PT1313781E

PT1313781E - Meios poliméricos funcionalizados para separação de analitos

Info

Publication number: PT1313781E
Application number: PT01964275T
Authority: PT
Inventors: Nandkumar V Deorkar; James Farina; Paul A Bouis
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Priority date: 2000-08-29
Filing date: 2001-08-21
Publication date: 2006-11-30
Also published as: IL154174A0; NZ523914A; ATE332320T1; AU8515201A; WO2002018464A2; KR20030041980A; US20050032922A1; CZ297821B6; CA2420683C; JP2004507594A; BR0113541B1; WO2002018464A3; DK1313781T3; RS50501B; CZ2003462A3; EP1313781B1; NO20030923D0; BR0113541A; DE60121347T2; EP1313781A2

Description

ΕΡ 1 313 781 /PT

DESCRIÇÃO "Meios poliméricos funcionalizados para separação de analitos"

Domínio do invento 0 invento refere-se à separação de uma variedade de analitos que são polares, não polares e iónicos utilizando meios poliméricos funcionalizados. 0 fascículo descreve a funcionalização de meios poliméricos e a utilização destes. A funcionalização de partículas de polímero é realizada para conferir propriedades superficiais desejáveis para aplicações de separação tais como cromatografia líquida e extracções em fase sólida.

Antecedentes do invento A separação cromatográfica e extractiva em fase sólida de analitos são realizadas fazendo contactar misturas de soluções de analitos com materiais sólidos também conhecidos como fases ligadas/sorventes. A adsorção/dessorção (repartição) dos analitos na fase ligada conduz à separação de misturas. (Practical HPLC Method Development, L.R. Snyder, J.J. Kirkland, e J.L. Glajch, John Wiley and Sons, 1997; Solid Phase Extraction for Sample Preparation, M. Zief, e R. Kiesel, J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, 1988). As publicações e outros materiais aqui utilizados para ilustrar os antecendentes do invento ou proporcionar detalhes adicionais no que respeita à prática, são aqui incorporados como referência e, para conveniência, são respectivamente agrupados na Lista de Referências em anexo. Os auxiliares são modificados para conferirem as propriedades que permitem a separação por vários mecanismos tais como a fase reversa e a permuta iónica. É conhecida a produção de fases ligadas de fase reversa utilizando partículas de sílica. Devido a várias desvantagens associadas à sílica, tais como a instabilidade sob condições acídicas e básicas, são considerados polímeros. Algumas das dificuldades associadas a resinas de copolímeros reticulados incluem o inchamento em solventes e a reduzida resistência mecânica (F. Nevejam, e M. Verzele, J. Chromatography, 350: 145 (1985)). Deste modo, é frequentemente necessário empregar partículas de polímeros 2

ΕΡ 1 313 781 /PT altamente reticulados mas porosos em que os pontos de adsorção são acessíveis aos analitos. A necessária selectividade de fases de polímero não funcional é conseguida variando os solventes que constituem a fase móvel enquanto que as fases ligadas à base de sílica são modificadas com uma combinação de características polares e não polares que proporcionam a desejada selectividade. Por isso, são necessários materiais poliméricos funcionalizados adequados e métodos para utilizar os mesmos que possam conduzir à desejada selectividade e capacidade de separação. É bem conhecido na arte corrente a utilização de polímeros reticulados de monovinilideno e de monómeros de polivinilideno para produzir polímeros funcionalizados. Por exemplo, a conversão de tais polímeros em resinas de permuta iónica por sulfonação é descrita na patente US N° 2366007. Na realização destas funcionalizações, a estrutura do polímero é feita reagir e, deste modo, altera as propriedades das partículas esféricas que se tornam hidrofílicas, tornando-as susceptíveis de racharem ou de estilhaçarem. Adicionalmente, a funcionalização controlada através de uma reacção em massa, tal como s sulfonação, é difícil. A conversão de meios cromatográficos hidrofóbicos em hidrofílicos é descrita na patente US N° 5030352. Estes meios cromatográficos são obtidos por aplicação de vários revestimentos hidrofílicos finos na superfície de substratos poliméricos hidrofóbicos (e.g. poliestireno-DVB). O processo inclui a adsorção de soluto possuindo domínios hidrofóbicos e hidrofílicos no substrato através de interacções hidrofóbicas-hidrofóbicas com o domínio hidrofílico que se estende para fora da superfície. As moléculas são então reticuladas no local. Estes materiais de revestimento podem ser ainda derivados para produzir vários materiais úteis nas separações. Um tal revestimento é limitado a um filme fino na superfície do suporte hidrofóbico, e deste modo, a capacidade é limitada. A hidrofobicidade do suporte é também diminuída e pode não ser suficiente para adsorver analitos hidrofóbicos. Meitzner e Olinem na patente US N° 4297220, descrevem copolímeros micro-reticulados formados por copolimerização de monómeros monoetilenicamente insaturados e monómeros de polivinilideno na presença de certos compostos para se obter um volume de vazios e uma área 3

ΕΡ 1 313 781 /PT superficial específicos que sejam utilizados para absorver um material orgânico a partir de uma mistura de fluidos contendo materiais orgânicos. Bouvier et al. na patente US N° 5882521 descrevem um método para remover um soluto orgânico de uma solução utilizando um copolímero molhável com água de monómeros hidrofílicos e hidrofóbicos possuindo 12-30 por cento molar de monómero hidrofílico.

