TWI258506B - Artificial dermis and method of preparation - Google Patents

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1258506 ——--- 五、發明說明（l) 目的及應用範圍： 本發明係指經添力Π鈣而在 凝塊而製成的一種人造皮，其^百血小板的情況下讓血漿 它皮細胞。接著，可將角所开^ 、埋置有結缔組織細胞或其 面上，使其特別能用於治療重：：，播，在延人造皮的表 對各種產品之過敏性的測試等、：用二=潰瘍’和控制 亦可用來當作一種基因療法：媒=用基因改變的細胞， 發明背景： 皮膚是種由兩部份構成的組織，即上皮或外部，與上 皮位於其上的真皮或内部。這兩部份具有截然不同的特 性。表皮實際上並無細胞外的組織，但這成分顯然主宰了 真皮中的細胞。皮膚疋種能以組織工程技術予以重建的組 織（Parenteau N.，Sci· Am.，28 0 : 83-84，1 9 99 )。就這 些技術而3 ’細胞成分大體上是以細胞培養技術在「活體 外」產生。從取自小裂皮膚活組織檢體之少量細胞開始的 這些技術，可在短期間内獲得大量的細胞。這些「活體 外」擴張的細胞可用來建立大面積的人造皮膚。雖然細胞 培養無法產生細胞外的基質，但它已事先在體外設計和製 造。細胞外的基質必須此提供促使原先培養之真皮細胞黏 附和刺激該等細胞正常生長的結構。在這人造基質上，細 胞開始製造用以構成天然真皮基質的正常蛋白質，同時它 們也讓原始結構退化，以便這人造基質會隨著時間而被與 天然者完全類似的一種真正的細胞外基質取代。原先培養

1258506 五、發明說明（2) 的上皮細胞（就皮膚而言，即為角皙 這人造基質上，藉助新的細胞培養細胞）可 該處產生一種與其起源之正常上皮 這些細 話說，由當知处τα日日α二皮極為類似的結 被播種在 胞就能在 構。換句 就是儘可能仿造人 能起動* 能與天然 素，則是 發出能對 甚小的活 表面面積 膚來更換 。缺乏可 真皮基 和 簡要說明 話說，皮膚組織工程的關鍵因素之 體的自然條件來設計真皮基質，若3就疋儘可 個複雜的過程時，其目的就在於開；出 ί f ί ί的結構。&膚組織工程的另-個關鍵因 /、皮基貝促使播種於其上之細胞生長的能力。開 真皮與上皮一者促進生長的真皮組織，表示可從 組織檢體培養出大面積的人造皮膚。對於身體雜 的9 0-95%，必須儘快用患者剩餘的小面積健康2 的重大灼傷，以這人造皮膚從事治療時尤其重要 «甚少活組織檢體來產生該等大面積人造皮膚的 貝，正疋别述真皮基質的限制之一（Sheridan R!. Tompkins ， Burns 25 :97-103 ，1999)。 人造皮模型共有幾種。茲將習用的一些模型 於後： 源自動物的I型膠原蛋白質。因為這是真皮所含各種 蛋白質中最豐富者（Maraguchi T.等人，Plast Reconstr. Surg.， 135:537-544，1994，Muhart 等人，Arch D e r m a t 〇 1，1 3 5 : 9 1 3 - 9 1 8，1 9 9 9 ) 0 硫酸軟骨膠（Boyce S·等人，Surgery，103 :421-431， 1 98 8 )。 結合或未結合到一種不透水S y 1 a s t i c薄膜的尼龍

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(Naughton和Mansbridge ，Clin. Plast. Surg.， 26 : 579-586，1 99 9 )。 t乳酸父酯/聚乙醇酸交酯（G i a r d i n 〇等人，J .

Trauma 47/ 303-308，1 99 9 )。這些聚合物形成二種網狀 物，以供當作可讓結締組織細胞植入、生長和能分離正& 真皮基質蛋白質的結構。 ^ 纖維蛋白。先質為纖維蛋白原的這種蛋白質，係從人 體血漿取得，並已採取各種不同方式用於培養角質形成細 胞。纖維蛋白為上皮細胞的生長提供良好的基地，因而這 種蛋白質冒被用來當作一種栽培角質形成細胞的惰性支^ (Ronfard 等人，Burns 17 : 18卜184 ， 1991) (Broly 等 人，ES2 0 6 0 8 0 3 )。纖維蛋白不會妨礙損傷基床與培養角質 形成細胞之間日後發展出正確的真皮/上皮結合。因為這$ 些特性，纖維蛋白已被廣泛用於當作一種角質形成細胞的 運輸系統（Pellegrino 等人，Transplantation 68 : 868-879 ， 1999 ’Kaiser和Stark ， Burns 20 : 23-29 ， 1994)。 纖維蛋白和/或人體血漿蛋白質凝塊後所製成的凝膠 體，已被用來當作一種運送原先「在試管内」擴張之皮膚 細胞的媒介物（Sadak I，JP 1 0277 1 43 )。 纖維蛋白亦可用來當作一種生產大面積培養皮膚的真皮基 底（Meana 等人，Burns 24 : 621-630，1998)。埋置在纖維 蛋白凝膠體中的結締組織細胞能生長。同時，這些結締組 織細胞具有如同角質形成細胞生長之可靠誘發劑的作用，

