ES2425489T3 - Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo - Google Patents

Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo Download PDF

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Abstract

Virus del herpes simple (VHS) modificado que comprende una envoltura glucoproteica en la que un anticuerpomonocatenario heterólogo sustituye una parte eliminada del dominio gD de dicha envoltura glucoproteica paraformar una proteína de fusión, en el que a) dicha parte eliminada comienza en una posición dentro de los aminoácidos 1 a 8 y acaba en una posicióndentro de los aminoácidos 38 a 55 de gD; o comienza en una posición dentro de los aminoácidos 40 a 61 yacaba en una posición dentro de los aminoácidos 210 a 218 de gD; b) dicho anticuerpo monocatenario comprende un dominio ligero variable (VL) y un dominio pesado variable (VH)separados por un enlazador (L1), en el que el enlazador permite a VL y VH asumir la conformación apropiada demanera que el anticuerpo monocatenario pueda unir en condiciones específicas un receptor que se expresasobre las células tumorales pero no sustancialmente sobre las células no tumorales; c) la envoltura se modifica de manera que la capacidad del VHS modificado de interactuar con el receptornectina1/HveC se reduce.

Description

Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un virus de herpes simple modificado (VHS), a las utilizaciones del VHS modificado, a una preparación farmacéutica y a un procedimiento de preparación de un VHS modificado.
Antecedentes
Una nueva frontera en el tratamiento de tumores es la viroterapia oncolítica, por la que un virus competente en replicación infecta las células tumorales, se propaga de célula a célula del tumor y las destruye. Dos de dichos tumores son los cánceres de mama y de ovario, que afectan a los animales tales como los seres humanos. Alrededor del 30% de los tumores de mama humanos, así como algunos tumores de ovario, son muy malignos y metastásicos.
Estos tumores deben su alto grado de malignidad y metastasicidad a la expresión de un receptor específico de moléculas de la superficie celular, denominado HER2, que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, y generalmente se tratan con cirugía o cirugía y radioterapia combinadas o quimioterapia.
El VHS es un virus patógeno para las células de mamíferos [VHS-1 se describe, por ejemplo en Ejercito, P. M., et al. (1968). J. Gen Virol. 2:357 y su genoma tiene el número de registro NC-001806 (GenBank)].
El VHS se introduce en las células por un proceso de varias etapas. La primera etapa es la fijación a la superficie celular, mediada por la interacción de las glucoproteínas gB y gC (Laquerre S., Argnani R., Anderson D. B., Zucchini S., Manservigi R., Glorioso J. C. (1998), J. Virol. 72 (7): 6119-30). Esto va seguido de la interacción más específica de la glucoproteína D (gD) de la envoltura del virión con uno de sus receptores de entrada: nectina1/ HveC, HVEM/HveA y restos sulfatados de sulfato de heparán enlazados por O (Spear P. G., Eisenberg R. J., Cohen G. H., (2000) Virology 275:1-9) (Campadelli-Fiume G., Cocchi F., Menotti L., López M. (2000) Reviews in Medical Virology, 10:305-319) (Campadelli-Fiume G. et al. (2007) Rev. Med. Virol., 17:313-326) (los códigos de GenBank para los receptores son los siguientes: nectina1 alfa AF060231, nectina1 beta AF110314, HVEM U70321).
En los últimos años, se ha intentado utilizar VHS genéticamente modificados como agentes oncolíticos principalmente para el tratamiento del glioma maligno. Dado que los virus naturales son virulentos, atacan y destruyen muchas células y tejidos diferentes, los VHS oncolíticos experimentales se han atenuado mucho. Los virus que han alcanzado los ensayos clínicos se hicieron dependientes para su replicación en la célula tumoral en división mediante la eliminación de dos genes de VHS, es decir, el gen gamma 43.5 - que codifica la proteína ICP34.5 cuya función es impedir la interrupción de la síntesis de proteínas en las células infectadas, y el gen UL39 que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa. Estos virus están dañados por la baja capacidad de replicarse, incluso en células en división, una característica que da lugar a dos efectos negativos. En primer lugar, la administración de dichos virus a los tumores no produce un alto rendimiento de la descendencia de los virus, capaces de propagarse de célula a célula del propio tumor, y por lo tanto ampliar la respuesta a cualquier dosis terapéutica dada del virus. En segundo lugar, los virus son difíciles de cultivar y apenas se pueden producir a gran
escala (10 -10 unidades formadoras de placas UFP/ml) para producir la cantidad de virus requerida para aplicaciones clínicas. Por otra parte, la capacidad conservada del virus para unirse a cualquier célula que lleva uno de los receptores naturales para el VHS sustrae el virus a los tejidos tumorales que más lo necesitan y disminuye el efecto terapéutico de la destrucción de células tumorales, y puede ejercer la infección no deseada de tejidos y células no cancerosos, incluyendo su muerte por apoptosis. Se señala que, incluso si estos virus se redirigían a los receptores específicos de tumores – están no obstante muy atenuados.
Recientemente VHS redirigidos a receptores específicos se han modificado genéticamente para que puedan infectar células que necesitan ser destruidas mientras se mantiene una alta capacidad de replicarse y propagarse de célula a célula. Aunque dichos virus tienen una buena capacidad de propagarse entre las células tumorales, todavía infectan indeseablemente tejidos y células no cancerosas.
La solicitud de patente con número de publicación WO2004/033639, da a conocer un VHS recombinante, que expresa en su envoltura glucoproteica una citocina natural. Aunque la utilización de VHS recombinante de este tipo ha sido propuesta para el tratamiento de tumores, es importante hacer hincapié en que: el receptor diana tiene el ligando natural de pequeño tamaño tal que puede insertarse fácilmente en gD, y el VHS recombinante propuesto es todavía capaz de interactuar con los receptores nectina1/HVEC y HVEM/HveA. En particular, el documento WO2004/033639 no consigue identificar mutaciones que podrían resultar en un VHS recombinante que ya no es capaz de unir nectina1/HveC y es capaz de unir receptores (tales como HER2/ErbB2) de células enfermas. Zhou, G. et al. (2003) J. Virol. Vol. 77, nº: 6, páginas 3759-3767 da a conocer una serie de mutantes de inserción-supresión de gD para cartografiar los dominios de gD necesarios para bloquear la apoptosis por los virus gD-1- y gD-1+ y los
implicados en la fusión célula a célula, demostrando que las modificaciones, especialmente las supresiones en la parte terminal en N de gD, afectan la unión a la nectina-1.
De ello se deduce que existe una necesidad todavía en la técnica de agentes terapéuticos víricos dirigidos selectivamente a células que necesitan ser destruidas. En particular, existe una necesidad de agentes terapéuticos víricos dirigidos a receptores que no tienen ningún ligando natural, y se sobreexpresan o se expresan selectivamente en las células enfermas, tales como las células cancerosas.
Sumario
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un VHS modificado, como se define en las reivindicaciones, diseñado para eliminar al menos en parte, los inconvenientes de la técnica conocida, y que, al mismo tiempo, son fáciles de aplicar.
Otros objetivos de la presente invención consisten en proporcionar utilizaciones del VHS modificado, según las reivindicaciones, preparados farmacéuticas, y un procedimiento de preparación del VHS modificado.
A menos que se especifique explícitamente lo contrario, los siguientes términos tienen el significado que a continuación se indica.
Como se emplea en la presente memoria, "anticuerpo monocatenario" (scFv) se refiere al anticuerpo monocatenario "apropiadamente denominado" (es decir, que tiene dos dominios conectados por un enlazador) u otros derivados de anticuerpos similares (por ejemplo, dominios individuales de tipo V). Ventajosamente, los "anticuerpos monocatenarios" se "denominan apropiadamente" anticuerpos monocatenarios. Un ejemplo no limitativo de un anticuerpo monocatenario "apropiadamente denominado" es scHER2 (descrito en los ejemplos presentados a continuación).
Como se emplea en la presente memoria, "porcentaje de identidad" o "% de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se refiere al porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias alineadas de manera óptima.
Para establecer el "porcentaje de identidad" de las dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se alinean las secuencias; para tener una alineación óptima, son posibles espacios (supresiones o inserciones - que posiblemente pueden estar situadas en los extremos de las secuencias). Se comparan los restos de aminoácidos o de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que ocupa la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias [es decir, % de identidad = (número de posiciones idénticas / número de posiciones totales x 100].
De acuerdo con las formas de realización ventajosas, las secuencias tienen la misma longitud (mismo número de restos de aminoácidos o nucleótidos).
Favorablemente, las secuencias comparadas no tienen espacios. El porcentaje de identidad se puede obtener empleando algoritmos matemáticos. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático, que se emplea para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2264-2268] modificado por Karlin y Altschul [Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90 (1993) 5873-5877].
Para obtener alineaciones también en presencia de uno o más espacios, es posible utilizar métodos que proporcionan una penalización relativamente alta a cada espacio y una penalización más baja a cada resto de aminoácido o nucleótido (dicho resto de aminoácido o nucleótido adicional se define como una extensión del espacio). Resultan grandes penalizaciones, obviamente, en alineaciones óptimas con un menor número de espacios.
Un ejemplo de un programa (software) diseñado para hacer dicho tipo de alineación es el programa BLAST como se describe en Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. Con este propósito pueden utilizarse los programas BLASTn y BLASTp con parámetros por defecto. En los programas BLAST se utiliza generalmente la matriz BLOSUM62.
Un ejemplo ventajoso y no limitativo de un programa para la obtención de una alineación óptima es el paquete GCG Winsconsin Bestfit (Universidad de Winsconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). También en este caso, se utilizan los parámetros por defecto (que proporcionan una penalización de -12 a cada espacio y una penalización de -4 a cada extensión).
Tal como se utiliza en la presente memoria, "porcentaje de homología" o "% de homología" entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se refiere al porcentaje de restos de aminoácidos o de nucleótidos homólogos en las
posiciones correspondientes en las dos secuencias alineadas de manera óptima.
El "porcentaje de homología" entre dos secuencias se establece de una manera sustancialmente idéntica a la descrita anteriormente haciendo referencia a la determinación del "porcentaje de identidad" con la excepción de que en el cálculo se consideran también posiciones homólogas y no sólo posiciones idénticas.
En lo que se refiere a secuencias de nucleótidos, dos posiciones homólogas pueden tener dos nucleótidos diferentes, pero estos dos nucleótidos, en el codón respectivo, codificar el mismo aminoácido.
