KR100785359B1 - 치료 용도 - Google Patents
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Abstract
EGFR 티로신 키나제 억제제는 (a) 침입성 유방암이 없는 사람에서 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소시키고, 및/또는 (b) 침입성 유방암이 없는 사람에서 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 악성 상태로의 상피 세포의 변형을 감소시키고, 및/또는 (c) 상피 조직을 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태로부터 정상 상태로 거의 복귀시키는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 이용된다.
Description
본 발명은 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나제 효소에 대해 억제 활성을 보유하는 화합물의 치료 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 정상 세포의 암 세포로의 변형을 억제하는 상기 화합물의 용도에 관한 것으로, 즉, 이 화합물은 암 화학예방제이다.
최근 몇년 동안 세포는 자신의 DNA의 일부를 발암유전자, 즉 활성화되면 악성 종양 세포의 형성을 유도하는 유전자로 변형시켜서 암 세포가 될 수 있다는 사실이 발견되었다(Bradshaw의 문헌[Mutagenesis, 1986, 1, 91]). 이러한 발암유전자 중 몇종은 성장 인자의 수용체인 단백질의 생산을 유도한다. 성장 인자 수용체 복합체는 이후에 세포 증식을 증가시킨다. 예컨대, 일부 발암유전자는 티로신 키나제 효소를 암호화하고, 특정 성장 인자 수용체는 또한 티로신 키나제 효소라는 것이 알려져 있다(Yarden 등의 문헌[Ann. Rev. Biochem., 1988, 57, 443]; Larsen 등의 문헌[Ann. Reports in Med. Chem. 1989, 13장]).
수용체 티로신 키나제는 세포 복제를 개시시키는 생화학적 신호 전달에 있어서 중요하다. 이들은 세포 막을 관통하고, 성장 인자(예, 상피세포 성장 인자[EGF])에 대한 세포외 결합 도메인 및 키나제로서 작용하여 단백질의 티로신 아미노산을 인산화시킴으로써 세포 증식에 영향을 주는 세포내 부분을 보유하는 거대 효소이다. 상이한 수용체 티로신 키나제에 결합하는 성장 인자의 과를 기초로 한 다양한 부류의 수용체 티로신 키나제가 공지되어 있다(Wilks의 문헌[Advances in Cancer Research, 1993, 60, 43-73]). 이 분류는 EGF, TGFα, NEU, erbB, Xmrk, HER 및 let23 수용체와 같은 수용체 티로신 키나제의 EGF과를 포함하는 클래스 I 수용체 티로신 키나제, 인슐린, IGFI 및 인슐린-관련 수용체(IRR)와 같은 수용체 티로신 키나제의 인슐린과를 포함하는 클래스 II 수용체 티로신 키나제, PDGFαa, PDGFβb 및 콜로니 자극 인자 1(CSF1) 수용체와 같은 수용체 티로신 키나제의 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)과를 포함하는 클래스 III 수용체 티로신 키나제를 포함한다.
수용체 티로신 키나제의 EGF과와 같은 클래스 I 키나제는 유방암(Sainsbury 등의 문헌[Brit. J. Cancer, 1988, 58, 458]; Guerin 등의 문헌[Oncogene Res., 1988, 3, 21] 및 Klijin 등의 문헌[Breast Cancer Res. Treat., 1994, 29, 73]), 선암을 비롯한 비-소세포 폐암(NSCLC)(Cerny 등의 문헌[Brit. J. Cancer, 1986, 54, 265]; Reubi 등의 문헌[Int. J. Cancer, 1990, 45, 269] 및 Rusch 등의 문헌[Cancer Research, 1993, 53, 2379]) 및 폐의 편평 세포 암(Hendler 등의 문헌[Cancer Cells, 1989, 7, 347]), 방광암(Neal 등의 문헌[Lancet, 1985, 366]), 식도암(Mukaida 등의 문헌[Cancer, 1991, 68, 142]), 결장암, 직장암 또는 위암과 같은 위장암(Bolen 등의 문헌[Oncogene Res., 1987, 1, 149]), 전립선암(Visakorpi 등의 문헌[Histochem. J. 1992, 24, 481]), 백혈병(Konaka 등의 문헌[Cell, 1984, 37, 1035]) 및 난소암, 기관지암 또는 췌장암(EP-A-0400586)과 같은 일반적인 사람 상피 암에서 자주 발견되는 것으로 알려져 있다. 그 밖의 사람 종양 조직도 수용체 티로신 키나제의 EGF과의 존재에 대해 테스트되고 있으므로, 이들의 광범위한 만연함은 갑상선암 및 자궁암과 같은 또 다른 암에서도 입증될 것으로 예측된다. 보다 최근에는(W J Gullick의 문헌[Brit. Med. Bull., 1991, 47, 87]) 티로신 키나제 활성을 보유하는 EGF 수용체가 뇌 종양, 폐 편평 세포 종양, 방광 종양, 위 종양, 유방 종양, 머리와 목 종양, 식도 종양, 여성생식계 종양 및 갑상선 종양과 같은 다수의 사람 암에서 과다발현되는 것으로 관찰되었다.
따라서, 수용체 티로신 키나제의 억제제가 상피 암 세포 성장의 선택적 억제제로서 가치가 있음을 인식하게 되었다(Yaish 등의 문헌[Science, 1988, 242, 933]).
EP-A-0566226 및 국제 특허 출원 WO-A-96/33980 및 WO-A-97/30034는 4-위치에 아닐리노 치환기를 갖는 일부 퀴나졸린 유도체가 EGFR 티로신 키나제 억제 활성을 보유하여 암 조직의 증식 억제제라고 보고하고 있다.
국제 특허 출원 WO-A-96/30347 및 WO-A-97/38983는 4-위치에 아닐리노 치환기를 갖는 일부 구조적으로 관련된 퀴나졸린 유도체 역시 EGFR 티로신 키나제 억제 활성을 보유한다고 보고하고 있다.
이후에, 다수의 다른 4-아닐리노퀴나졸린 유도체 및 이들의 구조적 관련 화합물이 EGFR 티로신 키나제 억제 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 활성 및 적절한 생체이용율을 보유하는 이러한 화합물들은 본 발명에 사용하기에 적합하다.
강력한 EGFR 티로신 키나제 억제 활성을 보유하는 것으로 알려진 구체적 화합물로는, 예컨대 문헌[J. Med. Chem., 1999, 42, 1803-1815]에 개시된 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(이하 코드 번호 ZD1839로 칭함); N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(이하 코드 번호 CP358774로 칭함); 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(이하 코드 번호 PD0183805로 칭함)과, 피롤로피리미딘(이하 코드 번호 PKI 166(CGP75166)으로 칭함)을 들 수 있다.
상기 화합물 모두는 전체 암 세포의 치료와 관련이 있다. 따라서, 이러한 EGFR 티로신 키나제 억제제는 ER- 암 세포에서 EGFR에 대한 하류 신호전달을 억제함으로써 암 세포의 증식을 억제하는 것으로 생각된다.
정상 세포에 대해서는, EGF는 마우스 유선 유래의 세포를 비롯한 배양으로 성장시킨 각종 비변형 상피 세포에서 미토젠 효과(Carpenter 등의 문헌[Annual Reviews in Biochemistry, 1979, 48, 193])를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 마우스의 특정 세포주와 자연적으로 증식하는 유방 조직에서는 성장 억제 효과(Coleman 등의 문헌[Development Biology, 1990, 137, 435])를 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 EGFR 티로신 키나제 억제제가 변형된 상피 암 세포의 성장은 물론, 정상 상피 세포의 구성적 성장에도 영향을 준다는 사실을 발견하였다. 예를 들면, 여성의 정상 사람 유방 상피 조직에서 에스트로겐은 정상 성장을 자극하고 프로게스테론 수용체의 발현을 유도한다. 이로 인해 2차 성징 스테로이드의 호르몬 효과가 유방 상피에서 매개된다. 예컨대 유방 상피 세포의 구성적 성장은 여성이 노화함에 따라, 그리고 폐경 후에 감소하는 비-에스트로겐 의존적 기본 교체(turnover)를 포함한다.
