PT1272188E

PT1272188E - Utilização de inibidores da tirosina-cinase egfr para tratamento de cancro da mama

Info

Publication number: PT1272188E
Application number: PT00973002T
Authority: PT
Inventors: Nigel James Bundred
Original assignee: Univ Manchester
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 2000-11-01
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CA2389411A1; JP2003513035A; GB9925958D0; NO20022065L; ES2275556T3; WO2001032155A3; CN1197577C; AU779190B2; DE60030889T2; ATE339957T1; ZA200203431B; CY1106285T1; AU1155901A; NO20022065D0; MXPA02004272A; BR0015194A; WO2001032155A2; DE60030889D1; NO323206B1; CA2389411C

Description

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DESCRIÇÃO "Utilização de inibidores da tirosina-cinase EGFR para tratamento de cancro da mama" 0 presente invento refere-se à utilização terapêutica de compostos que possuem actividade inibidora contra a enzima tirosina-cinase receptora do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Em particular o presente invento refere-se à utilização de tais compostos para inibir a transformação de células normais em célula cancerosas, i.e. os compostos são agentes quimiopreventivos de cancro.

Nos últimos anos foi descoberto que uma célula se pode tornar cancerosa em virtude da transformação de uma porção do seu ADN num oncogene, i.e. um gene que, após activação, conduz à formação de células tumorais malignas (Bradshaw, Mutagenesis 1: 91, 1986). Vários desses oncogenes dão origem à produção de proteínas que são receptores de factores de crescimento. 0 complexo do receptor de factor de crescimento conduz subsequentemente a um aumento na proliferação celular. Sabe-se, por exemplo, que vários oncogenes codificam enzimas tirosina-cinase e que certos receptores de factores de crescimento são também enzimas tirosina-cinase (Yarden et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 443, 1988; Larsen et ai., Ann. Reports in Med. Chem., Cap. 13, 1989).

As tirosina-cinases receptoras são importantes na transmissão de sinais bioquímicos que iniciam a replicação celular. São enzimas grandes que atravessam a membrana celular e possuem um domínio de ligação extracelular para factores de crescimento tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF) e uma porção intracelular que funciona como cinase para fosforilar aminoácidos tirosina em proteínas e assim a influenciar a proliferação celular. São conhecidas várias classes de tirosina-cinases receptoras (Wilks, Advances in Câncer Research 60: 43-73, 1993) com base em famílias de factores de crescimento que se ligam a diferentes tirosina-cinases receptoras. A classificação inclui as tirosina-cinases receptoras de Classe I compreendendo a família EGF de tirosina-cinases receptoras tais como os receptores de EGF, TGFa, NEU, erbB, Xmrk, HER e let23, as 2

ΕΡ 1 272 188 /PT tirosina-cinases receptoras de Classe II compreendendo a família de tirosina-cinases receptoras da insulina tais como os receptores da insulina, de IGFI e o receptor relacionado com a insulina (IRR), e as tirosina-cinases receptoras de Classe III compreendendo a família de tirosina-cinases receptoras do factor de crescimento derivado das plaquetas tais como os receptores de PDGFaa, PDGFhb e do factor estimulador de colónias 1 (CSF1).

Sabe-se que as cinases de Classe I tais como a família EGF de tirosina-cinases receptoras estão frequentemente presentes em cancros epiteliais humanos vulgares tais como o cancro da mama (Sainsbury et al., Brit. J. Câncer 58: 458, 1988; Guerin et al., Oncogene Res. 3: 21, 1988; e Klijn et al., Breast Câncer Res. Treat. 29: 73, 1994), cancros do pulmão das células não pequenas (NSCLC) incluindo adenocarcinomas (Cerny et al., Brit. J. Câncer 54: 265, 1986; Reubi et al., Int. J. Câncer 45: 269, 1990; e Rusch et al., Câncer Research 53: 2379, 1993) e cancro das células escamosas do pulmão (Hendler et al., Câncer Cells 7: 347, 1989), cancro da bexiga (Neal et al., Lancet 366, 1985), cancro esofágico (Mukaida et al., Câncer 68: 142, 1991), cancro gastrointestinal tal como cancro do cólon, rectal ou do estômago (Bolen et al., Oncogene Res. 1 : 149, 1987), cancro da próstata (Visakorpi et al., Histochem. J. 24: 481, 1992), leucemia (Konaka et al., Cell 37: 1035, 1984) e cancro do ovário, dos brônquios ou pancreático (EP-A-0400586). À medida que mais tecidos tumorais humanos são testados quanto à família EGF de tirosina-cinases receptoras espera-se que a sua prevalência disseminada seja estabelecida em mais cancros tais como o cancro da tiróide e uterino. Foi mostrado mais recentemente (W.J. Gullick, Brit. Med. Buli. 47: 87, 1991) que os receptores de EGF que possuem actividade de tirosina-cinase são sobre-expressos em muitos cancros humanos tais como tumores do cérebro, das células escamosas do pulmão, da bexiga, gástricos, da mama, da cabeça e do pescoço, esofágicos, ginecológicos e da tiróide.

Concordantemente foi reconhecido que um inibidor das tirosina-cinases receptoras deve ser valioso como inibidor selectivo do crescimento de células de cancro epiteliais (Yaish et al., Science 242: 933, 1988) . 3

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Sabe-se da EP-A-0566226 e dos Pedidos de Patente Internacional WO-A-96/33980 e WO-A-97/30034 que certos derivados de quinazolina que possuem um substituinte anilino na posição 4 possuem actividade inibidora da tirosina-cinase EGFR e são inibidores da proliferação de tecido cancerígeno.

Sabe-se ainda dos Pedidos de Patente Internacional WO-A-96/30347 e WO-A-97/38983 que certos derivados de quinazolina estruturalmente aparentados possuindo um substituinte anilino na posição 4 possuem também actividade inibidora da tirosina-cinase EGFR.

Subsequentemente mostrou-se que muitos outros derivados de 4-anilinoquinazolina e compostos estruturalmente aparentados destes possuem actividade inibidora da tirosina-cinase EGFR.

Compostos particulares que foi afirmado possuírem uma potente actividade inibidora da tirosina-cinase EGFR incluem: N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolino-propoxi)quinazolin-4-amina (identificado daqui em diante pelo número de código ZD1839); N-(3-etinilfenil)-6, 7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (identificado daqui em diante pelo número de código CP358774); e 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (identificado daqui em diante pelo número de código PD0183805) divulgados, por exemplo, em J. Med. Chem. 42: 1803-1815, 1999.

Todos os de cima referem-se ao tratamento de células completamente cancerosas. Assim, crê-se que tais inibidores da tirosina-cinase EGFR operam para inibir a sinalização a jusante para EGFR em células cancerosas ER e inibem desse modo a proliferação de tais células.

Quanto às células normais, sabe-se que EGF pode ter um efeito mitogénico numa variedade de células epiteliais não transformadas criadas em cultura (Carpenter et al., Annual Reviews in Biochemistry 48: 193, 1979) incluindo células das glândulas mamárias de ratinho mas que EGF pode também ter um efeito inibidor do crescimento em certas linhas celulares e 4

ΕΡ 1 272 188 /PT em tecido mamário naturalmente em proliferação em ratinhos (Coleman et ai., Developmental Biology 137: 425, 1990) .