Sumário do invento O presente invento difere substancialmente da arte precedente dado que não envolve a copolimerização reticulada de dois monómeros de monovinilideno e de polivinilideno e a funcionalização de uma estrutura polimérica. Este utiliza uma nova aproximação da funcionalização da superfície de partículas rígidas pré-formadas utilizando diferentes monómeros funcionais para produzir partículas esféricas funcionalizadas. Para além disso, o método de funcionalização descrito reduz significativamente o número de reacções e o consumo de reagentes e solventes que são necessários em comparação com outros métodos de funcionalização da estrutura polimérica. Por exemplo, para tornar um meio de permuta aniónica forte com uma funcionalidade amina, são necessários três passos reaccionais (bromação ou cloração, seguido de aminação seguido de quaternização). Deste modo, pela funcionalização de partículas rígidas pré-formadas que sejam homopolímeros de monómeros de polivinilideno, as propriedades físicas da estrutura do polímero não são afectadas mas são conferidas propriedades críticas à superfície que permitem uma útil separação cromatográfica e de extracção em fase sólida e eliminam as desvantagens associadas aos copolímeros. Ao utilizar a preparação descrita, podem ser funcionalizadas partículas rígidas pré-formadas altamente reticuladas por polimerização de monómeros de polivinilideno sem se alterarem as propriedades físicas das partículas (tais como a resistência mecânica e o não inchamento). O invento descreve a funcionalização para conferir propriedades hidrofílicas e de permuta catiónica e aniónica. De acordo com o presente invento, partículas rígidas pré-formadas porosas e não porosas de compostos de homopolímero de polivinilideno altamente reticulado são funcionalizadas utilizando grupos vinílicos residuais, sobre os quais os compostos 4

ΕΡ 1 313 781 /PT monovinílicos são covalentemente ligados através de polimerização. Deste modo, as partículas pré-formadas contendo grupos vinílicos residuais são suspensas e derivadas numa solução de um composto monovinílico possuindo as propriedades desejadas, tais como ser hidrofílico ou útil como permutador aniónico ou catiónico. Assim, o presente invento permite uma elevada funcionalização através de uma polimerização de cadeia longa dos compostos monovinílicos desejados na superfície das partículas rígidas que possuem grupos vinílicos altamente residuais.

De acordo com o presente invento verificaram-se com surpresa propriedades de separação significativamente diferentes e interessantes nos polímeros funcionalizados. Estas propriedades conduzem a cromatografia líquida e a separação extractiva de fase sólida de analitos polares, não polares e iónicos e mecanismos de permuta iónica.

Breve descrição das figuras A Figura 1 é um gráfico que mostra a retenção de acetaminofeno em DVB não funcionalizado quando é utilizada água desionizada como fase móvel durante até 55 minutos, eluída com metanol mudando de água desionizada para metanol aos 55 minutos. 0 acetaminofeno foi lixiviado durante e eluição com água e não houve pico de eluição com o metanol, mostrando, deste modo, pouca/nenhuma retenção. A Figura 2 é um gráfico que mostra a retenção de acetaminofeno em DVB funcionalizado com 0,5 mmol de N-metil-N-vinilacetamida (Exemplo 3) quando é utilizada água desionizada como fase móvel durante até 55 minutos, eluída com metanol mudando de água desionizada para metanol aos 55 minutos. Algum acetoaminofeno (aproximadamente 30%) foi lixiviado durante a passagem da água aos 35 minutos e um pico foi eluído com metanol mostrando, deste modo, uma melhor retenção em comparação com a retenção do DVB não funcionalizado. A Figura 3 é um gráfico que mostra a retenção do acetaminofeno no DVB funcionalizado com 1,2 mmol de N-metil-N-vinilacetamida (Exemplo 4) quando é utilizada água 5

ΕΡ 1 313 781 /PT desionizada como fase móvel durante até 55 minutos, eluída com metanol mudando de água desionizada para metanol aos 55 minutos. Algum acetaminofeno (155) foi lixiviado muito mais tarde durante a passagem da água aos 45 minutos e foi eluido um pico com metanol mostrando, deste modo, uma melhoria acrescida na retenção. A Figura 4 é um gráfico que mostra a retenção do acetaminof eno em DVB funcionalizado com 1,36 mmol de N-metil-N-vinilacetamida (Exemplo 6) quando é utilizada água desionizada como fase móvel durante até 55 minutos, eluída com metanol mudando de água desionizada para metanol. Uma quantidade negligenciável de acetaminofeno foi lixiviada durante a passagem e um pico foi eluido com metanol, mostrando deste modo uma melhoria acrescida na retenção e uma boa recuperação por eluição com metanol. A Figura 5 é um gráfico que mostra a retenção do acetaminofeno em DVB funcionalizado com 1,5 mmol de N-metil-N-vinilacetamida (Exemplo 6) quando é utilizada água desionizada como fase móvel durante até 55 minutos, eluída com metanol mudando de água desionizada para metanol aos 55 minutos. Quantidades negligenciáveis de acetaminofeno foram lixiviadas durante a passagem de água e um pico foi eluido com metanol, mostrando deste modo uma boa retenção e recuperação por eluição com metanol. A Figura 6 é um gráfico que mostra a retenção do acetaminofeno em DVB funcionalizado com 1,6 mmol de aminoestireno (Exemplo 1) quando é utilizada água desionizada como fase móvel durante até 55 minutos, eluída com metanol mudando de água desionizada para metanol aos 55 minutos. Um pico foi eluido com metanol, mostrando uma retenção substancialmente maior do que o DVB não funcionalizado. A Figura 7 é um gráfico que mostra a separação cromatográfica de uma mistura de ácidos orgânicos consistindo de ácido tartárico, ácido malónico e ácido succínico, utilizando uma coluna com enchimento de DVB não funcionalizado. 6

ΕΡ 1 313 781 /PT A Figura 8 é um gráfico que mostra a separação cromatográfica de uma mistura de ácidos orgânicos consistindo de ácido tartárico, ácido malónico e ácido succinico, utilizando uma coluna com o enchimento de DVB funcionalizado do Exemplo 5. A Figura cromatográfica dicarboxilico) dicarboxilico, funcionalizado 9 é um gráfico que mostra a separação de ácido maleico (ácido cis-1,2—etileno-e ácido fumárico (ácido trans-1,2-etileno-utilizando uma coluna com o enchimento de DVB do Exemplo 5. A Figura 10 é um gráfico que mostra a separação cromatográfica de ácido maleico (ácido cis-1,2—etileno-dicarboxilico) e ácido fumárico (ácido trans-1,2-etileno-dicarboxilico) , utilizando uma coluna com enchimento de DVB não funcionalizado.

