ES2371239T3

ES2371239T3 - Péptidos para el tratamiento de cáncer asociado con el virus del papiloma humano (vph) y otros tumores epiteliales.

Info

Publication number: ES2371239T3
Application number: ES02796490T
Authority: ES
Inventors: Silvio Ernesto Perea Rodriguez; Osvaldo Reyes Acosta; Nelson Francisco Santiago Vispo; Yaquelín PUCHADES IZAGUIRRE; Ricardo Silva Rodriguez; Alejandro Moro Soria; Alicia Santos Savio; Luis Javier Gonzalez Lopez; Belkis Gonzalez Barrios
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2022-12-04
Also published as: IS7320A; PE20030861A1; EP1491553B1; SI1491553T1; DK1491553T3; JP2005525090A; MY133530A; AU2002361922B2; BR0215213A; US20060233742A1; CA2471110A1; BRPI0215213B1; CN1620464A; KR20050002811A; MXPA04005832A; AR037825A1; CR7361A; IS2906B; DOP2002000548A; RU2290410C2

Abstract

Péptidos útiles para el tratamiento de tumores de origen epitelial y especialmente los asociados a tipos oncogénicos de Virus Papiloma (VPH). Identificación de péptidos cuya estructura permita el bloqueo del dominio de fosforilación por Caseína Kinasa II (CKII) mediante la interacción directa con dicho sitio. En la presente invención se muestran once péptidos de estructura cíclica y secuencia aminoacídica diferente, los cuales inhiben el sitio de fosforilación por CKII in vitro, producen citotoxicidad en células de carcinoma de cuello uterino humano transformadas por VPH-16 (CaSki) y además incrementan la sensibilidad de dichas células al efecto citostático del Interferón (IFN). La invención se relaciona además con el uso de estos péptidos conjugados o fusionados a otros péptidos y compuestos químicos de penetración intracelular así como con el uso de moléculas miméticas tanto de origen peptídico como de origen químico.

Description

Péptidos para el tratamiento de cáncer asociado con el virus del papiloma humano (VPH) y otros tumores epiteliales

La presente invención se refiere al campo de la Farmacología Molecular y, especialmente, al desarrollo de péptidos útiles para el tratamiento de tumores epiteliales asociados con VPH, ya que esto permite el bloqueo del domino de fosforilación de la Caseína Quinasa II (CKII) por interacción directa con dicho sitio.

La CKII es una enzima de treonina/serina implicada en la proliferación celular y su localización intracelular principalmente es en el núcleo durante el proceso de transformación maligna (Tawfic S, Yu S, Wang H, Faust R, Davis A, Ahmed K, 2001, Histol. Histopathol. 16: 573-582).

Basándose en los descubrimientos de altos niveles de CKII en diferentes tumores sólidos epiteliales, se ha supuesto que la fosforilación inducida por esta enzima es un acontecimiento importante en la transformación maligna y un marcador de la progresión tumoral (Seldin DC, Leder P, 1995, Science 267: 894-897) (Faust RA, Gapany M, Tristani P, Davis A, Adams GL, Ahmed K, 1996, Cancer Letters 101: 31-35). Por otra parte, la sobreexpresión de CKII en ratones transgénicos conduce a la tumorigénesis en las glándulas mamarias al aumentar las rutas de transducción de señales Wnt/beta-catenina en esas células epiteliales mamarias (Landesman-Bollag E, Romien-Mourez R, Song DH, Sonenshein GE, Cardiff RD, Seldin DC, 2001, Oncogene 20: 3247-3257).

