrato como um sólido castanho claro. A base livre foi preparada dissolvendo o sal de cloridrato em 50 mL de H2O e tratando com solução de NaOH a 10%. A suspensão aquosa foi, em seguida, concentrada até à secura e o resíduo foi tratado com CHCI3. Os sais resultantes foram removidos por filtração e o filtrado foi 42 concentrado para dar 3,82 g de l-[2-(2-aminoetoxi)etil]-2-(2-metoxietil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina como um pó acastanhado. MS 330 <M + H)+; RMN de 1 H O O cn MHz, DMSO -d6) δ 8,10 (d, J = 8 ,1 Hz, 1 H); 7, 66 (d, J = 8, 2 Hz f 1 H) ; 7,40 (m , i H) r 7, 25 (m, 1 H); 6,88 (s 1 , 2 H) ; 4, 78 (t, J = 5,4 Hz, 2 H) r 3,89 (t, J = OO Hz, 2 H); 3 ,84 (t , J = 6,9 Hz, 2 H) r 3, 54 (t, J = 5,4 Hz, 2 H) r 3,31 (s, 3 H); 3,23 (t, J = 6, 6 Hz , 2 H); 2,88 (t, J = 5, ,3 Hz, 2 H)

Parte κ

Sob uma atmosfera de azoto, foi adicionada uma solução de (azidossalicilamido)hexanoato de N-hidroxissulfossuc-cinimidilo (100) mg, 0,204 mmol de sulfo-LC-NHS-ASA de Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, IL, EUA) em DMF (2-4 mL) a uma solução de 1-[2-(2-aminoetoxi)etil]-2-(2-metoxietil)-lfí-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina (66 mg, 0,201 mmol) em DMF (5 mL) . Após 3,5 horas, a análise por HPLC mostrou que não estava presente qualquer material de partida. A mistura reaccional foi agitada dum dia para o outro e, em seguida, concentrada sob pressão reduzida. O residuo foi purificado por cromatografia flash (2 x 15 cm de S1O2 eluindo com 8% de metanol em clorofórmio) para proporcionar 55 mg de produto como um vidro incolor. O vidro foi transferido utilizando diclorometano para um balão cónico e depois concentrado para proporcionar uma espuma. A espuma foi seca dum dia para o outro sob alto vácuo e depois numa estufa de vácuo a 50°C durante 5 horas para proporcionar 45 mg de produto como um sólido branco fofo. A análise por HPLC indicou uma pureza de >95%.

Composto IRM 3 (IRM3): N- (2 —{2 —[4-amino-2-(2-metoxietil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il]etoxi}etil)hexadecanamida 43

Sob uma atmosfera de azoto, uma suspensão de 1—[2— (2 — aminoetoxi)etil]-2-(2-metoxietil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (140,5 mg, 0,428 mmol) numa mistura de diclorometano (3,5 mL) e trietilamina (150 pL, 1,07 mmol) foi arrefecida a 0 °C. Foi adicionado lentamente cloreto de palmitoilo (130 pL, 0,428 mmol). A mistura reaccional foi deixada a agitar à temperatura de 0 °C durante 2 horas, altura em que a análise por cromatografia em camada fina indicou que não havia nenhum material de partida remanescente. A mistura reaccional foi diluída com diclorometano (30 mL), lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio (2x5 mL), seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna (12 g de sílica gel eluída com 2% de metanol em diclorometano) para proporcionar 183 mg de N-(2-{2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxiJetil)hexadecanamida como um pó branco.

Anal. Calculado para C33H53N503: %C, 69,80; %H, 9,41; %N, 12,33; Encontrado: %C, 69,60; %H, 9,28; %N, 11,99.

Exemplo 1: Reticulação do Modificador de Resposta

Imunológica com Ovalbumina 44 0 IRMl foi suspenso em dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 mg/mL. A ovalbumina foi suspensa em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 10 mg/mL e o pH ajustado a >10,0 pela adição de NaOH. 500 pL da solução de ovalbumina (5 mg de ovalbumina) foram misturados com 100 pL da solução de IRMl (1 mg de IRMl) num único poço de uma placa de cultura de tecidos com 12 poços. A placa foi colocada em gelo e colocou-se uma fonte de luz UV de comprimento de onda longo directamente sobre a placa tão perto quanto possível do poço contendo a IRMl/ovalbumina. A mistura foi irradiada durante 15 minutos. O conjugado resultante foi removido do poço e ressuspenso em PBS a uma concentração final de 5 mg/mL de ovalbumina, 0,5 mg/mL de IRMl e submetido a diálise contra PBS para remover qualquer IRM não conjugado.

