PT1375647E - Derme artificial e respectivo método de produção - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DERME ARTIFICIAL E RESPECTIVO MÉTODO DE PRODUÇÃO"

Objectivo e campo de pedido

Esta invenção refere-se a uma derme artificial, preparada por coagulação de plasma com plaquetas, por adição de cálcio e na qual são embebidos fibroblastos ou outras células dérmicas. Como consequência, podem ser inoculados queratinócitos sobre a superfície desta derme artificial, o que a torna especialmente útil para o tratamento de queimaduras graves, úlceras crónicas, testes controlando a sensibilidade a diferentes produtos, etc. Pela utilização de células geneticamente alteradas, pode ser utilizada como um veiculo para terapia génica.

Antecedentes da invenção A pele é um tecido composto por duas partes, o epitélio ou parte externa e a derme ou a parte interna, sobre a qual o epitélio é posicionado. Estas duas partes têm caracteristicas claramente diferentes. Não existe praticamente nenhum tecido extracelular na epiderme, enquanto na derme este componente é claramente predominante em relação às células. A pele é um tecido que pode ser reconstruído por técnicas de engenharia de tecidos (Parenteau N, Sei Am, 280: 83 - 84, 1999). Nestas técnicas, em geral, o componente celular é gerado "ex vivo" por técnicas de cultura celular. Estas técnicas, começando com um pequeno número de células retiradas de uma pequena biopsia de 1 pele obtêm, num curto período de tempo, um grande número de células. Estas células expandidas "ex vivo" podem ser utilizadas para construir grandes áreas de pele artificial. A matriz extracelular não pode ser produzida por cultura celular mas é previamente concebida e fabricada no exterior do corpo. A matriz extracelular tem de ser capaz de proporcionar estruturas que facilitem a adesão das células dérmicas anteriormente cultivadas e estimulem o normal crescimento destas células. Sobre esta matriz artificial, as células começam a fabricar as proteínas normais que compõem a matriz dérmica natural e, ao mesmo tempo, degradam lentamente a estrutura original, de modo que, ao longo do tempo, esta matriz artificial é substituída por uma matriz extracelular verdadeira, completamente semelhante a uma natural. As células epiteliais anteriormente cultivadas (queratinócitos, no caso de pele) podem ser semeadas sobre esta matriz artificial onde, com novas técnicas de cultura celular, estas células são capazes de gerar uma estrutura que é muito semelhante ao epitélio normal de onde são originárias. Por outras palavras, um dos factores chave na engenharia de tecido de pele é a concepção de matrizes dérmicas que imitam as condições naturais do corpo tanto quanto possível e onde as células introduzidas são capazes de iniciar um complexo processo, cujo objectivo é desenvolver uma estrutura tão semelhante quanto possível à pele natural. 0 outro factor chave na engenharia de tecido de pele é a capacidade de a matriz dérmica facilitar o crescimento das células que são semeadas sobre a mesma. 0 desenvolvimento de matrizes dérmicas que encorajam o crescimento, tanto de células dérmicas como epiteliais significaria que seria possível cultivar grandes áreas de pele artificial a partir de uma biopsia menor. Isto é especialmente importante quando a pele artificial é para o tratamento de queimaduras graves, onde até 90 - 95% da área superficial total do corpo tem de ser 2 substituída, tão rapidamente quanto possível, utilizando as pequenas áreas de pele saudável que permanecem no doente. A ausência de matrizes dérmicas capazes de gerar estas grandes áreas de pele artificial a partir de biopsias menores é uma das limitações de matrizes dérmicas anteriormente descritas (Sheridan R e Tompkins, Burns 25: 97-103, 1999).

Existem diversos modelos de derme artificial. Alguns dos modelos anteriormente utilizados são resumidamente descritos abaixo:

Colagénio de tipo I de origem animal, visto que esta é a mais abundante das proteínas presentes na derme (Maraguchi T et al. Plast Reconstr Surg, 93: 537 - 544, 1994, Muhart et al. Arch Dermatol, 135: 913 - 918, 1999).

Sulfato de condroitina (Boyce S et al., Surgery, 103: 421 - 431, 1988) .

Nylon associado ou não a uma membrana impermeável Sylastic (Naughton e Mansbridge, Clln Plast Surg, 26: 579 - 586, 1999) .

Poli-láctico/poli-glicólido (Giardino et al., J Trauma 47: 303 - 308, 1999). Estes polímeros formam uma rede que actua como uma estrutura onde os fibroblastos pegam, crescem e são capazes de segregar proteínas de matriz dérmica normal.

