PT1453852E

PT1453852E - Péptidos de arilguanidina selectivos como inibidores da urocinase

Info

Publication number: PT1453852E
Application number: PT02787942T
Authority: PT
Inventors: Stefan Sperl
Original assignee: Wilex Ag
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2007-02-28
Also published as: EP1453852B1; AU2002352245B2; SI1453852T1; DK1453852T3; ES2275937T3; WO2003053999A2; EP1453852A2; US20040266766A1; CA2470078A1; DE50209313D1; JP4418680B2; AU2002352245A1; WO2003053999A3; JP2005518388A; CA2470078C

Description

ΕΡ 1 453 852 /PT

DESCRIÇÃO "Péptidos de arilguanidina selectivos como inibidores da urocinase" 0 presente invento refere-se a novos inibidores selectivos do activador de plasminogénio do tipo urocinase (uPA, EC 3.4.21.31), assim como à sua utilização como substâncias activas terapêuticas para o tratamento de doenças relacionadas com a urocinase, como por exemplo tumores malignos e a formação de metástases. 0 invento refere-se em particular a novos inibidores de elevada selectividade e actividade do activador de plasminogénio do tipo urocinase (uPA, EC 3.4.21.31) do tipo arilguanidina. 0 activador de plasminogénio do tipo urocinase (uPA) desempenha um papel chave na invasão de tumores e na formação de metástases (Schmitt et al., J. Obst. Gyn. 21 (1995), 151- 165) . 0 uPA é expressado em excesso em diferentes tipos de células tumorais (Kwaan; Câncer Metastasis Rev. 11 (1992), 291-311) e liga-se ao receptor de uPA relacionado com tumores (uPA-R), onde ocorre a activação do plasminogénio, sendo este transformado em plasmina. A plasmina consegue degradar diferentes componentes da matriz extracelular (ECM) como, por exemplo, fibronectina, laminina e colagénio do tipo IV e activa também algumas outras enzimas que degradam a ECM, especialmente metaloproteinases de matriz. Elevadas quantidades de uPA relacionado com tumores estão em correlação com um maior risco de formação de metástases para pacientes com cancro (Stephens et al., Breast Câncer Res. & Treat. 52 (1998), 99-111). Um bom ponto de partida para uma terapia anti-metastática é, por esta razão, uma inibição da actividade proteolítica do uPA.

Uma caracteristica comum de muitos inibidores de uPA sintéticos que se conhecem, é um radical básico que contém grupos amidino ou guanidino e é capaz de se ligar a Asp189 no bolso de especificidade SI de uPA, onde actua como mimético de arginina (Spraggon et al., Structure 3 (1995), 681-691).

No entanto, a maior parte dos inibidores que se conhecem não são selectivos para uPA, mas inibem, pelo contrário, 2 ΕΡ 1 453 852 /PT também outras serinaproteases como, por exemplo, tripsina, trombina, plasmina ou o activador de plasminogénio tecidual (tPA). A p-aminobenzamidina é um inibidor de uPA moderadamente selectivo com uma constante de inibição de 82 μΜ. Billstroem et al. (Int. J. Câncer 61 (1995), 542-547) conseguiram demonstrar uma nítida diminuição da taxa de crescimento de tumores DU145 (uma linha de células de adenocarcinoma da próstata) em ratos SCID em caso de uma administração oral numa dose diária de 125 a 250 mg de p-amino-benzamidina/ kg/dia. Os efeitos secundários eram negligenciáveis.

Algumas fenilguanidinas monossubstituídas revelaram-se ser inibidores de uPA eficazes e selectivos in vitro. Estas pequenas moléculas apresentam constantes de inibição no domínio micromolar, mas ligam-se no entanto apenas dentro do bolso SI de uPA (Yang et al. , J. Med. Chem. 33 (1990), 2956-2961) . Não foram realizados testes biológicos com estes compostos. O diurético Amilorida é um inibidor selectivo de uPA (Ki, uPA = 7 μΜ) que impede a formação de metástases pulmonares após uma inoculação i.v. de células de adenocarcinoma de peito de ratazana (Kellen et al., Anticancer Res. 8 (1988), 1373-1376). Também alguns derivados de 3-aminofenilalanina velaram-se ser inibidores eficazes de serinaproteases, no entanto estes compostos apresentam geralmente apenas uma selectividade reduzida em relação a uPA (Sturzebecher et al., J. Med. Chem. 40 (1997), 3091-3099; Sturzebecher et al., J. Enzyme Inhlb. 9 (1995), 87-99).

Inibidores de uPA que se conhecem, são derivados da benzo[b]tiofeno-2-carboxamidina (B428 e B623: Kif uPA = 0,32 e 0,07 μΜ, respectivamente; patente US 5,340,833). Após a administração de 4-iodobenzo[b]tiofeno-2-carboxamidina (B428), Rabbani et al. (Int. J. Câncer 63 (1995), 840-845) assim como Xing et al. (Câncer Res. 57 (1997), 3585-3593) conseguiram provar uma diminuição do crescimento tumoral e da formação de metástases num modelo singénico para o carcinoma da próstata de ratazana ou o carcinoma da mama de rata. Estes últimos estudos mostraram uma diminuição mais ampla do 3 ΕΡ 1 453 852 /PT crescimento do tumor primário em caso de uma administraçao comum de B428 com o antiestrogénio Tamoxifeno. 0 pedido de patente alemã 19940389.9 propõe a utilização de derivados de arilguanidina e, em especial, de derivados de fenilguanidina, como inibidores selectivos de uPA. Estes compostos contêm ainda um outro substituinte no sistema anelar aromático, de preferência em posição "para" em relação ao grupo guanidino, substituinte esse que contém um grupo metileno eventualmente substituído, seguido de funcionalidades de doador/aceitador de hidrogénio. Devido a este padrão de substituição, os compostos apresentam uma eficácia e selectividade particularmente elevadas em relação a uPA. Supõe-se que estes compostos interagem, como miméticos de arginina, com o resíduo de ammoacido Asp no bolso SI de uPA e que são capazes de entrar em interacção com o bolso S2 e/ou S3 de uPA. 0 pedido de patente alemã 10013715.6 descreve outros derivados de arilguanidina que conseguem entrar numa interacção ainda mais específica com uPA, em especial com os resíduos de aminoácido Gin e/ou Ser . Estes compostos contêm junto ao sistema anelar aromático, além do grupo guanidina, um outro substituinte que contém um grupo metileno eventualmente substituído, seguido de uma funcionalidade de doador de hidrogénio, de um aceitador de hidrogénio e de outro doador de hidrogénio. 0 pedido de patente internacional WO 00/04954 descreve derivados de arilamidina, em especial derivados de amidinofenilalanina, como inibidores da urocinase.

Um problema a resolver pelo presente invento era o de disponibilizar novo inibidores de elevada selectividade e actividade do activador de plasminogénio de urocinase.

Este problema é resolvido de acordo com o invento através da utilização dos compostos IV-[ (4-guanidinobenzil-carbamoil)metil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilamino-propionamida (WX-508), cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Ser-Ala-(4-guanidinobenzil)amida (WX-532), benzilsulfonil-(D)Ser-IV-Me-Gly-( 4-guanidinobenzil) amida (WX-538), 4-clorobenzil- 4

ΕΡ 1 453 852 /PT sulfonil-(d)-Ser-N-Me-Ala-(4-guanidinobenzil)amida (WX-582), cloridrato de 4-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil) amida (WXC-340), cloridrato de 3-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-318), cloridrato de 3-nitrobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-316), cloridrato de Λ7-(4-guanidinobenzil)-2-(3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilamino-propionilamino)-4-fenilbutiramida (WX-550), cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Ser-Ala-(4-guanidinobenzil)amida (WX-532), assim como dos compostos cloridrato de BZ-SO2-(D)-Ser-(Aza-Gly)-4-guanidinobenzilamida (WX-544) e cloridrato de N- [2-(4-guanidinobenzeno-sulfonilamino)etil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilamino-propionamida (WX-568) ou de sais destes compostos, para a fabricação de um produto para a inibição do activador de plasminogénio de urocinase.

