NO323206B1 - Anvendelse av EGFR-tyrosinkinase-inhibitor for fremstilling av et medikament, og et medisinsk testsett som omfatter en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av forbindelser som har inhiberende virkning overfor epidermal vekstfaktor-reseptor-(EGFR)-tyrosinkinase-enzymet. Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse anvendelse av EGFR-tyrosinkinase-inhibitor for fremstilling av et medikament, og et medisinsk testsett som omfatter en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor. Forbindelsene anvendes for fremstilling av et medikament, og i et medisinsk testsett for anvendelse i kjemoprevensjon av start av brystkreft.

I de senere år er det blitt oppdaget at en celle kan bli en kreftcelle ved transformasjon av en del av dens DNA til et onkogen, dvs. et gen som ved aktivering fører til dannelse av maligne tumorceller (Bradshaw, Mutagenesis, 1986,1, 91). Flere slike onkogener gir opphav til dannelse av proteiner som er reseptorer for vekstfaktorer. Vekstfaktor-reseptor-komplekset fører deretter til en økning i celleproliferasjonen. Det er for eksempel kjent at flere onkogener koder for tyrosinkinase-enzymer, og at visse vekstfaktor-reseptorer også er tyrosinkinase-enzymer (Yarden et al., Ann. Rev. Biochem., 1988, 57, 443; Larsen et al., Ann. Reports in Med. Chem. 1989, kap. 13).

Reseptor-tyrosinkinaser er viktige ved overføring av biokjemiske signaler som initierer cellereplikasjonen. De er store enzymer som spenner over cellemembranen og har et ekstracellulært bindingsdoméne for vekstfaktorer så som epidermal vekstfaktor (EGF), og en intracellulær del som funksjonerer som en kinase under fosforylering av tyrosin-aminosyrer i proteiner, og følgelig innvirker på celleproliferasjonen. Forskjellige klasser reseptor-tyrosinkinaser er kjent (Wilks, Advances in Cancer Research, 1993, 60, 43-73) basert på familier av vekstfaktorer som bindes til forskjellige reseptor-tyrosinkinaser. Klassifikasjonen innbefatter reseptor-tyrosinkinaser i klasse I, omfattende EGF-familien av reseptor-tyrosinkinaser så som EGF-, TGFa-, NEU-, erbB-, Xmrk-, HER- og Iet23-reseptorene, reseptor-tyrosinkinaser i klasse II, omfattende insulinfamilien av reseptor-tyrosinkinaser så som insulin-, IGFI- og insulinbeslektet reseptor-(IRR)-reseptorer og reseptor-tyrosinkinaser i klasse III, omfattende blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF)-familien av reseptor-tyrosinkinaser så som PDGFota-, PDGFfJb- og colonistimulerende faktor 1-(CSF1 preseptorene.

Det er kjent at klasse l-kinaser så som EGF-reseptor-tyrosinkinase-familien ofte finnes ved vanlige humane epitelkrefttyper så som brystkreft (Sainsbury et al., Brit. J. Cancer, 1988, 58, 458; Guerin et al., Oncogene Res., 1988, 3, 21 og Klijn et al., Breast Cancer Res. Treat, 1994, 29, 73), ikke-småcelle-lungekrefttyper (NSCLC) innbefattende adenokarsinomer (Cerny et al., Brit. J. Cancer, 1986, 54, 265; Reubi et al., Int. J. Cancer, 1990, 45, 269; og Rusch et al., Cancer Research, 1993, 53, 2379) og skjellcellekreft i lungen (Hendler et al., Cancer Cells, 1989, 7, 347), blærekreft (Neal et al., Lancet, 1985, 366), spiserørskreft (Mukaida et al., Cancer, 1991, 68,142), gastrointestinalkreft så som tykktarms-, rektal- eller magekreft (Bolen et al., Oncogene Res., 1987,1,149), kreft i prostata (Visakorpi et al., Histochem. J„ 1992, 24, 481), leukemi (Konaka et al., Cell, 1984, 37, 1035) og ovarie-, bronkial- og pankreaskreft (EP-A-0400586). Siden ytterligere humane tumorvev undersøkes med henblikk på EGF-reseptor-tyrosinkinasefamilien, er det ventet at den utbredte forekomst av dem vil bli påvist ved ytterligere krefttyper så som tyreoidea- og uteruskreft. Det er i den senere tid blitt vist (W.J. Gullick, Brit. Med. Bull., 1991, 47, 87) at EGF-reseptorer som har tyrosinkinaseaktivitet, er over-uttrykt ved mange krefttyper hos mennesker så som hjemetumorer, lunge-skjellcelletumorer, blæretumorer, magetumorer, brysttumorer, hode- og halstumorer, spiserør-tumorer, gynekologiske og tyreoidea-tumorer.

Man er følgelig blitt klar over at en inhibitor for reseptortyrosinkinaser skulle ha verdi som en selektiv inhibitor for veksten av epitelkreftceller (Yaish et al., Science, 1988, 242, 933).

Det er kjent fra EP-A-0566226 og internasjonale patentsøknader WO-A-96/33980 og WO-A-97/30034 at visse kinazolinderivater som har en anilinsubstituent i 4-stillingen, har EGFR-tyrosinkinase-inhiberende virkning og er inhibitorer for proliferasjon av kreftvev.

Det er videre kjent fra internasjonale patentsøknader WO-A-96/30347 og WO-A-97/38983 at visse strukturelt beslektede kinazolinderivater med en anilinsubstituent i 4-stillingen også har EGFR-tyrosinkinase-inhiberende aktivitet.

Videre er mange andre 4-anilinkinazolin-derivater og strukturelt beslektede forbindelser derav blitt vist å ha EGFR-tyrosinkinase-inhiberende aktivitet. Hvilken som helst slik forbindelse som har denne aktivitet og passende biotilgjengelighet, er egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse.

Spesielle forbindelser som er blitt angitt å ha potent EGFR-tyrosinkinase-inhiberende aktivitet, innbefatter: N-(3-klor-4-fluorfenyl)-7-metoksy-6-(3-morfolinopropoksy)kinazolin-4-amin (identifisert i det følgende med kodenummer ZD1839); N-(3-etylfenyl)-6,7-bis(2-metoksyetoksy)kinazolin-4-amin (identifisert i det følgende ved kodenummer CP358774;

6-akrylamid-N-(3-klor-4-fluorfenyl)-7-(3-morfolinopropoksy)kinazolin-4-amin (identifisert i det følgende ved kodenummer PD0183805) beskrevet for eksempel i J. Med. Chem., 1999, 42,1803-1815; og

pyrrolopyrimidin (identifisert i det følgende ved kodenummeret PK1166 (CGP75166).

A. J. Bridge, Emerging Drugs: The Prospect for Improved Medicines, Annual Executive Briefing, 1998, kapittel 18,"Current progress towards the development of tyrosine kinase inhibitors as anticancer agents." tilveiebringer en oversikt over litteratur opp til 1998 rapporterende effekten av tyrosinkinase-inhibitorer (TKI'er) på invasive kreftceller i pasienter som allerede lider av full invasiv kreft, med forskjellige midler. Spesielt tilveiebringes testsett av EG FR- og PDGFR-inhibitorer, inkludert ZD1839. Imidlertid nevnes ikke den mulige rollen til en TKI, heller ikke ZD1839, i behandling av pasienter fri for invasiv brystkreft, for slik å tillate profylaktisk behandling av slike pasienter, spesielt slike pasienter som er kjent å være høyrisikopasienter. Spesielt nevnes heller ikke den overraskende oppførselen til ZD1839 i forhold til normale - eller brystepitelceller i mellomtilstand.

