PT1491553E - Péptidos para o tratamento de cancro associado com o vírus do papiloma humano (hpv) e outros tumores epiteliais - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS PARA O TRATAMENTO DE CANCRO ASSOCIADO COM O VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO (HPV) E OUTROS TUMORES EPITELIAIS"

Esta invenção refere-se ao campo da Farmacologia Molecular e especialmente ao desenvolvimento de péptidos úteis para o tratamento de tumores epiteliais associados com HPV, uma vez que eles permitem o bloqueio do domínio de fosforilação da Caseína Cinase II (CKII), através de interação direta com um local deste tipo. A CKII é uma enzima treonina/serina envolvida na proliferação celular, e a sua localização intracelular é essencialmente situada no núcleo durante o processo de transformação celular (Tawfic S, Yu S, Wang H, Faust R, Davis A, Ahmed K, 2001, Histol. Histopathol. 16: 573-582).

Com base nas observações que descrevem níveis elevados de CKII em diferentes tumores sólidos epiteliais, foi assumido que a fosforilação originada por esta enzima é um evento importante na transformação maligna e um marcador de progressão tumoral (Seldin DC, Leder P, 1995, Science 267: 894-897) (Faust RA, Gapany M, Tristani P, Davis A, Adams GL, Ahmed K, 1996, Câncer Letters 101: 31-35). Por outro lado, a sobre-expressão de CKII em ratinhos transgénicos resulta em tumorigénese nas glândulas mamárias, através da amplificação das vias de sinalização Wnt/beta-catenina nestas células mamárias epiteliais (Landesman-Bollag E, Romien-Mourez R, Song DH, Sonenshein GE, Cardiff RD, Seldin DC, 2001, Oncogene 20: 3247-3257).

Dentro dos tumores epiteliais, aqueles originados por HPVs representam uma grande fração. Por exemplo, a maioria dos 2 tumores gentio-urinários são associados a estes oncovirus, e a presença de sequências de ADN de HPV foi demonstrada em 99,7% dos tumores originados em células cervicais escamosas (Walboormers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz N, 1999, J. Pathol 189: 12-19) . Do mesmo modo, a OMS reportou cerca de 500 000 doentes com cancro cervical anualmente em todo o mundo (Parkin DM, Laara E, Muir CS, 1980, Int. J. Câncer 41: 184-1972) . Em Cuba, 370 mulheres com cancro cervical morrem anualmente devido a esta doença (Organização Pan-americana da Saúde, 1999, Basic Country Health Profiles for the Américas. Cuba, 206-219) . Os HPVs são classificados como oncogénicos e não oncogénicos, dependendo se as lesões progridem para lesões malignas ou não (Lorincz AT, Temple GF, Kurman RJ, Jenson AB, Lancaster WD, 1987, J. Natl. Câncer Inst. 79: 671-677) . HPV-16 e -18 estão associados com neoplasias intraepiteliais que geralmente progridem para lesões malignas, e estes dois tipos de HPV estão associados com mais de 90% das displasias e carcinomas cervicais (Fujinaga Y, Shimada M, Okasawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K, 1991, J. Gen. Virol 72: 1039-1044).

Uma vez que não está ainda disponível uma vacina terapêutica ou profilática para a erradicação de tumores associados com HPV, a utilização de inibidores que têm como alvo a transcrição virai e oncoproteínas virais, tornou-se mais atrativa. Biomoduladores como IFNs foram usados com alguma eficácia em certas doenças associadas com HPV, como condiloma, verrugas e papilomatose respiratória (Koromilas AE, Li S, Matlashewski G, 2001. Cytokine & Growth Factor Reviews 12: 157-170). Em experiências anteriores realizadas em células transformadas com HPV (HeLa), nós demonstrámos que a exposição contínua a IFN alfa produz uma reversão do fenótipo maligno destas células, com a inibição 3 concomitante da expressão de ARNm do HPV (López-Ocejo 0, Perea SE, Reyes A, Vigoa L, López-Saura P, 1993. J. IFN Res 13: 369-375). No mesmo modelo celular, nós descobrimos que IFN alfa modula o ARNm de HPV através da repressão da transcrição virai endógena (Perea SE, López-Ocejo 0,