이에 따라, 무흉선 BALB/c nu/nu 마우스에서의 사람 정상 유방 조직 및 동일계 유방암의 이식 및 성장을 포함하는 이종이식편 모델(Holland 등의 문헌[J. National Cancer Institute(1997), 89, 1059 및 Gandhi 등의 문헌[Cancer Research(2000), 60, 4284-4288])을 이용하여, 본 발명자들은 EGFR 티로신 키나제 억제제가 폐경기 이전의 양성 유방 상피와 악성전[Ductal Carcinoma In Situ(DCIS)] 유방 상피의 구성적 증식 및 에스트로겐 자극 증식에 영향을 준다는 것을 알게 되었다. 구성적 증식과 에스트로겐 자극 증식에 미치는 억제 효과는 정상 세포의 암 세포로의 변형을 억제하는 방법, 즉 여성의 화학예방 치료법, 특히 악성 유방암의 발생 위험이 높은 여성의 화학예방 치료법에 기초를 제공한다.
이렇게 하여 EGFR 티로신 키나제 억제제는 상피 세포, 특히 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소, 바람직하게는 억제하는 데 사용될 수 있다.
EGF가 아마도 성장 수용체를 매개로 하여 마우스의 특정 세포주와 자연적으로 증식하는 유방 조직에 대해 성장 억제 효과를 나타낼 수 있음이 알려진다면, 이러한 성장 수용을 실질적으로 차단하는 화합물(EGFR 억제제) 역시 증식을 감소시킨 다는 것은 놀라운 사실이다.
따라서, 에스트로겐 수용체에 대한 에스트로겐 효과를 차단하고 세포에 의한 EGF/TGFα생산을 감소시키도록 효과적으로 작용하는 태목시펜과 같은 종래의 항에스트로겐과는 달리, 그리고 ER- 암 세포에 대한 EGFR 억제제의 전술한 작용 기전(역시 EGFR 차단과 관련이 있음)과는 달리, 이 EGFR 억제제는 생체내 양성 유방 상피 또는 생체내 비침입성 유방암(ER+이건 ER-이건간에)에 투여시 티로신 키나제의 세포 증식 역할을 직접 차단함으로써 작용한다고 생각된다. 이에 따라, EGFR 티로신 키나제를 직접 차단하면 세포의 호르몬 민감성은 무의미해지고, 즉 약제는 비호르몬 기전에 의해 작용한다.
보다 상세히 설명하면, 우선 세포 성장에 관하여는, 유방에서 대부분의 성장 세포는 EGFR+ 및 ER-이다. EGFR 억제제 부재시 에스트로겐은 EGF 생성물을 분비하는 ER+ 세포(만)을 자극하고, 이는 다시 파라크린 방식으로 ER- 세포에 작용하여 증식을 유도한다. 본 발명의 EGFR TK 억제제는 ER- 세포 상의 EGFR에 직접 결합하여 이러한 증식을 억제한다.
다른 한편으로는, 조직 기질과 성장 인자 모두에서 유래된 생존 신호에 의해 세포 사멸(아폽토시스)이 방지된다. 인슐린양 성장 인자(IGFI)는 IGFI 수용체를 통해 신호를 전달하여 유방의 세포 사멸을 방지한다.
Roudabush 등[J. Biol. Chem.,(2000), 275, 22583-22589]에 의한 최근 연구는 IGFR에 의해 유도된 IGFR 자극이 EGF과 구성원의 세포 밖으로의 분비를 자극하고, 이는 이후에 세포 자신과 이웃 세포의 EGFR에 작용한다는 것을 입증하였다. 따 라서 본 발명의 EGFR TK 억제제에 의한 유방에서의 EGFR의 차단은 유방 상피의 시험관내 및 생체내 세포 사멸(아폽토시스)을 유도한다.
놀라운 것은, EGFR TKI는 ER- 세포에 발현된 EGFR에 직접적으로 작용할 뿐만 아니라, ER+ 세포에도 독립적으로 작용한다는 것이다.
R B Clarke 등의 문헌[Cancer Research(1997 57 4987-4991)]은 정상 ER+/EGFR- 상피 유방 세포는 증식하지 않지만 이웃 ER-/EGFR+ 세포는 증식한다는 것을 보여주었는데, 이는 증식이 2가지 기전에 의해, 즉
(1) ER+ 세포; 및
(2) 이웃 EGFR+/ER- 세포를 파라크린 방식으로 자극하는 ER+ 세포에 의해 분비된 EGF 및 관련 리간드
의 에스트로겐 자극에 의해 일어난다는 것을 나타낸다.
TK를 EGFR TKI로 억제하면 이웃 ER-/EGFR+ 세포는 증식을 하지 못한다.
또한, 본 발명의 데이타는 EGFR TKI 역시 ER+ 세포에서 에스트로겐에 의해 유도된 프로게스테론 수용체의 발현을 막고 ER+ 세포 교체를 감소시킨다는 것을 입증한다.
따라서, 에스트로겐은 정상 ER+ 세포에서의 스테로이드 호르몬 수용체와 단백질 합성을 유도하여 세포가 증식 및 성장하게 하고, 호르몬 반응성을 유도하여 이웃 ER- 유방 상피 세포에 작용하는 성장 자극 인자(예, EGF)를 분비하게 한다.
또한, EGFR TK 억제제는 ER+ 세포에서 에스트로겐에 의한 프로게스테론 수용체의 유도를 막음으로써, 유방 상피의 호르몬 민감성과 자극을 감소시키고 정상 조 직의 암 조직으로의 변형을 예방한다.
폐경기 이전의 에스트로겐 레벨에 노출되지 않은 정상 유방 조직에서 약 5%인 프로게스테론 수용체 표지 지수(PRLI)는 에스트로겐에 노출시 15%로 증가한다(I J Laidlaw 등의 문헌[Endocrinology(1994), 136, 164-171]). 에스트로겐 자극에 대해 길항작용을 하는 ZD 1839를 사용하면 이러한 상승을 막아서 PRLI가 10%가 되게 한다.
또한, EGFR 티로신 키나제 억제제는 정상 상피(특히 정상 유방 상피)와 악성 침입성 상피(특히 악성 침입성 유방 상피) 사이의 비침입성 중간 단계로 발달된, 상피 조직, 특히 유방 상피 조직에서 사용되어, 이러한 세포의 증식을 막거나, 또는 이러한 세포의 상피 조직이 정상 상태로 거의 복귀되도록 할 수 있다.
이러한 중간 단계 세포의 예로는 유방의 관 및/또는 루멘내에 존재하는 이형 관 과형성, 소엽 신생 및 비침입성 동일계 암 세포가 있다. 이러한 세포들은 유방암 발생 위험이 높은 환자에 존재할 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 본 발명은 침입성 유방암이 없는 사람, 특히 여성에서 상피 세포, 특히 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소, 바람직하게는 억제하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 EGFR 티로신 키나제 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 본 발명은 침입성 유방암이 없는 사람, 특히 여성에서 상피 세포, 특히 유방 상피 세포의 상기한 바와 같은 중간 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소, 바람직하게는 억제하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있 어서의 EGFR 티로신 키나제 억제제의 용도를 제공한다.
제1 측면과 제2 측면 각각에 따르면, 본 발명은 특히 유방암 발생 위험이 높은 환자, 소위 "고위험율" 환자에게 적용가능하다. 유방암 위험율의 평가에 적합한 컴퓨터 생성 프로그램인 소위 가일 리스크 모델(Gail Risk Model)에서 1.5 이상의 점수를 갖는 환자를 고위험율 환자로 분류하는 것이 공지되어 있다(M. H. Gail 등의 문헌[J. Natl. Cancer Inst.(1989), 81, 1879-1886] 참조). 유방암 발생 위험을 증가시키는 요인으로는 이형 과형성(1촌 중의 유방암 실재를 이것의 가족력으로 포함), 소엽 신생, 비침입성 동일계 암 또는 돌연변이 BRCAI 유전자의 존재를 들 수 있다(D. L. Page 등의 문헌[BMJ(1994), 309, 61-64] 참조).