Alt det ovenstående angår behandling av fullstendige kreftceller. Det var følgelig antatt at slike EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer opererer slik at de inhiberer den nedstrøms signalisering for EGFR i ER- -kreftceller og derved inhiberer proliferasjon av slike celler.

Når det gjelder normale celler, er det kjent at EG F kan ha mitogen effekt i mange forskjellige ikke-transformerte epitelceller dyrket i kultur (Carpenter et al., Annual Reviews in Biochemistry, 1979, 48,193) innbefattende celler fra muse-brystkjertler, men at EGF også kan ha vekstinhiberende virkning for visse cellelinjer og for naturlig prolifererende brystvev i mus (Coleman et al., Developmental Biology, 1990, 137, 425).

Vi har nå funnet at EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer ikke bare har virkninger på veksten av transformerte epitelkreftceller, men også på den konstitutive vekst av normale epitelceller. I for eksempel normalt humant brystepitelvev hos kvinner stimulerer østrogen normal vekst og induserer ekspresjon av progesteron-reseptoren. Dette muliggjør at de hormonelle virkninger av et annet kjønnssteroid kan medieres i brystepitelet. Konstitiv vekst av for eksempel brystepitelceller omfatter den ikke-østrogenavhengige basislinje-fornying av celler som reduseres med kvinnens alder og etter menopausen.

Ved anvendelse av en xenotransplantatmodell som innbefatter implantasjon og vekst av humant normalt brystvev og in situ-brystkreft i atymiske BALB/c nu/nu-mus (Holland et al., J. National Cancer Institute, (1997), 89,1059 og Gandhi et al., Cancer Research, (2000), 60,4284-4288), har vi følgelig nå funnet at EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer har virkninger på den konstitutive og østrogenstimulerte proliferasjon av premenopausalt benignt og premalignt [duktalkarsinom in situ (DCIS)j brystepitel. Den inhiberende virkning på konstitutiv og østrogenstimulert vekst tilveiebringer en metode for inhibering av transformasjonen av normale celler til kreftceller, dvs. grunnlaget for den kjemopreventive behandling av kvinner, spesielt slike som har høyere risiko for å utvikle malign brystkreft.

En EGFR-tyrosinkinase-inhibitor kan derfor anvendes til reduksjon, fortrinnsvis til inhibering, av transformasjon av epitelceller, spesielt brystepitelceller, fra normal til malign tilstand.

På bakgrunn av at EG F er kjent for å være i stand til å ha en vekstinhiberende virkning på visse cellelinjer og naturlig prolifererende brystvev hos mus, antakelig via sin vekstreseptor, er det overraskende at en forbindelse som faktisk blokkerer slikt vekstmottak (en EGFR-inhibitor), også skulle redusere proliferasjonen.

Følgelig antas det at EGFR-inhibitorene, i motsetning til for vanlige antiøstrogener så som Tamoxifen, som effektivt virker ved at de blokkerer virkningen av østrogen på østrogenreseptoren og senker EGF/TGFa-produksjonen hos cellen, og, i motsetning til den tidligere nevnte mekanisme for virkning av EGFR-inhibitorer på ER-kreftceller (igjen forbundet med EGFR-blokkering), virker ved direkte blokkering av tyrosinkinasens celleprolifererende rolle, når de administreres til benignt brystepitel in vivo eller til ikke-invasiv brystkreft in vivo (enten ER+ eller ER-). Ved direkte blokkering av EG FR-tyrosinkinasen blir følgelig beskaffenheten av hormonfølsomheten hos cellene irrelevant; dvs. at medikamentene virker via en ikke-hormonell mekanisme.

Idet det først skal vises til cellevekst, er, mer detaljert angitt, de fleste vekstceller i brystet EGFR+ og ER-. I fravær av en EGFR-inhibitor stimulerer østrogen (bare) ER+-celler, som gir EGF-dannelse, som i sin tur virker på ER- - cellene på en parakrin måte under induksjon av proliferasjon. EGFR TK-inhibitorer ifølge oppfinnelsen bindes til EGFR direkte på ER- -celler under inhibering av slik proliferasjon.

På den annen side forhindres celledød (apoptose) ved overlevelsessignaler fra både vevsmatriks og vekstfaktorer. Insulinliknende vekstfaktor (IGFI) signaliserer via IGFI-reseptoren under forhindring av celledød i brystet.

Nyere forskning av Roudabush et al. ( J. Biol. Chem., (2000), 275,22583-22589) har vist at IGFR-stimuleringen indusert ved IGFR fører til sekresjon av et EGF-familiemedlem utenfor cellen som så virker på cellens eget, og nabocellers, EGFR. Blokkering av EGFR i brystet ved EGFR TK-inhibitorer ved oppf innelsen fører derfor til celledød (apoptose) in vitro og in vivo i brystepitel.

Overraskende nok kan EGFR-TKI virke direkte, ikke bare på EGFR som uttrykkes på ER-cellene, men uavhengig på ER+-celler.

R.B. Clarke et al. har vist i Cancer Research (1997, 57,4987-4991) at normale ER+/EGFR- -epitel-brystceller ikke prolifererer, mens nabo-ER-/EGFR+-celler prolifererer, noe som tyder på at proliferasjon finner sted ved to mekanismer, nemlig østrogenstimulering av

(1) ER+-cellerog

(2) EGF og beslektede ligander utskilt av ER+-celler under parakrin

stimulering av nabo-EGFR+/ER- -celler.

Ved inhibering av TK med EGFR-TKI hindres nabo-ER-/EGFR+-celler fra å proliferere.

Dessuten viser våre data at EGFR-TKI også forhindrer ekspresjon av den østrogeninduserte progesteronreseptor i ER+-celler og reduserer ER+-cellefomying.

Følgelig induserer østrogen steroidhormonreseptor- og proteinsyntese i normale ER+-celler slik at proliferasjon, vekst og hormonresponsivitet hos en celle muliggjøres, og vekststimulerende faktorer (f.eks. EGF) som virker på nabo-ER- • brystepitelceller, utskilles.

Dessuten forhindrer EGFR TK-inhibitorer induksjon av progesteron-reseptoren ved østrogen i ER+-celler, hvorved hormonell følsomhet og stimulering av brystepitel reduseres, og transformasjon av normalt vev til kreftvev forhindres.

Progesteronreseptor-merkingsindeksen (PRLI), som faller til rundt 5%

i normalt brystvev som ikke er eksponert for pre-menopause-nivåer av østrogen, økes ved eksponering for østrogen til 15% (I J Laidlaw et al, Endocrinology

(1994), 136, 164-171). Anvendelse av ZD1839 til motvirking av østrogenstimulering hindrer denne økning, noe som fører til en PRLI på 10%.