Fibrina. Esta proteína, cujo precursor, fibrinogénio, é obtido de plasma humano, foi utilizada de diferentes formas na cultura de queratinócitos. A fibrina proporciona uma boa base para o crescimento de células epiteliais, portanto, esta proteína tem sido utilizada como um suporte inerte sobre o qual se cultivam queratinócitos (Ronfard et al., Burns 17: 181 - 184, 1991) (Broly et al., documento 3 ES2060803). A fibrina não interfere com o desenvolvimento posterior de uma ligação dérmica/epidérmica correcta entre o estrato da lesão e os queratinócitos cultivados. Em virtude destas caracteristicas, a fibrina tem sido largamente utilizada como um sistema de transporte para queratinócitos (Pellegrino et al., Transplantation 68: 868 - 879, 1999, Kaiser e Stark, Burns 20: 23 - 29, 1994). A fibrina e/ou os géis preparados após a coagulação de proteínas plasmáticas humanas têm sido utilizados como um veículo para transplante de células de pele anteriormente expandidas "in vitro" (Sadaki I, documento JP10277143). A fibrina pode ser, igualmente, utilizada como uma base dérmica para a produção de grandes áreas de pele cultivada (Meana et al., Burns 24: 621 - 630, 1998). Os fibroblastos embebidos em géis de fibrina são capazes de crescer. Ao mesmo tempo, estes fibroblastos actuam como autênticos indutores de crescimento queratinocitico, de modo que plaqueando um número muito limitado de queratinócitos cultivados sobre um gel composto por fibrina e fibroblastos, em 8 - 12 dias obtém-se um epitélio confluente estratificado que imita o epitélio humano normal. Esta capacidade dos géis de fibrina para o desenvolvimento de células epiteliais foi utilizada em outro modelo de pele artificial (Meana et al., documento P9701533). Além do mais, a fibrina pode ser utilizada na presença de outros componentes que aumentam a sua rigidez e facilitam a sua utilização como um suporte dérmico (Meana A., documento P9601684). Esta capacidade de os géis de fibrina e fibroblastos obterem grandes áreas de pele artificial a partir de uma biopsia de pele menor está ausente em modelos baseados em derme artificial com outras composições. A explicação para isto reside no facto de que 4 os géis à base de fibrina são capazes de imitar o mecanismo de reparação de feridas fisiológico (Martin P, Science 216: 75 - 81, 1997).

Contudo, a produção da matriz dérmica baseada em concentrados de fibrina é apenas uma imitação do processo fisiológico. 0 verdadeiro coágulo de fibrina que é formado como parte do mecanismo de reparação e defesa tecidular é à custa de plasma sanguíneo. Existem muitas proteínas na fracção sanguínea extracelular e uma delas, fibrinogénio, é o precursor solúvel de fibrina, a principal mas não a única proteína no coágulo. A fuga do plasma após a agressão de um tecido é uma das formas nas quais todo o processo de coagulação é iniciado. Quando a agressão ocorre e os produtos tecidulares entram em contacto com a pele, a denominada via de coagulação extrínseca é activada e o resultado final é a activação do precursor de trombina inactivo presente no plasma. Esta trombina começa a converter o fibrinogénio em fibrina e, eventualmente, em fibrina solúvel que, ligada a células sanguíneas, forma parte do coágulo de fibrina, a primeira etapa na cura e reparação posterior de uma lesão do corpo (Singer e Clark, N Engl J med. 341: 736 - 746, 1999) . Das células envolvidas na formação do coágulo, deve ser feita especial menção às plaquetas. Estas células são um importante depósito para citocinas, as substâncias responsáveis pela iniciação da resposta celular no processo de reparação final de feridas. As plaquetas estão, igualmente, envolvidas no desenvolvimento do coágulo de fibrina no interior das veias. Esta é a denominada via de coagulação intrínseca, na qual um estímulo provoca o desenvolvimento de agregação plaquetária que irá activar uma série de proteínas plasmáticas que, por sua vez, irão estimular outras por um mecanismo de processo de cascata. Finalmente, irá ter-se a trombina que irá começar a formar o 5 coágulo. Em ambos os processos, vias de coagulação extrínsecas e intrínsecas, a presença de iões de cálcio livres é essencial para completar o seu desenvolvimento, em virtude de algumas destas proteínas da via dependerem deste ião para serem activadas. Após a formação do coágulo de fibrina a partir do plasma sanguíneo, as citocinas, inicialmente libertadas pelas plaquetas, irão atrair outras células, tais como macrófagos, neutrófilos, etc., que irão começar a destruir o coágulo e substituir este tecido fibrinóide pelo tecido normal que existia antes da agressão. Estas células, por sua vez, irão fabricar outras citocinas que irão manter e controlar a resposta à agressão. Elas irão atrair fibroblastos dérmicos e células endoteliais para a ferida que irão completar a resposta de reparação. Estas novas células de reparação irão fabricar outras citocinas que irão atrair células epiteliais para a ferida, de modo a cobrir toda a sua superfície. Como consequência, as células epiteliais são capazes de fabricar muitas substâncias que provocam diferentes respostas celulares nas células dérmicas subjacentes. As células epiteliais têm, igualmente, um efeito catabólico no coágulo de fibrina, em virtude de necessitarem de penetrar e eliminar o mesmo, de modo a revestirem novamente a superfície da ferida (Singer e Clark, N Eng J Med. 341: 738 - 746, 1999) . Depois de a lesão ter sido coberta pelo epitélio, o processo de cura está completo.