Exemplo 2: Imunizações

Ratos C57BL/6 foram imunizados com conjugado (1 mg de ovalbumina e 200 pg de IRMl, preparado como no exemplo 1) em 200 pL de PBS quer por via subcutânea ou por via intraperitoneal. Ratos de controlo foram imunizados com 1 mg de ovalbumina em 200 pL de PBS. Para análise das respostas primárias, os ratos foram sacrificados 5-7 dias após a imunização. Para análise das respostas secundárias, os ratos foram reforçados 7-15 dias após a imunização inicial e sacrificados 5-7 dias mais tarde. A menos que indicado de outro modo, foram colhidos nódulos linfáticos de ratos imunizados por via subcutânea para análise e foram colhidas células do baço de ratos imunizados por via intraperitoneal para análise.

Exemplo 3: Reagentes

Os anticorpos marcados com fluorocromo específico para CD8, CDllc e CD44 de rato foram obtidos de Pharmingen (San Diego, CA). O anticorpo monoclonal 25D1.16 (Dr. Ron 45

Germain, NIH) é específico para o péptido dominante de ovalbumina (SIINFEKL,) ligado à molécula de MHC de classe I H-2Kb. Porgador et al., Immunity 6:715-26. A ovalbumina foi obtida de sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Os tetrâmeros da molécula MHC classe I H-2Kb ligada ao péptido dominante de ovalbumina SIINFEKL foram produzidos como descrito em Kedl et al., J Exp. Med, 192:1105-13 (2000). A linha celular de melanoma que expressa ovalbumina Bl6ova foi preparada por lipofecção da linha de células B16-F10 (ATCC# CRL-6475) com um plasmídeo que codifica a ovalbumina de comprimento total. Ver Kedl et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98:10811-6. Os reagentes de captura e detecção de citoquinas foram de Miltyeni Biotech (auburn, CA).

Exemplo 4

Os ratos experimentais foram imunizados com conjugado como preparado no Exemplo 1 quer por via subcutânea ou por via intraperitoneal como se descreve no Exemplo 2. Os ratos de controlo foram imunizados com ovalbumina como se descreve no Exemplo 2. Sete dias mais tarde, os nódulos linfáticos ou o baço foram removidos e as células foram reveladas com anticorpos específicos para CD8, CD44 e tetrâmeros de H-2Kb/SIINFEKL e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são mostrados nas Figuras 1-3. As células que revelaram positivamente para todos os três marcadores identificam células T CD8+ especificas para ovalbumina activadas que se desenvolveram como resultado da imunização.

Cada uma das Figuras 1-3 inclui a percentagem de todas as células T CD8+ examinadas que foram identificadas como células T CD8+ especificas para ovalbumina activadas. Nos ratos de controlo, 0,07% das células T CD8+ eram células T CD8+ especificas para ovalbumina activadas. A imunização 46 subcutânea com conjugado gerou 0,52% de células T CD8+ específicas para ovalbumina activadas. A imunização intraperitoneal com conjugado gerou 0,92% de células T CD8+ específicas para ovalbumina activadas. A imunização com o péptido dominante de ovalbumina (SIINFEKL) conjugado com IRM1 (100 yg de péptido reticulado com 200 yg de IRMl) também induziu a activação de células T CD8+ específicas para ovalbumina.

Exemplo 5

Os ratos de controlo foram imunizados com ovalbumina como se descreve no Exemplo 2. Os ratos experimentais foram imunizados com conjugado como preparado no Exemplo 1 quer por via subcutânea ou por via intraperitoneal como se descreve no Exemplo 2. As células imunitárias apropriadas foram colhidas sete dias após a imunização e incubadas in vitro durante quatro horas com o péptido SIINFEKL. As células T CD8+ produtoras de interferão gama (IFN-γ) foram identificadas utilizando um ensaio de captura e detecção de IFN-γ acoplado a citometria de fluxo. As células T CD8+ que eram geradas por imunização com o conjugado IRMl-ovalbumina produziram IFN-γ em resposta à estimulação subsequente com antigénio (Figuras 4-6).