따라서, 본 발명은 특히 중간 단계 세포의 치료에 적용가능하다.
본 발명의 전술한 제1 측면의 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, ZD1839, CP358774, PD0183805 및 PKI 166에서 선택된 EGFR 티로신 키나제 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기 제1 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 용도를 제공한다.
본 발명의 전술한 제2 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 중간 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, ZD1839, CP358774, PD0183805 및 PKI 166에서 선택된 EGFR 티로신 키나제 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기 제2 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 중간 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 용도를 제공한다.
본 발명의 제3 측면에 따르면, 본 발명은 침입성 유방암이 없는 사람, 특히 여성에서 상피 세포, 특히 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소, 바람직하게는 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 EGFR 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 제3 측면의 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 ZD1839, CP358774, PD0183805 및 PKI 166에서 선택된 EGFR 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 제3 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제4 측면에 따르면, 본 발명은 침입성 유방암이 없는 사람, 특히 여성에서 상피 세포, 특히 유방 상피 세포의 중간 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소, 바람직하게는 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 EGFR 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 제4 측면의 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 중간 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 ZD1839, CP358774, PD0183805 및 PKI 166에서 선택된 EGFR 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 제4 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 사람, 특히 여성에서 유방 상피 세포의 중간 상태에서 악성 상태로의 변형을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 경우와 마찬가지로, 본 발명의 상기 제3 및 제4 측면은 전술한 바와 같이 특히 고위험율 환자와, 중간 상태 세포의 치료에 적용가능하다.
본 발명의 제5 측면에 따르면, 본 발명은 상피 조직, 특히 유방 상피 조직을, 정상 상피, 특히 정상 유방 상피와 악성 침입성 상피, 특히 악성 침입성 유방 상피 사이의 전술한 바와 같은 중간 상태에서 정상 상태로 거의 복귀시키는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 EGFR 티로신 키나제 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기 제5 측면의 바람직한 형태에서, 본 발명은 유방 상피 조직을, 정상 유방 상피와 악성 침입성 유방 상피의 중간 상태에서 정상 상태로 거의 복귀시키는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, ZD1839, CP358774, PD0183805 및 PKI 166에서 선택된 EGFR 티로신 키나제 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기 제5 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 유방 상피 조직을, 정상 유방 상피와 악성 침입성 유방 상피의 중간 상태에서 정상 상태로 거의 복귀시키는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 용도를 제공한다.
본 발명의 제6 측면에 따르면, 본 발명은 상피 조직, 특히 유방 상피 조직을, 정상 상피, 특히 정상 유방 상피와 악성 침입성 상피, 특히 악성 침입성 유방 상피 사이의 중간 상태에서 정상 상태로 거의 복귀시키는 방법으로서, 침입성 유방암이 없는 사람, 특히 여성에게 EGFR 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 제6 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 유방 상피 조직을, 정상 유방 상피와 악성 침입성 유방 상피 사이의 중간 상태에서 정상 상태로 거의 복귀시키는 방법으로서, 사람, 특히 여성에게 ZD1839, CP358774, PD0183805 및 PKI 166에서 선택된 EGFR 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 제6 측면의 보다 바람직한 형태에서, 본 발명은 유방 상피 조직을, 정상 유방 상피와 악성 침입성 유방 상피 사이의 중간 상태에서 정상 상태로 거의 복귀시키는 방법으로서, 사람, 특히 여성에게 EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
사용시 EGFR 티로신 키나제 억제는 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 정제 형태로 투여되는 것이 바람직하다.
일반적으로 유효량의 비독성량이 제공되도록 투여된다. 용량의 크기는 물론 선택된 특정 EGFR 티로신 키나제 억제제와 환자로의 투여 경로에 따라 달라진다. 일반적으로 각 EGFR 티로신 키나제 억제제의 통상적인 용량을 이용할 수 있다. 특히, EGFR 티로신 키나제 억제제 CP358774, PD0183805 및 PKI 166의 경우, 이들 화합물에 대한 출간물에 기재된 대로 통상적인 용량을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, EGFR 티로신 키나제 억제제 ZD1839의 경우, 1일 용량은, 예컨대 약 10 mg ∼ 5 g, 바람직하게는 약 10 mg ∼ 1000 mg, 보다 바람직하게는 약 10 mg ∼ 500 mg(즉, 약 0.2 mg/kg ∼ 100 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.2 mg/kg ∼ 20 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.2 mg/kg ∼ 10 mg/kg 체중)의 범위로 투여하고, 필요에 따라 용량을 분할하여 투여한다.
상기한 세포 변형의 억제는 단독 치료로서 이용될 수 있거나, 또는 EGFR 티로신 키나제 억제제(예, ZD1839) 외에도, 1종 이상의 다른 물질 및/또는 치료제와 함께 이용될 수 있다. 이러한 병행 치료는 치료제의 개별 성분들의 동시 투여, 순차적 투여, 개별적 투여, 또는 간헐적 투여로 실시할 수 있다. 예를 들면, 유방암 발생율이 평균 위험율 이상인 여성에서, 유방 조직의 유방암으로의 변형을 억제하기 위해 EGFR 티로신 키나제 억제제를 사용할 경우, 상이한 형태의 치료제를 병용하는 것이 일반적인 실시 형태이다. 이러한 병행 치료제의 다른 성분으로는 태목시 펜, 풀베스트런트(ICI 182, 780: 파슬로덱스) 또는 라록시펜과 같은 항에스트로겐을 들 수 있다. 이후에 예컨대 ZD1839와 같은 EGFR 티로신 키나제 억제제의 통상적인 용량을 투여하는 약 1∼6개월 기간의 1차 치료 후에, 태목시펜, 풀베스트런트 또는 라록시펜과 같은 항에스트로겐의 통상적인 용량을 투여하는 약 1∼6개월 동안의 2차 치료의 순차적 치료법을 이용하는 것이 이익이 될 수 있다. 이렇게 하면 이 기간 동안 유방 조직이 구성적으로 일부 성장하여 조직 위축 정도를 최소화하게 된다.
대안으로, 병행 치료법은 태목시펜, 풀베스트런트 또는 라록시펜과 같은 항에스트로겐의 연속 투여와, ZD1839와 같은 EGFR 티로신 키나제 억제제의 간헐적 투여를 포함할 수 있다. EGFR 티로신 키나제 억제제의 간헐적 치료는, 예컨대 약 1개월간 EGFR 티로신 키나제 억제제(예, ZD1389)를 투여하는 제1부에 이어, 약 1개월간 EGFR 티로신 키나제 약제를 투여하지 않는 기간을 포함하는 제2부로 이루어지는 2개월 사이클의 치료법을 포함할 수 있다. 이후에 이러한 2개월 사이클의 치료법을 추가로 이용할 수 있다.
하기 실시예와 첨부 도면을 참조로 하여 본 발명의 구체예를 보다 상세히 설명할 것이다.
도 1은 실시예 2에 대한 ER-/EGFR+ 및 ER+/EGFR- DCIS 상피에서의 증식(Ki67 LI)과 아폽토시스(AI)를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 3에 대한 (a) DCIS 및 (b) 정상 유방에서의 ZD18389 용량 반 응을 도시한 것이다.
실시예 1
본 발명의 EGFR 티로신 키나제 억제제의 효과는 암컷 무흉선 BALB/c nu/nu 마우스에서의 사람 정상 유방 조직 및 동일계 유방암의 이식 및 성장을 포함하는 이종이식편 모델(Holland 등의 문헌[J. National Cancer Institute(1997), 89, 1059 및 Gandhi 등의 문헌[Cancer Research(2000), 60, 4284-4288])을 이용하여 측정하였다. 치료 수술중인 여성으로부터 얻은 정상 유방 조직과 동일계 관 암종(DCIS)을 암컷 마우스에게 이종이식편으로서 이식하였다. 14일 후, 10∼200 mg/kg의 1일 용량의 ZD1839를 14일간 투여하기 시작하였다. 이종이식편 조직을 0일, 14일, 21일 및 28일에 절제하였다. 14일째, 대조군과 치료군 마우스 모두의 제2 세트 실험군에 17β-에스트라디올 펠렛(2 mg)을 피하 이식하고, 통상의 Ki67 면역염색을 이용하여 상피 증식을 평가하였다(Ki67은 세포내의 마커에 대한 단일클론 항체이다).
