KR20130101062A - 유방암 진단법 - Google Patents

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조셉 페닝거
다니엘 슈라멕
조지 쉐트
마틴 위츠웬터
이안 제이. 제이콥스
우샤 메논
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아이엠비에이 - 인스티튜트 퓌어 몰레쿨라레 바이오테크놀로지 게엠베하
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Abstract

본 발명은 암을 검출하거나 암이 발생할 환자를 예측하거나 암으로부터 고통받는 환자에서 암의 진행률을 결정하는 방법 및 수단에 관한 것이며, 상기 환자의 시료 내에 RANKL 활성 및/또는 OPG의 양을 측정하는 것을 포함한다.

Description

유방암 진단법{BREAST CANCER DIAGNOSTICS}
본 발명은 유방암 진단법 분야에 관한 것이다.
유방암은 인간에서 가장 흔한 암 중 하나이며 미국 및 유럽에서 평균 8명 중 1명에 이르는 여성이 그의 일생을 통해 영향을 받을 것이다. 여성 건강 발의(Women's Health Initiative, WHI) 및 백만 여성 연구(Million Women Study)에 따르면 호르몬 대체 요법(HRT)이 우발적이고 치명적인 유방암의 증가된 위험과 관련이 있는 것으로 나타났다. 특히 HRT 및 피임법을 위해 수백만의 여성이 사용한 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA)와 같은 합성 프로게스테론 유도체(프로게스틴)는 유방암 발생의 위험을 현저하게 증가시킨다.
NF-κB 리간드의 수용체 활성제(RANKL, 또한 ODF, TRANCE, OPGL, TNFSF11로도 알려짐) 및 그의 수용체 RANK(TRANCE-R, TNFRSF11A)는 파골세포의 발달과 활성화에 필수적이다. RANKL 억제는 잠재적으로 수백만의 환자들에서 골 손실을 예방하는 것으로 입증되었다. RANK 및 RANKL은 클로닝되고 특성이 분석되었다(US 6,017,729, EP 0 873 998, EP 0 911 342, US 5,843,678, WO 98/46751, WO 98/54201). RANKL과 RANK 발현 모두 인간의 원발성 유방암 및 유방암 세포주에서 관찰되었으며 RANKL/RANK 시스템이 증식 또는 사멸 감수성에 영향을 주지 않으면서 상피성 종양의 골 전이를 조절할 수 있음이 제안되었다14.
문헌[Terpos et al., Blood 102 (3) (2003): 1064-1069]은 골 병변을 야기하며 골수에서 혈액 세포의 생성을 저해하는 암인 다발성 골수종 발생의 예후에 대한 마커를 기술한다.
문헌[Hashimoto et al., Cancer & Chemotherapy 7 (31) (2004): 1027-1033 (abstract)]은 파골세포 및 조골세포 활성을 반영하는 가용성 RANKL 및 OPG를 포함하는 골 물질대사 마커가 골 질환 및 예후의 중증도에 대한 정보를 제공함을 언급한다.
WO 2005/060627 A2는 RANKL의 수준을 측정함으로써 비-외상성 골 골절의 위험을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법을 사용하기 위한 수단은 예컨대 RANK 또는 RANKL에 대한 항체이다.
WO 00/43553 A1은 에스트로겐-관련 마커의 수준을 측정함으로써 유방암을 가진 여성을 스크리닝하는 방법을 개시한다. 이 방법에서 측정된 마커는 유방관 유액으로부터 수득한, 아로마타제 효소, 아로마타제 활성, 에스트로겐 합성의 부생성물 및 에스트로겐 합성의 상류에 작용하는 단백질 작용기이다.
문헌[Beleut et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107 (7) (2010): 2989-2994]은 유선 증식을 유도하는 기전에 대한 연구를 제공한다. 주로, 프로게스테론이 유선 상피세포의 증식을 유도한다.
문헌[Leibbrandt et al., European. Journal. of Clincal.Investigation., 39 (10) (2009): 842-850]은 조골세포 및 파골세포에 대한 RANK, RANKL 및 OPG의 기능에 대한 검토 문헌이다.
문헌[Reid et al., Molecular Cancer 8 (49) (2009): 1-10]은 상피세포에 의한 OPG 생성의 자극을 개시한다.
문헌[Bo-Ying et al., Annals of Surgical Oncology 17 (6) (2010): 1675-1681]은 전립선암에서 증가된 골 전이와 관련된 TNFRSF11B 유전자에서 특정한 다형성의 식별을 기술한다.
본 명세서의 목적은 암을 식별하기 위한 진단 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
본 발명은 암에서 RANKL의 특이적 역할, 암과 암 발생을 진단 및 예측하기 위한 이의 사용에 관한 것이다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 암을 검출하거나 암이 발생할 환자를 예측하거나 암으로 고통받는 환자에서 암의 진행률을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 환자의 시료 내에 RANKL 활성 및/또는 OPC 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, RANK/RANKL 경로는 암 발생과 관련되며 암을 검출하고 암의 발병(onset)을 예측하기 위해 사용될 수 있음이 밝혀졌다. RANKL이 DNA 손상에 의해 유도된 이러한 돌연변이 후 세포 사멸을 예방하기 때문에, 발암성(cancerogenous) 돌연변이로부터 세포를 보호하는데 관여하는 것으로 밝혀졌다. 형질전환시키는 돌연변이에도 불구한 세포의 생존은 암 세포의 하나의 핵심 성질이다. 이 활성에서 새로 밝혀진 RANKL의 역할은 RANKL 활성 및/또는 OPG 농도와 암 발생의 연관성을 보여준다. 따라서, 암을 앓고 있거나 암이 발생할 환자의 가능성이 추정될 수 있다. 본 발명은 또한 개체의 시료 내에 RANKL 활성 또는 OPG 농도를 측정함으로써 개체에서 암 세포가 발생할 위험을 확인 또는 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 "예측하는"은 절대적인 개념으로, 즉 100% 확신을 가지고 환자에게서 명백하게 암이 발생할 것임이 예상될 수 있다는 의미로 이해되어서는 안되며, 본 발명은 암 발생에 대한 환자의 위험을 추정하는 것에 관한 것이다. 유사하게, "유방암을 검출하는"은 또한 모든 암 환자가 RANKL 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다는 것이 아니라, 환자가 암을 앓을 확률이 높을 수 있다는 것을 청구하는 것이다. 그러므로, RANKL 활성을 측정하는 것은, 가능하게는 더 침습성의 시험이 수반되는, 암을 식별하기 위한 최초의 실마리일 수 있다.
본 발명은 RANKL 활성 뿐만 아니라 이의 천연 리간드 OPG의 농도가 암 발생 및 발달과 서로 관련될 수 있고, 따라서 바람직한 구현예에서는 이러한 상관관계가 본 발명의 방법에 따라 포함될 수 있다는 결과를 기초로 한다. 예를 들어, (예컨대 암이 발생하지 않거나 발생하지 않았던 환자의)음성 대조군의 데이터 및/또는 (암이 발생하였던 환자의) 양성 대조군 데이터의 상관관계를 보여주고 이러한 음성 또는 양성 대조군 데이터를 환자의 시료로부터의 RANKL 활성과 비교하는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 진단능을 개선하기 위하여, 예컨대, 최소 또는 최대의 특정 간격, 예컨대, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 또는 그 이상의 간격으로 상이한 시점에서 RANKL 활성을 모니터링하는 것, 즉 환자의 시료 내에서 RANKL 활성을 측정하는 것이 가능하다. 2개 이상의 시점에서 RANKL 활성의 변화는 암 발생을 나타낼 수 있다. 특정한 구현예에서, 월경 주기 중 동일한 시점에서 RANKL 값을 모니터링하는 것이 바람직한데, 이는 RANKL 활성이 여성 성 호르몬에 영향을 받을 수 있기 때문이다. 예를 들면, 시료의 RANKL 활성은 배란 후 일정 기간 동안에 측정하는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예예서 암은 성장을 위해 호르몬에 의존적인 암이다. 이러한 호르몬은 프로게스테론 또는 에스트로겐과 같은 여성 성 호르몬과 같이 성 호르몬일 수 있다. 암 세포는 호르몬 수용체, 특히 프로게스테론 수용체 또는 에스트로겐 수용체를 가질 수 있다. 에스트로겐 수용체의 예는 ESR1(ER 알파 쇄를 포함함), ESR2(ER-베타 쇄를 포함함) 또는 혼합된 ER-알파 및 ER-베타 쇄의 것과 같은 헤테로머(hteromeric) 수용체를 포함한다. 이러한 수용체의 존재는 세포에서 호르몬 시그널링의 필요성을 나타낼 수 있다. 특히, 이 시그널링은 RANKL-매개된 것일 수 있다. 호르몬에 의한 RANKL의 활성화는 DNA 손상 유도된 세포 사멸로부터 암 세포 또는 전-암성(pre-cancerous) 세포를 보호한다. 따라서 이들 호르몬은 증가된 RANKL 활성을 통해 암을 지지할 수 있으므로, 본 발명에 따른 암을 진단 또는 예측하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 진단된 암의 바람직한 유형은 발달 동안에 성 호르몬 의존성인 암, 특히 유방암 또는 전립선암이다. 암의 추가적인 유형은 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 비-호지킨 림프종; B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종; T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종; 말초성 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종; NK 세포 종양; 거대 과립 림프구성 백혈병; 랑게르한스 세포 세포조직구 증식증; 골수성 종양형성증; 급성 골수성 백혈병; 급성 전 골수구성 백혈병; 급성 골수단구성 백혈병; 급성 단구성 백혈병; 골수이형성 증후군; 및 만성 골수이식성 장애를 포함한다. 특히 바람직한 암은 폐암, 유방암, 유선암(mammary cancer), 흑색종, 육종, 전립선암, 두경부암, 원발기원 불명 암(cancer of unknown primary origin), 림프종, 백혈병, 신장암, 및 위장암을 포함한다.
본 발명에 따르면 암은 원발성암일 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이 임상적 암 징후 이전 최대 2년까지의 암성 발생이 진단될 수 있으며 이에 따라 암은 RANKL 활성을 측정함으로써 예측될 수 있다. 따라서 원발성암은 진단되거나 예측될 수 있다. 추가로, 재발하는 암의 발생을 진단하거나 예측하는 것이 또한 가능하다.
본 발명에 따르면, RANKL 수준은 암 발생 이전 최대 2년까지 음성 대조군과 확연하게 상이함이 밝혀졌다. 예를 들면, 혈청 내 RANKL 수준은 임상적으로 명백한(menifest) 암의 발병 12 내지 24개월 전에 현저하게 증가하며, 이는 예컨대 통상적 생검에 의해 진단될 수 있음이 밝혀졌다. 놀랍게도, RANKL 혈청 수준은 명백한 암의 5 내지 12개월 이전에 감소한다. 특정 기간에 암이 발생하였던 환자의 이전에 취해진 시료의 양성 대조군 데이터와 비교함으로써 시료의 데이터의 상관관계를 보여주고 차후의 암 발생 및 암의 임상 증상이 생검에 의해서와 같은 통상적 수단에 의해 검출될 수 있기까지의 시간을 예측하는 것이 가능하다.
도 :
도 1. 프로게스테론 유도체 MPA는 RANK를 통한 생체 내(in vivo) RANKL 유전자 발현 및 유선 상피세포의 증식을 촉발한다.
a, 모의 처리와 MPA 이식 후 3일 된 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam 암컷의 유선에서 상피의 증식. Ki67의 인 시츄(in situ) 면역염색에 의해 증식을 결정하였다. b,c, RANK△ mam 유선이 아닌, 대조군의 MPA-처리된 유선에서 줄기세포가 풍부한 CD24+CD49high 집단(MaSC)의 현저한 증가. b, MPA- 또는 모의 처리된 8주령 처녀 암컷으로부터의 유선 MaSCs의 혈통 음성(CD31-(상피세포) CD45-(조혈모세포) TER199-(적혈구 세포))의 CD24와 CD49 발현을 보여주는 대표적인 FACS 프로파일. c, MPA- 또는 모의 처리 처녀 암컷 RANK△ mam와 대조군 한 배 새끼의 유선으로부터의 MaSC가 풍부한 CD24+CD49high 집단의 정량. 모든 MaSCs 실험에 대하여 생쥐를 3일 동안 MPA로 처리하였다. 그룹당 n=4 +/-sem. *P< 0.05; *** P<0.001 (스튜던트의 t-검정(Student's t-test)).