Os compostos podem estar presentes sob a forma de sais, de preferência sob a forma de sais de ácidos fisiologicamente aceitáveis, por exemplo como sais de ácidos minerais, de particular preferência sob a forma de cloridratos ou de sais de ácidos orgânicos adequados. 0 grupo guanidinio pode eventualmente ser protador de funções protectoras que, de preferência, possam ser separadas sob condições fisiológicas. Os compostos podem estar presentes sob a forma de compostos opticamente puros ou sob a forma de misturas dos enantiómeros ou/e diastereoisómeros.

Se for necessário, os inibidores de urocinase de acordo com o invento podem ser utilizados juntamente com substâncias auxiliares ou de suporte farmacêuticas adequadas, para a fabricação de medicamentos ou no diagnóstico, sendo possível uma administração em combinação com outras substâncias activas, por exemplo com outros inibidores de urocinase, como por exemplo anticorpos ou/e péptidos, mas também com produtos quimioterapêuticos e citostáticos ou/e com substâncias activas citostáticas.

Os medicamentos podem ser administrados a humanos e animais por via tópica, oral, rectal ou parentérica, por exemplo por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, sublingual, nasal ou/e inalativa, por exemplo sob a forma de comprimidos, drageias, cápsulas, 5

ΕΡ 1 453 852 /PT peletes, supositórios, soluções, emulsões, suspensões, lipossomas, sprays para inalação ou sistemas transdérmicos, como por exemplo emplastros.

Os compostos de acordo com o invento são adequados para o combate de doenças relacionadas com uma sobreexpressão patológica de uPA ou/e do receptor do activador de plasminogénio de urocinase (uPAR). São, por exemplo, capazes de inibir com elevada eficácia o crescimento ou/e a proliferação dos tumores malignos, assim como a formação de metástases de tumores. Neste âmbito, os inibidores de uPA podem ser utilizados, eventualmente, em conjunto com outros produtos antitumorais ou com outros tipos de tratamento, por exemplo radioterapia ou intervenções cirúrgicas. Além disso, os inibidores de acordo com o invento são também eficazes em relação a outras doenças relacionadas com uPA ou/e relacionadas com uPAR.

Os inibidores de uPA de acordo com o invento são de preferência caracterizados por apresentarem um valor de K± pelo menos duas vezes, de preferência pelo menos cinco vezes e, de particular preferência, pelo menos 10 até 1000 vezes mais baixo para uPA em relação comparação com a tPA, plasmina ou/e trombina. Além disso é notável que os compostos de acordo com o invento têm apenas uma influência reduzida na coagulação do sangue, uma vez que têm valores de Ki excessivamente elevados para uma inibição eficaz de trombina, plasmina e do factor Xa.

As substâncias de acordo com o invento podem ser utilizadas em combinação com substâncias fisiologicamente activas, por exemplo com radiomarcadores ou com produtos citotóxicos, por exemplo produtos quimioterapêuticos como a cis-platina ou 5-fluorouracilo, ou com péptidos. Além disso, a substâncias podem também ser incorporadas na membrana de vesículas de suporte, por exemplo lipossomas, ou/e ser administradas juntamente com substâncias activas incluídas nas vesículas de suporte, por exemplo agentes citotóxicos, como por exemplo doxorubicina.

Pelo invento é disponibilizado um método para a inibição da urocinase em seres vivos, em especial em humanos, através 6

ΕΡ 1 453 852 /PT de administração de uma quantidade eficaz de pelo menos um composto de acordo com o invento. A dosagem do composto encontra-se usualmente no intervalo de 0,01 a 100 mg/kg de peso do corpo por dia. A duração do tratamento depende da gravidade da doença, começando com uma administração única até chegar a um tratamento de várias semanas ou até mesmo de vários meses, o qual pode ser repetido periodicamente, se for necessário. O invento será pormenorizado melhor através dos exemplos que se seguem e das figuras em anexo. A figura 1 mostra as interacções entre inibidores de acordo com o invento em que B representa um grupo SO2, com urocinase. Vê-se as pontes de hidrogénio formados entre o grupo SO2 e os grupos NH na estrutura básica da urocinase de Gly 193, Asp 194 e Ser 195. A figura 2 mostra um esquema de síntese para a produção do composto particularmente preferido iV-[ (4-guanidinobenzil-carbarmoil)metil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilamino-propionamida (WX-508). Os compostos de fórmula (I) podem ser sintetizados de acordo com este esquema reaccional geral, partindo de p-aminobenzilamina. Na figura 2, Z significa o grupo protector benziloxicarbonilo e Boc o grupo protector terc-butiloxicarbonilo. A figura 3 mostra esquemas de síntese para a produção dos compostos particularmente preferidos WX-550 (figura 3a), WX-544 (figura 3b) e WX-568 (figura 3c) . Os compostos de fórmula (I) podem ser sintetizados de acordo com este esquema reaccional geral, partindo de p-aminobenzilamina. Na figura 3, Z significa o grupo protector benziloxicarbonilo e Boc o grupo protector terc-butiloxicarbonilo. A figura 4 mostra um esquema de síntese para a produção do composto WX-600.

Exemplos

Aqui serão utilizadas as seguintes abreviaturas: 7

ΕΡ 1 453 852 /PT HBTU hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio HOBt IV-hidroxibenzotriazole PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxi-tris-pirrolidino-fosfónio DCC NfN'-diciclo-hexilcarbodiimida tBu terc-butilo BOC grupo protector terc-butiloxicarbonilo Z grupo protector benziloxicarbonilo Z-OSu N- (benziloxicarboniloxi)succinimida TEA trietilamina DIPEA diisopropiletilamina Z-Gly-OSu éster Na-benziloxicarboniloglicina-iV-hidroxisuccinimídico TFA ácido trifluoroacético 4M 4-molar iV-Z-iV-Me-Gly Na-benziloxicarbonil-Na-metil-glicina iV-Z-iV-Me-Ala Na-benziloxicarbonilo-Na-metilalanina Z-HomoPhe-OH Να-benziloxicarbonil-homofenilalanina Fmoc-(D)Dap(Z)-OH ácido Na-Fluoreniloxicarbonil-iV-benziloxicarbonil-(D)-diaminopropiónico BOC-(D)-Ser(tBu)-OH Να-terc-butiloxicarbonil-O-terc-butil-(D)-serina

Exemplo 1

Descrição da síntese de cloridrato de N-[2-(4-guanidino-benzenossulfonilamino)etil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonil-aminopropionamida [WX-568] (ver fig. 3c)

Cloreto de 4-nitrofenilsulfonilo (1) é transformado, num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano) sob adição de uma base orgânica (por exemplo TEA, DIPEA) , com cloridrato de iV-Z-diaminoetano (2), no composto 3. Uma hidrogenação catalítica de 3 com um catalisador de Pd-carvão activo transforma o grupo nitro na amina correspondente, separando simultaneamente o grupo protector Z (4). 0 grupo aminoetilo do composto 4 pode ser transformado com reagentes de acoplamento usuais na guímica dos péptidos (por exemplo PyBOP, HBTU ou DCC e HOBt) juntamente com Z-(D)-Ser(tBu)-OH, na amida correspondente 5. A transformação no composto intermédio 6 plenamente protegido, é realizada com um reagente de guanidinilação adequado, como por exemplo N, N' -bis (terc-butoxicarbonil) - líí-pirazol-l-carboxamidina . A 8 ΕΡ 1 453 852 /PT separação subsequente do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com o catalisador de Pd-carvão activo (7) e reacção com cloreto de benzilsulfonilo num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano) sob adição de uma base orgânica, fornece o produto plenamente protegido 8. A separação dos grupos protectores (BOC e éter t-butílico) é realizada através de dissolução do composto 8 num ácido (por exemplo ácido trifluoroacético ou HClg 4M em dioxano), obtendo-se, assim, o sal correspondente do composto alvo N-[2-(4-guanidino-benzenossulfonilamino)etil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilaminopropionamida (9).