Exemplo 6

Os ratos foram imunizados com conjugado como preparado no Exemplo 1, como se descreve no Exemplo 2 e em seguida receberam um reforço com uma quantidade igual de conjugado no dia 15. As células do baço e dos nódulos linfáticos dos animais imunizados com reforço foram analisadas sete dias após o reforço. A análise mostrou uma maior percentagem de células T CD8+ específicas para ovalbumina activadas em 47 comparação com os ratos que tinham recebido apenas a imunização primária (Figura 7).

Exemplo 7

Os ratos foram injectados intradermicamente com a linha de células de melanoma que expressa ovalbumina B16ova (1 x 105 células) . No dia 7, os ratos foram injectados por via subcutânea com 1 mg de ovalbumina (controlo) ou com conjugado como preparado no Exemplo 1. No Dia 14, os ratos foram reforçados por via subcutânea com ovalbumina ou conjugado como no Dia 7. No Dia 20, o tamanho do tumor foi medido com paquímetros em duas dimensões. A imunização com o conjugado resultou na redução do tamanho do tumor, em comparação com o controlo (Figura 8).

Exemplo 8

Os ratos foram injectados intradermicamente com a linha de células de melanoma que expressa ovalbumina B16ova (1 χ 105 células) . Sete e 14 dias mais tarde, os ratos foram injectados por via intraperitoneal com 1 mg de ovalbumina (controlo) ou com conjugado como preparado no Exemplo 1. Vinte dias após o desafio com a linha de células de melanoma, os baços e os tumores foram removidos e as células de cada fonte foram reveladas com anticorpos específicos para CD8 e CD44 bem como para tetrâmeros H-2Kb/SIINFEKL. A análise por citometria de fluxo revelou uma expansão significativa de células T CD8+ específicas para ovalbumina activadas tanto no baço (Figura 9) como no tumor (Figura 10).

Exemplo 9

Os ratos foram imunizados por via intravenosa com ovalbumina, ovalbumina e IRM1: 1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina 48 desemparelhado (IRM1 antes da fixação do grupo de ligação - 0 produto da Parte G da sintese de IRMl) ou com conjugado como preparado no Exemplo 1. Catorze horas mais tarde, os baços foram removidos, tratados com colagenase e as células foram reveladas com anticorpos específicos para CD8, CDllc e o anticorpo 25D1.16, que é específico para o péptido de ovalbumina SIINFEKL complexado com a molécula MHC de classe 1 H-2Kb. A análise por citometria de fluxo indicou que a imunização de ratos com o conjugado de IRMl-ovalbumina (Figura 13) gerava uma maior percentagem de células dendríticas CDllc+, CD8+ que apresentavam Kb/SIINFEKL, do que a imunização de ratos com ovalbumina sozinha (Figura 11) ou uma mistura de ovalbumina não e IRMl emparelhados (Figura 12) .

Exemplo 10

Os ratos foram imunizados no Dia 0 por via subcutânea como se descreve no Exemplo 2 com ovalbumina (controlo) ou com conjugado de IRMl como preparado no Exemplo 1. Os ratos receberam imunizações de reforço no Dia 14. Os ratos foram então desafiados por via intradérmica com a linha de células de melanoma que expressa ovalbumina B16ova (1 χ 105 células) no Dia 28 e monitorizados para crescimento tumoral. No Dia 75, 80% dos ratos imunizados com conjugado sobreviveram e pareciam saudáveis, enquanto todos os ratos imunizados apenas com ovalbumina tinham morrido (Fig 14).

Exemplo 11

Foi preparada uma solução-mãe de IRM3 dissolvendo o IRM3 em DMSO a uma concentração de 10 mg/mL. A ovalbumina foi dissolvida em PBS até uma concentração de 50 mg/mL. Adicionou-se 50 pL da solução-mãe de IRM3 a 150 pL de PBS e em seguida misturou-se por agitação em vórtex. Adicionou-se 50 pL da ovalbumina à solução de IRM3 e misturou-se por 49 agitação em vórtex. Obteve-se uma suspensão coloidal turva de IRM3 e ovalbumina.