도 2. RANK는 프로게스틴(progestin)-유도 유선암(mammary cancer)의 발생율 및 발병을 조절한다.
a, MPA/DMBA 발암 계도(scheme). 무산부 6주령 암컷 생쥐의 피하조직 내에 MPA 펠렛을 이식하고, 표시된 대로 8주 동안 DMBA를 경구적으로 처리하였다. b, 도 2a에 표시된 대로 MMTV-Cre rankfloxed /△(RANK△ mam) 암컷 (n=14) 및 MPA 펠렛과 DMBA로 처리된, 연령-맞춤 한 배 새끼의 대조군 암컷(n=19)에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후에 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타낸다. 종양 발병의 중간값은 대조군의 경우 마지막 DMBA 처리 후 11일이고, RANK△ mam 암컷의 경우 DMBA 처리 후 30일이었다. c, 마지막 DMBA 처리 후 22일째의 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam 암컷으로부터 분리한 유선 종양의 대표적인 조직학적 절편. 사이토케라틴(Cytokeratin)5 염색을 보여준다. 배율 X20. d, e, 마지막 DMBA 처리 후 7일째(d) 및 22일째(e)에 대조군과 RANK△ mam 암컷에서 상피 내 암종 및 침습성 유선암의 개수. 결과는 생쥐 당 평균값 +/- sem으로 나타내었다. 유전자형 당 생쥐 n=3. 각각의 생쥐에 대하여 모든 10개의 유선을 분석하였다. *P<0.05 (스튜던트의 t-검정). 하부 패널은 대조군 암컷에서 전형적인 침습성 선암이 있는 대표적인 조직학적 절편을 보여준다. RANK△ mam 암컷의 경우, 정상적인 선포 형태(7일째)와 상피 내 암종(22일째)이 나타났다. H&E 염색된 절편과 증식 마커인 Ki67의 면역염색을 보여준다. 배율 X20.
도 3. RANK는 NFκB 시그널링 및 부착-비의존적 성장을 유도하고, 방사선-유도 상피성 아폽토시스로부터 보호한다. a, RANKL 자극(1 ㎍/㎖)에 대하여 분리된 일차 생쥐 유선 상피세포(MECs)에서 인산화된(P) IKKα, 전체 IKKα, 인산화된(P) p65 NFκB, 전체 p65 NFκB, 인산화된(P) IκBα, 및 전체 IκBα에 대한 웨스턴 블럿팅. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. b, 대조군, RANK△ mam, IKKα△ mam 암컷에서 발달된 유선의 선암종 말기 단계의 풀(pool)에서 IKKα, IKKβ, IKKγ, 인산화된(P) p65 NFκB, 전체 p65 NFκB, 인산화된(P) IκBα 및 전체 IκBα에 대한 웨스턴 블럿팅(각각의 레인에 대해 n=4). β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. c, 대조군, RANK△ mam, IKKα△ mam 암컷에서 발달한 말기 유선 선암종에서 RANK, 사이클린D1, 및 p21 mRNA의 발현. 발현은 qRT-PCR로 결정하였다. 결과는 평균값 +/- sem이다. 그룹당 n=4. d, 반고형-한천(agar) 콜로니 형성 분석. RANKL (1㎍/㎖) 또는 EGF (100ng/ml)의 자극에 대하여 반고형-한천에서 인간 SKBR3 유방암 세포의 성장. RANKL의 배양에서, 부착-의존적인, 육안으로 보이는 콜로니가 18일 후에 형성되며, 이는 유인 수용체(decoy receptor)인 OPG (1㎍/㎖)에 의해 저해되었다. 대조군은 비자극된 SKBR3 세포였다. e, MPA 펠렛 및 DMBA로 처리한 IKKα△ mam (n=10) 및 연령 -맞춤 한 배 새끼 대조군(n=11) 암컷에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. 대조군에 대한 종양 발현의 중간값은 마지막 DMBA 처리 후 10일이었으며, IKKα △ mam 암컷에 대해서는 24일이었다. f, g, 모의 수술을 하거나 MPA 펠렛을 이식한 대조군과 RANK △ mam 암컷 한 배 새끼에서 γ-방사선조사(5 Gray)는 유선 상피세포의 아폽토시스를 유도했다. 아폽토시스를 활성 케스파제-3(caspase-3)에 대한 면역염색에 의해 검출하였다. f, 대표적인 유선 절편에 대하여 상피세포의 아폽토시스 핵들(화살표들)이 나타났다. 배율 X40. g, 유선 상피세포 아폽토시스의 정량. 각각의 생쥐에 대하여 최소한 5000개의 핵을 계수하였다. 보여준 결과는 평균값 +/- sem이다. n = 그룹 당 3마리. *P<0.05; **P<0.02 (스튜던트의 t-검정)
도 4. RANK는 인간 유방암 세포 환자에게서 암 줄기세포의 자가재생과 RANKL/OPG의 혈청 수준을 조절한다.
a, e에서와 같이 동일한 코흐트로부터의 혈청 시료에서 sRANKL과 프로게스테론의 분석. 대조군에서 혈청 프로게스테론과 RANKL 사이의 연관성을 찾을 수 없었지만(p=0.43), 혈청 시료 채취 후 12-24개월에 유방암이 발병한 여성에게서는 sRANKL과 혈청 프로게스테론 수준 사이에 분명한 연관성이 존재하였다. p=0.047(스피어만 순위검정(Spearman rank test)). 혈청을 시험한 후 6-12개월 내에 유방암이 발병한 여성에서는 혈청 프로게스테론과 RANKL 수준의 상관관계가 없었다(p = 0.76). 결과는 혈청 프로게스테론의 함수로서 보여준다(낮음 <0.2 ng/ml; 중간 0.2-0.3ng/mL; 높음 >0.3 ng/mL). b, 추적검사 동안에 유방암이 발병하지 않았던 182명의 건강한 폐경 여성 및 혈청 수집 후 5-12개월에 ER 양성 유방암이 발병한 41명의 건강한 연령-맞춤 여성으로부터 전향적으로 수집한 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사) 혈청 시료의 sRANKL에 대한 OPG(OPG-to-sRANKL) 비율의 분석. 상자 도표는 혈청 시료를 모은 후 1년 내에 유방암이 발병한 여성에게서 유의미하게 더 높은 sRANKL에 대한 OPG 비율을 보여준다. p = 0.022 (만 휘트니 U 검증(Mann Whitney U test)). c, 182명의 건강한 폐경 여성 및 혈청 수집 후 12-24개월에 ER 양성 유방암을 발병한 57명의 건강한 연령-맞춤 여성으로부터 수집한 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사) 혈청 시료의 sRANKL에 대한 OPG 비율의 분석.
도 5. K5-Cre 생쥐와 이종교배한 RANKfl /△ 암컷은 임신 중에 결손 소엽-꽈리(defective lobulo-alveolar) 발생을 나타낸다.
a, 대조군 한 배 새끼의 유선과 비교하여 K5-Cre와 이종교배된 무산부 및 수유(L1) RANKfl /△ 암컷의 유선 조직의 전조직 표본(Whole-mount) 분석. 소엽-꽈리 구조로부터 임신 중인 야생형 암컷에서의 꽈리(화살표), 반면에 이러한 발생은 K5-Cre RANKfl /△ 암컷의 경우 흔적 꽈리 싹(화살표)에서 정지한다. b, RANKflox /△와 RANKflox/△; K5-Cre+ 암컷으로부터 유래한 정제된 유선 상피세포의 서던 블럿. 게놈 DNA를 PvuII, SphI으로 분해 후, 야생형 또는 삽입된(floxed) RANK 대립유전자(fl/+; 9.6 kb)와 제거된 RANK 대립유전자(fl/+; 3.9 kb)를 표시한다. c, 수유 1일째(L1)에 정상적인 소엽-꽈리 구조를 보여주는 대조군 BALBc 누드(nu / nu) 암컷 유래 유선의 전조직 표본 분석으로, 야생형 유선 조직을 이식한 "소거된(cleared)" nu/nu 생쥐의 L1에서의 정상적인 소엽-꽈리 구조, 및 RANKfl /△; K5-Cre 유선 조직을 이식한 "소거된" nu / nu 생쥐의 L1에서의 결손 소엽-꽈리 발생. 수술적으로 소거 후 nu/nu 생쥐의 지방 패드를 또한 보여준다. 모든 배율 X5.
도 6. 임신 중인 MMTV-Cre, RANKfl /△ 암컷에서 수유 유선의 정상적인 형성.
a, 정상적인 꽈리/도관 상피 구조를 보여주는 무산부 한 배 새끼 대조군과 RANKfl/△; MMTV-Cre 암컷의 유선 조직의 H&E 분석. 배율 X10(상부)와 X40(하부 패널). b, 대조군 한 배 새끼의 유선과 비교하여 MMTV-Cre와 이종교배한 무산부 및 유선(L1) RANKfl /△ 암컷 유선 조직의 전조직 표본 분석. RANKL의 MMTV-Cre 매개 제거는 수유 유선의 형성에 영향을 미치지 않았다. c, RANKflox /△와 RANKflox /△; MMTV-Cre 암컷으로부터 유래한 정제된 유선 상피세포의 서던 블럿. PvuII와 SphI로 게놈 DNA를 분해한 후에, 야생형 또는 삽입된(floxed) RANK 대립유전자(fl/+; 9.6 kb)와 제거된 RANK 대립유전자(△; 3.9 kb)가 표시된다. RANKflox /△; MMTV-Cre 동물은 이후에 RANK△ mam으로 나타낸다.
도 7. MPA는 유선에서 RANKL 발현과 상피 증식을 유도한다.
a-c, 도 1d에서 보는 것처럼 모의 처리와 MPA 이식 후 3일째에 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam 암컷의 유선에서 상피 증식의 정량. a, 결과는 각각의 유전자형의 모의 수술한 암컷과 비교하여 전체 Ki67+ 상피세포에서 상대적인 변화로 나타낸다. 생쥐 당 적어도 1000개의 유선 상피세포를 계수하였다. n = 유전자형 당 생쥐 3마리 ** P < 0.005; *** P < 0.001 (스튜던트의 t-검정). b, MPA 피하 이식 후 3일째에 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam 암컷의 유선으로부터 유래한 선포(acinus) 당 Ki67 인시츄(in situ) 면역염색한 세포의 정량. 대조군 암컷에서 ~80%의 선포가 중등도 내지 고등도의 증식 징후를 보인 반면, RANK△ mam 암컷에는 60% 이상의 선포가 매우 낮은 증식률을 나타냈다. c, 발정-의존적 배경 증식 수준을 조절하기 위해서, 과배란된 모의 수술한 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam 암컷을 분석하였다. 유선 당 적어도 1000개의 세포를 계수하였다. n=유전자형 당 3. b와 c에서, 결과는 낮은(상피세포의 <20%가 Ki67+임), 중간(상피세포의 20-80%가 Ki67+임), 및 높은(상피세포의 >80%가 Ki67+임) 증식 세포의 개수(+/- sem)를 갖는 선포/도관의 비율로 나타내었다. *** P < 0.001; * P < 0.03 (스튜던트의 t-검정). d, PBS 또는 RANKL (1 ㎍)의 복강 내 주사 후 1일째에 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam암컷의 유선에서의 상피 증식. 증식은 Ki67 인시츄(in situ) 면역염색에 의해 결정하였다. 배율 X40. e, PBS 또는 RANKL (1 ㎍)의 복강 내 주사 후 1일째에 상피 증식의 정량. Ki67 양성 세포의 평균 비율(+/- sem)을 보여준다. * P < 0.03; n=5 (스튜던트의 t-검정).