Descrição detalhada do invento 0 presente invento proporciona um método para a separação de uma variedade de analitos que são polares, não polares ou iónicos utilizando meios poliméricos funcionalizados. Mais particularmente, o presente invento refere-se à funcionalização de partículas poliméricas altamente reticuladas pré-formadas para conferirem as propriedades desejadas, tais como hidrofilicidade e capacidade de permuta aniónica e catiónica. Para além disso, o presente invento refere-se a cromatográfia líquida e a separação por extracção em fase sólida de uma variedade de analitos.

As partículas rígidas pré-formadas que podem ser funcionalizadas incluem partículas esféricas poliméricas porosas ou não porosas preparadas através de processos convencionais, tais como a polimerização por suspensão. As partículas esféricas poliméricas altamente reticuladas preparadas utilizando compostos de polivinilideno, tais como o divinilbenzeno e o trivinilbenzeno são preferidas devido às suas características de elevada resistência mecânica e de não inchamento. Adicionalmente, a polimerização do divinilvenzeno e a sua auto-reticulação conduz a suficientes ligações vinílicas (duplas) residuais na superfície que são 7

ΕΡ 1 313 781 /PT utilizadas para a funcionalização da superfície utilizando compostos monovinílicos. Assim, são preferidas partículas esféricas poliméricas pré-formadas possuindo um grande número de ligações duplas residuais porque estas podem conduzir a um elevado grau de funcionalização. Além disso, são preferidas partículas microporosas que possam proporcionar uma elevada funcionalidade devido a uma grande área superficial e ao acesso às porções funcionais. A funcionalização por pós-polimerização de compostos monoetilenicamente insaturados (compostos monovinílicos) com grupos vinilo residuais é realizada por iniciação de radicais livres. Os monómeros são seleccionados de uma classe de compostos que possuem porções activas, tais como as polares ou de permutadores catiónicos ou permutadores aniónicos. Após polimerização, as longas cadeias de polímero contendo tais porções activas estão ligadas à superfície e as longas cadeias poliméricas estendem-se para fora da superfície das partículas esféricas do polímero. Esta configuração não altera as propriedades físicas ou químicas, tais como a resistência mecânica, o inchamento, e a hidrofobicidade/hidrofilicidade da estrutura polimérica das partículas esféricas. Por exemplo, por pós-polimerização controlada (funcionalização) com porções activas contendo monómeros, são criadas bolsas de pontos activos nos poros ao longo das cadeias de polímero mas retendo bolsas hidrofóbicas na estrutura do polímero das partículas esféricas. Verificou-se que estas propriedades podem conduzir à separação eficiente de analitos polares, tal como descrito nos Exemplos.

As condições de pós-polimerização são escolhidas de modo a ser conseguida uma elevada funcionalização das partículas esféricas microporosas ao mesmo tempo que se mantém a microporosidade que permite a difusão dos analitos de e para os poros para se conseguir a separação desejada e a recuperação do analito.

Tal como descrito nos Exemplos, as partículas esféricas poliméricas microporosas podem ser preparadas utilizando polimerização em suspensão convencional. 0 grupo vinílico residual ou insaturação foi determinado através de um método 8

ΕΡ 1 313 781 /PT de titulação de acetato de mercúrio (Das M.N., Anal. Chem. 26; 1086 (1954)). Em conformidade, as partículas esféricas microporosas de poli(divinilbenzeno) foram preparadas e usadas para produzir partículas poliméricas funcionalizadas. Podem ser utilizadas partículas esféricas de polímero preparadas por homopolimerização de compostos de polivinilideno que possuem grupos vinílicos residuais suficientes. Compostos de polivinilideno adequados incluem divinilbenzeno, trivinilbenzeno, divinilpiridina, diviniltolueno, divinilnaftaleno, dimetilacrilato de etilenoglicol e N,N-metilenodiacrilamida. As partículas esféricas poliméricas de divinilbenzeno são preferidas devido à sua elevada resistência mecânica e aos grupos vinílicos residuais. As partículas esféricas de polímero podem ter um diâmetro na gama de 3 a cerca de 100 pm, preferencialmente cerca de 5-50 pm; um diâmetro de poro de cerca de 60 Ã a 1000 À, preferivelmente 100 Â-300 À (medido por porosimetria de mercúrio) e uma área superficial de cerca de 70-150 m2/g (medido por porosimetria de mercúrio) e uma área superficial de cerca de 150-800 m2/g (medido por adsorção de azoto).

Uma concretização do presente invento é um material de separação para a separação de vários analitos. O material de separação é preparado por funcionalização de partículas esféricas poliméricas através de pós-polimerização de compostos monovinílicos com grupos vinílicos residuais utilizando polimerização de radicais sob condições anaeróbicas. Catalisadores de radicais livres adequados incluem peróxido de benzoílo, benzoato de terc-butilo, peróxido de caproílo, azodiisobutironitrilo e azodiisobutiramida.

Numa concretização, o material de separação é produzido para conferir propriedades polares às partículas esféricas poliméricas. Compostos monovinílicos adequados incluem a N-metil-N-vinilacetamida, aminoestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de hidroxietilo, acrilato de hidroximetilo e N-vinilcaprolactama. Um composto monovinílico preferido é a N-metil-N-vinilacetamida. O polímero pode ser funcionalizado para se conseguir 0,5-3 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de polímero funcionalizado. A 9

ΕΡ 1 313 781 /PT funcionalização preferida que proporciona uma boa retenção de compostos polares é de 1,0 a 2,0 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de polímeros funcionalizados. Tal como ilustrado nos Exemplos, o aumento de funcionalização de 0,5 mmol para 1,5 mmol aumenta a retenção e a capacidade de separação dos analitos polares.