En lo que se refiere a secuencias de aminoácidos, dos posiciones homólogas tienen dos aminoácidos idénticos u homólogos. Los restos de aminoácidos homólogos tienen propiedades fisicoquímicas similares, por ejemplo, aminoácidos que pertenecen a un mismo grupo: aromáticos (Phe, Trp, Tyr), ácidos (Glu, Asp), polares (Gln, Asn), básicos (Lys, Arg, His), alifáticos (Ala, Leu, Ile, Val), con un grupo hidroxilo (Ser, Thr), con una cadena lateral corta (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). Es de esperar que dichas sustituciones entre aminoácidos homólogos no cambien un fenotipo de proteína (sustituciones conservadoras de aminoácidos).
Unos ejemplos específicos de sustituciones conservadoras en este campo de la técnica se dan a conocer en varias referencias [por ejemplo, Bowie et al. , Science, 247:1306-1310 (1990)].
Se citan otros ejemplos de programas y/o artículos relacionados con el establecimiento de alineaciones y/o porcentajes óptimos de homología y/o identidad, por ejemplo, en los documentos US2008003202, US2007093443, WO2006048777 y WO2007149406.
Como se emplea en la presente memoria, "posición correspondiente" se refiere a una posición de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos correspondiente (enfrentadas), una vez que se ha realizado una alineación, para una posición dada de una secuencia de referencia.
Por ejemplo, una posición correspondiente a una posición dada de gD que tiene la SEC. ID. nº: 1 se puede identificar alineando la SEC. ID. nº: 1 con una secuencia peptídica de interés, la alineación puede obtenerse ya sea manualmente o como anteriormente se ha descrito en referencia a la determinación del porcentaje de identidad.
Como se emplea en la presente memoria, "una cadena polipeptídica desnuda" se refiere a un polipéptido que no se modifica después de la traducción o dicho de otra manera no se modifica químicamente, pero contiene sólo aminoácidos unidos por enlaces covalentes.
Como se emplea en la presente memoria, "ligando capaz de unirse en condiciones específicas a un receptor" se refiere a un ligando que, cuando se inserta en el VHS mediante técnicas de biología molecular, permite al VHS penetrar en una célula por interacción con este receptor, que el ligando está diseñado para unirse. En particular, el ligando es capaz de unirse en las condiciones específicas a un receptor, cuando el VHS, que lo contiene, es capaz de interaccionar con ese receptor que pasa las pruebas descritas en el ejemplo 5 descrito a continuación o los ensayos análogos (con diferentes receptores).
Tal como se emplea en la presente memoria, "capacidad de VHS (en particular, el VHS modificado) de interactuar con un receptor" se refiere a la capacidad del VHS de penetrar en una célula por interacción con ese receptor. En particular, también en este caso, esta capacidad se evalúa por medio de las pruebas dadas a conocer en el ejemplo 5 descrito a continuación o los ensayos análogos (para diferentes receptores).
Breve descripción de las figuras
Las formas de realización no limitativas de la presente invención se describirán a título de ejemplo haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
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La figura 1A muestra la representación esquemática de los genomas recombinantes de VHS-BAC descritos en esta invención. El eje central de gDminus-EGFP-VHS-BAC se muestra como ejemplo. Se muestra el eje central de gDminus-EGFP-VHS-BAC. El VHS-BAC procede de pYEbac102 Tanaka, M., H. Kagawa, Y. Yamanashi, T. Sata e Y. Kawaguchi. 2003. El montaje de un cromosoma artificial bacteriano escindible que contiene un clon infeccioso completo del virus del herpes simple tipo 1: los virus reconstituidos a partir del clon presentan propiedades naturales in vitro e in vivo. J. Virol. 77:1382-91. [Tanaka, 2003 nº: 672], que lleva secuencias de pBeloBACll insertadas entre UL3 y UL4. En gDminus-EGFP-VHS-BAC se inserta la casete indicadora (a27-EGFP) en las secuencias de BAC. gDminus-LacZ-VHS-BAC tiene la misma estructura, pero lleva LacZ en lugar de EGFP.
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La figura 1B muestra unas representaciones esquemáticas de cartografías lineales de wt-gD (a) y de las proteínas híbridas gD: (b) de gD de R-LM31 recombinante, que lleva sustitución en el resto 34 de aminoácido; (c) de gD de R-LM39 recombinante, que lleva mutaciones en los restos 34, 215, 222 y 223 de aminoácidos; (d) de gD de R-LM113 recombinante, que lleva scHER2L en lugar de los restos 6-38 de aminoácidos, (e) de gD de R
LM249 recombinante, que lleva LscHER2L en lugar de los restos 61 a 218 de aminoácidos. Los números en negrita indican la longitud en restos de aminoácidos de cada fragmento. Los números corrientes se refieren a los restos de aminoácidos según las coordenadas en wt-gD. L, enlazadores. TM, el dominio transmembranario de gD. VH y VL , dominios variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos 4D5 anti-HER2/neu. 1,
5 supresión. Las barras están dibujadas a escala.
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La figura 2 muestra que el virus recombinante R-LM31 no está desorientado del receptor nectina1. Las micrografías de células J negativas para el receptor (A), y J-HER2 (B), J-hNectin1 (C) y J-mNectin1 (D) que expresan HER2 humano, y nectina1 humana o murina, respectivamente, se expusieron a R-LM31 en células 10 UFP. La infección se controló como actividad de �-galactosidasa por tinción con X-gal in situ 16 h después de la infección. E. La movilidad E. electroforética de natural y de las gD híbridas se expresó en células SKOV3 infectadas con virus recombinantes R-LM5, R-LM13, LM31-R, R-LM39, R-LM113 y R-LM249. Se separaron por SDS-PAGE los lisados de células infectadas, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se visualizaron mediante quimioluminiscencia intensificada. Los números a la izquierda representan las posiciones de migración
15 de los marcadores de peso molecular (en kilodaltons). Las flechas indican la movilidad electroforética aparente de las gD naturales o híbridos. De abajo a arriba, gD natural (wt-gD) expresada por el virus recombinante R-LM5, gD (161-218)-LscHER2L expresada por el virus recombinante R-LM249, gD (16-38)-scHER2L expresada por el virus recombinante R- LM113. La migración de gD-scHER2L expresada por R-LM13, R-LM31 y R-LM39 es indiscernible de la de gD (16-38)-scHER2L.
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La figura 3 muestra la infección de una variedad de estirpes celulares con los virus recombinantes R-LM113 y R-LM249. Las monocapas de las estirpes celulares indicadas se infectaron a células 5 UFP, y la expresión del gen indicador EGFP se midió 24 después mediante un fluorómetro. Los números a la izquierda indican la intensidad de EGFP en unidades arbitrarias.
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La figura 4 muestra el crecimiento de los virus recombinantes R-LM39, R-LM113 y R-LM249 y de referencia R-
LM5 y R-LM13.(A a G) Replican cultivos de J (A), J-Nectin1 (B), J-HVEM (C), J-HER2 (D), SKOV3 (E), I-143 tk (F), o HEp-2 (G) se infectaron células con virus recombinantes R-LM5 (.), R-LM13 (e), R-LM39 (1), R-LM113 (x)
o R-LM249 (.) a 1 UFP/célula. La descendencia del virus se recogió a las 3, 24 y 48 h después de la infección y se valoró en células SKOV3.
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La figura 5 muestra el bloque de la infección de las células SKOV3 con R-LM39 (A), R-LM113 (B) o R-LM249 (C) por los anticuerpos a HER2 (Herceptina) o nectina1 (R1.302). Se preincubaron células SKOV3 con las concentraciones indicadas de IgG purificada de Herceptina (1), Rl.302 (O) o la combinación de Herceptina más
35 R1.302 (e) o IgG de ratón irrelevantes (x) durante 2 horas a 4ºC. Se añadió el virus al anticuerpo que contiene el medio y se dejó adsorber a las células durante 90 min a 4ºC. Se controló la infección 16 h después como expresión de EGFP. El cien por ciento indica las lecturas de EGFP en los cultivos sin tratar infectados por virus.
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La figura 6A muestra la inhibición de la propagación de célula a célula por Herceptina. Las células SKOV3 infectadas con diluciones en serie de los virus indicados se cubrieron con medio que contiene con 1% de agarosa Seaplaque ± 10 µg/ml Herceptina. Se fotografió cada una de las placas a las 48 h, y las áreas de las placas se midieron mediante el programa herramienta Photoshop Histogram y se expresaron en píxeles x
103. Para cada virus, se midieron las áreas de 4 o 5 placas. Los histogramas representan promedios; barras de
error, desviaciones estándar. 45
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La figura 6B muestra las placas representativas a las que se hace referencia con respecto a la figura 6A.
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Las figuras 7 a 15 muestran cartografías de los siguientes plásmidos: pLM5, pLM13 (scHER2L entre los aa 24 y 25 de gD madura), pLM13 (obtenido por mutagenia de pLM13 para introducir la sustitución V34S), pS31 (plásmido lanzadera obtenido por subclonación del fragmento NruI-Pmel procedente del pLM31 en SmaI de pST76KSR), PS39 (plásmido lanzadera obtenido por mutagenia de pS31 con el cebador gD_215G-222N-223I_PvuI), pLM113 (lleva la secuencia que codifica gD donde los aa 6-38 de la proteína madura están sustituidos por scHER2L), pS113 (plásmido lanzadera obtenido por subclonación del fragmento NruI-Pmel de pLM113 en SmaI de pST76KSR), pLM249 (lleva la secuencia que codifica gD donde los aa 61 a 218 de la
55 proteína madura se sustituyen por scHER2 flanqueada por enlazadores), pS249 (plásmido lanzadera obtenido por subclonación del fragmento NruI-Pmel de pLM249 en Smal del pST76KSR), respectivamente: los números en cursiva negrita subrayadas indican las coordenadas del plásmido completo final; los números en letra normal indican las coordenadas en el vector y los fragmentos originales.
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La figura 16 muestra la actividad citotóxica de R-LM113 y R-LM249 recombinantes en comparación con el virus de referencia R-LM5. Los histogramas representan el número total de células (eje y: número de células x 104). Para cada muestra de células infectadas se contaron tanto las fracciones de células adherentes (a) como despegadas (d). Las partes sombreadas de los histogramas representan la fracción de células no viables (positivo a eritrosina B), y los valores correspondientes se indican en los valores porcentuales en los
65 histogramas. NI, células de referencia no infectadas.
Descripción de las formas de realización ilustrativas
Los objetivos de la presente invención son:
1) Un virus modificado del herpes simple (VHS) que comprende una envoltura glucoproteica en la que un anticuerpo monocatenario heterólogo sustituye a una parte eliminada del dominio gD de dicha envoltura glucoproteica para formar una proteína de fusión, en el que
a) dicha parte eliminada comienza en una posición en los aminoácidos 1 a 8 y acaba en una posición en los aminoácidos 38 a 55 de gD; o comienza en una posición en los aminoácidos 40 a 61 y acaba en una posición en los aminoácidos 210 a 218 de gD;
b) dicho anticuerpo monocatenario comprende un dominio ligero variable (VL) y un dominio pesado variable (VH) separados por un enlazador (L1), en el que el enlazador permite a VL y vehículo asumir la configuración apropiada de manera que el anticuerpo monocatenario pueda unir en condiciones específicas un receptor que se expresa en células tumorales pero no sustancialmente en células no tumorales;
c) La envoltura se modifica de modo que la capacidad del VHS modificado de interactuar con el receptor nectina1/HveC se reduce.