Entre los tumores epiteliales, los originados por VPH representan una gran fracción. Por ejemplo, la mayoría de los tumores genitourinarios están asociados con estos oncovirus y se ha demostrado la presencia de secuencias de ADN de VPH en el 99,7% de los tumores procedentes de células cervicales escamosas (Walboormers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Muñoz N, 1999, J. Pathol 189: 1219). De forma similar, la OMS ha dado parte de aproximadamente 500.000 pacientes con cáncer cervical anualmente en todo el mundo (Parkin DM, Laara E, Muir CS, 1980, Int. J. Cancer 41: 184-1972). En Cuba, 370 mujeres con cáncer cervical mueren anualmente debido a esta enfermedad (Organización Panamericana de la Salud, 1999, Basic Country Health Profiles for the Americas. Cuba, 206-219). Los VPH se clasifican en oncogénicos y no oncogénicos de acuerdo con si las lesiones progresan hacia una malignidad o no (Lorincz AT, Temple GF, Kurman RJ, Jenson AB, Lancaster WD, 1987, J. Natl. Cancer Inst. 79: 671-677). Los VPH-16 y -18 están asociados con neoplasia intraepitelial que generalmente progresa hacia malignidad y, además, los dos tipos de VPH están asociados con más de un 90% de las displasias y carcinomas cervicales (Fujinaga Y, Shimada M, Okasawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K, 1991 J. Gen. Virol 72: 1039-1044).

Como aún no se dispone de una vacuna terapéutica o profiláctica para la erradicación de los tumores asociados con VPH, el empleo de inhibidores que se dirigen a la transcripción viral y a oncoproteínas virales se ha vuelto más atractivo. Se han usado biomoduladores, tales como IFN, con alguna eficacia en ciertas enfermedades asociadas con VPH tales como condiloma, verrugas plantares y papilomatosis respiratoria (Koromilas AE, Li S, Matlashewski G, 2001. Cytokine & Growth Factor Reviews 12: 157-170). En experimentos previos sobre células transformadas con VPH (HeLa), los presentes inventores han demostrado que la exposición continua a IFN alfa produce una reversión del fenotipo maligno de estas células con la inhibición concomitante de la expresión del ARNm de VPH (López-Ocejo O, Perea SE, Reyes A, Vigoa L, López-Saura P, 1993. J. IFN Res 13: 369-375). En el mismo modelo celular, los presentes inventores descubrieron que el IFN alfa modula el ARNm de VPH mediante la represión de la transcripción viral endógena (Perea SE, López-Ocejo O, García-Milián R, Araña MJ, 1995, J. IFN & Cytokine Res 15: 495-501). De acuerdo con los resultados obtenidos en líneas celulares, los presente inventores observaron que el tratamiento con IFN alfa modulaba la expresión de ARNm en un estudio piloto en pacientes con cáncer cervical (García-Milián R, Rios MA, Diaz D, Silveira M, Guilar O, Amigó M, Araña MJ, Perea SE, 1996, J. IFN and Cytokine Res 16: 709-713). A pesar de los descubrimientos prometedores sobre el uso de IFN como regulador de la expresión del ARNm de VPH, cada vez más datos indican una respuesta variable de IFN y se ha notificado un fenómeno de resistencia hacia esta citocina entre el 40 y el 50% de los pacientes durante ensayos clínicos (Arany I, Tyring SK, Stanley MA, Tomai MA, Miller RL, Smith MH, McDermott, DJ, Slade HB, 1999, Antiviral Res 43: 55-63). Algunas pruebas moleculares y clínicas indican que la oncoproteína E7 juega un papel fundamental en el fenómeno de resistencia a IFN. Por ejemplo, se ha notificado que E7 se une al factor de transcripción inducido por IFN (p48) afectando de esta manera a la respuesta al IFN al bloquear la activación de la transcripción (Barnard P y McMillan NAJ, 1999, Virology 259: 305-313). Además, también se ha notificado la alteración del factor regulador de IFN (IRF1) en presencia de E7 (Park JS, Kim EJ, Kwon HJ, Hwang ES, Namkoong SE, Um SJ, 2000, J Biol Chem 275: 67646769) (Perea SE, Massimi P, Banks L, 2000, J Mol Med 5: 661-666). En ensayos clínicos, la respuesta a IFN se ha considerado dependiente de la expresión de E7 en las lesiones que contienen VPH (Frazer IH, McMillan NAJ, 1997, Papillomatosis and condyloma acuminate. Clinical Applications of the Interferons (R Stuart Harris and RD Penny, eds) pág. 79-90. Chapman and Hall Medical, Londres). La oncoproteína E7 juega un papel esencial en la transformación maligna inducida por estos virus oncogénicos. De esta manera, se ha demostrado que la inmortalización inducida por E7 de células primarias conduce a mutaciones y aberraciones cromosómicas desde el comienzo del proceso de inmortalización (Mougin C, Humbey O, Gay C, Riethmuller D, 2000, J. Gynecol Obstet. Biol. Reprod 29: 13-20). Por otra parte, los presentes inventores han demostrado que la transfección estable con el gen de E7 conduce al desarrollo de un fenotipo resistente a IFN en células tumorales sensibles (Moro A, Calixto A, Suárez E, Araña MJ, Perea SE, 1998, Bioch Bioph Res Comm 245:752-756). De forma similar, se ha notificado que la oncoproteína E7 se une y bloquea la función de genes supresores de tumores tales como el Retinoblastoma (Rb)