Os ratos foram imunizados no Dia 0 por via subcutânea como se descreve no Exemplo 2, quer com (a) ovalbumina sozinha ou (b) 50 pL da suspensão coloidal de ovalbumina e IRM3. No Dia 6, os nódulos linfáticos de drenagem foram removidos, homogeneizados e revelados com o tetrâmero de H-2Kb/SIINFEKL para identificar células T especificas para a ovalbumina. A Figura 15 mostra os dados de citometria de fluxo de um rato de controlo imunizado apenas com ovalbumina; as Figuras 16 e 17 mostram dados de dois ratos diferentes que foram imunizados com a suspensão coloidal.

Exemplo 12

Foi preparado um conjugado de IRM2 e ovalbumina como se descreve no Exemplo 1, excepto que se utilizou IRM2 em vez de IRMl.

Vinte e quatro ratos foram divididos em oito grupos de três. Quatro grupos de três ratos foram imunizados por via subcutânea como se descreve no Exemplo 2, no Dia 0, com cada grupo a receber quantidades crescentes de conjugado de IRMl-ovalbumina. Os restantes quatro grupos foram imunizados de modo análogo no Dia 0 com o conjugado de IRM2-ovalbumina. No dia 6, os ratos foram sacrificados e os nódulos linfáticos de drenagem foram removidos e revelados com o tetrâmero de H-2Kb/SIINFEKL para identificar células T especificas para a ovalbumina. A percentagem de células T especificas para ovalbumina foi calculada para cada rato. A Figura 18 resume os resultados.

Exemplo 13 50

Os ratos foram transferidos de modo adoptivo com aproximadamente 2xl06 células T transgénicas específicas para ovalbumina OTl (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) . Os ratos foram imunizados no Dia 0 por via subcutânea como se descreve no Exemplo 2 com (a) 100 yg de ovalbumina, (b) 100 yg de ovalbumina + 50 yg de CpG (Ova + CpG) , (c) 100 yg de ovalbumina + 50 yg de IRM1 não emparelhado (Ova + IRM) ou (d) 100 yg de ovalbumina conjugada com 50 yg de IRM1 (Ova x IRM) . No Dia 5, os nódulo linfáticos de drenagem foram removidos e as células

foram reveladas com o tetrâmero H-2Kb/SIINFEKL para identificar células T específica para ovalbumina. A Figura 19 mostra o número de vezes de expansão das células T específicas para ovalbumina nos grupos Ova + CpG, Ova + IRM e Ova x IRM relativamente aos ratos imunizados apenas com ovalbumina. Várias modificações e alterações a esta invenção tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica sem que se afastem do âmbito e do espírito desta invenção. As formas de realização e exemplos ilustrativos são proporcionados apenas como exemplos e não se destinam a restringir o âmbito da presente invenção. O âmbito da invenção é limitado apenas pelas reivindicações explicitadas como se segue.

Lisboa, 22 de Dezembro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunoestimulante compreendendo: uma porção modificadora da resposta imunológica emparelhada com uma porção antigénica, pelo que a difusão independente da porção modificadora da resposta imunológica em relação à porção antigénica está limitada, em que a porção modificadora da resposta imunológica é um composto da fórmula: NH2

l4 em que: Ri é um grupo de ligação; R2 é seleccionado do grupo consistindo de: -hidrogénio; -alquilo; -alcenilo; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -alquil-O-alquilo; -alquil-S-alquilo; -alquil-O-arilo; -alquil-S-arilo; -alquil-O-alcenilo; -alquil-S-alcenilo; e -alquilo ou alcenilo substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -OH; -halogéneo; 2 -n(r5)2; -co-n (r5) 2; -CS-N (R5) 2; -S02-N(R5)2; -NR5-CO-alquilo Ci-io; -NRs-CS-alquilo Ci-io; -NR5-S02-alquilo Ci-io; -CO-alquilo Ci-io; -CO-O-alquilo Ci_i0; -N3; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -heterociclilo; -heterociclilo substituído; -CO-arilo; -CO- (arilo substituído); -CO-heteroarilo; e -CO- (heteroarilo substituído); R3 e R4 são cada um independentemente: -hidrogénio; -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N (R5) 2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um grupo arilo ou heteroarilo fundido que está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; 3 -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N(R5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um anel saturado de 5 a 7 membros fundido, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos e opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N (R5) 2; e cada R5 é independentemente hidrogénio ou alquilo C1-10.