García-Millán R, Arana MJ, 1995, J. IFN & Cytokine Res 15: 495-501). De acordo com os resultados obtidos em linhas celulares, nós observámos que o tratamento com IFN alfa modula a expressão de ARNm num estudo piloto em doentes com cancro cervical (García-Millán R, Rios MA, Diaz D, Silveira M, Guilar 0, Amigó M, Arana MJ, Perea SE, 1996, J. IFN and Cytokine Res 16: 709-713). Apesar das descobertas promissoras acerca da utilização de IFN como regulador da expressão de ARNm de HPV, um conjunto de resultados indica uma resposta variável a IFN e o fenómeno de resistência a esta citoquina foi reportado entre 40 e 50% dos doentes durante ensaios clínicos (Arany I, Tyring SK, Stanley MA, Tomai MA, Miller RL, Smith MH, McDermott DJ, Slade HB, 1999, Antiviral Res 43: 55-63). Algumas evidências moleculares e clínicas indicam que a oncoproteina E7 desempenha um papel central no fenómeno de resistência a IFN. Por exemplo, foi reportado que E7 se liga ao fator de transcrição induzido por IFN (p 4 8), afetando assim a resposta a IFN, bloqueando a ativação da transcrição (Barnard P e McMillan NAJ, 1999, Virology 259: 305-313).

Adicionalmente, a alteração do fator de regulação de IFN (IRF-1) na presença de E7 foi também descrita (Park JS, Kim EJ, Kwon HJ, Hwang ES, Namkoong SE, Um SJ, 2000, J Biol

Chem 275: 6764-6769) (Perea SE, Massimi P, Banks L, 2000, J Mol Med 5: 661-666) . Em ensaios clínicos, a resposta a IFN

foi considerada como sendo dependente da expressão de E7 nas lesões contendo HPV (Frazer IH, McMillan NAJ, 1997, Papillomatosis and condyloma acuminate. Clinicai Applications of the Interferons (R Stuart Harris e RD 4

Penny, eds) páginas 79-90. Chapman and Hall Medicai, Londres). A oncoproteina E7 desempenha um papel essencial na transformação maligna iniciada por estes virus oncogénicos. Assim, foi demonstrado que a imortalização de células primárias induzida por E7 leva a mutações e aberrações cromossómicas desde o principio do processo de imortalização (Mougin C, Humbey O, Gay C, Riethmuller D, 2000, J. Gynecol Obstet. Biol. Reprod 29: 13-20). Por outro lado, nós demonstrámos que a transfecção estável com o gene E7 leva ao desenvolvimento de um fenótipo resistente a IFN em células tumorais sensíveis (Moro A, Calixto A, Suárez E, Arana MJ, Perea SE, 1998, Bioch Bioph Res Comm 245: 752-756) . Do mesmo modo, foi descrito que a oncoproteina E7 se liga e bloqueia a função de genes supressores tumorais, como Retinoblastoma (Rb) e Proteína de Ligação a Fator de Transcrição semelhante a Insulina 3 (IGFBP-3), através de Cys 24 e do domínio C-terminal respetivamente (Nevins JR, 1992, Science 258: 424-429) (Zwerschke W e Jansen-Durr P, 2000, Advances in Câncer Res 78: 1-29) . Do mesmo modo, foi demonstrado que os pares Ser 31/Ser 32 na proteína E7 são substrato para a enzima CKII. (Hashida T, Yasumoto S, 1990, Biochem. Biophys Res. Comm 172: 958-964) e este domínio é essencial para a capacidade transformante desta oncoproteina (Barbosa MS, Edmonds C, Fisher c, Schiller JT, Lowy DR, Vousden K, 1990 EMBO J 9: 153-160) (Chien W-M, Parker JN, Schmidt-Grimminger D-C, Broker TR, Chow LT, 2000, Cell Growth & Differentiation 11: 425-435) e a inibição da cascata de sinalização de IFN (Perea SE, López-Ocejo O, Garcia Milián R, Banks L, Arana MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7: 503).

