KR101088615B1

KR101088615B1 - 면역자극 조성물 및 면역 반응을 자극하는 방법

Info

Publication number: KR101088615B1
Application number: KR1020057002485A
Authority: KR
Inventors: 로스 엠. 케들; 조지 더블유. 그리스그라버; 이시드로 안젤로 이. 자라가
Original assignee: 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
Priority date: 2002-08-15
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2011-11-30
Also published as: WO2004032829A2; ATE488246T1; CN1671412B; JP2006507265A; PT1545597E; ES2355819T3; DE60335010D1; JP2011057699A; WO2004032829A3; DK1545597T3; AU2003299863A2; EP2269632B1; US7427629B2; EP2269632A2; EP1545597B1; KR20050026709A; AU2003299863A1; CA2495570A1; EP1545597A2; EP1545597A4

Abstract

본 발명은 항원 부분과 짝을 이룬 면역 반응 조절제 부분을 포함하는 면역자극 조성물을 제공한다.

면역자극 조성물, 타입 I 인터페론, TNF-α

Description

면역자극 조성물 및 면역 반응을 자극하는 방법{IMMUNOSTIMULATORY COMPOSITIONS AND METHODS OF STIMULATING AN IMMUNE RESPONSE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 U.S. 가특허 출원 No. 60/403,846(2002년 8월 15일 출원)에 대한 우선권을 청구한다.

배경기술

면역 반응 조절제("IRM")는 항바이러스 및 항종양 활성을 포함하지만, 그들에 한정되지 않는 잠재적인 면역조절 활성을 갖는 화합물을 포함한다. 소정의 IRM은 시토킨의 생성 및 분비를 조절한다. 예를 들어, 소정의 IRM 화합물은 시토킨, 예를 들어, 타입 I 인터페론, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, MIP-1, 및/또는 MCP-l의 생성 및 분비를 유발한다. 다른 예로서, 소정의 IRM 화합물은 소정의 TH-2 시토킨, 예컨대 IL-4 및 IL-5의 생성 및 분비를 억제할 수 있다. 또한, 일부 IRM 화합물은 IL-1 및 TNF를 억제하는 것으로 알려져 있다(U.S. 특허 No. 6,518,265).

소정의 IRM은 예를 들어, U.S. 특허 No. 4,689,338; 4,929,624; 4,988,815; 5,037,986; 5,175,296; 5,238,944; 5,266,575; 5,268,376; 5,346,905; 5,352,784; 5,367,076; 5,389,640; 5,395,937; 5,446,153; 5,482,936; 5,693,811; 5,741,908; 5,756,747; 5,939,090; 6,039,969; 6,083,505; 6,110,929; 6,194,425; 6,245,776; 6,331,539; 6,376,669; 6,451,810; 6,525,064; 6,545,016; 6,545,017; 6,558,951; 및 6,573,273; 유럽 특허 0 394 026; U.S. 특허 공보 No. 2002/0055517; 및 국제 특허 공개 No. WO 01/74343; WO 02/46188; WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; WO 02/46749; WO 02/102377; WO 03/020889; WO 03/043572 및 WO 03/045391에 기재된 것과 같은 작은 유기 분자(예를 들어, 큰 생물학적 단백질, 펩티드 등과 반대되는 바와 같은 약 1000 달톤 미만의 분자량, 소정의 경우에, 약 500 달톤 미만)이다.

작은 분자 IRM의 추가적인 예는 소정의 퓨린 유도체(예컨대, U.S. 특허 No. 6,376,501 및 6,028,076에 기재된 것), 소정의 이미다조퀴놀린 아미드 유도체(예컨대, U.S. 특허 No. 6,069,149에 기재된 것), 소정의 벤즈이미다졸 유도체(예컨대, U.S. 특허 6,387,938에 기재된 것), 및 헤테로시클릭 고리 함유 5원 질소에 융합된 4-아미노피리미딘의 소정의 유도체(예컨대, U.S. 특허 No. 6,376,501; 6,028,076 및 6,329,381; 및 WO 02/08595에 기재된 아데닌 유도체)를 포함한다.

다른 IRM은 큰 생물학적 분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 IRM 올리고뉴클레오티드 서열은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 함유하고 예를 들어 U.S. 특허 No. 6,194,388; 6,207,646; 6,239,116; 6,339,068; 및 6,406,705에 기재되어 있다. 일부 CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 U.S. 특허 No. 6,426,334 및 6,476,000에 기재되어 있는 것과 같은 합성 면역조절 구조 모티브를 포함할 수 있다. 다른 IRM 뉴클레오티드 서열은 CpG가 부족하고, 예를 들어 국제 특허 공개 No. WO 00/75304에 기재되어 있다.

소정의 IRM은 톨(Toll)과 같은 수용체(TLR) 작동제로서 역할을 할 수 있다. 일부 소분자 IRM은 하나 이상의 TLR 2, 4, 6, 7, 및 8을 통해 작용할 수 있다. CpG는 TLR 9를 통해 작용할 수 있다.

면역 체계의 소정의 양상을 자극할 뿐만 아니라 다른 양상을 억제하여(참조, 예를 들어, U.S. 특허 No. 6,039,969 및 6,200,592), IRM은 많은 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 소분자 IRM 이미퀴모드는 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 외부 생식기관 및 항문주위 사마귀의 치료에 유용하다[예를 들어, Tomai et al., Antiviral Research 28(3): 253-64(1995) 참조]. IRM을 사용하여 치료될 수 있는 다른 질병의 예는 기저세포 암종, 습진, 본태성 혈소판혈증, B형 간염, 다발성 경화증, 종양성 질환, 건선, 류마티스성 관절염, 타입 I 단순 포진, 및 타입 11 단순 포진을 포함하지만, 그들에 한정되는 것은 아니다.

IRM 화합물은 또한 B 세포에 의한 항체 생성을 자극하여 체액성 면역을 조절할 수 있다. 또한, 각종 IRM은 백신 보강제로서 유용한 것으로 보여졌다(예를 들어, U.S. 특허 No. 6,083,505 및 6,406,705 참조).

발명의 요약

이제, IRM, 특히 소분자 IRM, 및 TLR 2, 4, 6, 7, 및 8의 작동제가, 면역자극 조성물을 형성하기 위해 항원과 화학적 또는 물리적으로 짝이 될 때, 면역 반응의 자극시에 놀랄 정도로 효과적이라는 것을 발견했다. 특정 조성물의 면역자극 효과는 조성물 내, 그러나 짝지워지지 않은 형태로 투여된 것의 효과와 같이 동일한 항원 및 동일하거나 유사한 IRM의 면역자극 효과보다 더 클 수 있다.

본 발명은 항원 부분과 짝을 이룬 면역 반응 조절제(IRM) 부분을 포함하는 면역자극 조성물을 제공한다. 일부 태양에서, IRM 부분은 톨(Toll)유사 수용체 2, 톨 유사 수용체 4, 톨 유사 수용체 6, 톨 유사 수용체 7, 또는 톨 유사 수용체 8의 작동제일 수 있거나 작동제로부터 유도될 수 있다. 다른 태양에서, IRM 부분은 하기를 포함하거나, 하기로부터 유도될 수 있다: 이미다조퀴놀린 아민; 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민; 이미다조피리딘 아민; 아릴 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민; 1,2-다리결합 이미다조퀴놀린 아민; 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민; 이미다조나프티리딘 아민; 테트라히드로이미다조나프티리딘 아민; 옥사졸로퀴놀린 아민; 티아졸로퀴놀린 아민; 옥사졸로피리딘 아민; 티아졸로피리딘 아민; 옥사졸로나프티리딘 아민; 또는 티아졸로나프티리딘 아민. 또다른 태양에서, IRM 부분은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 잔기를 포함할 수 있거나, 그 유기 잔기로부터 유도될 수 있다. 항원 부분은 아미노산 서열, 뉴클레오티드 서열, 지방고분자당, 프라이온(prion), 박테리아, 바이러스, 또는 진균을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 환자의 T 세포를 자극하는 방법을 제공한다. 이 방법은 항원 부분과 짝을 이룬 면역 반응 조절제를 포함하는 면역자극 조성물을 제공하고; 면역자극 조성물이 항원 제공 세포와 결합할 수 있게 하여 항원 제공 세포를 활성화시키고; 및 활성화 항원 제공 세포가 환자의 T 세포를 자극할 수 있게 함을 포함한다. 환자의 T 세포는 생체 내 또는 시험관 내에서 자극될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 항체 생성 세포를 자극하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 항원 부분과 짝을 이룬 면역 반응 조절제 부분을 포함하는 면역자극 조성물을 제공하고; 및 면역자극 조성물이 항체 생성 세포와 결합할 수 있게 함을 포함한다. 항체 생성 세포는 생체 내 또는 시험관 내에서 자극될 수 있다.

본 발명의 각종 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명, 실시예, 청구의 범위 및 부가 도면을 참조로하여 쉽게 명확해진다. 전체 명세서의 몇 부분에서, 안내는 실시예의 목록을 통해 제공된다. 각 예에서, 인용된 목록은 단지 대표적인 군으로서 사용되고 한정적인 목록으로서 해석되어서는 안된다.

도 1은 실시예 4에서 기재된 바와 같이 오브알부민으로 면역시킨 마우스에 의해 생성된 오브알부민 특이성 활성화 CD8⁺T 세포의 %를 보여준다.

도 2는 실시예 4에서 기재된 바와 같이 IRM-오브알부민 접합체로 피하로 면역시킨 마우스에 의해 생성된 오브알부민 특이성 활성화 CD8⁺T 세포의 %를 보여준다.