2. Composição imunoestimulante da reivindicação 1, em que o porção modificadora da resposta imunológica é um agonista de receptor de tipo Toll 2, receptor de tipo Toll 4, receptor de tipo Toll 6, receptor de tipo Toll 7 ou receptor de tipo Toll 8.

3. Composição imunoestimulante da reivindicação 1, em que a porção modificadora da resposta imunológica compreende uma amina de imidazoquinolina; uma amina de tetra-hidroimidazoquinolina; uma amina de imidazopiridina; uma amina de imidazopiridina substituída com éter de arilo; uma amina de imidazoquinolina ligada 1,2 em ponte; uma amina de cicloalquilimidazopiridina fundida em 6,7; uma amina de imidazonaftiridina; uma amina de tetra-hidroimida-zonaftiridina; uma amina de oxazoloquinolina; uma amina de tiazoloquinolina; uma amina de oxazolopiridina; uma amina 4 de tiazolopiridina; uma amina de oxazolonaftiridina; ou uma amina de tiazolonaftiridina.

4. Composição imunoestimulante da reivindicação 1, em que a porção modificadora da resposta imunológica e a porção antigénica estão acopladas de forma covalente.

5. Composição imunoestimulante da reivindicação 1, em que a porção modificadora da resposta imunológica e a porção antigénica são emparelhadas por uma associação física ou química diferente do acoplamento covalente.

6. Composição imunoestimulante da reivindicação 1, em que a composição compreende uma suspensão coloidal.

7. Composição imunoestimulante da reivindicação 1, em que a porção antigénica compreende uma sequência de aminoácidos, uma sequência de nucleótidos, um lipopolissacárido, um prião, uma bactéria, um vírus ou um fungo.

8. Conjugado imunoestimulante da fórmula:

em que: Ri é um grupo de ligação; R2 é seleccionado do grupo consistindo de: -hidrogénio; -alquilo; -alcenilo; -arilo; -arilo substituído; 5 -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -alquil-O-alquilo; -alquil-S-alquilo; -alquil-O-arilo; -alquil-S-arilo; -alquil-O-alcenilo; -alquil-S-alcenilo; e -alquilo ou alcenilo substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -OH; -halogéneo; -N(R5)2; -co-n (r5) 2; -CS-N (R5) 2; -S02-N(R5)2; -NR5-CO-alquilo Ci_i0; -NR5-CS-alquilo Ci-io; -NR5-S02-alquilo Ci-io; -CO-alquilo Ci-io; -CO-O-alquilo Ci-io; -N3; -arilo; -arilo substituído; -heteroarilo; -heteroarilo substituído; -heterociclilo; -heterociclilo substituído; -CO-arilo; -CO- (arilo substituído); -CO-heteroarilo; e -CO-(heteroarilo substituído); R3 e R4 são cada um independentemente: -hidrogénio; β -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N(R5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um grupo arilo ou heteroarilo fundido que está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -n(r5)2; ou quando tomados em conjunto, R3 e R4 formam um anel saturado de 5 a 7 membros fundido, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos e opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados do grupo consistindo de: -halogéneo; -alquilo; -alcenilo; -O-alquilo; -S-alquilo; e -N(R5)2; e cada R5 é independentemente hidrogénio ou alquilo C1-10; e n é 1 a 10; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

9. Método para estimular células produtoras de anticorpos in vitro, compreendendo o método: 7 a) proporcionar uma composição imunoestimulante de acordo com a reivindicação 1; b) permitir que a composição imunoestimulante se ligue às células produtoras de anticorpo.

10. Composição imunoestimulante de acordo com a reivindicação 1 para ser utilizada na indução de uma resposta imunológica num organismo à porção antigénica. Lisboa, 22 de Dezembro de 2010