Exemplo 2

Descrição da síntese de cloridrato de Bz-SC>2- (D)-Ser- (Aza-Gly)-4-guanidinobenzilamida [WX-544] (ver fig. 3b) 0 grupo aminometilo do eduto 4-aminobenzilamina (10) é, em primeiro lugar, equipado com um grupo protector adequado, por exemplo através de transformação de 10 com cloroformiato de benzilo ou Z-OSu, no composto 11. A transformação com um reagente de guanidinilação adequadamente protegido, como por exemplo N, N' -bis(terc-butoxicarbonil)-lH-pirazol-1- carboxamidina, fornece o composto 12, cujo grupo protector Z pode ser separado através de hidrogenação catalítica com um catalisador de Pd-carvão activo (13) . A função amino desta maneira libertada é transformada, sob refrigeração e adição de um equivalente de uma base orgânica, com trifosgénio (um substituto sólido e, assim, menos tóxico do fosgénio) e a seguir in situ com carbazato de benzilo, no composto 14 [Z-

AzaGly-4-(N, N' -bis-BOC-guanidinobenzil)amida] . Como descrito para o composto 13, o grupo protector Z é separado através de hidrogenação (15) e transformado com Z-(D)-Ser(tBu)-OH e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo PyBOP, HBTU ou DCC e HOBt) , na amida 16. O grupo protector Z é novamente separado cataliticamente (17) e a amina livre resultante é transformada com cloreto de benzilsulfonilo num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano), sob adição de uma base orgânica, na sulfonamida correspondente 18. A separação dos grupos protectores restantes é realizada através de reacção em solução ácida (por exemplo em ácido trifluoroacético ou em HClg 4M /dioxano), obtendo-se o sal correspondente do 9

ΕΡ 1 453 852 /PT composto alvo BZ-SO2-(D)-Ser-(Aza-Gly)-4-guanidinobenzilamida (19) .

Exemplo 3

Descrição da síntese de cloridrato de N- (4-guanidinobenzil) -2-(3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilaminopropionilamino)-4-fenil-butiramida [WX-550] (ver fig. 3a) 4-Aminobenzilamina (20) é transformada com Z-(L)-homofenilalanina e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo PyBOP, HBTU ou DCC e HOBt), na amida 21. Através de hidrogenação catalítica com um catalisador de Pd-carvão activo é separado o grupo protector Z (22) e, como descrito para 21, o grupo amino livre é transformado com Z-(D)-Ser(tBu)-OH, na amida 23. A reacção com um reagente de guanidinilação adequadamente protegido, como por exemplo N, N' -bis (terc-butoxicarbonil)-lfí-pirazol-1-carboxamidina fornece o composto 24. O grupo protector Z N-terminal é separado como descrito para 22, e o composto resultante 25 é transformado com cloreto de benzilsulfonilo, na sulfonamida 26. Na última etapa, os grupos protectores restantes são separados num meio ácido (por exemplo em ácido trifluoroacético ou em HClg 4M /dioxano), obtendo-se o sal correspondente do composto alvo 27.

Exemplo 4 Síntese de cloridrato de N- [(4-guanidinobenzilcarbamoil)-metil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilaminopropionamida ou cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)-amida (WX-508) (ver fig. 2)

4-Aminobenzilamina de tipo comercial é transformada, num solvente inerte, com Z-Gly-OSu, em Z-Gly-(4-aminobenzil)-amida. (Alternativamente podem também ser utilizados Z-Gly-OH 10

ΕΡ 1 453 852 /PT e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt) . Após a separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Z-(D)-Ser(tBu)-OH, na Z-(D)Ser(tBu)-Gly-(4-aminobenzil)amida correspondente. A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N, N' -bis-BOC-lfí-pirazol-l-carboxamidina num solvente tão apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após nova separação catalítica do grupo protector Z é realizada a transformação com cloreto de fenilmetanossulfonilo, no produto plenamente protegido BzSC>2-(D)-Ser(tBu)-Gly-( 4-IV, N' -bis-BOC-guanidinobenzil) amida . Na última etapa da síntese, os grupos protectores BOC e o grupo de éter terc-butílico são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, directamente o cloridrato de N-[(4-guanidinobenzilcarbamoil)metil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulf onilamino-propionamida. Em alternativa, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente.

Exemplo 5 Síntese do elemento estrutural comum H-(D)-Ser(tBu)-Gly-(4,N,N' -bis-BOC-guanidinobenzil)amida (1)

4-Aminobenzilamina de tipo comercial é transformada, num solvente inerte, com Z-Gly-OSu, em Z-Gly-(4-aminobenzil)amida. (Alternativamente podem também ser 11

ΕΡ 1 453 852 /PT utilizados Z-Gly-OH e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt) . A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N, N' -bis-BOC-lH-pirazol-l-carboxamidina num solvente tão

apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Z-(D)-Ser(tBu)-OH, na Z-(D)Ser(tBu)-Gly-(4-N, N' -bis-BOC-guandinobenzil)amida correspondente. A separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de Pd-carvão activo fornece H-(D)Ser(tBu)-Gly-(4-N, Ν' -bis-BOC-guanidinobenzil)amida como elemento estrutural (1) para as reacções de derivatização N-terminal descritas a seguir.

Exemplo 6 Síntese dos derivados de sulfonamida N-terminais de fórmula geral

(Exemplos WXC-296, 298, 300, 302, 316, 318, 340)

Para a síntese dos derivados de sulfonamida N-terminais de acordo com o invento, o elemento estrutural 1 é levado a reagir com um equivalente do cloreto de sulfonilo substituído desejado, na presença de uma base orgânica terciária (por exemplo TEA ou DIPEA), num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). A seguir, os grupos protectores do produto plenamente protegido que é formado desta maneira, são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, o cloridrato dos compostos desejados R-SO2-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (R representa de um modo geral um 12 ΕΡ 1 453 852 /PT radical orgânico). Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 6.1. Exemplo comparativo: Cloridrato de (-)-cânfora-10-sulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-2 96)

Para a sintese do composto de acordo com o invento cloridrato de (-)-cânfora-10-sulfonil-(D)-Ser-Gly-(4- guanidinobenzil)amida (WXC-296), o elemento estrutural 1 é levado a reagir com um equivalente de cloreto de (-)-cânfora-10-sulfonilo na presença de uma base orgânica terciária (por exemplo TEA ou DIPEA), num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). A seguir, os grupos protectores do produto plenamente protegido que é formado desta maneira, são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, o cloridrato do composto alvo. Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 6.2. Exemplo comparativo: Cloridrato de (+)-cânfora-10-sulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-298) A síntese de cloridrato de (+)-cânfora-10-sulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-298) decorre como descrito em 6.1, no entanto com cloreto de (+)-cânfora-10-sulfonilo. 6.3. Exemplo comparativo: Cloridrato de n-butilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-300) A síntese de cloridrato de n-butilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-300) decorre como descrito em 6.1, no entanto com cloreto de butilsulfonilo. 6.4. Exemplo comparativo: Cloridrato de n-octilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-302) A síntese de cloridrato de n-octilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-302) decorre como descrito em 13

