ES2533762T3

ES2533762T3 - Diagnóstico de cáncer de mama

Info

Publication number: ES2533762T3
Application number: ES11758243.7T
Authority: ES
Inventors: Josef Penninger; Daniel Schramek; Georg Schett; Martin Widschwendter; Ian J. Jacobs; Usha Menon
Original assignee: IMBA Institut fur Molekulare Biotechonologie GmbH
Current assignee: IMBA Institut fur Molekulare Biotechonologie GmbH
Priority date: 2010-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2015-04-14
Anticipated expiration: 2031-09-22
Also published as: IL225441A0; MX2013003077A; US20130316374A1; AU2011306918B2; DK2619582T3; BR112013006683A2; EP2619582B1; US20170102388A1; NZ608208A; AU2011306918A1; CA2811558A1; CN103238067B; EP2434285A1; EP2619582A1; JP6006216B2; JP2013542419A; RU2013118332A; CN103238067A; WO2012038505A1; KR20130101062A

Abstract

Procedimiento de diágnostico de cáncer o para predecir el desarrollo de un cáncer en un paciente, en el que dicho cáncer es cáncer de mama, que comprende determinar la actividad de RANKL y la cantidad del ligando de RANKL, la osteoprotegerina (OPG), en una muestra de dicho paciente.