도 3은 실시예 4에서 기재된 바와 같이 IRM-오브알부민 접합체로 복강 내로 면역시킨 마우스에 의해 생성된 오브알부민 특이성 활성화 CD8⁺T 세포의 %를 보여준다.

도 4는 실시예 5에서 기재된 바와 같이 오브알부민으로 면역시킨 마우스에 의해 유발된 인터페론-γ의 생성을 보여준다.

도 5는 실시예 5에서 기재된 바와 같이 IRM-오브알부민 접합체로 피하로 면역시킨 마우스에 의해 유발된 인터페론-γ의 생성을 보여준다.

도 6는 실시예 5에서 기재된 바와 같이 IRM-오브알부민 접합체로 복강 내로 면역시킨 마우스에 의해 유발된 인터페론-γ의 생성을 보여준다.

도 7은 실시예 6에서 기재된 바와 같이 IRM-오브알부민 접합체에 의한 2차 면역의 제공시 항원 특이성 면역 반응의 증가를 보여준다.

도 8은 실시예 7에서 기재된 바와 같이 종양 특이성 IRM 항원 접합체에 의한 면역 후에 종양 크기의 감소를 보여준다.

도 9는 실시예 8에서 기재된 바와 같이 IRM-종양 항원 접합체에 의한 면역 후에 비장 중 활성 종양 항원 특이성 CD8⁺T 세포의 증식을 보여준다.

도 10은 실시예 8에서 기재된 바와 같이 IRM-종양 항원 접합체에 의한 면역 후에 종양 중 활성 종양 항원 특이성 CD8⁺T 세포의 증식을 보여준다.

도 11은 실시예 9에서 기재된 바와 같이 오브알부민에 의한 면역 후에 K^b/SIINFEKL을 제공하는 항원 제공 세포의 %를 보여준다.

도 12는 실시예 9에서 기재된 바와 같이 오브알부민 + 비(非)접합 IRM에 의한 면역 후에 K^b/SIINFEKL을 제공하는 항원 제공 세포의 %를 보여준다.

도 13은 실시예 9에서 기재된 바와 같이 IRM-오브알부민 접합체에 의한 면역 후에 K^b/SIINFEKL을 제공하는 항원 제공 세포의 %를 보여준다.

도 14은 실시예 10에서 기재된 바와 같이 오브알부민 발현 종양 세포로 면역테스트를 한 후에 오브알부민 또는 IRM-오브알부민 접합체로 면역시킨 마우스의 생 존율을 보여준다.

도 15는 실시예 11에서 기재된 바와 같이 오브알부민으로 면역시킨 후에 항원 특이성 CD8⁺T 세포의 증식을 보여준다.

도 16은 실시예 11에서 기재된 바와 같이 IRM 및 오브알부민의 콜로이드성 현탁액으로 면역시킨 후에 하나의 피실험물 중 항원 특이성 CD8⁺T 세포의 증식을 보여준다.

도 17은 실시예 11에서 기재된 바와 같이 IRM 및 오브알부민의 콜로이드성 현탁액으로 면역시킨 후에 제2 피실험물 중 항원 특이성 CD8⁺T 세포의 증식을 보여준다.

도 18은 2개의 상이한 IRM을 사용하는 IRM-항원 접합체에 의한 면역의 결과로서 항원 특이성 CD8⁺T 세포의 증식을 보여준다.

도 19은 각종 면역자극 조성물로 면역시킨 마우스의 오브알부민만에 의한 면역에 대한 CD8⁺T 세포의 배수 증식을 보여준다.

본 발명은 면역자극 조성물(ISC), 면역자극 조성물의 제조 방법, 면역자극 조성물을 사용하여 면역 반응을 유도하는 방법, 및 IRM을 다른 면역자극 성분(예를 들어, 항원)과 짝을 만들어서 IRM의 면역자극 활성을 향상하는 방법을 제공한다. ISC는 세포 매개성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 모두를 유도하기 위해 계획될 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 많은 IRM은 백신에도 제공된 1종 이상의 항원에 대해 발생된 면역 반응을 증가시키는 백신 보강제로서 사용될 수 있다. 놀랍게도. 본 발명에 따른 소정의 ISC는 짝을 이루지 않은 형태의 동일한 또는 필적할만한 IRM 및 동일한 항원을 함유하는 백신보다 훨씬 더 큰 면역 반응을 제공할 수 있다. 한 경우에, ISC는 동일한 항원 및 필적할만한 IRM을 포함한 백신에 의해 발생된 면역 반응보다 약 5배 더 큰 면역 반응을 제공했다.

본 명세서에서, 용어 "짝짓기" 및 이의 변형은 성분이 다른 것으로부터 자유롭게 분산하지 않도록 일부 화학적 또는 물리적 방식으로 결합된 성분을 의미한다. 예를 들어, 2개의 성분은 별개로 분산 또는 확산할 수 없도록 다른 하나에 공유결합될 수 있다. 짝짓기는 또한 예를 들어 비공유 친화성 결합, 이온성 결합, 친수성 또는 소수성 친화성, 물리 포착 등에 의해 달성될 수 있다. 짝짓기는 종래의 백신 중 항원 및 보강제의 단순 혼합물로부터 뚜렷하게 구별된다. 단순 혼합물에서, 성분은 백신접종된 환경 내에서 독립적으로 자유롭게 분산될 수 있다. 본 명세서에서, "짝짓기" 및 이의 변형은 짝은 이룬 성분이 면역 후에 화학적 또는 물리적 결합을 유지한다는 것을 의미한다.

면역 반응 조절제 부분은 임의의 적합한 IRM일 수 있거나, 그 IRM으로부터 유도될 수 있다. 적합한 IRM은 작은 유기 분자, 즉 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자를 포함하지만, 일부 태양에서 IRM은 약 700 달톤 미만의 분자량을 가질 수 있고, 일부 경우에, IRM은 약 500 달톤 ∼ 약 700 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 적합한 IRM은 또한 1종 이상의 TLR 2, 4, 6, 7, 8 및 9의 작용제를 포함한다. 일부 태양에서, 적합한 IRM은 상기에 기재된 소분자 IRM 화합물 및 이의 유도체를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다. 5원 질소 함유 헤테로시클릭 고리에 융합된 2-아미노피리딘을 갖는 적합한 소분자 IRM은 하기를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다: 아미드 치환 이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미드 치환 이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환 이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미도 에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환 이미다조퀴놀린 에테르, 및 티오에테르 치환된 이미다조퀴놀린 아민을 포함하지만 그에 한정되지 않은 이미다조퀴놀린 아민; 아미드 치환 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미드 치환 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 아릴 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 헤테로시클릭 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 아미도 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 술폰아미도 에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민, 우레아 치환 테트라히드로이미다조퀴놀린 에테르, 및 티오에테르 치환된 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민을 포함하지만 그에 한정되지 않은 테트라히드로이미다조퀴놀린 아민; 아미드 치환 이미다조피리딘 아민, 술폰아미도 치환 이미다조피리딘 아민, 우레아 치환 이미다조피리딘 아민을 포함하지만 그에 한정되지 않은 이미다조피리딘 아민; 아릴 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 헤테로시클릭 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 아미도 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 술폰아미도 에테르 치환된 이미다조피리딘 아민, 우레아 치환 이미다조피리딘 에테르, 및 티오에테르 치환된 이미다조피리딘 아민; 1,2-다리결합 이미다조퀴놀린 아민; 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민; 이미다조나프티리딘 아민; 테트라히드로이미다조나프티리딘 아민; 옥사졸로퀴놀린 아민; 티아졸로퀴놀린 아민; 옥사졸로피리딘 아민; 티아졸로피리딘 아민; 옥사졸로나프티리딘 아민; 및 티아졸로나프티리딘 아민.

추가의 적합한 소분자 IRM은 소정의 퓨린 유도체, 소정의 이미다조퀴놀린 아미드 유도체, 소정의 벤즈이미다졸 유도체, 및 상기에 기재된 5원 질소 함유 헤테로시클릭 고리에 융합된 4-아미노피리미딘의 소정의 유도체(예를 들어, 아데닌 유도체)를 포함한다.

다른 적합한 IRM은 CpG 및 다른 IRM 뉴클레오티드 서열(상기에 기재된 CpG 이 부족함)을 포함한다.

항원 부분은 세포 매개성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 모두를 상승시키는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 항원 물질은 하기를 포함하지만, 그에 한정되지는 않는다: 펩티드; 폴리펩티드; 지질; 당지질; 다당류; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; 프라이온; 활성 또는 비활성 박테리아, 바이러스 또는 진균; 및 박테리아, 바이러스, 진균, 원충, 종양 유도, 또는 유기체 유도 면역원, 독소 또는 변성독소.