ΕΡ 1 453 852 /PT 6.1, no entanto com cloreto de n-octilsulfonilo. 6.5. Cloridrato de 3-nitrobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4- guanidinobenzil)amida (WXC-316) A síntese de cloridrato de 3-nitrobenzilsulfonil-(D)-

Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-316) decorre como descrito em 6.1, no entanto com cloreto de 3-nitrobenzilsulf onilo . 6.6. Cloridrato de 3-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4- guanidinobenzil)amida (WXC-318) A síntese de cloridrato de 3-clorobenzilsulfonil-(D)-

Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-318) decorre como descrito em 6.1, no entanto com cloreto de 3-clorobenzilsulf onilo . 6.7. Cloridrato de 4-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4- guanidinobenzil)amida (WXC-340) A síntese de cloridrato de 4-clorobenzilsulfonil-(D)-

Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-340) decorre como descrito em 6.1, no entanto com cloreto de 4-clorobenzil-sulfonilo.

Exemplo 7 Síntese de derivados de ureia N-terminais de fórmula geral

(Exemplos comparativos: WXC-202, 304, 306,308, 310, 312, 314,320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 342)

Para a síntese dos derivados de ureia N-terminais de acordo com o invento, o elemento estrutural 1 é levado a 14 ΕΡ 1 453 852 /PT reagir com um equivalente do isocianato substituído desejado, num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). A seguir, os grupos protectores do produto plenamente protegido que é formado desta maneira, são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, o cloridrato dos compostos desejados N-[(4-guanidinobenzilcarbamoil)metil]-3-hidroxi-2-(3-R-ureido)propionamida (R representa de um modo geral um radical orgânico). Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 7.1. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3-clorofenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-2 92)

Para a síntese do composto de acordo com o invento cloridrato de 3-clorofenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4- guanidinobenzil)amida (WXC-292), o elemento estrutural 1 é levado a reagir com um equivalente de isocianato e 3-cloro-fenilo, num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). A seguir, os grupos protectores do produto plenamente protegido que é formado desta maneira, são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, o cloridrato do composto desejado. Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 7.2. Exemplo comparativo: Cloridrato de 2-clorofenil aminocarbonil- (D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-304) A síntese de cloridrato de 2-clorofenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-304) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 2-clorofenilo. 7.3. Exemplo comparativo: Cloridrato de 4-metoxifenil aminocarbonil- (D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-306) A síntese de cloridrato de 4-metoxifenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-306) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 4-metoxifenilo. 15

ΕΡ 1 453 852 /PT 7.4. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3,4,5-trimetoxifenil-aminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-3 0 8) A síntese de cloridrato de 3,4,5-trimetoxifenil-aminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-3 0 8) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 3,4,5-tri-metoxifenilo. 7.5. Exemplo comparativo: Cloridrato de 4-fenoxifenil- aminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-310) A síntese de cloridrato de 4-fenoxifenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-310) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 4-fenoxifenilo. 7.6. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3-etoxicarbonilfenil-aminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-312) A síntese de cloridrato de 3-etoxicarbonilfenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-312) decorre como descrito em 7.1, no entanto com 3-isocianato-benzoato de etilo. 7.7. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3-acetilfenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-314) A síntese de cloridrato de 3-acetilfenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-314) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 3-acetilfenilo. 7.8. Exemplo comparativo: Cloridrato de 1-adamantilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-320) A síntese de cloridrato de 1-adamantilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-320) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 1-adamantilo. 7.9. Exemplo comparativo: Cloridrato de 2-bromofenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-322) A síntese de 2-bromofenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-322) decorre como descrito em 7.1, 16 ΕΡ 1 453 852 /PT no entanto com isocianato de 2-bromofenilo. 7.10. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3-carboxifenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-324) A síntese de cloridrato de 3-carboxifenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-324) decorre como descrito em 7.1, no entanto com 3-isocianatobenzoato de terc-butilo. O grupo protector terc-butilo é separado juntamente com os outros grupos protectores sensíveis a ácidos, através de tratamento com HClg 4M em dioxano. 7.11. Exemplo comparativo: Cloridrato de 2,3-di-hidro-l,4-benzodioxin-6-ilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)-amida (WXC-326) A síntese de cloridrato de 2,3-di-hidro-l,4-benzodioxin-6-ilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-326) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 2,3-di-hidro-l,4-benzodioxin-6-ilo. 7.12. Exemplo comparativo: Cloridrato de 1-naftilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-328) A síntese de cloridrato de 1-naftilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-328) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 1-naftilo. 7.13. Exemplo comparativo: Cloridrato de 4-acetilfenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-33 0) A síntese de cloridrato de 4-acetilfenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-328) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 4-acetilfenilo. 7.14. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3,4-metilenodioxi-fenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-332) A síntese de cloridrato de 3,4-metilenodioxifenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-332) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 3,4-metilenodioxifenilo . 17

ΕΡ 1 453 852 /PT 7.15. Exemplo comparativo: Cloridrato de 2,3-diclorofenil- aminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-33 4) A síntese de cloridrato de 2,3-diclorofenilamino- carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-334) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 2.3- diclorofenilo. 7.16. Exemplo comparativo: Cloridrato de 4-etiloxicarbonil- fenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-336) A síntese de cloridrato de 4-etiloxicarbonilfenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-336) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 4-etiloxicarbonilfenilo. 7.17. Exemplo comparativo: Cloridrato de 2,4-dibromofenil- aminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-33 8) A síntese de cloridrato de 2,4-dibromofenilamino- carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-338) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 2.4- dibromofenilo. 7.18. Exemplo comparativo: Cloridrato de 4-nitrofenilamino-carbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil) amida (WXC-342) A síntese de cloridrato de 4-nitrofenilaminocarbonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-342) decorre como descrito em 7.1, no entanto com isocianato de 4-nitrofenilo.

Exemplo 8 Síntese de derivados de amida N-terminais de fórmula geral

(Exemplo WX-571) 18

ΕΡ 1 453 852 /PT

Para a síntese dos derivados de amida N-terminais de acordo com o invento, o elemento estrutural 1 é levado a reagir com um equivalente do cloreto de ácido carboxílico substituído desejado, na presença de uma base orgânica terciária (por exemplo TEA ou DIPEA), num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). Alternativamente é também possível transformar ácidos carboxílicos com reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU ou HOBt), na amida desejada. São também possíveis outras formas de activação dos ácidos carboxílicos, por exemplo sob a forma de ésteres pentafluorofenílicos, ésteres hidroxisuccinimídicos ou sob a forma de anidrido. A seguir, os grupos protectores do produto plenamente protegido que é formado desta maneira, são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, o cloridrato dos compostos desejados N- [ (4-guanidinobenzilcarbamoil)-metil]-3-hidroxi-2-R-acilaminopropionamida (R representa de um modo geral um radical orgânico). Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 8.1. Exemplo comparativo: Cloridrato de 3,4-di-hidroxifenil-acetil-(D)-Ser-Gly-(4 guanidinobenzil)amida (WX-571)