도 8. RANK△ mam 생쥐에서 프로게스틴-유도된 유선암의 생존 곡선
a,b, MPA는 유선 상피세포에서 RANKL 발현을 유도한다. 무산부 야생형 암컷을 DMBA 또는 오일 담체의 경구-위관투여(oral-gavage)로 처리하거나, 서방성 MBA 펠렛을 피하조직에 이식하거나, 모의 수술로 처리하였다. a, RANKL mRNA를 이식/경구 위관투여 후 3일째에 qRT-PCR에 의해 정제된 유선 상피세포에서 측정하였다. 결과를 모의 처리(+/- sem)와 비교하여 배수 변화로 나타내었다. n=그룹당 3. b, 오일 담체, DMBA, MPA 처리 또는 모의 수술 후 3일째에 정제된 유선 상피세포로부터의 세포 파쇄액에 대하여 웨스턴 블럿에 의해 가용성(s) RANKL 단백질(19 kDa)의 발현을 분석하였다. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다. 흥미롭게도, DMBA 또는 오일 담체 단독이 아닌 MPA만이 RANKL mRNA와 단백질 발현을 유도하였다. c, 도 2a에 표시된 대로 MPA 펠렛과 DMBA로 처리된, RANK△ mam(n=14)과 MMTV-Cre 함유(Cre+ 대조군; n=13) 또는 MMTV-Cre 비함유(Cre- 대조군; n=9) 연령-맞춤 한 배 새끼의 대조군 암컷에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. Cre+과 Cre- 대조군 사이에는 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 마지막 DMBA 처리 후 Cre+ 대조군의 경우 종양 발현의 중간값은 9일, Cre- 대조군의 경우는 11일, RANK△ mam 암컷의 경우는 30일이었다. d, RANKflox/+; MMTV-Cre+ 양성과 RANKflox /△; MMTV-Cre+ (RANK△ mam) 암컷에서 유래한 MPA/DMBA-유도 유선 종양의 대표적인 서던 블럿. PvuII와 SphI으로 게놈 DNA를 분해한 후, 야생형 또는 삽입된(floxed) RANK 대립유전자 (fl/+; 9.6 kb)와 제거된 RANK 대립유전자(△; 3.9kb)를 표시한다. RANK△ mam 암컷으로부터 유래된 모든 종양은 거의 완전히 제거되었다. e, MPA/DMBA 처리 후 RANK△ mam(n=9)과 연령-맞춤 한 배 새끼의 대조군 암컷(n=9)의 전체적인 생존에 대한 케플랜 마이어 분석(Kaplan Mayer analysis). 마지막 DMBA 처리 후 대조군에 대한 생존의 중간값은 48일이며, RANK △ mam 암컷에 대해서는 93일이었다.
도 9. RANK△ mam 암컷에서 편평 선암종의 발생.
a,b, 마지막 DMBA 처리 후 7일(a)과 21일(b)째에 대조군 한 배 새끼와 RANK△mam 암컷으로부터 분리한 유선 종양의 대표적인 조직학적 절편. 대조군 한 배 새끼와 RANK△ mam 암컷으로부터의 종양에서 도관 선암종의 전형적인 특징을 나타내는 H&E 염색과 E-캐드헤린(E-Cadherin) 염색을 나타내었다. 사이토케라틴14(K14) 발현은 대조군과 RANK△ mam 암컷 모두에서 기저 세포 기원을 증명한다. 그러나, RANK△ mam 암컷은 편평상피화생(squamous metaplasia)의 성질을 보이는 경향이 있다. 모든 배율 X20.
도 10. Mx-Cre RANKfloxed /△와 NeuT RANK△ mam 생쥐에서 유선암의 발병
a, 도 2a에 표시된 대로 MPA 펠렛과 DMBA로 처리한 Mx-Cre rank floxed / △ (n=4)와 연령-맞춤 Mx-Cre rank +/ △ 한 배 새끼(n = 6)에서 촉진가능한 유선 종양의 발병. Mx-유도된 Cre 재조합효소는 8일간의 과정에 걸친 4회의 폴리 I:C 복강주사에 의해 활성화하였다(200ml PBS 안에 200㎍). 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. 유의미한 차이가 발견되지 않았다. b, Mx-Cre rank floxed/ △ 생쥐에서 제거되지 않은 RANKfloxed /△ 대립유전자(fl/+) 및 제거(△) 유도 후의 서던 블럿. c, Mx-Cre rank floxed /△ 생쥐에서 제거(△)의 유도 후 다양한 기관의 서던 블럿. 다양한 수준의 제거(50-100%)가 흉선, 심장, 간, 및 비장에서 나타난 반면, RANKfloxed /△ 대립유전자의 제거는 정제된 유선 상피세포(MECs)에서는 유도되지 않았다.
도 11. MECs에서 RANKL/RANK 하류 시그널링
a, 임신 동안 수유 유선의 RANKL-RANK 매개된 형성을 조절하는, 유전적으로 확인된 시그널링 경로의 도식적인 개요. b, RANKL 자극(1㎍/ml)에 대하여 분리된 일차 생쥐 유선 상피세포에서 인산화된(P) AKT, 전체 AKT, 인산화된(P) ERK1/2, 전체 ERK1/2, 인산화된(P) p38-MAPK, 및 p38-MAPK에 대한 웨스턴 블럿팅. 결과는 4번의 실험을 대표한 것이다.
도 12. MPA는 NFκB 경로를 활성화하며, RANKL/RANK를 통한 사이클린D1 발현을 촉발한다.
a, MPA에 의한 NFκB 경로와 사이클린D1 발현의 활성화. 무산부 RANK△ mam과 한 배 새끼 대조군 암컷에게 서방성 MPA 펠렛을 피하 이식하거나 모의 수술로 처리하였다. a, MPA 처리 3일 후, RANK△ mam과 한 배 새끼 대조군 암컷의 유선 상피세포에서 인산화된(P) IκBα를 검출하기 위한 인시츄(in situ) 면역염색. b, MPA 처리 3일 후, RANK△ mam과 한 배 새끼 대조군 암컷에서 분리된 유선 상피세포에서 사이클린D1과 RANKL의 웨스턴 블럿 분석. 재조합 쥐 sRANKL 단백질을 분자 크기 비교를 위해 나타내었다. β-액틴을 로우딩 대조군으로 보여준다.
도 13. RANKL/RANK 하류 시그널링 경로.
a, RANKL 자극(1㎍/ml)에 대하여 인간 SKBR3 유방암 세포에서 인산화된(P) p65 NFκB, 전체 p65 NFκB, 인산화된(P) IκBα, 인산화된(P) ERK1/2, 전체 ERK1/2, 인산화된(P) p38-MAPK 및 p38-MAPK에 대한 웨스턴 블럿팅. 결과는 3번의 실험을 대표한 것이다. b, 통상의 성장 배지(대조군, 10% FCS를 보충한 DMEM)에서 또는 RANKL (1㎍/ml)의 존재 하에 배양된 SKBR3 유방암 세포의 성장곡선. 3일 이상 살아있는 세포(트리판 블루 제외)를 계수하여 세포 개수를 결정하였다. c, MPA 펠렛과 DMBA를 처리한 NFATc1△ mam(n = 10)과 연령-맞춤 한 배 새끼 대조군 암컷(n=16)에서 촉진가능한 유방 종양의 발병. 결과는 마지막 DMBA 시험처리 후 종양이 없는 생쥐의 비율로 나타내었다. 유의미한 차이가 발견되지 않았다. d, NFATc1△mam과 한 배 새끼 대조군 암컷 유래의 정제된 유선 상피세포(MECs)와 MPA-유도된 유선 종양에서 NFATc1 mRNA 발현의 정량. mRNA는 qRT-PCR에 의해 측정하였다. 결과는 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다. (+/- sem). n = 그룹당 5. * P < 0.05 (스튜던트의 t-검정).
도 14. RANKL은 일차 쥐과의 유선 상피세포와 인간 SKBR3 유방암 세포를 γ-방사선조사에 대한 아폽토시스로부터 보호한다.
a, RANKL 자극의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재 시에 γ-방사선조사(2 Gray)에 반응하여 일차 생쥐 유선 상피세포에서 분리한 γH2AX, 인산화된(P) Chk1, 전체 Chk1, p53, 및 β-액틴에 대한 웨스턴 블럿 분석. b,c, RANKL 자극의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재시 γ-방사선조사(2 Gray) 후에 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, PI) 염색된 b, 유선 상피세포와 c, SKBR3 인간 유방암 세포의 FACS 분석. 결과는 적어도 3번의 실험을 대표하는 것이다. DNA 함량이 <2n인 아폽토시스 세포가 sub-G1 부위에 나타난다. Sub-G1(M1), G1-기(M2), S/G2/M-기(M3) 뿐만 아니라 DNA 함량이 > 4n인 다배수체 세포의 비율을 표시된 시점에 나타냈다.
도 15. RANKL은 일차 쥐과의 유선 상피세포와 인간 SKBR3 유방암 세포를 독소루비신(doxorubicin)에 대한 아폽토시스로부터 보호한다.
a,b, RANKL의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재 시에 유전자 독성 물질인 독소루비신(doxorubicin, Dox, 1μM)과 함께 인큐베이션시킨, a, 유선 상피세포와 b, SKBR3 인간 유방암 세포의 FACS 분석. 결과는 적어도 3번의 실험을 대표하는 것이다. 독소루비신 처리 후 24시간 및 36시간 동안 Sub-G1(M1), G1-기(M2), S/G2/M-기(M3)의 세포 뿐만 아니라 DNA 함량이 >4n인 다배수체 세포의 비율을 나타냈다. c, RANKL 자극의 존재 시(1㎍/ml) 또는 부재 시에 γ-방사선조사(2 Gray) 6시간 후에 전-아폽토시스(pro-apoptotic) 유전자인 Bim, Puma, 및 Noxa의 mRNA 발현. 결과는 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타낸다(+/- sem). n=3. * P < 0.05; ** P < 0.005 (스튜던트의 t-검정).
도 16. IKKα는 방사선-유도된 상피성 아폽토시스로부터 MPA 유도된 보호를 매개한다.
a,b, IKKα△ mam 암컷에서 γ-방사선조사에 대한 유선 상피세포 아폽토시스의 감소된 유도. 한 배 새끼 대조군과 IKKα△ mam 암컷은 모의 수술하거나 MPA 펠렛을 이식하고 γ-방사선조사를 하였다(5 Gray). MPA 펠렛은 γ-방사선조사 3일 전에 이식하였다. 방사선조사 24시간 후에, 활성 카스파제 3에 대한 면역염색에 의해 아폽토시스를 검출하였다. a, 대표적인 유선 절편에 대하여 상피세포의 아폽토시스 핵(화살표)을 나타냈다. 배율 X40. b, 유방 상피세포 아폽토시스의 정량. 각 생쥐에 대하여 최소 5000개의 핵을 계수하였다. 나타낸 결과는 평균값 +/- sem이다. n=그룹 당 3. * P < 0.05 (스튜던트의 t-검정).
도 17. RANKL/OPG 비율은 혈청을 채취한 후 12-24개월 이내가 아닌 5-12개월 내에 유방암이 발병한 여성에게서 달라졌다.
a, 추적검사 동안에 유방암이 발병하지 않았던 182명의 건강한 폐경 여성 및 혈청 수집 후 5-12개월에 ER 양성 유방암을 발병한 41명의 건강한 연령-맞춤 여성으로부터 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사)에 따라 전향적으로 수집한 혈청 시료에서 개별적인 sRANKL 및 OPG 수준의 분석. 유방암의 발생은 생검에 의해 진단하였다. 이들 여성 중 누구도 샘플 수집 시 호르몬 대체 요법을 받지 않았다. OPG와 sRANKL 수준뿐만 아니라 sRANKL에 대한 OPG 비율의 상자 도표를 나타내었다. 혈청을 시험한 후 1년 내에 유방암이 발병한 여성은 유방암이 발병하지 않은 여성과 비교하여 유의미하게 증가된 OPG 수준을 가질 뿐만 아니라(p=0.041; 만 휘트니 U 검증(Mann Whitney U test)) 유의미하게 높은 sRANKL에 대한 OPG 비율을 가진다 (p=0.022; 만 휘트니 U 검증). b, 추적검사 동안에 유방암이 발병하지 않았던 182명의 건강한 폐경 여성 및 혈청 수집 후 12-24개월에 ER 양성 유방암이 발병한 57명의 건강한 연령-맞춤 여성으로부터 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사)에 따라 전향적으로 수집한 혈청 샘플에서 개별적인 sRANKL 및 OPG 수준의 분석. OPG와 sRANKL 수준뿐만 아니라 sRANKL에 대한 OPG의 비율의 상자 도표를 나타내었다. 유의미한 차이가 발견되지 않았다(만 휘트니 U검증). 상자 도표는 중간값 비율 수준과 사분위수 범위를 나타낸다.