Description

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Aparición de tumores mamarios palpables en hembras MMTV-Cre rankfloxeado/ (RANKmam) (n=14) y hembras de la camada control de la misma edad (n=19) tratadas con gránulos de MPA y DMBA tal como se indica en la Fig. 2a. Los datos se muestran como porcentaje de ratones libres de tumores después de la última exposición a DMBA. La aparición media de los tumores para los controles fue de 11 días después del tratamiento con DMBA y de 30 días para las hembras RANKmam . c, Secciones histológicas representativas de tumores mamarios aislados de hembras de la camada control y de las RANKmam 22 días después del último tratamiento con DMBA. Se muestra la tinción con citoqueratina 5. 20 x aumentos d,e, Números de carcinomas in situ y cánceres mamarios invasivos en hembras control y RANKmam el día 7 (d) y día 22 (e) después del final del tratamiento con DMBA. Los datos se muestran como valores medios por ratón +/-dtm. n=3 ratones por genotipo. Se analizaron las 10 glándulas mamarias de cada ratón. * P < 0,05 (ensayo de la t de Student). Los paneles inferiores muestran secciones histológicas representativas con adenocarcinomas invasivos típicos en las hembras control. Para las hembras RANKmam se muestran, la morfología normal acinar (día 7) y un carcinoma in situ (día 22). Se muestran secciones teñidas con H&E e inmunotinción para el marcador de proliferación Ki67. 20 X aumentos. Figura 3. RANK induce la señalización de NFB, el crecimiento independiente de anclaje, y protege de la apoptosis epitelial inducida por radiación. a, Transferencia de Western de IKK fosforilado (P), IKK total, p65 NFB fosforilado (P), p65 NFB total, IB fosforilado (P) e IB total en células epiteliales de glándula mamaria (CEM) de ratón primarias aisladas en respuesta a estimulación con RANKL (1 g/ml). Se muestra la -actina como un control de carga. b, Transferencia de Western para IKK, IKK, IKK, p65 NFB fosforilada (P), p65 NFB total, IB fosforilado (P) e IB total en adenocarcinomas mamarios en estadio tardío combinados (n=4 para cada carril) que se desarrollaron en hembras control, RANKmam e IKKmam. Se muestra la -actina como un control de carga c, Expresión de ARNm de RANK, CiclinaD1, y p21 en adenocarcinomas mamarios de estadio tardío que se desarrollaron en hembras control, RANKmam e IKKmam. La expresión se determinó por cRT-PCR. Los datos son valores medios +/-dtm. n=4 por grupo. d, Ensayo de Formación de Colonias en Agar Blando. Crecimiento de células humanas de cáncer de mama SKBR3 en agar blando en respuesta a la estimulación con RANKL (1 g/ml) o EGF (100 ng/ml). Después de 18 días en cultivo con RANKL, se formaron colonias macroscópicas independientes del anclaje lo que se impidió con el receptor señuelo de la OPG (1 g/ml). Los controles fueron células SKPR3 no estimuladas. e, Aparición de tumores mamarios palpables en hembras IKKmam (n=10) y de la camada control de la misma edad (n=11) tratadas con gránulos de MPA y DMBA. Los datos se muestran como el porcentaje de ratones libres de tumor después de la última exposición a DMBA. La aparición media de tumores en los controles fue de 10 días después del tratamiento con DMBA y de 24 días para las hembras IKKmam . f,g La radiación  (5 Gray) indujo la apoptosis de las células epiteliales mamarias en camadas de hembras control y RANKmam bien con operación simulada o implantadas con un tapón de MPA. La apoptosis se detectó por inmunotinción para Caspasa 3 activa. f, Los núcleos apoptóticos de las células epiteliales (flechas) se muestran para secciones representativas de glándula mamaria. 40 X aumentos. g, Cuantificación de la apoptosis epitelial mamaria. Se contaron un mínimo de 5000 núcleos para cada ratón. Los resultados mostrados son los valores medios +/-dtm. n=3 ratones por grupo. * P < 0,05; ** P<0,02 (ensayo de la t de Student). Figura 4. RANK controla la autorrenovación de células madre cancerosas y los niveles de RANKL/OPG en suero en pacientes humanos con cáncer de mama. a, Análisis de sRANKL y progesterona en muestras de suero de las mismas cohortes que en e. Aunque no pudo encontrarse asociación entre RANKL y progesterona en suero en el grupo control (p = 0,43) existe una clara asociación entre RANKL y los niveles de progesterona en suero en mujeres que desarrollaron cáncer de mama 12-24 meses después del muestreo de suero. p = 0,047 (ensayo de rango de Spearman). No hubo correlaciones de los niveles de progesterona y RANKL en suero en mujeres que desarrollaron cáncer de mama al cabo de 6-12 meses después de que se ensayara el suero (p = 0,76). Los datos se muestran como una función de la progesterona en suero (bajo <0,2 ng/ml; medio 0,2-0,3 ng/ml; alto >0,3 ng/ml). b, Análisis de relaciones de OPG con respecto a sRANKL en muestras de suero del UKCTOCS recogidas prospectivamente de 182 mujeres postmenopáusicas sanas que no desarrollaron cáncer de mama durante su seguimiento y de 41 mujeres sanas de la misma edad que desarrollaron cáncer de mama positivo para el RE 5-12 meses después de que se recogiera su suero. Los gráficos de cajas muestran relaciones de OPG con respecto a sRANKL significativamente más altas en las mujeres que desarrollaron cáncer de mama dentro del primer año después del muestreo del suero. p = 0,022 (ensayo de la U de Mann Whitney). c, Análisis de las relaciones de OPG con respecto a sRANKL en muestras de suero del UKCTOCS de 182 mujeres postmenopáusicas sanas y de 57 mujeres de la misma edad que desarrollaron cáncer de mama positivo para el RE 12-24 meses después de que se recogiera su suero. No se observaron diferencias significativas. Figura 5. Las hembras RANKfl/ cruzadas con los ratones K5-Cre muestran desarrollo lóbulo-alveolar defectuoso en la gestación. a, Análisis de montaje completo de tejido mamario de hembras nulíparas y lactantes (L1) RANKfl/ cruzadas con K5-Cre en comparación con glándulas mamarias de camadas control. Alveolos en hembras gestantes de tipo silvestre (flechas) de estructuras lóbulo-alveolares, aunque en hembras K5-Cre RANKfl/ este desarrollo se detiene en un botón alveolar rudimentario (flecha). b, Transferencia de Southern de células epiteliales mamarias purificadas derivadas de hembras K5-Cre+ RANKfl/ y RANKfl/ . Se indica el alelo RANK de tipo silvestre o floxeado (fl/+; 9,6 kb) y el alelo RANK delecionado (; 3,9 kb) después de la digestión de ADN genómico con Pvull y Sphl. c, Análisis de montaje completo de glándulas mamarias de hembras BALBc desnudas (nu/nu)