Para a síntese do composto de acordo com o invento cloridrato de 3,4-di-hidroxifenil-acetil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-571), o elemento estrutural 1 é levado a reagir com um equivalente de ácido 3,4-di-hidroxif enílico e 1,1 equivalentes de um dos reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), na presença de uma base orgânica terciária (por exemplo TEA ou DIPEA), num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). A seguir, os grupos protectores do produto plenamente protegido que é formado desta maneira, são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, o cloridrato dos compostos desejados. Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 19

ΕΡ 1 453 852 /PT

Exemplo 9 Síntese de BzS02-(D)-Ser-AzaGly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-544)

Para a síntese do composto de acordo com o invento BzSC>2-(D)-Ser-AzaGly-( 4-guanidinobenzil) amida transforma-se em primeiro lugar o grupo aminometilo de 4-aminobenzilamina com Z-OSu, na N-Z-(4-aminobenzil)amina. A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N, N'-bis-BOC-lB-pirazol-1-carboxamidina num solvente tão apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado primeiro, num solvente inerte (por exemplo diclorometano) sob refrigeração com gelo, com 1/3 de equivalente de trifosgénio e um equivalente de TEA, e, terminada esta reacção, com carbazato de benzilo em Z-AzaGly-( 4-IV, N' -bis-BOC-guanidinobenzil) amida. Após separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Z-(D)Ser(tBu)-OH, na respectiva Z-(D)-Ser(tBu)-AzaGly-(4-N,N' -bis-BOC-guanidinobenzil)amida. Após nova separação catalítica do grupo protector Z é realizada a transformação com cloreto de fenilmetanossulfonilo, no produto plenamente protegido BZSO2-(D)-Ser(tBu)-AzaGly-4(N,N'-bis-BOC-guanidino-benzil)amida. Na última etapa da síntese, os grupos protectores BOC e o grupo de éter terc-butílico são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se assim directamente o cloridrato de BZSO2-(D)-Ser-AzaGly-4-(guanidinobenzil)-amida. Alternativamente, os grupos protectores podem também 20

ΕΡ 1 453 852 /PT ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente.

Exemplo 10 Síntese de compostos de acordo com o invento do tipo BzSC>2-(D)-Ser-Aaa-(4-guanidinobenzil)amida (Aaa significa homofenilalanina)

(Exemplo WX-550) 4-Aminobenzilamina de tipo comercial é transformada, num solvente inerte, com o desejado aminoácido protegido por Z (Z-Aaa) e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt) , na Z-Aaa-(4-aminobenzil)amida. Grupos reactivos eventualmente presentes na cadeia lateral do aminoácido Aaa deveriam neste caso estar equipados, se possível, com um grupo protector sensível a ácidos (por exemplo BOC, tritilo, éster ou éter terc-butílico). Após separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Z-(D)Ser(tBu)-OH, na respectiva Z-(D)-Ser(tBu)-Aaa-(4-aminobenzil)amida. A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N,N'~bis-BOC-lií-pirazol-l-carboxamidina num solvente tão apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após nova separação catalítica do grupo protector Z é realizada a transformação com cloreto de fenilmetanossulfonilo, no produto plenamente protegido BzSC>2- (D) -Ser (tBu) -Gly-4-(N, N' -bis-BOC-guanidinobenzil)amida. Na última etapa da síntese, os 21

ΕΡ 1 453 852 /PT grupos protectores BOC e o grupo de éter terc-butílico são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, directamente o cloridrato de BzSCU- (D) -Ser-Aaa- (4-guanidino-benzil)amida. Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 10.1 Cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Ser-HomoPhe-(4-guanidinobenzil)amida (WX-550)

4-Aminobenzilamina de tipo comercial é transformada, num solvente inerte (por exemplo diclorometano), com Z-HomoPhe-OH e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), em Z-HomoPhe-(4-amino-benzil)amida. Após separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Z-(D)Ser(tBu)-OH, na respectiva Z-(D)-Ser(tBu)HomoPhe-(4-aminobenzil)amida. A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N, N' -bis-BOC-lfí-pirazol-l-carboxamidina num solvente tão apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após nova separação catalítica do grupo protector Z é realizada a transformação com cloreto de fenilmetano-sulfonilo, no produto plenamente protegido BzS02-(D)-Ser(tBu)-HomoPhe-4-(N, N' -bis-BOC-guanidinobenzil)amida. Na última etapa da síntese, os grupos protectores BOC e o grupo de éter terc-butílico são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, directamente o cloridrato de BzS02-(D)-Ser-HomoPhe-(4-guanidinobenzil)amida. Em alternativa os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 22

ΕΡ 1 453 852 /PT

Exemplo 11 11.1 Síntese do composto de acordo com o invento 2-(4-cloro-fenilmetanossulfonilamino)-N-[1-(4-guanidinobenzilcarbamoil)-etil]-3-hidroxi-IV-metilpropionamida ou 4-clorobenzilsulfonil-(d) -Ser-iV-Me-Ala- (4-guanidinobenzilamida) (WX-582)

Para a síntese do composto de acordo com o invento, N-Z-N-metil-alanina é transformada com reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU ou HOBt) , com 4-aminobenzilamina, em N-Z-N-metilalanina-(4-aminobenzil)amida. Após separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Z-(D)Ser(tBu)-OH, na respectiva Z-(D)-Ser(tBu)-N-metil-Ala-(4-aminobenzil)amida. A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N,N'-bis-BOC-lH-pirazol-1-carboxamidina num solvente tão apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após nova separação catalítica do grupo protector Z é realizada a transformação com cloreto de clorofenilmetanossulfonilo, no produto plenamente protegido 4-C1-BzS02-(D)-Ser(tBu)-N-metil-Ala-(4-N, N'-bis-BOC-guanidinobenzil)amida. Na última etapa da síntese, os grupos protectores BOC e o grupo de éter terc-butílico são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, directamente o cloridrato de 2-(4-cloro-fenilmetanossulfonilamino)-N- [1-(4-guanidinobenzilcarbamoil) -etil]-3-hidroxi-iV-metilpropionamida. Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 23

ΕΡ 1 453 852 /PT 11.2 Síntese de benzilsulfonil-(D)-Ser-IV-Me-Gly-(4-guanidino-benzil)amida (WX-538) A síntese do composto de acordo com o invento benzilsulfonil-(D)-Ser-iV-Me-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-538) decorre em analogia com 11.1, no entanto com N-Z-N-Me-Gly-OH em vez de N-Z-iV-met il-alanina e com cloreto de benzilsulfonilo em vez de cloreto de 4-clorobenzilsulfonilo.

Exemplo 12 (exemplo comparativo) Síntese de cloridrato de iV-[N'-guanidinof enil)-hidrazino-carbonilmetil]-3-hidroxi-2-fenil-metanossulfonilamino-propionamida (WX-600) (ver fig. 4) 4-Nitrofenil-hidrazina (1) é transformada com Z-Gly-OH e um dos reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo PyBOP, HBTU ou DCC e HOBt), num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano ou DMF) , no composto 2. Através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo pode não apenas ser separado o grupo protector Z como também ser reduzida a função nitro ao grupo amino correspondente, obtendo-se, assim, ácido aminoacético-N'-(4-aminofenil)-hidrazina (3). A função amino alifática pode ser transformada através de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo PyBOP, HBTU ou DCC e HOBt), num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano ou DMF), com Z-(D)-Ser-(tBu)-OH, na amida 4. A formação da função guanidino protegida por Bis-Boc (5) é realizada através de reacção com N,N'-bis(terc-butoxicarbonil)-lH-pirazol-l-carboxamidina num solvente orgânico inerte (por exemplo diclorometano). Através de uma nova hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo é separado o grupo protector Z (6). A reacção subsequente com 1 equivalente de cloreto de benzilsulfonilo em diclorometano fornece o produto plenamente protegido 7, que é desprotegido através de reacção com HClg 4M em dioxano, obtendo-se o cloridrato do produto desejado N-[N'-(4-guanidinofenil)-hidrazinocarbonilmetil]-3-hidroxi-2-fenil-metanossulfonilaminopropionamida (8). 24