본 발명의 면역자극 조성물이 치료제로서 사용될 수 있는 질환은 하기를 포함하지만, 그에 한정되지 않는다:

(a) 바이러스성 질환, 예컨대 생식기관 사마귀, 보통 사마귀, 발바닥 사마귀, B형 간염, C형 간염, 단순 포진 바이러스 타입 I 및 타입 II, 전염물렁종, 두창, HIV, CMV, VZV, 리노바이러스, 아데노바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자, 가성 인플루엔자;

(b) 박테리아성 질환, 예컨대 결핵, 및 조류형 결핵균, 나병;

(c) 다른 감염성 질환, 예컨대 진균병, 클라미디아, 칸디다, 아스페르길루스, 크립토코쿠스 수막염, 폐포자충, 와포자충증, 히스토플라스마증, 톡소포자충증, 파동편모충 감염, 리슈만편모충증;

(d) 종양성 질환, 예컨대 상피내종양, 자궁경부 형성이상, 광선 각화증, 기저세포 암종, 편평 세포 암종, 털세포 백혈병, 카르포시(Karposi)육종, 흑색종, 콩팥 세포 암종, 골수성 백혈병, 다발 골수성, 비(非)호지킨(Hodgkin)림프종, 피부 T-세포 임파종, 및 기타 암;

(e) TH-2 매개의, 아토피, 및 자가면역 질환, 예컨대 아토피성 피부염 또는 습진, 호산구증가증, 천식, 알레르기, 알레르기성 비염, 전신성 홍반성 루프스, 본태성 혈소판혈증, 다발성 경화증, 옴멘(Ommen)증후군, 원반모양 루프스, 원형 탈모증, 흉터종 형성 및 다른 형태의 흉터형성의 억제, 및 만성 상처를 포함하는 상처 치료의 개선; 및

(f) 활성 바이러스 및 박테리아성 면역원 및 비활성 바이러스성, 종양 유도의, 원충의, 유기체 유도의, 진균류의, 및 박테리아 면역원, 변성독소, 독소, 다당류, 단백질, 당단백질, 펩티드, 세포 백신, DNA 백신, 재조합 단백질, 당단백질, 및 펩티드 등과 같은 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 상승시키는 임의의 물질과 결합하여 사용하기 위한 백신 보강제 (이는 예를 들어, BCG, 콜레라, 흑사병, 장티프스, A형, B형, 및 C형 간염, A형 및 B형 인플루엔자, 파라인플루엔자, 회색질척수염, 광견병, 홍역, 볼거리, 풍진, 황열, 파상풍, 디프테리아, b형 헤모필러스(hemophilus) 인플루엔자, 결핵, 수막구균성 및 폐렴구균 백신, 아데노바이러스, HIV, 수두, 거대세포바이러스, 뎅기, 고양이 백혈병, 닭 흑사병, HSV-1 및 HSV-2, 돼지 콜레라, 일본 뇌염, 호흡기 세포융합 바이러스, 로타바이러스, 유두종 바이러스, 및 황열과 결합하여 사용됨).

본 발명의 면역자극 조성물은 면역 반응 조절제 부분 및 항원 부분 모두의 유효량의 생물학적 활성을 포함한다. 유효량의 면역 반응 부분의 생물학적 활성("IRM 활성")은 하나 이상의 하기를 포함한다: T 세포에 의한 시토킨 생성 증가, 항원에 특이적인 T 세포의 활성, 및 가지 세포의 활성. 유효량의 항원 부분의 생물학적 활성("항원 활성")은 하나 이상의 하기를 포함한다: B 세포에 의한 항원에 특이적인 항체의 생성, 및 항원을 제공하는 항원 제공 세포의 생성. 본 발명의 면역자극 조성물은 제약학적 조성물을 형성하기 위해 제약학적으로 허용가능한 담체, 하나 이상의 부형제, 또는 이들의 일부 조합물과 조합될 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물에 사용된 활성 화합물의 여분의 양이 당업자에게 공지된 인자, 예컨대 면역자극 조성물의 물리적 및 화학적 본성, 담체의 본성, 피실험물의 면역 시스템의 본성(예를 들어, 억제, 절충, 자극), 및 목적하는 투여 요법에 따라 변할지라도, 본 발명의 제약학적 조성물은 피실험물에 대해 약 100ng/kg ∼ 약 50mg/kg, 바람직하게는 약 10μg/kg ∼ 약 5mg/kg의 IRM의 투여량을 제공하기 위해 충분한 면역 반응 조절제 부분을 함유할 것이라는 것이 예상된다.

다양한 투여 형태, 예컨대 정제, (마름모꼴)정제, 캡슐, 비경구 제형, 시럽, 크림, 연고, 에어로솔 제형, 경피 패치, 점막 패치 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 치료 요법에서 단일 치료제로서 투여될 수 있거나, 제약학적 조성물은 다른 제약학적 조성물 또는 다른 활성제(추가 면역 반응 조절제, 항바이러스, 항생제, 항체, 단백질, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등 포함)와 조합하여 투여될 수 있다.

일부 태양에서, 면역자극 면역 반응 조절제 부분은 면역자극 접합체를 형성하기 위해 항원 부분에 공유결합적으로 연결될 수 있다. 본 명세서에서, "공유결합적인 연결"은 배타적으로 공유결합을 통한 2개의 성분의 직접 및 간접 연결을 의미한다. 직접 공유결합 연결은 면역 반응 조절제 부분의 원자와 항원 부분의 원자 사이의 직접 공유결합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 공유결합 연결은 IRM 부분 및 항원 부분의 공유결합 연결을 쉽게 하는 IRM 부분, 항원 부분 또는 모두에 공유결합적으로 부착된 연결 기를 통해 일어날 수 있다. 간접 공유결합 연결은 제3 성분, 예를 들어 면역 반응 조절제 부분 및 항원 부분이 별개로 공유결합적으로 부착된 고체 지지체를 포함할 수 있다. 또한, "공유결합 연결" 및 "공유 부착"은 서로 교환하여 사용된다.

면역자극 접합체는 IRM 부분으로서 면역 반응 조절제 잔기 및 항원 부분으로서 항원 함유 잔기를 포함할 수 있다. 면역자극 접합체를 합성하는 경우, 각 면역 반응 조절제 잔기, 연결 기, 및 항원 함유 잔기는 수득한 면역자극 접합체가 유효량의 IRM 활성 및 유효량의 항원 활성을 가지도록 선택될 수 있다.

연결 기는, 유효량의 IRM 활성 및 항원 활성을 유지하는 동안에, 항원 함유 잔기가 면역 반응 조절제 잔기에 공유결합적으로 연결되게 하는 임의의 적합한 유기 연결 기일 수 있다. 일부 태양에서, 연결 기는 활성 핵심과 T 세포 사이의 생물학적 유효 상호작용 (이는 시토킨 생성과 같은 IRM 활성으로 귀결됨)을 방해하지 않도록 면역 반응 조절제 잔기의 활성 핵심과 항원 함유 잔기 사이의 충분한 공간을 만들기 위해 선택될 수 있다.

연결 기는 공유결합을 형성하기 위해 항원과 반응할 수 있는 반응성 기를 포함한다. 적합한 반응성 기는 문헌[Hermanson, G.(1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, 제2장 "The Chemistry of Reactive Functional Groups", 137-166]에서 논의된 것을 포함한다. 예를 들어, 연결 기는 1차 아민(예를 들어, N-히드록시숙신이미딜 에스테르 또는 N-히드록시술포숙신이미딜 에스테르)과 반응할 수 있고; 술프히드릴 기(예를 들어, 말레이미드 또는 요오도아세틸)와 반응할 수 있거나, 광반응성 기(예를 들어, 4-아지도페닐, 2-히드록시-4-아지도페닐, 2-니트로-4-아지도페닐, 및 2-니트로-3-아지도페닐을 포함하는 페닐 아지드)일 수 있다.

연결 기와 공유결합적으로 연결될 수 있는 화학적 활성 기는 연결 기에 공유결합적 연결을 위해 직접 사용될 수 있는 기 또는 연결 기에 공유결합 연결을 위해 이용할 수 있도록 변성될 수 있는 기(들)을 포함한다. 예를 들어, 적합한 화학적 활성 기는 1차 아민 및 술프히드릴 기를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다. 소정의 항원 함유 잔기, 예를 들어 단백질 및 기타 펩티드가 복수의 화학적 활성 기를 포함할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 소정의 ISC는 특정 항원 함유 잔기에 접합된 복수의 IRM 잔기를 포함할 수 있다.

면역자극 접합체의 제조 방법

본 발명에 따른 면역자극 접합체는 통상 면역 반응 조절제를 가교제와 반응시키고, 그 다음, 수득한 중간체를 항원과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 생(生)접합체의 제조에 적합한 많은 가교제는 공지되어 있고, 많은 것들은 시판되고 있다. 예를 들어, 문헌[Hermanson, G.(1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press] 참조.

본 발명에 따른 면역자극 접합체는 예를 들어 반응식 I에 보여진 방법으로 제조될 수 있는데, 반응식 I에서, 항원 함유 잔기는 R₁을 통해 IRM 잔기에 연결된다. 반응식 I의 단계(1)에서, 화학식 III의 화합물은 화학식 IV의 이종2관능성 가교제와 반응하여 화학식 II의 화합물을 제공한다. R_A 및 R_B 각각은 다른 쪽과 반응하기 위해 선택된 관능기를 함유한다. 예를 들어, R_A가 1차 아민을 함유한다면, 그 때, 이종2관능성 가교제는 R_B가 아민 반응성 관능기, 예컨대 N-히드록시술포숙신이미딜 에스테르를 함유하는 것으로 선택될 수 있다. R_A 및 R_B는 반응하여 접합체 내에 원하는 링커(linker)기를 제공하도록 선택될 수 있다.

R_A가 관능기를 함유하는 화학식 III의 화합물의 제조방법은 공지되어 있다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 4,689,338; 4,929,624; U.S. 특허 No. 5,268,376; 5,389,640; 5,352,784; 5,494,916; 4,988,815; 5,367,076; 5,175,296; 5,395,937; 5,741,908; 5,693,811; 6,069,149; 6,194,425; 및 U.S. 특허 6,331,539 및 국제 공개 WO 00/76505; WO 00/76518; WO 02/46188, WO 02/46189; WO 02/46190; WO 02/46191; WO 02/46192; WO 02/46193; 및 WO 02/46194 참조.