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control que muestran estructuras lóbulo-alveolares normales el día 1 de la lactancia (L1), estructuras lóbulo-alveolares normales el día L1 en ratones nu/nu “depurados” trasplantados con tejido de glándulas mamarias de tipo silvestre y desarrollo lóbulo-alveolar defectuoso en ratones nu/nu L1 “depurados” trasplantados con tejido de glandular mamario de RANKfl/; K5-Cre. Se muestran también los panículos adiposos de ratones nu/nu después de la depuración quirúrgica. Todas a 5 X aumentos. Figura 6. Formación normal de una glándula mamaria lactante en hembras MMTV-Cre, RANKfl/ gestantes. a, Análisis con H&E de tejido mamario de hembras MMTV-Cre nulíparas de la camada control y RANKfl/; que muestran estructuras epiteliales alveolares/ductales normales. 10 X aumentos (superior) y 40 X aumentos (paneles inferiores). b, Análisis de montaje completo de tejido mamario completo de hembras nulíparas y lactantes (L1) RANKfl/ cruzadas con MMTV-Cre en comparación con glándulas mamarias de las camadas control. La deleción de RANK mediada por MMTV-Cre no afectó a la formación de una glándula mamaria lactante. c, Transferencia de Southern de células epiteliales mamarias purificadas derivadas de hembras RANKfl/ y RANKfl/; MMTV-Cre. El alelo de RANK de tipo silvestre o floxeado (fl/+; 9,6 kb) y el alelo de RANK delecionado (; 3,9 kb) se indican después de digestión de ADN genómico con Pvull y Sphl. En lo sucesivo, los animales RANKfl/; MMTV-Cre se indican como RANKmam . Figura 7. MPA induce la expresión de RANKL y la proliferación epitelial en glándulas mamarias. a-c, Cuantificación de la proliferación epitelial en glándulas mamarias de hembras de las camadas control y RANKmam 3 días después de tratamiento simulado e implantación de MPA tal como se muestra en la Fig. 1d. a, Los datos se muestran como cambios relativos en células epiteliales Ki67+ totales en comparación con hembras operadas de manera simulada del genotipo respectivo. Se contaron al menos 1000 células epiteliales de la glándula mamaria por ratón. n = 3 ratones por genotipo. ** P < 0,005; *** P <0,001 (ensayo de la t de Student). b, Cuantificación de células teñidas inmunológicamente in situ con Ki67 por acino de glándulas mamarias de hembras de la camada control y RANKmam 3 días después de la implantación s.c. de MPA. Mientras que en las hembras control  80 % de los acinos mostraron signos de proliferación media a alta, más del 60 % de los acinos en hembras RANKmam mostraron tasas de proliferación muy bajas. c, Para controlar los niveles residuales de proliferación dependientes del estro, se analizaron hembras súperovuladas y operadas de manera simulada de la camada control y de RANKmam. Se contaron al menos 1000 células por glándula mamaria. n = 3 por genotipo. En b, y c, se muestran los datos como porcentaje de acinos/conductos con números bajos (<20 % de las células epiteliales son Ki67+), medios (20-80 % de las células epiteliales son Ki67+) y altos (>80 % de las células epiteliales son Ki67+) de células proliferantes +/-dtm. *** P < 0,001; * P < 0,03 (ensayo de la t de Student). d, Proliferación epitelial en glándulas mamarias de hembras de las camadas control y de RANKmam 1 día después de inyección i. p. de PBS o RANKL (1 g). La proliferación se determinó por inmunotinción in situ de Ki67. 40 X aumentos. e, Cuantificación de la proliferación epitelial 1 día después de la inyección i. p. de PBS o RANKL (1 g). Se muestran los porcentajes medios de células positivas a Ki67 +/-dtm. * P < 0,03; n = 5 (ensayo de la t de Student). Figura 8. Curvas de supervivencia de cánceres mamarios estimulados por progestina en ratones RANKmam . a,b, MPA induce la expresión de RANKL en células epiteliales mamarias. Hembras nulíparas de tipo silvestre se trataron con sonda oral de DMBA o vehículo en aceite, se les implantaron, por vía s.c., gránulos de MPA de liberación lenta, o se trataron con cirugía simulada. a, El ARNm de RANKL se determinó en células epiteliales mamarias purificadas mediante cRT-PCR 3 días después de la implantación/sonda oral. Los datos se muestran como factores de cambio en comparación con tratamiento simulado +/-dtm. n=3 ratones por grupo. b, La expresión de la proteína(s) RANKL soluble (19 kDa) se ensayó en lisados celulares de células epiteliales mamarias purificadas por transferencia de Western 3 días después del tratamiento con vehículo en aceite, DMBA, MPA, o cirugía simulada. Se muestra la -actina como un control de carga. Cabe destacar, que solamente MPA pero no DMBA o el vehículo en aceite por sí solo indujeron la expresión del ARNm y de la proteína de RANKL. c, Aparición de tumores mamarios palpables en hembras RANKmam (n=14) y hembras de la camada control de la misma edad con MMTV-Cre (Cre+ control; n=13) o sin MMTV-Cre (Cre-control; n=9) tratadas con gránulos de MPA y DMBA tal como se indica en la Fig. 2a. Los datos se muestran como porcentaje de ratones libres de tumores después de la última exposición a DMBA. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos control Cre+ y Cre-. La aparición media de los tumores para los controles Cre+ fue de 9 días, para los controles Cre-fue de 11 días, y para las hembras RANKmam 30 días después del último tratamiento con DMBA. d, Transferencia de Southern representativa de tumores mamarios inducidos por MPA/DMBA derivados de hembras RANKfl/+; MMTV-Cre+ y RANKfl/; MMTV-Cre+ (RANKmam). El alelo de RANK de tipo silvestre o floxeado (fl/+; 9,6 kb) y el alelo de RANK delecionado (; 3,9 kb) se indican después de la digestión de ADN genómico con Pvull y Sphl. Todos los tumores derivados de hembras RANKmam mostraron deleción casi completa. e, Análisis de Kaplan Mayer para la supervivencia total de hembras RANKmam (n=9) y de la camada control de la misma edad (n=9) después de tratamiento con MPA/DMBA. La supervivencia media fue de 48 días para el control y de 93 días después del último tratamiento de DMBA para las hembras RANKmam . Figura 9. Desarrollo de adenocarcinomas escamosos en hembras RANKmam . a,b, Secciones histológicas representativas de tumores mamarios aislados de hembras de la camada control y RANKmam 7 (a) y 21 (b) días después del último tratamiento con DMBA. Se muestran tinciones con H&E y Ecadherina que indican las características típicas de los adenocarcinomas ductales en tumores de hembras de las camadas control y RANKmam. La expresión de citoqueratina 14 (K14) demuestra el origen de las células basales