2) VHS modificado según el punto 1, en el que la envoltura está tan modificada que la capacidad del VHS modificado para interactuar con el receptor nectina1/HveC y HVEM/HveA se reduce o se elimina sustancialmente.
3) VHS modificado según el punto 1 o 2, en el que la parte eliminada de gD empieza en la posición 6 y acaba en la posición 38, o empieza en la posición 61 y acaba en la posición 218.
4) VHS modificado según uno de los apartados anteriores, en el que dicho gD tiene por lo menos 80% de identidad con SEC. ID. nº: 1.
5) VHS modificado según uno de los apartados anteriores, en el que dicho receptor expresado en células tumorales tiene por lo menos el 90% de identidad con un receptor seleccionado de entre: HER2/ErbB2, EGFR1, EGFR3, PMSA, CEA, GD2, VEGFR1 y VEGFR2.
6) VHS modificado según uno de los apartados anteriores, en el que dicho anticuerpo monocatenario comprende además un segundo enlazador (L2) y/o un tercer enlazador (L3), en el que:
VH está situado entre L1 y L2 y les conecta, y
HL está situado entre L1 y L3 y les conecta.
7) VHS modificado según uno de los apartados 6 a 8, en el que:
VL tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC. ID. nº: 2
VH tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC. ID. nº: 3
L1 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 4
L2 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 5
L3 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 6 o con la SEC. ID. nº: 7
8) VHS modificado según uno de los apartados anteriores, en el que dicha proteína de fusión resultante de la sustitución de una parte de gD por dicho ligando peptídico tiene por lo menos el 70% de identidad con la SEC. ID. nº: 9 o la SEC. ID. nº: 10.
9) VHS modificado según uno de los apartados anteriores que comprende además un marcador, y en particular un marcador adecuado para observar un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor de estómago, un tumor de glándulas salivales, un melanoma, un carcinoma de cabeza y cuello, el tejido neoangiogénico de un tumor, neuroblastoma y/o metástasis de los mismos.
10) Preparación farmacéutica que comprende un VHS modificado según uno de los apartados 1 a 9 anteriores y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11) VHS modificado según uno de los apartados 1 a 9 anteriores para su utilización en el tratamiento de una enfermedad tumoral, y en particular de un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor de estómago, un tumor de glándulas salivales, un melanoma, un carcinoma de cabeza y cuello o un neuroblastoma.
12) VHS modificado según uno de los apartados 1 a 9 anteriores para su utilización en el tratamiento de una 5 metástasis de una enfermedad tumoral, y en particular de una metástasis de un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un melanoma o de un neuroblastoma.
13) Procedimiento para preparar un VHS modificado según uno de los apartados 1 a 9 anteriores, que comprende:
10 Eliminar una parte del ADN que codifica la gD del VSH, sustituir la parte eliminada por el ADN que codifica el anticuerpo monocatenario que determina la capacidad del VHS modificado resultante para unirse a por lo menos un receptor expresado por las células tumorales pero no sustancialmente por las células no tumorales.
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un virus modificado del herpes simple (VHS) que
15 comprende una envoltura glucoproteica, que tiene un ligando peptídico heterólogo capaz de unirse en condiciones específicas a un receptor dado expresado por células enfermas y sustancialmente no (o poco) expresado por células no enfermas. Estando la envoltura glucoproteica tan modificada que se reduce la capacidad del VHS modificado de unir en condiciones específicas el receptor nectina1/HveC (con respecto al VHS natural). Ventajosamente, la capacidad del VHS modificado de unir en condiciones específicas el receptor nectina1/HveC se elimina
20 sustancialmente.
Según algunas formas de realización preferidas, la capacidad del VHS modificado de unir en condiciones específicas el receptor de HVEM/HveA se reduce, mejor se elimina sustancialmente.
25 Las formas de realización ilustrativas se dan a conocer utilizando como virus ilustrativo un miembro de la familia Herpesviridae, VHS-1.
Los VHS-1 y VHS-2 son virus del herpes simple. El objeto de la presente invención comprende cualquier miembro de la familia Herpesviridae y no se limita a las formas de realización ejemplificativas descritas en los
30 ejemplos. Muchos VHS son conocidos en la técnica. Dichos virus pueden contener uno o más genes mutados. Los ejemplos de virus recombinantes que contienen genes heterólogos y procedimientos de preparación y utilización de dichos virus se describen en el documento US5599691. Los genes heterólogos incluyen los genes que codifican proteínas marcadoras (tales como las proteínas fluorescentes rojas o verdes o variaciones de las mismas, luciferasa o -galactosidasa), que permiten la detección de las células infectadas que expresan la proteína.
35 El VHS modificado proporcionado en la presente memoria tiene la ventaja de mantener una parte relevante de la infectividad del virus natural.
Según unas formas de realización específicas, el ligando peptídico se inserta en la gD (glucoproteína D) de la
40 envoltura glucoproteica del VHS en las posiciones definidas en la reivindicación 1. Una parte de la gD se elimina. Mejor, el ligando peptídico se inserta en lugar de la parte eliminada, en particular, de modo que el ligando peptídico y gD forman una proteína de fusión.
Por lo general, gD natural (madura) tiene la secuencia peptídica SEC. ID. nº: 1.
45 La gD natural procede de un precursor, que tiene la secuencia peptídica SEC. ID. nº: 34.
El precursor mencionado está codificado por la secuencia de nucleótidos SEC. ID. nº: 35.
50 Según algunas formas de realización de la presente invención, gD, antes de modificarse, tiene por lo menos 80% de homología, mejor de identidad, con respecto a SEC. ID. nº: 1.
Según algunas formas de realización, la porción, que se extiende entre las posiciones correspondientes a 40 a 61, por un lado, y 210 a 218, en el otro lado, se eliminan. Ventajosamente, la parte eliminada se extiende entre las
55 posiciones correspondientes a 61, por un lado, y 218, en el otro lado.
En la presente memoria, locus (posición) de las secuencias peptídicas modificadas o no modificadas se identifica haciendo referencia a una numeración de aminoácidos de restos de aminoácidos en las posiciones correspondientes de una gD natural (madura) no modificada como se identifica por la SEC. ID. nº: 1. Las posiciones correspondientes
60 pueden identificarse alineando los restos no modificados (véase anteriormente). Por ejemplo, se describe a continuación la numeración de secuencias de la gD natural (SEC. ID. nº: 1) y su precursor (SEC. ID. nº: 34).
SEC. ID. nº: 1
SEC. ID. nº: 34
10 Según algunas formas de realización, la parte eliminada se extiende entre las posiciones correspondientes a 1 a 8, por un lado, y 38 a 55, en el otro lado. Ventajosamente, la parte eliminada se encuentra entre las posiciones correspondientes a 6, en un lado, y 38, en el otro lado.
El ligando péptido mencionado anteriormente es cualquier tipo de ligando adecuado conocido en la técnica, por
15 ejemplo, una citocina, un factor de crecimiento, un derivado de anticuerpo monoclonal o, ventajosamente, un anticuerpo monocatenario.
Según algunas formas de realización específicas, el ligando peptídico es capaz de unirse en condiciones específicas al receptor dado, que tiene por lo menos 90% de homología, mejor identidad, con respecto al receptor HER2/ErbB2.
20 El HER2/ErbB2 es un receptor que es sobreexpresado por, por ejemplo, el tumor de ovario, el tumor de mama, el tumor de estómago y las células tumorales de las glándulas salivales (Hynes N. E. y H. A. Lane "ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors". Nat. Rev. Cancer (2005) 5: 341; Holbro, T. y Hynes, N. E. ErbB receptors: directing key signaling networks throughout life. Annu Rev. Pharmacoll Toxicol. 44, 195-217 (2004);
25 Hynes, N. E. y Stern D. F. The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its rol in cancer. Biochim. Biophys. Acta 1198, 165184 (1994)), y que se expresa a niveles muy bajos en tejidos no malignos (Yamamoto et al., Nature. enero 1986 1622; 319 (6050):230-4) (Press M. F. et al., Oncogene (1990.) 5: 953).
Según otras formas de realización, el ligando peptídico es capaz de unirse en condiciones específicas del receptor
30 dado, que tiene por lo menos 90% de homología, mejor identidad, con respecto a un receptor dado seleccionado en el grupo que consiste en: EGFR1 (receptor del factor de crecimiento epidérmico) [Carpenter, G. (1992). Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. Faseb J 6(14), 3283-9] , EGFR3 [Hynes,
N. E. y Lane, H. A. (2005). ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat. Rev. Cancer 5 (5), 341-54], PMSA (antígeno asociado a la membrana prostática), CEA (antígeno carcinoembrionario), GD2
35 (disialogangliósido, expresado en el neuroblastoma y en el melanoma), los receptores 1 y 2 de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) expresados en los nuevos vasos sanguíneos [Carmeliet, P. (2005). VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer. Oncology 69 Supl. 3, 4-10].
Es importante hacer hincapié en que, algunos de los ligandos naturales de receptores anteriormente mencionados
40 son conocidos, por ejemplo, EGF, VEGF. En la situación actual de la técnica, se conocen anticuerpos monoclonales y anticuerpos monocatenarios, que se dirigen al receptor diana expresado por las células enfermas. Por ejemplo, J591, J415 y J533 se han preparado (véase la solicitud de patente con número de publicación US20030007974). Single chain antibodies to EGFR1 (Nakamura, T., Peng, K. W., Vongpunsawad, S., Harvey, M.,
Mizuguchi, H., Hayakawa, T., Cattaneo, R., and Russell, S. J. (2004). Antibody-targeted cell fusion. Nat. Biotechnol. 22 (3), 331-6), to EGFR3 (Horak, E., Heitner, T., Robinson, M. K., Simmons, H. H., Garrison, J., Russeva, M., Furmanova, P., Lou, J., Zhou, Y., Yuan, Q. A., Weiner, L. M., Adams, G. P. y Marks, J. D. (2005). Isolation of scFvs to in vitro produced extracellular domains of EGFR family members. Cancer Biother. Radiopharm. 20 (6), 603-13), to
5 VEGFR2/KDR (A7 scFv, Boldicke, T., Tesar, M., Griesel, C, Rohde, M., Grone, H. J., Waltenberger, J., Kollet, O. , Lapidot, T., Yayon, A., and Weich, H. (2001). Anti-VEGFR-2 scFv para el aislamiento de células. Se han descrito anticuerpos monocatenarios que reconocen el receptor-2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGFR-2/fIk-1) en la superficie de las células endoteliales primarias y células CD34+ preseleccionadas de la sangre del cordón umbilical. Stem Cells 19 (1), 24-36).