1258506 五、發明說明（4) 以致只要在由纖維蛋白和結締組織細胞構成之凝膠體上， 擺放數S極少的培養角質形成細胞，於g — 1 2日便獲得一 種與正常人體上皮相似的複層融合上皮。纖維蛋白凝膠體 可供發展上皮細胞的這種能力，也被用於另一人造皮膚模 型（Meana等人，P9701533)。此外，纖維蛋白可在存有增 進其剛性和促進其用途之其它成分的情況下，用來當作一 種真皮支托（Meana Α·，P960 1 684 )。纖維蛋白凝膠體和結 缔組織細胞的這種，可從小型皮膚活組織檢體獲取大面積 人造皮膚的能力，是以其它組分之人造皮為基礎的模型所 缺乏的。關於這點的原因在於，纖維蛋白為基礎的凝膠 體，能模仿生理性的傷口修補機制（Martin p.，Scie/ee 276 : 75-81 ， 1997) 〇 為模仿 部份的 胞外血 是纖維 的蛋白 個凝塊 觸時， 動所謂 把纖維 白，當 此為治 為基礎的真皮基質，僅 組織修補及防禦機制一 以人體血漿為代價。細 的纖維蛋白原 而，生產 該生理過 真正纖維 液部份有 蛋白的可 質。組織 過程的方 若是血聚 的外源性 蛋白原轉 其結合到 療及隨後 以纖維蛋 程而已。 蛋白凝塊 許多蛋白 溶性先質 遭受侵襲 法之一。 中所含的 凝塊途徑 化成纖維 血球時， 修補人身 臼〉晨縮物 可供形成 ，則是要 質，屬於 ，也是凝 後，血敷 發生侵襲 失活凝血 ，即最後 蛋白，最 即形成纖 體損傷的 其中一種

塊中的主 的漏汽即 和各組織 酵素先質 結果。這 後再變成 維蛋白凝 第一步（S 要會並非唯一 為開始進行整 產物與皮膚接 經活化，便促 凝血酵素開始 可溶性纖維蛋 塊的一部份， i n g e r 和