Verificámos agora que o inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839 possui efeitos não apenas no crescimento de células cancerosas epiteliais transformadas mas também no crescimento constitutivo de células epiteliais normais. Por exemplo, em tecido epitelial mamário humano normal na mulher o estrogénio estimula o crescimento normal e induz a expressão do receptor da progesterona. Isto permite que os efeitos hormonais de um segundo esteróide sexual sejam mediados no epitélio da mama. 0 crescimento constitutivo, por exemplo, de células epiteliais mamárias, compreende a renovação limiar não dependente de estrogénio das células o que diminui com a idade da mulher e após a menopausa.

Assim, utilizando um modelo de xenoenxerto envolvendo a implantação e o crescimento de tecido da mama normal humano e cancro da mama in situ em ratinhos BALB/c nu/nu atimicos (Holland et al., J. National Câncer Institute 89: 1059, 1997 e Gandhi et al., Câncer Research 60: 4284-4288, 2000), verificámos agora que o inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839 possui efeitos na proliferação constitutiva e estimulada por estrogénio de epitélio da mama benigno e pré-maligno pré-menopausa [Carcinoma Ductal in situ (DCIS)]. O efeito inibidor no crescimento constitutivo e estimulado por estrogénio proporciona um método para a inibição da transformação de células normais em células cancerosas, i.e. a base para o tratamento quimiopreventivo de mulheres, particularmente das que têm um risco mais elevado de desenvolver cancro da mama maligno. O inibidor da tirosina-cinase EGFR pode portanto ser utilizado para reduzir, de preferência para inibir, a transformação de células epiteliais, em particular células epiteliais mamárias, de um estado normal para um maligno.

Dado que se sabe que EGF é capaz de ter um efeito inibidor do crescimento em certas linhas celulares e em tecido mamário naturalmente em proliferação em ratinhos, presumivelmente através do seu receptor de crescimento, é surpreendente que um composto que bloqueia de facto tal 5 ΕΡ 1 272 188 /PT recepção de crescimento (um inibidor de EGFR) deva reduzir também a proliferação.

Assim, ao contrário dos anti-estrogénios convencionais tais como Tamoxifeno, que operam eficazmente a bloquear o efeito do estrogénio sobre o receptor do estrogénio e a baixar a produção de EGF/TGFa pela célula, e ao contrário do mecanismo anteriormente mencionado de operação dos inibidores de EGFR em células de cancro ER (novamente associado ao bloqueio de EGFR), crê-se que o inibidor de EGFR ZD1839, quando administrado in vivo a um epitélio mamário benigno ou in vivo a cancro mamário não invasivo (seja ER+ ou ER-), é operativo através do bloqueio directo do papel de proliferação celular da tirosina-cinase. Assim, ao bloquear directamente a tirosina-cinase EGFR, a natureza da sensibilidade à hormona das células torna-se irrelevante; i.e., o fármaco opera através de um mecanismo não hormonal.

Em mais detalhe, primeiro em relação ao crescimento celular, na mama, a maioria das células do crescimento são EGFR+ e ER-. Na ausência de um inibidor de EGFR, o estrogénio estimula (apenas) células ER+, que segregam a produção de EGF, que por sua vez actua nas células ER- de um modo parácrino para induzir a proliferação. Os inibidores da TK EGFR do presente invento ligam-se directamente a EGFR nas células ER- para inibir tal proliferação.

Por outro lado, a morte celular (apoptose) é evitada através de sinais de sobrevivência tanto da matriz tecidual como de factores de crescimento. 0 factor de crescimento semelhante à insulina (IGF1) sinaliza através do Receptor de IGFl para impedir a morte celular na mama.

Um trabalho recente por Roudabush et al. (J. Biol. Chem. 275: 22583-22589, 2000) demonstrou que a estimulação de IGFR induzida por IGFR conduz à secreção de um membro da família EGF fora da célula que actua então no EGFR da própria célula e das células vizinhas. O bloqueio do EGFR na mama por inibidores da TK EGFR no presente invento conduz portanto a morte celular (apoptose) in vitro e in vivo no epitélio da mama. 6

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Surpreendentemente, a TKI EGFR pode actuar directamente, não só no EGFR expresso nas células ER- como independentemente em células ER+. R.B. Clarke et al., em Câncer Research (57: 4987-4991, 1997), mostraram que células epiteliais da mama ER+/EGFR-normais não proliferam enquanto que células ER-/EGFR+ vizinhas sim, indicando que a proliferação ocorre através de dois mecanismos, nomeadamente estimulação por estrogénio de: (1) células ER+ e (2) EGF e ligandos relacionados segregados por células ER+ de forma a estimularem de forma parácrina células EGFR+/ER- vizinhas.

Através da inibição de TK com TKI EGFR, as células ER-/EGFR+ vizinhas são impedidas de proliferar.

Adicionalmente, os nossos dados demonstram que a TKI EGFR impede também a expressão do receptor de progesterona induzido por estrogénio em células ER+ e reduz a renovação de células ER+.

Assim, o estrogénio induz o receptor da hormona esteróide e a síntese proteica em células ER+ normais para permitir a proliferação e o crescimento e a capacidade de resposta à hormona de uma célula para segregar factores estimulantes do crescimento (p. ex. EGF) que actuam em células epiteliais da mama ER- vizinhas.

No entanto, uma vez que o inibidor de TK EGFR previne a indução do receptor da progesterona pelo estrogénio em células ER+, este reduz a sensibilidade e estimulação hormonal do epitélio da mama e impede a transformação de tecido normal em canceroso. 0 índice de marcação do receptor da progesterona (PRLI), que cai em tecido da mama normal não exposto a níveis pré-menopausa de estrogénio para cerca de 5%, aumenta para 15% após exposição a estrogénio (I.J. Laidlaw et al., Endocrinology 136: 164-171, 1994). A utilização de ZD1839 7

ΕΡ 1 272 188 /PT para antagonizar a estimulação de estrogénio abole este aumento conduzindo a um PRLI de 10%.

Adicionalmente, pode ser utilizado um inibidor da tirosina-cinase EGFR em tecido epitelial, em particular tecido epitelial mamário, que se desenvolveu até um estádio intermédio não invasivo entre epitélio normal, em particular epitélio normal da mama, e epitélio maligno invasivo, em particular epitélio maligno invasivo da mama, para prevenir a proliferação de tais células ou para fazer com que o tecido epitelial em tais células reverta substancialmente de novo para um estado normal.

Exemplos de tais células de estádio intermédio são as associadas a hiperplasia ductal atípica, neoplasia lobular e células cancerígenas não invasivas in situ presentes dentro do dueto e/ou no lúmen de uma mama. Tais células podem estar presentes em pacientes em elevado risco de cancro da mama. De acordo com o primeiro, segundo e terceiro aspectos do presente invento representado através das alternativas (a)-(c) abaixo, é proporcionada a utilização de um inibidor da tirosina-cinase EGFR no fabrico de um medicamento para utilizar em quimioprevenção do surgimento de cancro da mama num ser humano sem cancro da mama invasivo, especialmente uma mulher, através simultaneamente da diminuição da proliferação e do aumento da apoptose de células epiteliais num estado normal ou num estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, deste modo (a) reduzindo, de preferência inibindo, a transformação de células epiteliais, em particular células epiteliais mamárias, de um estado normal para um maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; (b) reduzindo, de preferência inibindo, a transformação de células epiteliais, em particular células epiteliais mamárias, de um estado intermédio, tal como definido acima, para um estado maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; ou (c) causando uma reversão substancial do tecido epitelial, em particular tecido epitelial mamário, novamente para um estado normal a partir do estado intermédio, tal como anteriormente definido, entre epitélio normal, em 8

ΕΡ 1 272 188 /PT particular epitélio normal da mama, e epitélio maligno invasivo, em particular epitélio maligno invasivo da mama; cujo inibidor da tirosina-cinase EGFR é ZD1839. 0 presente invento, de acordo com cada um do primeiro e segundo aspectos (a) e (b) acima, é particularmente aplicável a pacientes em elevado risco de cancro da mama, designados pacientes de "alto risco". Sabe-se como classificar pacientes de elevado risco como sendo aqueles possuindo um registo de pelo menos 1,5 no designado Modelo de Risco de Gail, um programa gerado por computador aceitável para avaliação do risco de cancro da mama (ver M.H. Gail et al., J. Natl. Câncer Inst. 81: 1879-1886, 1989). Os factores que aumentam o risco de desenvolvimento de cancro da mama incluem a presença de células intermédias associadas a hiperplasia atípica incluindo a história desta assim como de cancro da mama num parente em primeiro grau), neoplasia lobular, cancro in situ não invasivo ou a presença de um gene BRCAI mutante (ver D.L. Page et al., BMJ 309: 61-64, 1994).