Com base no papel do local de fosforilação de CKII na resistência de HPV a IFN e desenvolvimento de cancro, o desenvolvimento de fármacos que bloqueiam este domínio pode 5 ser uma ferramenta útil para a terapia oncológica. Moléculas que inibem o local de fosforilação de CKII em E7 ou em outros substratos celulares não foram, até hoje, descritas.

Em relação à oncoproteina E7, apenas péptidos que bloqueiam o local de ligação a Rb (Cys 24) (Webster KR, Koleman KG, 1997, US5625031) (Oliff AI, Riemen MW, EP 0412762 A2 910213) e outras regiões C-terminal (39-98) foram descritos (Pidder J-D, Zwerschke W, 2000, EP0969013).

Alguns candidatos a vacinas focados para desenvolver uma resposta CTL especifica para E7 de HPV foram, até agora, descritos em ensaios clínicos ou pré-clínicos (Chen C, Wang CC, Hung C, Pardoll DM, Wu T, 2000, Vaccine 18: 2015-2022) (Chen CH, Ji H, Suh KW, Choti MA, Pardoll DM, Wu TC, 1999, Gene Ther 12: 1972-1981). Contudo, as estratégias que focam as respostas CTL enfrentam vários obstáculos relacionados com a biologia de HPV. Por exemplo, os tipos oncogénicos de HPV desregulam os antigénios MHC classe I, os quais são essenciais para a resposta CTL (Connor ME, Stem PL, 1990, Int J Câncer 46: 1029-1034). Adicionalmente, a expressão de E7 foi associada com imunossupressão local no microambiente tumoral e isto pode também afetar o desenvolvimento apropriado da resposta CTL (Le Buanec H, D'Anna R, Lachgar A, Zagury JF, Bernard J, Ittlele D, d'Alessio P, Hallez S, Giannouli C, Burny A, Bizzini B, Gallo RC, Zagury D, 1999, Biomed Pharmacother 53: 424-431) (Lee SJ, Cho YS, Shim JH, Lee KA, Ko KK, Choe YK, Park SN, Hoshino T, Kim S, Dinarello CA, Yoon DY, 2001, J Immunol 167: 497-504). De acordo com os elementos anteriores, parece que a combinação de vacinas CTL com fármacos contra E7 pode oferecer grandes perspetivas. 6

De igual modo, a estratégia de vacinas contra HPV preventivas enfrenta um elevado risco custo beneficio devido a aspetos biológicos e sociais diferentes, incluindo: 1) período de latência longo após a infeção primária com HPV, 2) fraca compreensão dos mecanismos de infeção do HPV, 3) ausência de um modelo animal apropriado para a propagação de HPV, 4) especificidade de espécie e 5) a avaliação do impacto social de uma vacina preventiva para HPV poderá demorar muito tempo. Por isso, a utilização de fármacos que têm como alvo especifico oncoproteinas virais fornece vantagens relativamente às estratégias que focam a manipulação do sistema imunitário.

ESSÊNCIA DA INVENÇÃO A essência e novidade desta invenção encontram-se na descrição, pela primeira vez, de péptidos cíclicos que permitem a inibição direta do local de fosforilação por CKII, assim como da citotoxicidade produzida in vivo em células de carcinoma cervical com HPV-16. Adicionalmente, estes péptidos aumentam a sensibilidade destas células ao efeito citostático de IFN.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se principalmente a péptidos com a capacidade de se ligarem ao local de fosforilação por CKII, os quais exibem as seguintes sequências: (a) CSVRQGPVQKC (Id. Sec. N° . (b) CSSCQNSPALC (Id. Sec. N° . 2) (c) CQIPQRTATRC (Id. Sec. N° . 3) (d) CAKQRTDPGYC (Id. Sec. N° . 4) (e) CWMSPRHLGTC (Id. Sec. N° . 5) (f) CRNCTVIQFSC (Id. Sec. N° . 6) (g) CHYIAGTVQGC (Id. Sec. N° . 7) (h) CPLVSLRDHSC (Id. Sec. N° . 8) (i) CKQSYLHHLLC (Id. Sec. N° . 9) 7 (j) CFQPLTPLCRC (Id. Sec. N°. 10) (k) CQSYHELLLQC (Id Sec. N°. 11)