10 Se han preparado anticuerpos monocatenarios contra CEA: entre otros, scFv MFE23 (que se describen en: Chowdhury et al., Retargeting Retrovirus, 2004 Mol. Ther. 9:85, Imaging, Mayer A., Clin. Cancer Res. 6 (5): 1711 (2000), y en la solicitud de patente con el número de publicación US20020090709) y scFv T84.66 (que se dio a conocer en: Hu, Cancer Research (1996) 56:3055; Olafsen T. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17:21; Wong Y. J.
15 et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10:5014; Kenanova V. et al. Cancer Res., (2005) 65:622; US20030171551). El anticuerpo monoclonal MAb 3F8 (US20040116379, US20040115688, US6716422, Kushner B.H. et al., (2001) 19:4189, Tur M.K. et al., Int.. J. Molec. Med. (2001) 8:579, US20040180386) y el anticuerpo monocatenario scFv
14.18 contra GD2 también son conocidos en la técnica.
20 El ligando puede tener por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% de homología (mejor identidad) con un ligando elegido en el grupo formado por: scFv J591, scFv MFE23, MAb 3F8, scFv T84.66 y scFv 14.18.
Según algunas formas de realización, el ligando consta de al menos trescientos aminoácidos; mejor por lo menos trescientos veinte, trescientos sesenta o doscientos cuarenta.
25 Ventajosamente, el ligando comprende un primer dominio (VL) y un segundo dominio (VH) y un primer enlazador (L1), que conecta el primer y el segundo dominios (dominios VL, VH) y es capaz de permitir que el primer y el segundo dominio (VL, VH) tomen una posición relativa adecuada; diseñándose el primer y el segundo dominios (VL, VH) para enlazar dicho receptor dado.
30 El ligando comprende además un segundo enlazador (L2) y/o un tercer enlazador (L3). El segundo dominio (VH) está situado entre el primer y el segundo enlazador (L1, L2) y los conecta. El primer dominio (VL) está situado entre el primer y el tercer enlazador (L1, L3) y los conecta.
35 El primer dominio (VL) se compone de al menos un centenar de aminoácidos, mejor no más de ciento diecisiete aminoácidos. El segundo dominio (VH) se compone de al menos ciento diez, mejor no más de ciento treinta, aminoácidos. El primer enlazador (L1) se compone de al menos doce, mejor no más de treinta, aminoácidos.
Según algunas formas de realización, el primer dominio (VL) tiene al menos 80% de homología, mejor identidad, con 40 respecto a la SEC. ID. nº: 2.
SEC. ID. nº: 2
El primer dominio (VL) puede tener por lo menos 80%, 90%, 95%, 98% o 100% de homología, mejor identidad, con 45 respecto a la SEC. ID. nº: 3.
SEC. ID. nº: 3 KSDMPMADPN RFRGKNLVFH Según algunas formas de realización, el segundo enlazador (L2) tiene por lo menos 50% de homología, mejor de identidad, con respecto a la SEC. ID. nº: 5.
50
Según algunas formas de realización, el primer enlazador (L1) tiene por lo menos 50% de homología, mejor de identidad, con respecto a la SEC ID N º: 4.
55
SEC. ID. nº: 4
5 SEC. ID. nº: 5 SSGGGSGSGG S
10 SEC. ID. nº: 8 SSGGGSGSGG SG Según algunas formas de realización, el tercer enlazador (L3) se compone de al menos dos y, mejor, no más de
15 ocho aminoácidos. El tercer enlazador (L3) tiene por lo menos 50% de homología, mejor de identidad, con respecto a la SEC. ID. nº: 6 o la SEC. ID. nº: 7. SEC. ID. nº: 6 20 EN SEC. ID. nº: 7 HSSGGGSG
25 Según algunas formas de realización específicas, el ligando peptídico se inserta en la gD (glucoproteína D) de la envoltura glucoproteica y una porción de gD se borra, de modo que la gD modificada obtenida tiene por lo menos 70% de homología, mejor de identidad, con respecto a la SEC. ID. nº: 10 o la SEC. ID. nº: 9.
30 SEC. ID. nº: 10
SEC. ID. nº: 9
Los precursores de la SEC. ID. nº: 10 y la SEC. ID. nº: 9 pueden ser expresados por la SEC. ID. nº: 36 y la SEC. ID. nº: 37, respectivamente.
Las secuencias de péptidos descritas en la presente memoria, en particular, la gD modificada, pueden cambiarse tras la traducción. Los cambios posibles incluyen, pero no se limitan a la glucosilación, la pegilación, la albuminación, la farnisilación, la carboxilación, la hidroxilación y la fosforilación.
En este sentido debe tenerse en cuenta que, la gD natural tiene oligosacáridos ligados por N añadidos en cada secuencia de consenso específica (Asn-X-Ser y/o Asn-X-Thr) (Sodora, D. L., Cohen G. H. y R. J. Eisenberg. 1989
Influence of asparagine-linked oligosaccharides on antigenicity, processing, and cell surface expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein D. J. Virol. 63:5184-93) y posible oligosacáridos unidos por O a uno o más restos Ser y/o Thr. De manera ventajosa, también la gD modificada y/o el ligando incluyen dichas modificaciones.
Se ha observado experimentalmente que, sorprendentemente, el VHS modificado según la presente invención, aunque las secuencias de aa 7-32, que en la gD natural están involucradas en la interacción con HVEM, no siempre se eliminaban, no sólo ha perdido la capacidad de interactuar con nectina1, sino también con HVEM, y por lo tanto no se dirigen tanto desde receptores naturales HVEM como de nectina1.
En este sentido, cabe señalar que, contrariamente a los esfuerzos descritos por Zhou y Roizman (documento WO 2004/033639), el ligando utilizado (en este caso el scFv) no se inserta en el terminal en N de la gD, pero se inserta entre dos fragmentos de gD que contienen restos que no se pueden eliminar (es decir, el terminal en N hasta el resto del aa 60, y la región del extremo 218). Una característica específica del VHS modificado es que estas porciones están unidas entre sí en una sola cadena polipeptídica, y están unidas y mantienen juntas, en particular, por el scFv que, en este caso, cumple simultáneamente dos funciones (i) proporciona el nuevo ligando para los receptores a los que va dirigido (y por lo tanto dirige el tropismo del virus recombinante para el receptor de elección), y (ii) proporciona la función de soporte que, en la gD natural, se encuentra en la porción de Ig plegada incluida en el polipéptido 61-218.
Otras modificaciones que posiblemente mejoran la capacidad del virus específico para unirse específicamente a las células que expresan el receptor dirigido por el ligando heterólogo y entrar en ellas incluyen la eliminación de secuencias específicas en la glucoproteína gB (restos de aminoácidos 68-77) y gC (restos de aminoácidos 136 152) que permiten la unión al receptor sulfato de heparán del VHS específico. Dichas secuencias, o ampliaciones de las mismas, pueden reemplazarse con el ligando heterólogo de elección, a fin de concentrar más el virus recombinante en las células de elección.
Una aplicación adicional consiste en la introducción en el genoma vírico de las mutaciones que favorecen en gran medida la propagación del virus desde una célula infectada a unas células adyacentes próximas. Se conocen mutaciones que ejercen dicho efecto. Por lo general provocan que las células infectadas formen un sincitio (o policariocito) con las células cercanas, y se denominan mutaciones sincitiales (syn). Los ejemplos de dichas mutaciones son A40V situada en gK y R858H, T813I y R796C situada en gB.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el VHS modificado anteriormente identificado para su utilización como medicamento, mejor para el tratamiento de tumores; en concreto, del tumor de ovario, tumor de mama, tumor de próstata, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de glándulas salivales, melanoma, neuroblastoma, carcinoma de cabeza y cuello, el tejido neoangiogénico, en particular los tejidos neoangiogénicos de un tumor, y/o metástasis de los mismos. De manera ventajosa, el VHS modificado anteriormente definido se utiliza para el tratamiento del tumor de ovario, tumor de mama, tumor de próstata, tumor de estómago, tumor de glándulas salivales y metástasis de los mismos. De manera ventajosa, el VHS modificado anteriormente definido se proporciona para su utilización en el tratamiento de tumor de ovario, del tumor de mama y de la metástasis de los
mismos.
En este sentido, es importante señalar que el VHS modificado anteriormente mencionado es particularmente útil para el tratamiento de la metástasis tumoral. Esto es debido al hecho de que una vez que se administra el VHS modificado, se difunde e infecta de forma autónoma la metástasis.
El VHS modificado se puede administrar a un paciente por cualesquier medios conocidos. En particular, el VHS modificado se puede administrar directamente en la zona de un tumor o, alternativamente, en todo el organismo, por ejemplo, cuando se ha detectado metástasis o el tumor no es accesible directamente.
Los preparados farmacéuticos que contienen el VHS modificado están sustancialmente desprovistos de impurezas que pueden causar daños al paciente, en particular, a los seres humanos o a otros mamíferos. Los preparados farmacéuticos, de manera ventajosa, comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
El VHS modificado puede formularse para cada tipo conocido de administración: en particular, para administración oral, parenteral o rectal o en formas diseñadas para la inhalación o insuflado (tanto por la boca como por la nariz). Las formulaciones para uso parenteral resultan ventajosas.
Para la administración oral, los preparados farmacéuticos pueden estar, por ejemplo, en forma de comprimidos o cápsulas preparadas por procedimientos conocidos con excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico como agentes aglutinantes (por ejemplo almidón de maíz pregelatinizado, polividona o metilcelulosa); cargas (por ejemplo lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); aditivos (por ejemplo estearato de magnesio, talco, sílice); disgregantes (por ejemplo almidón de patata); y/o agentes lubricantes (por ejemplo, laurilsulfato sódico). Los comprimidos se pueden recubrir por métodos conocidos. Los preparados líquidos para administración oral pueden tener forma, por ejemplo, de soluciones o suspensiones de tipo jarabe, o pueden estar en la forma de un producto seco que se puede disolver en agua o en otro líquido antes de su uso. Estos preparados se pueden preparar de maneras conocidas con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, sorbitol, derivados de celulosa, grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); líquidos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y/o conservantes (por ejemplo hidroxibenzoatos de metilo o propilo, sórbico ácido o ácido ascórbico). Los preparados también pueden contener, en casos apropiados, sales tamponantes, colorantes, agentes aromatizantes y/o edulcorantes.