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y la Proteína-3 de Unión al Factor de Crecimiento similar a la Insulina (IGFBP-3) a través de la Cys 24 y el dominio C-terminal respectivamente (Nevins JR, 1992, Science 258: 424-429) (Zwerschke W y Jansen-Durr P, 2000, Advances in Cancer Res 78: 1-29). De forma similar, los dobletes Ser 31/Ser 32 en la proteína E7 han mostrado ser sustratos para la enzima CKII. (Hashida T, Yasumoto S, 1990, Biochem. Biophys Res. Comm 172: 958-964) y este dominio es esencial tanto para la capacidad transformante de esta oncoproteína (Barbosa MS, Edmonds C, Fisher C, Schiller JT, Lowy DR, Vousden K, 1990, EMBO J 9: 153-160) (Chien W-M, Parker JN, Schmidt-Grimminger D-C, Broker TR, Chow LT, 2000, Cell Growth & Differentiation 11: 425-435) como para la inhibición de la cascada de señalización de IFN (Perea SE, López-Ocejo O, García Milián R, Banks L, Araña MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7: 503).

Basándose en el papel del sitio de fosforilación de CKII en la resistencia del VPH a IFN y en el desarrollo de cáncer, el diseño de fármacos que bloqueen dicho dominio podría convertirse en una herramienta útil para la terapia del cáncer. Hasta ahora no se han descrito moléculas que inhiban el sitio de fosforilación de CKII en E7 o en otros sustratos celulares.

En relación con la oncoproteína E7, sólo se han descrito péptidos que bloquean el sitio de unión a Rb (Cys 24) (Webster KR, Koleman KG, 1997, documento US5625031) (Oliff Al, Riemen MW, documento EP 0412762 A2 910213) y otras regiones C-terminales (39-98) (Pidder J-D, Zwerschke W, 2000, documento EP0969013).

Hasta ahora se han descrito algunos candidatos de vacuna dirigidos a desarrollar una respuesta CTL específica de E7 de VPH en ensayos clínicos o preclínicos (Chen C, Wang CC, Hung C, Pardoll DM, Wu T, 2000, Vaccine 18: 2015-2022) (Chen CH, Ji H, Suh KW, Choti MA, Pardoll DM, Wu TC, 1999, Gene Ther 12:1972-1981). Sin embargo, los enfoques dirigidos a la respuesta CTL se enfrentan con diferentes obstáculos relacionados con la biología del VPH. Por ejemplo, los tipos oncogénicos de VPH regulan negativamente los antígenos del CMH de clase I que son esenciales para la respuesta CTL (Connor ME, Stem PL, 1990, Int J Cancer 46: 1029-1034). Además, la expresión de E7 se ha asociado con inmunosupresión local en el entorno tumoral y esto podría afectar también al desarrollo apropiado de la respuesta CTL (Le Buanec H, D’Anna R, Lachgar A, Zagury JF, Bernard J, Ittlele D, d’Alessio P, Hallez S, Giannouli C, Burny A, Bizzini B, Gallo RC, Zagury D, 1999, Biomed Pharmacother 53: 424-431) (Lee SJ, Cho YS, Shim JH, Lee KA, Ko KK, Choe YK, Park SN, Hoshino T, Kim S, Dinarello CA, Yoon DY, 2001, J Immunol

167: 497-504). De acuerdo con los elementos anteriores, parece ser que la combinación de vacunas CTL y productos farmacéuticos que se dirijan a E7 podría tener grandes perspectivas.