도 18. 웨스턴 블럿의 정량
실험 당 적어도 3번의 독립적인 웨스턴 블럿에 대하여 음영계측 (densitometry)을 수행하였다. 웨스턴 블럿에 대한 결과를 도 1b, 도 1c, 도 3a, 및 도 3b에서 나타내었다. 표시된 단백질에 대한 발현 값을 β-액틴 로우딩 대조군으로 표준화하였다. 인산화의 정량을 위하여 결과를 각각의 전체 단백질 밴드에 대하여 표준화하였다. * P <0.05; ** P < 0.001 (스튜던트의 t-검정).
RANKL은 수지상 세포 및 파골세포의 기능을 조절하는 세포 표면 수용체 RANK의 리간드도 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 암의 발생에서 추가적인 기전이 밝혀졌다. RANKL은 암 발생에 영향을 미치는 호르몬을 유도한다. 이러한 호르몬은 임의의 개인에서 정상적인 호르몬 배경의 것일 수 있거나 인공적으로 투여(호르론 대체 요법, 폐경기 치료에서 또는 피임제로서와 같은)된 것일 수 있다. 뿐만 아니라, 암에서 이 리간드의 세포 기전 및 활성이 조사되고 특성화되었다. RANKL의 효과(effect)인 "RANKL 활성"은 RANK에의 RANKL의 결합 및 그의 결과적인 활성화를 포함한다. RANK는 추가적으로 IKKα, IκBα, P-NFκB 및 사이클린D1 뿐만 아니라 Id2-p21, MAPK Erk 및 p38 경로를 차례차례 활성화시킨다. RANKL에 기인한 이 경로에서 임의의 상향조절은 본 발명의 진단 방법을 위한 지표로서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 임의의 이들 인자를 변형시키는 것은 본 명세서에 추가적으로 기술되는 치료적 방법을 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 이 경로의 임의의 구성원의 임의의 상향조절 또는 활성화는 "RANKL 활성"을 추정하기 위해 사용될 수 있다. 대부분의 이들 단백질은 세포내이며 세포 시료를 이용하여 이의 농도를 평가하는 것이 가능하다. 대안적으로 또는 단백질 농도를 추정하는 것에 부가적으로, 예컨대 세포, 특히 유방 조직 세포 내에 mRNA 농도를 측정함으로써 이들 단백질의 발현을 측정하는 것이 가능하다. 그러므로, 본 발명은 RANK, IKK-알파, IkB-알파, P-NF-카파-B, 사이클린D1(Id2-p21, MAPK Erk 또는 p38) 중 임의의 하나의 시그널링을 측정함으로써 RANKL 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 임의의 이들 인자의 시그널링 및 활성화는 예컨대 활성화된 RANK, IKK-알파, IkB-알파, P-NF-카파-B 및/또는 사이클린D1 또는 Id2-p21, MAPK Erk 및/또는 p38의 양을 검출 및/또는 정량화함으로써 측정될 수 있다. 이들 단백질의 활성화된 형태는 이들 단백질의 인산화된 버전을 측정함으로써 또는 단백질 응집체를 측정함으로써 결정될 수 있다. 언제나처럼 음성 또는 양성 대조군에 대한 비교는 하나 이상의 이들 단백질의 증가된 활성화를 확인하는 것을 도울 수 있다. 그러나, 접근성 이유로 인해, 환자의 혈액 또는 혈청 시료 내 RANKL 농도를 측정하는 것이 바람직하다.
RANK가 RANKL에 대한 유일한 수용체는 아니다. 오스테오프로테긴(Osteoprotegin; OPG)은 RANKL 활성(RANK에의 RANKL의 결합 및 IKKα, IκBα, P-NFκB 및 사이클린D1)을 감소시킬 수 있는 분비된 유인(decoy) 수용체이다. 부가적으로, RANKL은 OPG 발현을 상향조절하고 특히 혈액 또는 혈청 시료 내에 증가된 OPG 농도를 유도할 수 있다. OPG는 RANKL에 결합함으로써 유리(free) RANKL의 농도를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, RANKL 농도는 이의 유리, 가용성 형태로 측정될 수 있다. 다른 구현예에서, 총 RANKL 농도(유리 RANKL + OPG 결합된 RANKL)는 암의 지표일 수 있다. RANKL의 활성이 유방암 발생의 원인이라 하더라도, 차례차례로 이의 조절성 리간드 OPG를 상향조절할 수 있는 RANKL 농도의 상향조절은 진단 마커로서 작용하여 암을 진단 또는 예측할 수 있다. 그러므로, 진단 목적을 위하여, 용어 "RANKL 활성을 측정하는"은 RANKL 시그널링 경로 또는 임의의 RANKL 농도 둘 모두에서 임의의 상향조절을 측정하는 것을 포함한다. RANKL 활성이 언급된 곳 어디에서나, OPG 농도를 대신에 또는 부가적으로 사용하는 것 또한 선택적으로 가능하다. 특히 바람직한 구현예에서 OPG 및 RANKL의 조합이, 본 발명의 예측 또는 진단을 위한 지표로서 사용되고, 대개는 아마도 특히 OPG 양과 RANKL 사이의 시료 내 비율이 사용된다. 감소된 유리 가용성 RANKL을 초래하는 증가된 OPG 농도는 암 발생의 제1 단계를 이미 개시하였을 (증가된 OPG 완충 효과 없는) 증가된 RANKL 농도의 이전 시기(phase)의 결과이다. 그러므로, 임상적 암의 발생을 유도하는, 암 발병의 상이한 단계 동안 발견된 상이한 RANKL 농도와 일치하게, OPG는 암 발생의 유사한 역(reverse) 마커이다. 따라서, 본 발명은 암의 진단 또는 예후를 위한 진단 마커로서 OPG의 사용에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서 증가된 RANKL 활성 또는 RANKL 혈청 농도는 (대개는 아마도) 암이 12 내지 24개월 이내에 발생할 것이라는 것을 예측하는데 사용된다. 감소된 혈청 RANKL 농도는 5 내지 12개월 이내에 암의 발병을 예측하는데 사용될 수 있으며, 증가와 감소 둘 모두는 바람직하게는 음성 대조군과 비교하여 검출된다. 바람직하게는 RANKL의 감소 및 OPG의 증가는 본 발명의 진단 또는 예측/예후를 위한 지표로서 사용된다. 바람직한 구현예에서, 상대적인 양성 대조군을 사용하여 대개는 아마도 암이 발생할 때까지의 시간을 추정한다. 음성 및 양성 대조군 값은 바람직하게는 예컨대 스튜던트의 T-시험을 이용해 그룹을 비교하여 통계적 유의성을 결정하기 위한 통계적 분석을 수반하는 상관관계 분석에 사용될 수 있다.
RANKL 활성은 바람직하게는 시료 내에 RANKL 및/또는 RANK의 양을 측정함으로써 결정된다. RANKL/RANK 캐스캐이드 내 임의의 시그널링 인자를 분석하여 유방암 발생의 발병을 예측할 수 있다고 하더라도, RANKL 및/또는 RANK 그 자체의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 일반적으로 RANKL 또는 RANK의 양은 시료 부피 내의 농도 또는 대안적으로 시료 내에 세포 당 양으로서 나타낸다. 특히 RANKL의 경우에는, 특히 혈액 또는 혈청 시료 내에 RANKL 용질 농도를 측정하는 것이 바람직하다.
세포 시료는 바람직하게는 이후의 암 발생에 대해 진단되거나 이를 나타낼 수 있는 환자의 세포의 조직을 포함한다. 바람직하게는 세포는 유방 세포를 포함한다. RANKL, RANK 또는 RANKL 시그널링 경로의 임의의 추가적인 구성원의 농도의 양은 본 기술 분야에 알려진 방법에 의해, 특히 리간드를 결합하고 이러한 결합 이벤트를 검출함으로써 추정될 수 있다. 바람직한 리간드는 RANKL 또는 RANK 또는 시그널링 경로의 임의의 세포 단백질에 대하여 지시된 항체이다. 항-RANKL-항체, 예컨대 데노수맵(Denosumb)은 상업적으로 입수가능하며, US 2008/107597에 개시되어 있다. 세포내 단백질을 측정하기 위하여, 일반적으로 세포-막을 파괴하거나 세포 시료를 균질화하거나 세포내 표지를 이용하는 것이 필요하다. 바람직하게는 결합 이벤트는 표지, 특히 형광 표지를 이용하여 검출된다.
추가적인 구현예에서, RANKL mRNA 수준 또는 RANK, IKKα, IκBα, P-NFκB 및 사이클린D1을 포함하는, RANKL 시그널링 경로에서 임의의 인자의 mRNA 수준의 농도를 단독 또는 이들 인자의 하나 이상의 조합으로 측정함으로써 RANKL 활성을 추정하는 것이 가능하고, 바람직하게는 RANKL이다. 임의의 이들 인자 및 특히 RANKL의 증가된 발현은 암 발생의 원인인 증가된 RANKL 활성의 직접적인 지표이며, 따라서 암을 진단 또는 예측하기 위해 사용될 수 있다.
뿐만 아니라, RANKL 활성은 암, 특히 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬-유도된 암의 진행 및 확산과 상관관계를 보일 수 있다. 암은 상피성 기원의 것일 수 있다. 바람직하게는 이러한 상관관계는 특정한 속도로 진행된 암이 발생한 환자의 양성 대조군 시료와 비교하여 만들어진다.
환자는 바람직하게는 포유동물, 특히 바람직하게는 영장류, 더욱 바람직하게는 인간, 특히 여성이다. 환자는 호르몬, 특히 여성 성 호르몬을 사용한 치료요법을 받거나 받았었을 것이다.
프로게스테론 및 특히 그의 합성 유도체(프로게스틴)는 폐경후 여성에서 처음에 발달하는 에스트로겐-유도된 자궁내막암의 위험을 감소시키고 폐경기 증후군을 경감시키기 위해 호르몬 대체 요법(HRT)과 병용하여 사용된다. 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA)는 호르몬 피임법에서 가장 흔하고 오래 사용된 프로게스틴이며 HRT를 위해 흔히 사용된다.
암 발생에서 RANKL 활성이 에스트로겐 또는 프로게스테론과 같은 여성 성 호르몬을 포함하는 성 호르몬, 특히 프로게스테론 또는 이의 유도체(프로게스틴)에 의해 영향받음이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 그러므로, 바람직한 구현예에서 환자는 호르몬으로 치료를 받거나, 바람직하게는 프로게스테론 또는 프로게스틴을 이용하는 바람직하게는 호르몬 대체 요법을 받거나, 호르몬 피임제를 이용하여 치료된다. 프로게스틴의 예는 메드록시프로게스테론(또는 이의 아세테이트, 예컨대 17-아세테이트), 노르에티스테론, 에티스테론, 노르에티노드렐, 노르에틴드론 아세테이트, 에티노디올 디아세테이트, 레보노르게스트렐, 노르게스트렐, 데소게스트렐, 게스토덴, 노르게스티메이트, 드로스피레논, 디에노제스트, 네스테론, 노메게스트롤 아세테이트, 트리메게스트론, 타나프로게트(tanaproget), 메게스트롤 아세테이트, 프라논, 에토노게스트렐이다. 호르몬 또는 유도체는 바람직하게는 프로게스틴적인 효과를 갖는다.