많은 이종2관능성 가교제는 공지되어 있고, 많은 것은 시판되고 있다. 예를 들어 문헌[Hermanson, G.(1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, 제5장 "Heterobifunctional Cross-Linkers", 229-285] 참조. 반응은 통상 적합한 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 중 화학식 III의 화합물의 용액을 적합한 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 중 화학식 IV의 이종2관능성 가교제의 용액과 조합시킴으로써 수행될 수 있다. 반응은 실온에서 수행될 수 있다. 그 다음, 화학식 II의 생성물은 종래의 기술로 분리될 수 있다.

반응식 I의 단계(2)에서, 반응성 기 Z_A를 함유하는 화학식 II의 화합물은 항원과 반응하여 화학식 I의 면역자극 접합체를 제공한다. 반응은 통상 적합한 용매, 예컨대 디메틸 술폭시드 중 화학식 II의 화합물의 용액을 적합한 완충제, 예컨대 PBS 중 항원의 용액과 조합시킴으로써 수행될 수 있다. 반응은 실온 또는 감소된 온도(∼4℃)에서 수행될 수 있다. Z_A가 광반응성 기, 예컨대 페닐 아지드이면, 그 때, 반응 혼합물은 가교결합을 달성하는데 적합한 시간의 길이(예를 들어, 10 - 20분)동안에 장파장 UV 광에 노출될 것이다. 항원 부분에 대한 면역 반응 조절제 잔기의 평균 수는 반응에 사용된 화학식 II의 화합물의 양을 조절함으로써 제어될 수 있다. 화학식 I의 면역 반응 접합체는 종래의 기술을 사용하여 분리 및 정제될 수 있다.

대안적으로, 화학식 II의 화합물은 이종2관능성 가교제의 사용없이 합성될 수 있다. 화학식 II의 화합물이 반응성 기 Z_A를 함유하는 한, 상기의 단계(2)의 방법을 사용하여 항원과 반응하여 면역자극 접합체를 제공할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬", "알케닐" 및 접두어 "알크-"는 직쇄, 측쇄, 및 환형 기, 즉, 시클로알킬 및 시클로알케닐을 포함한다. 달리 상술하지 않으면, 이들 기는 탄소수 1 - 20 을 함유하고, 알케닐 기는 탄소수 2 - 20 을 함유한다. 바람직한 기는 총탄소수 10 이하를 갖는다. 환형 기는 단일환형 또는 다환형일 수 있고, 바람직하게는 고리 탄소원자 3 - 10을 갖는다. 예시적인 환 형 기는 시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로프로필메틸, 및 아다만틸을 포함한다.

용어 "할로알킬"은 퍼플루오르화 기를 포함하는, 1개 이상의 할로겐 원자에 의해 치환된 기를 포함한다. 이는 또한 접두어 "할로-"를 포함하는 기에 대해서도 마찬가지이다. 적합한 할로알킬 기의 예는 클로로메틸, 트리플루오로메틸 등이다.

본 명세서에 사용된 용어 "아릴"은 탄소환형 방향족 고리 또는 고리계를 포함한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 비페닐, 플루오레닐 및 인데닐을 포함한다. 용어 "헤테로아릴"은 방향족 고리 또는 고리계(이는 1개 이상의 고리 헤테로 원자, 예를 들어 O, S, N 을 함유함)를 포함한다. 적합한 헤테로아릴 기는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 트리아졸릴, 피롤릴, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 카르바졸릴, 벤즈옥사졸릴, 피리미디닐, 벤즈이미다졸릴, 퀸옥살리닐, 벤조티아졸릴, 나프티리디닐, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 푸리닐, 퀸아졸리닐 등을 포함한다.

"헤테로시클릴"은 비방향족 고리 또는 고리계(이는 1개 이상의 고리 헤테로 원자, 예를 들어, 0, S, N 을 함유함)을 포함하고, 상기 헤테로아릴 기의 전부 포화 및 부분 불포화 유도체 모두를 포함한다. 예시적인 헤테로시클릭 기는 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 및 아미다졸리디닐을 포함한다.

아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릴 기는 비치환될 수 있거나, 하기로 이루 어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있다: 알킬, 알콕시, 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시, 알킬티오, 할로알킬, 할로알콕시, 할로알킬티오, 할로겐, 니트로, 히드록시, 메르캅토, 시아노, 카르복시, 포르밀, 아릴, 아릴옥시, 아릴티오, 아릴알콕시, 아릴알킬티오, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 헤테로아릴알콕시, 헤테로아릴알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 헤테로시클로알킬, 알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알콕시카르보닐, 할로알킬카르보닐, 할로알콕시카르보닐, 알킬티오카르보닐, 아릴카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시카르보닐, 아릴티오카르보닐, 헤테로아릴티오카르보닐, 알카노일옥시, 알카노일티오, 알카노일아미노, 아릴카르보닐옥시, 아릴카르보닐티오, 알킬아미노술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 헤테로아릴술포닐, 아릴디아지닐, 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 아릴알킬술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 알케닐카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 아릴알킬카르보닐아미노, 헤테로아릴카르보닐아미노, 헤테로아릴알킬카르보닐아미노, 알킬술포닐아미노, 알케닐술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 아릴알킬술포닐아미노, 헤테로아릴술포닐아미노, 헤테로아릴알킬술포닐아미노, 알킬아미노카르보닐아미노, 알케닐아미노카르보닐아미노, 아릴아미노카르보닐아미노, 아릴알킬아미노카르보닐아미노, 헤테로아릴아미노카르보닐아미노, 헤테로아릴알킬아미노카르보닐아미노, 및 헤테로시클릴의 경우에, 옥소. 다른 기가 "치환된" 또는 "임의 치환된"으로서 기재된다면, 그때, 그들 기는 또한 1개 이상의 상기 열거된 치환기에 의해 치환될 수 있다.

소정의 치환기가 통상 바람직하다. 예를 들어, 바람직한 R₂기는 수소, 탄소수 1 - 4개의 알킬 기(즉, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 및 시클로프로필메틸), 및 알콕시알킬 기(예를 들어, 메톡시에틸 및 에톡시메틸)를 포함한다. 바람직하게는, R₃ 및 R₄는 독립적으로 수소 또는 메틸이거나, R₃ 및 R₄는 함께 결합하여 벤젠 고리, 피리딘 고리, 6원 포화 고리 또는 6원 포화 고리(이는 질소 원자를 함유함)를 형성한다. 1개 이상의 이들 바람직한 치환기는, 존재한다면, 임의의 조합으로 본 발명의 화합물에 존재할 수 있다.

일부 태양에서, 면역자극 접합체는 항원 부분 및 IRM 부분이 부착되는 고체 지지체 구조를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, IRM 부분, 항원 부분, 또는 모두는 연결 기, 예컨대 상기에 기재된 것을 사용하여 고체 지지체에 공유결합적으로 부착될 수 있다. 고체 지지체는 예를 들어 아가로스 비드, 금 입자 등을 포함할 수 있다. 그 다음, 고체 지지체는 부착된 IRM 부분 및 항원 부분을 적절한 표적 세포군에 함께 전달하기 위해 사용될 수 있다. 생물분자를 고체 지지체에 부착하는 방법은 선행기술에 공지되어 있다. 고체 지지체 상에 생물분자를 고정시키는 프로토콜은 선행기술에 공지되어 있고, 적합한 시약은 시판되는 것을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 면역자극 조성물은 IRM 부분 및 항원 부분 사이의 화학적 결합 (공유결합 연결 제외)을 함유할 수 있다. 예를 들어, ISC는 항원 부분 및 IRM 부분 사이의 친화성 상호작용을 포함할 수 있다. 아비딘-바이오틴 친화성은 항원 부분을 IRM 부분과 짝을 이루기 위해 이용될 수 있는 비공유결합 상호작용의 하나의 예를 나타낸다. 바이오틴 분자는 예를 들어 단백질성 항원(예를 들어, 1차 아민 또는 술프히드릴 기) 중 아미노산에 존재하는 수많은 관능기 중의 하나를 통해 항원에 화학적으로 부착될 수 있다. IRM 부분은 유사한 화학 수단에 의해 아비딘 분자에 접합될 수 있다. 그 다음, IRM 부분 및 항원 부분은 아비딘-바이오틴 친화성 상호작용에 의해 짝을 이룰 수 있다. 단백질을 바이오티닐화시키고 화학 기를 아비딘에 연결하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. ISC를 만드는데 유용할 수 있는 대안적인 친화성 상호작용은 예를 들어 항원/항체 상호작용, 당단백질/레시틴 상호작용을 포함한다.

면역자극 조성물은 또한 IRM 부분 및 항원 부분 사이의 이온성 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, IRM 부분, 항원 부분, 또는 모두는 화학적으로 변형되어 정반대로 충전된 성분을 함유할 수 있다. 그 다음, 정반대로 충전된 IRM 부분 및 항원 부분은 2개의 실체 사이의 이온성 상호작용을 위하여 함께 인큐베이팅될 수 있다. 그 다음, 수득한 ISC는 피실험물 또는 세포군에 투여될 수 있고, 그 결과, IRM 및 항원 모두를 표적 세포에 함께 전달할 수 있다.

공유결합적으로 연결된 ISC의 경우에서와 같이, IRM 부분 및 항원 부분이 비공유결합적으로 짝을 이룬 ISC는 고체 지지체를 포함할 수 있다.