第10頁 1258506 五、發明說明（5) Π-k，N· Engl· Med· 34 1 :73"4 ;的：關細胞，，應特別提及的是血小板」此ί 胞活素的重要儲藏所， k二、，’ 4, ψ g ^^ 而細胞活素則是在傷口最後 矛王T負貝引舍、、、田胞反廣的私所 榜力轉V由Μ八Η …的物貝。血小板也涉及纖維 塊在f尹派中的發展。此與· π % 一 ^ ^ ^ ,, ^此舉稱為内源性凝塊途徑，其 一種刺激物去激發血小板繫隹 Α將疋△所、、工儿 」伋水木的發展，屆時將使一 血水蛋白貝活化，再轉而士 ％ $ 得而由该專蛋白質利用一種級 (cascade process)的機制去刺激其它的蛋白質。資 便獲得將開始形成凝塊的凝血酵素。在這兩種過程 外源性和内源性凝塊途# ’游離職子是完成其發 件，因為該等途徑的-些蛋白f依賴這種離子使其 從血液的血漿形成纖維蛋白凝塊後，最初由血小皮 細胞活素將會吸引其它的細胞，例如巨噬體、嗜中 球等，屆時它們將開始摧毀凝塊，並以在侵襲^已 正常組織取代這種擬纖維蛋白。接著，該等細胞又 造其它的細胞活素，以保持和控制對這侵襲的反應 會將真皮結締組織細胞和内皮細胞吸引到傷口處， 成修補反應。這些新的修補細胞會製造其它的細胞 並由其把上皮細胞吸引到傷口處，以覆蓋這傷口的 面。反之’上皮細胞能製造許多可在下方真皮細胞 同細胞反應的物質。上皮細胞也對纖維蛋白凝塊具 代謝的影響，因為它們需滲透和消除該凝塊，以便 佈傷口 的表面（Singer 和 Clark，N. Eng. J Med. 7 3 8〜7 4 6，1 9 9 9 )。一當損傷處被上皮覆蓋時，治療 形成凝 胞是細 修補過 蛋白凝 中係以 系列的 聯過程 ί後， 中，即 展的要 活化。 釋放的 性白血 存在的 轉而製 。它們 由其完 活素， 整個表 激發不 有分解 重新塗 341 : 過裎即 I2585〇6 五、發明說明（6) 完成。 傷口的生理性 維蛋白凝塊為基礎 白原為基礎。這凝 發附近的上皮細胞 口閉合。然而，此 有存在的上皮細胞 皮，以培養角質形 的移植來完成這過 91-100 ， 1995)。 如果傷口修補 那麼基礎在於以人 造皮膚模型，因為 條件，所以可發揮 教勵。 >補可認為是以富含血滎細胞活素的纖 换:這凝塊則以溶解於血漿中的纖維蛋 動身體的初步修補反應，並將誘 ':取接近傷口的各點移動，最後將傷 =補程具有限度，當損傷完全摧毀所 二見又深的傷口），即需大量的人造上 f細胞，懸浮角質形成細胞，或人造皮 %(Navsaria 等人，TIBTECH 13 : 的起端在於取自血漿的纖維蛋白凝塊， 體血裝當作細胞外基質之初步來源的人 ^建了身體傷口修補過程的各種生理性 n度效用’和能對細胞生長提供額外的 發明綱要說明： 礎$ t η兄明使用人體血漿作為細胞外基質的根本基 展人造皮的情形。人體血浆係對全血進行初步 1Γ &在其成分中包括血小板。讓先前培養的真皮 、、、〇締組織細胞重新縣、、采 尺 0厂坷心/予在血漿中，等凝塊後，即產生一種 7 . 體外」擴張的角質形成細胞隨後將被播種在 §g . , m ^ 、迈人&皮上，角質形成細胞「在試管中」 顯現出如同傷口体雜讲扣「 ^復過長「在體内」類似的行為。它們的 第頁 1258506 五、發明說明（7) 黏連、移動及生長方法是從幾個細胞開始，接著在8到1 2 曰就覆蓋血漿凝膠體的整個表面和形成複層上皮。結果經 過幾日後，我們便從最初的少數幾個細胞獲得一種由兩部 份構成的組織’即上部的複層上皮細胞，和由佈滿稠密結 締組織細胞之細胞外基質組成的下部。 採用前述技術（Meana等人，第P9 70 1 53 3號專利）和將 這些凝膠體固定到一固體支托上，即可將其製備以供移 植’因而能用於治療皮膚損傷。這些凝膠體如採用大於平 常的用量，則不必固定到固體支托上就可使用，以致更進 一步的降低處理的困難度，和減少最終成本。在實驗動物 身上移植這種人造皮時，顯示出若將它置於傷口上即能植 入’而且能發展出成人皮膚上通常可見到的所有各層，包 括角質層。迄今所完成的各種研究也顯示出這種上皮的形 成可持續到動物的整個生命期限。該等實驗結果表示這種 人造皮亦可用於灼傷病患的永久性上皮形成。 一這種皮所用材料的易於取得性，及其簡易的操控性， 表示產品最終成本可大幅降低，而成本正是人工培養皮受 到限制不能廣泛用於治療上的一個重要因素（phiUps τ. ·’ Arc= Dermatol 135 :977-978 ， 1999)。 Λ月的人k皮係在存有血小板且事先已添加人工培 、二5 ί締組織細胞的人體血漿，、經凝塊後產生的-種 ! . t 成。凝塊是添加鈣鹽的結果。或者，亦可利用 外源性凝血醮去只# ^ 京及舞離子而使血漿中含有的纖維蛋白原轉 化艨以產生凝膠體。

1258506 ------ 五、發明說明（8) 視凝膠體中、 存有或未存有抗^纖維蛋白原的濃度而定，這種凝塊可在 體所含的纖維；^纖維蛋白原溶解劑時發生，但每m 1之凝膠 血漿是在f白原如低於2 mg時，建議添加。 下，以靜日if办^有且為能使鈣離子螫合之抗凝劑的情況 外，亦取全…輕度離心分離而取得。另 二/矛】用血聚分離法抽取血漿。 養結締組織細胞^ =成細胞播種於這個以血浆及人工培 細胞生長的另_為基礎的凝膠體上。在存有促使角質形成 工#養广1 2 θ μ不同媒介物的情況下，按低密度編排及人 Γ:ί種由這些細胞，即會生長並能形成-種複層上 组成的由廣，水結締組織細胞凝膠體與自體培養上皮所 它也可以：Γ ::用於重大灼傷患者的永久性上皮形成。 = ί =膚潰瘍。除了皮膚外，心上也 口腔黏膜、泡狀黏膜㊁。產生其它的上皮組織，例如 皮。這種原型可供移植到一個傷口，植入而使損傷生成上 ，種凝膠體可能需要被固定到一固體支托 用^移植。這支托可以是個浸漬或未浸潰凡士林的吵$ 布固定到凝勝體上。石夕薄膜亦可用來當作支托，尸^ = 諸如纖維蛋白之類的有機黏合劑從事固定。就後者而=用 不需為了提供真皮基底而用結缔組織細胞層把皮膚損：處