Também são mencionados qualquer variante ou mimético homólogos dos péptidos mencionados, que tenham sido obtidos por síntese ou de forma recombinante, assim como qualquer péptido de fusão contendo os péptidos descritos na lista. Qualquer péptido cuja estrutura permita bloquear o local de fosforilação por CKII nos seus substratos respetivos, é considerado como uma variante homóloga. Do mesmo modo, qualquer molécula química (não peptídica), cuja estrutura permita bloquear este local de fosforilação, é considerada como uma variante mimética.

Outro objeto da invenção é a composição farmacêutica que compreende um ou mais dos péptidos descritos na invenção, assim como um transportador apropriado.

Do mesmo modo, a invenção compreende a utilização dos péptidos mencionados isoladamente ou em combinação com qualquer outra molécula apropriada, tal como citoquinas e interferões, para: 1) a inibição da proliferação de células tumorais, 2) o tratamento de cancros associados a HPV e não associados a HPV e 3) o tratamento de lesões associadas a HPV em estádios pré-malignos.

Adicionalmente, os péptidos desta invenção podem ser utilizados para o tratamento de doentes infetados com HPV, que apresentam resistência ao tratamento com interferão.

Em outro aspeto da invenção, ela compreende um vetor de expressão para células de mamíferos contendo uma sequência de ADN que codifica para qualquer um dos péptidos referidos anteriormente. 8

Os péptidos da invenção possuem uma estrutura cíclica, e são principalmente caracterizados pela capacidade de ligação ao local de fosforilação por CKII e eliminar este acontecimento bioquímico. Os péptidos são descritos na lista inclusa. Por outro lado, os efeitos in vivo produzidos pelos péptidos em células transformadas por HPV-16 são também apresentados.

Os péptidos descritos foram definidos pela sua capacidade para inibir a fosforilação da sequência RRREEETEEE previamente descrita como o domínio consenso ideal para a fosforilação por CKII (Promega Cat: V5661), e o local de fosforilação contido na região 28-38 da oncoproteína E7 de HPV-16.

Para definir os péptidos descritos na invenção, foi construída uma biblioteca de péptidos cíclicos com 11 aminoácidos, e esta foi expressa na região P8 de fagos filamentosos. A triagem da biblioteca foi realizada usando a região 28-38 de E7 sintética como alvo, a qual foi também conjugada com biotina para a fixar a uma superfície sólida. A seleção destes fagos ligados à região 28-38 de E7 foi realizada através de imunodeteção, usando um anticorpo específico contra a região P8 no fago. Finalmente, o ADN correspondendo aos 11 fagos com capacidade elevada de ligação à região 28-38 de E7 foi sequenciado, e os péptidos respetivos foram sintetizados quimicamente, pelo método da fase sólida. Os péptidos sintéticos foram adicionalmente purificados por HPLC, analisados por espetrometria de massa e finalmente avaliados relativamente à eficácia in vitro e in vivo.

De acordo com esta invenção, apesar das diferentes sequências de aminoácidos entre os péptidos cíclicos aqui 9 descritos, eles inibem igualmente o acontecimento de fosforilação por CKII. Este facto denota que a interação destes péptidos com o local de fosforilação por CKII é principalmente baseada nas suas estruturas, e não na sequência em si.

Nesta invenção, também é demonstrado que péptidos lineares exibem uma menor capacidade de inibir o local de fosforilação por CKII. Esta observação reforça a importância da estrutura na capacidade de ligação destes péptidos a um dominio deste tipo. Esta observação também sugere a eficácia de outras moléculas miméticas, as quais se ligam ao local de fosforilação de CKII.