천연 호르몬 수준은 세포에서 암성 돌연변이의 암성 RANKL 보호를 유도하기에 충분할 수 있다. 호르몬은 또한 개체에서 인공적으로 증가될 수 있다. 호르몬 대체 요법에서 또는 호르몬 피임법을 사용함으로써, 일반적인 성 호르몬의 호르몬 수준은 본 발명에 따른 RANKL 경로를 통한 암의 발생과 관련될 수 있는 증가된 프로게스테론 수준을 유도하도록 상향조절된다. 그러므로, 호르몬 또는 호르몬 피임제를 받거나 이로 치료된 환자는 암이 발생하는 위험이 증가되어 있다. 이들 환자에 대해, 상기 기술한 바와 같은 RANKL 활성을 측정하는 것은 암, 암 발생 또는 암 진행에 특히 예측적이다.
특히, 월경 주기의 호르몬 또는 여성 성 호르몬 또는 (프로게스틴과 같은) 이의 기능적 유도체를 측정하는 것을 포함하고, 바람직하게는 특히 음성 및/또는 양성 대조군과의 비교에서, RANKL 활성의 값과 함께 상관관계에 이 데이터를 포함함으로써, 본 발명의 진단의 예측 값, 암의 예측 또는 암의 진행의 예측을 개선시킬 수 있음이 밝혀졌다. 부가적으로, 또는 대안적으로서, 시료 내에 RANKL 리간드의 농도를 측정하는 것이 또한 가능하다. 이는 리간드에 결합이 가능한 RANKL의 정보를 포함함으로써 유리 혈청 RANKL 농도의 측정을 교정할 수 있게 한다. RANKL의 바람직한 리간드는 OPG와 같은 RANKL의 혈청 리간드이다. 그러므로, 추가적인 바람직한 구현예에서 본 발명의 방법은 월경 주기의 호르몬, 이의 기능적 유도체 또는 환자의 시료 내에 RANKL 리간드의 혈청 농도를 측정하는 단계를 포함한다. RANKL 리간드는 OPG와 같은 생체내에서 RANKL의 농도에 의해서 조절되는 RANKL 조절성 단백질일 수 있다.
이러한 호르몬의 예는 프로게스테론이고 프로게스테론 유도체의 예는 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA)와 같은 프로게스틴이다. 특히 높은 프로게스틴 또는 프로게스테론 수준(예컨대 혈청 농도 >0.3ng/㎖) 및 RANKL 활성은 암 발생과 상관관계를 보일 수 있다. 그러므로 바람직한 구현예에서 본 발명은 RANKL 활성과 프로게스테론(및/또는 프로게스테론 수준), 특히 이의 혈청 농도의 값 둘 모두를 추정함으로써 유방밤이 발생할 위험을 결정하는 것을 제공한다.
대안적으로 또는 이에 부가적으로, 본 발명은 또한 상기 환자의 시료 내에, 바람직하게는 혈청 시료 내에 오스테오프로테게린(OPG)의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 오스테오프로테게린은 유리 혈청 RANKL 농도를 감소시킬 수 있는 RANKL의 분비된 천연 리간드이다. 추가로 OPG는 혈청 내에 증가된 RANKL 농도에 대하여 상향조절될 수 있으므로 OPG는 암 또는 암이 발생하는 위험의 대안적이거나 부가적인 지표이다.
특히 RANKL 활성과 OPG의 농도 둘 모두를 결정하고 본 발명의 암의 진단 또는 예측을 위한 음성 및/또는 양성 대조군 시료와 비교시 농도와 활성 둘 모두 상관관계를 보이는 것이 바람직하다. 이러한 상관관계에 대해, 임의의 가산, 감산 또는 오스테오프로테게린과 RANKL 사이의 비율이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서 (새로-발병한) 암은 RANKL에 대한 오스테오프로테게린의 비율을 결정함으로써 진단 또는 예측된다. 놀랍게도, 이러한 비율은 오스테오프로테게린의 혈청 농도 및 유리 가용성 RANKL의 혈청 농도를 이용함으로써 혈청 데이터에서 아주 높은 통계적 유의성을 달성하였다. 유리 가용성 RANKL은 본 발명에 따라 결정된 RANKL의 바람직한 종이다.
RANKL을 검출하기 위한 수단은 결합 리간드, 특히 RANKL에 대해 특이적인 항-RANKL 항체를 포함한다. 적합한 항체는 US 2008/107597에 개시되어 있고 예컨대 항체 데노수맵이 상업적으로 입수가능하다. "항-RANKL-항체"는 Fab, F(ab)2, Fv와 같은 항체 단편, 또는 단일쇄 항체(scAb)를 포함하는 임의의 기능적 등가물 및 이의 유도체를 포함한다. RANKL 활성 관련 단백질 및 인자, 구체적으로 RANKL 시그널링 경로에서 RANKL 및 RANK 및 임의의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 항체는 전장 단백질, 이 단백질의 가용성 형태, 또는 이의 단편을 이용한 면역화에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있거나, 경쇄 및 중쇄 상에 쥐 불변 영역이 인간 서열에 의해 대체된 키메라 항체와 같은 재조합 항체일 수 있거나, 상보성 결정 영역만이 쥐 기원인 CDR-이식된 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 예를 들면, 인간 항체를 생산할 수 있는 형질전환 동물의 면역화에 의해(WO 93/12227) 제조된 인간 항체일 수 있다. 항체는 생물학적 시료에서 RANKL을 검출하는데 유용하며, 단백질을 생산하는 세포 또는 조직의 식별을 가능하게 한다.
본 발명은 또한 RANKL, OPG와 같은 RANKL 리간드, 및/또는 여성 성 호르몬, 특히 프로게스테론, 프로게스틴 및 에스트로겐을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
키트는 첨가제, 검출제, 세척 용액 및/또는 다양한 pH 값 및 이온 강도를 갖는 완충액(트리스, 아세테이트 또는 포스페이트 완충액), 트윈 또는 폴리소르베이트와 같은 가용화제, 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 담체, 티메로살 또는 벤질 알코올과 같은 보존제 및 아스코르브산 또는 메타중아황산 나트륨과 같은 항산화제를 포함할 수 있다. 특정한 키트 조성물의 선별은 사용되는 시료를 포함하는 인자의 수에 좌우될 것이다.
키트는 RANK에 대한 검출제, 및 생리학적 RANKL 리간드 및/또는 프로게스틴에 대한 검출제를 포함할 수 있다. 바람직한 조합은 RANKL에 대한 검출제 및 생리학적 RANKL 리간드의 조합; 또는 RANKL에 대한 검출제 및 여성 성 호르몬의 조합이다. "검출제"는 시료 내에 특정한 피분석물 검출 및/또는 정량화하기 위한 수단에 관한 것이다.
생리학적 RANKL 리간드는 OPG일 수 있다. 호르몬은 프로게스틴, 특히 프로게스테론일 수 있다.
RANKL 검출제는 합성 리간드 및 작은 분자를 포함하는 RANKL 결합 리간드일 수 있다. 바람직하게는 RANKL 결합 리간드는 항-RANKL-항체이다. RANKL 결합 리간드는 형광 또는 방사성 동위원소와 같은 것에 의해 표지될 수 있다.
이 키트는 상기 상세하게 기술한 바와 같이 암, 암 발생을 결정, 예측 또는 예상하거나, 암 세포를 식별하는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기와 같이 정의된다:
1. 유방암을 검출하거나 유방암이 발생할 환자를 예측하거나 유방암으로 고통받는 환자에서 유방암의 진행률을 측정하는 방법으로서, 상기 환자의 시료 내에 RANKL 활성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
2. 정의 1에 있어서, RANKL 활성이 시료 내에 RANKL 및/또는 RANK의 양을 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 정의 1 또는 2에 있어서, RANKL 활성이 RANK, IKK-알파, IkB-알파, P-NF-카파-B, 사이클린D1 중 어느 하나의 시그널링을 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 시료가 환자의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 정의 1, 2 또는 3의 방법.
5. 세포가 유방 세포를 포함하는 것인 정의 3의 방법.
6. 정의 4 또는 5에 있어서, 세포가 프로게스테론 수용체, 에스트로겐 수용체로부터 선택된, 바람직하게는 ESR1, ESR2 또는 헤테로다이머 수용체로부터 선택된 호르몬 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. RANKL이 상기 환자의 혈청 시료 내에서 측정되는 것을 특징으로 하는 정의 1 또는 2의 방법.
8. 정의 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 암이 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 정의 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 암이 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 정의 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 환자가 호르몬에 의해 치료되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 환자가 호르몬 대체 요법에 의해 또는 호르몬 피임법을 이용해 치료되는 것인 정의 10의 방법.
12. 호르몬이 프로게스테론 또는 프로게스틴인 정의 10 또는 11의 방법.
13. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 환자의 시료 내 월경 주기의 호르몬 또는 이의 기능적인 유도체 RANKL 리간드의 혈청 농도를 측정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
14. RANKL 리간드가 생체내 RANKL의 농도에 의해 조절되는 RANKL 리간드 또는 RANKL 조절성 단백질인 것인 정의 13의 방법.
15. 시료 내에 프로게스테론 및/또는 프로게스틴 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 정의 13의 방법.
16. 유방암 발생 위험 또는 암 진단이 RANKL 활성 및 프로게스테론 및/또는 프로게스틴 수준의 적어도 둘 모두의 값에 의해서 추정되는 것인 정의 13 내지 15의 방법.
17. 상기 환자의 시료 내에 오스테오프로테게린의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것인 정의 13 또는 16의 방법.
18. 시료가 혈청 시료인 것인 정의 13 내지 17의 방법.
19. 새롭게-발병된 유방암이 RANKL에 대한 오스테오프로테게린의 비율을 결정함으로써 진단 또는 예측되는 것인 정의 12 내지 18 중 어느 하나의 방법.
20. RANKL에 대한 검출제, 및 생리학적 RANKL 리간드 및/또는 프로게스틴 중 하나에 대한 검출제를 포함하는 키트.
21. 정의 20에 있어서, RANKL 및 여성 성 호르몬에 대한 검출제를 포함하는 것인 키트.
22. 정의 20 또는 21에 있어서, RANKL 리간드가 OPG인 것인 키트.
23. 정의 20에 있어서, RANKL 및 여성 성 호르몬에 대한 검출제를 포함하는 것인 키트.
24. 정의 23에 있어서, 호르몬이 프로게스테론인 것인 키트.
25. 정의 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, RANKL 검출제가 RANKL 결합 리간드인 것인 키트.
26. 정의 25에 있어서, RANKL 결합 리간드가 항-RANKL-항체인 것인 키트.
27. 정의 25 또는 26에 있어서, RANKL 결합 리간드가 표지된 것인 키트.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해서, 이러한 특정한 실시예로 제한 되지 않으면서, 추가로 예시된다.
실시예 :
실시예 1: 생쥐.
Rank floxed 생쥐는 최근에 생성되었다1. 간단히 말하면, Rank의 무반응 대립유전자 생쥐(null allele)(rank △ 대립 유전자)를 보유한 생쥐를 만들기 위하여, rank floxed 생쥐를 β-액틴-Cre 편재성 결손(ubiquitous deletion) 생쥐와 이종 교배하였다. MMTV-Cre rank△/ floxed 생쥐를 생성하기 전에, rank floxed 또는 rank △ 대립 유전자를 보유해 생쥐뿐만 아니라 MMTV-Cre 생쥐를 BALBc 배경에 대해 7번 역교배(backcross) 하였다. MMTV-NeuT 생쥐는 친절하게도 이탈리아 밀라노의 Guido Forni가 제공하였다. MMTV-Cre 생쥐(스톡 # 003553)와 Mx-Cre 생쥐(스톡 # 003556)는 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. K5-Cre, IKKαfloxed 및 NFATc1 floxed 생쥐는 이전에 기술되었다2 -4. 생쥐 유전자형을 PCR과 서던 블럿 분석에 의해 결정하였다. 모든 실험에서, 동종 번식 유래의 한 배 새끼 생쥐만을 사용하였다. 모든 생쥐는 규격화된 지침에 따라 사육하고 유지하였다.
종양에서 RANK 의 제거 및 Cre 효과.
RANK△ mam암컷에서 발달한 종양의 서던 블럿팅은 RANK의 제거를 보여주었으며(도 8c), 비록 일부 잔여 야생형 밴드가 관찰되었지만 이는 다른 세포 형태 및 다른 도망 세포(escaper cells)의 존재로 설명될 수 있다. Cre 음성 대조군 암컷과 MMTV-Cre 형질전환 유전자를 발현하는 한 배 새끼에서 종양의 발병에 있어서 차이점은 발견되지 않았는데, 이는 MPA/DMBA 유선 종양 모델에서 Cre 발현 자체가 종양의 발생빈도를 변경하지 않는다는 것을 나타낸다(도 8d).