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Reactivos – soluciones de trabajo

Micropartículas recubiertas de M Estreptavidina (tapa transparente), 1 frasco, 6,5 ml: micropartículas recubiertas de estreptavidina, 0,72 mg/ml; conservante.

Ac-anti-progesterona R1 ~ biotina (tapa gris), 1 frasco, 10 ml: anticuerpo (ratón) monoclonal anti-progesterona marcado con biotina 0,15 mg/l, tampón fosfato 25 mmol/l, pH 7,0; conservante.

Péptido de progesterona R2 ~ Ru (bpy)2+ (tapa negra), 1 frasco, 8 ml: progesterona (de origen vegetal) acoplada a un péptido sintético marcado con complejo de rutenio, 10 ng/ml; tampón fosfato 25 mmol/l, pH 7,0; conservante.

Ejemplo 11: Datos estadísticos. Todos los valores del presente documento se dan como medias dtm. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante el ensayo de la t de Student. Para el análisis de Kaplan-Meier de aparición de tumores se realizó un ensayo de rango logarítmico. Un valor de P de 0,05 se aceptó como estadísticamente significativo. Además del ensayo de rango logarítmico se realizó un análisis de fuerza post-hoc (Fuerza PS y Cálculos de Tamaño de Muestra, en la web de biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize) para calcular la probabilidad de rechazar correctamente la hipótesis nula de mismos tiempos de aparición de tumores dado el número de animales experimentales. Para el estudio que implicaba a los animales RANKmam la hipótesis nula se puede rechazar con una probabilidad (fuerza) de 0,933 y para los animales IKKmam con una probabilidad de 0,766. La probabilidad de error de Tipo I asociada con este ensayo de esta hipótesis nula es de 0,05. Los datos de seres humanos se analizaron usando un ensayo de la t de muestras relacionadas, el ensayo de la U de Mann Whitney, o un ensayo de rango de Spearman como se indica.