Dessuten kan det anvendes en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor på epitelvev, spesielt brystepitelvev, som har utviklet seg til et ikke-invasivt mellomstadium mellom normalt epitel, spesielt normalt brystepitel, og malignt invasivt epitel, spesielt malignt invasivt brystepitel, enten slik at proliferasjon av slike celler forhindres, eller at epitelvevet i slike celler i det vesentlige går tilbake til normal tilstand.

Eksempler på slike mellomstadium-celler er slike som er forbundet med atypisk duktal hyperplasi, lobulær neoplasi og ikke-invasive in situ-kreftceller som finnes i brystgangen og/eller -lumen. Slike celler kan være tilstede hos pasienter med høy risiko for brystkreft.

I henhold til et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt anvendelse av EGFR-tyrosinkinase-inhibitor for fremstilling av et medikament for anvendelse i kjemoprevensjon av start av brystkreft i et menneske som er fritt for invasiv brystkreft ved samtidig å redusere proliferasjon og øke apoptose av epitelceller i normal tilstand eller et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, for derigjennom;

(a) å reduseres transformasjonen av cellene fra en normal til en malign tilstand i et menneske fritt for invasiv brystkreft, (b) å redusere transformasjonen av cellene fra et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, til et malignt stadium i et menneske fritt for invasiv brystkreft, eller (c) å forårsake vesentlig reversjon av epitelvev tilbake til en normaltilstand fra en mellomtilstand, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel,

hvor EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren er N-(3-klor-4-fluorfenyl)-7-metoksy-6-(3-morfolinopropoksy)kinazolin-4-amin.

I henhold til det første aspektet er oppfinnelsen spesielt anvendbar for pasienter med høy risiko for brystkreft, såkalte «høyrisiko»-pasienter. Det er kjent å klassifisere høyrisikopasienter som slike som har en verdi på minst 1,5 på den såkalte Gail Risk-modellen, et datamaskin-frembrakt program som er akseptabelt for vurdering av risikoen for brystkreft (se M.H. Gail et al, J. Nati. Cancer Inst.,

(1989), 81,1879-1886). Faktorer som øker risikoen for utvikling av brystkreft, innbefatter tilstedeværelse av mellomceller forbundet med atypisk hyperplasi (innbefattende en historie for denne og likeså for brystkreft hos en nærmeste slektning), lobulær neoplasi, ikke-invasiv in situ-kreft eller tilstedeværelse av et mutant BRCAI-gen (se D.L Page et al, BMJ, (1994), 309, 61-64). I henhold til en foretrukket anvendelse av oppfinnelsen er medikamentet en kombinasjon av en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor som en første aktiv forbindelse og et antiøstrogen som en andre aktiv forbindelse, hvor komponentene administreres simultant eller separat. Foretrukket kan antiøstrogenet velges fra tamoxifen, fulvestrant og raloxifen. I henhold til et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt et medisinsk testsett av første og andre aktive komponent for anvendelse i kjemoprevensjon av start av brystkreft i et menneske fritt for invasiv brystkreft ved samtidig å redusere proliferasjon og øke apoptose av epitelceller i et normalstadium eller i et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, for derigjennom; (a) å reduseres transformasjonen av epitelcellene fra en normal til en malign tilstand i et menneske fritt for invasiv brystkreft, (b) å redusere transformasjonen av cellene fra et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, til et malignt stadium i et menneske fritt for invasiv brystkreft, eller ( c) å forårsake vesentlig reversjon av epitelvev tilbake til en normal tilstand fra en mellomtilstand, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, hvor den første aktive komponenten er en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor som er N-(3-klor-4-fluorfenyl)-7-metoksy-6-(3-morfolinopropoksy)kinazolin-4-amin, og den andre aktive komponenten er et antiøstrogen. I en foretrukket utførelsesform av det medisinske testsettet velges antiøstrogenet fra tamoxifen, fulvestrant og raloxifen. I bruk kan EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren administreres alene eller i et preparat inneholdende en farmasøytisk akseptabel eksipient. Fortrinnsvis administreres den i tablettform. Den vil vanligvis bli administrert slik at det gis en effektiv, ikke-toksisk dose. Størrelsen av dosen vil naturligvis variere i henhold til den spesielle EGFR-tyrosinkinase-inhibitor som velges og måten den administreres på til pasienten. Vanligvis kan det anvendes vanlige doser av hver EGFR-tyrosinkinase-inhibitor. Spesielt blir det, når det gjelder EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren ZD1839, administrert en daglig dose i området for eksempel fra ca. 10 mg til 5 g, fortrinnsvis ca. 10 mg -1000 mg, mer foretrukket ca. 10 - 500 mg (dvs. ca. 0,2 - 100 mg pr. kg kroppsvekt, fortrinnsvis ca. 0,2 - 20 mg pr. kg kroppsvekt, mer foretrukket ca. 0,2-10 mg pr. kg kroppsvekt), hvis nødvendig avgitt i delte doser. Inhiberingen av celletransformasjon definert i det foregående kan anvendes som eneste terapi, eller den kan, i tillegg til en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor så som ZD1839, innbefatte én eller flere andre substanser og/eller behandlinger. Slik sam-behandling kan oppnås ved samtidig, sekvensiell, atskilt eller intermitterende administrering av de individuelle komponenter ved behandlingen. For eksempel kan det, hos kvinner med mer enn gjennomsnittlig risiko for å utvikle brystkreft, når EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren anvendes til inhibering av transformasjonen av brystvev til brystkreft, være normal praksis å anvendelse en kombinasjon av forskjellige former for behandling. Den andre komponent ved slik sam-behandling kan innbefatte et antiøstrogen så som tamoxifen, fulvestrant (IC1182 780: faslodex) eller raloxifen. Det kan da være fordelaktig å anvende sekvensiell terapi med for eksempel et første behandlingstidsrom på ca. 1-6 måneder i løpet av hvilket det administreres en vanlig dose av en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor så som ZD1839, fulgt av et andre behandlingstidsrom på ca. 1-6 måneder i løpet av hvilket det administreres en vanlig dose av et antiøstrogen så som tamoxifen, fulvestrant eller raloxifen. Derved avsettes det et tidsrom hvorved en viss konstitutiv vekst av brystvev muliggjøres for minimalisering av omfanget av vevsatrofi. Alternativt kan kombinasjonsbehandlingen innbefatte fortløpende administrering av et antiøstrogen så som tamoxifen, fulvestrant eller raloxifen, og intermitterende administrering av en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor så som ZD1839. Den intermitterende behandling med EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren kan for eksempel innbefatte en to måneders behandlingssyklus omfattende en første del innbefattende dosering av EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren så som ZD1839 i et tidsrom på ca. én måned, fulgt av en andre del omfattende et EGFR-tyrosinkinaseiegemiddel-fritt tidsrom på ca. én måned. Deretter kan det gis ytterligere to måneders sykluser med slik behandling. Utførelsesformer av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet mer detaljert med henvisning til følgende eksempler og medfølgende tegninger, hvor: Fig. 1 illustrerer, når det gjelder eksempel 2, proliferasjon (Ki67 LI) og apoptose (Al) i ER-/EGFR+- og ER+/EGFR- - DCIS-epitel; og fig. 2 illustrerer, når det gjelder eksempel 3, ZD1839-doserespons i (a) DCIS og (b) normalt bryst.