Assim, o presente invento é especialmente aplicável ao tratamento de células intermédias.

Um tal medicamento, tal como produzido acima, pode ser empregue num método para redução, de preferência inibição, da transformação de células epiteliais, em particular células epiteliais mamárias, de um estado normal para um maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo, especialmente uma mulher, que compreende a administração de uma quantidade eficaz do inibidor da tirosina-cinase EGFR.

Um medicamento, tal como produzido acima, pode também ser empregue num método para redução, de preferência inibição, da transformação de células epiteliais, em particular células epiteliais mamárias, de um estado intermédio para um maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo, especialmente uma mulher, que compreende a administração de uma quantidade eficaz do inibidor da tirosina-cinase EGFR. 9

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Tais métodos de administração tal como descritos acima são particularmente aplicáveis a pacientes de elevado risco e a tratamento de células intermédias, tal como anteriormente aqui definido.

Um tal medicamento, tal como produzido acima, pode ser empregue num método que compreende a administração a um ser humano sem cancro da mama invasivo, especialmente uma mulher, de uma quantidade eficaz do inibidor da tirosina-cinase EGFR.

Em utilização, o inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839 pode ser administrado sozinho ou numa composição contendo um excipiente farmaceuticamente aceitável. De preferência, é administrado na forma de comprimidos.

Será geralmente administrado para que seja dada uma dose eficaz, não tóxica. 0 tamanho da dose variará naturalmente de acordo com a via de administração ao paciente escolhida. Em geral, podem ser empregues doses convencionais do inibidor da tirosina-cinase EGFR. Mais particularmente, para o inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839, é administrada uma dose diária no intervalo de, por exemplo, de cerca de 10 mg a 5 g, de preferência de cerca de 10 mg a 1000 mg, de maior preferência de cerca de 10 mg a 500 mg (i.e. cerca de 0,2 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, de preferência de cerca de 0,2 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal, sendo preferível de cerca de 0,2 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal), dada, se necessário, numa dose dividida. A inibição da transformação celular aqui definida acima pode ser aplicada como uma terapia única ou pode envolver, para além do inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839, uma ou mais substâncias e/ou tratamentos.

Assim, um quarto aspecto do presente invento proporciona um estojo medicinal do primeiro e segundo componentes activos para utilizar em quimioprevenção do surgimento de cancro da mama num ser humano sem cancro da mama invasivo através simultaneamente da diminuição da proliferação e do aumento de apoptose de células epiteliais num estado normal ou num estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, deste modo: 10

ΕΡ 1 272 188 /PT (a) reduzindo a transformação das células epiteliais de um estado normal para um maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; (b) reduzindo a transformação das células de um estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, para um estado maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; ou (c) causando uma reversão substancial do tecido epitelial, novamente para um estado normal a partir de um estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo; em que o primeiro componente activo é um inibidor da tirosina-cinase EGFR que é ZD1839 e o segundo componente activo é um anti-estrogénio.

Tal tratamento conjunto pode ser alcançado por meio de administração simultânea, sequencial, separada ou intermitente dos componentes individuais do tratamento. Por exemplo, em mulheres acima do risco médio de desenvolver cancro da mama, quando o inibidor da tirosina-cinase EGFR é utilizado para inibir a transformação de tecido mamário em cancro da mama, pode ser prática corrente utilizar uma combinação de diferentes formas de tratamento. O outro componente de um tal tratamento conjunto pode incluir um anti-estrogénio tal como tamoxifeno, fulvestrant (ICI 182780: faslodex) ou raloxifeno. Pode então ser benéfico empregar terapia sequencial, por exemplo, com um primeiro período de tratamento de cerca de 1 a 6 meses durante o qual é administrada uma dose convencional de um inibidor da tirosina-cinase EGFR tal como ZD1839, seguido de um segundo período de tratamento de cerca de 1 a 6 meses durante o qual é administrada uma dose convencional de um anti-estrogénio tal como tamoxifeno, fulvestrant ou raloxifeno. Deste modo é permitido um período através do qual é permitido algum crescimento constitutivo de tecido mamário para minimizar a extensão da atrofia tecidual.

Alternativamente a terapia de combinação pode incluir a administração contínua de um anti-estrogénio tal como tamoxifeno, fulvestrant ou raloxifeno e a administração intermitente do inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839. A 11

ΕΡ 1 272 188 /PT terapia intermitente do inibidor da tirosina-cinase EGFR pode envolver, por exemplo, um ciclo bimensal de tratamento compreendendo uma primeira porção envolvendo a dosagem do inibidor da tirosina-cinase EGFR ZD1839 durante um período de cerca de um mês seguido de uma segunda porção envolvendo um período isento do fármaco para a tirosina-cinase EGFR de cerca de um mês. A partir daí podem ser dados mais ciclos bimensais de tal tratamento.

As concretizações do presente invento serão agora descritas em mais detalhe com referência aos seguintes Exemplos e desenhos anexos nos quais: A Fig. 1 ilustra, para o Exemplo 2, a proliferação (Ki67 LI) e a apoptose (AI) em epitélio DCIS ER-/EGFR+ e ER+/EGFR-; e A Fig. 2 ilustra, para o Exemplo 3, a resposta à dose de ZD1839 em (a) DCIS e (b) mama normal.

Exemplo 1 0 efeito dos inibidores da tirosina-cinase EGFR do presente invento foi determinado utilizando um modelo de xenoenxerto envolvendo a implantação e o crescimento de tecido de mama normal humano e cancro da mama in situ em ratinhos BALB/c nu/nu atímicos (Holland et al., J. National Câncer Institute 89: 1059, 1997 e Gandhi et al., Câncer Research 60: 4284-4268, 2000). Tecido da mama normal e tecido de carcinoma ductal in situ (DCIS) de mulheres sujeitas a cirurgia terapêutica foi implantado como xenoenxertos em ratinhos fêmea. Após 14 dias, foi começada a dosagem diária de ZD1839 a 10 a 200 mg/kg durante um período de 14 dias. O tecido do xenoenxerto foi excisado aos dias 0, 14, 21 e 28. Pastilhas de 17-B-estradiol (2 mg) foram implantadas subcutaneamente num segundo conjunto de experiências (utilizando xenoenxertos de mama normal) no dia 14 tanto nos ratinhos de controlo como nos de tratamento e foi utilizada imunomarcação de Ki67 convencional para avaliar a proliferação epitelial (Ki67 é um anticorpo monoclonal para um marcador numa célula). 12