De forma similar, el enfoque de las vacunas preventivas frente a VPH se enfrenta con un alto riesgo de beneficios y costes debido a los diferentes aspectos biológicos y sociales que incluyen: 1) un periodo de latencia prolongado después de la infección primaria por VPH, 2) una comprensión insuficiente del mecanismo de infección de VPH, 3) la ausencia de modelos animales para la propagación apropiada de VPH, 4) la especificidad de especie y 5) la evaluación del impacto social de una vacuna preventiva contra VPH podría tardar bastante tiempo. Por lo tanto, el uso de productos farmacéuticos que se dirijan específicamente a oncoproteínas virales podría proporcionar ventajas con respecto a los enfoques centrados en la manipulación del sistema inmune.

Esencia de la invención

La esencia y novedad de esta invención radica en la descripción por primera vez de péptidos cíclicos que permiten la inhibición directa del sitio de fosforilación de CKII así como la citotoxicidad producida in vivo sobre células de carcinoma cervical VPH-16. Además, estos péptidos aumentan la sensibilidad de las células al efecto citostático de IFN.

Descripción detallada de la invención:

La invención se refiere principalmente a péptidos capaces de unirse al sitio de fosforilación de CKII que presentan las siguientes secuencias:

(a): CSVRQGPVQKC (Sec Id Nº 1)

(b): CSSCQNSPALC (Sec Id Nº 2)

(c): CQIPQRTATRC (Sec Id Nº 3)

(d): CAKQRTDPGYC (Sec Id Nº 4)

(e): CWMSPRHLGTC (Sec Id Nº 5)

(f): CRNCTVIQFSC (Sec Id Nº 6)

(g): CHYIAGTVQGC (Sec Id Nº 7)

(h): CPLVSLRDHSC (Sec Id Nº 8)

(i): CKQSYLHHLLC (Sec Id Nº 9)

(j): CFQPLTPLCRC (Sec Id Nº 10)

(k): CQSYHELLLQC (Sec Id Nº 11)

También se menciona cualquier variante homóloga o mimético de los péptidos mencionados, que se haya obtenido por síntesis o de forma recombinante, así como cualquier péptido de fusión que contenga los péptidos descritos en la lista. Cualquier péptido cuya estructura permita bloquear el sitio de fosforilación de CKII en sus sustratos respectivos se considera una variante homóloga. De forma similar, cualquier molécula química (no peptídica) cuya

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estructura permita bloquear dicho sitio de fosforilación se considera una variante mimética.

Otro objeto de la invención es la composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos descritos en la invención así como un vehículo apropiado.

De forma similar, la invención comprende el uso de los péptidos mencionados solos o combinados con cualquier otra molécula apropiada tal como citocinas o interferones para: 1) inhibir la proliferación de células tumorales, 2) tratar el cáncer tanto asociado como no asociado con VPH y 3) tratar lesiones asociadas con VPH en los estadios premalignos.

Además, los péptidos de la invención podrían emplearse para tratar a pacientes infectados por VPH resistentes al tratamiento con interferón.

En otro aspecto de la invención, ésta comprende un vector de expresión para células de mamífero que contiene una secuencia de ADN que codifica cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente.

Los péptidos de la invención tienen una estructura cíclica y se caracterizan principalmente por la capacidad de unirse al sitio de fosforilación de CKII y anular dicho acontecimiento bioquímico. Los péptidos se describen en la lista adjunta. Por otra parte, también se muestran los efectos in vivo producidos por los péptidos sobre las células transformadas por VPH-16.

Los péptidos descritos se definieron por su capacidad de inhibir la fosforilación de la secuencia RRREEETEEE presentada previamente como el dominio consenso óptimo para la fosforilación por CKII (Promega Cat: V5661) y el sitio de fosforilación contenido en la región 28-38 de la oncoproteína E7 de VPH-16.