ΕΡ 1 453 852 /PT

Exemplo 13 Síntese dos derivados com a fórmula geral

13.1. Exemplo comparativo: Síntese de cloridrato de benzil-sulfonil-(D)-Dap(Z)-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXM-5) 4-Aminobenzilamina de tipo comercial é transformada, num solvente inerte, com Z-Gly-OSu, em Z-Gly-(4-aminobenzil)-amida. (Alternativamente podem também ser utilizados Z-Gly-OH e reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt) . Após a separação do grupo protector Z através de hidrogenação catalítica com um catalisador de paládio/carvão activo, o grupo amino livre é transformado com a ajuda de reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos (por exemplo DCC ou HBTU e HOBt), com Fmoc-(D)-Dap(Z)-OH na respectiva Fmoc-(D)Dap(Z)-Gly-(4-aminobenzil)amida. A formação da função guanidino protegida por BOC pode ser realizada nesta etapa, por exemplo, através de reacção com N,N'-bis-BOC-lH-pirazol-l-carboxamidina num solvente tão apoiar e inerte quanto possível (por exemplo diclorometano). Após a separação do grupo protector Fmoc através de uma base orgânica secundária (por exemplo dietilamina ou piperidina), é realizada a transformação com cloreto de fenilmetanossulfonilo no produto protegido BzSC>2-(D)-Dap(Z)-Gly-( 4-IV, N' -bis-BOC-guanidinobenzil) amida . Na última etapa da síntese, os grupos protectores BOC são separados através de HClg 4M em dioxano, obtendo-se, assim, directamente o cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Dap(Z)-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXM-5). Alternativamente, os grupos protectores podem também ser separados através de TFA. A seguir, o sal resultante com TFA do produto é transformado através de permuta iónica no cloridrato correspondente. 25

ΕΡ 1 453 852 /PT 13.2. Exemplo comparativo: Síntese de bis-cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Dap-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXM-6) 0 bis-cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Dap-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WXM-β) pode ser sintetizado através de hidrogenação catalítica de WXM-5 (veja-se 13.1) com um catalisador de paládio/carvão activo, em metanol contendo 2 equivalentes molares de HC1 1 M.

Exemplo 14

Inibição in vitro de urocinase e plasmina

Para determinar a actividade do inibidor, foram incubados 200 μΐ de tampão Tris (0,05 mol/1, contendo o inibidor, 0,154 mol/1 de NaCl, pH 8,0), 25 μΐ de substrato (Pefachrome uPA, Pefachrome PL ou Pefabloc TH em H20; Pentapharm LTD, Basel, Suiça) e 50 μΐ de urocinase (Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden, Alemanha) ou uma outra protease correspondente, por exemplo plasmina, trombina ou FXa, durante 10 minutos a 30°C. Após cerca de 30 minutos e 30 ciclos, determina-se a absorção aos 405 nm por meio de um Mikroplate Reader (Mediators PHL, Aureon Biosystems, Viena, Áustria). Os valores Ki foram determinados de acordo com Dixon, através de regressão linear mediante um programa de computador. Os valores Ki são a média de, pelo menos, três medições, o desvio padrão foi inferior a 25%. 26

ΕΡ 1 453 852 /PT Fónnuia Design. Κί[μΜ] Píastnina Ki ffiMJ Trombina kí I [nM] FXa Ki [μ·Μ1 oPA /r^-co T NH WX- 508 >200 >350 0,034 ΛγίΛ ° 1 J HO"' HSN_,NH X iil Tu * wx- C304 no mh *) γΥΑΥτΤ Ò° HoJ WX- €292 no mh, *) 0 j ] HO" Η*Ν-^χΝΗ T NH (ΎΤ1 ? ie WX- C306 4,1 /ύίΛ A,0 j HO" Ih o LXn T f °x ’ * wx- j C308 1 >20 27

ΕΡ 1 453 852 /PT

Formata Design. Ki £μΜ] Plasmina Kí [|i.M] Trombina Kí [μΜ] FXa Kí tliM] uPA o o H,«wNM LJ 1Γ * NH WX- C310 2,0 Η/ίγΝΗ *· NH WX- C312 1,4 HJí---«H nc WX- C314 no inh. *) /y^VV^QI o íí |*| HO~* X WX- C320 >20 rVVyYS5 I ] HO'·'* Η,Ν^ .HH Y m WX- C322 | .................... >20 28

ΕΡ 1 453 852 /PT Fórmuis Desiga Ki [μ,Μ] Piasmirsa <3 ΪΙ ^ o $£ H Ki [μΜ} FXa Ki [μΜ] uPA χΥύΥυ*τοΛη ò0 M°J hjí^Jíh m wx- C324 3,1 ΛτΛΥτΧ) 1 l hcH η,ν^νη * X WX- G326 > 20 ιν»νΛο [f J HO"* jf T Η,ΝγΝΗ * NH WX- caae > 2õ ήτΑν-η, IjíJ H O Η,Ν. JíH X wx* C330 >20 jV^VCO H Η,Ν-yNH WX- C332 >20 29

ΕΡ 1 453 852 /PT FôfmtJÍ8 Design, Ki [μΜ] Píasmina Kí [μΜ] Tramijina Kí [μΜ3 FXa Ki [μΜ] uPÁ J 8 8 x XI rrsjTTj Y NH wx- C334 >20 jVA Λ 0 \\ 1 hcH X Vy\ 0 * WX- C336 13,1 rVA /SX ° { ΗΟ"^ H*N- .NH I Η Η Γ /ΝνΆ TtX ^ Br * WX-0 338 >20 /r/ ! A. ° I H0~ H^í^NH I Η H Γ Y π 0 A WX- C342 4,9 jC σ ^ [ 0* ~*Υί o jf ho-' CA HjNvJh X wx- C298 0,45 30

ΕΡ 1 453 852 /PT Fórmuia Design. Κί [μΜ] Piasmms Ki [μΜ] Trombina Ki [μΜ] FXa Ki [μΜ] uPA /yY^ky 1^1 HO X NH WX- C298 0,16 /τΛΧ í 1 HO-' S Η,Ν^ΝΗ ΊΓ ·* NH WX- C300 0,27 γ"υίΛ jf^Sj 0 hcH T NH JLj* o4$S ^ •k WX-C302 0,5 Α^Λλ·*0 jfl f Ϊ í Y0**^^S«, O j w * 1 | HG-* HjN. ,NH T NH W X-C 316 no inh, at 100 μΑΙ *) no inh. at 100 μΜ *) 32,4 0,09 A -Λ. r y^b ,Α, ° II HO" Kj? Η,Ν* ,HH Y NH 1 wx- ΛΥΧ. Γ Μ 1 | no inh aí 100 pM*) no inh, at 100 μΜ *} 36 0,047 31

ΕΡ 1 453 852 /PT I— ' ! Fòrmute Design. Ki [μΜ] Piasmina KÍ [μΜ] Trombina f f-"· .** I «33 I 2 JkiL· L..... kí | [μΜ] | a PA ff| HO-* X WX-C 340 no ính. at 100 μΜ *} no ính, at 100 μΜ *) 34 0,01 rV^VnT Aj δ mJ 0 ^oh ¥ * NH WX- 571 14,7 XAÍrVíXí T Η,Η,^ΝΗ nk WX- 532 40 m ính. at 100 μΜ *) 0,016 iVrV&O tT^ Hcr Ύ NH WX- 538 130 > 100 >100 0,041 IX JUl ΧΪ \J^-O HjN- NH Y NH wx- 544 no inh. at 100 μΜ *) 0,83 32