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Foram obtidos os seguintes resultados: índice de Ki67 Dia 0 Dia 21 Dia 2 8 Mama Normal Controlo Controlo Grupo de ZD1839 Controlo Grupo de ZD1839 Mediana 7,6 3,3 0,7 6,1 1,8 índice de Ki67 Dia 0 Dia 21 Dia 28 Tecido de DCIS Controlo Controlo Grupo de ZD1839 Controlo Grupo de ZD1839 Mediana 19,9 10,6 7,2 23 3,2 índice de Ki67 Dia 0 Dia 21 Dia 28 Mama Normal Estimulada com Estrogénio Controlo Controlo Grupo de ZD1839 Controlo Grupo de ZD1839 Mediana 10, 4 15, 7 1,5 14, 8 1,2

Exemplo 2

Sumário do Procedimento

Tecido da mama de 16 mulheres sujeitas a cirurgia para DCIS foi implantado em 16-20 ratinhos imunossuprimidos por experiência (8 xenoenxertos/ratinho). O tratamento começou 2 semanas após o implante e consistiu em administração diária por sonda esofágica de ZD1839 a 10-200 mg/kg durante 14-28 dias; estiveram presentes controlos apropriados. Os xenoenxertos foram removidos nos Dias 14, 21, 28 e 42 e depois avaliados quanto à proliferação (LI) através de imunomarcação com Ki6 7 e a apoptose (AI) através da morfologia.

Materiais e Métodos

Pacientes

Os participantes neste estudo foram mulheres que eram assistidas no Nightingale Breast Screening Assessment Centre ou no Symptomatic Breast Clinic em University Hospital of South Manchester, U.K. durante o período de Novembro de 1998 a Janeiro de 2000. As mulheres eram incluídas no estudo se tivessem mamogramas apresentando microcalcificação disseminada indicativa de DCIS e confirmação citopatológica 13 ΕΡ 1 272 188 /PT ou histopatológica do diagnóstico (n=16). Todas as amostras de tecido foram obtidas na excisão terapêutica de DCIS. A aprovação para remover tecido de amostras patológicas neste estudo foi concedida pelo South Manchester Medicai Research Ethics Committee.

Animais

Ratinhos nus atimicos de 8-10 semanas de idade, fêmeas, adultos, intactos (BALB/c nu/nu) foram obtidos a partir da colónia de procriação do Paterson Institute for Câncer Research. Foram mantidos sob condições convencionais com um ciclo de 12 horas de luz e escuro (luzes apagadas das 7 PM às 7 AM) em gaiolas com tecto de filtro. Foi-lhes fornecida ração irradiada e água filtrada ad libitum e camas irradiadas durante a procriação. Foram utilizadas ração, água e camas normais durante as experiências. Todos os cuidados com os animais e procedimentos cirúrgicos foram efectuados de acordo com Home Office Regulations e a UK Scientific Procedures (1986) Act. Para todos os procedimentos foi utilizada anestesia inalável de halotano (halotano a 2-4% em oxigénio; Halovet Vapouriser, International Market Supplies, Congleton, U.K.).

Tratamento de Amostras de Tecido

Para a preparação de espécimes para enxerto em ratinhos, pedaços de 1-2 cm3 de tecido da mama, contendo microcalcificações, foram tomadas no momento da cirurgia a partir do espécimen principal. Ao tecido fresco foi retirada a gordura em excesso e este foi imediatamente dividido sob condições estéreis em três ou quatro porções mais pequenas e colocado em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com 4,5 g/1 de glicose e sem piruvato de sódio (Gibco Life Technology, Paisley, Scotland, RU) à temperatura ambiente até à implantação nos ratinhos. No laboratório, o tecido foi colocado em DMEM fresco numa caixa de Petri estéril e o tecido foi cuidadosamente dissecado em amostras de 2 mm x 2 mm x 1 mm com uma lâmina de bisturi. Dependendo do volume de tecido disponível, foram aleatoriamente seleccionados entre 5 e 20 pedaços da caixa de Petri que não foram implantados nos ratinhos mas foram em vez disso utilizados 14

ΕΡ 1 272 188 /PT para histologia. Metade destes enxertos não implantados (dia 0) foram imediatamente fixados em formalina tamponada (formaldeido a 4%) durante 24 horas e a outra metade em fixador de Camoy durante 1 hora e depois foram todos armazenados em álcool a 70%. Após pelo menos 24 horas, as amostras de tecido fixadas foram colocadas individualmente em cassetes de tecido (Tissue Tek III, Bayer Diagnostics Ltd., Basingstoke, UK) e armazenadas em álcool a 70% até serem embebidas em parafina. Estas amostras representando o DCIS excisado de cada paciente, foram marcadas como espécimes do "Dia 0" e foram reservadas para revisão histológica, imunomarcação e contagem de células apoptóticas.

Implantação de Xenoenxertos em ratinhos nus

Tal como no Exemplo 1, cada amostra de um paciente foi dividida entre 10 e 32 ratinhos (dependendo do volume de tecido e do número de ratinhos disponíveis; número mediano, dezasseis). A transplantação de xenoenxertos para os ratinhos foi terminada em 90 minutos desde a remoção de tecido do doente. Foram feitas duas pequenas incisões medianas na pele ao longo da pele dorsal através das quais foram simetricamente colocados 8 pedaços de tecido (4 de cada lado) . A recuperação destes xenoenxertos nos momentos apropriados requereu re-anestesia dos ratinhos e excisão de cada enxerto utilizando dissecção fina. Os enxertos foram então processados para histologia tal como descrito acima para os espécimes do Dia 0. Para as experiências de ZD1839 a 100-200 mg/kg, os enxertos foram removidos nos Dias 14, 21 e 28; a menores doses (10-75 mg/kg), os enxertos foram retirados nos Dias 14, 28 e 42. Dois xenoenxertos foram removidos de cada ratinho em cada momento intermédio e 4 xenoenxertos a cada momento final.

Tratamento

Aos ratinhos foi administrado através de sonda esofágica durante 14-28 dias ZD1839 (10-200 mg/kg) ou veículo a começar no Dia 14 após a remoção dos primeiros 2 xenoenxertos. ZD1839 (4-(3-cloro-4-flurofenilamino)-7-metoxi-6(3-(4-morfolinil)-quinazolina), uma EGFR-TKI oralmente activa e selectiva foi 15 ΕΡ 1 272 188 /PT uma generosa oferta de AstraZeneca Pharmaceuticals. 0 veículo (controlo) foi polissorbato a 0,5%.

Avaliação Histológica dos Xenoenxertos

Todos os espécimes do Dia 0 e cada xenoenxerto foram embebidos em blocos de parafina. Secções de 3 μιη de cada bloco coradas com H&E foram examinadas quanto à presença de DCIS por um único patologista da mama com experiência; as que continham DCIS foram avaliadas quanto a apoptose e imunogenicidade do antigénio Ki67 (como marcador da proliferação epitelial) tal como anteriormente descrito. O grau nuclear e a presença ou ausência de comedo-necrose foram também avaliados em todos os espécimes do Dia 0 contendo DCIS. Adicionalmente, os espécimes do Dia 0 foram avaliados imuno-histoquimicamente quanto ao estado de ER, c-erbB-2, EGFR.