第14頁 !258506 五、發明說明（9) 這種凝膠體。 ，細胞凝膠體的優點 水通常是在存有螫 而產生。只需採用 用分離性輪血程序亦 =迅速生長。縱然結 月匕在血漿凝膠體内迅 $長。在血漿和結締 日才會分泌出讓它們變 控制角質形成細胞的 細胞’若與採行習用 只要3到4個星期，就 如下： 合鈣的情況下 離心分離法便 可從全血取得 缔組織細胞開 速生長，以致 組織細胞凝膠 成真正餵食細 生長。在這種 方法者相較， 能產生總面積 前30日内不會收縮或減低其表面面 暫時覆蓋住，即可使用 人體血聚與結締組 1. 原料易於取得。 以靜脈穿刺抽取人體全 可從全血取得血漿。使 人體血漿。 2. 確保角質形成細 始的濃度極低，但它們 能促進角質形成細胞的 體中，該等細胞於生長 胞的物質，因而刺激與 凝膠體上培養角質形成 則於執行活組織檢查後 更大的培養皮膚。 3 ·凝膠體在生長的 積與總容積。 4 ·真皮結缔組織細胞可用另一來源的細胞取代。在用 血漿製成的凝膠體中，結締組織細胞的功能可用其它細胞 取代。骨髓中找到的間質幹細胞（Young等人，j. ^^thQ i Res· 16 ; 406 - 413，1996)若被埋置在這些凝膠體之内 時’即可發揮如同結締組織細胞的作用。其它也能增進角 質形成細胞之生長的細胞是内皮細胞。使用皮膚以外其它 不同部份所取得的真皮細.胞，是種新的可行辦法，尤其對 難以取得可供細胞開始生長之皮膚的重大灼傷患者來說。

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或人體凝血酵素） 五、發明說明（10) 5 ·不需添加外源性酵母蛋白質（牛 即 凝 可促發凝塊。不同於纖維蛋白原濃縮物， … 塊級聯（cascade)的所有成分，包括以’所人體血漿具有 者）存在的凝血酵素，即凝血酵素原。、八貝形式（失活性 自血小板的磷脂體（也存在，如後文所^加^和在存有源 源性途徑（intrinsic pathway)即可/日守’則只運用内 1 J運扞；耗秘 ^ 人造皮。使用這種凝塊途徑表示不㊉ * ’因而產生 為它是在與濃縮的維維蛋白原一起、靈 ’、/旋血酵素，因 有血小板的血漿，如今第一次能讓人造τ σ而要。利用存 的起源來自最後會把這皮移植至其本s s t S所有蛋白質 6 ·強化源自血小板的各種生長因子 ^

塊所產生的凝膠體中存有-部份在纖維蛋白凝J 有的生長因子與細胞黏著分子'然而，在由直接血！；； 之血漿所產生的凝膠體中也存有血小皮細胞活素，因為這 些細胞有一部份在離心分離後始終存在。另外也可修改離 心分離參數，據以強化血漿中的血小板部份。存有血小皮 時，皮便極富含PDGF 和TGF-B (Anitua E.， Int. Oral Maxillofac Implants 14 :529-535，1999)。開始進行組 織修補的這兩種關鍵因素（Marx等人，Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Radiol Endod·， 85 :638-646 ， 1 9 9 8 )。這全表示由人體血漿和血小板產生並佈有結締組 織細胞的凝膠體，可保持與增進纖維蛋白凝膠體的能力， 以便在相當短的時間内獲得大面積的培養人造皮膚，並使 它們適於培養角質形成細胞，以供治療重大灼傷患者。在