실시예 2: MPA / DMBA -유도된 유선 암형성 .
MPA/DMBA 처리는 기술된 바와 같이 수행하였다5 ,6. 간단히 말하면, 6주령의 암컷 생쥐를 케타민-자일라진(ketamine-xylazone)으로 마취했고, 서방성 메드록시프로게스테로 아세테이트(MPA) 펠렛(50mg, 90일 동안 방출; Innovative Research of America)를 수술적으로 오른쪽 옆구리 피하 조직에 이식하였다. 도 2a에 개략적으로 보여준 대로, 이후의 8주간에 걸쳐서 200㎕ DMBA (5mg/ml로 면실유에 희석됨)를 경구-위관투여에 대해 6회 투여하였다. 유선 종양의 발병은 촉진에 의해 결정했다. Cre 음성 대조군 암컷과 MMTV-Cre 형질전환 유전자를 발현하는 한 배 새끼에서 종양의 발병에 있어서 차이점은 발견되지 않았는데, 이는 MPA/DMBA 유선 종양 모델에서 Cre 발현 자체가 종양의 발생빈도를 변경하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 유선조직 이식편 .
이식 연구를 위하여, 유선 상피 조직을 무산부 3주령 기증자로부터 분리하였고, 이전에 기술한 바와 같이7 3주령의 숙주 nu / nu 생쥐의 내재성 상피가 없는 소거된 유선 지방 패드 내로 이식하였다. 수술 3주 후에 숙주를 짝지어 주었고, 분석을 위하여 유선 조직을 분리하였다.
실시예 4: 조직학, 전조직 표본, 및 면역조직화학.
조직학적 분석을 위하여, 5㎛ 절편을 잘랐고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다(H&E). 이전에 기술한 대로8, 유선의 전조직 표본 염색을 수행하였다. 면역페록시다제(immunoperoxidase) 염색을 위하여, 파라핀(paraffin)-포매 절편을 탈수시키고, 10 mM 시트레이트 완충액을 사용하거나 전자레인지에 데워서 항원 에피토프를 노출시켰다. 절편을 사이토케라틴5, 사이토케라틴14, E-캐드헤린, 항-Ki67(Novocastra사) 및 항-활성 카스파제 3(Cell Signaling사)에 대한 항체로 인큐베이션시켰고, 페록시다제-접합 이차항체를 사용하여 시각화하였다. 양성인 상피세포의 숫자를 상피세포의 전체 숫자로 나누어 조직형태계측 지수(증식과 아폽토시스)를 계산하였는데, Ki67 염색에 대해서는 절편당 적어도 1000개의 핵을, 활성화된 카스파제 3 염색에 대해서는 절편당 적어도 5000개의 세포를 계수하였다.
실시예 5: 웨스턴 블럿팅 .
인간의 상피 유방 종양 세포주 SKBR3와 일차 비형질전환 생쥐 유선 상피세포를 비처리 상태로 방치하거나, 재조합 쥐 RANKL로 자극하였다9. 선암종은 대조군과 돌연변이 생쥐로부터 분리하였으며, 전체 단백질 파쇄액을 준비하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 간단히 말하면, 블럿을 1X TBS, 0.1% Tween-20(TBST)가 들어간 5% BSA로 1시간 동안 블록킹시키고, (제조사의 프로토콜에 따라 TBST로 희석된) 일차항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 생쥐 RANKL (AF462; R&D사), 사이클린 D1 (Santa Cruz사 #Sc-8396), β-액틴 (Sigma사), 인산화된(P) NFκB (#3033), NF-κB (#4767), 인산화된(P) IκBα(#2859), IκBα(#4814), 인산화된(P) IKKα(#2681), IKKα(#2678), IKKβ (#2678), IKKγ(#2685), 인산화된(P) Akt (#3787), Akt (#9272), 인산화된(P) Erk1/2 (#9101), Erk1/2 (#9102), 및 p38-MAPK (#9212), p53 (# 2524), 인산화된(P) Chk1 (# 2348), Chk1 (# 2345) (모두 Cell Signaling사 제품임), p38-MAPK (AF869; R&D사), 및 γH2Ax (Ser139 #07-164 Millipore사)에 반응성인 1차 항체를 사용하였다. 블럿을 TBST로 30분간 3번 세척하였고, HRP-접합된 이차항체(1:2000으로 희석, Promega사)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, TBST에 30분 동안 3번 세척하였고 ECL을 사용하여 시각화하였다.
실시예 6: qRT - PCR .
종양의 전체 RNA를 제조사의 지침에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen사)를 사용하여 준비하였다. 전체 RNA(2 ㎍)를 정량적 (q)RT-PCR 분석에 적용하였다. 다음 프라이머가 사용되었다 :
β-액틴 순방향 프라이머: 5'- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3';
β-액틴 역방향 프라이머: 5'-CCTGAACCCTAAGGCCAACCG -3'.
RANKL 순방향 프라이머: 5'- CTGAGGCCCAGCCATTTG -3'
RANKL 역방향 프라이머: 5'- GTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCTTG -3'
RANK 순방향 프라이머: 5'- CTTGGACACCTGGAATGAAG -3'
RANK 역방향 프라이머: 5'- CAGCACTCGCAGTCTGAGTT -3'
사이클린 D1 순방향 프라이머:5'- CTGTGCGCCCTCCGTATCTTA -3'
사이클린 D1 역방향 프라이머:5'- GGCGGCCAGGTTCCACTTGAG -3'
p21 (Cdkn1a) 순방향 프라이머: 5'- GTGGCCTTGTCGCTGTCTT -3'
p21 (Cdkn1a) 역방향 프라이머: 5'- GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG -3'
tRANKL 순방향 프라이머: 5'- GCGCCGGGCCAGCCGAGACTAC -3'
RANKL1 순방향 프라이머: 5'- GTCCCACACGAGGGTCCGCTGC -3'
RANKL2 순방향 프라이머: 5'- TGCGCACTCCGGCGTCCCG -3'
RANKL3 순방향 프라이머: 5'- CCGAGACTACGGCGGATCCTAACAG -3'
RANKLcom. 역방향 프라이머: 5'- TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAGCCCC-3'
Puma 순방향 프라이머:5'- CCGCCTGATGCCCTCCGCTGTAT -3'
Puma 역방향 프라이머:5'- CGGGCCCACTCCTCCTCCTCCAC -3'
Noxa 순방향 프라이머: 5'- ACTTTGTCTCCAATCCTCCG -3'
Noxa 역방향 프라이머: 5'- GTGCACCGGACATAACTGTG -3'
Bim 순방향 프라이머: 5'- GTTGAACTCGTCTCCGATCC -3'
Bim 역방향 프라이머: 5'- GCCCCTACCTCCCTACAGAC -3'
실시예 7: DNA 손상 반응.
세포주기 정지(rest)와 아폽토시스의 측정을 위해, 일차 생쥐 유선 상피세포와 SKBR3 인간 유방암 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 100000개 세포의 세포밀도로 접종하고, 24시간 동안 자랄 수 있게 놓아두었다. 그 후 재조합 RANKL(1 ㎍/ml)의 존재 시 또는 부재 시에 세포를 독소루비신(doxorubicin(1μM))으로 처리하거나 γ-방사선조사(2 Gray)를 실시하였다. 세포주기 정지와 죽은 세포의 개수는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodine) 염색을 사용하여 결정하였다. 생체 내 유선 상피세포 사멸을 결정하기 위하여, 대조군과 RANK△ mam 한 배 새끼 암컷에 5 Gray(Gy)의 총 선량으로 γ-방사선조사를 하였다. 6시간 후 유선을 분리하였고, 아폽토시스의 지표로 사용할 수 있는, 활성 캐스파제3(Cell Signaling사)에 대해 면역염색하였다.
실시예 8: 전향적인 인간 집단 연구.
전향적인 집단-기반의 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사) 연구에서 참가자 모집의 상세한 내용에 대해서는 참고문헌10을 참조한다. 개체는 난소암에 대한 가장 큰 다기관 무작위제어 임상시험인 영국 공동 임상시험 난소암 선별검사(UKCTOCS)의 참가자였다. 임상시험은 잉글랜드, 웨일스, 및 북아일랜드에 있는 13곳의 NHS 위탁업체에서 착수했으며 UCL에 있는 부인과 암연구센터가 조정하였다. 50-74세의 여성을 27개의 참여한 일차 관리 위탁업체의 연령/성별 등록부로부터 무작위로 초청하였다. 초청에 응한 여성에게 임상시험에 대한 정보를 서면과 구두로 제공하였다. 2001년과 2005년 사이에 50-74세 폐경기 여성 202,638명이 난소암에 대한 선별검사 또는 무-선별검사에 무작위로 배정되었다. 모든 여성은 모집 시에 혈액 시료를 제공하였고, 추가적으로 50,640명의 여성이 매년 일련의 혈액 시료를 제공하였다. 이 임상시험을 ISRCTN22488978로 ClnicalTrials.gov 번호 NCT00058032에 등록하였다. 환자로부터 모집 여성의 의학적 병력기록에 접근하는 것과 차후 연구에서 모집 여성의 데이터/시료 사용을 포함한 서면 동의서를 받았다. 각 여성은 모집 시에 시료를 제공하였고, 병력과 가족력에 관한 기본적인 설문지에 응답하였다. 참여 여성에게 모집 후 3.5년째에 임상시험에 참여한 후 임의의 암이 발병했는지 여부를 질문하는 후속 설문지를 보냈다. 후속 설문 조사 시에 유방암을 스스로 보고한 여성이나 국가 통계청(ONS, Office for National Statistics)이 유방암이 발병했다고 확인을 해 준 여성은 그들의 진료의사를 통해서 추적 조사를 하였다. ER-양성 침습성 유방암으로 진단되었으나, 모집시 HRT 치료를 받지 않았고 임상시험내로의 무작위화를 수반하는 진단의 적어도 5-24개월 전에 제공된 혈청 시료를 보유한 여성을 분석을 위해 선택하였다(98건의 사례). 유방암 사례는 연령-맞춤으로 유방암의 병력이 없는 여성으로 통일시켰으며(182명의 대조군), 같은 날짜에 같은 병원에서 혈청 시료를 수집하였다. 센터에서 수집된 혈액 시료를 2,500 rpm에서 5분 동안 원심분리 한 후, Grienger 겔 튜브 내에 넣고 밤새 보관하였으며 다음날 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사) 중앙 실험실에서 처리하였다. 혈청을 500 ㎕의 스트로 튜브에 분취한 후 이를 열로 밀봉하고, 바코드를 붙여서 액체 질소 탱크 안에 특별 용기에 보관하였다. 시료는 사용 직전에 해동하였다. 인간 연구 윤리에 대한 UCL/UCLH 공동 위원회에 의해 윤리적인 허가를 받았다(REC reference number: 06/Q0505/102).
실시예 9: 유방암 환자.
사용된 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사) 코호트10 추적검사 동안 유방암이 발병하지 않은 182명의 건강한 폐경기 여성과 혈청 수집 후 5-24개월에 에스트로겐 수용체(ER) 양성인 유방암을 발병한 98명의 건강한, 연령-맞춤 여성으로부터 전향적으로 수집한 혈청 시료를 포함한다. 이러한 98명의 여성 중에서 41명이 1년 이내에 유방암이 발병했으며, 57명의 여성이 혈청 시료 수집 후 12-24개월에 유방암이 발병했다. 시료 수집 시 이들 여성 중 그 누구도 호르몬 대체요법을 받지 않았다.
실시예 10: 프로게스테론 분석.
ㆍ 1차 인큐베이션: 30 μL 시료를 바이오티닌 표지된 단일클론의 프로게스테론-특이적 항체와 루테늄 복합체(ruthenium complex)로 표지된 프로게스테론 유도체의 존재 하에서 프로게스테론을 분비시키기 위해 Danazol과 함께 인큐베이션시켰다. 시료로부터의 프로게스테론은 항체 결합 부위에 대하여 표지된 프로게스테론 유도체와 경쟁한다.