Avaliação da Morte Celular Apoptótica

As secções coradas com H&E de amostras de DCIS foram examinadas utilizando microscopia óptica quanto a evidências morfológicas de apoptose. Os critérios utilizados para identificar células apoptóticas são bem reconhecidos e incluem condensação de cromatina inicialmente nas margens do núcleo; condensação do citoplasma (cromofilia); destacamento das células circundantes, indicado pelo aparecimento de um halo branco característico em torno da célula moribunda; e gemulação citoplasmática para formar fragmentos ligados por membrana (corpos apoptóticos). Para adquirir o AI, foram contadas pelo menos 1000 células a uma amplificação de 400x utilizando um microscópio Zeiss e o número de células que apresentava morfologia apoptótica foi expresso como percentagem do número total contado.

Determinação imuno-histoquímica de ER e do Antigénio Nuclear Ki6 7

Foram empregues metodologias imuno-histoquímica de ER e Ki67. Estas foram anteriormente descritas (Gandhi et ai., Br. J. Câncer 78: 785-794, 1998). 16

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Tanto a coloração de ER como a de Ki67 foram predominantemente nucleares com uma absorção citoplasmática mínima. A intensidade da coloração foi variável, mas esta não foi avaliada separadamente e as células foram consideradas positivas ou negativas. 0 índice de Marcação (LI) de Ki67 foi calculado a partir da contagem de 1000 células epiteliais e o número de núcleos positivamente corados foi expresso como percentagem do número total contado. O estado de ER foi determinado contando também 1000 células e as lesões eram consideradas ER+ se >5% das células estivessem positivamente coradas para ER.

Determinação imuno-histoquímica de c-erbB-2, EGFR e pErkl/Erk2

Secções de cera de parafina (3 μπι de espessura) de tecido de cada espécimen foram cortadas, montadas em lâminas revestidas com APES (3-aminopropiletoxissilano) , a cera retirada e hidratadas antes da coloração imuno-histoquímica para o c-erbB-2, EGFR e Erkl/Erk2 fosforilado (p). A recuperação do antigénio foi alcançada através de um método de microondas (650 W) durante 30 minutos (min). A actividade de peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em peróxido de hidrogénio [1,5% (v/v) para EGFR e c-erbB-2, 3% (v/v) para pErkl/Erk2] em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 15 min. Para o antigénio c-erbB-2 e EGFR, as lâminas foram lavadas em TBS antes da utilização de soro de coelho normal a 10% para bloquear a ligação inespecífica e depois incubadas com o anticorpo primário a uma diluição de 1:20 para EGFR (monoclonal de ratinho anti-humano, NCL-EGFR; Novocastra labs, Newcastle upon Tyne, UK) e a uma diluição de 1:40 para c-erbB-2 (monoclonal de ratinho, MAB4022, Chemicon, Harrow, UK), durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma imunoglobulina de coelho anti-ratinho biotinilada (E413, Dako, High Wycombe, UK) foi aplicada como anticorpo secundário (diluição de 1:350, incubado durante 30 min) e após esta uma incubação de 30 min à temperatura ambiente com a peroxidase de rábano padrão de três camadas estreptavidina-avidina-biotina (K0377, Dako) para c-erbB-2 e EGFR. 17

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Para a detecção do antigénio pErkl/Erk2, as secções foram bloqueadas com soro humano normal a 20% durante 15 min antes da aplicação dos anticorpos primários policlonais de coelho anti-humano de pMEK, pErkl/Erk2, pElkl a uma diluição de 1:20 (9101L, New England Biolabs, UK) . Biogenex Multil Link a uma diluição de 1:100 (Euro/DPC, Llanberis, UK) foi aplicado como anticorpo secundário durante 1 h. Foi empregue um procedimento do estojo imuno-histoquímico de complexo avidina/biotina (Biogenex Concentrated Label, Euro/DPC).

Foi aplicado o cromogénio diaminobenzidina (Sigma, Poole, UK) durante 5 min e depois hematoxilina como contrastante durante 5 min.

Foram utilizados controlos negativos (IgG de ratinho genérica, X0931, Dako) e positivos (secções de células A431 para EGFR, e de tecido de DCIS que se mostrou anteriormente ser fortemente positivo para c-erbB-2 e pErkl/Erk2).

As colorações para c-erbB-2 e EGFR foram predominantemente membranosas mas houve também absorção citoplasmática e nuclear. Estas foram registadas como positivas (escala de 1-4) ou negativas em relação às lâminas de controlo positivas e negativas. A coloração para pErkl/Erk2 foi nuclear e citoplasmática e registada de acordo com a intensidade da coloração nos componentes nucleares e citoplasmáticos tal como anteriormente descrito (Gee et al., Int. J. Câncer 64: 269-273, 1995).

Todas as avaliações histológicas foram efectuadas por investigadores desconhecedores do grupo de tratamento. A reprodutibilidade das contagens foi avaliada pelo mesmo investigador registando novamente 10 lâminas coradas com o anticorpo Ki67 e 10 lâminas de H&E para a apoptose vários meses após a estimativa inicial. Os dois conjuntos de resultados assim obtidos estavam bem correlacionados através de análise de regressão (r=0,95, P<0,001). 18

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Proliferação epitelial em intestino normal de ratinho A metodologia de remoção, processamento do tecido intestinal para avaliação de Ki67 e registo foi anteriormente descrita (Potten e Grant, Br. J. Câncer 78: 993-1003, 1998). Métodos Estatísticos A análise estatística foi efectuada utilizando suporte lógico SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA) pelo CRC Department of Computing and Biomathematics no Paterson Institute for Câncer Research. Para cada caso mostrando epitélio da mama normal ou DCIS, foi feita uma comparação entre amostras recuperadas de ratinhos tratados com ZD1839 e de controlo a cada momento da avaliação. As amostras de tecido obtidas a cada momento da avaliação nos dois grupos de estudo foram consideradas serem estatisticamente independentes e foram comparadas utilizando o teste U de Mann Whitney. Todos os testes de significância foram bilaterais, utilizando o nível de significância convencional de 5%. Os dados das doses de ZD1839 separadas foram comprimidos após uma análise inicial ter demonstrado um efeito em todas as doses. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para examinar o grau de correlação entre variáveis métricas. A análise estatística da proliferação em epitélio intestinal foi através da comparação das medianas em cada posição das células epiteliais nas criptas.

Resultados A idade mediana das mulheres sujeitas a cirurgia foi n = intervalo (estado de menopausa).

Implante e recuperação dos xenoenxertos

DCIS

Dos 16 espécimes de tecido da mama que se verificou conterem DCIS na cirurgia, 13 (81,3%) produziram espécimes do Dia 0 que continham DCIS, dos quais 11 expressavam imuno-histoquimicamente EGFR+ com um registo mediano de 2 (intervalo de 1-3), e 2 foram EGFR-. Destes 11 casos EGFR+, 7 19

ΕΡ 1 272 188 /PT foram ER-/c-erbB-2 positivos (todos de elevado grau nuclear) e 3 ER+/c-erbB-2 positivos (1 de elevado grau, 2 de grau intermédio) e 1 ER+/c-erbB-2 negativo (grau baixo). Os 13 espécimes de tecido da mama deram origem a um total de 273 amostras de Dia 0 das quais 44 (16,1%) continham focos de DCIS. Foi implantado um total de 1904 xenoenxertos, dos quais 1858 (97,5%) foram recuperados com sucesso. Dos

1858 xenoenxertos recuperados, 329 (17,7%) continham DCIS. A recuperação mediana de DCIS por experiência foi 71% da esperada (intervalo de 14-91,3%). O DCIS foi recuperado em xenoenxertos dos Dias 14, 21, 28 e 42 em todas as 13 experiências.