Noutra concretização, o material de separação é produzido para conferir propriedades iónicas às partículas esféricas poliméricas de modo a que as partículas esféricas possam ser utilizadas para a separação de permuta aniónica e catiónica de analitos. Compostos monovinílicos adequados para funcionalização incluem N-(4-vinilbenzeno)-N,N-dimetilamina, cloreto de vinilbenziltrimetilamónio, ácido 4-vinilbenzóico, ácido estirenossulfónico (também designado por ácido N-vinilbenzenossulfónico) e ácido metacrílico. Além disso, as partículas esféricas poliméricas pós-polimerizadas que utilizam metacrilato de glicidilo com grupos vinilo residuais podem ser ainda feitos reagir com etilenodiamina, dietilamina, polietilenoimina, ácido hidroxipropilsulfónico, ácido hidroxibenzenossulfónico ou ácido hidroxibenzóico para formar locais funcionais iónicos no polímero pós-polimerizado para originar polímeros funcionais.

Noutro aspecto deste invento os polímeros funcionalizados são utilizados para a separação de analitos através de cromatografia líquida e extracção em fase sólida. Os polímeros funcionalizados são úteis de várias maneiras, tal como ilustrado nos Exemplos.

Por exemplo, a recuperação de analitos orgânicos polares, tais como o acetaminofeno, niacinamida e resorcinal é substancialmente maior nos polímeros funcionalizados devido à presença de grupos polares do que é a sua recuperação no polímero de DVB não funcionalizado ou em sílica modificada com octadecilo (sílica ligada a cis) . Mostra-se também que o polímero funcionalizado possui uma mais alta capacidade de adsorção. Tal como mostrado nos Exemplos, para o DVB não funcionalizado e Cis a recuperação é inferior para uma solução altamente concentrada de acetaminofeno (0,1 mg/ml) do que para uma solução menos concentrada (0,01 mg/ml), enquanto que a recuperação com DVB funcionalizado permanece 10

ΕΡ 1 313 781 /PT elevada (quantitativa) para ambos os niveis de concentração. Também se verificou que quando os polímeros funcionalizados são embalados numa coluna de cromatografia líquida e utilizados para separação, ácidos orgânicos assim como isómeros (cis e trans) de ácidos orgânicos podem ser separados utilizando uma fase móvel aquosa pura.

Para além disso, verificou-se que quando se utiliza um polímero funcionalizado possuindo características iónicas, podem ser separados analitos por combinação de permuta iónica e de mecanismos de fase reversa. Assim, pode ser conseguida uma melhor separação de analito iónico e hidrofóbico. Tal como ilustrado nos Exemplos, um analito acídico, tal como o sulindac que possui um grupo carboxílico é retido num polímero funcionalizado iónico assim como noutros polímeros (não iónicos e não funcionalizados) e Cis· Contudo, o analito é lavado dos materiais não iónicos com a primeira lavagem de metanol, enquanto que não é lavado analito do polímero funcionalizado iónico com a primeira lavagem de metanol. Após a lavagem com um ácido, tal como o ácido clorídrico IN seguido de metanol (acidificado), o analito foi recuperado quantitativamente. Isto proporciona um método muito eficaz para a separação de analitos acídicos de analitos hidrofóbicos. O presente invento é ainda descrito nos Exemplos seguintes. As técnicas correntes são bem conhecidas na arte ou são utilizadas técnicas especificamente descritas a seguir.

Exemplos

Preparação de partículas esféricas de poli(divinilbenzeno) (DVB)

Partículas esféricas poliméricas de DVB foram produzidas através de polimerização em suspensão convencional utilizando 80% de DVB, peróxido de benzoílo como iniciador, e tolueno como agente de formação de poros. O polímero continha 0,2 meq/g de grupos vinílicos residuais. O diâmetro do poro era de 180 Ã e a área superficial medida por porosimetria de mercúrio era de 95 m2/g. Análise elementar 11

ΕΡ 1 313 781 /PT mostrou que não havia azoto presente. Exemplo 1 A um balão de fundo redondo de um litro seco e limpo foi adicionado: 350 g de água, 4 g de poli (álcool vinilico) e 4 g de cloreto de sódio. Polímero DVB (15 g) foi adicionado ao balão. Numa proveta de 25 ml foram adicionados: 4 g de aminoestireno, 0,3 g de azodiisobutironitrilo (AIBN) e 20 g de tolueno. A mistura reaccional foi agitada para dissolver os reagentes. A mistura de monómero foi adicionada ao balão. O balão foi purgado de todo o ar e foi adicionado azoto para tornar a atmosfera inerte. 0 balão foi aquecido durante a noite a 75EC. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80 EC. Análise elementar do produto polimérico mostrou haver azoto a 2,4%. Este produto polimérico foi então tratado com cloreto de acetilo (10 g) em 100 ml de tetra-hidrofurano na presença de trietilamina (6 g) durante 4 horas, à temperatura ambiente. Análise elementar do polímero mostrou a existência de azoto em 2,3% o que é equivalente a 1,6 mmol de aminoestireno por grama de produto final.