ΕΡ 1 453 852 /PT Fórmula Design. Kí ίμΜΙ Plasmína Kí ;μΛ'*| Trombina Ki &*M] FXa Kí :[μΜ1 uPA A^k-o Η/ίγΙπ ÍÍH WX- SSÔ 2,5 >50 > 100 0,10 A» "* SJ ° kAa h4m^Jh NH wx- 582 0,01 Α'ό^ο 1 j Hjíf Η,Ν^,^ΝΗ ΊΓ * ífH WX- M8 0,15 /T^PQ f I I γ o^o^V^j Η,ΝγΑπ NH WX- M5 0,5 33

ΕΡ 1 453 852 /PT Fórmula Design. Ki {μΜ] Plasmina Ki [jjlMJ Trombina Ki mi FXa Ki [μΜ] uPA WX- 568 > 1000 > 1000 2,1 HNvJH, T * NH WX- 600 2,1 * » exemplo comparativo) *} no ính. = nâo há inibição *} no ính. at = não há inibição a

Exemplo 15

Inibição in vitro de urocinase através de WX-508

Para determinar a actividade inibidora de uPA, foram incubados 200 μΐ de tampão Tris (0,05 mol/1, contendo o inibidor, 0,154 mol/1 de NaCl, pH 8,0), 25 μΐ de substrato (Pefachrome uPA ou ΒΖ-β-Ala-Gly-Arg-pNA em H20; Pentapharm LTD, Basel, Suiça) e 50 μΐ de urocinase (Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden, Alemanha) ou uma outra protease correspondente, a 30°C. Após cerca de 30 minutos e 30 ciclos, determina-se a absorção aos 405 nm por meio de um Mikroplate Reader (Mediators PHL, Aureon Biosystems, Viena, Áustria). Os valores Ki foram determinadas de acordo com Dixon, através de regressão linear mediante um programa de computador. Os valores Ki são a média de, pelo menos, três medições, o desvio padrão foi inferior a 25%. Κι (μΜ) 0,04 > 1000 > 1000

Urocinase

Plasmina

Trombina 34

ΕΡ 1 453 852 /PT

Exemplo 16

Experiências de cultura celular (Ensaio Caco)

Foi examinado o transporte dos compostos WX-508, WXC-316, WXC-318, WXC-324, WXC-340, WX-532, WX-538, WX-550 e WX-582 através de monocamadas celulares Caco-2. Neste ensaio, os compostos mencionados foram avaliados em relação à sua biodisponibilidade após aplicação oral. 16.1 Arranjo do ensaio 16.1.1 Cultura celular: Células Caco-2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, Estados Unidos) são cultivadas em Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) (Life Technologies, Gibco BRL, Reino Unido) contendo 10 % vol/vol de soro de feto de vitela (FCS) desnaturado termicamente, 1% vol/vol de aminoácidos não essenciais, 160 U/ml de benzilpenicilina e 100 U/ml de estreptomicina (Sigma Chemical, St. Louis, MO, Estados Unidos). As células são mantidas a 37°C numa atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 com uma humidade atmosférica relativa de 90%. As células são cultivadas em balões de cultura de 25 cm3, sendo que o meio é substituído de dois em dois dias e as células são tripsinadas uma vez por semana. 16.1.2. Experiências de transporte e resistência eléctrica transepitelial (TEER)

Para ensaios de transporte, as células Caco-2 são cultivadas em membranas de filtro de policarbonato porosas com um tamanho de poros de 0,4 pm e um superfície de 4,7 cm2 em grupos de 6 cavidades (Costar Transwell, Badhoevedorp, Paises Baixos). As células são inoculadas com uma densidade inicial de 104 células/cm2 em cada filtro. Estas células são mantidas a 37°C numa atmosfera como a descrita anteriormente. O meio é substituído de dois em dois dias ao longo de três semanas.

No dia das experiências de transporte, o meio de cultura é substituído pelo mesmo volume de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) tamponada com HEPES 30 mM num pH 7,2 (meio de transporte) e as células são deixadas em repouso durante uma hora, para se equilibrar. A seguir, o meio apical é 35 ΕΡ 1 453 852 /PT substituído por 1,5 ml de uma solução que contém os compostos em HBSS/HEPES (10 pg/ml). As monocamadas celulares são incubadas durante quatro horas. No fim das experiências são retiradas amostras dos compartimentos apicais e basolaterais e utilizadas para a determinação quantitativa do transporte dos respectivos compostos. A resistência eléctrica transepitelial (TEER) é medida antes e depois da equilibração, utilizando um medidor Milicell ERS ligado a um par de eléctrodos para assegurar a integridade das monocamadas formadas nos filtros. A TEER é também medida no fim das experiências, para assegurar que a monocamada celular se mantenha coerente. São realizados ensaios de permeabilidade, utilizando 14C-manitol em cima de monocamadas de células Caco-2, através de adição de 1,5 ml da solução de 14C-manitol com marcação radioactiva em HBSS-HEPES (4 mmol/1 com um actividade específica de 0,2 pCi/ml) ao lado apical. São retiradas amostras dos lados apical e basolateral e, a seguir à adição de um cocktail cintilador, analisadas num contador beta. Todas as experiências foram realizadas três vezes.

Eis o fluxograma da experiência:

Tempo (h) 1 2 3 4 5 Equilibração Incubação com/sem compostos T T T TEER TEER TEER

Resultados:

Composto Quantidade em % no compartimento oasolateral WX-508 0,2 0,1 0,7 WXC-316 0,2 0,2 3,6 WXC-318 0,4 1,0 4,5 WXC-324 * 0,1 0,1 2,0 WXC-340 2,4 0, 2 0,1 WX-532 0 0 0 WX-538 0,2 0,2 0,1 WX-550 0 3,1 0,6 WX-582 0,4 3,1 5,2 ... Exemplo comparativo 36 ΕΡ 1 453 852 /PT 16.1.3 Resultados

As monocamadas celulares Caco-2 simulam o epitélio intestinal absorptivo humano e são uma ferramenta valiosa para o estudo do transporte transepitelial. Os valores TEER representam um controlo para a capacidade vital e coerência da monocamada e encontravam-se entre os 100% e 120%. TEER é definida como sendo o produto de resistência x superfície. A resistência reflecte a resistividade através de compostos densos (rota paracelular) e não através de membranas celulares (rota transcelular).

Os valores obtidos neste ensaio de transporte in vitro mostram que para os compostos ensaiados ocorre um transporte do lado apical da camada celular epitelial para o lado basolateral. Os resultados mostram que os compostos ensaiados apresentam um biodisponibilidade.