De modo a obter a ação intracelular nos substratos endógenos de CKII, os péptidos descritos podem ser conjugados quimicamente ou ligados geneticamente aos péptidos com capacidade de penetração na célula, pertencendo a proteínas como Tat 1 do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1) (Schwarze SR, Dowdy SF, 2000, Trends Pharmacol 21: 45-48), o fator de transcrição codificado pelo gene Antenapedia de Drosophyla (Derossi D, et al., 1996, J. Biol Chem 271: 18188-18193), a proteína VP22 do Vírus Herpes Simplex (HSV) (Lindgreen M, et al., 2000, Trends Pharmacol Sei 21: 99-102), a penetratina e o transportan (Gariepy J, Kawamura K, 2001, Trends Biotech 19: 21-28), entre outros. Para testar a hipótese in vivo desta invenção, os péptidos cíclicos foram sintetizados ligados ao péptido com capacidade de penetração em células descrito para HIV-1, a proteína Tat 1 (GRKKRRQRRRPPQC) e um sinal de localização nuclear pertencendo ao antigénio T grande de SV 40 (KKKRKVE). 10

Os resultados apresentados nesta invenção mostram claramente que péptidos cíclicos exibem citotoxicidade de uma forma dependente da dose, em células de carcinoma cervical transformadas por HPV-16 (CaSki). Estes resultados sugerem a utilização destes péptidos como ferramenta terapêutica para o tratamento de tumores da mesma origem histológica, assim como estádios pré-malignos, como a neoplasia intraepitelial cervical. Do mesmo modo, os dados experimentais in vivo mostraram que os péptidos cíclicos foram mais eficazes que as suas formas lineares respetivas, reforçando assim a importância da estrutura no efeito propriamente dito.

Do mesmo modo, os péptidos cíclicos descritos nesta invenção são eficazes em células HeLa contendo o HPV-18, assim como em células H-82 derivadas de cancro do pulmão de não pequenas células negativas para HPV. Estes resultados correlacionam-se com aqueles obtidos in vitro nesta invenção, em que péptidos bloqueiam não apenas o local de fosforilação por CKII em E7 de HPV-16, mas também bloqueiam em outras proteínas contendo um local deste tipo. O fato de os péptidos aqui descritos serem eficazes em células tumorais negativas para HPV, fornece um argumento para a sua utilização potencial em outros tumores epiteliais. Outros resultados nesta invenção indicam que o tratamento de células CaSKi com os péptidos cíclicos aqui descritos aumenta a sensibilidade das células ao efeito citostático de IFN alfa. Considerando evidências anteriores, mostrando que o local de fosforilação por CKII em E17 de HPV-16 é necessário para bloquear a cascata de sinalização de IFN (Perea SE, López-Ocejo 0, Garcia Milián R, Banks L, Arana MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7:503), os péptidos aqui descritos podem ser úteis para ultrapassar a resistência a IFN observada frequentemente na infeção por HPV. 11 0 objeto desta invenção também pode ser relacionado com o ADN que codifica cada um dos péptidos aqui descritos. Este ADN pode ser introduzido num vetor de expressão em células de mamíferos, e adicionalmente transfectado em células transformadas e não transformadas com HPV-16. 0 vetor contendo o oligonucleotídeo que codifica cada um dos péptidos também pode ser usado como uma alternativa para a terapia genética em cancro associado a HPV.

Em princípio, os péptidos aqui descritos podem ser usados em doenças associadas com HPV, juntamente com outros agentes, assim como resposta celular contra HPV com base em vacinas terapêuticas.

Esta invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos:

Exemplo 1: Efeito dos péptidos no local de fosforilação por CKII: Este ensaio tem como base uma reação de fosforilação in vitro, usando a sequência substrato RRREEETEEE, a qual representa o domínio consenso otimizado para a fosforilação por CKII. A reação é realizada em 50 pL de Tris:HCl 25 mM pH 7,5, 1 pCi 32Ρ-γΑΤΡ, 100 μΜ de ATP, 2 mg/mL do péptido substrato, 0,2 M de NaCl, 10 mM de MgCl e 1 unidade da enzima CKII (Promega) . A reação é incubada a 37°C durante 10 minutos. A seguir, 5 pL da reação foram colocados em papel para cromatografia PE-81 (Whatmann) e foram feitas quatro lavagens com H3PO4 10 mM. Finalmente, a radioatividade associada com os filtros foi medida e os níveis cpm mostram a atividade enzimática de CKII em cada amostra. Simultaneamente, um inibidor de CKII específico, como heparina, é incluído no ensaio como controlo interno. Os resultados apresentados na Figura 1 demonstraram que péptidos cíclicos inibem a fosforilação por CKII em 80%. Os 12 péptidos lineares também inibem a fosforilação por CKII na região 28-38 em E7, embora em menor grau do que a forma cíclica. Estas evidências indicam que os péptidos aqui descritos inibem o local de fosforilação por CKII e sugerem que a estrutura desempenha um papel essencial na sua interação com as sequências alvo.