다음과 같은 결과를 얻었다.
| Ki67 지수 | 0일 | 21일 | 28일 | ||
| 정상 유방 | 대조군 | 대조군 | ZD1839군 | 대조군 | ZD1839군 |
| 중간값 | 7.6 | 3.3 | 0.7 | 6.1 | 1.8 |
| Ki67 지수 | 0일 | 21일 | 28일 | ||
| DCIS 조직 | 대조군 | 대조군 | ZD1839군 | 대조군 | ZD1839군 |
| 중간값 | 19.9 | 10.6 | 7.2 | 23 | 3.2 |
| Ki67 지수 | 0일 | 21일 | 28일 | ||
| 에스트로겐으로 자극된 정상 유방 | 대조군 | 대조군 | ZD1839군 | 대조군 | ZD1839군 |
| 중간값 | 10.4 | 15.7 | 1.5 | 14.8 | 1.2 |
실시예 2
절차의 요약
DCIS에 대해 수술중인 16명의 여성으로부터 얻은 유방 조직을 1회 실험당 16∼20마리의 면역억제된 마우스에 이식하였다(마우스 1마리당 8개의 이종이식편). 치료는 이식 2주 후에 시작하였고, 10∼200 mg/kg의 ZD1839를 매일 위관영양법으로 14∼28일간 투여하는 것으로 구성되었다. 적절한 대조군도 포함시켰다. 이종이식편은 14일, 21일, 28일 및 42일에 제거한 다음, Ki67 면역염색으로 증식(LI)을 평가하고 형태를 관찰하여 아폽토시스(AI)를 평가하였다.
재료 및 방법
환자
이 실험의 참여자들은 1998년 11월부터 2000년 1월까지의 기간 동안 나이팅게일 유방 스크리닝 평가 센터 또는 영국 소재의 사우쓰 맨체스터 대학 병원의 증후성 유방 클리닉에 참가한 여성이었다. 이 여성들 중 DCIS의 지표인 만연된 미소석회화와, 진단의 세포병리학적 확증 또는 조직병리학적 확증을 나타내는 유방 X선 사진을 보유하는 여성들을 이 실험에 포함시켰다(n=16). 모든 조직 샘플은 DCIS의 치료 절제부에서 얻었다. 이 실험에서 병리 샘플로부터 조직을 제거하는 것에 대해 사우쓰 맨체스터 의학 연구소 윤리 위원회의 승인을 받았다.
동물
패터슨 암 연구소의 사육 군체로부터 무손상 어른 암컷인 8∼10주령의 무흉선 누드 마우스(BALB/c nu/nu)를 입수하였다. 이들을 12시간 명암 사이클(7PM에서 7AM에는 불을 끔)의 통상의 조건으로 필터 탑 케이지 안에서 사육하였다. 사육 기간 동안 마우스에게 방사선 조사된 먹이와 여과시킨 물, 그리고 방사선 조사된 깔짚을 임의로 제공하였다. 실험 기간 동안에는 표준 식이, 물 및 깔짚을 이용하였다. 동물의 모든 관리와 수술 절차는 내무부 규정 및 UK 사이언티픽 프로시져(1986) 조례에 따라 수행하였다. 모든 절차에 있어서 할로세인 흡입 마취(산소 상의 2∼4% 할로세인; 영국 콩글레턴 소재의 인터내셔널 마켓 서플라이즈 할로벳 배이퍼라이저)를 이용하였다.
조직 샘플의 처리
마우스에 이식하기 위한 조직 표본을 준비하기 위해, 수술시에 주 표본으로부터 미소석회화를 포함하는 1∼2 cm3의 유방 조직 단편을 취하였다. 이 신선한 조직으로부터 과량의 지방을 제거하고, 즉시 멸균 조건하에서 3 또는 4개의 더 작은 부분으로 분할하여, 4.5 g/ℓ의 포도당을 함유하고 피루브산나트륨을 함유하지 않는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)[영국 스코틀랜드 패이슬레이 소재의 깁코 라이프 테크놀로지]에 넣고, 이를 마우스에 이식할 때까지 실온에 두었다. 실험실에서는, 조직을 멸균 페트리 디쉬내의 새 DMEM에 넣고, 이 조직을 외과용 메스날을 이용하 여 2 mm x 2 mm x 1 mm 크기의 샘플로 주의를 기울여 절개하였다. 유용한 조직의 용적에 따라, 페트리 디쉬로부터 5∼20개의 단편을 무작위로 선택하여, 마우스에 이식하는 대신에 조직검사에 사용하였다. 이러한 비이식용 이식편의 반은(0일) 즉시 완충 포르말린(4% 포름알데히드)에 24시간 동안 고정시키고, 나머지 반은 카노이(Carnoy) 고정액에서 1시간 동안 고정시킨 다음, 이들 모두를 70% 알코올에 보관하였다. 최소 24시간 후, 고정된 조직 샘플을 조직 카세트(티슈 텍 III; 영국 배싱스톡 소재의 바이어 다이애그노스틱스 엘티디.)에 개별적으로 넣고, 파라핀 포매시까지 70% 알코올에 보관하였다. 각 환자로부터 절제한 DCIS를 나타내는 샘플들은 "0일" 표본으로 표지하고, 조직검사 재검토, 면역염색 및 아폽토시스 세포 수 측정을 위해 저장하였다. 나머지 이종이식편을 누드 마우스에 이식하였다.
이종이식편의 누드 마우스로의 이식
실시예 1에서와 같이, 각 환자 샘플을 10∼32마리의 마우스로 분할하였다(유용한 조직 용적과 유용한 마우스의 수에 따라서 분할; 중간수=16). 이종이식편의 마우스로의 이식은 환자로부터 조직을 제거한지 90분내에 완료하였다. 등쪽 피부를 가로질러 2개의 작은 중심선 피부 절개를 실시하고, 이를 통해 8개의 조직 단편(한쪽당 4개 단편)이 대칭적으로 배치되도록 이식하였다. 적절한 시점에 이들 이종이식편을 회수하기 위해 마우스를 다시 마취시키고 날카로운 절개로 각 이식편을 절제하였다. 이어서 0일째 표본에 대한 조직검사를 위해 이식편을 전술한 바와 같이 가공하였다. 100∼200 mg/kg ZD1839 실험의 경우, 14일, 21일 및 28일에 이식편을 제거하고, 보다 낮은 용량(10∼75 mg/kg)의 경우, 14일, 28일 및 42일에 이식편을 회수하였다. 매 중간 시점에 2개의 이종이식편을 제거하고, 각 마지막 시점에 각 마우스로부터 4개의 이종이식편을 제거하였다.
처리
처음 2개의 이종이식편을 제거한 후 14일째부터 시작하여 ZD1839(10∼200 mg/kg) 또는 부형제를 14∼28일간 마우스에게 위관영양법으로 투여하였다. 경구 활성이 있는 선택적인 EGFR-TKI인 ZD1839(4-(3클로로-4플루오로페닐아민)-7-메톡시-6(3-(4모르폴리닐)퀴나졸린)은 아스트라제네카 파마슈티컬스로부터 제공받았다. 부형제(대조군)는 0.5% 폴리소르베이트였다.
이종이식편의 조직검사 평가
0일째의 모든 표본과 각 이종이식편을 파라핀 블록에 포매하였다. 각 블록으로부터 H&E 염색된 3 ㎛ 절편을 단일 경험의 유방 병리학자가 DCIS 존재에 대해 검사하였다. DCIS를 포함하는 것들은 전술한 바와 같이 아폽토시스 및 Ki67 항원 면역원성(상피 증식의 마커로서)에 대해 평가하였다.
DCIS를 포함하는 모든 0일째 표본에서는 핵 기(grade)와 면포성-괴사의 존재 또는 부재에 대해서도 확인하였다. 또한, 0일째 표본으로 ER, c-erbB-2, EGFR 상태에 대한 면역조직화학 평가도 실시하였다.