Exemplo 2 A um balão de fundo redondo de 250 ml seco e limpo foi adicionado 75 g de etanol. Polímero DVB (15 g) foi adicionado ao balão. Numa proveta de 25 ml foram adicionados: 5 g de N-metil-N-vinilacetamida e 0,2 g de AIBN e 10 ml de etanol e os conteúdos agitados para dissolver os reagentes. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão. O balão foi purgado de todo o ar e adicionou-se azoto e os conteúdos foram agitados a 100 rpm. O balão a rodar foi aquecido durante a noite a 75EC. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de etanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (15 g) mostrou a existência de 1,9% de azoto, equivalente a 1,36 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de produto final. A área superficial medida por porosimetria de mercúrio era de 12

ΕΡ 1 313 781 /PT 126 m2/g e o diâmetro do poro era de 173 Ã. Exemplo 3

Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados: 200 g de etanol e 40 g de polimero de DVB. A agitação foi iniciada e ajustada para 300 rpm. Numa proveta de 50 ml foram adicionados 10,5 g de N-metil-N-vinilacetamida e 0,6 g de AIBN com 20 ml de etanol e agitou-se para dissolver. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 75EC. 0 produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de etanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (42 g) mostrou a existência de 0,7% de azoto, equivalente a 0,5 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de produto final.

Exemplo 4

Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados: 200 g de etanol e 45 g de polímero de DVB. A agitação foi iniciada e ajustada para 300 rpm. Numa proveta de 50 ml foram adicionados 20 g de N-metil-N-vinilacetamida e 0,6 g de AIBN com 20 ml de etanol e agitou-se para dissolver os reagentes. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 80EC, durante 16 horas. 0 produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. 0 produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (48 g) mostrou a existência de 1,8% de azoto, equivalente a 1,2 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de produto final.

Exemplo 5

Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e 13

ΕΡ 1 313 781 /PT um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados 800 g de etanol e 200 g de polímero de DVB. A agitação foi iniciada e ajustada para 300 rpm. Numa proveta de 250 ml foram adicionados 89 g de N-metil-N-vinilacetamida e 2,68 g de AIBN com 100 ml de etanol e agitou-se para dissolver. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 80EC, a 16 horas. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 1 1 de água desionizada e uma vez com 1 1 de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (42 g) mostrou a existência de 2,1% de azoto, equivalente a 1,5 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de produto final. Este polímero foi extractado durante a noite com acetato de etilo para determinar a estabilidade da funcionalização. Não se observou alteração na análise elementar, mostrando deste modo uma ligação covalente da N-metil-N-vinilacetamida ao DVB.

Exemplo 6

Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados 200 g de etanol e 45 g de polímero de DVB. A agitação foi iniciada e ajustada para 300 rpm. Numa proveta de 50 ml foram adicionados 20 g de N-metil-N-vinilacetamida e 0,6 g de AIBN com 25 ml de etanol e agitou-se para dissolver os reagentes. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 80EC, durante 16 horas. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 1 1 de água desionizada e uma vez com 1 1 de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (48 g) mostrou a existência de 1,9% de azoto, equivalente a 1,36 mmol de N-metil-N-vinilacetamida por grama de produto final.

Exemplo 7

Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados 150 g de etanol e 30 g de polímero de DVB. A agitação foi iniciada 14

ΕΡ 1 313 781 /PT e ajustada para 300 rpm. Numa proveta de 50 ml foram adicionados 13 g de metacrilato de glicidilo e 0,4 g de AIBN com 20 ml de etanol e agitou-se para dissolver. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 80EC, durante 16 horas. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. FT-IR do produto polimérico (32 g) mostrou um pico a 1250 cm-1, tipico de um anel epóxido.

Exemplo 8 A reacção seguinte produziu um meio de permuta aniónica fraco possuindo aminas funcionais primárias e secundárias. Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados 15 g de polímero do Exemplo 7, 250 ml de THF e 50 g de etilenodiamina. A mistura foi refluxada durante 8 horas sob atmosfera de azoto. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (16 g) mostrou a existência de 2,9% de azoto.

Exemplo 9 A reacção seguinte produziu um meio de permuta aniónica fraco possuindo uma funcionalidade de amina terciária. Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados 15 g de polímero do Exemplo 7, 250 ml de THF e 50 g de dietilamina. A mistura foi refluxada durante 8 horas sob atmosfera de azoto. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico mostrou a existência de 0,8% de azoto. A capacidade de permuta aniónica era de 0,12 meq/g. 15

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Exemplo 10 A reacção seguinte produziu um meio de permuta aniónica fraco possuindo uma funcionalidade de amina terciária. Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão juntaram-se 300 g de etanol e 45 g de polimero de DVB. A agitação foi iniciada e ajustada para 300 rpm. A uma proveta de 50 ml foram adicionados 20 g de N- (4-vinilbenzil) -N,N-dimetilamina e 0,6 g de AIBN com 25 ml de etanol e agitou-se para dissolver os reagentes. A mistura de monómero foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 80EC durante 16 horas. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (47 g) mostrou a existência de 0,84% de azoto. O diâmetro do poro era de 125 Â.

Exemplo 11 A reacção seguinte produziu um meio de permuta aniónica forte possuindo uma funcionalidade de amina quaternária. Um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo foi equipado com um agitador mecânico, um borbulhador de azoto e um condensador de refluxo. Ao balão foram adicionados 300 g de etanol e 30 g de polimero de DVB. A agitação foi iniciada e ajustada para 300 rpm. A uma proveta de 50 ml foram adicionados 15 g de cloreto de vinilbenziltrimetilamónio e 0,6 g de AIBN com 20 ml de etanol e agitou-se para dissolver. A mistura de monómero foi adicionada ao balão de fundo redondo. A mistura foi agitada a 300 rpm a 80EC durante 16 horas. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (31 g) mostrou a existência de 1,4% de azoto. A capacidade de permuta aniónica era de 0,6 meq/g.

Exemplo 12 A um balão de fundo redondo de 500 ml limpo e seco foram adicionados 300 g de etanol e 30 g de polimero de DVB. A uma 16

ΕΡ 1 313 781 /PT proveta de 50 ml foram adicionados 20 g de ácido est irenossulf ónico e 0,6 g de AIBN dissolvido em 25 ml de etanol e os conteúdos foram agitados para dissolver os reagentes. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. O balão foi purgado de todo o ar e colocado sob atmosfera de azoto e agitou-se a 100 rpm. O balão foi aquecido durante a noite a 80 EC. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. O produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. Análise elementar do produto polimérico (34 g) mostrou a existência de 3,5% de enxofre. A capacidade de permuta catiónica era de 0,6 meq/g.