Exemplo 2: Efeito dos péptidos na fosforilação de E7 de HPV-16: Este ensaio tem como base a reação de fosforilação in vitro da oncoproteina E7 de HPV-16 expressa em E. coli na forma de uma proteína de fusão com a Glutationa S-Transferase (GST). Antes da reação enzimática, a proteína de fusão E7-GST foi purificada por cromatografia de afinidade, usando esferas de Glutationa-Sepharose (Pharmacia) . A mistura de reação é realizada em 50 pL de tampão Tris:HCl 25 mM pH 7,5, 1 pCi de 32Ρ-γΑΤΡ, 100 pL de ATP, 40 pL das esferas contendo E7-GST, 0,2 M de NaCl, 10 mM de MgCl e 1 unidade de CKII (Promega) . A reação é incubada a 37°C durante 40 minutos. Depois, as esferas são lavadas três vezes com 0,5 mL de tampão e finalmente o nível de fosforilação de E7-GST é analisado por electroforese com SDS-PAGE 10%. A visualização das proteínas fosforiladas foi realizada pela revelação dos filmes de raios X previamente expostos aos géis secos. A quantificação da fosforilação de E7 foi feita por densitometria. Os resultados da Figura 2 indicam que os péptidos aqui descritos são igualmente eficazes em termos da inibição do local de fosforilação por CKII em E7 de HPV-16.

Exemplo 3: Efeito dos péptidos na proliferação de células transformadas com HPV-16 e HPV-18 (CaSki e HeLa, respetivamente): Neste ensaio, células CaSki ou HeLa foram semeadas a uma densidade de 2 x 104 células/mL em placas de 13 96 poços (Costar), usando DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) (Gibco) . Após 24 horas, os péptidos foram adicionados ao meio de cultura a doses compreendendo uma gama entre 15 μΜ e 500 μΜ. A incubação foi realizada durante 96 horas em 5% de CO2 e finalmente 20 pL de uma solução de MTS (1,90 mg/mL) Promega foram adicionados a cada poço. As placas foram subsequentemente mantidas uma hora nas mesmas condições de incubação e a absorvância a 490 nm foi finalmente analisada. Os resultados são expressos como percentagem de crescimento em relação ao controlo sem os péptidos. Para tal, os péptidos cíclicos e lineares foram sintetizados quimicamente, ligados ao péptido com capacidade de penetração celular Tat-1 de HIV-1, o qual é capaz de penetrar no citoplasma e no núcleo (Schwarze SR, Dowdy SF, 2000, Trends Pharmacol 21: 45-48). Os resultados obtidos desta experiência demonstraram que os péptidos aqui descritos produzem um efeito dependente da dose em ambas as células CaSki (HPV-16) e HeLa (HPV-18) (Figuras 3A e 3B) . Este exemplo mostra que os péptidos desta invenção são eficazes não apenas para HPV-16, mas também para HPV-18.