Los preparados para administración oral pueden formularse de una manera conocida, para administración parenteral por inyección o administración continua. Las fórmulas inyectables pueden ser en forma de dosis individuales, por ejemplo en ampollas o recipientes multidosis que contienen conservantes. La preparación puede estar en forma de suspensión, en líquidos acuosos u oleosos, y puede contener elementos de formulación tales como agentes dispersantes y estabilizantes. Alternativamente, el compuesto activo puede estar en forma de polvo para disolverse inmediatamente antes de su uso en un líquido adecuado, por ejemplo agua esterilizada.
El VHS modificado se puede formular para administración rectal en forma de supositorios o enteroclisis, por ejemplo, que contiene excipientes para los supositorios de un tipo conocido, tal como manteca de cacao u otras grasas.
El VHS modificado también se puede formular, de una manera conocida, como preparados de liberación prolongada. Estos preparados de liberación prolongada se pueden administrar mediante un implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) o mediante una inyección intramuscular. Así, por ejemplo, el VHS modificado se puede formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, una emulsión o un aceite) o con resinas de intercambio iónico, o derivados relativamente poco solubles, tales como sales relativamente poco solubles.
Para la administración intranasal, el VHS modificado se pueden formular para la administración mediante un dispositivo (conocido), por ejemplo, en forma de polvo con los vehículos adecuados.
Las dosis del VHS modificado pueden definirse como el número de unidades formadoras de placa (ufp). Los ejemplos de dosis incluyen 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 ufp.
El paciente que se debe tratar puede ser cualquier mamífero, por ejemplo un ser humano. Otros ejemplos de animales que se pueden tratar son: los animales de granja tales como ganado vacuno, cerdos, cabras, ovejas, caballos; animales domésticos tales como gatos y perros; conejo, ratón, rata.
En algunos casos es posible administrar el VHS modificado junto con otros tratamientos de quimio-, inmuno-, radioterapia y/o otros tipos de tratamientos.
En particular, el VHS modificado se puede utilizar combinado con inhibidores de angiogenia tales como, por ejemplo: Endostatina (EntreMed), SU5416, SU6668 (Sugen, San Francisco), Talidomida, COL-3 (Collagenex, Newton PA), AG3340 (Agouron, LaJoIIa, CA), Marimastat (British Biotech), Neovastat (Aeterna, Quebec), BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb).
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la utilización de un VHS modificado para visualizar un proceso fisiológico, mejor para identificar la metástasis tumoral. Por consiguiente, en la presente memoria se proporciona la utilización del VHS modificado para la preparación de una composición destinada a visualizar un proceso fisiológico. Dicha composición puede prepararse utilizando procedimientos conocidos de modo que pueda administrarse a un paciente.
Mejor, la visualización puede dirigirse a: tumor de ovario, tumor de mama, tumor de próstata, tumor de colon, tumor de estómago, tumor de la glándula salival, melanoma, carcinoma de cabeza y cuello, tejido neoangiógeno, en particular los tejidos neoangiógenos de un tumor, y neuroblastoma y/o metástasis de los mismos; mejor, tumor de ovario, tumor de mama, tumor de próstata, tumor de estómago, tumor de la glándula salival y metástasis de los mismos; en particular, el tumor de ovario, tumor de mama y metástasis de los mismos.
La visualización de las condiciones fisiológicas puede obtenerse mediante el diagnóstico por la imagen de la expresión del gen de la timidina-quinasa (TK) utilizando técnicas de detección muy sensibles tales como PET o SPECT (Sharma et al., Molecular imaging of gene expression and protein function in vivo with PET and SPECT, J. Magn. Reson. Imaging., 16 (4) : 336-51, 2002) (Vries et al., Scintgraphic Imaging of HSV Gene Therapy, Curr. Pharm. Des., 8 (16) : 1435-50 , 2002) (Vries et al. , Positron Emission Tomography: measurement of transgene expression, Methods, 27 (3.): 234, 2002).
Alternativamente, es posible fusionar una proteína no esencial (por ejemplo Us11) y una proteína indicadora capaz de ser identificada in vivo (por ejemplo, proteínas rojas o verdes fluorescentes o variaciones de las mismas, luciferasa o -galactosidasa).
Cuando se utiliza la luciferasa, su presencia puede hacerse resaltar mediante un sustrato luminiscente o cromático adecuado. La proteína indicadora puede fusionarse a una timidina-cinasa (Soling et al., Intercellular localization of Herpes simplex virus of the type 1 thymidine kinase fused to different fluorescent proteins depends on choice of fluorescent tag, FEBS Lett., 527 (1-3): 153, 2002).
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento de preparación de un VHS modificado como se ha definido anteriormente. El procedimiento comprende una fase de inserción, durante la cual se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica el ligando peptídico en el ADN del VHS por lo que el VHS modificado así obtenido expresa en su envoltura el ligando peptídico.
Mejor, el ADN del VHS está tan manipulado que la secuencia de codificación gD del VHS modificado tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de homología, mejor de identidad, con respecto a la SEC. ID. nº: 36 o SEC. ID. nº: 37, en particular, la SEC. ID. nº: 37.
Antes de la inserción de ligandos adecuados, mejor anticuerpos monocatenarios, pueden identificarse utilizando técnicas conocidas para probar su capacidad de fijación a por lo menos un receptor expresado por las células enfermas.
Las características adicionales de la presente invención pondrán más claramente de manifiesto la siguiente descripción de algunos ejemplos ilustrativos.
Ejemplo 1 - Construcción de VHS que expresan gD modificadas genéticamente que llevan supresiones sustituidas con un anticuerpo monocatenario dirigido a HER2/Neu y que llevan EGFP como gen informador.
A) Eliminación de gD procedente de VHS-BAC.
Para generar un virus gDminus, el procedimiento de "clonación de ET" se realizó en bacterias (Muyrers, J. P., Y. Zhang, G. Testa y A. F. Stewart. 1999. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27:1555-7). Un casete con resistencia a kanamicina flanqueada por dos sitios FRT se amplió por RCP a partir del plásmido pFRT-2, con cebadores que contenían en sus extremos 5' 60 nt de las secuencias que flanquean gD ORF: gDup_Kan_f (TGT TCG GTC ATA AGC TTC AGC GCG AAC GAC CAA CTA CCC CGA TCA TCA GTT ATC CTT AAG CCA GTG AAT TCG AGC TCG GTA C) (SEC ID Nº: 11) y gDdown_Kan_r (ACT TAT CGA CTG TCC ACC TTT CCC CCC TTC CAG ACT CGC TTT ATA TGG AGT TAA GGT CCC GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTC C) (SEC ID nº : 12). pFRT-2 se construido por inserción de la resistencia a la kanamicina procedente del pCP15 en los sitios NsiI de pCP16 reemplazando el gen de resistencia a tetraciclina Cherepanov, P. P., y W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14. The PCR product was electroporated into DH10B E. coli (Stratagene) harboring the YEbaclO2 HSV-BAC Tanaka, M., H. Kagawa, Y. Yamanashi, T. Sata e Y. Kawaguchi. 2003. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77:1382-91, and transiently expressing lambda phage Red-and Red-y recombinases from pKD46 plasmid Datsenko, K. A., y B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12
using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-5. Los clones recombinantes se seleccionaron en placas que contienen dos antibióticos, 25 !g/ml de kanamicina (marcador contenido en el producto de RCP) y 20 !g/ml de cloranfenicol (marcador contenido en secuencias de VHS-BAC), para asegurar la sustitución de la secuencia de codificación de gD por la casete de resistencia a kanamicina. Para extraer la casete de kanamicina, los clones positivos se sometieron a electroporación con pCP20 (Cherepanov, P. P., y W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14), un plásmido que expresa la FLP recombinasa de levadura, que se dirige a secuencias FRT. Por último, se analizaron las colonias para determinar la pérdida del marcador de kanamicina y la resistencia a
cloranfenicol. El genoma de VHS-BAC de gDminus resultante denominado 102gD -FRT, se comprobó por transferencia Southern, RCP, secuenciación, y para la capacidad para formar placas sólo en R6, y no en otras estirpes celulares.
B) Ingeniería de EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) o genes indicadores LacZ en 102gD-FRT VHS-BAC.
La segunda etapa en la ingeniería de recombinantes de VHS-BAC fue la inserción del gen indicador EGFP o LacZ, generando de este modo gDminus-EGFP-VHS-BAC o gDminus-LacZ-VHS-BAC. Se han seleccionado como punto de inserción del gen indicador las propias secuencias de pBeloBAC, de modo que, el gen marcador se puede eliminar junto con las secuencias de BAC por la Cre recombinasa, si es necesario (Fig. 1 A). La secuencia de codificación de EGFP seguida de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) se amplió por RCP a partir de pCMS-EGFP (Clontech) con los cebadores EGFP_BamHI_f (CAA CCC GGG ATC CAC TCG CGG CCA CCA TGG TGA GC) (SEC. ID. nº: 13) y EGFP + pA_BamHI_r (CCC CTT GGG ATC CTT CTG CAC CCC CCC ACC CCC CAG AAT AG) (SEC. ID. nº: 14), y se clonó corriente abajo del activador a27 del VHS. La casete a27-EGFP se insertó entre dos secuencias de 700 pb, ampliadas RCP a partir del plásmido pBeloBac11 (nº: de registro en GenBank: U51113). Las dos secuencias de 700 pb anteriormente mencionadas se designaron pBeloBac11-up [cebadores Sal_pBelo_1209_f: TTG CCA GTC GAC ATT CCG GAT GAG CAT TCA TCA GGC GGG CA (SEC. ID. nº: 15) y pBelo_1897_Xho_r: GCA AAA ACT CGA GTG TAG ACT TCC GTT GAA CTG ATG GAC (SEC. ID. nº: 16)] y pBeloBac11-down [cebadores Mun_pBelo_1898_f: GGA AGT CAA TTG GAA GGT TTT TGC GCT GGA TGT GGC TGC CC (SEC. ID. nº: 17) y pBelo_2586_Eco_r: CAC ACT GAA TTC GCA ATT TGT CAC AAC ACC TTC TCT AGA CA (SEC. ID. nº: 18)]. En el montaje resultante, la casete a27-EGFP resultó insertada entre los nt 1897 y 1898 (coordenadas originales) de pBeloBac11. La casete a27-EGFP más las secuencias adyacentes pBeloBac11 se subclonaron en el vector lanzadera pST76KSR Adler, H., M. Messerle, M. Wagner, y U.
H. Koszinowski. 2000. Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus 68 genome as an infectious bacterial artificial chromosome. J. Virol. 74:6964-74 para la recombinación homóloga en bacterias. Para la inserción de LacZ, se siguió la misma estrategia, secuencias de clonación pBeloBac11-arriba y -abajo en un plásmido que ya contiene la casete a27-LacZ. Las regiones de inserción y adyacentes relevantes se secuenciaron para precisión en todos los plásmidos.