Mama normal

Foi verificado tecido da mama histologicamente normal em todos os 16 espécimes removidos da cirurgia para DCIS. A maioria (97,6%) dos xenoenxertos implantados foi recuperada, dos quais 22,4% continham mama normal. Mama normal foi recuperada de todos os momentos em 100% de todas as experiências.

Todos os 16 casos eram ER+ e EGFR+ com um registo mediano de 1 (intervalo de 1-2) e 2 foram também fracamente positivos para c-erbB-2.

Mama Normal (Tabela 1) A Tabela 1 mostra a proliferação de EGFR+ (LI) e a apoptose (AI) em (a) mama normal e (b) epitélio DCIS tratados com ZD1839 (10-200 mg/kg [dados comprimidos]) versus com veículo a diferentes momentos. Os números entre parênteses representam os intervalos interquartis **p<0,01, ***p<0,001 versus controlo. Os xenoenxertos de mama normal tiveram uma diminuição no LI mediano dos Dias 0 a 14 (4,9 [IQR: 4,0-5,7] versus 3,8 [IQR: 2,7-5,1], p<0,05) que permaneceu então

inalterado durante os outros momentos (Dias 21, 28 e 42) . O LI mediano diminuiu no grupo tratado com ZD1839 em comparação com os controlos no Dia 21 (2,3 [IQR: 1,0-3,8] versus 4,1 [IQR: 2,8-5,2]), Dia 28 (2,2 [IQR: 1,7-3,3] versus 4,1 [IQR: 2,4-5,4]), e Dia 42 (1,7 [IQR: 1,1-2,6] versus 2,8 [IQR: 2,3-5,1]) (todos p<0,01). 20

ΕΡ 1 272 188 /PT

Todas as descobertas de AI foram descobertas semelhantes aos xenoenxertos tratados com DCIS de cima. Não se observou redução no AI mediano do Dia 0 a 14 (0,20 [IQR: 0,17-0,29] versus 0,18 [IQR: 0,10-0,21], p=0,90). No Dia 21 houve um aumento no AI mediano nos xenoenxertos tratados com ZD1839 em comparação com os controlos (0,36 [IQR: 0,23-0,53] versus 0,18 [IQR: 0,10 a 0,25, p<0,001). Após 14 dias de tratamento (Dia 28), o AI mediano equilibrou-se com os niveis de controlo (ZD1839 0,19 [IQR: 0,10-0,28] versus Controlo 0,18 [IQR: 0, 10-0,20] , p=0,35) .

Tabela 1 O efeito de ZD1839 na proliferação e apoptose em epitélio

normal da mama e DCIS

Mediana Dia 0 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Controlo ZD1839 Controlo ZD1839 LI Mama Normal 4,9 3,8 4,1 2,3** 3,4 2,2** (4,0-5,7) (2,7-5,1) (2,8-5,3) (1,0-3,8) (2,4-5,4) (1,7-3,3) DCIS 13,9 12,6 11,2 4,6** 13,1 5,1** (11,9-15) (9,1-14,1) (9,7-12,9) (3,2-7,2) (11,8-15,8) (3,2-10,6) AI Mama Normal 0,20 0, 18 0, 18 0,36** 0,18 0,19 (0,18-0,29) (0,10-0,21) (0,10-0,25) (0,23-0,53) (0,10-0,20) (0,10-0,28) DCIS 1,07 0,79 0,72 1,47** 0,46 0,64 (0,89-1,21) (0,53-1,19) (0,55-0,91) (1,25-2,18) (0,34-0,85) (0,38-1,15) LI/AI 23,9 25,7 15,9 3,9*** 33,8 8,5*** Mama Normal (18,3-43,3) (13,4-33,3) (8,0-26,3) (1,6-5,2) (21,4-70,6) (5,8-17,4) DCIS 12,1 12,1 17,7 2,7*** 29,7 4 4*** (8,4-15,8) (8,2-19,9) (12,7-22,0) (2,2-3,6) (13,1-40,2) (2,7-6,9) DCIS EGFR+ (Fig. 1) A Figura 1 mostra mudanças no LI e AI induzidas por ZD1839 em DCIS ER-/EGFR+ (la e lc) e ER+/EGFR+ (lb e ld) , respectivamente. Foi dado ZD1839 ou veiculo do Dia 14 em diante. Os valores para os dias 0 e 14 são de ratinhos não tratados. Foi observado um aumento no AI e uma diminuição no LI no grupo de ZD1839 após 7 e 14 dias de tratamento (*p<0,05, **p<0,01 versus controlo) tanto em DCIS ER-/EGFR+ como ER+/EGFR+. Os números entre parênteses representam o número de observações feitas para esse momento em particular 21

ΕΡ 1 272 188 /PT e para esse grupo. Os valores medianos são mostrados como linhas horizontais grossas, as caixas representam o intervalo interquartil. 0 LI e AI medianos em espécimes do Dia 0 foi superior nos 7 casos de DCIS ER-/EGFR+ que nos 4 casos de DCIS ER+/EGFR- (14,0 [IQR: 13,0-15,3] versus 7,8 [IQR: 6,5-11,2], e 1,3 [IQR: 1,0-1,6] versus 0,79 [IQR: 0,6-1,0], respectivamente, ambos p<0,05). O LI mediano em DCIS ER-/EGFR+ diminuiu no grupo tratado com ZD1839 em comparação com o grupo tratado com veículo pelo Dia 21 (4,7 [IQR: 2,6-17,2] versus 11,6 [IQR: 10,7-15,1], p=0,19), Dia 28 (8,3 [IQR: 2,7-10,9] versus 13,5 [IQR: 12,0- 16.3] , p<0,01), e Dia 42 (11,4 [IQR: 10,8-11,8] versus 13,0 [IQR: 12,0-14,8], p<0,05) (Fig. la). Não houve alteração no AI mediano em DCIS ER-/EGFR+ do Dia 0 ao 14 (1,3 [IQR: 1,0-1,6] versus 1,0 [IQR: 0,8-1,44], p=0,14). Após 7 dias de tratamento (Dia 21), houve um aumento significativo no AI mediano no grupo tratado com ZD1839 em comparação com o grupo tratado com veículo (2,1 [IQR: 1,0- 2.3] versus 0,7 [IQR: 0,5 a 1,1], p<0,01), embora, após 14 dias de tratamento (Dia 28), o AI mediano tivesse voltado aos níveis de controlo (ZD1839 1,1 [IQR: 0,8-1,2] versus Control 1,2 [IQR 0,5-1,5], p=0,44) (Fig. lb).

Mudanças semelhantes em LI e AI em DCIS ER+/EGFR+ (Fig. lb e ld) foram observadas com uma queda significativa em LI no Dia 14 (ZD1839 4,6 (IQR 3,9-5,2%) versus 11,2 Controlo (IQR 9,2-15,55) e uma subida na apoptose (ZD1839 1,5 (IQR 1,3-1,6) versus Controlo (IQR 0,6-0,9%). LI de Ki67 em EGFR+ (Fig. 2) A Figura 2 mostra as taxas de proliferação epitelial (LI de Ki67) em xenoenxertos EGFR+ de (a) DCIS e (b) mama normal após 2 semanas (Dia 28) de administração por sonda esofágica de diferentes doses de ZD1839 (10-200 mg/kg) ou de controlo de veículo. Os números entre parênteses representam o número de observações feitas para esse momento em particular e para esse grupo. Os valores medianos são mostrados como linhas 22

ΕΡ 1 272 188 /PT horizontais grossas, as caixas representam o intervalo interquartil.

