PT1244790E - Ácidos nucleicos que codificam (poli)péptidos possuindo uma actividade de chips - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Ácidos nucleicos que codificam (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS" 0 presente invento refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica um (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS. 0 invento refere-se ainda à utilização da informação contida no ácido nucleico para a preparação do correspondente (poli)péptido e aos vectores e hospedeiros para utilização nesse sentido. Além disso, o invento refere-se a moléculas não (poli)peptidicas que possuem uma estrutura e função similares aos (poli)péptidos. 0 (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS que é codificado pela molécula de ácido nucleico do invento pode ser utilizado no tratamento de reacções inflamatórias. Os (poli)péptidos e os não (poli)péptidos podem, adicionalmente, ser utilizados para inibir a activação dos leucócitos e das células endoteliais.

Os leucócitos estão envolvidos principalmente na protecção do corpo contra invasores estranhos (por exemplo, bactérias, virus, fungos e células cancerosas) . As células mais importantes são os linfócitos, os monócitos e os neutrófilos. Os linfócitos constituem o sistema imunitário especifico e provocam reacções imunitárias contra os invasores. A sua tarefa mais importante consiste em

desenvolver gradualmente uma memória específica contra o invasor para que, da próxima vez que o invasor entre no corpo, seja rapidamente reconhecido, morto e removido. Por vezes estes linfócitos não só atacam os invasores, como também reagem contra determinadas estruturas e/ou moléculas do próprio corpo (os denominados auto-antigénios), causando doenças auto-imunes (por exemplo, a artrite reumatóide). A morte e remoção dos invasores são levadas a cabo principalmente pelos monócitos e neutrófilos, células do sistema imunitário inato, através do reconhecimento directo dos invasores ou com o auxílio de linfócitos específicos.

Em contraste com a delicada rede de reacções ajustadas e controladas dos linfócitos, as células do sistema inato reagem de uma forma agressiva e relativamente não específica. Uma vez que elas fazem parte da primeira linha de defesa do 2 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ corpo, a sua tarefa mais importante consiste em matar e remover o agente invasor o mais rapidamente possível. Isto é conseguido por meio de substâncias muito agressivas (por exemplo, radicais livres e enzimas) que não só são letais para o invasor, como também provocam danos nas células circundantes do hospedeiro. As substâncias provenientes destas células danificadas e as células activadas localmente do próprio sistema inato atrairão adicionalmente números crescentes de neutrófilos e monócitos, causando uma inflamação local. Na maioria dos casos, esta reacção inflamatória agressiva e prejudicial, causada por neutrófilos sobreactivados, é desnecessária. Em alguns casos, esta resposta inflamatória é responsável por perturbações graves, por vezes letais, e inclui condições como a síndrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), lesões graves dos tecidos após eventos trombóticos como ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais, doenças inflamatórias do intestino e a artrite reumatóide. A inflamação abrandará quando todos os invasores forem mortos e removidos, juntamente com as várias células mortas no processo. A cicatrização da ferida, que foi causada pela resposta inflamatória, pode então ter início. Embora haja alguma sobreposição de funções, a tarefa principal dos neutrófilos consiste em atacar os invasores e a tarefa principal dos monócitos consiste em remover os detritos resultantes deste ataque. Além disso, os neutrófilos têm outra tarefa pacífica no auxílio ao processo de cicatrização da ferida.

Quando as bactérias invadem o corpo e, por exemplo, infectam o sistema nervoso central (como acontece na meningite), elas começam a produzir substâncias microbianas, incluindo os polipéptidos formilados (como o péptido fMLP). Outras substâncias de origem microbiana activam o complexo enzimático da convertase do factor 5 (C5) do complemento, que converte C5 do sistema do complemento na sua forma C5a activada. Tanto C5a como fMLP são quimioatractores: substâncias que podem activar e atrair células dos vasos sanguíneos (o processo de migração). Os neutrófilos respondem a estas duas substâncias e também à interleucina-8 (IL—8) . Esta "quimiocina" (a designação atribuída aos quimioatractores que são produzidos por células do sistema imunitário) é produzida principalmente pelos monócitos 3 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ activados (mas também em quantidades diminutas pelos próprios neutrófilos activados). Os neutrófilos interagem com estas substâncias, pois têm receptores para elas no exterior da sua membrana celular.