면역자극 접합체를 사용하여 면역 반응을 유도하는 방법

본 발명에 따른 면역자극 조성물은 시험관 내 또는 생체 내에서 면역계의 세포로부터 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 ISC는 백신의 성분으로서, 또는 T 세포 또는 B 세포의 시험관 내 세포 배양에 사용된 면역자극 인자로서 유용할 수 있다. 사실, IRM은 짝을 이루지 않은 백신 보강제로서 전달되는 것과 비교하여 본 발명에 따른 ISC의 부분으로 전달될 때, 더욱 강한 면역자극 인자일 수 있다. 시험관 내에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 때, 시험관 내에서 활성화된 면역 세포는 환자에게 재도입될 수 있다. 대안적으로, 활성화된 면역 세포에 의해 분비된 인자, 예를 들어 항체, 시토킨 등은 조사, 진단 및/또는 치료 용도를 위해 수집될 수 있다.

달리 언급하지 않는다면, 숙주는 피하로 또는 복강내로 면역성이 제공될 수 있다. 숙주가 ISC에 대한 면역 반응을 발생시키게 하는 충분한 시간 후에, 면역 부위에 적합한 면역 세포는 채취된다. 예를 들어, 임파 절은 피하로 면역성이 제공되었던 숙주로부터 채취될 수 있다. 비장 세포는 복강으로 면역성이 제공된 숙주로부터 채취될 수 있다. 일부 숙주를 위해, 세포 채취는 숙주의 희생을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 세포 채취는 적합한 조직의 생체검사 또는 수술적 절제를 포함할 수 있다.

하나의 태양에서, ISC는 항원 특이성 T 세포의 증식을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 숙주(예를 들어, 마우스)는 특정 항원을 포함하는 ISC로 면역성이 제공될 수 있다. 숙주의 충분한 배양 후에, 소정의 T 세포(예를 들어, CD8⁺T 세포)는 면역에 응하여 항원 특이성 T 세포를 성숙시킬 것이다. 높은 %의 T 세포는 항원만으로 면역성이 제공된 숙주에 비해 ISC로 면역성이 제공된 숙주에서 항원 특이적일 것이다(도 1-3). ISC는 IRM 부분 및 항원 부분을 공유결합적으로 연결시키거나(도 1-3), 대안적으로 예를 들어 콜로이드성 현탁액을 비공유결합적으로 짝짓기를 함으로 짝을 이룰 수 있다(도 15-17).

항원이 단백질(예를 들어, 오브알부민)이라면, ISC가 전체 단백질을 포함하는 것은 필요하지 않을 수 있다. 예를 들어, 단백질로부터의 면역우성 펩티드는 전체 단백질 항원에 특이적인 T 세포의 발달을 야기하는데 필요한 모든 것일 수 있다. 더욱이, 추가 면역, 예를 들어, 초기 면역 후 15일은 항원 특이성 T 세포의 유도를 증가시킬 수 있다(도 7).

ISC에 의한 숙주의 면역은 CD8⁺ 세포독성 T 림프구(CTL)에서 항원 특이성 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 반응은 종양 및 바이러스성 감염 세포군을 포함하지만 그에 한정되지 않는 많은 조건에 대해서일 수 있다. ISC는 또한 장래의 종양 또는 바이러스성 감염에 대한 보호성 CTL 면역성을 숙주에게 제공하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.

또다른 태양에서, ISC는 시험관 내에서 항원 특이성 T 세포에 의해 시토킨 생성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 면역 숙주로부터의 적합한 조직은 채취될 수 있고, 항원으로 시험관 내에서 인큐베이팅될 수 있고, 이에 따라, 하나 이상의 시토킨의 생성을 유도할 수 있다(예를 들어, IFN-γ, 도 4-6 참조). 또한, 항원이 단백질인 경우에, 항원 단백질로부터의 면역우성 펩티드는 시토킨을 생성 및 분비하기 위해 세포 배양에서 항원 특이성 T 세포를 유도하는데 필요한 모든 것일 수 있다.

또다른 태양에서, ISC는 생체 내에서 종양 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 특정 항원을 발현하는 종양 세포를 갖는 숙주는 항원을 함유하는 ISC로 면역성이 제공될 수 있다. 일부 태양에서, 초기 면역은 제2 면역으로 상승될 수 있다. 항원을 함유하는 ISC로 면역성이 제공된 숙주로부터 채취된 종양은 항원만으로 면역성이 제공된 숙주로부터 채취된 종양보다 통상 더 작다(도 8). 더욱이, 종양 분석의 결과에 따르면, ISC로 면역성이 제공된 숙주로부터 채취된 종양은 항원만으로 면역성이 제공된 숙주로부터 채취된 종양보다 더 높은 % 의 항원 특이성 T 세포를 함유했다(도 10).

또다른 태양에서, ISC는 세포 표면에서 MHC 부류 I 착체 내의 항원의 펩티드를 제공하는 항원 제공 세포(APC, 예를 들어, 가지 세포)를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 숙주는 이러한 유형의 반응을 유도하기 위해 정맥 내로 면역성이 제공될 수 있다. 반응은 항원/MHC 부류 I 착체를 제공하는 APC에 대해 비장 세포를 채취 및 분석함으로써 입증될 수 있다(도 11-13).

대안적인 태양에서, ISC는 시험관 내에서 항원 특이성 T 세포를 발달시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 골수 세포는 특정 항원을 발현하는 종양을 갖는 환자로부터 채취될 수 있다. 채취된 세포는 종양에 의해 발현된 항원을 함유하는 ISC로 시험관 내에서 인큐베이팅될 수 있다. 다시 한번, 항원이 단백질이라면, ISC는 단백질의 면역우성 펩티드만을 포함할 필요가 있을 수 있다. ISC에 의한 인큐베이팅에 응하여 시험관 내에서 발달하는 항원 특이성 T 세포는 환자에게 재도입 될 수 있다.

또 다른 대안적인 태양에서, ISC는 생존의 가능성, 기간 또는 모두를 증가시키기 위해 종양을 갖는 피실험물에 투여될 수 있다. 흑색종 세포로 면역 유도된 마우스에 투여된 종양 특이성 항원 부분을 포함하는 ISC는 종양 항원만으로 면역성이 제공된 마우스에 비해 증가된 생존률을 제공한다(도 14).

하기 실시예는 본 발명의 특성, 이점, 및 다른 세부사항을 단지 추가로 설명하기 위해 선택되었다. 그러나, 실시예는 이러한 목적을 만족시키지만, 다른 조건 및 세부사항 뿐만 아니라 사용된 특정 물질 및 양은 본 발명의 범위를 부당하게 제한하는 식으로 해석되어서는 안된다는 것을 명확히 이해해야 한다.

IRM 화합물의 제조

IRM 화합물 1(IRM1): N-[6-({2-[4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-l,1-디메틸에틸}아미노)-6-옥소헥실]-4-아지도-2-히드록시벤즈아미드

파트 A

N₂하에서, 200mL의 무수 CH₂Cl₂ 중 4-클로로-3-니트로퀴놀린(17.3g, 83.2mmol)의 교반 용액을 트리에틸아민(23.2mL, 166.4mmol) 및 1,2-디아미노-2-메틸프로판(9.57mL, 91.5mmol)으로 처리했다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 800mL의 CHCl₃로 희석하고, H₂0(3×300mL) 및 염수(300mL)로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 2-메틸-N¹-(3-니트로퀴놀린-4-일)프로판-1,2-디아민(21.0g)을 담황색 고체로서 수득했다.

파트 B

N₂하에서, 50mL의 테트라히드로푸란(THF) 중 2-메틸-N¹-(3-니트로퀴놀린-4-일)프로판-1,2-디아민(2.60g, 10.0mmol)의 용액을 O℃로 냉각하고, 10mL의 1N NaOH 용액으로 처리했다. 그 다음, 디-tert-부틸 디카보네이트(2.18g, 10.0mmol)을 급속하게 교반된 용액에 첨가했다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반했다. 추가 400 mg의 디-tert-부틸 디카보네이트를 첨가하고, 교반을 3일 동안 계속했다. 그 다음, 반응물을 에틸 아세테이트(200mL)로 처리하고, H₂0(2×) 및 염수로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고 농축하여 10% EtOAc/헥산으로 연화한 황색 고체를 수득했다. 고체를 여과로 분리하고 밤새 진공에서 건조시켜 tert-부틸 1,1-디메틸-2-[(3-니트로퀴놀린-4-일)아미노]에틸카바메이트 (2.80g)을 황색 분말로서 수득했다.

파트 C

150mL의 톨루엔 중 tert-부틸 1,1-디메틸-2-[(3-니트로퀴놀린-4-일)아미노]에틸카바메이트(3.50g, 9.72mmol)의 용액을 0.3g의 5% 백금/탄소로 처리하고, H₂(3 atm, 3 Kg/cm²)하에서 6시간 동안 진탕했다. 그 다음, 용액을 셀라이트(Celite) 패드를 통해 여과하고 농축하여 3.04g의 미정제 tert-부틸 2-[(3-아미노퀴놀린-4-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트를 담오렌지색 포말(foam)로서 수득했다.

파트 D

50mL의 CH₂Cl₂ 중 tert-부틸 2-[(3-아미노퀴놀린-4-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(3.04g, 9.21mmol)의 용액을 O℃로 냉각하고, 트리에틸아민(1.41mL, 10. 13mmol) 및 에톡시아세틸 클로라이드(1.02mL, 10.17mmol)로 처리했다. 2시간 후에, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축했다. 수득한 시럽을 100mL의 EtOH에 넣고, 4.5mL의 트리에틸아민으로 처리했다. 용액을 밤새 환류로 가열했다. 반응 혼합물을 농축하고, 100mL의 CH₂Cl₂에 넣고, H₂0(2×) 및 염수로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고, 농축했다. 수득한 시럽을 칼럼 크로마토그래피(SiO₂, 80% EtOAc/헥산)로 정제하여 tert-부틸 2-[2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀 린-1-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(1.57g)를 복숭아색 포말로서 수득했다.