Ejemplo 12: Ratones con RANKL/RANK alterado:

Para examinar la posible función de RANKL/RANK en la tumorigénesis, RANK se delecionó de las células epiteliales mamarias usando la escisión mediada por K5-Cre y MMTV-Cre de un alelo inducible de RANK (ratones K5-Cre rankflox/ y ratones MMTV-Cre rankflox/). Ambas líneas de ratones parecen estar sanas y muestran estructuras óseas y formación de ganglios linfáticos normales. Como se esperaba, los ratones K5-Cre rankflox/ mostraron un desarrollo aparentemente normal de las glándulas mamarias en la pubertad; sin embargo, estos ratones no desarrollaron estructuras lóbuloalveolares secretoras de leche durante la gestación (Fig. 5a,b). Estos efectos fueron autónomos de células que usan experimentos de trasplantes (Fig. 5c). En los ratones MMTV-Cre ranktr/, el desarrollo de las glándulas mamarias en hembras nulíparas y la formación de estructuras lóbuloalveolares secretoras de leche durante la gestación parecían normales (Fig. 6a-c). Para excluir que cualquier problema de los efectos en el desarrollo de los ratones K5-Cre rankflox/ que pudiera afectar a determinadas poblaciones de células en la fisiología normal, los ratones MMTV-Cre rankflox/ se usaron, por lo tanto, para todos los experimentos adicionales. En lo sucesivo, en el presente documento, estos ratones mutantes MMTV-Cre rankflox/ se denominan n RANKmam .

Ejemplo 13: Mecanismo de activación de RANK después de la administración de progestina:

En una población de tipo silvestre, el tratamiento con MPA (una progestina) desencadena la proliferación masiva de células epiteliales mamarias. La proliferación inducida por MPA de las células epiteliales mamarias se redujo significativamente en las hembras RANKmam (Fig. 1a; Fig. 7a-c). Por consiguiente, las inyecciones i. p. de RANKL en hembras nulíparas desencadenaron la proliferación de células epiteliales de la glándula mamaria por medio de RANK (Fig. 7d,e). Recientemente se ha notificado que la progesterona endógena afecta al número de células madre Lin-CD24+CD49falto durante la gestación15 y el ciclo menstrual16. En ambos estudios, el sistema RANKL/RANK estuvo implicado basándose en estudios de bloqueo de Ac en todo el organismo in vivo y en la expresión de RT-PCR, sin embargo, no se supo si éste es un efecto directo de RANKL-RANK en las células epiteliales mamarias más que un efecto secundario. Por lo tanto, se evaluó si las progestinas, tales como MPA, podían expandir también las células Lin-CD24+CD49falto. El tratamiento con MPA dio como resultado una doble expansión de las células LinCD24+CD49falto. Dicha expansión no se produjo en hembras RANKmam tratadas con MPA (Fig. 1b, c). Estos datos proporcionan la primera demostración genética de que el sistema RANKL/RANK controla la expansión de células Lin-CD24+CD49falto.

Ejemplo 14: Influencia de las progestinas sobre el desarrollo de cáncer mediante RANK/RANKL en ratones control y con déficit de RANK/RANKL:

En la Women´s Health Initiative (WHI) y el Million Women Study, el uso de progestinas se ha relacionado epidemiológicamente con la aparición y frecuencia del cáncer de mama. El cáncer de mama estimulado por progestinas puede modelarse en ratones hembra en los que la implantación de gránulos de MPA de liberación lenta en presencia del agente dimetilbenz[a]antraceno (DMBA), perjudicial para el ADN, desencadena cáncer de mama (Fig. 2a; Fig. 8a,b).

En las hembras control, el tratamiento con MPA/DMBA indujo una aparición rápida de tumores mamarios palpables. Curiosamente, en los ratones hembra RANKmam, se observó un notable retraso en la aparición del cáncer mamario inducido por MPA/DMBA (Fig. 2b; Fig. 8c,d). La aparición tardía de tumores en las hembras RANKmam también dio como resultado una notable mejora de la supervivencia (Fig. 8e). Las transferencias de Southern de los tumores que

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se desarrollaron en hembras RANKmam confirmaron la deleción eficaz de RANK (Fig. 8c). Todos los tumores que se desarrollaron en las hembras control y RANKmam mostraron una histopatología típica de adenocarcinomas ductales que expresan E-Cadherina, del subtipo celular basal positivo a Citoqueratina (CK) 5 y a CK14 (Fig. 2c, Fig. 9a,b). Sin embargo, los adenocarcinomas ductales originados en hembras RANKmam frecuentemente desarrollaban grandes áreas de metaplasia escamosa (Fig. 2c, Fig. 9a,b).