ㆍ 2차 인큐베이션: 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 미세입자들의 첨가 후, 복합체는 바이오틴과 스트렙타비딘의 상호작용을 통하여 고체상에 결합하게 된다. 고체상에 결합한 표지된 프로게스테론 유도체의 양은 시료의 프로게스테론 함량에 역으로 비례한다.
ㆍ 미세입자가 자기적으로 전극의 표면에 포획된 측정 셀(measuring cell) 내로 반응 혼합물을 흡입시킨다. 그 후에 결합되지 않은 물질들은 Procell로 제거하였다. 이어서 전극에 대한 전압의 적용은 광전자 배증기(photomultiplier)에 의해 측정되는 화학 발광성 방출을 유도한다.
ㆍ 결과는 2점 보정에 의해 기구-특이적으로 생성된 보정곡선 및 시약 바코드(barcode)를 통해 제공되는 모곡선(master curve)을 통하여 결정된다.
시약 - 작업 용액( Reagent - working solutions )
M 스트렙타비딘-코팅된 미세입자(투명한 캡), 한 개의 병, 6.5mL: 스트렙타비딘-코팅된 미세입자, 0.72mg/mL; 보존제.
R1 항-프로게스테론-항체~바이오틴(회색 캡), 한 개의 병, 10mL: 바이오틴화된 단클론성 항-프로게스테론 항체 (생쥐) 0.15mg/L, 인산 완충액 25mmol/L, pH 7.0; 보존제.
R2 프로게스테론-펩티드~Ru(bpy)2+(검정 캡), 한 개의 병, 8mL: 루테늄 복합체(ruthenium compley)로 표지된 합성 펩티드에 결합된(식물성 기원의) 프로게스테론, 10 ng/mL; 인산 완충액 25 mmol/L, pH 7.0; 보존제.
실시예 11: 통계.
본 명세서의 모든 값은 평균들 (+/-)sem으로 나타내었다. 그룹간의 비교는 스튜던트의 t-검정으로 실시하였다. 종양 발병의 케플렌-메이어(Kaplan-Meier) 분석의 경우 로그 랭크 시험(log rank test)을 수행하였다. P 0.05를 통계적으로 유의하다고 받아들였다. 로그 랭크 시험에 추가로 실험동물의 숫자가 주어진 경우 동일한 종양의 발병 시점에 대한 귀무가설(null hypothesis)을 정확하게 거부하는 확률을 계산하기 위하여 포스트-혹 파워 분석(post-hoc power analysis)을 수행하였다(PS Power and Sample Size Calculations, 웹사이트 biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize). RANK△ mam 동물을 포함한 연구의 경우, 귀무가설은 0.933의 확률 (파워)로 거부될 수 있고, IKKα△ mam 동물은 0.766의 확률로 거부될 수 있다. 이 귀무가설의 시험과 관련된 유형 1 오류의 확률은 0.05 이다. 인간의 결과는 지시된 바에 따라 한 쌍의 t-검정인 맨 휘트니 유 테스트(Mann Whitney U test) 또는 스피어만 순위 검정(Spearman rank test)을 사용하여 분석하였다.
실시예 12: RANKL / RANK 결손 생쥐:
MPA 매개 종양 형성에서 RANKL/RANK의 잠재적인 역할을 시험하기 위하여, K5-C와 MMTV-Cre 매개로 유도 가능한 RANK 대립유전자의 제거법을 사용하여 유선 상피세포에서 RANK를 제거하였다(K5-Cre rank flox /△ 생쥐와 MMTV-Cre rank flox / △ 생쥐). 양쪽 생쥐 계통은 건강한 것으로 보이며, 정상적인 뼈 구조들의 림프절 형성을 나타내었다. 기대한 바대로, K5-Cre rank flox /△ 생쥐는 사춘기의 2차 성징 후 명백하게 정상적인 유선 발달을 보였다. 그러나, 이러한 생쥐는 임신 동안에 젖을 분비하는 소엽꽈리 구조가 발달하지 않았다(도 5a,b). 이러한 영향은 이식 수술을 이용하여 세포 자율적이었다(도 5c). MMTV-Cre rank flox /△ 생쥐에서, 무산부 암컷에서 유선발달과 임신시 수유 소엽꽈리 구조의 형성을 정상적으로 보였다(도 6a-c). K5-Cre rank flox/△ 생쥐에서 정상적인 생리현상에서 특정한 세포 집단에 영향을 줄 수도 있는 발달 효과로 인한 임의의 논란을 배제하기 위하여, MMTV-Cre rank flox /△ 생쥐를 이후의 모든 실험에 사용하였다. 이러한 MMTV-Cre rank flox /△ 돌연변이 생쥐는 여기서부터 RANK△ mam이라고 명명한다.
실시예 13: 프로게스틴 투여 시 RANKL 활성화의 기전
야생형 집단에서, MPA 처리는 유선 상피세포들의 대규모 증식을 촉발시킨다. 유선 상피세포들의 MPA-유도 증식은 RANK△ mam 암컷에서 현저하게 감소하였다(도 1a; 도 7a-c). 따라서, 무산부 암컷으로 RANKL의 복강 내 주입은 RANK를 통한 유선 상피세포의 증식을 촉발시켰다(도 7d,e). 최근에는 내재적인 프로게스테론이 임신15과 발정주기1 6 동안 Lin-CD24+CD49fhi 줄기세포의 개수에 영향을 미친다는 것이 보고되었다. 두 연구에서, RANKL/RANK 시스템이 생체 내 전신의 항체 차단(blocking) 연구와 RT-PCR 발현을 기반으로 한 것이 의도되지만 이것이 이차적 영향이 아닌 유선 상피세포에서 RANKL-RANK의 직접적인 영향인지 여부는 알려져 있지 않다. 그러므로, MPA와 같은 프로게스틴이 또한 Lin-CD24++CD49fhi 세포를 확장할 수 있는지 여부를 분석하였다. MPA 처리는 Lin-CD24++CD49fhi 세포의 2배 확장을 야기했다. 이러한 확장은 MPA-처리된 RANK△ mam 암컷에서는 일어나지 않았다(도 1b,c). 이러한 결과는 RANKL/RANK 시스템이 Lin-CD24++CD49fhi 세포의 확장을 조절한다는 첫 번째 유전적 증거를 제공한다.
실시예 14. 대조군과 RANK / RANKL 결손 생쥐에서 RANK / RANKL 을 통한 암 발달에 대한 프로게스틴의 영향
여성 건강 발의(WHI) 및 백만 여성 연구에 따르면, 프로게스틴의 사용은 유방암의 발병 및 발병빈도와 역학적으로 연관되어 왔다. DNA 손상 제제인 디메틸벤즈 안트라센(DMBA)의 존재시에 서방성 MPA 펠렛의 이식이 유선암을 촉발하는, 프로게스틴-유도된 유선암이 제작될 수 있다(도 2a; 도 8a,b).
대조군 암컷에서, MPA/DMBA 처리는 촉진가능한 유선 종양의 신속한 발병을 유도하였다. 흥미롭게도, RANK△ mam 암컷 생쥐에서, MPA/DMBA-유도한 유선암의 발병이 현저히 지연됨이 관찰되었다(도 2b; 도 8c,d). RANK△ mam 암컷에서 지연된 종양의 발병은 또한 현저히 향상된 생존을 야기했다(도 8e). RANK△ mam 암컷에서 발달한 종양의 서던 블럿팅으로 RANK의 효율적인 제거를 확인하였다(도 8c). 대조군과 RANK△mam 암컷에서 발달한 모든 종양은 사이토케라틴(CK)5와 CK14 양성 기저세포 아형(subtype)의 E-캐드헤린 발현 도관 선암종의 전형적인 조직병리학적 특징을 나타냈다(도 2c, 도 9a,b). 그러나, RANK△ mam 암컷에서 발생하는 도관의 선암종은 종종 넓은 범위의 편평상피화생을 발달시켰다(도 2c, 도 9a,b).
실시예 15: RANKL 매개된 프로게스틴 상호 의존적인 손상 후 암의 발병:
RANK△ mam는 프로게스틴-유도된 유선암에서 지연된 발병을 보여주었기 때문에. 이번에는 DMBA 시험처리 후 초기 단계에서 유선 종양의 발생빈도를 분석하였다. MPA를 다시 사용해 프로게스테론 배경(background)를 자극시켜 RANK/RANKL 시그널링을 촉발시켰다. 마지막 DMBA 처리 1주일 후, 모든 RANK 발현 대조군 암컷은 이미 다발성 상피내 암종 및 심지어 침습적 유선 종양까지도 나타내었다. 대조적으로, 마지막 DMBA 시범처리 1주일 후, RANK△ mam 동물에서는 상피내 암종은 거의 관찰되지 않았으며 침습적 유선 암종은 전혀 관찰되지 않았다(도 2d). 마지막 DMBA 시험처리 3주 후에, 상피내 암종의 발생빈도는 대조군과 RANK△ mam 암컷에서 비슷했으나, 침습적 암종은 RANK△ mam 암컷에서 여전히 매우 드물었다(도 2e). 게다가, 증식은 RANK△mam 암컷으로부터의 종양에서 전형적으로 감소하였다(도 2d,e). Mx-Cre rank flox / flox 생쥐를 사용한, 유선 상피세포가 아닌, 간, 심장, 근육, 및 조혈 부분을 포함하는 다양한 다른 조직에서 RANK의 제거는 MPA/DMBA-유도된 유선암의 발병을 현저하게 지연시키지 않았는데(도 10a-c), 이는 RANK/RANKL 손상의 효과가 유선 상피세포에서 우세함을 시사한다.
실시예 16: RANKL 시그널링 :
유선 상피에서 IKKα-NFκB-사이클린 D1를 통한 RANKL-RANK 시그널링을 도 14a에 나타내었다. RANKL 자극은 실제로 일차 생쥐 유선 상피세포(MECs)에서 p65 NFκB와 IκBα의 인산화를 야기했다(도 3a). 게다가, MEC의 RANKL 자극은 p38-MAPK 및 ERK의 인산화를 촉발시켰다(도 11b). RANK가 생체 내에서 프로게스틴의 NFκB-사이클린 D1 활성화 하류를 매개하는지 여부를 직접적으로 보여주기 위하여, 생쥐에게 MPA를 시험처리하였다. 3일 동안의 MPA 처리는 활성 NFκB 경로를 나타내는, 인산화된 IκBα의 핵 축적과, 유선 상피세포에서 사이클린 D1 단백질 발현 유도를 야기했으며, 이들 모두 RANK△ mam 암컷에서 심하게 감소하였다(도 12a,b). 게다가, 대조군과 RANK△ mam 암컷에서 분리된 MPA/DMBA-유도된 유선 선암종에서, NFκB 경로의 손상된 활성화(도 3b) 및 사이클린D1의 하향조절된 mRNA 발현을 발견하였다(도 3c). 이러한 일차 종양에서 또한 전사적으로 Id2 경로에 의해 억제되는17, p21 mRNA의 상향조절이 관찰되었다(도 3c). Id2 경로는 유선 상피세포에서 RANKL/RANK에 대해 유전적으로 확인된 두 번째 하류 경로이다17. 이러한 발견을 인간에게까지 확장하기 위하여, 인간 SKBR3 유방 종양세포를 분석하였다. RANKL 자극은 SKBR3 세포에서 NFκB, p38-MAPK, 및 ERK의 활성화 및 증식을 유도하였다(도 13a,b). RANKL 자극의 효과를 더 시험하기 위하여, 이러한 세포가 생체 내 종양 형성과 매우 연관이 있는18, 부착-비의존적 방식으로 자랄 수 있는 능력을 평가하였다. 중요하게도, EGFR 자극과 비슷하게, RANKL이 반고형 한천에서 SKBR3 세포의 성장을 유도함이 관찰되었는데(도 3d), 즉, RANK 시그널링은 증식을 촉발시킬 뿐만 아니라 부착-비의존적 성장을 유도하기 위한 형질전환 제제로서 작용한다.