파트 E

30mL의 CH₂Cl₂ 중 tert-부틸 2-[2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(1.57g, 3.94mmol)의 용액을 3-클로로퍼옥시벤조산(77%, 1.01g, 4.57mmol)으로 처리했다. 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 30mL의 추가 CH₂Cl₂ 으로 처리하고, 1% Na₂CO₃ 용액(2×30mL), H₂0 및 염수로 세정했다. 그 다음, 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 tert-부틸 2-[2-(2-(에톡시메틸)-5-옥시도-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(1.58g)를 담갈색 포말로서 수득했다.

파트 F

20mL의 1,2-디클로로에탄 중 tert-부틸 2-[2-(2-(에톡시메틸)-5-옥시도-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(1.57g, 3.79mmol)의 용액을 70℃로 가열하고, 2mL의 농축 NH₄0H 용액으로 처리했다. 급속하게 교반된 용액에 고형 p-톨루엔술포닐 클로라이드(795 mg, 4.17mmol)를 첨가했다. 그 다음, 반응 혼합물을 가압 용기에 밀봉시키고, 가열을 2시간 동안 계속했다. 그 다음, 반응 혼합물을 냉각하고, 50mL의 CHCl₃로 처리했다. 그 다음, 반응 혼합물을 H₂0, 1% Na₂CO₃ 용액(3×) 및 염수로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 담갈색 오일로서 생성물을 수득했다. 수득한 오일을 칼럼 크로마토그래피(SiO₂, 2-5% MeOH/CHCl₃)로 정제하여 tert-부틸 2-[4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(1.26g)를 담황색 포말로서 수득했다.

파트 G

tert-부틸 2-[4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-1,1-디메틸에틸카바메이트(1.26g, 3.05mmol)를 10mL의 EtOH에 용해시키고, EtOH 중 10mL의 2M HCl로 처리했다. 2시간 동안 환류에서 가열한 후, 반응 혼합물을 냉각하고, 감압하에서 농축했다. 수득한 황색 고체를 50mL의 H₂0에 용해시키고, CHCl₃(20mL)로 추출했다. 유기층을 버리고, 수성 부분은 농축 NH₄0H 용액의 첨가로 염기성(pH ∼ 12)으로 만들었다. 그 다음, 이를 CHCl₃(4×20mL)으로 추출하고, 합한 유기성 부분을 Na₂SO₄으로 건조하고, 농축시켜 1-(2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(808 mg)을 담갈색 분말로서 수득했다. m. p. 161.0 - 162.0℃;

파트 H

질소 대기 하에서, N,N-디메틸포름아미드 DMF(2-4mL) 중 N-히드록시술포숙신이미딜(아지도살리실아미도)헥사노에이트(100mg, 0.204mmol의 Sulfo-LC-NHS-ASA(피어스 바이오테크놀로지, 인크. (Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 락포드 소재))의 용액을 DMF(5 mL) 중 1-(2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(63mg, 0.201mmol)의 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 포일로 싼 용기에서 질소하에서 교반했다. 2일 후, 추가 50 mg의 N-히드록시술포숙신이미딜(아지도살리실아미도)헥사노에이트를 첨가했다. 약 1주 후에, 반응 혼합물을 감압하에서 55℃에서 농축했다. 잔류물을 소량의 메탄올 함유 디클로로메탄과 물 사이에서 분배했다. 유기층을 분리하고, 감압하에서 농축했다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(클로로포름 중 6% 메탄올로 용리한 2×15 cm SiO₂)로 정제하여 53 mg의 생성물을 무색 유리로서 얻었다. 원뿔형 플라스크에 디클로로메탄을 사용하여 유리를 옮긴 후, 농축하여 포말을 얻었다. 포말을 고진공하에서 밤새 건조하여 48mg의 백색 결정형 고체를 얻었다. NMR에 의한 분석은 디클로로메탄 의 존재를 보여주고, 그 결과, 물질을 고진공 하에서 밤새 및 그 다음 50 ℃에서 5시간 동안 진공 오븐에서 건조했다. HPLC에 의한 분석은 순도 > 93% 을 나타내었다.

IRM 화합물 2(IRM2): N-{6-[(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸)아미노]-6-옥소헥실}-4-아지도-2-히드록시벤즈아미드

파트 A

N₂하에서, 180mL의 테트라히드로푸란(THF) 중 2-(2-아미노에톡시)에탄올(29.0g, 0.276 mol)의 용액을 O℃로 냉각하고, 140mL의 2N NaOH 용액으로 처리했다. 그 다음, 180mL의 THF 중 디-tert-부틸 디카보네이트(60.2g, 0.276 mol)의 용액을, 급속하게 교반된 용액에 1시간에 걸쳐 적가했다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가 18시간 동안 교반했다. 그 다음, THF를 감압하에서 제거하고, 잔류 수성 슬러리를 150mL의 1M H₂SO₄ 용액의 첨가로 pH 3 이 되게 했다. 그 다음, 이를 에틸 아세테이트(300mL, 100mL)로 추출하고, 합한 유기층을 H₂0(2×) 및 염수로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 tert-부틸 2-(2-히드록시에톡시)에틸카바메이트를 무색 오일(47.1g)로서 수득했다.

파트 B

1L의 무수 CH₂Cl₂ 중 tert-부틸 2-(2-히드록시에톡시)에틸카바메이트(47.1g, 0.230mol)의 급속하게 교반된 용액을 N₂하에서 O℃로 냉각하고, 트리에틸아민(48.0mL, 0.345mol)로 처리했다. 그 다음, 메탄술포닐 클로라이드(19.6mL, 0.253 mol)를 30분에 걸쳐 적가했다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가 22시간 동안 교반했다. 반응물을 500mL 포화 NaHCO₃ 용액의 첨가로 켄칭시키고, 유기층을 분리했다. 그 다음, 유기상을 H₂0(3×500mL) 및 염수로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에톡시}에틸 메탄술포네이트를 갈색 오일(63.5g)로서 수득했다.

파트 C

400mL의 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 중 2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에톡시}에틸 메탄술포네이트(63.5g, 0.224 mol)의 교반된 용액을 NaN₃(16.1g, 0.247 mol)로 처리하고, 반응 혼합물을 N₂ 하에서 90℃로 가열했다. 5시간 후에, 용액을 실온으로 냉각하고, 500 ml의 차가운 H₂0로 처리했다. 그 다음, 반응 혼합물을 Et₂O(3×300mL)로 추출했다. 합한 유기 추출물을 H₂0(4×100mL) 및 염수(2×100mL)로 세정했다. 유기성 부분을 MgSO₄ 상에서 건조하고 농축하여 52.0g의 tert-부틸 2-(2-아지도에톡시)에틸카바메이트를 담갈색 오일로서 수득했다.

파트 D

MeOH 중 tert-부틸 2-(2-아지도에톡시)에틸카바메이트(47.0g, 0.204 mol)의 용액을 4g의 10% 팔라듐/탄소로 처리하고, H₂(3 Kg/cm²)하에서 24시간 동안 진탕했다. 그 다음, 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 농축하여 35.3g의 미정제 tert-부틸 2-(2-아미노에톡시)에틸카바메이트를, 추가 정제없이 사용되는 무색 액체로서 수득했다.

파트 E

N₂하에서, 500mL의 무수 CH₂Cl₂ 중 4-클로로-3-니트로퀴놀린(31.4g, 0.151 mol)의 교반된 용액을 트리에틸아민(43mL, 0.308mol) 및 tert-부틸 2-(2-아미노에톡시)에틸카바메이트(0.151mol)로 처리했다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 H₂0(2×300mL) 및 염수(300mL)로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축 하여 선황색 고체로서 수득했다. 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화하여 43.6g의 tert-부틸 2-{2-[(3-니트로퀴놀린-4-일)아미노]에톡시}에틸카바메이트를 선황색 결정으로서 수득했다.

파트 F

톨루엔 중 tert-부틸 2-{2-[(3-니트로퀴놀린-4-일)아미노]에톡시}에틸카바메이트(7.52g, 20.0mmol)의 용액을 1.5g의 5% 백금/탄소로 처리하고, H₂(3 Kg/cm²)하에서 24시간 동안 진탕했다. 그 다음, 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 농축하여 6.92g의 미정제 tert-부틸 2-{2-[(3-아미노퀴놀린-4-일)아미노]에톡시}에틸카바메이트를 황색 시럽으로서 수득했다.

파트 G

250mL의 무수 CH₂Cl₂ 중 tert-부틸 2-{2-[(3-아미노퀴놀린-4-일)아미노]에톡시}에틸카바메이트(10.2g, 29.5mmol)의 용액을 O℃로 냉각하고, 트리에틸아민(4.18mL, 30.0mmol)로 처리했다. 그 다음, 메톡시프로피오닐 클로라이드(3.30mL, 30.3mmol)를 5분에 걸쳐 적가했다. 그 다음, 반응물을 실온으로 가온하고, 교반을 1시간 동안 계속했다. 그 다음, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 오렌지색 고체를 수득했다. 이를 250mL의 EtOH에 용해시키고, 12.5mL의 트리에틸아민을 첨가했다. 혼합물을 환류로 가열하고, N₂하에서 밤새 교반했다. 그 다음, 반응물을 감 압하에서 농축 건조하고, 300mL의 Et₂O로 처리했다. 그 다음, 혼합물을 여과하고, 여과물을 감압하에서 농축하여 갈색 고체를 수득했다. 고체를 200mL의 뜨거운 메탄올에 용해시키고, 활성 목탄으로 처리했다. 뜨거운 용액을 여과하고 농축하여 11.1g의 tert-부틸 2-{2-[2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸카바메이트를 황색 시럽으로서 수득했다.