C) Construcción de vectores lanzadera para la inserción de gD híbrida en los gDminus BAC.
El vector lanzadera gD denominado PS31 (figura 10) lleva el scHER2L (scFv anti HER2 más un enlazador de serina glicina de 9-aa) insertado entre los restos 24 y 25 de gD, más la sustitución V34S (Fig. 1 B, b). Se construyó de la siguiente manera. En primer lugar, la sustitución V34S se introdujo por mutagenia dirigida en pLM13 (Fig. 8), montaje que lleva scHER2L insertado entre los restos 24 y 25 de gD, generando pLM31 (Fig. 9). La mutagenia se realizó mediante el kit Stratagene QuickChange II (Stratagene) con los cebadores gD_34S_StuI 5'-TCC TCC GGG GAG CCG GCG CGT GTA CCA CAT CCA GGC AGG CCT ACC GG-3 ´ (SEC. ID. nº: 19) y su inversa. Los cebadores contenían las enzimas de restricción imperceptibles indicadas, para facilitar la detección de clones mutantes. A continuación, la casete que contiene gD + scHER2 mutagenizada más gD genómica corriente arriba y corriente abajo de las secuencias adyacentes (alrededor de 500 pb cada una) se transfirió al vector lanzadera pST76KSR para permitir la recombinación homóloga en E. coli.
Para construir PS39 (figura 11), las sustituciones D215G, R222N, F223I se añadieron a gD clonada en PS31 por medio del cebador gD_215G-222N-223I_PvuI 5'-AGG GGG TGA CGG TGG GCT CGA TCG GGA TGC TGC CCA ACA TCA TCC CCG AGA ACC-3 '(SEC. ID. nº: 20) y su inversa (figura 1 B, c).
El vector lanzadera pS113 (figura 13) contiene gD, en el que los restos de aa 6-38 se suprimieron y se sustituyeron con scHER2L [scFv contra HER2 seguido de un enlazador serina-glicina de 11 aa: SSGGGSGSGGS (SEC. ID. nº: 5), codificado por la secuencia TCGAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGGATCC (SEC. ID. nº: 21)] (figura 1 B, d). Para generar este montaje, las enzimas de restricción EcoRI y BamHI se introdujeron sucesivamente en el ORF de gD en pLM5 (figura 7). La enzima de restricción EcoRI se insertó en las posiciones 6-8 de aminoácidos de la secuencia proteica y la enzima de restricción BamHI se insertó en las posiciones 37-39 de los aminoácidos de la secuencia proteica, mediante los cebadores mutágenos gD_6/8_EcoRI_f 5'-CAA ATA TGC CTT GGC GGA GAA TTC TCT CAA GAT GGC CG-3 ' (SEC. ID. nº: 22) y gD_37/38_BamHI_f 5'-CGG GGG TCC GGC GCG GAT CCC ACA TCC AGG CGG G-3' (SEC. ID. nº: 23) , respectivamente. La inserción de la enzima EcoRI introduce las sustituciones D6E y A7N. El scHER2L se amplió a partir del pS2019a Sidhu, S. S., B. Li, Y. Chen, F. A. Fellouse, C.
Eigenbrot y G. Fuh. 2004. Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions. J. Mol. Biol. 338:299-310 con los cebadores scFv_x6_Eco_f 5'-GCA AAG GAA TTC CGA TAT CCA GAT GAC CCA GTC CCC G-3' (SEC. ID. nº: 24) y scFv_SG_x37_BamH 5'-CGG AGG ATC CAC CGG AAC CAG AGC CAC CGC CAC TCG AGG-3' (SEC. ID. nº: 25). Este montaje se denominó pLM113 (figura 12). El plásmido lanzadera pS113 final se construyó subclonando la gD genéticamente modificada junto con las secuencias genómicas adyacentes (fragmento NruI-Pmel) en pST76KSR (figura 13).
El vector lanzadera pS249 contiene gD, en el que los restos de aa 61 a 218 se suprimieron y se sustituyeron con LscHER2L [scFv contra HER2 flanqueada por enlazadores serina-glicina, 8 aa corriente arriba: HSSGGGSG (SEC. ID. nº: 7), codificada por la secuencia de CATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGA (SEC. ID. nº: 26); 12 aa corriente abajo: SSGGGSGSGGSG (SEC. ID. nº: 8), codificada por la secuencia TCGAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGGATCCGGT (SEC. ID. nº: 27)] en lugar de los restos de aa 61 a 218 de gD (figura 1 B, e). La mutagenia y la clonación se realizaron en pLM5 (figura 7), plásmido que contiene el ORF de gD clonado en pcDNA3.1 (-) (Invitrogen), flanqueado por dos secuencias genómicas flanqueantes corriente arriba y corriente abajo de 500 pb Menotti, L., A. Cerretani y G. Campadelli-Fiume. 2006. Un virus recombinante de herpes simple que presenta un anticuerpo monocatenario a HER2/neu introduce células a través del receptor de tumor de mama, independientemente de los receptores de gD. J. Virol. 80:5531-9. En primer lugar, se insertaron dos secuencias NdeI en la secuencia de codificación que sustituye los aminoácidos 61-62 y 218-219 de gD madura, respectivamente, utilizando los cebadores mutagénicos gD_61/62_NdeI_f (5'-acg gtt tac tac gcc CAT Atg gag cgc gcc tgc c-3' ) (SEC. ID. nº: 28) y gD_218/219_NdeI_f (5'-GAC GGT GGA CAG CAT CCA TAT GCT GCC CCG CTT C-3' ) (SEC. ID. nº: 29). A continuación, se insertó un enlazador serina-glicina de 9 aa hibridando y ligando en la enzima NdeI los dos oligos fosforilados P-SG9Bam7/Nde_f (5'-TAG TAG TGG CGG TGG CTC TGG ATC CGG-3 ') (SEC. ID. nº: 30) y P-SG9Bam7/Nde r (5'-tAC CGG AtC CAG AGC CAC CGC CAC Tac-3') (SEC. ID. nº: 31), que contiene una enzima BamHI imperceptible. El scHER2 se amplió a partir de pS2019a Sidhu, S. S., B. Li, Y. Chen, F.
A. Fellouse, C. Eigenbrot y G. Fuh. 2004. Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions. J. Mol. Biol. 338:299-310 con los cebadores scFv_Bam_f (5'-GGC TTA TGG ATC CGA TAT CCA GAT GAC CCA GTC CCC-3') (SEC. ID. nº: 32) y scFv_SG_x37_BamH_r (5'-CGG Agg atc cAC CGG AAC CAG AGC CAC CGC CAC TCG AGG-3') (SEC. ID. nº: 33) y se insertó en la enzima BamHI del enlazador serina-glicina. La longitud total de inserción es de 801 pb, que codifica 267 restos de aa. El montaje se denominó pLM249. Por último, la casete que contiene gD161-218 + LscHER2L genéticamente modificado más las secuencias adyacentes a gD genómica corriente arriba y corriente abajo (el fragmento NruI-Pmel de pLM249) se subclonó en SmaI del vector lanzadera pST76KSR generando pS249 (figura 14) para la recombinación homóloga en E. coli. Las regiones de inserción y adyacentes relevantes se secuenciaron para precisión en todos los plásmidos.
D) Generación de genomas recombinantes por sustitución en dos etapas en bacterias. El procedimiento aplicado para generar genomas recombinantes en E. coli fue esencialmente como describió, con ligeras modificaciones O'Connor, M., M. Peifer y W. Bender. 1989. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science 244:1307-12; Messerle, M., I. Crnkovic, W. Hammerschmidt, H. Ziegler y Ü. H. Koszinowski. 1997. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:14759-63; Borst, E. M., G. Hahn, U. H. Koszinowski y M. Messerle. 1999. Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants. J. Virol. 73:8320-9. En resumen, DH10B electrocompetentes de E. coli (Stratagene) que alojan los genomas gDminus VHS-BAC pertinentes se sometieron a electroporación con el vector lanzadera en cubetas de electroporación de 0,2 cm (Bio-Rad) a 200 O, 25 !F, 2,5 kV, se colocaron en placas en LB agar-agar que contenía 25 !g/ml de Kana (marcador del vector lanzadera) y 20 !g/ml de Cam (marcador de BAC) Tanaka, M., H. Kagawa,
Y. Yamanashi, T. Sata e Y. Kawaguchi. 2003. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77:1382-91), y se incubaron a 30ºC o/n para permitir la expresión de RecA del vector lanzadera. Los clones se volvieron a colocar en placas en LB + Kana + Cam a 43ºC para permitir la identificación de los que alojan los cointegrados (visibles como colonias grandes, en comparación con el fenotipo "pequeña colonia" sensible a la temperatura determinado por vectores lanzadera no integrados). Posteriormente, se permitió a los cointegrados resolver por siembra los clones en LB + Cam a 30ºC, y los clones que contienen el VHS-BAC resuelto se seleccionaron en placas de LB + Cam enriquecido con 10% de sacarosa. Por último, se comprobó la pérdida de la resistencia Kana en los clones, y la presencia del inserto deseado por RCP de colonias.
La recombinación entre el 102gD-FRT VHS-BAC y los vectores lanzadera adecuados generó ADN con gDminusEGFP-VHS-BAC o gDminus-LacZ-VHS-BAC, que contiene la casete activador a27-EGFP (o activador a27-LacZ) insertada en secuencias BAC (Fig. 1 A). Los virus se reconstruyeron mediante la transfección del ADN de BAC en las células R6 que complementan gD.
El gDminus-VHS-BAC se utilizó como receptor para la generación de recombinantes que contienen la gD genéticamente modificada. Los genomas recombinantes se verificaron por RCP y secuenciación. Los virus se reconstruyeron mediante transfección de los BAC-ADN en células R6 Zhou, G., V. Galván, G. Campadelli-Fiume y B. Roizman. 2000. La glucoproteína D o J presentada en apoptosis de bloques trans en células SK-N-SH producida por un virus del herpes simple 1 mutante que carece de genes intactos que expresan ambas glucoproteínas. J. Virol. 74:11782-91, seguido de un solo paso en células BHK (riñón de cría de hámster) y crecimiento posterior en J-HER2
Menotti, L., A. Cerretani y G. Campadelli-Fiume. 2006. A virus de herpes simple recombinante que presenta un anticuerpo monocatenario a HER2/neu introduce células a través del receptor de tumor de mama, independientemente de los receptores de gD. J. Virol. 80:5531-9 o células SKOV3 (ATCC nº HTB-77). Las reservas de virus se cultivaron en células J-HER2 o SKOV3 y atenuadas en serie durante más de 10 pases. El valor del virus se determinó en células SKOV3.