第16頁 1258506 五、發明說明（11) 纖維蛋白内之結締組織細胞和播種於表面上之角質形成細 胞這二者的細胞生長非常重要，以致可從甚小的活組織檢 體取得足夠用於真皮及表皮成分二者的充分細胞。換句話 說，本發明之人造皮的細胞成分完全來自日後將對其移植 的患者本身。 7 ·因為使用血漿，所以可用極低的纖維蛋白原濃度產 生穩定的凝膠體。使凝膠體在整個培養期間保持其完整性 所需的纖維蛋白原濃度可以低於千分之〇 · 5 m g。縱然在這 此 些濃度條件下，由血漿產生的凝膠體仍穩定 ，g 組織細胞和播種於其上的角質形成細胞迅速消化掉〜 外’如果它們被結合到一種抗纖維蛋白原溶解劑時（抑胰 月太酵素（aprotinin)，抗血纖溶環酸（tranexamic acid) ’e~ 氨基己酸（epsyl〇n- aminocaproic acid))，纖 維蛋白原的濃度甚至可更低，以致從2-3 ml的血漿便可獲 得高達7 0 -90平方公分的皮膚。若使血漿凝膠體結合到一 固，，托時（vicryl，p〇lactic-聚乙醇酸等），血漿總濃 度就可進一步減低。這些凝膠體的另一優點（因為每一平 的血漿用量極少)是它能讓人造皮所用的 中身。使用來自患者本身的血聚，連同這皮 串、者太I，蛋白質，再加上人造皮膚的所有細胞都能來自 二 ，即為本發明的眾多新面向之一，因為^_ 次能以所有成八认+ ^ ^ U馬k疋弟一 部位，亦即利：f來自心者本身的人造皮膚去治療大灼傷 因為這此、疑=全的自體人造皮膚治療重大灼傷患者。 二峰膠體的生物特性，它們可用來當作各種細

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胞（結締組織細胞或其它細胞種，包括基因改變的細 ^托，和能產生可用於不同疾病的蛋白質（内皮生長因子 專）。 發明詳細說明： 以下是如何取得皮基底各主要組分的說明。 從全血（4)取得含有血小板的血漿（2)。這是在 床用抗凝劑的情況下，尤其是利用全血（4)中離子化鈣/ 縮之螯合作用而發揮效用的抗凝齊卜以靜脈穿刺所抽取辰

=可從出血治療（ha_therapy)常用的—個血 衣中取付，或需用數量較少時，可從VacutaUerR 容=1的血來取得。帶有血小板的血襞⑺是以離心 为離法取付’若欲取得富於血小板者即採用低速，而如欲 取得浪度較低的產物時，則採用高速。 :離時Μ更將相關的血裝成分直接用於形 ：：：： -咖的^度下冷束，以便日後使用。儲存前，血裝如^ 二：用，時準備治療的患者身上取得），則可先用 ^U Υ 6 6)處理這血漿，使可能的病毒失去 凝膠體是從血襞中所含有 疋利用人體或牛的凝血酵素及 本身所含有的凝血酵素原，經 以便重建可在血漿中自發存在 fe四醋酸（E D T A)的檸檬酸納使 的纖維蛋白原製成，其方法 妈離子的作用，或只用血漿 添加宜為氣化4弓形式的i弓， ’但已被當作抗凝劑之乙二 其失效的離子鈣值。纖維蛋

第18頁 1258506 五、發明說明（13) 白是凝膠體中的主要結槿έ八 1王罟、、α構組分，但卻不是唯一的一種，因 :纖維蛋白係被共價結合到原漿纖維連結蛋 ξ。m:出的一個要點是，人體血漿蛋白素，球蛋 質，會影響到凝膠體的中运有許多其它的蛋白 之細胞的生長。 產和穩定性’以及凝膠體中培養 ^'使用的人體結締組織細胞，其來源有下列幾種： j ^同種結締組織細胞。係由取自包莖手術之包皮和/ :健康成人的皮結缔組織細胞培養而&。患其法定代 表人必須表示同意。 :)自體結締組織細胞。係從患者⑴的皮膚活組織檢 體⑸爾，其專供用於準備移植到同一患者的皮。 凝膠體的取得方式如下： 化叙二f士使結締組織細胞重新懸浮於培養基或〇.9%氯 、容解:^ °把血漿添加到這溶液，再添加抗纖維蛋白 ς解劑。^溶液準備妥時，可用二種不同方式使其凝 二種溶解於〇·η氯化納中的1%氯化納溶液。 個單位之間)σΓ#溶解於40 raM氯化每中的凝血酵素（2到4 第一種方法係採用血漿中所存有，並因鈣的 〃、活化的凝塊因子。這是一種最後會將血漿 ：而使 血酵素原轉化成凝血酵素的緩慢過程。接】有之綾 對纖維蛋白原起㈣，使其轉化成纖d;白質將 *蛋白最後再經由