Exemplo 13 A um balão de fundo redondo de 500 ml limpo e seco foram adicionados 300 g de etanol e 20 g de polímero de DVB. A uma proveta de 50 ml foram adicionados 20 g de ácido metacrílico e 0,6 g de AIBN dissolvido em 25 ml de etanol e estes foram agitados para dissolver. A mistura de monómeros foi adicionada ao balão de fundo redondo. O balão foi purgado de todo o ar e colocado sob atmosfera de azoto e agitou-se a 100 rpm. O balão foi aquecido durante a noite a 80 EC. O produto foi filtrado num tampão de dynel, lavado 2x com 200 ml de água desionizada e uma vez com 200 ml de metanol. 0 produto foi seco durante a noite numa estufa de vácuo a 80EC. A capacidade de permuta catiónica era de 0,9 meq/g. FT-IR do produto polimérico mostrou um pico do carbonilo do ácido a 1750 cm-1.

Exemplo 14

As eficiências de retenção de analitos polares, solúveis em água foram determinadas utilizando uma pequena coluna de HPLC (4,6 x 50 mm) com um enchimento de aproximadamente 0,25-0,30 g de DVB de polímeros de DVB funcionalizados. A primeira coluna foi lavada com 5 ml de metanol seguido de 10 ml de água desionizada. Então foi injectado 200 μΐ de solução de acetaminofeno (1,0 mg/ml em água) e o desenvolvimento cromatográfico continuou utilizando água durante 55 minutos. Aos 55 minutos a fase móvel foi mudada para metanol. A eficiência de retenção foi determinada a 17

ΕΡ 1 313 781 /PT partir da área dos picos antes dos 55 minutos (quando o eluente era água pura) e após 55 minutos (quando foi utilizado metanol para eluição). Os resultados são mostrados nas Figuras 1-6. 0 DVB funcionalizado (Exemplo 5) mostra uma elevada retenção do acetaminofeno dado que o acetaminofeno não foi lixiviado durante a lavagem com água mas foi eluido após 55 minutos do metanol. Tal como mostrado na Figura 1, com o DVB não funcionalizado a maior parte do acetaminofeno foi lixiviado com água, e mostrou fraca retenção. Ao aumentar o nivel de funcionalização da N-metil-N-vinil-acetamida (%N de 0,7-2,0) o acetaminofeno foi retido e recuperado quantitativamente (Figuras 1-5) . O comportamento de retenção semelhante foi observado com os polímeros funcionalizados de amionoestireno (Figura 6).

Exemplo 15 A recuperação de analitos por extracção em fase sólida (SPE) com polímero funcionalizado foi determinada utilizando colunas de SPE (1 ml) com enchimento de 2 0 mg de DB ou DVB funcionalizado (do Exemplo 5) que retém/absorve analito através de um mecanismo de fase reversa. Estas colunas foram utilizadas para extracção e recuperação de vários analitos a partir de soluções diluídas. As colunas de SPE foram colocadas num processador de pressão positiva (o dispositivo força o líquido a atravessar a coluna utilizando ar ou azoto pressurizado). A coluna de SPE foi condicionada fazendo passar 1 ml de metanol seguido de 1 ml de água desionizada. Então, 1 ml de solução de alimentação de analito (0,01-0,1 mg/ml) em tampão de fosfato (20 mM, pH 5,0-8,0) foi feito passar através da coluna com um caudal de 2-3 ml/minuto. Após lavagem da coluna com 1 ml de água desionizada, o analito foi eluido na coluna com metanol (500 μΐ). A concentração do analito na solução de alimentação de partida foi determinada através de cromatografia líquida de alta eficiência e foi utilizada para calcular a recuperação do analito. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Os resultados mostram que o DVB funcionalizado mostrou uma elevada recuperação de analitos polares. Também ao aumentar a concentração de acetaminofeno de 0,01-0,1 mg/ml, não se observou perda de acetaminofeno indicando uma elevada capacidade de adsorção. 18

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Tabela 1

Recuperação de vários analitos por SPE

Composto Condições de extracção % recuperação DVB DVB funcionalizado (Exemplo 5) Cl8 Acetaminofeno 0,1 mg/ml em KH2P04 2 0 mM, pH 6,0 91,0 101,0 22,0 Acetaminofeno 0,01 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6,0 95, 0 98,6 50,0 Resorcinol 0,1 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6,0 55,0 99,0 0,0 Pindolol 0,05 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6,0 106,0 100,0 98, 0 Procainamida 0,01 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6,0 96,8 101, 0 98,2 Primidona Fenobarbital 0,05 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6, 0 100, 7 98,1 98,2 98,7 98.1 98, 1 Niacinamida 0,05 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6,0 0,0 43,0 0, 0 Bupivacaína 0,05 mg/ml em KH2P04 20 mM, pH 6,0 86, 7 100,3 92,4

Exemplo 16 A eficiência da separação de ácidos orgânicos foi avaliada por HPLC (cromatografia liquida de alta eficiência) usando DVB e DVB funcionalizado (Exemplo 5) em enchimento de colunas (4,6 χ 150 mm). As colunas foram cheias (3,8 g em 22 ml de clorofórmio-isopropanol, em mistura de 85:15) a 4500 psi. Fosfato de potássio, tampão de pH 3,0 (20 mM) foi utilizado como fase móvel. Uma mistura de 60 μΐ de ácido tartárico, ácido malónico e ácido succinico contendo, respectivamente, 10 pg, 25 pg e 375 pg, foi injectada e os picos cromatográficos foram registados a 210 nm. Foram feitas injecções semelhantes de componentes individuais para determinar os tempos de retenção de cada um dos componentes. 19