Ejemplo 2 - Ensayo de infección con el R-LM31 recombinante que lleva la sustitución V34S en gD.
La 1ª generación de recombinantes R-LM11 y R-LM11L llevaban scHER2 insertado entre los restos 24 y 25 de gD Menotti, L., A. Cerretani y G. Campadelli-Fiume. 2006. Un virus de herpes simple recombinante que presenta un anticuerpo monocatenario a HER2/neu se introduce en las células a través del receptor de tumor de mama, independientemente de los receptores de gD. J. Virol. 80:5531-9. La inserción alteró el terminal en N de modo que la entrada a través de HVEM se ve obstaculizada. La entrada por nectina1 se mantuvo Menotti, L., A. Cerretani y G. Campadelli-Fiume. 2006. Un virus de herpes simple recombinante que presenta un anticuerpo monocatenario a HER2/neu se introduce en las células a través del receptor de tumor de mama, independientemente de los receptores de gD. J. Virol. 80:5531-9. El primer intento para generar un nectina1 inespecífica recombinante consistió en la inserción de la mutación de V34S en gD-scHER2 (Fig. 1 b). Cuando se introdujo en el gD redirigida a IL13, la sustitución V34S disminuyó fuertemente entrada por la nectina1 Zhou, G., y B. Roizman. 2006. Construction and properties of a herpes simplex virus 1 designed to enter cells solely via the IL-13alpha2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103:5508-13. El ADN LM31-BAC recombinante se generó por recombinación homóloga en E. coli. El genoma receptor fue gDminus-LacZ-VHS-BAC. El virus recombinante R-LM31 se obtuvo por transfección del ADN LM31-BAC en las células R6 que complementan gD. El tropismo R-LM31 se ensayó en células J que expresan nectina1 humana o murina, o HER2 humano, y se controló como actividad de -galactosidasa. Como se muestra en la Fig. 2 A-D, el R-LM31 recombinante infectó células J-nectina1 (Cocchi, F., L. Menotti, P. Mirandola, M. López, y G. Campadelli-Fiume. 1998. El ectodominio de un nuevo miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas relacionado con el receptor del poliovirus tiene los atributos de un receptor auténtico para los virus de herpes simple 1 y 2 en células humanas J. Virol. 72:9992-10002) (a través ya sea del receptor humano o murino); por lo tanto no específico de nectina1. El resultado indica que el efecto de la sustitución V34S varía dependiendo del inserto presente en gD.
Ejemplo 3 - Movilidad electroforética de las gD naturales e híbridas expresadas en las células SKOV3.
Se infectaron células SKOV3 con R-LM5 (la secuencia peptídica de gD de R-LM5 es la SEC. ID. nº: 1, cuyo precursor se expresa por la secuencia de nucleótidos SEC. ID. nº: 35), R-LM13 (la secuencia peptídica de gD de R-LM13 es la SEC. ID. nº: 42, cuyo precursor se expresa por la secuencia de nucleótidos SEC. ID. nº: 43), R-LM31 (la secuencia del péptido de gD de R-LM31 es la SEC. ID. nº: 38, cuyo precursor se expresa por la secuencia de nucleótidos SEC. ID. nº: 39), R-LM39 (la secuencia del péptido de gD de R-LM39 es la SEC. ID. nº: 40, cuyo precursor se expresa por la secuencia de nucleótidos SEC. ID. nº: 41), R-LM113 (SEC. ID. nº: 9) y R-LM249 a una
m.o.i de 10 ufp/célula. Tras 24 h los lisados celulares infectados se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham), y se visualizaron por inmunotransferencia Western con MAb BD80 contra la fracción del terminal C de gD del ectodominio, seguido de anti-IgG de ratón conjugada con peroxidasa y quimioluminiscencia aumentada (figura 2 E). En los recombinantes R-LM31 y R-LM39 la presencia de scHER2L da como resultado una migración más lenta, como en el virus prototipo R-LM13, en comparación con el R-LM5 que lleva gD natural. En el R-LM113 recombinante la movilidad electroforética de la gD híbrida es indistinguible de la de los R-LM13-31-39 recombinantes. En el R-LM249 recombinante, la sustitución de 158 restos de aa con LscHER2L produce una migración intermedia entre gD natural y gD de R-LM113 (donde 6-38 restos de aminoácidos de gD se sustituyen por scHER2L). R-LM113 produce menos gD que R-LM5 o R-LM249, ya que la banda correspondiente necesitaba ser cargado con 10 veces como mucho de lisado en comparación con el R-LM5 o R-LM249 para obtener la señal observada en la figura 2. Esta producción menor de gD fue descrita anteriormente para los virus que llevan supresión en terminal en N de gD Zhou, G., y B. Roizman. 2006. Construction and properties of a herpes simplex virus 1 designed to enter cells solely via the IL- 13alpha2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:5508-13.
Ejemplo 4 - Infección de una variedad de estirpes celulares con R-LM113 y R-LM249.
Unas monocapas de una variedad de estirpes celulares de origen roedor, simio o humano se infectaron a m.o.i. creciente, y se midió la expresión del gen indicador EGFP (Clontech) 24 h después por medio de un fluorómetro. Se tomaron fotografías digitales con una cámara Kodak conectada a un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan. LM113 y R-LM249 infectaron células J-HER2, pero no las células J que expresan nectina1 humana o nectina1 murina como único receptor (Fig. 3). La inespecificidad de nectina1 murina se confirmó por el fracaso para infectar células L y NIH-3T3. Las células humanas fueron sensibles a R-LM113 y R-LM249, siempre que expresen a HER2 a un alto nivel (SKOV3). Células negativas a HER2, por ejemplo, HEp-2 ATCC nº CCL-23, 1-143 tk- (Post, L.
E. y Roizman, B. (1981). A generalized technique for deletion of specific genes in large genomes: alpha gene 22 of herpes simplex virus 1 is not essential for growth. Cell 25(1), 227- 32.) y células RH4 (rabdomiosarcoma) Ricci, C., L. Landuzzi, I. Rossi, C. De Giovanni, G. Nicoletti, A. Astolfi, S. Pupa, S. Menard, K. Scotlandi, P. Nanni, y P. L. Lollini. 2000. Expression of HER/erbB family of receptor tyrosine kinases and induction of differentiation by glial growth factor 2 in human rhabdomyosarcoma cells. Int. J. Cancer 87:29-36, se infectaron a un nivel insignificante.
Curiosamente, R-LM113 y R-LM249 eran específicos para HER2 humano, ya que no consiguieron infectar la línea celular de ratón TT12.E2 que expresa el ortólogo de rata de HER2 (neu-NT) De Giovanni, C., G. Nicoletti, L. Landuzzi, A. Astolfi, S. Croci, A. Comes, S. Ferrini, R. Meazza, M. Iezzi, E. Di Carlo, P. Musiani, F. Cavallo, P. Nanni y P. L. Lollini. 2004. Immunoprevention of HER-2/neu transgenic mammary carcinoma through an interleukin 12 engineered allogeneic cell vaccine. Cancer Res. 64:4001-9.
Ejemplo 5 - Ensayo de replicación de virus.
Las células J, J-hNectin1, J-HVEM, J-HER2, SKOV3, I-143 tk-y HEp-2 cultivadas en placas de 12 pocillos se infectaron con los virus indicados en la figura 4 a una m.o.i de 1 ufp/célula durante 90 min a 37ºC. Después de la adsorción del virus, se retiró el inóculo y el virus no penetrado se inactivó por medio de un lavado con ácido (ácido cítrico 40 mM, KCl 10 mM, NaCl 135 mM [pH 3]) Brunetti, C. R., R. L. Burke, B. Hoflack, T. Ludwig, K. S. Dingwell, y
D.C. Johnson. 1995. Role of mannose-6- phosphate receptors in herpes simplex virus entry into cells and cell-to-cell transmission. J. Virol. 69:3517-28. Los cultivos replicados se congelaron a los tiempos indicados (3, 24, 48 h) después de la infección. Se valoró la descendencia vírica (intracelular más extracelular) en células SKOV3.
El crecimiento de R-LM39, R-LM113 y R-LM249 se comparó con R-LM5 del virus recombinante (que codifica a gD natural) y R-LM13 (que codifica al híbrido gD-scHER2L sin más mutaciones o supresiones). (i) R-LM39 fue incapaz de crecer en las células J-HVEM, pero se replicó en las células J-HER2 y en J-nectina1, lo que implica que se podría utilizar tanto a HER2 como a nectina1 como receptores (Fig. 4 B, C, D). Por consiguiente, se replica en las estirpes celulares humanas SKOV3 (que expresan tanto nectina1 como HER2), células I-143 tk-y HEp-2 (que expresan nectina1) (figura 4 E, F, G). (ii) R-LM113 creció de manera eficiente en las células J-HER2, mejor que R-LM249 y R-LM5 (figura 4D). En las células SKOV3 R-LM113 y R-LM249 se replicaron para los valores de sólo 1 a 1,5 órdenes de magnitud inferiores a los del virus R-LM5 de referencia (figura 4E). (iii) R-LMl13 y R-LM249 eran inespecíficos tanto para nectina1 como HVEM, según se evaluó por su incapacidad para crecer en las células J-nectina1 y J-HVEM, así como en 1-143 tk-humana y HEp-2 a valores superiores a 102-103-104 ufp/ml (Fig. 4 B, C, F, G).
Ejemplo 6 - Inhibición de la infección de virus por anticuerpos.
Las células SKOV3 cultivadas en placas de 96 pocillos se incubaron durante 2 h en hielo con concentraciones crecientes de anticuerpos (Rl.302 contra nectina1, Herceptina contra HER2, o inmunoglobulinas de ratón) diluidos en DMEM sin suero, y a continuación con el inóculo vírico en el m.o.i de 2 ufp/célula (valorados en células SKOV3) durante más de 90 min en hielo. Después de la adsorción del virus, el virus no unido se retiró y las células se lavaron dos veces con medio RPMI+Glutamax enfriado con hielo enriquecido con 2,5% de FBS. Las células se cubrieron con medio que contiene la misma concentración de anticuerpos o de las IgG, se cambiaron rápidamente a 37ºC, y se incubaron durante 16 h. La infección se cuantificó como intensidad de fluorescencia EGFP mediante un lector de placas Victor (Perkin Elmer). El valor de 100% representa los datos obtenidos con las células infectadas con el virus, en ausencia de anticuerpos.