Os resultados obtidos para os compostos ensaiados são mais uma vez resumidos na tabela que se segue: 37

EP 1 453 852 /PT

Tabela: Determinação da constante inibidora, da especificidade biodisponibilidade oral

38 ΕΡ 1 453 852 /PT

39 ΕΡ 1 453 852 /PT

40

ΕΡ 1 453 852 /PT CM -3 1 2 g JJ Μ 1 á ^ 0/3,1/5,20,4 / 2,9 / 3,0 * tL s Á 2 <0 iO SS ^ e Έ ^ 1 e *— o &: £ Í1Í X ÍL Έ .d, 2 íU ^ c 3. «> 1— SS 2 K < 0. Hf j. 2 ** O o O (0 r~ O Design, w 05 ·? X 6 O Q 8 < s « co Ctt 0Í 9 X fl3 r* £ /3 § /“\ o w S W> /W"vn £ X3j O O w °n * *-a ω / »«·< \«o “^>1, 5¾. X o lô * S 6 /~~* s β*Γ A0 3CSS O ©ss/ O 3EX ^=o \«/ v~| / X aT •r~ 0> ID m V=/f 0 /yv> s °< o X3S X© -o JÉ-SE» \==o xv^TVi W/ \ * /^z 5. £

41ΕΡ 1 453 852 /PT 0> 04 ^ Ο ^ <0 Ο ^ Ο Τ"ο ο &α. 03 c 2S ε2 Η ΐβX U*

* £L £L 3 c ο> ο η

'Ό IL CSÍ 0?ο 2 > α£οuο CL£ ω X φ 42

ΕΡ 1 453 852 /PT *) no inh. = não há inibição *) no inh. at = não há inibição a

Exemplo 17 Testes in vivo

Dez candidatos a inibidor de uPA foram ensaiados em roedores, em relação à sua biodisponibilidade oral e cinética no plasma. Para este efeito foram realizados testes em ratos Balb/c femininos com uma idade de nove semanas e um peso de 17,6 a 18,5 g. Foram utilizadas as seguintes substâncias de teste, as quais eram derivados de guanidinofenilalanina com HC1 como contra-ião: MW incl. HC1 Ki uPA humana [μΜ] 1 WX-508 499 0, 034 2 WXC-316 544 0, 09 3 WXC-318 534 0, 047 4 WXC-340 533 0, 01 5 WX-532 513 0, 016 6 WX-538 513 0, 041 7 WX-550-Homo-Phe 603 0, 10 8 WX-582 564 0, 01 9 WXC-300 * 465 0, 27 10 WXC-298 * 559 0, 016 *... Exemplo comparativo

Os compostos foram aplicados no intervalo de 0,1 a 1000 mg/kg, em especial 0,5 a 500 mg, sendo mais preferido 3 a 300 mg/kg. A administração foi realizada nestes casos através de uma sonda estomacal. As amostras foram tomadas ao cabo de 20, 40 e 60 minutos.

Os resultados são resumidos na tabela que se segue: 43

ΕΡ 1 453 852 /PT

Substância de teste Dose mg/kg Momento em que s amostra foi Brada o jjjg/rntJ no swo 1a análise o {jsgfrnij no soro 2a análise 0 41.1 55,5 10 i.v. 10 4,3 4,7 30 0,7 0,2 20 0,3 0,3 WX-5Q6 30 orai 40 5,7 4,5 80 0,08 0,09 20 3,5 - 300 orai 40 7,5 8,3 eo 5,4 5,8 0 45,4 67,5 10 i.v. 10 12,4 14,3 30 2,7 2,6 20 0,5 0,6 WXC-316 30 oral 40 S.9 7,1 60 0,4 0,5 20 6,0 7,2 300 orai 40 21,3 32,1 60 5,3 5,8

44 ΕΡ 1 453 852 /PT

45

ΕΡ 1 453 852 /PT

SuteiSncte de (este Dose mg/Kg Momento era que a amostra foi tirada c fcgftnft m soro 1a aoálísè c Jjjgímt j ra> soro 2a anátisa 0 7,2 2,5 i.v. 10 0,7 30 0,02 20 0 WX-550 7,5 ora! 40 0 60 0 20 0 75 orai 40 0,3 60 0 0 11,5 2,5 i.v. 10 0,8 30 0,1 20 0 WX-582 7,5 oral 40 0 50 0 20 1 75 orai 40 0,7 60 0,4 0 66,2 10 í.v. 10 18,3 30 2,1 20 0,2 WXC-298 * 30 orai 40 0,4 60 0.1 20 17,0 300 orai 40 1.0,7 SO 7,0 0 94,4 10 i.v. 10 11,0 30 1,3 20 0,2 WXC-300 * 30 orai 40 0,2 60 0,2 20 1,5 300 orai 40 4,6 60 0,6 *» exemplo comparativo

Lisboa

Claims

ΕΡ 1 453 852 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Cloridrato de N- [ 2-(4-guanidinobenzenossulfonil- amino)etil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilamino-propionamida (WX-568), cloridrato de Bz-SCg-(D)-Ser-(Aza-Gly)-4-guanidino-benzilamida (WX-544), cloridrato de iV-(4-guanidinobenzil)-2-(3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilamino-propionilamino)-4-fenil-butiramida (WX-550), cloridrato de 3-nitrobenzil-sulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-C316), benzil- sulfonil-(D)Ser-iV-Me-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-53 8), N- [(4-guanidinobenzilcarbamoil)metil]-3-hidroxi-2-fenilmetano-sulfonilaminopropionamida (WX-508), 4-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-iV-Me-Ala-(4-guanidinobenzil)amida (WX-582), cloridrato de 4-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-C340), cloridrato de 3-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-C318).
2. Utilização dos compostos cloridrato de IV-[2-(4- guanidinobenzenossulfonilamino)etil]-3-hidroxi-2-fenilmetano-sulfonilaminopropionamida (WX-568), cloridrato de Bz-SC>2-(D)-Ser-(Aza-Gly)-4-guanidinobenzilamida (WX-544), cloridrato de N-(4-guanidinobenzil)-2-(3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonil-amimopropionilamino)-4-fenil-butiramida (WX-550), cloridrato de 3-nitrobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-C316) , benzilsulf onil- (D) Ser-iV-Me-Gly- (4-guanidinobenzil) -amida (WX-538), N-[(4-guanidinobenzilcarbamoil)metil]-3-hidroxi-2-fenilmetanossulfonilaminopropionamida (WX-508), 4- clorobenzilsulfonil-(d)-Ser-IV-Me-Ala-(4-guanidinobenzil)amida (WX-582), cloridrato de benzilsulfonil-(D)-Ser-Ala-(4-guanidinobenzil)amida (WXC-532), cloridrato de 4-clorobenzilsulf onil- (D) -Ser-Gly-(4-guanidinobenzil)amida (WX-C340), cloridrato de 3-clorobenzilsulfonil-(D)-Ser-Gly-(4- guanidinobenzil)amida (WX-C318) ou de sais destes compostos para a produção de um produto para a inibição selectiva do activador de plasminogénio de urocinase.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, para a produção de uma preparação farmacêutica para o combate de doenças relacionadas com uma sobreexpressão patológica de urocinase ou/e do receptor de urocinase. ΕΡ 1 453 852 /PT 2/2
4. Utilização de acordo com uma das reivindicações 2 ou 3 para a produção de uma preparação farmacêutica para o combate de tumores.
5. Utilização de acordo com uma das reivindicações 2 a 4 para a produção de uma preparação farmacêutica para o combate da formação de metástases.
6. Utilização de acordo com uma das reivindicações 2 a 5 para a produção de uma preparação farmacêutica que pode ser administrado por via oral, tópica, rectal, parentérica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, sublingual, nasal ou inalativa.
7. Utilização de acordo com uma das reivindicações 2 a 6, em que o agente é produzido na forma de comprimidos, drageias, cápsulas, peletes, supositórios, soluções, emulsões, suspensões, lipossomas, sprays para inalação ou sistemas transdérmicos, como por exemplo emplastros.
8. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 para a produção de uma preparação farmacêutica para inibição da urocinase em seres vivos.
9. Utilização de acordo com a reivindicação 8 para a produção de um medicamento para inibição da urocinase em humanos.
10. Preparação farmacêutica que contém uma quantidade terapeuticamente activa de um composto de acordo com a reivindicação 1. Lisboa,