파트 H

250mL의 CHCl₃ 중 tert-부틸 2-{2-[2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸카바메이트(10.22g, 24.7mmol)의 용액을 3-클로로퍼벤조산(77%, 9.12g, 40.8mmol)으로 처리했다. 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 1% Na₂CO₃ 용액(2×75mL) 및 염수로 세정했다. 그 다음, 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 10.6g의 tert-부틸 2-{2-[2-(2-메톡시에틸)-5-옥시도-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸카바메이트를, 추가 정제없이 사용되는 오렌지색 포말로서 수득했다.

파트 I

100mL의 1,2-디클로로에탄 중 tert-부틸 2-{2-[2-(2-메톡시에틸)-5-옥시도-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸카바메이트(10.6g, 24.6mmol)의 용액을 6O℃로 가열하고, 10mL의 농축 NH₄0H 용액으로 처리했다. 급속하게 교반된 용액에 고형 p-톨루엔술포닐 클로라이드(7.05g, 37.0mmol)를 10분에 걸쳐 첨가했다. 반응 혼합물을 추가 1mL 농축 NH₄0H 용액으로 처리하고, 그 다음, 가압 용기에 밀봉하고, 가열을 2시간 동안 계속했다. 그 다음, 반응 혼합물을 냉각하고, 100mL의 CHCl₃로 처리했다. 그 다음, 반응 혼합물을 H₂0, 1 % Na₂CO₃ 용액(2×) 및 염수로 세정했다. 유기성 부분을 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 농축하여 10.6g의 tert-부틸 2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸카바메이트를 갈색 포말로서 수득했다.

파트 J

tert-부틸 2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸카바메이트(10.6g, 24.6mmol)를 에탄올 중 75mL의 2M HCl로 처리하고, 혼합물을, 가열하면서 환류로 가열했다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 냉각하고, 여과하여 고무성 고체를 수득했다. 고체를 에탄올 및 Et₂O로 세정하고 진공하에서 건조하여 히드로클로라이드 염을 담갈색 고체로서 수득했다. 히드로클로라이드 염을 50mL의 H₂0에 용해시키고 1O% NaOH 용액으로 처리하여 유리 염기를 만들었다. 그 다음, 수성 현탁액을 농축 건조하고, 잔류물을 CHCl₃로 처리했다. 수득한 염을 여과로 제거하고, 여과물을 농축하여 3.82g의 1-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민을 황갈색 분말로서 수득했다.

MS 330(M + H) ⁺;

파트 K

질소 대기 하에서, DMF(2 - 4mL) 중 N-히드록시술포숙신이미딜(아지도살리실아미도)헥사노에이트(100mg, 0.204mmol의 Sulfo-LC-NHS-ASA(피어스 바이오테크놀로지, 인크.(미국 일리노이주 락포드 소재)))의 용액을 DMF(5 mL) 중 1-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(66mg, 0.201mmol)의 용액에 첨가했다. 3.5시간 후, HPLC에 의한 분석은 개시 물질이 존재하지 않음을 보여주었다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음, 감압하에서 농축했다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(클로로포름 중 8 % 메탄올로 용리한 2×15 cm SiO₂)로 정제하여 55 mg의 생성물을 무색 유리로서 수득했다. 원뿔형 플라스크에 디클로로메탄을 사용하여 유리를 옮기고, 그 다음, 농축하여 포말을 얻었다. 포말을 고진공 하에서 밤새 및 그 다음 진공 오븐에서 50℃에서 5시간 동안 건조하여 45mg의 생성물을 백색 보풀이 있는 고체로서 얻었다. HPLC에 의한 분석은 순도 >95%를 나타내었다.

IRM 화합물 3(IRM3): N-(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸)헥사데칸아미드

질소 대기하에서, 디클로로메탄(3.5mL) 및 트리에틸아민(150㎕, 1.07mmol)의 혼합물 중 1-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(140.5mg, 0.428mmol)의 현탁액을 0℃로 냉각했다. 팔미토일 클로라이드(130㎕, 0.428mmol)를 서서히 첨가했다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 2시간 동안 교반시켜 두는데, 여기서, 박층 크로마토그래피에 의한 시간 분석은 개시 물질이 남아있지 않음을 보여주었다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(30mL)으로 희석하고, 포화 중탄산나트륨 용액(2×5mL)으로 세정하고, 황산마그네슘 상에서 건조하고, 그 다음, 감압하에서 농축했다. 수득한 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 2 % 메탄올로 용리한 12g의 실리카겔)로 정제하여 183mg의 N-(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸)헥사데칸아미드를 백색 분말로서 수득했다.

실시예 1: 면역 반응 조절제의 오브알부민에의 가교결합

IRM1을 디메틸 술폭시드(DMSO)에 10mg/ml로 현탁시켰다. 오브알부민을 포스 페이트 완충 염수(PBS)에서 10mg/ml로 현탁시키고, pH를 NaOH의 첨가로 >10.0로 조절했다. 500㎕의 오브알부민 용액(5mg 오브알부민)을 100㎕의 IRM1 용액(1mg IRM1)과, 12웰 조직 배양판의 단일 웰에서 혼합했다. 그 판을 얼음 위에 올려놓고, 장파장 UV 광원을 가능한 한 IRM1/오브알부민 혼합물을 함유하는 웰에 가깝게 판 위에 직접 위치시켰다. 혼합물을 15분 동안 조사했다. 수득한 접합체를 웰로부터 제거하고, 5mg/ml 오브알부민의 최종 농도로 PBS에서 0.5 mg/ml IRM1을 재현탁시키고, PBS에 대해 투석하여 임의의 비접합 IRM을 제거했다.

실시예 2: 면역

C57BL/6 마우스를 200㎕ PBS내 접합체(1mg 오브알부민 및 200 μg IRM1, 실시예 1과 같이 제조됨)로 피하로 또는 복강 내로 면역시켰다. 대조군 마우스를 200㎕ PBS내 1mg 오브알부민으로 면역시켰다. 1차 반응의 분석을 위해, 마우스를 면역 5 - 7일 후에 희생시켰다. 2차 반응의 분석을 위해, 마우스를 초기 면역 7 - 15일 후 후속면역시키고, 5 - 7일 후에 희생시켰다. 달리 언급하지 않는 한, 임파절을 분석용으로 피하로 면역된 마우스로부터 채취하고 비장 세포를 분석용으로 복강 내로 면역된 마우스로부터 채취했다.

실시예 3: 시약

마우스 CD8, CD1lc, 및 CD44에 특이적인 형광색소 표지된 항체는 파르민겐(Pharmingen(캘리포니아주 샌 디에고 소재))으로부터 얻었다. 단일클론 항체 25D1.16(Dr. Ron Germain, NIH)는 MHC 부류 I 분자 H-2K^b에 결합된 우성 오브알부민 펩티드(SIINFEKL)에 특이적이다. 문헌[Porgador et al., Immunity 6:715-26] 참조. 오브알부민은 시그마 케미컬 캄파니(Sigma Chemical Company(미주리주 세인트 루이스 소재))로부터 얻었다. 우성 오브알부민 펩티드 SIINFEKL에 결합된 MHC 부류 I 분자 H-2K^b의 사량체를 문헌[Kedl et al.(J Exp Med, 192:1105-13(2000))]에 기재된 바와 같이 제조했다. 오브알부민 발현 흑색종 세포주 Bl6ova는 전장 오브알부민을 코딩하는 플라스미드로 B16-F10 세포주(ATCC# CRL-6475)를 리포펙션(lipofection)하여 만들었다. 문헌[Kedl et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 98:10811-6] 참조. 시토킨 포획 및 검출 시약은 밀티에니 바이오테크(Miltyeni Biotech(캘리포니아주 오번 소재))로부터 얻었다.

실시예 4

실험 마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 피하로 또는 복강 내로 실시예 1에서 제조된 바와 같이 접합체로 면역화했다. 대조군 마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 오브알부민으로 면역화했다. 7일 후에, 임파절 또는 비장을 제거하고, 세포를 CD8, CD44, 및 H-2K^b/SIINFEKL 사량체에 특이적인 항체로 착색하고, 유세포측정 분석기로 분석했다. 결과는 도 1 - 3에 나타나 있다. 모두 3개의 마커에 대해 양성적으로 착색된 세포는 면역의 결과로서 발달된 활성 오브알부민 특이 성 CD8⁺T 세포를 확인했다.

도 1 - 3 각각은 활성 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포로서 확인된, 시험된 모든 CD8⁺T 세포의 %를 포함한다. 대조군 마우스에서, 0.07%의 CD8⁺T 세포는 활성 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포였다. 접합체에 의한 피하 면역은 0.52% 활성 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포를 산출했다. 접합체에 의한 복강 내 면역은 0.92% 활성 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포를 산출했다.

IRM1에 접합된 우성 오브알부민 펩티드(SIINFEKL; 200㎍ IRM1에 가교결합된 100㎍ 펩티드)에 의한 면역은 또한 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포의 활성을 유도했다.