1258506 五、發明說明

其它凝塊因子的作用而轉化成不溶解性纖維蛋白，亦即 發明之皮的主要結構蛋白質。 第二種辦法是把凝塊酵素直接添加到血漿，因而過程 加快許多。對照之下，如把人或牛的另一種蛋白質添=至7 這產品，就會導致與各種疾病傳染有關的問題。 把這混合物導入一個細胞培養皿中，於3 了。c的溫产條 件下靜待3 0到1 2 0分鐘，直到完全形成凝膠體為止。等 時間結束時，凝膠體已變成固體，可用一種完全的培養A 覆蓋。 〇 土 所生產的凝膠體在被用於培養成的角質形成細胞之 前’係於5 %二氧化碳的培養器（i n c u b a ΐ 〇 r)中以3 7。C的溫 度儲存’但最多不得超過14日。在正常的培養條件下，這 些凝膠體始終保持安定和黏附在培養亚的底部，並未觀察 到退縮或容積損失的情形。 所需要的若是完全的皮膚（7)生長，便把取自初級培 養的角質形成細胞（6 )添加到這皮基底。在存有飼養細胞 的時’可用鈣量低的培養基或完全限定的培養基而以各種 大不相同的方法來培養該等細胞（Myers等人，Am. J.

Surg 170 ; 75-83 ’1995)。以這些系統中的任一種所生 產的角質形成細胞（6 )均可用於這種人造皮（丨）上。 一當播種的角質形成細胞即將融合或完全融合時，凝 膠體便可供£?σ床使用，和準備移植。完成此舉的方法是把 匕們固定到一支托上，以致能在不損失凝膠體或不使移植 部立破裂的情況下運送該等凝膠體。若是凝膠體非常厚

第20頁 1258506 五、發明說明（15) 日^ ’就不需要這種固定過程。大體上，如需在短時間内讓 角質形成細胞從事大面積的生長（重大灼傷患者），就要用 小型凝膠體，因而需要固體支托（9 )以便移植。至於其它 用途（慢性潰瘍）的培養物，在處理及移植時則不需這種固 定過程。凝膠體係以一種臨床使用的無機黏合劑，再施用 極少量的缝線而被固定到這固體支托（9)上。一當培養物 被固定到固體支托（9)上，即用手使其與培養皿的底部分 開。 作為含有血小板之血漿（2)的一種來源，所用的人體 全血（4)係在存有抗凝劑時以靜脈穿刺所抽取者。 如需從單一捐贈者取得大量的血漿，即使用一種裝有 抗凝塊/保鮮溶液（S A G - M a n i t ο 1)，通常稱為三袋組 (triple bag set)的450 ml抽血袋來進行抽血。一當抽取 完時，便對全血進行離心分離。如需富含血小板的血漿 (P R P) ’則在2 0。C的溫度條件下，以大約1 5 〇 〇 Γ p m的轉速 進行5分鐘的離心分離。若需較不富含血小板的血漿 (PPP)，就以大約2 9 0 0 -3 0 0 0 rpm的轉速進行10分鐘的離心 分離\經離心分離後，再對血袋從事正常的分離，以便分 出所獲知的血槳。這血漿可供直接使用，以亞曱藍處理便 可使病毒失去活性。這種血漿在—2 〇◦ c的溫度條件下可保 存至少一年。 ^ 所需者如為少量血漿，以供用於小的皮部位，即以無 菌真空管（VacutainerR式）或具有類似特性的其它同等 採用按R?、原廠建議比例、屬於飽和狀況的約螫合劑 1258506

五、發明說明（16) (檸檬酸鈉，EDTA)當作抗凝塊溶液來執行全血的抽取。 一種亦可採用的抗凝劑是鈉肝磷脂（s〇diuni heparin)。另 所需者究竟是PRP或PPP而定，離心分離分別以丨6〇 g 視 (PRP)或40 0 g (PPP)條件下進行1〇分鐘。從真空管取出* 有血小板的血漿（2 )部份，以求不取出紅血球。為增加血v 漿抽取量，再以3 0 0 0 g的條件對含有這血球部份的H斗 (pellet)進行1〇分鐘的離心分離。等這作業結束時，便將 取出血漿與前一離心分離所獲得的浮起物（supernata討）、 混合。由於這培養系統通常係用於生產準備移植到提供該 血液（自體血漿）之患者身上的皮，所以不需亞曱藍處理。 不論選用那種方法來取得全血（4)和分離出血^，均 將以出自Kraus當初所述方法而衍生的商用方式 (MumfibrenR U，Dade Behring)來測量溶解於血漿中 的纖維蛋白原。 從計劃性包莖手術之後取得的人體包皮，或從皮膚活 組織檢體(5 )’將可獲得不同種類的人體結締組織細胞 (3 )。樣本係被收集在—運輸媒質中（⑽龍，丨〇 %的牛胚沪 亡=二100 u/ml的盤尼西林，100 "g/ml的鏈黴素）。二 :驗’以無菌的PBS將它清洗三次，再仔細切成若干 在37%的溫度條件下將其導入30⑸的〇.〇5%胰 :隔：JriPSln) _ 〇,〇2%隨的溶液中，同時攪拌。 母隔30刀4里，便收集胰蛋白酵素和 基(_N，10%的牛胚胎血清）’使姨蛋白酵辛力中;= 這作業，直到不再獲得細胞為止。對於所獲得的細胞，以