Os neutrófilos activados podem migrar facilmente a partir dos vasos sanguíneos. Isto acontece porque os quimioatractores, os produtos microbianos e as substâncias provenientes dos monócitos activados já terão aumentado a permeabilidade dos vasos e estimulado as células endoteliais das paredes dos vasos para expressar determinadas moléculas de adesão. Os neutrófilos expressam selectinas e integrinas (por exemplo, CDllb/CDl8) que se ligam a estas moléculas de adesão. Uma vez o neutrófilo aderido às células endoteliais, ele é capaz de migrar através das células, sob a orientação de quimioatractores/quimiocinas, até ao local da infecção, onde a concentração destas substâncias está no seu nível mais elevado. Estas substâncias também activam os neutrófilos para produzir uma variedade de outras moléculas, algumas das quais atraem mais neutrófilos (e subsequentemente monócitos), mas elas são principalmente responsáveis por destruir as bactérias invasoras. Algumas destas substâncias (por exemplo, radicais livres, enzimas que degradam proteínas (proteases) e membranas celulares (lipases)) são tão reactivas e inespecificas que as células do tecido circundante (e os próprios neutrófilos) são destruídas, provocando danos nos tecidos. Estes danos são exacerbados pela presença de líquido derivado do sangue, que ultrapassou a parede do vaso vazante e é responsável pelo inchaço que sempre acompanha a inflamação (denominado edema). 0 aumento da pressão causado por este excesso de líquido resulta em danos celulares adicionais e morte.

Posteriormente no processo inflamatório, os monócitos migram até à cena e ficam activados. Além do seu papel na remoção de bactérias e detritos celulares, eles também produzem substâncias como o factor de necrose tumoral (TNF de "Tumor Necrosis Factor") e a IL-8 que, pelo seu lado, atraem mais neutrófilos activados, causando mais danos locais. 0 TNF também tem um efeito estimulador directo sobre os neutrófilos. Após a remoção de todos os invasores, a resposta inflamatória abrandará, e a área será limpa das restantes 4 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ "vítimas". Em seguida, tem início o processo de cicatrização da ferida. Embora se saiba que os neutrófilos desempenham um papel central na cicatrização da ferida, não é claro quais as substâncias suas derivadas que estão envolvidas e a forma como os neutrófilos são activos na cicatrização sem serem agressivos para o tecido circundante. Em geral, o tecido danificado será substituído por tecido cicatrizante constituído essencialmente por fibroblastos e colagénio. Quando ocorre inflamação em áreas do corpo com uma função importante, como sejam os tecidos formados a partir de células do músculo cardíaco, as células do cérebro ou as células alveolares dos pulmões, a função normal ficará comprometida pela formação da cicatriz resultante, originando condições graves como insuficiência cardíaca, paralisia e enfisema. Para minimizar as consequências debilitantes destas condições, é importante "amortecer" a reacção inflamatória o mais rapidamente possível. A intervenção para controlar a resposta inflamatória aguda de fase precoce representa uma oportunidade para melhorar o prognóstico de uma grande variedade de doentes cujos sintomas podem remontar a um evento deste tipo. Esta abordagem tem sido defendida para muitas doenças baseadas na inflamação crónica e aguda e o seu potencial demonstrado através de resultados provenientes de modelos de doenças relevantes. Os fármacos anti-inflamatórios clássicos, como sejam os fármacos anti-inflamatórios esteróides e não esteróides (aines), não têm o perfil de acção ideal, quer em termos de eficácia quer em termos de segurança. Os esteróides afectam o tipo "errado" de células (monócitos) e os seus efeitos "amortecedores" são facilmente contornados. Os AlNEs geralmente apresentam um efeito relativamente suave, em parte porque intervêm numa fase tardia do processo inflamatório. Ambas as classes de fármacos produzem uma série de efeitos secundários indesejáveis resultantes de outros aspectos da sua actividade farmacológica. Os fármacos que actuam directa e especificamente para impedir a migração e activação dos neutrófilos poderão ter algumas vantagens, vários fármacos em fase de desenvolvimento inicial apenas interferem com um aspecto individual da activação (por exemplo, inibidores da convertase de 05, anticorpos contra C5a, fármacos bloqueadores dos receptores de C5a) e da migração (anticorpos 5 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ contra as integrinas (como CDllb/CDl8) e a selectina L nos neutrófilos e anticorpos contra as moléculas de adesão (como ICAM-1 e selectina E) nas células endoteliais) dos neutrófilos. Os anticorpos contra TNF e IL-8 têm efeitos na inflamação crónica, mas apenas efeitos marginais na inflamação aguda, devido ao papel mínimo que os monócitos (que são essencialmente responsáveis pela produção destas substâncias) desempenham na fase aguda.