Exemplo 4: Efeito dos péptidos na proliferação de células tumorais HPV-negativas: Neste ensaio, células H-82 (cancro do pulmão de células pequenas) foram semeadas a uma densidade de 2 x 104 células/mL em placas de 96 poços (Costar) , usando DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) (Gibco) . Após 24 horas, os péptidos foram adicionados ao meio de cultura a doses compreendendo uma gama entre 15 μΜ e 500 μΜ. A incubação foi realizada durante 96 horas em 5% de CO2 e finalmente 20 pL de uma solução de MTS (1,90 mg/mL) Promega foram adicionados a cada poço. As placas foram subsequentemente mantidas uma hora nas mesmas condições de incubação e a absorvância a 14 490 nm foi finalmente analisada. Os resultados são expressos como percentagem de crescimento em relação ao controlo sem os péptidos. Para este ensaio, os péptidos cíclicos ligados ao péptido com capacidade de penetração celular, Tat-1 de HIV-1, descritos na invenção, foram utilizados tal como referido anteriormente. Os resultados obtidos nestas experiências demonstraram que os péptidos desta invenção produzem um efeito na proliferação celular de células H-82, dependente da dose. Na Figura 4 é demonstrado que os péptidos da invenção são eficazes não apenas para células transformadas por HPV, mas também para células tumorais de outras localizações e tipos histológicos, tal como cancro do pulmão de células pequenas.

Exemplo 5: Efeito dos péptidos na resposta de HPV-16 ao tratamento por IFN em células CaSki: Neste ensaio, células CaSki foram semeadas a uma densidade de 2 x 104 células/mL em placas de 96 poços (Costar), usando DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) (Gibco) . Após 24 horas, 120 μΜ de cada péptido foram adicionados ao meio de cultura. Vinte e quatro horas depois, IFN alfa foi adicionado entre 1000 e 31,5 U/mL. A incubação foi realizada durante 96 horas em 5% CO2 e 20 pL de MTS 1,90 mg/mL foram adicionados depois. Adicionalmente, as placas foram mantidas uma hora nas mesmas condições e a absorvância a 490 nm foi finalmente lida. Os resultados são apresentados como percentagem do crescimento em relação ao controlo. Nestas experiências, os péptidos descritos nesta invenção foram usados na sua variante cíclica, ligados ao péptido com capacidade de penetração celular, Tat-1 de HIV-1, tal como mencionado anteriormente. Os resultados observados na Figura 5 demonstram que a incubação prévia de células CaSki com os péptidos descritos na invenção torna 15 estas células sensíveis ao efeito antiproliferativo de IFN alfa. Estes resultados sugerem a utilidade dos péptidos descritos nesta invenção para o tratamento de doentes infetados com HPV que apresentam resistência à terapia com IFN.

Exemplo 6: Efeito antitumoral do péptido de inibição da fosforilação por CKII em tumores humanos implantados em modelos de ratinhos nude: Para estas experiências, ratinhos fêmea BalbC nude com 6-8 semanas de idade foram usados. A implantação do tumor foi realizada usando células H-125 (cancro do pulmão de não-pequenas células), que foram ressuspendidas em solução salina (PBS) a 10000 000 células/mL. A suspensão de células foi inoculada subcutaneamente no abdómen. A administração de péptido (sequência 1 na lista) foi feita juntamente com as células e continuou a cada segundo dia até completar um mês de tratamento. Neste ensaio, foram avaliadas doses variando entre 1 e 10 mg/kg de peso. Para examinar o efeito antitumoral, progressão de parâmetros. Estes resultados mostram a eficácia antitumoral do péptido de inibição da fosforilação por CKII num modelo de tumor humano implantado em animais experimentais.

Vantagens da Invenção: 1. Fornece fármacos de amplo espetro de aplicação, os quais não são apenas úteis para doenças associadas com HPV, mas também para tumores sólidos com níveis elevados de atividade endógena de CKII. 2. O fato de que a região 28-38 é conservada entre HPVs, fornece a possibilidade de usar estes fármacos em doenças associadas com diferentes tipos de HPV. 16 3. Péptidos como moléculas terapêuticas exibem antigenicidade baixa quando administrados a humanos. 4. É um fármaco fácil de fabricar e com baixo custo.