Para definir los péptidos descritos en la invención, se construyó una biblioteca de péptidos cíclicos de 11 aminoácidos y se expresó en la región P8 de fagos filamentosos. La exploración de la biblioteca se realizó usando la región 28-38 sintética de E7 como diana, que también se conjugó con biotina para fijarla a una superficie sólida. La selección de los fagos unidos a la región 28-38 de E7 se realizó por inmunodetección usando un anticuerpo específico contra la región P8 en el fago. Finalmente, se secuenció el ADN correspondiente a los once fagos con alta capacidad de unión a la región 28-38 de E7 y los péptidos respectivos se sintetizaron químicamente por el procedimiento de fase sólida. Los péptidos sintéticos se purificaron adicionalmente por HPLC, se analizaron por espectrometría de masas y finalmente se evaluaron con respecto a la eficacia in vitro e in vivo.

De acuerdo con la presente invención, a pesar de las diferentes secuencias de aminoácidos entre los péptidos cíclicos descritos en la presente memoria, inhiben igualmente el acontecimiento de fosforilación por CKII. Este hecho indica que la interacción de estos péptidos con el sitio de fosforilación de CKII se basa principalmente en su estructura en lugar de en la propia secuencia.

En la presente invención también se demuestra que los péptidos lineales presentan una menor capacidad de inhibir el sitio de fosforilación de CKII. Este descubrimiento refuerza la importancia de la estructura en la capacidad de unión de estos péptidos a dicho dominio. Además, este descubrimiento sugiere la eficacia de otras moléculas miméticas que se unen al sitio de fosforilación de CKII.

Para conseguir la acción intracelular sobre los sustratos endógenos de CKII, los péptidos descritos pueden conjugarse químicamente o fusionarse genéticamente con los péptidos de penetración celular que pertenecen a proteínas tales como el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH-1) Tat 1 (Schwarze SR, Dowdy SF, 2000,. Trends Pharmacol 21: 45-48), el factor de transcripción codificado por el gen Antenapedia de Drosophyla (Derossi D, y col, 1996, J. Biol Chem 271: 18188-18193), la proteína VP22 del Virus del Herpes Simple (VHS) (Lindgreen M, y col., 2000, Trends Pharmacol Sci 21: 99-103), la penetratina y transportano (Gariepy J, Kawamura K, 2001, Trends Biotech 19: 21-28) entre otros. Para ensayar la hipótesis in vivo en la presente invención, los péptidos cíclicos se sintetizaron fusionados al péptido de penetración celular indicado para la proteína Tat 1 de VIH-1 (GRKKR-RQRRRPPQC) y una señal de localización nuclear perteneciente al antígeno grande T de SV 40 (KKKRKVE).

Los datos mostrados en la presente invención indican claramente que los péptidos cíclicos presentan citotoxidad de una manera dependiente de la dosis sobre células de carcinoma cervical transformadas por VPH-16 (CaSki). Estos resultados siguieren el empleo de estos péptidos como herramienta terapéutica para tratar tumores del mismo origen histológico así como de estadios premalignos tales como la neoplasia intraepitelial cervical. De forma similar, los datos experimentales in vivo mostraron que los péptidos cíclicos eran más eficaces que su forma lineal respectiva, reforzando de esta manera la importancia de la estructura sobre el propio efecto.

De forma similar, los péptidos cíclicos descritos en la presente invención son eficaces sobre células Hela que contienen el VPH-18 así como sobre células H-82 derivadas de cáncer pulmonar no microcítico negativo para VPH. Estos resultados se correlacionan con los obtenidos in vitro en la presente invención, donde los péptidos bloquean no sólo el sitio de fosforilación de CKII en el E7 de VPH-16, sino que también lo bloquean en otras proteínas que contienen dicho sitio. El hecho de que los péptidos descritos en la presente memoria sean eficaces sobre células tumorales negativas para VPH proporciona un argumento para su empleo potencial en otros tumores epiteliales. Otros resultados de la presente invención indican que el tratamiento de células CaSki con los péptidos cíclicos

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descritos en la presente memoria aumenta la sensibilidad celular al efecto citostático del IFN alfa. Considerando las pruebas previas que muestran que el sitio de fosforilación de CKII sobre E7 de VPH-16 es necesario para bloquear la cascada de señalización de IFN (Perea SE, López-Ocejo O, García Milián R, Banks L, Araña MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7: 503), los péptidos descritos en la presente memoria pueden ser útiles para evitar la resistencia común al IFN observada en la infección por VPH.