Algumas vezes, a causa da inflamação aguda não pode ser removida e a inflamação torna-se crónica. Com excepção da tuberculose, da hepatite crónica e de algumas outras condições, este raramente é o caso das infecções. Contudo, a inflamação crónica também pode ser causada por estímulos diferentes de bactérias, tais como as reacções auto-imunes. A investigação mostrou que, na inflamação crónica, o papel dos monócitos é muito mais proeminente, e que a migração e activação dos neutrófilos, a migração e activação dos monócitos, os danos nos tecidos, a remoção de células mortas e a cicatrização da ferida estão todos a decorrer ao mesmo tempo. Esta cascata complexa de interacções entre as células e muitas citocinas e quimiocinas diferentes tem sido objecto de pesquisa intensa há muitos anos. Acreditava-se que os monócitos e os seus produtos eram os elementos mais importantes que importava inibir para amortecer a inflamação crónica. Isto explica a razão de os esteróides, que interagem especificamente com os monócitos, serem geralmente mais eficazes na inflamação crónica em oposição à inflamação aguda. Contudo, o tratamento a longo prazo com esteróides não é uma opção desejável, pois podem verificar-se efeitos secundários graves e inaceitáveis às doses necessárias para produzir um efeito clínico. Tratamentos mais recentes que utilizam anticorpos contra tnf ou il-8 apresentaram bons resultados e foram inicialmente considerados como prova do papel fundamental que, segundo se acreditava, os monócitos desempenham na inflamação crónica. A investigação recente levanta dúvidas quanto ao papel exclusivo dos monócitos na inflamação e aponta para um papel crítico dos neutrófilos, que são actualmente vistos como melhores alvos para uma intervenção terapêutica. 6 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ A causa subjacente a uma condição inflamatória crónica nem sempre é clara, e a causa original poderá nem sempre ser responsável pela recorrência futura. Alguns cientistas acreditam que, em determinadas doenças inflamatórias crónicas, existe um ciclo continuo de eventos. A sua ideia consiste no facto de os neutrófilos e monócitos activados existentes atraírem e activarem continuamente novos grupos de células, perpetuando, assim, a resposta inflamatória mesmo quando o estimulo inicial deixa de estar presente. Isto sugeriria que um tratamento agudo ou periódico com um inibidor eficaz da activação dos neutrófilos e monócitos interromperia o ciclo de recrutamento de novas células, conduzindo, na altura própria, a uma modificação da progressão da doença, ou mesmo a uma cura total, e não apenas ao alívio sintomático.