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Tal como mostrado na Figura 7, os tempos de retenção do ácido tartárico, ácido malónico e ácido succínico são, respectivamente, de 1,8, 2,6 e 10,2 minutos. Os resultados mostram uma fraca separação do ácido tartárico e do ácido malónico com o DVB não funcionalizado. A funcionalização com N-metil-N-vinilacetamida na superfície do polímero resultou num meio de separação melhorado dado que a eficiência de separação de todos os três componentes aumentou significativamente (Figura 8). O tempo de retenção de todos os três componentes também aumentou significativamente. A separação pode ser atribuída à ramificação das porções de amida polares contendo N-metil-N-vinilacetamida de cadeia longa que se estendem para fora da superfície polar. Verificou-se também que um DVB funcionalizado (Exemplo 5) pode separar ácidos cis-trans. Uma mistura da forma cis do ácido 1,2-etilenodicarboxílico (ácido maleico) e a forma trans do ácido 1,2-etilenodicarboxílico (ácido fumárico) foi separada com DVB funcionalizado utilizando tampão de fosfato de potássio 20 mM, pH 3,0 como fase móvel (Figura 9), enquanto que ambos os componentes são co-eluídos com DVB não funcional (Figura 10).

Exemplo 17 A recuperação de analitos por extracção em fase sólida (SPE) com polímero funcionalizado foi determinado utilizando colunas de SPE (1 ml) com um enchimento de 2 0 mg de DVB ou um DVB funcionalizado de permuta aniónica forte (quat) (do Exemplo 11) que retém um analito por interacção iónica e também através de um mecanismo de fase reversa. Foi demonstrado que o analito acídico pode ser separado por interacções mistas. As colunas de SPE foram colocadas num processador de pressão positiva. As colunas de SPE foram condicionadas passando 1 ml de metanol, seguido de NaOH 0,1 N e 1 ml de água desionizada. Então 1 ml de solução de alimentação de analito acídico (0,05 mg/ml) em NaOH 0,01 N passou através da coluna com um caudal de 2-3 ml/min. A primeira coluna foi lavada com 1 ml de metanol para remover outros analitos hidrofóbicos enquanto que o analito acídico ficou retido na coluna. Então a coluna foi lavada com HC1 1 N para converter o analito iónico numa forma ácida e para 20

ΕΡ 1 313 781 /PT perturbar interacções iónicas com o que o analito acídico foi retido através de um mecanismo de fase reversa. Finalmente, o analito acidico foi eluido com 1 ml de metanol acidificado (90:10, metanol:HC1 IN). As concentrações do analito acidico na primeira lavagem com metanol e do eluido de metano final foram determinadas por HPLC para calcular as recuperações (Tabela 2). Tal como mostrado na Tabela 2, o DVB funcionalizado (Exemplo 11) que possui locais de permuta aniónica retém o analito acidico através de um mecanismo quer aniónico quer de fase reversa. Este modo, o analito não é lavado com a primeira lavagem de metanol mas é eluido com o metanol acidificado final quando não existe interacção iónica. Para o DVB funcionalizado (Exemplo 5), DVB não funcionalizado e Cis, o analito é lavado com a primeira lavagem de metanol e não mostra a capacidade de separação de analitos acidicos e hidrofóbicos. Similarmente, a recuperação de ácido salicilico com DVB funcionalizado (Exemplo 5), DVB não funcionalizado e Cis é muito pobre dado que o ácido salicilico não é retido nas colunas.

Tabela 2 % de Recuperação de analito acidico

Composto Sulindac Ácido salicilico DVB funcionalizado em quat (Exemplo 11) Primeira lavagem de metanol 0, 0 0, 0 Eluato final de metanol 85, 6 94, 4 DVB funcionalizado (Exemplo 5) Primeira lavagem de metanol 96, 1 9,4 Eluato final de metanol 0, 0 0, 0 DVB Primeira lavagem de metanol 92, 7 0, 0 Eluato final de metanol 0, 0 0, 0 Cl8 Primeira lavagem de metanol 93,0 0, 0 Eluato final de metanol 0,0 0, 0 21

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Lista de referências

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Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S.

Zief M e Kisel R (1988). Solid Phase Extraction for Sample Preparation, J.T. Baker, Phillipsburgo, NJ 2366007 4297220 5030352 5882521