El objeto de la presente invención también puede relacionarse con el ADN que codifica cada péptido descrito en la presente memoria. Este ADN podría introducirse en un vector de expresión de mamífero e introducirse por transfección adicionalmente en células tanto transformadas con VPH-16 como no transformadas. El vector que contiene el oligonucleótido que codifica cada péptido también puede usarse como alternativa para la terapia génica en cánceres asociados con VPH.

En principio, los péptidos descritos en la presente memoria pueden usarse en enfermedades asociadas con VPH junto con otros agentes así como con vacunas terapéuticas basadas en la respuesta celular contra VPH.

La presente invención se ilustra por los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1: Efecto de los péptidos sobre el sitio de Fosforilación de CKII: Este ensayo se basa en una reacción de fosforilación in vitro que usa la secuencia sustrato RRREEETEEE que representa el dominio consenso optimizado para la fosforilación por CKII. La reacción se realizó en 50 μl de Tris:HCl 25 mM pH 7,5, 1 μCi de 32PγATP, 100μM ATP, 2 mg/ml del péptido sustrato, NaCl 0,2 M, MgCl 10 mM y 1 unidad de la enzima CKII (Promega). La reacción se incubó a 37 ºC durante 10 minutos. Posteriormente, se aplicaron puntualmente 5 μl de reacción en papel de cromatografía PE-81 (Whatmann) y se realizaron cuatro lavados con H3PO4 10 mM. Finalmente, se midió la radiactividad asociada con los filtros y los niveles de cpm mostraron la actividad enzimática de CKII en cada muestra. De forma simultánea, en el ensayo se incluyó un inhibidor de CKII específico tal como heparina como control interno. Los datos mostrados en la Figura 1 demostraron que los péptidos cíclicos inhiben la fosforilación por CKII en un 80%. Además, los péptidos lineales inhiben la fosforilación por CKII de la región 28-38 en E7 aunque en una menor medida en comparación con la forma cíclica. Estas pruebas indican que los péptidos descritos en la presente memoria inhiben el sitio de fosforilación de CKII y sugieren que la estructura juega un papel esencial en su interacción con las secuencias diana.

Ejemplo 2: Efecto de los péptidos sobre la Fosforilación de E7 de VPH-16: Este ensayo se basa en la reacción de fosforilación in vitro de la oncoproteína E7 de VPH-16 expresada en E. coli como una proteína de fusión con la Glutatión S Transferasa (GST). Antes de la reacción enzimática, la proteína de fusión E7-GST se purificó por cromatografía de afinidad usando perlas de Glutatión Sepharose (Pharmacia). La mezcla de reacción se realizó en 50 μl de tampón Tris:HCl 25 mM pH 7,5, 1 μCi de 32P-γATP, ATP 100 μM, 40 μl de las perlas que contenían E7-GST, NaCl 0,2 M, MgCl 10 mM y 1 unidad de CKII (Promega). La reacción se incubó a 37 ºC durante 40 minutos. Posteriormente, las perlas se lavaron tres veces con 0,5 ml del tampón y finalmente se analizó el nivel de fosforilación de E7-GST por electroforesis SDS-PAGE al 10%. La visualización de las proteínas fosforiladas se realizó revelando películas de rayos X previamente expuestas a los geles secados. La cuantificación de la fosforilación de E7 se realizó por densitometría. Los datos de la Figura 2 indican que los péptidos descritos en la presente memoria son igualmente eficaces en términos de inhibición del sitio de fosforilación de CKII en la E7 de VPH-16.