실시예 5

대조군 마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 오브알부민으로 면역화했다. 실험 마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 피하로 또는 복강 내로 실시예 1에서 제조된 바와 같이 접합체로 면역화했다. 적합한 면역 세포를 면역 7일 후에 채취하고, 4시간 동안 시험관 내에서 SIINFEKL 펩티드와 함께 인큐베이팅했다. 인터페론 감마(IFN-γ)생성 CD8⁺T 세포를 유세포 측정 분석기와 짝을 이룬 IFN-γ 포획 및 검출 검정을 사용하여 확인했다. IRM1-오브알부민 접합체에 의한 면역으로 생 성된 CD8⁺T 세포는 차후의 항원 자극에 응하여 IFN-γ를 생성했다(도 4-6).

실시예 6

마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 실시예 1에서 제조된 접합체로 면역화하고, 그 다음, 15일째는 동일한 양의 접합체로 후속면역화했다. 후속면역화된 동물로부터의 비장 및 임파절 세포를 후속면역화 7일 후에 분석했다. 분석은 1차 면역만을 받은 마우스의 세포에 비해 활성 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포의 증가된 %를 보여주었다(도 7).

실시예 7

마우스를 오브알부민 발현 흑색종 세포주 Bl6ova(1×10⁵ 세포)로 진피 내로 주사했다. 7일에, 마우스를 1mg 오브알부민(대조군) 또는 접합체(실시예 1에서 제조됨)로 피하로 주사했다. 14일째에, 마우스를 7일에서와 같이 오브알부민 또는 접합체로 피하로 후속면역화했다. 20일째에, 종양 크기를 2차원에서 캘리퍼스로 측정했다. 접합체에 의한 면역 결과, 대조군과 비교된 바와 같이 종양 크기가 감소되었다(도 8).

실시예 8

마우스를 오브알부민 발현 흑색종 세포주 Bl6ova(1×10⁵ 세포)로 진피 내로 주사했다. 7일 및 14일 후에, 마우스를 1mg 오브알부민(대조군) 또는 접합체(실시예 1에서 제조됨)로 복강 내로 주사했다. 흑색종 세포주에 의한 면역 유도 20일 후, 비장 및 종양을 제거하고, 각 공급원으로부터의 세포를 H-2K^b/SIINFEKL 사량체 뿐만 아니라 CD8 및 CD44에 특이적인 항체로 착색했다. 유세포 분석은 비장(도 9) 및 종양(도 10) 모두에서 활성 오브알부민 특이성 CD8⁺T 세포의 상당한 증식을 보여주었다.

실시예 9

마우스를 오브알부민, 오브알부민 및 짝을 이루지 않은 IRM1: 1-(2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(링커 기의 부착 전의 IRM1 - IRM1의 합성의 파트 G의 생성물), 또는 접합체(실시예 1에서 제조됨)로 정맥 내로 면역화했다. 14시간 후에, 비장을 제거하고, 콜라겐 분해효소 처리하고, 세포를 CD8, CD11c, 및 항체 25D1.16(이는 MHC 부류 IH-2K^b 분자와 착체화된 오브알부민 펩티드 SIINFEKL에 특이적임)에 특이적인 항체로 착색했다. 유세포 측정 분석은 IRM1-오브알부민 접합체(도 13)에 의한 마우스 면역이 오브알부민 단독(도 11) 또는 짝을 이루지 않은 오브알부민 및 IRM1의 혼합물(도 12)에 의한 마우스의 면역보다 큰 %의 K^b/SIINFEKL를 제공하는 CD11c⁺, CD8⁺ 가지 세포를 산출함을 보 여주었다.

실시예 10

마우스를 오브알부민(대조군) 또는 IRM1 접합체(실시예 1에서 제조됨)로 실시예 2에서 기재된 바와 같이 피하로 0일에 면역화했다. 마우스를 14일째에 후속 면역화했다. 그 다음, 마우스를 28일째에 오브알부민 발현 흑색종 세포주 B16ova(1×10⁵ 세포)로 진피 내 면역 유도하고 종양 성장을 모니터링했다. 75일째에, 접합체로 면역된 80%의 마우스가 생존했고, 외관상 건강했으며, 한편, 오브알부민만으로 면역된 모두 마우스는 죽었다(도 14).

실시예 11

IRM3의 모액을 IRM3을 DMSO에 농도 10mg/ml로 용해시켜서 제조했다. 오브알부민을 PBS에 농도 50mg/ml로 용해했다. 50㎕의 IRM3 모액을 150㎕의 PBS에 첨가한 다음, 와동으로 혼합했다. 50㎕의 오브알부민을 IRM3 용액에 첨가하고 와동으로 혼합했다. IRM3 및 오브알부민의 흐린 콜로이드성 현탁액을 수득했다.

마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 피하로 0일째에 (a) 오브알부민 단독, 또는 (b) 오브알부민 및 IRM3의 콜로이드성 현탁액 50㎕로 면역화했다. 6일째에, 배수 임파절을 제거하고, 균질화하고, H-2K^b/SIINFEKL 사량체로 착색하여 오브알부민 특이성 T 세포를 확인했다. 도 15는 오브알부민만으로 면역된 대조군 마우 스로부터의 유세포측정 데이터를 보여주고; 도 16 및 17은 콜로이드성 현탁액으로 면역된 2마리의 상이한 마우스로부터의 데이터를 보여준다.

실시예 12

IRM2 및 오브알부민의 접합체를 실시예 1에서 기재된 것과 같이 제조하지만, IRM2를 IRM1 대신에 사용했다.

24마리의 마우스를 세 마리씩 8개의 그룹으로 나누었다. 세 마리씩 4개의 그룹을 0일째에 실시예 2에 기재된 바와 같이 피하로 면역했고, 각 그룹은 증가된 양의 IRM1-오브알부민 접합체를 받았다. 잔류 4개의 그룹을 마찬가지로 0일째에 IRM2-오브알부민 접합체로 면역했다. 6일째에, 마우스를 희생하고, 배수 임파절을 제거하고, H-2K^b/SIINFEKL 사량체로 착색하여 오브알부민 특이성 T 세포를 확인했다. 오브알부민 특이성 T 세포의 % 를 각 마우스에 대해 계산했다. 도 18은 결과를 요약하여 보여준다.

실시예 13

마우스에 약 2×16⁶OT1 오브알부민 특이성 형질전환 T 세포(더 잭슨 래보라토리 (The Jackson Laboratory, 메인주 바 하버 소재))를 채택하여 전이했다. 마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 피하로 0일째에 (a) 100㎍ 오브알부민, (b) 100㎍ 오브알부민 + 50㎍ CpG(Ova + CpG), (c) 100㎍ 오브알부민 + 50㎍ 짝은 이루 지 않은 IRM1(Ova + IRM), 또는 (d) 50㎍ IRM1에 접합된 100㎍ 오브알부민(Ova×IRM)로 면역화했다. 5일째에, 배수 임파절을 제거하고, 세포를 H-2K^b/SIINFEKL 사량체로 착색하여 오브알부민 특이성 T 세포를 확인했다. 도 19는 오브알부민만으로 면역된 마우스에 비해 Ova + CpG, Ova + IRM, 및 Ova×IRM 군에서 오브알부민 특이성 T 세포의 배수 증식을 보여준다.

본원에 인용된 특허, 특허 문헌 및 공보의 완전한 설명은 각각이 개별적으로 포함된 것과 같이 그의 전부가 참고로 포함되어 있다. 상충될 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 제어할 것이다.

본 발명의 각종 변형 및 변경은 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명확할 것이다. 예시적인 태양 및 실시예는 단지 예로서만 제공되고 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명의 범위는 하기에 기재되어 있는 청구의 범위에 의해서만 한정된다.

Claims

삭제
하기 식의 면역자극 접합체 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.

[식 중,

R₁ 은 링커 기이고;

R₂ 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:

-수소;

-알킬;

-알케닐;

-아릴;

-치환된 아릴;

-헤테로아릴;

-치환된 헤테로아릴;

-알킬-O-알킬;

-알킬-S-알킬;

-알킬-O-아릴;

-알킬-S-아릴:

-알킬-O-알케닐;

-알킬-S-알케닐; 및

-알킬 또는 알케닐 (이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환됨):

-OH;

-할로겐;

-N(R₅)₂;

-CO-N(R₅)₂;

-CS-N(R₅)₂;

-SO₂-N(R₅)₂;

-NR₅-CO-C_1-10 알킬;

-NR₅-CS-C_1-10 알킬;

-NR₅-S0₂-C_l-10 알킬;

-CO-C_l-10 알킬;

-CO-O-C_1-10 알킬;

-N₃;

-아릴;

-치환된 아릴;

-헤테로아릴;

-치환된 헤테로아릴;

-헤테로시클릴;

-치환된 헤테로시클릴;

-CO-아릴;

-CO-(치환된 아릴);

-CO-헤테로아릴; 및

-CO-(치환된 헤테로아릴);

R₃ 및 R₄ 는 각각 독립적으로 하기이고:

-수소;

-할로겐;

-알킬;

-알케닐;

-O-알킬;

-S-알킬; 및

-N(R₅)₂; 또는

함께 R₃ 및 R₄ 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 임의로 치환된 융합된 아릴 또는 헤테로아릴 기를 형성하고:

-할로겐;

-알킬;

-알케닐;

-O-알킬;

-S-알킬; 및

-N(R₅)₂; 또는

함께 R₃ 및 R₄ 는 하나 이상의 헤테로원자를 임의로 함유하고 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 임의로 치환된 융합된 5원 - 7원 포화 고리를 형성하고:

-할로겐;

-알킬;

-알케닐;

-O-알킬;

-S-알킬; 및

-N(R₅)₂;

R₅ 는 각각 독립적으로 수소 또는 C_1-10 알킬이고;

n은 1 - 10임.]
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