Eksempel 1

Virkningen av EGFR-tyrosinkinase-inhibitorene som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse ble bestemt ved anvendelse av en

xenotransplantatmodell innbefattende implantasjon og vekst av humant normalt brystvev og in situ-brystkreft hos athymiske hunnmus av typen BALB/c nu/nu (Holland et al., J. National Cancer Institute, 1997, 89,1059 og Gandhi et al., Cancer Research, (2000), 60, 4284-4268). Normalt brystvev og duktalkarsinom in situ (DCIS)-vev fra kvinner som gjennomgikk terapeutisk kirurgi, ble implantert som xeno-transplantater i hunnmus. Etter 14 dager ble daglig dosering av ZD1839 med 10-200 mg pr. kg startet for et tidsrom på 14 dager. Xenotransplantatvev ble fjernet på dagene 0, 14, 21 og 28. Pellet av 17|3-østradiol (2 mg) ble implantert subkutant i et andre sett forsøk (ved anvendelse av normale bryst-xenotransplantater) på dag 14 både i kontrollmus og mus som ble behandlet, og det ble anvendt vanlig Ki67-immunmerking for vurdering av epitelproliferasjon (Ki67 er et monoklonalt antistoff mot en markør i en celle).

Følgende resultater ble oppnådd:

Eksempel 2

Oppsummering av metode

Brystvev fra 16 kvinner som gjennomgikk kirurgi på grunn av DCIS, ble implantert i 16-20 mus med immunsuppresjon pr. forsøk (8 xenotransplantater pr. mus). Behandlingen startet 2 uker etter implantering og besto av daglig tilføring av ZD1839 i en mengde på 10-200 mg pr. kg i 14-28 dager; passende kontroller var medtatt. Xenotransplantatene ble fjernet på dagene 14, 21, 28 og 42 og deretter vurdert med henblikk på proliferasjon (LI) ved Ki67-immunmerking, og apoptose (Al) i henhold til morfologi.

Materialer og metoder

Pasienter

Deltagerne ved denne undersøkelse var kvinner som enten var deltagere ved Nightingale Breast Screening Assessment Centre eller Symptomatic Breast Clinic ved Universitetssykehuset i Syd-Manchester, Storbritannia, i tidsrommet fra november 1998 til januar 2000. Kvinnene ble medtatt i undersøkelsen hvis de hadde mammogrammer som viste utbredt mikroforkalkning, noe som var et tegn på DCIS, og enten cytopatologisk eller histopatologisk bekreftelse av diagnosen (n=16). Alle vevsprøver ble oppnådd ved terapeutisk fjerning av DCIS. Godkjennelse til å fjerne vev fra patologiske prøver ved denne undersøkelse ble gitt av South Manchester Medical Research Ethics Committee.

Dyr

Intakte, voksne 8-10 uker gamle atymiske hårløse hunnmus (BALB/c nu/nu) ble anskaffet fra oppdrettskolonien ved Paterson Institute for Cancer Research. De ble oppbevart under vanlige betingelser med en 12 timers syklus med lys og mørke (lysene av fra kl. 1900 til kl. 0700) i bur med filtertopp. De hadde fri tilgang til bestrålt mat og filtrert vann og hadde bestrålt underlag under oppdrettingen. Normal mat, vann og underlag ble anvendt under forsøkene. Alt stell av dyrene og kirurgiske prosesser ble utført i henhold til Home Office Regulations og UK Scientific Procedures (1986) Act. Halothane-inhalerings-bedøvelse (2-4% halothane på oksygen; Halovet Vapouriser, International Market Supplies, Congleton, Storbritannia) ble anvendt for alle prosesser.

Behandling av vevsprøver

For tillaging av vevsprøver for transplantering til mus ble stykker av brystvev på 1-2 cm<3>, inneholdende mikrokalsifikasjoner, tatt på tidspunktet for kirurgi fra hovedprøven. Det friske vev ble befridd for overskudd av fett og umiddelbart delt under sterile betingelser, i tre eller fire mindre porsjoner og anbrakt i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), med 4,5 g glukose pr. liter og uten natriumpyruvat (Gibco Life Technology, Paisley, Scotland, Storbritannia) ved romtemperatur inntil implantering i musene. I laboratoriet ble vevet anbrakt i friskt DMEM i en steril petriskål, og vevet ble dissekert forsiktig til prøver på 2 mm x 2 mm x 1 mm med skalpellblad. Avhengig av volumet av tilgjengelig vev ble det tilfeldig valgt mellom 5 og 20 stykker fra petriskålen som ikke ble implantert i musene, men som i stedet ble anvendt for histologi. Halvparten av disse ikke-implanterte (dag 0) transplantater ble umiddelbart fiksert i bufret formalin (4% formaldehyd) i 24 timer, og den andre halvdel i Carnoys fikseringsløsning i 1 time, og deretter ble alle oppbevart i 70% alkohol. Etter minst 24 timer ble de fikserte vevsprøver anbrakt individuelt i vevskassetter (Tissue Tek III; Bayer Diagnostics Ltd., Basingstoke, Storbritannia) og oppbevart i 70% alkohol til paraffin-innstøping. Disse prøver, som representerte DCIS fjernet fra hver pasient, ble merket som «dag 0»-prøvene og ble holdt av for histologisk gjennomgåelse, immunmerking og tellinger av apoptotiske celler. De gjenværende xenotransplantater ble implantert i hårløse mus.

Implantasjon av xenotransplantater i hårløse mus

Som i eksempel 1, ble hver pasientprøve delt mellom 10 og 32 mus (avhengig av volumet av vevet og antallet tilgjengelige mus; median-antall seksten). Transplantasjon av xenotransplantater på musene ble fullført innen 90 minutter etter fjerning av vevet fra pasienten. To små midtlinje-hudinnsnitt ble utført gjennom dorsalhuden, gjennom hvilke 8 vevsstykker ble symmetrisk anbrakt (4 på hver side). Tilbakevinning av disse xenotransplantater på de passende tidspunkter fordret ny bedøvelse av musene og utskjæring av hvert transplantat ved anvendelse av skarp disseksjon. Transplantatene ble så bearbeidet med henblikk på histologi som beskrevet ovenfor for dag 0-prøvene. Når det gjaldt forsøkene med 100-200 mg ZD1839 pr. kg, ble transplantatene fjernet på dagene 14,21 og 28; i de lavere doser (10-75 mg/kg) ble transplantatene tilbakevunnet på dagene 14,28 og 42. To xenotransplantater ble uttatt ved hvert mellom-tidspunkt, og 4 xenotransplantater på hvert slutt-tidspunkt fra hver mus.

Behandling

Musene ble i 14-28 dager tilført enten ZD1839 (10-200 mg/kg) eller bærermateriale, idet man startet på dag 14 etter fjerning av de første 2 xenotransplantater. ZD1839 (4-<3-klor-4-fluorfenylamin)-7-metoksy-6-(3-(4-morfolinyl)kinazolin), en oralt aktiv, selektiv EGFR-TKI var en velvillig gave fra AstraZeneca Pharmaceuticals. Bærermaterialet (kontrollen) var 0,5% polysorbat.