아폽토시스에 의한 세포 사멸의 평가
광학 현미경을 이용하여 DCIS 샘플의 H&E 염색된 절편에서 아폽토시스의 형태적 증거를 관찰하였다. 아폽토시스 세포를 확인하는 데 이용된 기준은 널리 인정되고 있는 것으로, 먼저 핵의 경계 부분에 나타나는 염색질의 응축; 세포질(호색소 체)의 응축; 주변 세포로부터의 분리; 죽어가는 세포 주변의 특징적인 백색 후광의 출현; 그리고 막 결합 단편(아폽토시스체)을 형성하는 세포질 버딩을 포함한다. AI를 얻기 위해, Zeiss 현미경을 이용하여 400배 확대로 1000개 이상의 세포를 세고, 아폽토시스 형태를 나타내는 세포의 수를 계수된 총수에 대한 비율로서 나타내었다.
ER 및 Ki67 핵 항원의 면역조직화학적 측정
ER 및 Ki67 면역조직화학법을 이용하였다. 이 방법에 대해서는 Gandhi 등의 문헌[Br. J. Cancer(1998), 78, 785-794])에 기술되어 있다.
ER 및 Ki67 염색 모두 최소한으로 세포질을 염색하여 주로 핵이 염색되었다. 염색의 강도는 다양하였지만, 이것을 개개로 평가하지 않았고, 세포를 양성 또는 음성으로 판단하였다. 최소한 1000개의 상피 세포로부터 Ki67 표지 지수(LI)를 계산하고, 양으로 염색된 핵의 수를 계수된 총수에 대한 비율로서 나타내었다. 1000개의 세포의 ER 상태 역시 측정하고, 세포의 >5%가 ER에 대해 양으로 염색될 경우 이 병변을 ER+로 간주하였다.
c-erbB-2, EGFR 및 pErk1/Erk2의 면역조직화학적 측정
각 표본에서 얻은 조직의 파라핀 왁스 절편(3 ㎛ 두께)을 절단하여, APES(3-아미노프로필에톡시실란) 코팅된 슬라이드 위에 마운팅하고, 왁스를 제거하고 수화시켜서, c-erbB-2, EGFR 및 인산화된(p)Erk1/Erk2에 대한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 극초단파법(650W)을 30분간 이용하여 항원을 회수하였다. 인산염 완충 염수(PBS) 중의 과산화수소[EGFR 및 c-erbB-2의 경우 1.5%(부피/부피), pErk1/Erk2 의 경우 3%(부피/부피)]에서 15분간 항온처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. c-erbB-2 및 EGFR 항원의 경우, 슬라이드를 TBS에서 헹군 후, 10% 정상 토끼 혈청을 이용하여 비특이적 결합을 차단한 다음, EGFR의 경우 1:20으로 희석시킨 1차 항체(마우스 단일클론 항-사람, NCL-EGFR; 영국 뉴캐슬 어폰 타인 소재의 노보캐스트라 랩스) 및 c-erbB-2의 경우 1:40으로 희석시킨 1차 항체(마우스 단일클론, MAB4022, 영국 해로우 소재의 케미콘)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 비오티닐화된 토끼 항-마우스 면역글로불린(E413, 영국 하이 위콤 소재의 다코)을 2차 항체(1:350 희석, 30분간 항온처리)로서 가하고, 그 후 c-erbB-2 및 EGFR 의 경우, 표준 3겹 스트렙타비딘-아비딘-비오틴 호스래디쉬(K0377, 다코)와 함께 실온에서 30분간 항온처리하였다.
pErk1/Erk2 항원 검출의 경우, 절편을 20% 정상 사람 혈청으로 15분간 차단한 후, 1:20으로 희석시킨 다클론 토끼 항-사람 pMEK, pErk1/Erk2, pElk1 1차 항체(9101L, 영국 뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 첨가하였다. 1:100으로 희석시킨 바이오제넥스 멀티 링크(영국 랜베리스 소재의 Euro/DPC)를 2차 항체로서 1시간 동안 가하였다. 아비딘/비오틴 복합체 면역조직화학 키트 절차(Euro/DPC의 바이오제넥스 컨센트레이티드 라벨)를 이용하였다.
색원체인 디아미노벤지딘(영국 풀 소재의 시그마)을 5분간 가한 후, 대비 염색제로 헤마톡실린을 5분간 가하였다.
음성 대조군(마우스속 IgG, X0931, 다코) 및 양성 대조군(EGFR의 경우 A431 세포의 절편, c-erbB-2 및 pErk1/Erk2의 경우 강력한 양성으로 이미 알려진 바 있 는 DCIS 조직 절편)을 이용하였다.
c-erbB-2 및 EGFR에 대한 염색은 주로 막에 대한 것이었지만, 세포질과 핵에도 염색이 되었다. 이들은 양성 및 음성 대조군 슬라이드와 비교하여 양성(스케일 1∼4) 또는 음성으로 점수를 매겼다. pErk1/Erk2에 대한 염색은 핵과 세포질에 되었으며, Gee 등의 종래 문헌[Int. J. Cancer(1995), 64, 269-273])에 기재된 대로 핵과 세포질 성분에서의 염색 강도에 따라 점수를 매겼다.
모든 조직학적 평가는 처리군에 대해 알지 못하는 조사자가 수행하였다. 최초 측정 후 몇개월 후에 동일한 조사자가 Ki67 항체로 염색된 10개의 슬라이드와 아폽토시스에 대한 10개의 H&E 슬라이드의 점수를 다시 매겨서 집계의 재현성을 평가하였다. 이렇게 얻은 2세트의 결과는 회귀 분석시 상관성이 있었다(r=0.95, P<0.001).
정상 마우스 장에서의 상피 증식
Ki67 평가를 위한 장 조직의 제거, 가공, 그리고 채점 방법은 종래의 Potten 및 Grant의 문헌[Br. J. Cancer(1998), 78, 993-1003]에 기재되어 있다.
통계 방법
패터슨 암 연구소의 전산 및 생물수학의 CRC 분과에서 SPSS 소프트웨어(SPSS, 미국 일리노이주 시카고)를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 정상 유방 상피 또는 DCIS를 나타내는 각 경우에 대해, 매 평가 시점마다 ZD1839 처리군과 대조군 마우스로부터 회수한 샘플들을 비교하였다. 2개의 실험군에서 매 평가시에 얻은 조직 샘플은 통계적으로 독립적인 것으로 간주하였고, Mann Whitney U 테스트를 이용하여 비교하였다. 모든 유의성 테스트는 통상의 5% 유의성 레벨을 이용하여 양측으로 하였다. 모든 용량에서 최초 분석으로 효과를 입증한 후, 개개의 ZD1839 용량으로부터 얻은 데이타를 하나로 정리하였다. 피어슨 상관계수를 이용하여 측정기준 변수간의 상관 정도를 조사하였다. 음와내의 각 상피 세포 위치에서의 중간값을 비교하여 장 상피에서의 증식을 통계적으로 분석하였다.
결과
수술중인 여성들의 중간 나이는 n=범위였다(폐경기 상태).
이종이식편 이식 및 회수
DCIS
수술시에 DCIS를 포함하는 것으로 확인된 16개의 유방 조직 표본 중에서 13개(81.3%)로 DCIS를 포함하는 0일째 표본을 제조하였고, 그 중 11개는 면역조직화학적으로 중간 점수 2(범위 1∼3)의 EGFR+를 나타내었으며, 2개는 EGFR-를 나타내었다. 이들 11개의 EGFR+ 사례 중에서 7개는 ER-/c-erbB-2 양성(모두 말기 핵), 3개는 ER+/c-erbB-2 양성(1개는 말기, 2개는 중기), 그리고 1개는 ER+/c-erbB-2 음성(초기)이었다. 13개의 유방 조직 표본으로 총 273개의 0일째 샘플을 제조하였고, 그 중에서 44개(16.1%)는 DCIS 병소를 포함하였다. 총 1904개의 이종이식편을 이식하였고, 그 중에서 1858개(97.5%)는 성공적으로 회수되었다. 회수된 1858개의 이종이식편 중에서 329개(17.7%)는 DCIS를 포함하였다. 1회 실험당 DCIS의 중간 회수율은 예상치(범위 14∼91.3%)의 71%였다. 13회의 실험 모두에서 14일, 21일, 28일 및 42일 이종이식편에서 DCIS를 회수하였다.