1258506 五、發明說明（17) 每平方公分培養表面1 0 0, 0 0 0個細胞的密产將其置於 皿中。培養基每隔72小時換一次，直到細A胞融合\培養 融合時，便將這些細胞予以胰蛋白酵素化 ”、、 。等 (tipsinated)，並按照對前一階段各培養皿採用二 皿的比例進行第二次培養。當細胞顯現出一層盥社。養 細胞（3)類似的細胞時，就以習用的技術將豆」部伶a且織 凍，並將其儲存在液態氮的低溫瓶（cry〇vial)内。刀/ 些結締組織細胞的理想道數（pass)是在第4和第12 這 間。 準備把同一患者（δ)的人體結締組織細胞〇)用於 皮時’係以相同方式淮杆。电本f Q、Μ + 《人造 孫职1 ▲ U万式進仃患者（8)的皮膚活組織檢！ =π刖述程序處理。一當取得細胞時，便以每平方八體^5) 胎0血〇!°:細：的密度將其一部份培養刻_ f π中。製備相關的次培養物，直到取得足以製、生 (8)所需人造皮（1) k患者 止。 ^U)之充刀數1的人體結締組織細胞（3)為^ 化，= =締組織細胞⑺予以騰蛋白酵素 皮⑴。 〃重新芯汗在培養基中，以便立即用於人造 二，％基本材料時，便開始製造凝 如同在製造皮基底時所，。 公分培養皿的所需。至:法足夠-個75平方 值，僅按照培養 匕的尺寸亦將使用相同的數 人、生士 ,〇養之表面的比例予以增減而已 入仏皮Q)的製備·· 。

第23頁 五、發明說明（18) 製備一種溶液，該溶液基本上含有培養基，〇· 9%的氯 化鈉洛液和人體結締組織細胞（3 )(在3 〇，〇⑽到2 5 〇，〇⑽個 細胞之間）。如有必要時，即添加抗纖維蛋白原溶解劑 go,ooo單位的抑胰月太酵素，5到20 mg之間的抗血纖溶 裱酸或20〇-30〇11^的6-氨基己酸，最後是111]1的〇.〇41^一 鈣化一氯（C12Ca)溶液，其中已先溶解有2到4個國際單位 的凝血酵素。混合好這些組分時，即添加3到6 d之間帶 有血小板的血漿（2)(視纖維蛋白原的濃度而定）。視所用 的血漿量而定，完成的最終容積為15 ml，多少帶點氯化 鈉。將這溶液迅速導入培養里，並均質分散在其整個表面 上。接著以3 7°C的溫度將其留在二氧化碳烘箱中，直 生凝塊情形和凝膠體被聚合化為止。 x 作為使用外源性凝血酵素的另一種選項’凝膠 下列方式製備： 用 製備一種溶液，該溶液基本上含有培養基，〇 . 9% 化納溶液和人體結缔組織細胞（3)(在30,000到25〇, 2 細胞之間）。如有必要時’即添加抗纖維蛋白原溶解 (10, 〇〇〇單位的抑騰月太酵素，5到20 mg之間的抗血容 環酸或2 0 0 -3 0 0 mg的e-氨基己酸，最後是1 ml的溶於 9%氯化鈉溶液中的U —鈣化二氯（n2Ca)溶液。混人好丄 些組分時，即添加含有血小板⑺的血漿。視所用的口血將、 量而定，完成的最終容積為15 mi，多少帶點氯化鈉。ς 這溶液迅速導入培養JHI，並均質分散在其整個表面上。 著以3則溫度將其留在二氧化碳烘箱中，直‘發生凝:妾