Na pesquisa que conduziu ao presente invento, encontrou-se um novo agente com propriedades inibidoras da inflamação no meio extracelular de Staphylococcus aureus (S. aureus) em crescimento. Este agente é o objecto do pedido co-pendente PCT/NL99/00442. Verificou-se que o agente é capaz de, directa ou indirectamente, bloquear diferentes receptores de quimiocinas. A incubação de diferentes células com o meio resultou numa grande redução da expressão de vários dos receptores de quimiocinas: tanto da expressão de receptores de agentes quimiotácticos clássicos, como fMLP e C5a, nos granulócitos, como da expressão dos receptores CXCR4 e CCR5 nos linfócitos, monócitos e macrófagos. A expressão reduzida dos receptores foi relacionada com uma quimiotaxia grandemente reduzida em relação às quimiocinas, assim como com uma infecção reduzida com o VIH. A actividade da proteína já é evidente no sobrenadante de cultura de S. aureus em crescimento. A proteína activa poderia ser subsequentemente purificada, por exemplo, por meio de algumas colunas de corantes. Efectuou-se inicialmente uma pré-purificação numa denominada "coluna amarela" (coluna de esferas de agarose reticulada a 4% com corante "Reactive Yellow 86" (Sigma)), seguida de uma coluna de cromatografia de absorção (a chamada "coluna verde" (coluna de esferas de agarose reticulada a 4% com corante "Reactive Green 19" (Sigma)) e uma coluna de ADN (DNA Cellulose (Pharmacia)). As 7 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ duas últimas colunas podem alternar-se. A coluna de ADN remove um contaminante com o mesmo peso molecular da proteína. A coluna de cromatografia de absorção concentra a proteína e é selectiva para a proteína. Finalmente, também tem lugar uma pós-purificação por meio de cromatografia de filtração em gel e permuta aniónica (MonoQ, Pharmacia). Na filtração em gel, a proteína com o peso molecular de aproximadamente 17 kDa é seleccionada. Esta é a proteína que se verificou possuir propriedades inibidoras da quimiotaxia. Como é isolada do sobrenadante de Staphylococcus aureus e proporciona uma inibição da quimiotaxia, esta proteína foi designada por "CHIPS": "CHemotaxis Inhibitory Protein from Staphylococcus aureus (proteína inibidora da quimiotaxia de Staphylococcus aureus) (aqui também designada por "CHIPS original"). 0 isolamento da proteína CHIPS a partir do sobrenadante de S. aureus não é muito rentável. Além disso, para a utilização prática da proteína CHIPS em terapia, é desejável que a parte activa da proteína seja isolada. As moléculas mais pequenas de proteínas ou de péptidos apresentam um risco menor de induzir uma resposta imunológica num sujeito que está a receber a proteína ou o péptido em termos terapêuticos. Ademais, é desejável poder modificar a proteína ou o péptido para aumentar adicionalmente a sua actividade biológica e/ou reduzir a sua imunogenicidade. 0 objectivo do presente invento consiste, por conseguinte, em proporcionar o meio para produzir a proteína CHIPS original ou outros (poli)péptidos correspondentes que possuem uma actividade de CHIPS, bem como fragmentos, derivados ou análogos funcionais destes, sem ser por isolamento a partir da células hospedeira produtora natural. 0 presente invento disponibiliza, assim, uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS, em que a referida sequência nucleotídica corresponde a uma sequência seleccionada entre o grupo que consiste em: a) uma sequência nucleotídica compreendendo pelo menos parte da sequência representada na Figura 4 (SEQ ID NO 4); 8 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ b) sequências nucleotídicas que codificam um (poli)péptido possuindo a actividade de CHIPS e possuindo a sequência de aminoácidos representada na Figura 5 (SEQ ID NO 5); c) sequências nucleotídicas que têm pelo menos 40% de identidade com qualquer uma das sequências nucleotídicas a) ou b) ; d) sequências nucleotídicas que hibridam em condições de estringência com qualquer uma das sequências nucleotídicas a), b) ou c) e e) sequências nucleotídicas complementares de qualquer uma das sequências nucleotídicas a), b), c) ou d), em que as condições de estringência no passo d) consistem em hibridação durante a noite a 42°C em SSC 5x e lavagem a 65°C em SSC 0,lx, e em que a actividade de CHIPS é a capacidade para comprometer especificamente a ligação ligando-(C5a ou fMLP).

Relativamente à identidade ou homologia como referida em d), é de notar que, no caso dos alinhamentos com lacunas, os parâmetros estatísticos podem ser estimados utilizando o algoritmo de Smith-Waterman que produz pontuações de alinhamentos óptimos. Os homólogos da sequência de ácido nucleico ou da sequência proteica CHIPS são definidos por uma penalidade de abertura de lacuna ("Gap Open Penalty") de pelo menos 12 e uma penalidade de extensão de lacuna ("Gap Expression Penalty") de pelo menos 1. A "actividade de CHIPS" é aqui definida como a capacidade para comprometer especificamente pelo menos as respostas induzidas por ambas as espécies fMLP e C5a, incluindo pelo menos o comprometimento da ligação ligando-(C5a ou fMLP) e, opcionalmente, o comprometimento da quimiotaxia e da activação celular (por exemplo, mobilização do cálcio). Contudo, os (poli)péptidos poderão ter ainda outras actividades biológicas, tais como um efeito inibidor sobre a activação dos leucócitos e das células endoteliais. 9 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ

Na descrição que se segue, os termos "proteína CHIPS" e "gene CHIPS" ou "gene chp" são utilizados para a proteína isolada a partir do sobrenadante de S. aureus de ocorrência natural e para o seu gene isolado, respectivamente. Os termos "(poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS" e "molécula de ácido nucleico que codifica um (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS" são utilizados para todos os outros (poli)péptidos e moléculas de ácido nucleico correspondentes que estão de alguma forma relacionados com, ou derivam de, a proteína ou o gene CHIPS, mas que possuem uma sequência de aminoácidos ou nucleótidos que não é idêntica a essas. A actividade de CHIPS tal como definida acima é uma característica inerente a estes (poli)péptidos. Este efeito será demonstrado para a proteína CHIPS no Exemplo 5. A sequência fornecida na Figura 4 (SEQ ID NO 4) é a sequência de ADN isolada de acordo com o invento. Ela compreende uma região promotora dos nucleótidos 1 a 40, uma sequência "leader" dos nucleótidos 41 a 124, a região codificante do (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS dos nucleótidos 125 a 490, assim como uma região não traduzida 3' dos nucleótidos 491 a 603.