Pode considerar-se que a reparação fisiológica de uma ferida é baseada num coágulo de fibrina rico em citocinas plasmáticas, com base no fibrinogénio dissolvido no plasma. Este coágulo irá começar a resposta de reparação primária do corpo e irá induzir as células epiteliais vizinhas a migrarem dos pontos mais próximos para a ferida e, finalmente, a fechá-la. Este processo de reparação tem limites e, quando a lesão destrói 6 completamente todas as células epiteliais presentes (queimaduras extensas e profundas), para que o processo se complete, é requerida uma quantidade artificial de epitélio, por meio de enxertos de queratinócitos cultivados, queratinócitos suspensos ou pele artificial cultivada (Navsaria et al., TIBTECH 13: 91 - 100, 1995) .

Se a origem de reparação de ferida estiver no coágulo de fibrina do plasma, é possível que um modelo de pele artificial, baseado na utilização de plasma humano como a fonte primária da matriz extracelular, seja altamente eficaz e proporcione um extraordinário encorajamento para o crescimento celular, visto que reconstrói as condições fisiológicas do processo de reparação de feridas do corpo.

Descrição da invenção

Esta invenção descreve o desenvolvimento de uma derme artificial baseada na utilização de plasma humano, como a base fundamental para a matriz extracelular. Este plasma humano é obtido por fraccionamento primário de sangue total e inclui plaquetas na sua composição. Os fibroblastos dérmicos anteriormente cultivados são ressuspensos no plasma e, após coagulação, produz-se uma derme artificial. Os queratinócitos expandidos "ex vivo" irão ser posteriormente semeados nesta derme artificial. Nesta derme artificial, os queratinócitos mostram um comportamento semelhante "in vitro" e em "in vivo" no processo de reparação de feridas. Eles aderem, migram e crescem de tal modo que, a partir de apenas algumas células, em 8 - 12 dias cobrem toda a superfície do gel de plasma e formam um epitélio estratificado. O resultado final é que a partir de um 7 pequeno número inicial de células obtém-se, dias depois, um tecido composto por duas partes, uma parte superior de células epiteliais estratificadas e uma parte inferior consistindo numa matriz extracelular, densamente povoada com fibroblastos.

Estes géis podem ser preparados para transplantação utilizando a técnica anteriormente descrita (Meana et al., documento P9701533) e fixando-os a um suporte sólido, de modo que possam ser potencialmente utilizados para tratar lesões de pele. Utilizando uma quantidade de gel superior à normal, estes géis podem ser utilizados sem fixação a um suporte sólido, o que reduz ainda mais as suas dificuldades de manuseamento e diminui o custo final. A transplantação desta pele artificial em animais experimentais mostra que é capaz de pegar quando colocada sobre uma ferida e que desenvolve, igualmente, todas as camadas normalmente verificadas em pele humana madura, incluindo o estrato córneo. Os estudos conduzidos até à data mostram, igualmente, que a epitelização perdura durante toda a vida do animal. Estes resultados experimentais sugerem que esta pele artificial pode ser utilizada na epitelização definitiva de doentes com queimaduras. A acessibilidade do material empregue nesta derme e sua manipulação simples, sugere uma importante redução do custo final do produto, o que tem sido um dos factores que tem restringido a utilização maciva de pele cultivada em terapia (Philips T J, Arch Dermatol 135: 977 - 978, 1999). A derme artificial que é o objectivo desta invenção consiste num gel produzido por coagulação de plasma humano com plaquetas, ao qual foram anteriormente adicionados fibroblastos 8 humanos cultivados. A coagulação é o resultado da adição de sais de cálcio.

Dependendo da concentração de fibrinogénio no gel, esta coagulação pode realizar-se na presença ou não de agentes que actuam como anti-fibrinolíticos e a sua adição é recomendada quando o fibrinogénio é inferior a 2 mg/mL de gel. 0 plasma é obtido por centrifugação leve de sangue total extraído por punção venosa, na presença de agentes anticoagulantes, de um modo preferido, agentes que quelam o ião de cálcio. 0 plasma pode ser, igualmente, extraído por plasmaferese.