Ejemplo 15: Aparición de cáncer después del daño en el ADN en dependencia de la señal de RANKL mediada por progestinas:

Dado que los animales RANKmam mostraron un retraso en la aparición del cáncer de mama. A continuación se analizó la frecuencia de tumores mamarios en estadios tempranos después de la exposición a DMBA. Para desencadenar la señalización de RANKL/RANK, nuevamente se usó MPA para simular un fondo de progesterona. Una semana después del último tratamiento con DMBA, todas las hembras control que expresaban RANK ya mostraban carcinomas múltiples in situ e incluso tumores mamarios invasivos. Por el contrario, se observaron muy pocos carcinomas in situ y nunca ningún carcinoma mamario invasivo en los animales RANKmam una semana después de la última exposición a DMBA (Fig. 2d). Tres semanas después de la última exposición a DMBA la frecuencia de carcinomas in situ fue similar entre las hembras control y las RANKmam, pero los carcinomas invasivos fueron aún más infrecuentes en las hembras RANKmam (Fig. 2e). Además, la proliferación se redujo típicamente en los tumores de las hembras RANKmam (Fig. 2d,e). La deleción de RANK en otros tejidos múltiples, incluyendo el hígado, corazón, músculo y compartimiento hematopoyético, pero no en las células epiteliales mamarias, usando ratones Mx-Cre rankflox/flox, no retrasó mucho la aparición de cáncer de mama inducido por MPA/DMBA (Fig. 10a-c), lo que sugiere que los efectos de la alteración de RANK/RANKL son dominantes en las células epiteliales mamarias.

Ejemplo 16: Señalización de RANKL:

En la Fig. 11a se ilustra la señalización de RANKL-RANK mediante IKK-NFB-Ciclina D1 en células epiteliales mamarias. De hecho, la estimulación de RANKL, produjo la fosforilación de p65 NFB e IB en células epiteliales primarias de glándula mamaria (CEM) de ratón (Fig. 3a). Además, la estimulación por RANKL de las CEM desencadenó la fosforilación de p38-MAPK y ERK (Fig. 11b). Para mostrar directamente cómo RANK media la activación de NFB-Ciclina D1 aguas abajo de las progestinas in vivo, los ratones se expusieron a MPA. Un tratamiento de tres días con MPA produjo la acumulación nuclear de IB fosforilado, indicativa de una ruta activa de NFB, y de la inducción de la expresión proteica de Ciclina D1 en células epiteliales mamarias, ambas de las cuales se redujeron severamente en hembras RANKmam (Fig. 12a,b). Además, en los adenocarcinomas mamarios inducidos por MPA/DMBA aislados de las hembras control y de las RANKmam se descubrió una activación alterada de la ruta de NFB (Fig. 3b) y una expresión regulada negativamente del ARNm de la Ciclina D1 (Fig. 3c). En estos tumores primarios también se observó regulación positiva del ARNm de p21 (Fig. 3c), un gen que se suprime transcripcionalmente por medio de la ruta de Id217. La ruta de Id2 es una ruta secundaria genéticamente confirmada aguas abajo de RANKL/RANK en células epiteliales mamarias17. Para extender estos hallazgos en seres humanos, se ensayaron células humanas de tumores de mama SKBR3. La estimulación de RANKL indujo la activación y proliferación de NFB, de las p38-MAPK y de ERK en células SKBR3 (Fig. 13a,b). Para ensayar adicionalmente los efectos de la estimulación con RANKL, se evaluó la capacidad de estas células para crecer de una manera independiente del anclaje, que correlaciona bien con la tumorigenicidad in vivo18. Cabe destacar que, de manera similar a la estimulación con EGFR, se observó que RANKL indujo el crecimiento de células SKBR3 en agar blando (Fig. 3d), es decir, que la señalización de RANK no solamente desencadena la proliferación sino que también actúa como un agente transformante para inducir el crecimiento independiente del anclaje.