第24頁 1258506 五、發明說明（19) 情形和凝膠體被聚合化為止。以這方法，凝膠體的聚合極 慢。 纖維蛋白原在凝膠體中大約的最終濃度係每一 m 1的凝 膠體有0 · 4到2 m g之間的纖維蛋白原。但在某些情況下， 血漿不必先用氯化鈉稀釋即可使用，以致纖維蛋白原的濃 度可高達每一ml的凝膠體有4 mg。 凝膠體中之人體纖維蛋白原（3 )的初始濃度可以有相 當大的變化。一般說來，建議的濃度是每平方公分凝膠體 表面存有不低於5 0 0個的結締組織細胞，但更多時也可 以。結締組織細胞的初始數目最好不要超過每平方公分4， 0 0 0個’因為濃度較高時，凝膠體易於在生長的第6到第7 曰被消化掉，以致不能從事移植處理。 視所需的生長量而定，角質形成細胞係以差異甚大的 密度（在每平方公分皮具有1，5 〇 〇到1 5，0 0 0個細胞之間）被 播種在這凝膠體上。 採用的角質形成細胞（6 )可從皮膚活組織檢體（5 )的初 級培養物取得。利用前述的任一種角質形成細胞培養系 統’即可在這凝膠體上培養角質形成細胞（6 )，但培養基 如以=胚胎血清增補時，所獲得的結果最佳。 々s角質形成細胞融合或即將融合時，通常這是在生長 的第、8日，便製備可供移植的皮片（sheet)。這層人造皮膚 (7)必須直接從培養贩的底部分開，或被固定到一固體支 托（9)上。破膠體如果不太稠密時（纖維蛋白原的初始濃度 低，大面積等），即需固定到一固體支托⑻上，這表示若

第25頁 !2585〇6 ---------- 五、發明說明（20) '—""" — -- I =凝膠體固定到—固體支托（9)上，就無法臨床使用。 &序係由下列各階段構成： /取走最後的培養基和打開培養孤。以無菌紗布（可塗 膜或不塗佈凡士林）蓋住凝膠體，讓紗布確切蓋住整個凝 二體表面。用解剖刀使凝膠體的各邊與培養皿分開。一當 一成^作業行動’便用一種無機黏合劑Cyanoacrylate (氮基丙烯酸酯）’ Histoacry 1R，Braum或具有類似特性的 其它同等品）將其固定到凝膠體的上表面（角質形成細胞所 在的那一面）。Cyanoacrylate (氰基丙烯酸酯）的用法是 對破膠體的邊緣滴上幾小滴，另可對中間滴幾滴黏合劑。 一當點合劑變乾時，便用壓舌板使凝膠體與培養亚分開。 紗布有助於使含有皮基底的凝膠體和培養成的角質形成細 胞上層保持成一體。接著即可在不致損失其完整性或造成 破裂的情況下運送這原型達1 6小時以上。 表一是習用技術與本發明標的之人造皮的基本特性比 表一 習用技術(Sadaki) 本發明 無 ^ήι酵素 有 非強制性 纖維蛋白原 ^ 60 mg/ral 0.5-2 mg/ml 藉締繊細胞 50,000/平方公分 < 4,000 /平方公分 凝膠體培養時間 22小時 函 12 日 ' ' 凝膠體中的細魅長 極少 是 $質形成細胞 50,000/平方公分 1，500 - 15,000/平方公分 舍組織檢體尺寸 ----—-------——- X 83 X 1000 - 5000

第26頁 1258506 圖式簡單說明 圖示摘要說明： 第一圖所示者係使用本發明之人造皮而對重大灼傷患 者移植皮膚所需作業的圖表。 主要元件圖號說明： 人造皮 結締組織細胞 皮膚活組織檢體 皮膚 固體支托 1 帶有血小板的血漿 3 全血 5角質形成細胞 7患者 9 4 6 8

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Claims (1)

1. :案號 91103519 月 Ή_； ，丨\)」£本 1258506 ί六、申請蓴利範圍 …v-m …成 乂如' 1、 一種人造皮的製作方法，該方法包括下列各階 段： 對患者的全血進行低速離心分離，而取得帶有血小板 的血漿，隨後將其冷凍； 使用已知的方法從皮膚活組織檢體培養皮細胞； 添加鈣鹽使事先解凍的帶有血小板的血漿凝結成塊，以便 取得一種纖維蛋白基質； 把皮細胞埋置於纖維蛋白内。 其特徵在 其中該凝 其特徵在 2、 如申請專利範圍第1項所述的製作方法 凝塊過程中，添加凝血酵素。 3、 如申請專利範圍第2項所述的製作方法 血酵素的添加濃度為0. 2 IU/ml。 4、 如申請專利範圍第1項所述的製作方法 對每3到6 m 1帶有血小板的血漿而言，#5鹽係由1 m 1溶液 中的1% —鈣化二氣（C12Ca)構成。

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