Doses crescentes de ZD1839 foram associadas a quedas crescentes na proliferação epitelial em DCIS tanto ER-/EGFR+ como ER+/EGFR+ mas não em mama normal (Fig. 2).

Correlação da Proliferação com a Apoptose

Demonstrámos anteriormente uma correlação positiva do LI com o AI em DCIS. 0 LI mostrou uma correlação positiva com o AI na mama normal e em DCIS (r=0,10, p=0,02, e r=0,25, p<0,01, respectivamente) não tratados com ZD1839 (i.e., Dias 0, Dia 14, e casos de controlo de veiculo). A comparação da população celular utilizando a razão LI/AI mediana (como razão da renovação celular) revelou que o tratamento de ZD1839 inibiu significativamente a renovação celular tanto em DCIS como em mama normal no Dia 28 (4,4 [2,7-6,9] versus 29,7 [13,1-40,2], e 8,5 [5,8-17,4] versus 33,8 [21,4-70,6], respectivamente, p<0,001).

Subregulação de pErkl/2 em DCIS e mama normal tratados com TKI EGFR

Para determinar se a via de sinalização das MAP-cinases é efectuada através da inibição da tirosina-cinase EGFR, foi efectuada detecção imuno-histoquímica de Erkl/Erk2 fosforilado (p) em secções do Dia 0 e do Dia 42 de xenoenxertos de DCIS e de mama normal tratados com ZD1839 ou veículo. O registo (HScore) nuclear mediano de DCIS e de mama normal do Dia 0 foi 30 (IQR: 12-45) e 22 (IQR: 12-34) . Em DCIS, o registo (HScore) nuclear foi diminuído no grupo tratado com ZD1839 em comparação com os controlos após 28 dias de tratamento (8 [IQR: 5-18] versus 25 [IQR: 8-30], p<0,05). Em mama normal houve uma diferença semelhante (7 [IQR: 3-17,5] versus 18 [IQR: 8-32], p<0,01). O registo (HScore) Nuclear de pErkl/Erk2 correlacionou-se com o LI de Ki67 em DCIS e em mama normal (ambos r=0,52, p=0,05).

Discussão 23

ΕΡ 1 272 188 /PT Ο DCIS ER- sobre-expressa o oncogene c-erbB-2 e é também relatado como expressando EGFR em 50% dos casos. Verificámos uma dupla expressão de ambos os receptores na mesma população celular em 10 de 11 (90%) dos DCIS ER-. O DCIS ER- possui uma elevada taxa proliferativa, que em amostras pré-tratamento se correlacionou com uma elevada expressão da enzima de transdução do sinal de MAP-cinase.

Por essa razão colocámos a hipótese de que a formação de heterodímeros EGFR/c-erbB-2 era responsável pela elevada taxa de proliferação e expressão de MAP-cinase e testámos a nossa teoria através da utilização de um péptido TKI EGFR, ZD1839. No tratamento com ZD1839, foi observada uma queda prolongada na proliferação epitelial e uma diminuição na expressão da MAP-cinase combinadas com um aumento da apoptose num estado inicial confirmando a nossa hipótese. Sabe-se que EGFR produz um sinal mitogénico e se correlaciona com proliferação e duplicação de tumores em cancro da mama invasivo, e a inibição desta via conduziu a uma queda no índice de marcação de Ki67 em xenoenxertos de DCIS.

Foi observado um aumento da apoptose tanto em DCIS como em epitélio de mama normal após sete dias de tratamento. Embora se pense que o Factor de Crescimento Semelhante à Insulina-1 (IGF-1) seja importante na sobrevivência celular, o trabalho recente de Roudabush et al., J. Biol. Chern. 275: 22583-22589, 2000, indicou que a estimulação do receptor de IGF-1 conduz à secreção de EGF de ligação à heparina extracelularmente e promove transactivação no receptor de EGF. Assim, o EGFR pode ser mais importante para a sobrevivência celular na mama normal do que foi anteriormente reconhecido. Uma vez que a proliferação epitelial se correlaciona com a apoptose na mama normal seria de esperar que uma redução na proliferação se correlacionasse com uma redução na apoptose. Após o aumento inicial na apoptose após 7 dias no grupo tratado com ZD1839 a queda no índice de marcação (proliferação) conduziu a uma queda na apoptose aos 14 dias. No entanto, a razão global LI/AI nos grupos tratados com ZD1839 tanto em DCIS como em mama normal foi reduzida indicando uma menor renovação celular global com a inibição da TK EGFR. Para além disso a queda global na renovação 24

ΕΡ 1 272 188 /PT celular indica o potencial efeito quimiopreventivo de uma TKI EGFR na mama normal. 0 DCIS ER- de elevado grau está relatado como sendo o mais provável de recair após uma ampla excisão local e no relapso pelo menos 50% tornou-se cancro da mama invasivo de elevado grau com metástases nodais ou distantes associadas. A prevenção do relapso e da progressão para cancro invasivo requer um agente que suprima a proliferação ou aumente a apoptose e a TKI EGFR descrita preenche estes critérios.

Uma supressão da proliferação epitelial de mama normal combinada com um aumento da apoptose indica o potencial dos inibidores da TK EGFR como agentes quimiopreventivos em mulheres em risco aumentado de cancro da mama.

Crê-se que a via da MAP-cinase EGFR seja importante na proliferação, sobrevivência e diferenciação celulares. A significativa correlação positiva de pErkl/Erk2 com o índice de marcação de Ki6 7 em DCIS e mama normal sugere que a sinalização da MAP-cinase é importante a mediar a proliferação celular no epitélio da mama. Uma diminuição de pErkl/Erk2 no grupo tratado com ZD1839 correlacionou-se com uma queda na proliferação e é provável que EGFR sinalize através desta via e que as alterações da MAP-cinase prevejam a resposta ao fármaco.

Exemplo 3

Utilizando o método do Exemplo 1, os passos processuais do qual estão descritos mais completamente no Exemplo 2, foi medido o efeito de ZD1839 na proliferação (LI de Ki67) em epitélio de mama normal estimulado com estrogénio. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

No epitélio de mama normal, no Dia 0, a data de implantação num ratinho, o valor de LI de Ki67 foi de 4,1 e reduziu-se para 2,6 no 14° dia. Os ratinhos de controlo foram então tratados só com estrogénio, enquanto que os ratinhos de teste foram tratados com estrogénio e ZD1839. A quantidade de estrogénio administrado correspondeu a um nível pré-menopausa; i.e. uma pastilha de 17-B-estradiol (2 mg) (ver Holland et al., referido no Exemplo 1). Após 21 dias, o valor 25 ΕΡ 1 272 188 /PT de LI de Ki67 para os ratinhos de controlo foi tão elevado como 6,5, enquanto que para os ratinhos de teste o valor foi consideravelmente reduzido até um valor de 1,4. Após 28 dias, o valor de LI de Ki67 para os ratinhos de controlo foi de 5,4, enquanto que para os ratinhos de teste, o valor continuou a cair, até um nível tão baixo como 1,1.