Os queratinócitos podem ser, depois, semeados sobre este gel baseado em plasma e fibroblastos cultivados. Estas células, plaqueadas a uma baixa densidade sobre a superfície e cultivadas durante 8-12 dias, na presença de um dos diferentes meios que são utilizados para cultivar queratinócitos, crescem e são capazes de formar um epitélio estratificado. Esta pele, consistindo no gel de plasma/fibroblastos e no epitélio cultivado autólogo, poderia ser utilizada na epitelização definitiva de doentes com queimadura grave. Poderia ser, igualmente, utilizada com um epitélio do dador como uma cobertura temporária para queimaduras ou como uma terapia para úlceras de pele crónicas. Este sistema de cultura pode ser igualmente aplicado em outros epitélios humanos, com excepção de pele, gerando outros tecidos epiteliais, tais como mucosa oral, mucosa vesicular, etc.

Este protótipo poderia ser transplantado para uma ferida, pegar e epitelizar a lesão. 9

Este tipo de gel pode necessitar de ser fixado a um suporte sólido, de modo a permitir a sua utilização para transplantação. Este suporte poderia ser uma gaze, embebida ou não em vaselina. A gaze pode ser fixada ao gel por uma cola inorgânica inerte, de utilização clinica, ou outro sistema mecânico. Uma membrana de silicone pode ser, igualmente, utilizada como um suporte, caso em que poderia ser fixada por uma cola orgânica, tal como fibrina. Nestas últimas condições, este tipo de gel pode ser utilizado sem uma camada queratinocitica para cobrir temporariamente lesões de pele, proporcionando-lhes uma base dérmica.

As vantagens de plasma humano e géis de fibroblastos são como se segue: • A matéria-prima é fácil de obter. 0 plasma é produzido a partir de sangue humano total extraído por punção venosa, normalmente na presença de um cálcio quelante. Para se obter plasma a partir de sangue total é apenas requerida centrifugação. 0 plasma humano pode ser, igualmente, obtido de sangue total utilizando o processo de aferese. • Garantem rápido crescimento queratinocítico. Os fibroblastos crescem rapidamente dentro do gel de plasma e são capazes de aumentar o crescimento queratinocítico, mesmo quando os fibroblastos estão inicialmente a uma concentração extremamente baixa. Em géis de plasma e fibroblastos, estas células crescem segregando substâncias que as tornam autênticas células alimentadoras, estimulando e controlando o crescimento queratinocítico. Com a cultura 10 de queratinócitos sobre este tipo de gel, é possível produzir uma área total maior de pele cultivada do que por utilização dos métodos descritos até à data, apenas 3 a 4 semanas após realização de uma biopsia. • 0 gel não se retrai ou reduz a sua área superficial e volume total nos primeiros 30 dias de crescimento. • Iniciar a coagulação sem adição de uma proteína iniciadora

exógena (trombina bovina ou humana). O plasma humano, ao contrário de concentrados de fibrinogénio, tem todos os componentes da cascata de coagulação, incluindo a trombina que está presente na forma do seu precursor (inactivo), protrombina. A coagulação e, por conseguinte, a produção da derme artificial, pode ser realizada utilizando exclusivamente a via intrínseca, pela adição de cálcio e em presença de fosfolípidos de origem plaquetária (igualmente presentes, como mencionado na secção seguinte). A utilização desta via para coagulação significa que não existe necessidade de trombina exógena, a qual é requerida quando se trabalha com fibrinogénio concentrado. Pela utilização de plasma na presença de plaquetas é, agora, possível, pela primeira vez, que a origem de todas as proteínas na derme artificial seja proveniente dos doentes aos quais a derme irá ser, eventualmente, transplantada. • O enriquecimento de factores de crescimento de origem plaquetária. No gel produzido por coagulação directa de plasma está presente parte dos factores de crescimento e moléculas de adesão celular que está, igualmente, presente em géis de fibrina. Contudo, em géis produzidos por 11 coagulação directa de plasma, estão igualmente presentes citocinas plaquetárias, visto que uma fracção destas células está sempre presente após centrifugação. Pode, igualmente, enriquecer-se a fracção plaquetária do plasma por modificação dos parâmetros de centrifugação. A presença de plaquetas torna a presente derme muito rica em pdgf e TGF-B (Anitua E, Int Oral Maxillofac Implants 14: 529 - 535, 1999), ambos factores chave na iniciação da reparação tecidular (Marx et al., Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 85: 638-646, 1998). Tudo isto significa que os géis produzidos a partir de plasma humano e plaquetas e povoados com fibroblastos preservam e aumentam a capacidade de os géis de fibrina obterem grandes áreas de pele artificial cultivada, num período de tempo relativamente curto, o que os torna adequados para a cultura queratinocítica, de modo a tratar doentes com queimadura grave. 0 crescimento celular, tanto dos fibroblastos dentro de fibrina como de queratinócitos semeados sobre a superfície, é tão importante que é possível obter células suficientes tanto para o componente dérmico como o epidérmico, a partir de uma biopsia menor. Por outras palavras, o componente celular da presente pele artificial provém, exclusivamente, do doente a quem irá ser posteriormente transplantado. • Com a utilização de plasma, é possível produzir géis estáveis, a uma concentração de fibrinogénio muito baixa. A concentração de fibrinogénio requerida para que o gel mantenha a sua integridade ao longo da cultura pode ser inferior a 0,5 mg por mil. Mesmo a estas concentrações, os géis preparados a partir de plasma são estáveis e não são rapidamente digeridos pelos fibroblastos e queratinócitos 12 semeados sobre eles. Além do mais, se forem associados a um produto anti-fibrinolítico (aprotinina, ácido tranexâmico, ácido épsilo-aminocapróico), a concentração de fibrinogénio pode até ser inferior, de modo que a partir de 2 - 3 mL de plasma, pode obter-se até 70 - 90 cm2 de pele. A concentração plasmática total poderia ser reduzida ainda mais por associação do gel de plasma a um suporte sólido (vicril, ácido poláctico-poliglicólico, etc.). Outra vantagem destes géis (visto que são quantidades mínimas de plasma por cm2 de gel) é que é possível que o plasma utilizado na derme artificial seja proveniente do próprio/própria doente. A utilização de plasma a partir do próprio/própria doente, juntamente com a ausência de proteínas exógenas na derme, adicionada à possibilidade de todas as células na pele artificial provirem do próprio doente, é um dos novos aspectos desta invenção, visto que é possível, pela primeira vez, tratar grandes áreas queimadas com pele artificial na qual todos os componentes provêm do próprio doente, que é o tratamento de doentes com queimadura grave com pele artificial totalmente autóloga.

Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra um diagrama das operações requeridas para a transplantação de pele para um doente com queimadura grave, utilizando a derme artificial que é o objectivo desta invenção. 13

Descrição detalhada da invenção

Segue-se uma descrição de como obter os principais componentes da base dérmica. 0 plasma com plaquetas (2) é obtido de sangue (4) total. Este é extraído por punção venosa, na presença de um agente anticoagulante de utilização clínica, particularmente um agente anticoagulante que actua por meio de quelação da concentração de Ca++ ionizado no sangue total. 0 sangue (4) total pode ser obtido num dos sacos normalmente utilizados em hemoterapia ou, para pequenas quantidades, de sangue recolhido em pequenos recipientes do tipo Vacutainer®. 0 plasma com plaquetas (2) irá ser obtido por centrifugação a baixa velocidade, de modo a obter-se um plasma muito rico em plaquetas ou a velocidade elevada, de modo a obter-se um produto com uma concentração inferior destas células. Após a centrifugação do sangue, a fracção de plasma correspondente irá ser utilizada directamente, de modo a formar o gel ou ser congelada a -20 °C, para posterior utilização. Antes de ser armazenado, o plasma pode ser, igualmente, tratado com azul de metileno, de modo a inactivar possíveis vírus, se o plasma não for para ser utilizado num modo autólogo (obtido do doente a ser tratado). O gel é preparado a partir do fibrinogénio presente no plasma, utilizando a protrombina que está presente no próprio plasma, por adição de cálcio, de um modo preferido na forma de cloreto de cálcio, de modo a reconstituir os valores de cálcio iónico que estão espontaneamente presentes no plasma e que foram tornados nulos pelo citrato de sódio de EDTA, utilizados como agentes anticoagulantes. A fibrina é o principal componente estrutural no gel, mas não o único, em virtude de, neste modelo, 14 a fibrina estar covalentemente ligada à fibronectina plasmática. É, igualmente, importante salientar que existem muitas outras proteínas no plasma humano, albumina, globulinas, factores de crescimento, plasminogénio, etc., que estão envolvidas na produção e estabilidade do gel e no crescimento das células que são cultivadas no gel.

Podem ser utilizados fibroblastos humanos de diversas fontes: 1) Fibroblastos homólogos. Cultivados a partir de prepúcios obtidos de operações de fimose e/ou fibroblastos dérmicos de adultos saudáveis. 0 doente ou seus/suas representantes legais têm de proporcionar o seu consentimento. 2) Fibroblastos autólogos. Obtidos de biopsias (5) de pele extraídas de um doente (8) que irão ser utilizados exclusivamente na derme a ser implantada no mesmo doente. 0 gel é obtido como se segue:

Por um lado, os fibroblastos são ressuspensos num meio de cultura ou numa solução de cloreto de sódio a 0,9%. O volume de plasma é adicionado a esta solução, seguido do agente anti-fibrinolítico. Quando esta solução estiver pronta, é coagulada por: 1) Adição de uma solução cloreto de cálcio a 1%, dissolvida em cloreto de sódio a 0,9%.