파골세포에서, NFκB 경로 이외에, 칼시뉴린(calcineurin)- NFATc1 시그널링 경로가 RANKL-RANK 매개 파골세포 형성에 필수적인 것으로 발견되었다. NFATc1은 또한 RANKL 매개 파골세포 형성 동안에 Id2 경로에 의해 조절될 수 있다. 이러한 핵심적인 RANKL-RANK 활성화 경로가 또한 MPA/DMBA-유도된 유선암에서 작동 가능한 지 여부를 평가하기 위하여, 유선 상피세포에서 NFATc1과 IKKα를 제거하기 위해서 MMTV-Cre nfatc1 flox /△ (NFATc1△ mam)과 MMTV-Cre Ikkαflox / flox (IKKα△ mam) 생쥐를 생성하였다. 양쪽 돌연변이체 생쥐 종족은 건강하게 보였고, 분석한 어떠한 기관에서도 명확한 결함을 보이지 않았다. MPA/DMBA로 시험처리 했을 때, IKKα△ mam 생쥐는 유선암의 지연된 발병을 보였다(도 3e). IKKα△ mam 생쥐로부터의 종양에서 IKKβ와 IKKγ의 정상적인 발현이 발견되었으나, 증가된 IκB 단백질 수준과 감소된 p65 NFκB 인산화에 의해 결정된 바와 같은 감소된 NFκB의 활성(도 3b)과 NFκB 표적 유전자인 사이클린D1의 하향조절된 mRNA 발현(도 3c)은 IKKα가 이들 종양에서 실제로 NFκB 시그널링에 요구된다는 것을 시사한다. 예상했던 대로, Id2 경로 유전자인 p21은 IKKα△ mam 생쥐로부터의 종양에서 영향을 받지 않았다(도 3c). 대조군과 NFATc1△ mam 생쥐 사이 종양의 발병에 있어 유의미한 차이가 관찰되지 않았는데(도 13c,d), 이는 파골세포 전구체와 유선 상피세포 사이에서 하류 시그널링 요구조건이 다르다는 것을 시사한다. 그러므로, 유선 상피세포에서, NFATc1이 아닌, IKKα의 제거는 유선암의 발병에 영향을 미친다.
실시예 17: DNA 손상으로 인한 프로게스틴 -유도된 암의 발생.
세포주기 정지와 아폽토시스와 같은 DNA 손상에 대한 세포 반응에서 RANKL의 역할을 분석하기 위하여, 생쥐 일차 유선 상피세포(MEC)와 RANKL-반응성 인간 유방암 세포주 SKBR3을 DNA 손상물질인 독소루비신(doxorubicin)이나 γ-방사선조사로 처리했다. RANKL 처리는 γH2AX와 p53의 유도, 또는 기능적 DNA 손상 반응의 원형적(prototypic) 마커인 Chk1의 활성화를 변화시키지 않았다(도 14a). 게다가, RANKL은 γ-방사선조사(도 14b,c) 또는 독소루비신에 의한 DNA 손상 후 초기 세포주기 정지를 변화시키지 않았다(도 15a, b). 놀랍게도, RANKL 처리는 γ-방사선조사(도 14b,c) 및 독소루비신-유도된 DNA 손상(도 15a,b)에 대한 세포사멸로부터 뚜렷한 보호를 초래하였다. 기전적으로, 전-아폽토시스 분자인 Bim, Puma, 및 Noxa의 γ-방사선조사-유도된 상향조절은 RANKL의 존재 시에 일어나지 않았다(도 15c). 암컷 생쥐의 γ-방사선조사가 유선 상피세포의 아폽토시스의 5배 유도를 초래함이 생체 내에서 확인되었다19. 그러므로, 이전에 확립된 이러한 시스템을 γ-방사선조사-유도된 세포사멸에 대한 MAP-RANKL/RANK 축의 효과를 평가하기 위하여 사용하였다. MPA(프로게스틴) 유도된 RANKL/RANK는 생체 내 유선 상피세포를 γ-방사선조사-유도된 아폽토시스로부터 실제로 보호하였다. 유선 상피세포에 대한 RANK 발현의 손실은 γ-방사선조사-유도된 세포사멸에 대한 MPA의 보호 효과를 제거하였다(도 3f,g). 게다가, IKKα 경로는 γ-방사선조사 후 유선상피의 MPA-유도된 보호에 관여 하였다(도 16a,b). 따라서, 세포주기 진행을 촉진하는 것에 더하여, MPA는 RANKL/RANK 및 IKKα 시그널링을 통하여 DNA 손상 후 세포사멸로부터 보호할 수 있다.
실시예 18: 유방암 환자에서 진단 마커로서 RANKL :
본 명세서에 제시한 결과는 프로게스틴이 RANKL/RANK를 유도할 수 있고, 이것이 유방암으로 이어질 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 연구를 유방암 환자에서 확인하기 위하여 전향적인 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사)에 참여하는 여성에서 RANKL과 프로게스테론의 혈청 수준을 분석하였다(실시예 9). 코호트는 유방암의 징후가 나타나기 전에 가용성 RANKL, 프로게스테론, 및 OPG의 혈청 수준의 변화를 연구하는 특별한 기회를 제공했다. 놀랍게도, 대조군 여성에서는 프로게스테론 수준과 혈청 RANKL 수준 사이 상관관계가 없는 반면에, 혈청 수집 후 12-24개월에 유방암이 발병한 여성에서는 통계학적으로 유의미한 상관관계가 있었다(p = 0.047, 스피어맨 순위 검정) (도 4a). 사실, 높은 프로게스테론 그룹 내에 있는 여성들 중에서, 혈청 RANKL은 유방암으로 발병하려고 하는 그룹에서 현저하게 높다(p=0.01, 단측 윌콕슨 순위검정) (도 4a). 그러므로, RANKL의 높은 혈청 수준과 높은 혈청 프로게스테론은 미래에 유방암의 발병을 예측하는 데 사용할 수 있다.
혈청 시료를 얻은 후 5-12개월 후에 유방암이 발병한 여성에서의 상관관계는 달랐다. 대신에, 이러한 그룹은 sRANKL과 OPG의 혈청 수준에서 유의미한 변화를 보여 주었으며, 이는 유방암이 발병할 미래의 가능성과 관련이 있었다(도 4b; 도 17a). 유방암으로 발병하지 않거나 혈청 시료를 채취한 후 12-24개월 사이에 유방암이 발병한 UKCTOCS(영국 공동 임상시험 난소암 선별검사) 참가자에서는 OPG와의 이러한 변화가 발견되지 않았다(도 4c; 도 17b).
RANKL/OPG에서 이러한 혈청 변화는 직관에 반하는(counterintuitive) 것으로 보인다. 하지만, 이런 발견은 이전의 결과와 같은 맥락이다. 예를 들면, 골다공증 환자에서 병이 생긴 뼈의 RANKL mRNA 수준은 뼈의 파괴와 양성적인 상관관계가 있으나, 혈청 RANKL 수준과는 역 상관관계에 있다고 보고되었다11. 게다가, 혈청 RANKL 수준과 골다공증에서 비슷한 현상이 나타났다: 낮은 혈청 RANKL 수준은 폐경기 여성에서 비창상성 골절의 10배 더 높은 위험성과 관련이 있다20. 게다가, 폐경기 여성에서 증가한 OPG는 호르몬 대체요법에 대한 것이 아닌, 증가한 뼈 손실과 관련이 있다21. 유방암에서 이러한 혈청 변화의 기전은 체내의 다른 부위 내에서 발달하는 미세종양 및/또는 RANKL/OPG의 재분포/격리에 대해 보상적 기전을 반영할 수 있다. 진단 또는 예후에서 결과가 오역되는 것을 피하기 위해 음성 대조군(암이 발병하지 않는 환자)에 대해 양성(암이 발병한 환자)인 시료 결과를 비교하는 것이 바람직하다.
실시예 19: 토론:
이러한 결과에 기반하여 어떻게 MPA와 같은 프로게스틴이 유방암을 유도하는지에 대한 다음의 분자적 시나리오가 분명하다. 프로게스테론과 프로게스틴( 및 폐경 전에서와 같이 내재적인 프로게스테론의 강한 탈조절)은 유선에서 가장 중요한 RANKL의 유도를 촉발한다. 유선 상피세포에서 RANK를 통한 RANKL은 이러한 세포를 세포주기로 유도하며, 중요하게는, 생쥐뿐만 아니라 인간 유선 상피세포를 γ-방사선조사를 포함한 DNA 손상에 대한 아폽토시스로부터 보호한다. 게다가, RANKL/RANK는 유선암 줄기세포의 자가 재생 및 부착-비의존적 성장을 조절한다. 그러므로, 프로게스틴-유도 RANKL/RANK는 유선암을 일으키는 전제조건인 손상된 유선 상피에 유리한 성장과 생존을 제공한다22. 이러한 효과는, 적어도 부분적으로 IKKα-NFκB 시그널링 전달 경로를 통해 매개된다.
이들 결과는 약간 흥미로운 함축된 의미를 갖는다. 예를 들면, 프로게스틴은 비정상적인 유방조영상(mammogram)을 가질 증가된 위험과 관련이 있어 왔다23. 유방조영상은 미세-칼슘 침착뿐만 아니라 선(glandular) 밀도를 검출하고, RANKL/RANK는 뼈 대사/미네랄화에 중요한 역할을 담당하기 때문에12 ,13, RANKL/RANK에 이러한 병변의 칼슘 침착 및/또는 선 밀도의 칼슘 침착에 기여할 것이라고 추측할 수 있을 것이다. 이러한 사실은 명백한 유방암 시작의 전 5-12개월과 후에 여성의 혈청에서 변화된 RANKL/OPG 비율이 발견되었기 때문에 흥미로운데, 이는 암의 검출을 위해 RANKL/OPG 혈청 수준이 유용한 생물학적 지표임을 입증하는 것이다. 본 명세서의 결과는 또한 증가한 RANKL과 프로게스테론의 혈청 수준이 종양이 진단되기 전 12-24개월에 미래의 유방암을 예측할 수 있다는 것을 보여준다. 수많은 여성은 프로게스테론 유도체를 피임제와 호르몬 대체요법을 위해 복용한다. 이러한 호르몬은 유방암 발병의 증가된 위험과 역학적으로 연결되어 왔다.
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Claims (13)

  1. 환자의 시료 내에 RANKL 활성 및/또는 OPG의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 암을 검출하거나 암이 발생할 환자를 예측하거나 암으로 고통받는 환자에서 암의 진행률을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, RANKL 활성이 시료 내에 RANKL 및/또는 RANK의 양을 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, RANKL 활성이 RANK, IKK-알파, IkB-알파, P-NF-카파-B, 사이클린D1 중 어느 하나의 시그널링을 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 환자의 세포, 특히 유방 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 세포가 프로게스테론 수용체, 에스트로겐 수용체로부터 선택된, 바람직하게는 ESR1, ESR2 또는 헤테로다이머 수용체로부터 선택된 호르몬 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, RANKL이 상기 환자의 혈청 시료 내에서 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 호르몬에 의해 치료되거나, 바람직하게는 프로게스테론 또는 프로게스틴을 이용하여 바람직하게는 호르몬 대체 요법을 받거나, 또는 호르몬 피임제를 이용하여 치료되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 시료 내에 월경 주기의 호르몬 또는 이의 기능적 유도체 또는 RANKL 리간드, 바람직하게는 생체내 RANKL의 농도에 의해 조절되는 RANKL 리간드 또는 RANKL 조절성 단백질의 혈청 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 시료 내에 프로게스테론 및/또는 프로게스틴 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 유방암이 발생할 위험이 RANKL 활성 및 프로게스테론 및/또는 프로게스틴 수준의 값 적어도 둘 모두에 의해서 추정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 환자의 시료 내에, 바람직하게는 혈청 시료 내에 오스테오프로테게린의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 특히 바람직하게는 신규-발병한 유방암이 RANKL에 대한 오스테오프로게린의 비율을 결정함으로써 진단되거나 예측되는 것인 방법.
  13. RANKL에 대한 검출제, 및 생리학적 RANKL 리간드, 특히 OPG, 및/또는 프로게스틴에 대한 검출제 중 하나를 포함하는 키트.
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