Tabela 2 0 efeito de ZD1839 na proliferação (LI de Ki67) em epitélio de mama normal estimulado com estrogénio índice Mediano Dia 0 Dia 14 de Marcação de Ki67 Dia Controlo 21 ZD1839 Dia Controlo 28 ZD1839 Mama normal 4,1 2,6 6,5 1,4*** 5,4 ^ *** -L r -L estimulada com (3,2-5,3) (2,1-4) estrogénio (5-8,6) (0,8-1,9) (4,6-6,1) (0,9-1,6) Os números entre parênteses representam intervalos interquartis *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs controlo

Exemplo 4

Novamente utilizando o método do Exemplo 1, foi medido o efeito de ZD1839 na apoptose (AI) em epitélio de mama normal estimulado com estrogénio. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

No epitélio de mama normal, no dia 0, a data de implantação num ratinho, o valor de AI foi de 0,3 e reduziu-se para 0,2 no 14° dia. Os ratinhos de controlo foram então tratados só com estrogénio, enquanto que os ratinhos de teste foram tratados com estrogénio e ZD1839. A quantidade de estrogénio administrado correspondeu a um nível de pré-menopausa. Após 21 dias, o valor de AI para os ratinhos de controlo foi tão elevado como 0,5, enquanto que para os ratinhos de teste o valor foi ainda maior, a um valor de 0,7. Após 28 dias, o valor de AI para os ratinhos de controlo foi de 0,6, enquanto que para os ratinhos de teste, o valor permaneceu a um nível de 0,7. 26

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Tabela 3 0 efeito de ZD1839 na apoptose (AI) em epitélio de mama normal estimulado com estrogénio índice Dia 0 Dia 14 Dia 21 Dia 2 8 Apoptótico Mediano Controlo ZD1839 Controlo ZD1839 Mama normal 0,3 0,2 0,5 0,7 0,6 0,7 estimulada (0,19-0,3) (0,1-0,2) (0,45-0,65) (0,55-0,78) (0,45-0,66) (0,57-0,81 com estrogénio

Os números entre parênteses representam intervalos interquartis **p<0,01 vs controlo

Exemplo 5

Utilizando o mesmo regime de aplicação que no Exemplo 1, foi medido o efeito de ZD1839 na expressão do receptor da progesterona (LI de PR) em epitélio de mama normal estimulado com estrogénio (o receptor da progesterona aumenta a capacidade de resposta hormonal da célula). Os resultados são mostrados na tabela 4.

No epitélio de mama normal, no dia 0, a data de implantação num ratinho, o valor de LI de PR foi de 11,8 e reduziu-se para 5,8 no 14° dia. Os ratinhos de controlo foram então tratados só com estrogénio, enquanto que os ratinhos de teste foram tratados com estrogénio e ZD1839. A quantidade de estrogénio administrado correspondeu a um nível de pré-menopausa. Após 21 dias, o valor de LI de PR para os ratinhos de controlo subiu para tanto quanto 17,2, enquanto que para os ratinhos de teste o valor foi de apenas 10,4. A indução de estrogénio da expressão de PR foi portanto suprimida por ZD1839. Assim, os efeitos hormonais (normalmente mediados pelos receptores de progesterona) dos esteróides sexuais progesterona e androgénio são inibidos. 27

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Tabela 4 0 efeito de ZD1839 na expressão de PR (LI de PR) em epitélio de mama normal estimulado com estrogénio LI de PR Mediano (%) Dia 0 Dia 14 Dia Controlo 21 ZD1839 Mama normal 11,8 5,8 17,2 *10,4 estimulada com estrogénio (6,9-13,5) (4,5-7,7) (13,5-22,0) (8,9-13,1) Os números entre parênteses representam **p<0,001 vs controlo intervalos interquartis

Dos resultados de cima, pode-se observar que tal como aqui afirmado anteriormente, o efeito inibidor no crescimento constitutivo e o efeito promotor na morte de tecido celular da mama normal proporciona um método para inibição da transformação de células normais em células cancerosas, i.e., a base para o tratamento quimiopreventivo de mulheres, particularmente das que estão em maior risco de desenvolver cancro da mama maligno.

Estudos de epitélio de mama normal mostram que a terapia de substituição hormonal (TSH) aumenta a expressão do receptor de progesterona (ver Hargreaves et al., Br. J. Câncer 78 ( 7) : 945-949, Out. de 1998 e Hofscth et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 84(12): 4559-4565, Dez. 1999) e a TSH combinada (estrogénio e progesterona) aumenta significativamente mais a proliferação epitelial da mama que a TSH só com estrogénio (ver Hofstch, supra). A utilização de TSH combinada de mais longo prazo possui uma maior taxa de indução de cancro da mama em comparação com TSH só com estrogénio (ver Persson et al., Câncer Causes Control 10(4): 253-260, Ago. 1999; Colditz, J. Womens Health 8(3): 347-357, Abr. 1999; e Magnusson et al., Int. J. Câncer 81(3): 339-344, 5 de Maio de 1999). Através da inibição da indução do receptor da progesterona, a progesterona não pode exercer os seus efeitos e a frequência de desenvolvimento de cancro da mama é reduzida.

Adicionalmente, o efeito de inibição em tecido de mama normal estimulado com estrogénio indica que o inibidor da tirosina-cinase EGFR funcionará sozinho mesmo na presença de 28 ΕΡ 1 272 188 /PT elevados níveis de estrogénio; i.e. para proporcionar quimioprevenção em mulheres em pré-menopausa.

Assim, a inibição da TK EGFR utilizando ZD1839 oferece uma nova abordagem ao tratamento e prevenção de cancro independentemente do estado de ER e proporciona uma potencial nova abordagem quimiopreventiva, especialmente em famílias em elevado risco de cancro da mama.

Lisboa,

Claims

ΕΡ 1 272 188 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor da tirosina-cinase EGFR no fabrico de um medicamento para utilizar em quimioprevenção do surgimento de cancro da mama num ser humano sem cancro da mama invasivo através de, simultaneamente, diminuição da proliferação e aumento da apoptose de células epiteliais num estado normal ou num estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, deste modo: (a) reduzindo a transformação das células de um estado normal para um maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; (b) reduzindo a transformação das células de um estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, para um estado maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; ou (c) causando uma reversão substancial do tecido epitelial novamente para um estado normal a partir do estado intermédio entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo; em que o inibidor da tirosina-cinase EGFR é ZD1839.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é uma combinação do inibidor da tirosina-cinase EGFR como primeiro componente activo e um anti-estrogénio como segundo componente activo, componentes estes que são administráveis simultânea ou separadamente.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o anti-estrogénio é seleccionado a partir de tamoxifeno, fulvestrant ou raloxifeno.
4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tecido epitelial é tecido epitelial mamário.
5. Estojo medicinal de primeiro e segundo componentes activos para utilização combinada em quimioprevenção do surgimento de cancro da mama num ser humano sem cancro da mama invasivo através de, simultaneamente, diminuição da proliferação e aumento da apoptose de células epiteliais num ΕΡ 1 272 188 /PT 2/2 estado normal ou num estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, deste modo: (a) reduzindo a transformação de células epiteliais de um estado normal para um maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; (b) reduzindo a transformação das células de um estado intermédio, entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo, para um estado maligno num ser humano sem cancro da mama invasivo; ou (c) causando uma reversão substancial do tecido epitelial novamente para um estado normal a partir de um estado intermédio entre epitélio normal e epitélio maligno invasivo; em que o primeiro componente activo é um inibidor da tirosina-cinase EGFR que é ZD1839 e o segundo componente activo é um anti-estrogénio.
6. Estojo medicinal de acordo com a reivindicação 5, em que o anti-estrogénio é seleccionado a partir de tamoxifeno, fulvestrant ou raloxifeno. Lisboa,