Este método utiliza os factores de coagulação presentes no plasma que são activados pela presença de Ca. Este é um processo lento que irá, eventualmente, transformar a protrombina presente no plasma em trombina. Esta proteína irá, depois, actuar sobre o fibrinogénio, transformando-o em fibrina e, eventualmente, pela 15 acção de outros factores de coagulação, em fibrina insolúvel, a principal proteína estrutural na presente derme. A mistura é introduzida numa placa de cultura celular e deixada durante 30 - 120 minutos, a 37 °C, até que o gel se tenha formado por completo. No fim deste tempo, o gel tornou-se sólido e pode ser coberto com um meio de cultura completo.

Os géis produzidos são armazenados durante 14 dias, no máximo a 37 °C, numa incubadora de C02 a 5%, até serem utilizados para queratinócitos cultivados. Em condições de cultura normais, estes géis permanecem estáveis e aderem ao fundo da placa e não é observada qualquer retracção ou perda de volume.

Se o que é requerido é um crescimento de pele (7) completo, os queratinócitos (6) obtidos de uma cultura primária irão ser adicionados a esta base dérmica. Estas células podem ser cultivadas de formas muito diferentes, na presença de células alimentadoras, utilizando meios pobres em cálcio ou meios completamente definidos (Myers at al., Am J Surg 170: 75 - 83, 1995). Os queratinócitos (6) produzidos com qualquer destes sistemas podem ser utilizados nesta derme (1) artificial.

Assim que os queratinócitos semeados estejam pré-confluentes ou completamente confluentes, os géis estão prontos para utilização clínica e são preparados para transplantação. Isto pode ser feito pela sua fixação a um suporte que irá tornar possível o transporte do gel, sem qualquer perda ou quebra, para o local do transplante. Este processo de fixação não irá ser requerido para géis muito espessos. Em geral, quando é requerida uma grande área de crescimento queratinocítico num curto período de tempo (doentes 16 com queimadura grave), irão ser utilizados géis pequenos, requerendo um suporte (9) sólido para transplantação. As culturas para outras utilizações (úlceras crónicas) podem ser manipuladas e transplantadas sem este processo de fixação. Os géis irão ser fixados a este suporte sólido utilizando uma cola inorgânica de utilização clinica e aplicando suturas mínimas. Assim que a cultura esteja fixada ao suporte é separada, à mão, do fundo da placa.

Como uma fonte de plasma com plaquetas (2), utiliza-se sangue (4) humano total, extraído por punção venosa, na presença de agentes anticoagulantes.

Se o que é requerido é obter grandes quantidades de plasma a partir de um único dador, a extracção irá ser feita utilizando um saco de extracção de sangue de 450 mL, contendo uma solução anticoagulante/conservante (SAG-Manitol), que é normalmente denominado um conjunto de saco triplo. Após a extracção, o sangue total é centrifugado. Se for necessário um plasma rico em plaquetas (PRP), a centrifugação irá ser a, aproximadamente, 1500 rpm, durante 5 minutos, a 20 °C) . Se for necessário um plasma menos rico em plaquetas (PRP), a centrifugação irá ser a, aproximadamente, 2900 - 300 rpm, durante 10 minutos). Após centrifugação, o plasma resultante é separado por fraccionamento normal do saco de sangue. O plasma obtido pode ser utilizado directamente, tornando-o viralmente inactivo por tratamento com azul de metileno. Este plasma pode ser conservado durante, pelo menos, um ano a -20 °C.

Se o que é requerido são pequenas quantidades de plasma para pequenas áreas de derme, a extracção de sangue total irá ser realizada com tubos de vácuo estéreis (do tipo Vacutainer®) 17 ou outros modelos de características semelhantes, utilizando um quelante de cálcio em condições saturadas (citrato de sódio, EDTA), nas proporções recomendadas pelo fabricante, como uma solução anticoagulante. Pode ser, igualmente, utilizado outro género de agente anticoagulante, heparina sódica. Dependendo se é requerido PRP ou PPP, a centrifugação irá realizar-se a 160 g (PRP) ou 400 g (PPP), durante 10 minutos. A fracção de plasma com plaquetas (2) é removida do tubo, tentando não remover os glóbulos vermelhos. De modo a aumentar o rendimento da extracção de plasma, o sedimento contendo o resto da fracção celular é, depois, centrifugado a 3000 g, durante 10 minutos. No fim desta operação, o plasma é removido e misturado com o sobrenadante obtido da centrifugação anterior. Visto que este sistema de cultura irá ser, normalmente, utilizado na produção de derme a ser transplantada para o doente proporcionando o sangue (plasma autólogo), o tratamento com azul de metileno não é necessário.