Lisboa,

Claims

ΕΡ 1 313 781 /PT 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas preparadas por a) polimerização de um monómero de polivinilideno para formar um homopolímero auto-reticulado; e posteriormente b) polimerização de um monómero funcional para se ligar covalentemente ao referido homopolímero.
2. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1 em que o referido monómero de polivinilideno é seleccionado do grupo constituído por divinilbenzeno, trivinilbenzeno, divinilpiridina, diviniltolueno, divinilnaftaleno, dimetilacrilato de etilenoglicol e N,N-metilenodiacrilamida.
3. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 2 em que o referido monómero de polivinilideno é divinilbenzeno.
4. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1 em que o referido homopolímero é poli(divinilbenzeno).
5. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1 em que o referido monómero funcional é um composto monovinílico.
6. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 5 em que o referido composto monovinílico possui uma porção polar ou uma porção iónica.
7. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1 em que o referido monómero funcional é seleccionado do grupo constituído por N-metil-N-vinilacetamida, aminoestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de hidroximetiletilo, acrilato de hidroxietilo e N-vinilcaprolactama.
8. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 7 em que o referido monómero ΕΡ 1 313 781 /PT 2/6 funcional é a N-metil-N-vinilacetamida.
9. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 8 em que as referidas partículas esféricas compreendem 0,5-3,0 milimoles de N-metil-N-vinilacetamida por grama de partículas esféricas de polímero funcionalizadas.
10. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1 em que o referido monómero funcional é seleccionado do grupo constituído por N-(4-vinilbenzil)-N,N-dimetilamina, cloreto de vinilbenzil-trimetilamónio, ácido 4-vinilbenzóico, ácido estireno-sulfónico e ácido metacrílico.
11. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1 em que o referido monómero funcional é o metacrilato de glicidilo.
12. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 11 que são ainda feitas reagir com etilenodiamina, dietilamina, polietilenoimina, ácido hidroxipropilssulfónico, ácido hidroxilbenzenossulfónico ou ácido hidroxibenzóico.
13. Partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 11 que são ainda feitas reagir com etilenodiamina.
14. Método para preparar uma partícula esférica de polímero funcionalizada, compreendendo o referido método os passos de: a) polimerização de um monómero de polivinilideno para formar um homopolímero; e posteriormente b) polimerização de um monómero funcional que se liga covalentemente ao referido homopolímero.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a seguir ao passo (a) permanecem grupos vinílicos residuais no referido homopolímero. ΕΡ 1 313 781 /PT 3/6
16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que os referidos monómeros funcionais formam um polímero funcional que está covalentemente ligado ao referido homopolímero através de um grupo vinílico residual.
17. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero de polivinilideno é seleccionado do grupo constituído por divinilbenzeno, trivinilbenzeno, divinilpiridina, diviniltolueno, divinilnaftaleno, dimetilacrilato de etilenoglicol e N,N-metilenodiacrilamida.
18. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero de polivinilideno é divinilbenzeno.
19. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero funcional é um composto monovinílico.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido composto monovinílico possui uma porção polar ou uma porção iónica.
21. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero funcional é seleccionado do grupo constituído por N-metil-N-vinilacetamida, aminoestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de hidroxietilo, acrilato de hidroxietilo e N-vinil- caprolactama.
22. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero funcional é N-metil-N-vinilacetamida.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a referida partícula esférica de polímero funcionalizada compreende 0,5-3,0 milimoles de N-metil-N-vinilacetamida por grama de partículas esféricas de polímero funcionalizadas.
24. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero funcional é seleccionado do grupo constituído por N-(4-vinilbenzil)-N,N-dimetilamina, cloreto de vinilbenziltrimetilamónio, ácido 4-vinilbenzóico, ácido estirenossulfónico e ácido metacrílico. ΕΡ 1 313 781 /PT 4/6
25. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido monómero funcional é metacrilato de glicidilo.
26. Método de acordo com a reivindicação 25 que compreende adicionalmente: c) a reacção das partículas esféricas de polímero funcionalizadas produzidas no passo (b) com etilenodiamina, dietilamina, polietilenoimina, ácido hidroxipropilsulfónico, ácido hidroxilbenzenossulfónico ou ácido hidroxibenzóico.
27. Método de acordo com a reivindicação 25 que compreende adicionalmente: c) a reacção das partículas esféricas de polímero funcionalizadas produzidas no passo (b) com etilenodiamina.
28. Método de acordo com a reivindicação 14 em que o passo (b) é catalizado por um radical livre sob condições anaeróbicas.
29. Método de acordo com a reivindicação 28 em que é utilizado um catalisador de radical livre, sendo o referido catalisador de radical livre seleccionado do grupo constituído por peróxido de benzoílo, benzoato de terc- butilo, peróxido de caproílo, azodiisobutironitrilo e azodiisobutiramida.
30. Método de acordo com a reivindicação 29 em que o referido catalisador de radical livre é o azodiisobutironitrilo.
31. Método para separar um analito a partir de uma solução que compreende o referido analito e um primeiro solvente, compreendendo o referido método o contacto da referida solução com partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1, pelo que o referido analito é adsorvido sobre as referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas.
32. Método de acordo com a reivindicação 31 em que, após o contacto das referidas partículas esféricas de polímero ΕΡ 1 313 781 /PT 5/6 funcionalizadas com a referida solução, as referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas são lavadas com o referido primeiro solvente.
33. Método de acordo com a reivindicação 31 em que o referido analito é libertado das referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas por lavagem das referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas com um segundo solvente.
34. Método de acordo com a reivindicação 32 em que o referido primeiro solvente é aquoso.
35. Método de acordo com a reivindicação 33 em que o referido segundo solvente é metanol.
36. Método de acordo com a reivindicação 31 em que o referido analito é seleccionado do grupo constituído por acetaminofeno, resorcinal, pindolol, procainamida, primidona, fenobarbital, niacinamida e bupivacaína.
37. Método de acordo com a reivindicação 31 em que as referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas compreendem grupos funcionais de N-metil-N-vinilacetamida.
38. Método para a separação de analitos numa mistura por passagem da referida mistura através de uma coluna de partículas esféricas de polímero funcionalizadas de acordo com a reivindicação 1.
39. Método de acordo com a reivindicação 38 em que um tampão aquoso é utilizado como fase móvel.
40. Método de acordo com a reivindicação 38 em que o referido método compreende cromatografia líquida de alta eficiência.
41. Método de acordo com a reivindicação 38 em que os referidos analitos são ácidos orgânicos.
42. Método de acordo com a reivindicação 38 em que os referidos analitos são isómeros entre si. ΕΡ 1 313 781 /PT 6/6
43. Método de acordo com a reivindicação 38 em que as referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas compreendem N-metil-N-vinilacetamida.
44. Método de acordo com a reivindicação 38 em que as referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas compreendem um permutador aniónico.
45. Método de acordo com a reivindicação 44 em que as referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas compreendem cloreto de vinilbenziltrimetilamónio.
46. Método de acordo com a reivindicação 38 em que os referidos analitos são separados por lavagem das referidas partículas esféricas de polímero funcionalizadas com uma série de solventes.
47. Método de acordo com a reivindicação 46 em que a referida série de solventes compreende metanol, um ácido e metanol acidificado. Lisboa,