Ejemplo 3: Efecto de los péptidos sobre la proliferación de células transformadas con VPH-16 y VPH-18 (CaSki y HeLa respectivamente): En este ensayo, se sembraron células CaSki o HeLa a 2 x 104 células/ml en placas de 96 pocillos (Costar) usando DMEM suplementado con un 10% de Suero Bovino Fetal (FCS) (Gibco). Después de 24 horas, se añadieron péptidos al medio de cultivo a dosis que comprendían un intervalo entre 15 μM y 500 μM. La incubación se realizó durante 96 horas en CO2 al 5% y finalmente se añadieron a cada pocillo 20 μl de una solución MTS (1,90 mg/ml) de Promega. Las placas posteriormente se mantuvieron una hora en las mismas condiciones de incubación y finalmente se analizó la absorbancia a 490 nm. Los resultados se expresan como porcentaje del crecimiento con respecto al control sin péptidos. Para este fin, se sintetizaron químicamente péptidos tanto cíclicos como lineales fusionados al péptido de penetración celular Tat-1 de VIH-1 que puede penetrar en el citoplasma y el núcleo (Schwarze SR, Dowdy SF, 2000,. Trends Pharmacol 21: 45-48). Los datos obtenidos a partir de este experimento demostraron que los péptidos descritos en la presente memoria producen un efecto dependiente de la dosis tanto sobre células CaSki (VPH-16) como sobre células HeLa (VPH-18) (Figuras 3A y 3B). Este ejemplo muestra que los péptidos de la presente invención son eficaces no sólo para VPH-16, sino también para VPH-18.

Ejemplo 4: Efecto de los péptidos sobre la proliferación de células tumorales negativas para VPH: En este ensayo, se sembraron células H-82 (Cáncer Pulmonar Microcítico) a 2 x 104 células/ml en placas de 96 pocillos (Costar) usando DMEM suplementado con un 10% de Suero Bovino Fetal (FCS) (Gibco). Después de 24 horas, se añadieron péptidos al medio de cultivo a dosis que comprendían un intervalo entre 15 μM y 500 μM. La incubación se realizó durante 96 horas en CO2 al 5% y finalmente se añadieron a cada pocillo 20 μl de una solución de MTS (1,90 mg/ml) de Promega. Posteriormente, las placas se mantuvieron una hora en las mismas condiciones de incubación y finalmente se analizó la absorbancia a 490 nm. Los resultados se expresan como porcentaje de crecimiento con respecto al control sin péptidos. Para este ensayo, se emplearon los péptidos cíclicos descritos en la invención fusionados al péptido de penetración celular Tat-1 de VIH-1 como se ha mencionado anteriormente. Los resultados obtenidos a partir de estos experimentos demostraron que los péptidos de la presente invención producen un efecto dependiente de la dosis sobre la proliferación celular de células H-82. En la Figura 4, se demuestra que los péptidos de la invención son eficaces no sólo para las células transformadas con VPH, sino

Ejemplo 5: Efecto de los péptidos sobre la respuesta de VPH-16 al tratamiento con IFN en células CaSki: En este ensayo, se sembraron células CaSki a 2 x 104 células/ml en placas de 96 pocillos (Costar) usando DMEM suplementado con FCS al 10% (Gibco). Después de 24 horas, se añadió una concentración 120 μM de cada péptido al medio de cultivo. Veinticuatro horas después, se añadió IFN alfa en un intervalo comprendido entre 1000 y 31,5 10 U/ml. La incubación se realizó durante 96 horas en CO2 al 5% y posteriormente se añadieron 20 μl de MTS a 1,90 mg/ml. Además, las placas se mantuvieron una hora en las mismas condiciones y finalmente se leyó la absorbancia a 490 nm. Los datos se muestran como porcentaje de crecimiento con respecto al control. En estos experimentos, los péptidos descritos en la invención se usaron en su variante cíclica fusionada al péptido de penetración celular perteneciente a la proteína Tat-1 de VIH como se ha mencionado anteriormente. Los resultados observados en la

15 Figura 5 demuestran que la incubación previa de células CaSki con los péptidos descritos en la invención hace que estas células sean sensibles al efecto antiproliferativo del IFN alfa. Estos datos sugieren la utilidad de los péptidos descritos en la invención para tratar a pacientes infectados con VPH que son refractarios a la terapia con IFN.

Ejemplo 6: Efecto antitumoral del péptido inhibidor de la fosforilación por CKII en tumores humanos implantados en modelos de ratón desnudo: Para estos experimentos, se usaron ratones desnudos BalbC hembra 20 de 6-8 semanas de edad. La implantación tumoral se realizó usando células H-125 (Cáncer Pulmonar No Microcítico) que se resuspendieron en solución salina (PBS) a 1000 000 células/ml. La suspensión celular se inoculó por vía subcutánea en el abdomen. Se realizó una administración de péptidos (secuencia 1 en la lista) junto con las células y se continuó un día sí y otro no hasta completar un mes de tratamiento. En este ensayo se evaluaron dosis que variaban entre 1 y 10 mg/kg de peso. Para examinar el efecto antitumoral, se usó la progresión de los

25 parámetros. Estos datos muestran la eficacia antitumoral del péptido inhibidor de la fosforilación por CKII en un modelo de tumor humano implantado en animales experimentales.