Seja qual for o método escolhido para obter o sangue total e separar o plasma, o fibrinogénio dissolvido no plasma irá ser medido por um método comercial derivado do método inicialmente descrito por Kraus (multifibren® U, Dade Behring).

Diferentes linhas de fibroblastos (3) humanos irão ser obtidas de prepúcios humanos, obtidos após cirurgia de fimose programada ou de uma biopsia (5) de pele. A amostra é recolhida num meio de transporte (DMEM, soro fetal bovino a 10%, penicilina a 100 u/mL, estreptomicina a 100 pg/mL). No laboratório, é lavada três vezes em PBS estéril e cuidadosamente cortada em pedaços. É introduzida em 30 mL de solução de tripsina a 0,05% - EDTA a 0,02%, agitando simultaneamente a 37 °C. A cada 30 minutos, a tripsina é recolhida e trocada por 18 tripsina nova. A tripsina é neutralizada por adição de meio de cultura completo (DMEN, soro fetal bovino a 10%) . A operação é repetida até não se obterem mais células. As células obtidas são colocadas numa placa de cultura, a uma densidade de 100000 células por cm2 de superfície de cultura. O meio é trocado todas as 72 horas, até que as células estejam confluentes. Após confluência, estas células são tripsinadas e são preparadas culturas secundárias, numa proporção de duas placas de cultura por cada placa de cultura, na fase anterior. Quando as células mostram uma única camada de células semelhante aos fibroblastos (3), parte delas é congelada, utilizando uma técnica comum e são armazenadas em cryovials em azoto líquido. Os passos ideais para a utilização destes fibroblastos são entre o 4o e o 12°.

Quando os fibroblastos (3) humanos do mesmo doente (8) forem ser utilizados na derme (1) artificial, procede-se da mesma forma. A biopsia (5) de pele do doente (8) irá ser processada como descrito na secção anterior. Após a obtenção das células, parte delas irá ser cultivada em DMEM, soro fetal bovino a 10%, a uma densidade de 100000 células por cm2. As subculturas correspondentes irão ser preparadas até que se obtenha um número suficiente de fibroblastos (3) humanos para fabricar a derme (1) artificial de que o doente (8) necessita.

Os fibroblastos (3) humanos cultivados são tripsinados, contados e ressuspensos em meio de cultura para utilização imediata na derme (1) artificial.

Após a obtenção dos materiais básicos, procede-se ao fabrico do gel. 19 0 cálculo proporcionado é como utilizado no fabrico de uma base dérmica suficiente para uma placa de cultura de 75 cm2. Para outras dimensões, irão ser utilizados os mesmos valores, reduzindo-os ou aumentando-os em proporção à superfície da placa de cultura.

Preparação da derme (1) artificial: É preparada uma solução contendo, basicamente, meio de cultura, solução de cloreto de sódio a 0,9% e fibroblastos (3) humanos (entre 30000 e 250000 células). Se necessário, é adicionado o anti-fibrinolítico (10000 U de aprotinina, entre 5 e 20 mg de ácido tranexâmico ou 200 - 800 mg de ácido épsilo-aminocapróico) e, por fim, 1 mL de solução de Cl2Ca a 1%, dissolvida em cloreto de sódio a 0,9%. Após a mistura destes componentes, é adicionado o plasma humano com plaquetas (2) . O volume final é completado para 15 mL com mais ou menos cloreto de sódio, dependendo da quantidade de plasma utilizada. A solução é rapidamente introduzida na placa de cultura e espalhada, de modo homogéneo, sobre a superfície. A placa é deixada numa estufa de C02, a 37 °C, até que ocorra a coagulação e o gel polimerize. Com este método, o gel polimeriza muito lentamente. A concentração final aproximada de fibrinogénio no gel é entre 0,4 e 2 mg de fibrinogénio/mL de gel. Embora, em algumas condições, o plasma possa ser utilizado sem ser anteriormente diluído com cloreto de sódio, também a concentração de fibrinogénio poderia ser tanto como 4 mg/mL de gel. A concentração inicial de fibroblastos (3) humanos no gel pode variar consideravelmente. Em geral, é recomendada uma 20 concentração não inferior a 500 fibroblastos/cm2 de superfície de gel, embora possa ser maior. Um número inicial de fibroblastos de mais de 4000/cm2 não é recomendado em virtude de que, com concentrações superiores, os géis tendem a ser digeridos até ao 6°-7° dia de crescimento e não podem ser processados para transplantação.

Os queratinócitos são semeados sobre este gel a uma densidade extremamente variada (entre 1500 e 15000 células/cm2 de derme), dependendo da quantidade de crescimento requerida.