Histologisk evaluering av xenotransplantater

Alle dag 0-prøver og hvert xenotransplantat ble innstøpt i paraffinblokker. H&E-fargede 3 urn snitt fra hver blokk ble undersøkt av en enkelt erfaren brystpatolog med henblikk på tilstedeværelse av DCIS; slike som inneholdt DCIS, ble vurdert med henblikk på apoptose og Ki67-antigenimmunogenitet (som markør for epitelproliferasjon) som tidligere beskrevet.

Kjernegrad og tilstedeværelse eller fravær av komedon-nekrose ble også konstatert for alle dag 0-prøver inneholdende DCIS. Dessuten ble dag 0-prøver evaluert immunhistokjemisk med hensyn til ER, c-erbB-2, EGFR-status.

Vurdering av apoptotisk celledød

H&E-fargede snitt av DCIS-prøver ble undersøkt ved anvendelse av lysmikroskopi med henblikk på morfologisk tegn til apoptose. Kriteriene som ble anvendt til identifisering av apoptotiske celler, er vel anerkjente og innbefatter kondensering av kromatin innledningsvis i kjemenrendene; kondensasjon av cytoplasma (kromofili); løsning fra de omgivende celler, angitt ved tilsynekomst av en karakteristisk hvit halo rundt den døende celle; og cytoplasmisk avsnøring under dannelse av membranbundne fragmenter (apoptotiske legemer). For oppnåelse av Al ble minst 1000 celler tellet ved en forstørrelse på 400x ved anvendelse av et Zeiss-mikroskop, og antallet celler som viste apoptotisk morfologi, ble uttrykt som prosentandel av det totale antall tellede.

Immunhistokjemisk bestemmelse av ER og Ki67- kierneantiqen

Immunhistokjemisk ER- og Ki67-metodikk ble anvendt. Disse er blitt beskrevet tidligere (Gandhi et al., Br. J. Cancer, (1998), 78, 785-794).

Både ER- og Ki67-merking var overveiende nukleær med minimalt cytoplasmaopptak. Intensiteten av merkingen var variabel, men dette ble ikke vurdert separat, og cellene ble bedømt som positive eller negative. Ki67-merkingsindeksen (LI) ble beregnet ut fra telling av minimalt 1000 epitelceller, og antallet positivt merkede kjerner ble uttrykt som prosentandel av det totale antall tellede. ER-statusen ble bestemt også med telling av 1000 celler, og lesjoner ble ansett som ER+ hvis >5% av cellene var positivt merket med hensyn til ER.

Immunhistokjemisk bestemmelse av c- erbB- 2. EGFR oa pErk1/ Erk2

Paraffinvoks-snitt (3 urn tykke) av vev fra hver prøve ble kuttet, montert på APES (3-aminopropy!etoksysilan)-belagte objektglass, befridd for voks og hydratisert før immunhistokjemisk merking med henblikk på c-erbB-2, EGFR og fosforylert (p) Erk1/Erk2. Antigen-tilbakevinning ble oppnådd ved hjelp av en mikrobølgemetode (650 W) i 30 minutter (min). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering i hydrogenperoksid [1,5 volum% med hensyn til EGFR og c-erbB-2, 3 volum% med hensyn til pErk1/Erk2] i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 15 min. Når det gjaldt c-erbB-2- og EGFR-antigenet, ble objektglassene skyllet i TBS før anvendelse av 10% normalt kaninserum for blokkering av ikke-spesifikk binding, og deretter inkubert med det primære antistoff i en fortynning på 1:20 for EGFR (monoklonalt muse-antihumant, NCL-EGFR; Novocastra labs, Newcastle upon Tyne, Storbritannia) og ved en fortynning på 1:40 for c-erbB-2 (monoklonalt muse-MAB4022, Chemicon, Harrow, Storbritannia), i 1 time ved romtemperatur. Et biotinylert kanin-antimus-immunglobulin (E413, Dako, High Wycombe, Storbritannia) ble påført som det annet antistoff (1:350 fortynning, inkubert i 30 min), og etter dette ble det foretatt en 30 min inkubering ved RT med standard trelags-streptavidin-avidin-biotin-pepperrot (K0377, Dako) med hensyn til c-erbB-2 og EGFR.

Når det gjaldt pErk1/Erk2-antigenpåvisning, ble snittene blokkert med 20% normalt humanserum i 15 min før påføring av de polyklonale kanin-antihuman-pMEK-, pErk1/Erk2-, pEIkl -primærantistoffer ved en fortynning på 1:20 (9101L, New England Biolabs, Storbritannia). Biogenex Multil Link i en fortynning på 1:100 (Euro/DPC, Llanberis, Storbritannia) ble påført som det sekundære antistoff i 1 time. En avidin/biotin-kompleks immunhistokjemisk utstyrssett-metode (Biogenex Concentrated Label, Euro/DPC) ble anvendt.

Kromogenet diaminobenzidin (Sigma, Poole, Storbritannia) ble påført i 5 min, og deretter hematoxylin som mot-farge i 5 min.

Negative (generisk muse-IgG, X0931, Dako) og positive kontroller (snitt av A431-celler for EGFR, og av DCIS-vev tidligere vist å være sterkt positivt med hensyn til c-erbB-2 og pErk1/Erk2) ble anvendt.

Merking med henblikk på c-erbB-2 og EGFR var hovedsakelig membranmerking, men det var også cytoplasmisk og nukleært opptak. Disse bie angitt som positive (skala 1-4) eller negative i forhold til de positive og negative kontroll-objektglass. Merking med henblikk på pErk1/Erk2 var nukleær og cytoplasmisk og fikk poeng i henhold til intensitet av merking i kjerne- og cytoplasma-komponentene som tidligere beskrevet (Gee et al., Int. J. Cancer,

(1995), 64, 269-273).

Alle histologiske vurderinger ble utført av forskere som var «blindet» overfor behandlingsgruppen. Reproduserbarhet av tellingen ble vurdert av den samme forsker under ny bedømmelse av 10 objektglass merket med Ki67-antistoffet, og 10 H&E-objektglass med henblikk på apoptose flere måneder etter innledende bedømmelse. De to således oppnådde sett avresultater ble grundig sammenholdt ved regresjonsanalyse (M),95, P<0,001).

Epitelproliferasjon i normal musetarm

Fjerning, bearbeidelse av intestinalvev med henblikk på Ki67-vurdering, samt poenggivningsmetodikk er blitt beskrevet tidligere (Potten og Grant, Br. J. Cancer, (1998), 78,993-1003).