En osteoclastos, además de la ruta de NFB, se ha descubierto que la ruta de señalización de calcineurina-NFATc1 es esencial para la osteoclastogénesis mediada por RANKL-RANK. NFATc1 también puede regularse por la ruta de Id2 durante la osteoclastogénesis mediada por RANKL. Para evaluar si esta activación de las rutas clave de RANKL-RANK también está operativa en el cáncer de mama inducido por MPA/DMBA, se generaron ratones MMTV-Cre nfatc1flox/ (NFATc1mam) y MMTV-Cre Ikkflox/flox (IKKmam) para delecionar NFATc1 e IKK en células epiteliales mamarias. Ambas cepas mutantes de ratón parecen sanas y no muestran defectos aparentes en ninguno de los órganos evaluados. Cuando se estimularon con MPA/DMBA, los ratones IKKmam mostraron un retraso de la aparición del cáncer de mama (Fig. 3e). En los tumores de los ratones IKKmam se descubrió una expresión normal de IKK e IKK pero una activación reducida de NFB, como determinan los niveles aumentados de la proteína IB y la fosforilación disminuida de p65 NFB (Fig. 3b) y la expresión regulada negativamente del ARNm del gen diana de NFB Ciclina D1 (Fig. 3c), lo que sugiere que IKKen efecto, se requiere para la señalización de NFB en estos tumores. Tal como se esperaba, el gen p21 de la ruta de Id2 no estaba afectado en tumores de ratones IKKmam (Fig. 3c). No se observaron diferencias significativas en la aparición de tumores entre los ratones control y los NFATc1mam (Fig. 13c,d), lo que sugiere que los requerimientos de la señalización aguas abajo son distintos en progenitores de osteoclastos y células epiteliales de glándulas mamarias. Por lo tanto, la deleción de IKK, pero no la de NFATc1, en las células epiteliales de las glándulas mamarias, afecta a la aparición del cáncer de mama.

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Ejemplo 17: Desarrollo de cáncer estimulado por progestinas debido al daño en el ADN:

Para analizar el papel de RANKL en la respuesta celular al daño en el ADN, así como en la detención del ciclo celular y la apoptosis, células epiteliales mamarias (CEM) primarias de ratón y la línea de células humanas de cáncer de mama sensible a RANKL, SKBR3, se trataron con el agente inductor de daño en el ADN, doxorrubicina, o radiación . El tratamiento con RANKL no alteró la inducción de H2AX y p53 o la activación de Chk1, marcadores prototípicos de una respuesta funcional al daño en el ADN (Fig. 14a). Además, RANKL no alteró la detención temprana del ciclo celular después del año en el ADN con la radiación  (Fig. 14b,c) o con doxorrubicina (Fig. 15a,b). Sorprendentemente, el tratamiento con RANKL produjo una notable protección de la muerte celular en respuesta al daño en el ADN inducido por radiación  (Fig. 14d,c) y doxorrubicina (Fig. 15a,b). Mecánicamente, la regulación positiva inducida por la radiación  de las moléculas proapoptóticas Bim, Puma y Noxa no ocurrió en presencia de RANKL (Fig. 15c). Se ha mostrado in vivo que la radiación  de hembras de ratón produce una inducción quíntuple de la apoptosis de las células epiteliales mamarias19. Por lo tanto, este sistema previamente establecido se usó para evaluar los efectos del eje progesterona-RANKL/RANK sobre la muerte celular inducida por radiación . De hecho, RANKL/RANK inducido por MPA (una progestina) protegió de la apoptosis inducida por radiación  en las células epiteliales mamarias in vivo. La pérdida de la expresión de RANK en las células epiteliales mamarias anuló los efectos protectores del MPA sobre la muerte celular inducida por radiación  (Fig. 3f,g). Además, la ruta de IKK estaba implicaba en la protección inducida por MPA del epitelio mamario después de la radiación  (Fig. 16a,b). Por lo tanto, además de promover la progresión del ciclo celular, el MPA puede proteger de la muerte celular después del daño en el ADN mediante la señalización de RANKL/RANK e IKK.

Ejemplo 18: RANKL como marcador diagnóstico en pacientes con cáncer de mama:

Los datos presentados en este documento muestran que las progestinas pueden inducir RANKL/RANK que después estimula el cáncer mamario. Para confirmar estos estudios en pacientes humanos con cáncer de mama se analizaron los niveles de RANKL y progesterona en suero en mujeres que participaron en el estudio prospectivo UKCTOCS (Ensayo Cooperativo de la Cribado en el Cáncer de Ovario del RU) (Ejemplo 9). Esta cohorte proporcionó una oportunidad única para estudiar cambios en los niveles en suero de RANKL soluble, progesterona y OPG antes de la manifestación del cáncer de mama. De manera asombrosa, mientras que en las mujeres control no hubo correlación entre los niveles de progesterona y RANKL en suero, hubo una asociación estadísticamente significativa en mujeres que desarrollaron cáncer de mama 12-24 meses después de la recogida del suero (p = 0,047, ensayo de rangos de Spearman) (Fig. 4a). De hecho, entre mujeres dentro de los grupos de progesterona alta, el RANKL en suero es significativamente más elevado en el grupo que va a desarrollar cáncer de mama (p=0,01, ensayo de la suma de rangos de Wilcoxon de una vía) (Fig. 4a). Por lo tanto, para predecir la aparición futura del cáncer de mama, pueden usarse los altos niveles de RANKL en suero y la progesterona alta en suero.