Ventajas de la invención:

1. Proporciona productos farmacéuticos de amplio espectro de aplicación que no sólo son útiles en

enfermedades asociadas con VPH, sino también en tumores sólidos con altos niveles de actividad 30 endógena de CKII.

2.: El hecho de que la región 28-38 esté conservada entre los VPH, proporciona la posibilidad de usar este producto farmacéutico en enfermedades asociadas con diferentes tipos de VPH.

3.: Los péptidos como moléculas terapéuticas presentan baja antigenicidad cuando se administran a seres humanos.

35 4. Es un producto farmacéutico de fácil fabricación y bajo coste.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Efecto de péptidos sobre la fosforilación por CKII Figura 2: Efecto de péptidos sobre la fosforilación por CKII de E7 de VPH Figura 3 A: Efecto de péptidos sobre la proliferación de células CaSki

40 Figura 3 B: Efecto de péptidos sobre la proliferación de células HeLa Figura 4: Efecto de péptidos sobre la proliferación de células tumorales de pulmón Figura 5: Efecto de péptidos sobre la respuesta de células transformadas con VPH-16 a la acción del IFN Figura 6: Efecto antitumoral del péptido inhibidor de la fosforilación de CKII en tumores humanos implantados en ratones desnudos.

45 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

<120> Péptidos para el tratamiento del cáncer asociado con el Papilomavirus Humano (VPH) y otros tumores epiteliales

<130> Secuencias

50 <140>

<141>

<160> 11

<170> PatentIn ver. 2.1

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 1

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 1

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 2

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

20 <400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 3

<220>

<221> PÉPTIDO 30 <222> (1)..(11)

<400> 3

<210> 4

<211> 11 35 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 4

<220> 40 <221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 4

<210>: 5 45 <211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 5

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 5

<210>: 6 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 6

15 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 6

20 <210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 7

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 7

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 8

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

40 <400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 9

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 9

<210> 10

<211> 11 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 10

<220> 15 <221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 10

<210> 11 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido 11

25 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 11

35 E02796490 07-11-2011

Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptidos que se unen e inhiben el sitio de fosforilación de la Caseína Quinasa II (CKII) que presentan las siguientes secuencias:

a.

CSVRQGPVQKC;

b.

CSSCQNSPALC;

c.

CQIPQRTATRC;

d.

CAKQRTDPGYC;

e.

CWMSPRHLGTC;

f.

CRNCTVIQFSC;

g.

CHYIAGTVQGC;

h.

CPLVSLRDHSC;

i.

CKQSYLHHLLC;

j.

CFQPLTPLCRC;

k.

CQSYHELLLQC.
2.

Péptidos de acuerdo con la reivindicación 1, que presentan una estructura cíclica.
3.

Péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, que están contenidos en un polipéptido de fusión.
4.

Una composición farmacéutica que comprende uno o diferentes péptidos de las reivindicaciones 1-3 así como un vehículo apropiado.
5.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 que contiene además una citocina.
6.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 cuya citocina es un interferón (IFN).
7.

Los péptidos de las reivindicaciones 1-3 para uso en la inhibición de la proliferación de células tumorales.
8.

Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizados porque se inhiben tumores tanto asociados como no asociados con VPH.
9.

Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso en el tratamiento de lesiones asociadas con VPH en estadios premalignos.
10.

Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizados porque los péptidos se emplean junto con citocinas.
11.

Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizados porque la citocina es un IFN.
12.

Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizados porque los péptidos se emplean para tratar a pacientes infectados por VPH resistentes al tratamiento con IFN.
13.

Un vector de expresión de mamífero que contiene las secuencias de ADN que codifican cualquiera de los péptidos mostrados en las reivindicaciones 1-3.