정상 유방
DCIS 수술시에 제거한 총 16개의 표본에서 조직 검사시 정상인 유방 조직을 발견하였다. 이식된 이종이식편의 대다수(97.6%)를 회수하였고, 그 중 22.4%는 정상 유방을 포함하였다. 모든 실험의 100%에서 모든 시점에서 정상 유방을 회수하였다. 16가지 사례 모두 중간 점수가 1(범위 1∼2)인 ER+ 및 EGFR+였고, 2개는 약하게 c-erbB-2 양성으로 나타났다.
정상 유방(표 1)
하기 표 1은 상이한 시점에서 ZD1839(10∼200 mg/kg[하나로 정리된 데이타]) 대 부형제 처리된 (a) 정상 유방 및 (b) DCIS 상피에서의 EGFR+ 증식(LI) 및 아폽토시스(AI)를 나타낸 것이다. 괄호안의 수는 사분위 범위 **p<0.01, ***p<0.001 대 대조군을 나타낸다.
정상 유방 이종이식편에서는 0∼14일에 중간 LI가 감소되었고(4.9[IQR: 4.0-5.7] 대 3.8[IQR: 2.7-5.1], p<0.05), 이는 다른 시점(21일, 28일 및 42일)에서는 변하지 않고 유지되었다. 21일째 ZD1839 처리군은 대조군에 비해 중간 LI가 감소하였다(2.3[IQR: 1.0-3.8] 대 4.1[IQR: 2.8-5.2]), 28일(2.2[IQR: 1.7-3.3] 대 4.1[IQR: 2.4-5.4]) 및 42일(1.7[IQR: 1.1-2.6] 대 2.8[IQR: 2.3-5.2])(모두 p<0.01).
AI 조사 결과는 상기 DCIS 처리된 이종이식편에 대한 조사 결과와 유사하였다. 0∼14일에는 중간 AI의 감소가 관찰되지 않았다(0.20[IQR: 0.17-0.29] 대 0.18[IQR: 0.10-0.21], p=0.90). 21일째, ZD1839 처리된 이종이식편은 대조군에 비 하여 중간 AI가 감소하였다(0.36[IQR: 0.23-0.53] 대 0.18[IQR: 0.10-0.25, p<0.001). 처리 14일 후(28일), 중간 AI는 대조군 레벨과 동일해졌다(ZD1839 0.19[IQR: 0.10-0.28] 대 대조군 0.18[IQR: 0.10-0.20], p=0.35).
| ZD1839가 정상 유방 상피 및 DCIS 상피의 증식 및 아폽토시스에 미치는 영향 | ||||||
| 중간값 | 0일 | 14일 | 21일 | 28일 | ||
| 대조군 | ZD1839 | 대조군 | ZD1839 | |||
| LI | ||||||
| 정상 유방 | 4.9 (4.0-5.7) | 3.8 (2.7-5.1) | 4.1 (2.8-5.3) | 2.3** (1.0-3.8) | 3.4 (2.4-5.4) | 2.2** (1.7-3.3) |
| DCIS | 13.9 (11.9-15) | 12.6 (9.1-14.1) | 11.2 (9.7-12.9) | 4.6** (3.2-7.2) | 13.1 (11.8-15.8) | 5.1** (3.2-10.6) |
| AI | ||||||
| 정상 유방 | 0.20 (0.18-0.29) | 0.18 (0.10-0.21) | 0.18 (0.10-0.25) | 0.36** (0.23-0.53) | 0.18 (0.10-0.20) | 0.19 (0.10-0.28) |
| DCIS | 1.07 (0.89-1.21) | 0.79 (0.53-1.19) | 0.72 (0.55-0.91) | 1.47** (1.25-2.18) | 0.46 (0.34-0.85) | 0.64 (0.38-1.15) |
| LI/AI | ||||||
| 정상 유방 | 23.9 (18.3-43.3) | 25.7 (13.4-33.3) | 15.9 (8.0-26.3) | 3.9*** (1.6-5.2) | 33.8 (21.4-70.6) | 8.5*** (5.8-17.4) |
| DCIS | 12.1 (8.4-15.8) | 12.1 (8.2-19.9) | 17.7 (12.7-22.0) | 2.7*** (2.2-3.6) | 29.7 (13.1-40.2) | 4.4*** (2.7-6.9) |
EGFR+ DCIS(도 1)
도 1은 ER-/EGFR+(1a 및 1c) 및 ER+/EGFR+(1b 및 1d) DCIS 각각에서 ZD1839에 의해 유도된 LI 및 AI의 변화를 나타낸 것이다. ZD1839 또는 부형제를 14일 이후부터 투여하였다. 0일 및 14일의 값은 미처리 마우스에서 얻은 값이다. 처리 7일 및 14일 후에 ZD1839 군의 ER-/EGFR+ 및 ER+/EGFR+ DCIS 모두에서 AI의 증가와 LI의 감소가 관찰되었다(*p<0.05, **p<0.01 대 대조군). 괄호안의 수는 특정 시점과 해당군의 관찰한 횟수를 나타낸다. 중간값은 진한 가로선으로 나타내었고, 박스는 사분위 범위를 나타낸다.
0일째 표본에서의 LI 및 AI의 중간값은 ER+/EGFR- DCIS의 4가지 사례보다 ER-/EGFR+ DCIS의 7가지 사례에서 더 높았다(각각 14.0[IQR: 13.0-15.3] 대 7.8[IQR: 6.5-11.2] 및 1.3[IQR: 1.0-1.6] 대 0.79[IQR: 0.6-1.0], 두 경우 모두 p<0.05).
21일째(4.7[IQR: 2.6-17.2] 대 11.6[IQR: 10.7-15.1], p=0.19), 28일째(8.3[IQR: 2.7-10.9] 대 13.5[IQR: 12.0-16.3], p<0.01) 및 42일째(11.4[IQR: 10.8-11.8] 대 13.0[IQR: 12.0-14.8], p<0.05) ZD1839 처리군은 부형제 처리군에 비해 ER-/EGFR+ DCIS의 LI 중간값이 감소하였다(도 1a).
0∼14일에는 ER-/EGFR+ DCIS에서 AI 중간값에 변화가 없었다(1.3[IQR: 1.0-1.6] 대 1.0[IQR: 0.8-1.44], p=0.14). 처리한지 7일 후(21일째), ZD1839 처리군의 AI 중간값은 부형제 처리군에 비해 현저히 감소하였지만(2.1[IQR: 1.0-2.3] 대 0.7[IQR: 0.5-1.1 p<0.01), 처리 14일 후(28일)에는, AI 중간값은 대조군 레벨로 복귀하였다(ZD1839 1.1[IQR: 0.8-1.2] 대 대조군 1.2[IQR: 0.5-1.5], p=0.44)(도 1b).
ER+/EGFR+ DCIS에서의 LI 및 AI의 유사한 변화(도 1b 및 1d)는 14일째의 LI에서의 현저한 감소(ZD1839 4.6(IQR 3.9-5.2%) 대 11.2 대조군(IQR 9.2-15.55)) 및 아폽토시스의 증가(ZD1839 1.5(IQR 1.3-1.6) 대 대조군(IQR 0.6-0.9%))와 함께 관찰되었다.
EGFR+에서의 Ki67 LI(도 2)
도 2는 상이한 용량의 ZD1839(10∼200 mg/kg) 또는 부형제 대조군으로 위관 영양법을 실시한지 2주(28일) 후 EGFR+ (a) DCIS 및 (b) 정상 유방 이종이식편에서의 상피 증식율(Ki67 LI)을 나타낸 것이다. 괄호안의 수는 특정 시점과 해당 군의 관찰 횟수를 나타낸 것이다. 중간값은 진한 가로선으로 나타내었고, 박스는 사분위 범위를 나타낸다.