La correlación en mujeres que desarrollaron cáncer de mama después de 5-12 meses tras el muestreo del suero, fue distinta. En cambio, este grupo mostró alteraciones significativas en los niveles de sRANKL y OPG en suero, que se asociaron con la probabilidad futura de desarrollar cáncer de mama (Fig. 4b; Fig. 17a). No se encontró ninguna de dichas alteraciones con OPG en las participantes del UKCTOCS que nunca desarrollaron cáncer de mama o que desarrollaron cáncer de mama entre 12-24 meses después del muestreo del suero (Fig. 4c; Fig. 17b).

Estas alteraciones de RANKL/OPG en suero parecen ser incomprensibles. Sin embargo, este hallazgo está en la línea de los datos anteriores. Por ejemplo, se ha notificado que los niveles de ARNm de RANKL en los huesos afectados de pacientes con osteoartritis se correlacionan positivamente con la destrucción ósea pero se correlacionan de modo inverso con los niveles de RANKL en suero11. Además, un fenómeno similar se mostró para los niveles de RANKL en suero y la osteoporosis: bajos niveles de RANKL en suero están asociados con un riesgo 10 veces mayor de fracturas no traumáticas en mujeres postmenopaúsicas20. Además, la OPG aumentada está asociada con pérdida ósea aumentada en mujeres postmenopáusicas que no están sometidas a terapia de reemplazo hormonal21. Los mecanismos de estos cambios en suero en cáncer de mama pueden reflejar mecanismos compensatorios contra el desarrollo de microtumores y/o redistribución/secuestro de RANKL/OPG en distintos compartimentos corporales. Para impedir la integración errónea de datos en un diagnóstico o pronóstico se prefiere comparar los datos de la muestra con controles positivos (pacientes y/o aquellos que no desarrollaron cáncer) o negativos (pacientes que no desarrollaron cáncer).

Ejemplo 19: Análisis:

Basándose en estos resultados, es evidente el siguiente escenario molecular de cómo las progestinas, tales como el MPA, estimulan el cáncer mamario: la progesterona y las progestinas (y posiblemente la desregulación del sistema endógeno de progesterona tal como en la pre-menopausia) desencadenan una inducción de RANKL, primero en la glándula mamaria. RANKL por medio de RANK en las células epiteliales mamarias estimula a estas células en el ciclo celular y, notablemente, protege a las células epiteliales de la glándula mamaria de ratones así como de seres humanos de la apoptosis en respuesta al daño en el ADN incluyendo la radiación . Además, RANKL-/RANK controla la autorrenovación de las células madre de cáncer mamario y el crecimiento independiente de anclaje. Por lo tanto, RANKL/RANK inducido por progestina proporciona una ventaja de crecimiento y supervivencia al epitelio mamario dañado, un requisito previo para iniciar el cáncer mamario22. Estos efectos están, al menos en parte,

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mediados a través de la ruta de señalización de IKK-NFB.

Estos datos tienen algunas implicaciones interesantes. Por ejemplo, las progestinas se han asociado con un riesgo aumentado de tener una mamografía anómala23. Puesto que las mamografías detectan microcalcificaciones, así como la densidad glandular y RANKL/RANK tiene papeles clave en el metabolismo/mineralización del hueso12,13, debería suponerse que RANKL/RANK contribuye a la calcificación de dichas lesiones y/o densidades glandulares. Esto es interesante porque las proporciones RANKL/OPG alteradas en el suero de las mujeres antes y después (512 meses) de que se descubriera la aparición de las manifestaciones de cáncer de mama, demuestra que los niveles de RANKL/OPG en suero son biomarcadores útiles para la detección del cáncer. Los datos del presente documento también muestran que los niveles aumentados de RANKL y progesterona en suero pueden predecir un futuro cáncer de mama 12-24 meses antes de que los tumores se diagnostiquen. Millones de mujeres toman derivados de progesterona en anticonceptivos y para la terapia de reemplazo hormonal. Dichas hormonas se han asociado epidemiológicamente a un riesgo aumentado de desarrollar cáncer de mama.

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Claims

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