El uso del receptor se confirmó en experimentos que bloquean virus con Herceptina, Mab R1.302, o mezcla de los dos anticuerpos. Los resultados en la figura 5 demuestran que el R-LM39 no fue bloqueado por Herceptina o R1.302 administrados solos, sino sólo por los dos anticuerpos en combinación (figura 5 A). Los resultados implican que R-LM39 puede utilizar alternativamente nectina1 o HER2 como receptores, documentando más la falta de inespecificidad de nectina1. Por el contrario R-LM113 y R-LM249 fueron bloqueados por Herceptina (figuras 5 B y C). La combinación de Herceptina más MAb R1.302 ejerció la misma inhibición que Herceptina sola; MAb R1.302 no tuvo ningún efecto. La infección por R-LM113 o R-LM249 fue inhibida por Herceptina sola, mientras que MAb R1.302 solo no tuvo ningún efecto. Se concluye que R-LM113 y R-LM249 pueden penetrar en las células sólo a través del receptor HER2, según los resultados mostrados en la figura 4.
Ejemplo 7 - Inhibición de la formación de placa de R-LM113 y R-LM249 por Herceptina.
Se cuestionó si R-LM113 y R-LM249 utilizaron HER2 utilizan no sólo para la infección por el virus, sino también para la propagación célula a célula. Se infectaron células SKOV3 con diluciones en serie de los virus indicados y se cubrieron con medio que contiene 1% agarosa Seaplaque, con o sin adición de 10 µg/ml de Herceptina (MAb contra HER2 Genentech). Se hizo el seguimiento a placas fluorescentes con un microscopio de fluorescencia Zeiss, y se tomaron fotografías de 5 placas por muestra a las 48 h después de la infección. Se midieron las áreas de las placas con la herramienta Photoshop Histogram. Como se muestra en la figura 6, la exposición a Herceptina de monocapas de SKOV3 infectadas con R-LM113-y R-LM249 redujo el tamaño de la placa (en la figura 6, -Herceptin indica en ausencia de Herceptin; +Herceptin indica en presencia de Herceptina. La Herceptina no redujo el tamaño de la placa de R-LM5 y de los demás virus inespecíficos (R-LM13 y R-LM39).
Ejemplo 8 -. Actividad citotóxica de los virus recombinantes.
Se cuestionó si R-LM113 y R-LM249 mantuvieron la actividad citotóxica del virus original VHS-1. Se sembraron células SKOV3 en placas de 12 pocillos (4 x 105 células/pocillo) y se infectaron al día siguiente con R-LM5, R-LM116
o R-LM249 a una m.o.i. de 3 ufp/célula. Después de tres días las células infectadas se trataron con tripsina, y se
determinó el número de células viables y no viables mediante el ensayo de exclusión de Eritrosina B. En resumen, las células se mezclaron 1:1 con Eritrosina B al 0,04% (Sigma) en PBS, se cargaron en un hemocitómetro y se contaron. Las células no viables absorben el colorante y aparecen de color rojo. El número de células no viables se describió como una fracción del número total de células (rojo más incoloro). Las células desprendidas de la 5 monocapa y presentes en el sobrenadante de las muestras infectadas se recogieron y se contaron en la misma manera. Los pocillos replicados de células no infectadas se incluyeron como referencia. Como se muestra la figura 16, la infección vírica casi evita que las células se dividan, ya que el número total de células es menor en comparación con las células no infectadas. Además la infección produce citotoxicidad celular, ya que el porcentaje de células no viables es mayor en los cultivos infectados con respecto a cultivos replicados no infectados. El efecto
10 de la infección de los R-LMl13 y R-LM249 recombinantes es comparable al del virus R-LM5, que lleva gD natural, lo que indica que la reorientación y la inespecificidad del virus no afectó a las propiedades citotóxicas de los recombinantes.
Listado de secuencias
<110> ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
<120> Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo
<130> E6277/08-WO 20 <160> 43
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 369
<212> PRT 25 <213> Virus del herpes simple
<400> 1
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> anticuerpo monocatenario
<400> 2
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial 15 <220>
<223> anticuerpo monocatenario
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> anticuerpo monocatenario
<400> 4
10 <210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 15 <223> anticuerpo monocatenario
<400> 5
<210> 6
<211> 2 20 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> anticuerpo monocatenario
<400> 6
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial 30 <220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 7
35 <210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 8
<210> 9
<211> 596
<212> PRT 10 <213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 9
<210> 10
<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 10
<210> 11 5 <211> 82
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético 10 <400> 11
<210> 12
<211> 82
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 12
15
<210> 13 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 13
20
caacccggga tccaccggtc gccaccatgg tgagc 35
25
<210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 14
30
ccccttggga tcctgcccca ccccaccccc cagaatag 38
35
<210> 15 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 15
40 45
ttgccagtcg acattccgga tgagcattca tcaggcgggc a <210> 16 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 16 41
50 55
gcaaaaactc gagtgtagac ttccgttgaa ctgatggac <210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 17 39
60
ggaagtcaat tggaaggttt ttgcgctgga tgtggctgcc c <210> 18 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial 41
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 18
5 cacactgaat tcgcaatttg tcacaacacc ttctctagaa c 41
<210> 19
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 19
15 tcctccgggg agccggcgcg tgtaccacat ccaggcaggc ctaccgg 47
<210> 20
<211> 54
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 20
25 agggggtgac ggtgggctcg atcgggatgc tgcccaacat catccccgag aacc 54
<210> 21
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Anticuerpo monocatenario
<400> 21
35 tcgagtggcg gtggctctgg ttccggtgga tcc 33
<210> 22
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 22
45 caaatatgcc ttggcggaga attctctcaa gatggccg 38
<210> 23
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 23
55 cgggggtccg gcgcggatcc cacatccagg cggg 34
<210> 24
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador sintético
<400> 24
65 gcaaaggaat tccgatatcc agatgaccca gtccccg 37
5
<210> 25 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 25
cggaggatcc accggaacca gagccaccgc cactcgagg
39
15
<210> 26 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Anticuerpo monocatenario <400> 26
catagtagtg gcggtggctc tgga
24
25
<210> 27 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Anticuerpo monocatenario <400> 27
tcgagtggcg gtggctctgg ttccggtgga tccggt
36
35
<210> 28 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 28
acggtttact acgcccatat ggagcgcgcc tgcc
34
45
<210> 29 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 29
gacggtggac agcatccata tgctgccccg cttc
34
55
<210> 30 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligo <400> 30
tagtagtggc ggtggctctg gatccgg
27
65
<210> 31 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligo
<400> 31
taccggatcc agagccaccg ccactac
27
5 10
<210> 32 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 32
ggcttatgga tccgatatcc agatgaccca gtcccc
36
15 20
<210> 33 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador sintético <400> 33
cggaggatcc accggaacca gagccaccgc cactcgagg
39
25
<210> 34 <211> 394 <212> PRT <213> virus del herpes simple <400> 34
<210> 35
<211> 1185
<212> ADN
<213> virus del herpes simple
<400> 35
<210> 36
<211> 1512
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 36 <210> 37
<211> 1866
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 37 <210> 38
<211> 625
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 38
<210> 39
<211> 1953
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 39
<210> 40
<211> 625 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 40
<210> 41
<211> 1953
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 41 <210> 42
<211> 625
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 42
<210> 43
<211> 1953
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> gD de VHS y anticuerpo monocatenario
<400> 43

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Virus del herpes simple (VHS) modificado que comprende una envoltura glucoproteica en la que un anticuerpo monocatenario heterólogo sustituye una parte eliminada del dominio gD de dicha envoltura glucoproteica para formar una proteína de fusión, en el que
    a) dicha parte eliminada comienza en una posición dentro de los aminoácidos 1 a 8 y acaba en una posición dentro de los aminoácidos 38 a 55 de gD; o comienza en una posición dentro de los aminoácidos 40 a 61 y acaba en una posición dentro de los aminoácidos 210 a 218 de gD;
    b) dicho anticuerpo monocatenario comprende un dominio ligero variable (VL) y un dominio pesado variable (VH) separados por un enlazador (L1), en el que el enlazador permite a VL y VH asumir la conformación apropiada de manera que el anticuerpo monocatenario pueda unir en condiciones específicas un receptor que se expresa sobre las células tumorales pero no sustancialmente sobre las células no tumorales;
    c) la envoltura se modifica de manera que la capacidad del VHS modificado de interactuar con el receptor nectina1/HveC se reduce.
  2. 2.
    VHS modificado según la reivindicación 1, en el que la envoltura está modificada de manera que la capacidad del VHS modificado para interactuar con el receptor nectina1/HveC y HVEM/HveA se reduce o se elimina sustancialmente.
  3. 3.
    VHS modificado según la reivindicación 1 o 2, en el que la parte eliminada de gD empieza en la posición 6 y acaba en la posición 38, o empieza en la posición 61 y acaba en la posición 218.
  4. 4.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho gD tiene por lo menos 80% de identidad con SEC. ID. nº: 1.
  5. 5.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho receptor expresado sobre las células tumorales tiene por lo menos 90% de identidad con un receptor seleccionado de entre: HER2/ErbB2, EGFR1, EGFR3, PMSA, CEA, GD2, VEGFR1 y VEGFR2.
  6. 6.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo monocatenario comprende además un segundo enlazador (L2) y/o un tercer enlazador (L3), en el que:
    VH está situado entre y conecta L1 y L2, y
    HL está situado entre y conecta L1 y L3.
  7. 7. VHS modificado según una de las reivindicaciones 6 a 8, en el que:
    VL tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC. ID. nº: 2
    VH tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC. ID. nº: 3
    L1 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 4
    L2 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 5
    L3 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 6 o con la SEC. ID. nº: 7
  8. 8.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha proteína de fusión resultante de la sustitución de una parte de gD con dicho ligando peptídico tiene por lo menos 70% de identidad con la SEC. ID. nº: 9 o la SEC. ID. nº: 10.
  9. 9.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores que comprende además un marcador, y en particular un marcador adecuado para visualizar un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor de estómago, un tumor de glándulas salivales, un melanoma, un carcinoma de cabeza y cuello, un tejido neoangiogénico de un tumor, neuroblastoma y/o metástasis de los mismos.
  10. 10.
    Preparación farmacéutica que comprende un VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  11. 11.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores para su utilización en el tratamiento de una enfermedad tumoral, y en particular de un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor de estómago, un tumor de glándulas salivales, un melanoma, un carcinoma de cabeza y cuello o un
    neuroblastoma.
  12. 12.
    VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores para su utilización en el tratamiento de una
    metástasis de una enfermedad tumoral, y en particular de una metástasis de un tumor de ovario, un tumor de mama, 5 un tumor de próstata, un tumor de colon, un melanoma o de un neuroblastoma.
  13. 13. Procedimiento para preparar un VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores, que comprende:
    10 eliminar una parte del ADN que codifica el gD del VSH, sustituir la parte eliminada con el ADN que codifica el anticuerpo monocatenario que determina la capacidad del VHS modificado resultante para unirse a por lo menos un receptor expresado por las células tumorales pero no sustancialmente por las células no tumorales.
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