Statistiske metoder

Statistisk analyse ble utført under anvendelse av SPSS-programvare (SPSS, Chicago, IL, USA) av CRC Department of Computing and Biomathematics ved Paterson Institute for Cancer Research. For hvert tilfelle som viste normalt brystepitel eller DCIS ble det utført en sammenlikning mellom prøver tatt fra ZD1839-behandlede og kontrollmus ved hvert vurderingstidspunkt. Vevsprøvene tatt ved hvert vurderingstidspunkt for de to undersøkelsesgrupper bie ansett for å være statistisk uavhengige og ble sammenliknet under anvendelse av Mann Whitney U-testen. Alle signifikanstester var tosidige, med anvendelse av det vanlige 5% signifikansnivå. Data fra de separate ZD1839-doser ble slått sammen etter at innledende analyse viste effekt ved alle doser. Pearsons korrelasjons-koeffisient ble anvendt til undersøkelse av graden av samsvar mellom metriske variabler. Statistisk analyse av proliferasjon i intestinal-epitel ble foretatt ved sammenlikning av medianer ved hver epitelcelleposisjon i kryptene.

Resultater

Median-alderen for kvinner som gjennomgikk kirurgi, var n=område (menopausestatus).

Xenotransplantat-implantasjon og -tilbakevinning

DCIS

Blant de 16 brystvevprøver som ble funnet å inneholde DCIS ved kirurgi ga 13 (81,3%) dag 0-prøver som inneholdt DCIS, hvorav 11 immunhistokjemisk uttrykt EGFR+ med en medianverdi på 2 (område 1-3), og 2 var EGFR-. Blant disse 11 EGFR+-tilfeller var 7 ER-/c-erbB-2-positive (alle høy kjernegrad), og 3 ER+/c-erbB-2-positive (1 høy grad, 2 mellom-grad), og 1 ER+/c-erbB-2-negativ (lav grad). De 13 brystvevprøver ga opphav til totalt 273 dag 0-prøver, hvorav 44 (16,1%) inneholdt foki med DCIS. Totalt 1904 xenotransplantater ble implantert, hvorav 1858 (97,5%) ble vellykket tilbakevunnet. Av de 1858 tilbakevunne xenotransplantater inneholdt 329 (17,7%) DCIS. Median-tilbakevinningen av DCIS pr. forsøk var 71% av det ventede (område 14-91,3%). DCIS ble tilbakevunnet på dagene 14, 21, 28 og 42, xenotransplantater i alle de 13 forsøk.

Normalt bryst

Histologisk normalt brystvev ble funnet i alle 16 prøver uttatt ved kirurgi med henblikk på DCIS. Hovedandelen (97,6%) av de implanterte xenotransplantater ble tilbakevunnet, hvorav 22,4% inneholdt normalt brystvev. Normalt bryst ble tilbakevunnet fra alle tidspunktene i 100% av alle forsøk. Alle 16 tilfeller var ER+ og EGFR+ med en medianverdi på 1 (område 1-2), og 2 var også svakt c-erbB-2-positive.

Normalt brvst ( tabell 1)

Tabell 1 viser EGFR+-proliferasjon (LI) og apoptose (Al) i ZD1839 (10-200 mg/kg [sammenslåtte data]) sammenstilt med bærermaterial-behandlet (a) normalt bryst- og (b) DCIS-epitel på de forskjellige tidspunkter. Tall i parentes representerer interkvartilområdene <**>p<0,01, <***>p<0,001 sammenstilt med kontroll.

Normalbryst-xenotransplantater hadde en reduksjon i median-LI fra dag 0 til 14 (4,9 [IQR: 4,0-5,7] sammenstilt med 3,8 [IQR: 2,7-5,1], p<0,05) som så forble uforandret for de andre tidspunkter (dagene 21, 28 og 42). Median-LI minket i den ZD1839-be han diede gruppe sammenliknet med kontroller på dag 21 (2,3 [IQR: 1,0-3,8] sammenstilt med 4,1 [IQR: 2,8-5,2]), dag 28 (2,2 [IQR: 1,7-3,3] sammenstilt med 4,1 [IQR: 2,4-5,4], og dag 42 (1,7 [IQR: 1,1-2,6] sammenstilt med 2,8 [IQR: 2,3-5,1]) (alle p<0,01).

Al-funnene hadde likhet med funnene for de DCIS-behandlede xenotransplantater ovenfor. Ingen reduksjon i median-AI ble observert fra dag 0 til 14 (0,20 [IQR: 0,17-0,29] sammenstilt med 0,18 [IQR: 0,10-0,21], p=0,90). På dag

21 var det en økning i median-AI i ZD1839-behandlede xenotransplantater sammenliknet med kontroller (0,36 [IQR: 0,23-0,53] sammenstilt med 0,18 [IQR: 0,10-0,25], p<0,001). Etter 14 dagers behandling (dag 28) var median-AI likeverdig med kontrollnivåene (ZD1839 0,19 [IQR: 0,10-0,28] sammenstilt med kontroll 0,18 [IQR: 0,10-0,20], p=0,35).

EGFR+ - DCIS f Fig. 11

Fig. 1 viser forandringer i LI og Al indusert av ZD1839 i henholdsvis ER-/EGFR+ (1 a og 1 c)- og ER+/EGFR+ (1 b og 1 d)- DCIS. ZD1839 eller bærermateriale ble gitt fra dag 14 og videre. Verdier for dagene 0 og 14 er fra ubehandlede mus. En økning i Al og en reduksjon i LI kunne sees i ZD1839-gruppen etter 7 og 14 dagers behandling (<*>p<0,05, "p<0,01 sammenstilt med kontroll) i både ER-/EGFR+- og ER+/EGFR+ -DCIS. Tallene i parentes representerer antallet observasjoner som kunne sees for dette bestemte tidspunkt og for denne gruppe. Medianverdier er vist som tykke horisontale linjer, og stavene representerer interkvartift område.

Median-LI- og Al i dag 0-prøvene var høyere i de 7 tilfeller med ER-/EGFR+ DCIS enn i de 4 tilfeller med ER+ EGFR- DCIS, henholdsvis (14,0 [IQR: 13,0-15,3] sammenstilt med 7,8 [IQR: 6,5-11,2], og 1,3 [IQR: 1,0-1,6] sammenstilt med 0,79 [IQR: 0,6-1,0], begge p<0,05).

Median-LI i ER-/EGFR+ DCIS var redusert i den ZD1839-behandtede gruppe sammenliknet med den bærermaterial-behandlede gruppe på dag 21 (4,7 [IQR: 2,6-17,2] sammenstilt med 11,6 [IQR: 10,7-15,1], p=0,19), dag 28 (8,3 [IQR: 2,7-10,9] sammenstilt med 13,5 [IQR: 12,0-16,3], p<0,01), og dag 42 (11,4 [IQR:10,8-11,8] sammenstilt med 13,0 [IQR: 12,0-14,8], p<0,05) (fig. 1a).

Det var ingen forandring i median-AI i ER-/EGFR+ DCIS fra dag 0 til 14 (1,3 [IQR: 1,0-1,6] sammenstilt med 1,0 [IQR: 0,8-1,44], p=0,14). Etter 7 dagers behandling (dag 21) var det en signifikant økning i median-AI i den ZD1839-behandlede gruppe sammenliknet med den bærermaterial-behandlede gruppe (2,1 [IQR: 1,0-2,3] sammenstilt med 0,7 [IQR: 0,5-1,1], p<0,01), skjønt etter 14 dagers behandling (dag 28) gikk median-AI tilbake til kontrollnivåer (ZD1839 1,1 [IQR: 0,8-1,2] sammenstilt med kontroll 1,2 [IQR: 0,5-1,5], p=0,44) (fig. 1b).