Breve Descrição das Figuras:

Figura 1: Efeito de péptidos na fosforilação por CKII Figura 2: Efeito de péptidos na fosforilação por CKII de HPVE7

Figura 3A: Efeito de péptidos na proliferação de células CaSki

Figura 3B: Efeito de péptidos na proliferação de células

HeLa

Figura 4: Efeito de péptidos na proliferação de células de cancro do pulmão

Figura 5: Efeito de péptidos na resposta de células transformadas por HPV-16 à ação de IFN

Figura 6: Efeito antitumoral do péptido de inibição da fosforilação por CKII em tumores humanos implantados em ratinhos nude

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Centro para Engenharia Genética e Biotecnologia <120> Péptidos para o tratamento de cancro associado com o Vírus do Papiloma Humano (HPV) e outros tumores epiteliais <130> Sequências <140> <141> <160> 11 <170> PatentIN ver. 2.1

<210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial 17 <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 1 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <4 00> 1

Cys Ser Vai Arg Gin Gly Pro Vai Gin Lys Cys 1 5 10

<210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 2 <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 2

Cys Ser Ser Cys Gin Asn Ser Pro Ala Leu Cys 1 5 10

<210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 3 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 3

Cys Gin Ile Pro Gin Arg Thr Ala Thr Arg Cys 15 10

<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 4 <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 4

Cys Ala Lys Gin Arg Thr Asp Pro Gly Tyr Cys 15 10 18

<210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 5 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 5

Cys Trp Met Ser Pro Arg His Leu Gly Thr Cys 15 10

<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 6 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 6

Cys Arg Asn Cys Thr Vai Ile Gin Phe Ser Cys 15 10

<210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 7 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> ()..(11) <400> 7

Cys His Tyr Ile Ala Gly Thr Vai Gin Gly Cys 15 10

<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 8 <2 2 0> 19 <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 8

Cys Pro Leu Vai Ser Leu Arg Asp His Ser Cys 15 10

<210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 9 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <400> 9

Cys Lys Gin Ser Tyr Leu His His Leu Leu Cys 15 10

<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 10 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <4 00> 10

Cys Phe Gin Pro Leu Thr Pro Leu Cys Arg Cys 15 10

<210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Péptido 11 <2 2 0> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(11) <4 00> 11

Cys Gin Ser Tyr His Glu Leu Leu Leu Gin Cys 15 10

Lisboa, 9 de Novembro de 2011

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptidos que se ligam e inibem o local de fosforilação por Caseína Cinase II (CKII), os quais apresentam as seguintes sequências: a. CSVRQGPVQKC ; b. CSSCQNSPALC; c. CQIPQRTATRC; d. CAKQRTDPGYC; e. CWMSPRHLGTC; f. CRNCTVIQFSC; g- CHYIAGTVQGC; h. CPLVSLRDHSC; i. CKQSYLHHLLC; j · CFQPLTPLCRC; k. CQSYHELLLQC.

2. Péptidos de acordo com a reivindicação 1, os quais apresentam uma estrutura cíclica.

3. Péptidos de acordo com as reivindicações 1 e 2, os quais são contidos num polipéptido de fusão.

4. Uma composição farmacêutica que compreende um ou diferentes péptidos das reivindicações 1-3, assim como um transportador apropriado.

5. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, a qual contém adicionalmente uma citoquina.

6. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, sendo a citoquina um Interferão ( IFN) . 2

7. Os péptidos das reivindicações 1-3 para utilização na inibição da proliferação de células tumorais.

8. Os péptidos de acordo com as reivindicações 1-3 para uso de acordo com a reivindicação 7, em que são inibidos tumores associados com HPV e não associados com HPV.

9. Os péptidos de acordo com as reivindicações 1-3 para uso no tratamento de lesões associadas com HPV em estádios pré-malignos.

10. Os péptidos de acordo de acordo com as reivindicações 1-3 para uso de acordo com as reivindicações 7-9, em que os péptidos são utilizados juntamente com citoquinas.

11. Os péptidos de acordo com as reivindicações 1-3 para uso de acordo com a reivindicação 10, em que a citoquina é um IFN.

12. Os péptidos de acordo com as reivindicações 1-3 para uso de acordo com as reivindicações 7-9, em que os péptidos são utilizados para tratamento de doentes infetados com HPV que são resistentes ao tratamento com IFN.

13. Um vetor de expressão em células de mamífero contendo as sequências de ADN que codificam qualquer um dos péptidos apresentados nas reivindicações 1-3. Lisboa, 9 de Novembro de 2011