Os queratinócitos (6) empregues podem ser obtidos de uma cultura primária de uma biopsia (5) de pele. A cultura de queratinócitos (6) sobre este gel pode ser feita por qualquer dos sistemas de cultura de queratinócitos descritos acima, embora os melhores resultados tenham sido obtidos com meios suplementados com soro fetal bovino.

Quando os queratinócitos estão confluentes ou pré-confluentes, normalmente no 8o dia de crescimento, a folha é preparada para transplantação. A camada de pele (7) artificial tem de ser separada do fundo da placa de cultura, directamente ou fixada a um suporte sólido. A fixação a um suporte (9) sólido é necessária quando os géis não são muito consistentes (concentração inicial em fibrinogénio baixa, grandes áreas, etc.), o que significa que a sua utilização clínica não seria possível sem a sua fixação a um suporte sólido. Este processo consiste nos estádios seguintes: O último meio de cultura é removido e a placa de cultura é aberta. O gel é coberto com uma gaze estéril (revestida ou não com vaselina), de modo que a gaze cubra exactamente toda a 21 superfície do gel. É utilizado um escalpelo para separar os lados do gel da placa de cultura. Após a conclusão desta manobra, este irá ser fixado à superfície superior do gel (o lado onde estão os queratinócitos) por utilização de uma cola inorgânica (Cyanoacrylate, Histoacryl®, Braum ou outra de características semelhantes) . 0 cianoacrilato irá ser utilizado aplicando pequenas gotas aos bordos do gel e diferentes gotas de cola podem ser aplicadas no centro. Após a secagem da cola, é utilizada uma espátula para separar o gel da placa de cultura. A gaze ajuda a manter o gel, contendo a base dérmica e a camada superior de queratinócitos cultivados, inteiro. Este protótipo pode ser, depois, transportado, sem perder a sua integridade ou quebrar, durante mais de 16 horas. A Tabela 1 compara as características básicas da técnica anterior e da derme artificial que é o objectivo desta invenção. TABELA 1 TÉCNICA ANTERIOR (Sadaki) INVENÇÃO Plaquetas NÃO SIM Trombina SIM NÃO Fibrinogénio 60 mg/mL 0,5 - 2 mg/mL Fibroblastos 50000/cm2 < 4000/cm2 Tempo de cultura de gel 22 h 8 a 12 dias Crescimento celular no gel MÍNIMO SIM Queratinócitos 50000/cm2 1500-15000/cm2 Tamanho de biopsia X 83 X 1000 - 5000

Lisboa, 9 de Fevereiro de 2010 22

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método de obtenção de uma derme artificial compreendendo as etapas de: (a) obtenção de plasma com plaquetas a partir de sangue total; (b) adição de células de fibroblastos dérmicos humanos cultivados ao plasma com plaquetas; e (c) coagulação do plasma com plaquetas na ausência de trombina adicionada de um modo exógeno, por adição de sais de cálcio, resultando num gel embebido com células de fibroblastos dérmicos.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que os fibroblastos são adicionados a uma concentração inicial compreendida entre 500 e 4000 fibroblastos/cm2.
3. 3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o método compreende, adicionalmente, a etapa de semear o gel com queratinócitos.
4. 4. Método da reivindicação 3, em que os queratinócitos são cultivados, durante 8 a 12 dias, sobre o gel ou até que os queratinócitos estejam pré-confluentes ou confluentes produzindo, desse modo, pele artificial. 1
5. 5. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a concentração final de fibrinogénio no gel é entre 0,4 e 2 mg/mL.
6. 6. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o plasma, plaquetas, fibroblastos e queratinócitos são derivados do mesmo indivíduo.
7. 7. Derme artificial, compreendendo um gel de plasma humano coagulado, plaquetas e fibroblastos dérmicos humanos cultivados.
8. 8. Derme artificial de acordo com a reivindicação 7, em que os fibroblastos são fibroblastos homólogos ou fibroblastos autólogos.
9. 9. Derme artificial de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8 compreendendo, adicionalmente, queratinócitos.
10. 10. Pele artificial, em que a derme artificial de acordo com a reivindicação 9 compreende, adicionalmente, um epitélio estratificado.
11. 11. Pele artificial de acordo com a reivindicação 10, compreendendo uma parte superior de células epiteliais estratificadas e uma parte inferior consistindo numa matriz extracelular densamente povoada com fibroblastos.
12. 12. Pele ou derme artificial de qualquer reivindicação anterior para utilização em terapia. 2
13. 13. Pele ou derme artificial de acordo com a reivindicação 12, em que o plasma com plaquetas e/ou queratinócitos é derivado do doente em quem a pele ou derme artificial irá ser utilizada. Lisboa, 9 de Fevereiro de 2010 3