ZD1839의 용량 증가는 정상 유방을 제외하고 ER-/EGFR+ 및 ER+/EGFR+ DICS 모두에서의 상피 증식의 감소와 연관이 있었다(도 2).
증식과 아폽토시스와의 상관성
본 발명자들은 이미 DCIS에서 LI와 AI의 양의 상관성을 입증한 바 있다. LI는 ZD1839로 처리하지 않은(즉, 0일, 14일 및 부형제 대조군 사례) 정상 유방과 DCIS에서 AI와 양의 상관성을 나타내었다(각각 r=0.10, p=0.02 및 r=0.25, p<0.01).
중간 LI/AI 비(세포 교체 비로서)를 이용한 세포 군집의 비교를 통해, ZD1839 처리가 DCIS와 정상 유방 모두에서 28일째 세포 교체를 현저히 억제하였다는 것을 알게 되었다(각각 4.4[2.7-6.9 대 29.7[13.1-40.2] 및 8.5[5.8-17.4] 대 33.8[21.4-70.6], p<0.001).
EGFR TKI 처리된 DCIS와 정상 유방에서의 pErk1/2의 하향조절
MAP 키나제 신호전달 경로가 EGFR 티로신 키나제 억제에 의해 이루어지는지를 확인하기 위해, ZD1839 또는 부형제 처리된 0일 및 42일째의 DCIS 절편과 정상 유방 이종이식편에서 인산화된 (p)ErK1/Erk2을 면역조직화학적으로 검출하였다. 0일째 DCIS 중간값과 정상 유방 핵 HScore는 30(IQR: 12-45) 및 22(IQR: 12-34)였 다. DCIS에서, 핵 HScore는 처리 28일 후 대조군에 비해 ZD1839 처리된 군에서 감소하였다(8[IQR: 5-18] 대 25[IQR: 8-30], p<0.05). 정상 유방에서도 유사한 차이가 있었다(7[IQR: 3-17.5] 대 18[IQR:8-32], p<0.01).
DCIS와 정상 유방에서 pErK1/Erk2의 핵 HScore와 Ki67 LI는 상관성이 있었다(두 경우 모두 r=0.52, p=0.05).
고찰
ER- DCIS는 c-erbB-2 발암유전자를 과다발현하고, 사례의 50%에서 EGFR 역시 발현하는 것으로 보고되고 있다. 본 발명자들은 11개의 ER- DCIS 중 10개(90%)에서 동일한 세포 군집 상에 상기 두가지의 수용체가 이중 발현된다는 것을 발견하였다. ER- DCIS는 증식 속도가 빠르며, 이는 처리전 샘플에서 MAP 키나제 신호 전달 효소의 높은 발현과 서로 관련이 있다.
이에 따라 본 발명자들은 EGFR/c-erbB-2 헤테로이량체의 형성이 높은 증식 속도와 MAP 키나제 발현을 유발시킨다고 가정하고, EGFR-TKI 펩티드인 ZD1839를 이용하여 상기 이론을 테스트하였다. 상기 가설의 초기 단계 검증에서 ZD1839 처리시 상피 증식의 연장된 감소와 활성화된 MAP 키나제 발현의 감소가 아폽토시스의 증가와 함께 관찰되었다. EGFR은 미토젠성 신호를 생성하고, 침입성 유방암에서 증식과 교체의 배가와 상관성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이 경로를 억제하면 DCIS 이종이식편에서의 Ki67 표지 지수가 감소되었다.
처리 7일 후 DCIS와 정상 유방 상피 모두에서 아폽토시스가 증가하였다. 인슐린양 성장 인자-1(IGF-1)은 세포 생존에 있어서 중요한 것으로 생각되지만, Roudabush 등의 최근 연구 결과[J. Biol. Chem., (2000), 275, 22583-22589]는 IGF-1 수용체 자극이 헤파린 결합-EGF의 세포외 분비를 유도하고, EGF 수용체의 트랜스활성화를 촉진한다고 보고하였다. 따라서, EGFR은 이미 알고 있는 것보다 정상 유방의 세포 생존에 있어서 더욱 중요한 것일 수 있다. 상피 증식은 정상 유방에서 아폽토시스와 상호 관련이 있으므로, 증식의 감소는 아폽토시스의 감소와 상호 관련이 있는 것으로 예측된다. ZD1839 처리군에서 7일 후의 아폽토시스의 초기 증가 후, 표지 지수(증식)의 감소는 14일 경에 아폽토시스의 감소를 유도하였다. 그러나, DCIS와 정상 유방의 ZD1839 처리군에서의 전체적인 LI/AI 비는 감소되었고, 이는 EGFR-TK 억제시의 더 낮은 총 세포 교체를 나타낸다. 또한, 세포 교체의 전체적인 감소는 EGFR TKI가 정상 유방에 미치는 잠재적인 화학예방 효과를 나타낸다. ER- 말기 DCIS는 광범위한 국부 절제 후 재발할 빈도가 가장 높으며, 50% 이상의 재발율은 결절성 전이 또는 원거리 전이를 수반하는 침입성 말기 유방암으로 되는 것으로 보고되고 있다. 재발 및 침입성 암으로의 진행을 막기 위해서는 증식을 억제하거나 아폽토시스를 증가시키는 제제가 필요하고, 상기 EGFR-TKI는 이러한 기준을 달성한다.
아폽토시스를 증가시키면서 정상 유방 상피 증식을 억제하는 것은 유방암 발생 위험이 높은 여성을 위한 화학예방제로서 EGFR-TK 억제제를 사용할 수 있음을 나타낸다.
EGFR MAP 키나제 경로는 세포 증식, 생존 및 분화에 있어서 중요한 것으로 생각된다. DCIS와 정상 유방에서 pErk1/Erk2와 Ki67 표지 지수의 유의적인 양의 상 관성은 MAP 키나제 신호전달이 유방 상피에서 세포 증식을 매개하는 데 있어서 중요하다는 것을 제시한다. ZD1839 처리군에서의 pErk1/Erk2의 감소는 증식의 감소와 상관성이 있으며, 이 경로를 통한 EGFR 신호와 MAP 키나제의 변화로 약제 반응을 예측할 수 있다.
실시예 3
실시예 2에 보다 완전히 설명한 실시예 1의 방법의 절차적 단계를 이용하여, ZD1839가 에스트로겐 자극된 정상 유방 상피의 증식(Ki67 LI)에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과는 표 2에 기재하였다.
정상 유방 상피에서, 0일째, 즉 마우스로 이식한 날, Ki67 LI 값은 4.1이었고, 14일째에는 2.6으로 감소되었다. 그 후 대조군 마우스를 에스토로겐만으로 처리하고, 테스트 마우스는 에스트로겐과 ZD1839로 처리하였다. 투여된 에스트로겐의 양은 폐경기 이전의 레벨에 해당하는 것으로, 즉 17-β-에스트라디올 펠렛(2 mg)이었다(실시예 1에서 언급한 Holland 등의 문헌 참조). 21일 후, 대조군 마우스에 대한 Ki67 LI 값은 6.5인 반면, 테스트 마우스의 값은 1.4로 현저히 감소하였다. 28일 후 대조군 마우스의 Ki67 LI 값은 5.4였으며, 테스트 마우스의 값은 계속 감소하여 1.1까지 떨어졌다.
| ZD1839가 에스트로겐 자극된 정상 유방 상피의 증식(Ki67 LI)에 미치는 영향 | ||||||
| 중간 Ki67 표지 지수 | 0일 | 14일 | 21일 | 28일 | ||
| 대조군 | ZD1839 | 대조군 | ZD1839 | |||
| 에스트로겐 자극된 정상 유방 | 4.1 (3.2-5.3) | 2.6 (2.1-4) | 6.5 (5-8.5) | 1.4*** (0.8-1.9) | 5.4 (4.6-6.1) | 1.1*** (0.9-1.6) |
| 괄호안의 수는 사분위 범위를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 대 대조군 | ||||||
실시예 4
역시 실시예 1의 방법을 이용하여, ZD1839가 에스트로겐 자극된 정상 유방 상피의 아폽토시스(AI)에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 기재하였다.