Liknende forandringer i LI og Al i ER+/EGFR+ DCIS (fig. 1b og 1d) kunne sees med et signifikant fall i LI på dag 14 (ZD1839 4,6 (IQR 3,9-5,2%) sammenstilt med 11,2 kontroll (IQR 9,2-15,55) og en økning i apoptose (ZD1839 1,5 (IQR 1,3-1,6) sammenstilt med kontroll (IQR 0,6-0,9%).

K167 LI i EGFR+ flia. 2i

Fig. 2 viser epitelproliferasjonshastigheter (Ki67 LI) i EGFR+ (a) DCIS og (b) normale bryst-xenotransplantater etter 2 uker (dag 28) med tilføring av enten forskjellige doser ZD1839 (10-200 mg/kg) eller bærermaterialkontroll. Tallene i parenteser representerer antallet observasjoner som kunne sees for dette bestemte tidspunkt og for denne gruppe. Medianverdier er vist som tykke horisontale linjer, mens stavene representerer interkvartilt område.

Økende doser av ZD1839 var forbundet med økende fall i epitelproliferasjon i både ER-/EGFR+ og ER+/EGFR+ DCIS, men ikke i normalt bryst (fig. 2).

Samsvar mellom proliferasjon og apoptose

Vi har tidligere påvist et positivt samsvar mellom LI og Al i DCIS. LI viste et positivt samsvar med Al i det normale bryst og DCIS (henholdsvis r=0,10, p=0,02, og r=0,25, p<0,01) ikke behandlet med ZD1839 (dvs. dag 0, dag 14 og bærermaterialkontroll-tilfeller).

Sammenlikning av cellepopulasjon ved anvendelse av median-LI/AI-forholdet (som et cellefornyingsforhold) viste at ZD1839-behandling signifikant inhiberte cellefornying både i DCIS og normalt bryst på dag 28 (henholdsvis 4,4 [2,7-6,9] sammenstilt med 29,7 [13,1-40,2] og 8,5 [5,8-17,4] sammenstilt med 33,8 [21,4-70,6], p<0,001.

Nedregulering av pERk1/2 i EGFR-TKI-behandlet DCIS og normalt bryst

For bestemmelse av om hvorvidt MAP-kinasesignaliseringsveien settes i gang ved EGFR-tyrosinkinase-inhibering, ble det utført immunhistokjemisk påvisning av fosforylert (p) ErK1/Erk2 på dag 0- og dag 42-snitt av DCIS og normale bryst-xenotransplantater behandlet med ZD1839 eller bærermateriale. Median-dag 0 DCIS og normalbryst-nukleær HScore var 30 (IQR: 12-45) og 22 (IQR: 12-34). I DCIS var nukleær-HScore redusert i den ZD1839-behandlede gruppe sammenliknet med kontroller etter 28 dagers behandling (8 [IQR: 5-18] sammenstilt med 25 [IQR: 8-30], p<0,05). I normalt bryst var det en liknende forskjell (7 [IQR: 3-17,5] sammenstilt med 18 [IQR: 8-32], p<0,01).

Nucleær HScore for pErK1/Erk2 samsvarte med Ki67 LI i DCIS og i normalt bryst (begge r=0,52, p=0,05).

Diskusjon

ER- DCIS over-uttrykker c-erbB-2-onkogen og er også rapportert å uttrykke EGFR i 50% av tilfellene. Vi fant dobbeltekspresjon av begge reseptorer på den samme cellepopulasjon i 10 av 11 (90%) av ER- DCIS. ER- DCIS har høy proliferativ hastighet, som for for-behandlings-prøver samsvarte med høy ekspresjon av MAP-kinase-signaloverføringsenzymet.

Vi antok derfor at dannelsen av EGFR/c-erbB-2-heterodimerer var ansvarlig for den høye proliferasjonshastighet og MAP-kinase-ekspresjon, og vi testet vår teori ved anvendelse av et EGFR-TKI-peptid, ZD1839. Ved ZD1839-behandling kunne det sees et langvarig fall i epitelproliferasjon og en reduksjon i aktivert MAP-kinase-ekspresjon, kombinert med en økning i apoptose på et tidlig stadium, noe som bekreftet vår hypotese. EGFR er kjent for å frembringe et mitogent signal og samsvarer med proliferasjon og tumordobling i invasiv brystkreft, og inhibering av denne vei førte til et fall i Ki67-merkingsindeks i DCIS-xenotransplantater.

En økning i apoptose kunne sees både i DCIS- og normalt brystepitel etter sju dagers behandling. Skjønt den insulinliknende vekstfaktor-1 (IGF-1) antas å være viktig ved celleoverlevelsen, har nyere forskning av Roudabush et al., J. Biol. Chem., (2000), 275, 22583-22589, vist at IGR-1-reseptor-stimulering fører til sekresjon av heparinbindende EGF ekstracellulært og befordrer transaktivering i EGF-reseptoren. Følgelig kan EGFR være viktigere for celleoverlevelsen i det normale bryst enn det man tidligere har vært klar over. Siden epitelproliferasjon samsvarer med apoptose i det normale bryst, vil en reduksjon i proliferasjon være ventet å samsvare med en reduksjon i apoptose. Etter den innledende økning i apoptose etter 7 dager i den ZD1839-behandlede gruppe, førte fallet i merkingsindeks (proliferasjon) til et fall i apoptose etter 14 dager. Imidlertid var det totale LI/AI-forhold i de ZD1839-behandlede grupper både i DCIS og normalt bryst redusert, noe som viser en lavere total cellefomying med EGFR-TK-inhibering. Videre viser det totale fall i cellefomying den potensielle kjemopreventive virkning av en EGFR-TKI på normalt bryst.

ER- høygrad-DCIS er rapportert å være det som mest sannsynlig vil komme tilbake etter omfattende lokal fjerning, og ved tilbakefall er minst 50% blitt invasiv høygrads-brystkreft med tilknyttede knute- eller fjemmetastaser. Forhindring av tilbakefall og utvikling til invasiv kreft fordrer et middel som undertrykker proliferasjonen eller øker apoptosen, og den beskrevne EGFR-TKI oppfyller dette kriterium.

En undertrykking av normal brystepitelproliferasjon kombinert med en økning i apoptose viser potensialet hos EGFR-TK-inhibitorer som kjemopreventive midler for kvinner med øket risiko for brystkreft.

EGFR MAP-kinaseveien antas å være viktig ved celleproliferasjon, -over-levelse og -differensiering. Det signifikante positive samsvar mellom pErk1/Erk2 og Ki67-merkingsindeks ved DCIS og normalt bryst tyder på at MAP-kinasesignalisering er viktig når det gjelder mediering av celleproliferasjon i brystepitel. En minskning i pErk1/Erk2 i den ZD1839-behandlede gruppe samsvarte med et fall i proliferasjon, og det er sannsynlig at EGFR-signalene via denne vei og MAP-kinaseforandringer vil forutsi medikamentrespons.

Eksempel 3

Ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge eksempel 1, hvis prosesstrinn er beskrevet mer fullstendig i eksempel 2, ble virkningen av ZD1839 på proliferasjonen (Ki67 LI) i østrogenstimulert normalt brystepitel målt. Resultatene er vist i tabell 2.