정상 유방 상피에서, 0일째, 즉 마우스로 이식한 날, AI 값은 0.3이었고, 14일째 0.2로 감소되었다. 그 후 대조군 마우스를 에스토로겐만으로 처리하고, 테스트 마우스는 에스트로겐과 ZD1839로 처리하였다. 투여된 에스트로겐의 양은 폐경기 이전의 레벨에 해당하는 것이었다. 21일 후, 대조군 마우스에 대한 AI 값은 0.5였고, 테스트 마우스의 값은 0.7로 더 높았다. 28일 후 대조군 마우스의 AI 값은 0.6이었으며, 테스트 마우스의 값은 0.7 레벨에서 유지되었다.
| ZD1839가 에스트로겐 자극된 정상 유방 상피의 아폽토시스(AI)에 미치는 영향 | ||||||
| 중간 아폽토시스 지수 | 0일 | 14일 | 21일 | 28일 | ||
| 대조군 | ZD1839 | 대조군 | ZD1839 | |||
| 에스트로겐 자극된 정상 유방 | 0.3 (0.19-0.3) | 0.2 (0.1-0.2) | 0.5 (0.45-0.65) | 0.7 (0.55-0.78) | 0.6 (0.45-0.66) | 0.7 (0.57-0.81) |
| 괄호안의 수는 사분위 범위를 나타낸다. **p<0.01 대 대조군 | ||||||
실시예 5
실시예 1에서와 동일한 방법으로 에스트로겐 자극된 정상 유방 상피에서 프로게스테론 수용체 발현(PR LI)에 ZD1839가 미치는 영향을 측정하였다(프로게스테론 수용체는 세포의 호르몬 반응성을 증가시킨다). 그 결과는 표 4에 수록하였다.
정상 유방 상피에서, 0일째, 즉 마우스로 이식한 날, PR LI 값은 11.8이었고, 14일째 5.8로 감소되었다. 그 후 대조군 마우스를 에스토로겐만으로 처리하고, 테스트 마우스는 에스트로겐과 ZD1839로 처리하였다. 투여된 에스트로겐의 양은 폐경기 이전의 레벨에 해당하는 것이었다. 21일 후, 대조군 마우스에 대한 PR LI값은 17.2였지만, 테스트 마우스의 값은 10.4에 불과했다. 따라서 PR 발현의 에스트로겐 유도는 ZD1839에 의해 억제되었다. 이렇게 하여, 성 스테로이드 프로게스테론 및 안드로겐의 호르몬 효과(일반적으로 프로게스테론 수용체를 통해 매개됨)는 억제된다.
| ZD1839가 에스트로겐 자극된 정상 유방 상피의 PR 발현(PR LI)에 미치는 영향 | ||||
| 중간 PR LI(%) | 0일 | 14일 | 21일 | |
| 대조군 | ZD1839 | |||
| 에스트로겐 자극된 정상 유방 | 11.8 (6.9-13.5) | 5.8 (4.5-7.7) | 17.2 (13.5-22.0) | *10.4 (8.9-13.1) |
| 괄호안의 수는 사분위 범위를 나타낸다. **p<0.001 대 대조군 | ||||
상기 결과로부터, 전술한 바와 같이, 정상 유방 세포 조직의 구성적 성장에 미치는 억제 효과 및 세포 사멸에 미치는 촉진 효과는 정상 세포의 암 세포로의 변형을 억제하는 방법, 즉 여성, 특히 악성 유방암 발생 위험이 높은 여성의 화학예방 치료법의 기초를 제공한다는 것을 알 수 있다.
정상 유방 상피를 이용한 실험은 호르몬 대체 요법(HRT)이 프로게스테론 수용체의 발현을 증가시키고(Hargreaves 등의 문헌[Br. J. Cancer(Oct. 1998) 78(7), 945-949 및 Hofscth 등의 문헌[J. Clin. Endocrinol. Metab.,(Dec 1999), 84(12), 4559-4565]), 병용 HRT(에스트로겐 및 프로게스테론)는 에스트로겐만을 이용한 HRT보다 훨씬 더 유방 상피 증식을 증가시킨다는 것을 보여준다(상기 Hofstch의 문헌 참조). 장기간 병용 HRT의 이용은 에스트로겐만을 이용한 HRT에 비해 유방암 발생율을 증가시켰다(Persson 등의 문헌[Cancer Causes Control,(Aug 1999), 10(4), 253-260; Colditz의 문헌[J. Womens Health, (Apr 1999), 8(3), 347-357; 및 Magnusson 등의 문헌[Int. J. Cancer(5 May 1999), 81(3), 339-344] 참조). 프로게스테론 수용체의 유도를 억제하면, 프로게스테론은 그 효과를 나타낼 수 없고, 유방암 발생 빈도는 감소된다.
또한, 에스트로겐 자극된 정상 유방 조직에 미치는 억제 효과는 EGFR 티로신 키나제 억제제가 높은 레벨의 에스트로겐의 존재하에서도 단독으로 작용한다는 것을 나타내며, 즉 폐경기 이전의 여성을 위한 화학적 예방법을 제공한다.
따라서, EGFR-TK 억제는 ER 상태와 관계없이 신규한 암 치료법과 예방법을 제공하고, 특히 유방암 발생 위험이 높은 가계에 강력한 신규 화학예방법을 제공한다.
Claims (13)
- 정상 상태 또는 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 동시에 상피세포의 증식을 감소시키며 또 상피 세포의 세포자멸사를 증가시켜서(a) 침입성 유방암이 없는 사람에서 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소시키거나;(b) 침입성 유방암이 없는 사람에서 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 악성 상태로의 상피 세포의 변형을 감소시키거나; 또는(c) 상피 조직을 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태로부터 정상 상태로 거의 복귀시킬 수 있도록 상피 세포를 치료함으로써, 침입성 유방암이 없는 사람에서 유방암의 발병을 화학적으로 예방하는, EGFR 티로신 키나제 억제제인 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(ZD1839)를포함하는 약학조성물.
- 정상 상태 또는 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 동시에 상피세포의 증식을 감소시키며 또 상피 세포의 세포자멸사를 증가시켜서(a) 침입성 유방암이 없는 사람에서 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소시키거나;(b) 침입성 유방암이 없는 사람에서 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 악성 상태로의 상피 세포의 변형을 감소시키거나; 또는(c) 상피 조직을 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태로부터 정상 상태로 거의 복귀시킬 수 있도록 상피 세포를 치료함으로써, 침입성 유방암이 없는 사람에서 유방암의 발병을 화학적으로 예방하는 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 제1활성성분과 제2활성성분의 조합물을 포함하고, 이들 제1활성성분과 제2활성성분은 동시에 또는 분리하여 투여 가능하며, 또 제1활성성분은 EGFR 티로신 키나제 억제제인 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(ZD1839)이고 또 제2활성성분은 항에스트로겐인 것인 약학조성물.
- 제2항에 있어서, 항에스트로겐은 태목시펜, 풀베스트런트 및 라록시펜으로 부터 선택되는 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상피 조직이 유방 상피 조직인 약학조성물.
- 정상 상태 또는 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 동시에 상피세포의 증식을 감소시키며 또 상피 세포의 세포자멸사를 증가시켜서(a) 침입성 유방암이 없는 사람에서 상피 세포의 정상 상태에서 악성 상태로의 변형을 감소시키거나;(b) 침입성 유방암이 없는 사람에서 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태에서 악성 상태로의 상피 세포의 변형을 감소시키거나; 또는(c) 상피 조직을 정상 상피와 악성 침입성 상피 사이의 중간 상태로부터 정상 상태로 거의 복귀시킬 수 있도록 하기 성분으로 상피 세포를 치료함으로써, 침입성 유방암이 없는 사람에서 유방암의 발병을 화학적으로 예방하기 위한 의약용 키트로서, 제1활성성분은 EGFR 티로신 키나제 억제제인 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(ZD1839)이고, 또 제2활성성분은 항에스트로겐인 의약용 키트.
- 제5항에 있어서, 항에스트로겐은 태목시펜, 풀베스트런트 및 라록시펜으로 부터 선택되는 의약용 키트.
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