I det normale brystepitel var Ki67 Ll-verdien 4,1 på dag 0, datoen for implantasjon i en mus, og var redusert til 2,6 på den 14. dag. Kontrollmusene ble så behandlet med østrogen alene, mens testmusene ble behandlet med både østrogen og ZD1839. Mengden av administrert østrogen svarte til et pre-menopause-nivå; dvs. 17-p-østradiol-pellet (2 mg) (se Holland et al, omtalt i eksempel 1). Etter 21 dager var Ki67 Ll-verdien for kontrollmusene så høy som 6,5, mens verdien for testmusene var betydelig redusert, tii en verdi på 1,4. Etter 28 dager, var Ki67 Ll-verdien for kontrollmusene 5,4, mens verdien for testmusene fortsatte å falle til et nivå så langt ned som 1,1.

Eksempel 4

Ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble igjen virkningen av ZD1839 på apoptose (Al) i østrogenstimulert normalt brystepitel målt. Resultatene er vist i tabell 3.

I det normale brystepitel var Al-verdien 0,3 på dag 0, datoen for implantasjon i en mus, og ble redusert til 0,2 på den 14. dag. Kontrollmusene ble så behandlet med østrogen alene, mens testmusene ble behandlet med både østrogen og ZD1839. Mengden av administrert østrogen svarte til et premenopause-nivå. Etter 21 dager var Al-verdien for kontrollmusene så høy som 0,5, mens verdien for testmusene var enda høyere, med en verdi på 0,7. Etter 28 dager var Al-verdien for kontrollmusene 0,6, mens verdien for testmusene forble på et nivå på 0,7.

Eksempel 5

Ved anvendelse av det samme påføringsregime som i eksempel 1 ble virkningen av ZD1839 på progestronreseptor-ekspresjon (PR LI) i østrogenstimulert normalt brystepitel målt (progesteronreseptor øker den hormonelle responsivitet hos cellen). Resultatene er vist i tabell 4.

I det normale brystepitel var PR Ll-verdien 11,8 på dag 0, datoen for implantasjon i en mus, og den ble redusert til 5,8 på den 14. dag. Kontrollmusene ble så behandlet med østrogen alene, mens testmusene ble behandlet med både østrogen og ZD1839. Mengden av administrert østrogen svarte til et pre-menopause-nivå. Etter 21 dager steg PR Ll-verdien for kontrollmusene til så høyt som 17,2, mens verdien for testmusene bare var 10,4. Østrogeninduksjon av PR-ekspresjon ble derfor undertrykket av ZD1839. Følgelig er de hormonelle virkninger (normalt mediert via progesteron-reseptorene) av kjønnssteroidene progesteron og androgen inhibert.

Av ovenstående resultater kan det sees at som angitt i det foregående, tilveiebringer den inhiberende virkning apå konstitutiv vekst og fremmende virkning på død av normalt brystcellevev en fremgangsmåte for inhibering av transformasjonen av normale celler til kreftceller, dvs. grunnlaget for kjemopreventiv behandling av kvinner, spesielt slike som har høyere risiko for å utvikle malign brystkreft.

Undersøkelser av normalt brystepitel viser at hormonerstatningsterapi (HRT) øker ekspresjonen av progesteronreseptor (se Hargreaves et al., Br. J. Cancer, (okt. 1998), 78 (7), 945-949, og Hofscth et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., (des. 1999), 84 (12), 4559-4565), og kombinert HRT (østrogen og progesteron) øker brystepitelproliferasjon signifikant mer enn HRT gjør med østrogen alene (se Hofstch, som ovenfor). Lengre tids kombinert HRT-anvendelse har en øket brystkreftinduksjonshastighet sammenliknet med HRT med østrogen alene (se Persson et al., Cancer Causes Control, (aug. 1999), 10 (4), 253-260; Colditz, J. Womens Health, (apr. 1999), 8 (3), 347-357; og Magnusson et al., Int. J. Cancer, (5. mai 1999), 81 (3), 339-344). Ved inhibering av induksjonen av progesteronreseptor, kan ikke progesteron utøve sine virkninger, og hyppigheten av brystkreftutvikling reduseres.

Dessuten viser den inhiberende virkning på østrogenstimulert normalt brystvev at EGFR-tyrosinkinase-inhibitor vil virke alene selv i nærvær av høye nivåer av østrogen: dvs. under tilveiebringelse av kjemoforebygging hos kvinner i premenopausen.

Følgelig gir EGFR-TK-inhibering en ny fremgangsmåte for behandling og forebygging av kreft uansett ER-status, og tilveiebringer en potensiell ny kjemopreventiv fremgangsmåte, spesielt hos familier med høy risiko for brystkreft.

Claims (6)

1. Anvendelse av EGFR-tyrosinkinase-inhibitor for fremstilling av et medikament for anvendelse i kjemoprevensjon av start av brystkreft i et menneske som er fritt for invasiv brystkreft ved samtidig å redusere proliferasjon og øke apoptose av epitelceller i normal tilstand eller et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, for derigjennom; (a) å reduseres transformasjonen av cellene fra en normal til en malign tilstand i et menneske fritt for invasiv brystkreft, (b) å redusere transformasjonen av cellene fra et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, til et malignt stadium i et menneske fritt for invasiv brystkreft, eller (c) å forårsake vesentlig revers jon av epitelvev tilbake til en normaltilstand fra en mellomtilstand, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, hvor EGFR-tyrosinkinase-inhibitoren er N-(3-klor-4-fluorfenyl)-7-metoksy-6-(3-morfolinopropoksy)kinazolin-4-amin.

2. Anvendelse i følge krav 1, hvor medikamentet er en kombinasjon av en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor som en første aktiv forbindelse og et antiøstrogen som en andre aktiv forbindelse, hvor komponentene administreres simultant eller separat.

3. Anvendelse i følge krav 2, hvor antiøstrogen er valgt fra tamoxifen, fulvestrant og raloxifen.

4. Anvendelse i følge et hvilket som helst foregående krav, hvor epitelvevet er pattedyrepitelvev.

5. Medisinsk testsett av første og andre aktive komponent for anvendelse i kjemoprevensjon av start av brystkreft i et menneske fritt for invasiv brystkreft ved samtidig å redusere proliferasjon og øke apoptose av epitelceller i et normalstadium eller i et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, for derigjennom; (a) å reduseres transformasjonen av epitelcellene fra en normal til en malign tilstand i et menneske fritt for invasiv brystkreft, (b) å redusere transformasjonen av cellene fra et mellomstadium, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, til et malignt stadium i et menneske fritt for invasiv brystkreft, eller ( c) å forårsake vesentlig reversjon av epitelvev tilbake til en normal tilstand fra en mellomtilstand, mellom normal epitel og malignt invasivt epitel, hvor den første aktive komponenten er en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor som er N-(3-klor-4-fluorfenyl)-7-metoksy-6-(3-morfolinopropoksy)kinazolin-4-amin, og den andre aktive komponenten er et antiøstrogen.

6. Medisinsk testsett i følge krav 5, hvor antiøstrogen er valgt fra tamoxifen, fulvestrant og raloxifen.