Numa primeira concretização do invento, a molécula de ácido nucleico isolada possui uma sequência nucleotídica que corresponde aos nucleótidos 1 a 490 da Figura 4. Numa concretização alternativa, a região promotora já não está presente. Nesta concretização, a sequência nucleotídica da molécula de ácido nucleico corresponde aos nucleótidos 41 a 490 da Figura 4. Com esta molécula de ácido nucleico, é possível utilizar um promotor diferente e/ou outras sequências reguladoras da transcrição. A escolha de um promotor e/ou de outras sequências reguladoras depende das condições em que a transcrição terá lugar. Um perito na arte é capaz de seleccionar regiões promotoras e/ou outras regiões reguladoras da transcrição adequadas. O gene CHIPS isolado da Figura 4 ou qualquer ácido nucleico derivado a partir dele poderá, por exemplo, estar ligado funcionalmente ao sistema de expressão trc (Brosius et al., Gene 27:161-172 (1984)). Muitas outras sequências de controlo da expressão, bem como métodos de expressão de 10 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ proteínas recombinantes adequados são conhecidos (F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John

Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y.). A sequência nucleotídica apresentada na Figura 4 também contém uma sequência "leader". A região codificante da proteína madura corresponde aos nucleótidos 125 a 490 da Figura 4. É possível utilizar outras sequências "leader". Ou a sequência "leader" poderá ser inteiramente omitida, dependendo da célula hospedeira em que a sequência será expressa. A sequência de aminoácidos na Figura 5 é deduzida a partir da sequência de ADN da Figura 4. Numa concretização adicional do invento, a molécula de ácido nucleico poderá, assim, ter uma sequência nucleotídica que corresponde a todas as variantes degeneradas do gene CHIPS isolado.

Encontram-se aqui também descritas moléculas de ácido nucleico que codificam (poli)péptidos que não possuem a sequência completa da Figura 5, e sim uma ou mais porções funcionais desta que, individualmente ou em conjunto, constituem um (poli)péptido biologicamente activo possuindo uma actividade de CHIPS. Estas porções poderão variar em termos de tamanho, indo desde a sequência completa de aminoácidos menos um aminoácido até péptidos com pelo menos 2, preferencialmente pelo menos 5 aminoácidos. No caso da parte activa da proteína se situar em duas ou mais porções da sequência de aminoácidos completa, as sequências de ácido nucleico poderão codificar estas porções separadas de um modo conducente a uma configuração do péptido que retém a actividade biológica. Na prática, isto pode significar, por exemplo, a necessidade de incorporar sequências espaçadoras entre as porções biologicamente activas para conduzir a uma conformação biologicamente activa.

Assim, quando se faz referência a "pelo menos parte da sequência", isto significa não só as três partes descritas acima (isto é, os nucleótidos 1-490, 41-490 e 125-490), como também outros fragmentos do gene ou suas combinações desde que ainda codifiquem um (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS. 11 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ

Encontra-se aqui também descrita uma molécula de ácido nucleico isolada do invento que consiste na região codificante de uma ou mais porções da sequência de aminoácidos da Figura 5, em que uma porção da sequência de aminoácidos constitui, sozinha ou com outras porções da sequência de aminoácidos, a(s) região(ões) do (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS que conduzem à actividade biológica. 0 presente invento não está limitado a moléculas de ácido nucleico que possuem a mesma sequência exacta da sequência representada na Figura 4 ou às suas variantes acima descritas. Deste modo, de acordo com o invento, disponibilizam-se moléculas de ácido nucleico adicionais possuindo uma sequência nucleotidica que tem pelo menos 40% de identidade, preferencialmente pelo menos 50% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 60% de identidade, ainda mais preferencialmente pelo menos 70% de identidade, muito preferencialmente pelo menos 80% de identidade e, muito mais preferencialmente, pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das sequências nucleotidicas definidas em a), b) ou c) acima.

Constatou-se que a proteína CHIPS possui uma homologia inferior a 40% com as proteínas e péptidos conhecidos até ao momento. As proteínas e péptidos que apresentam uma homologia de aminoácidos de pelo menos 40% com a proteína CHIPS e possuem uma actividade de CHIPS fazem também, assim, parte deste invento. O invento refere-se adicionalmente a moléculas de ácido nucleico possuindo uma sequência nucleotidica que híbrida, em condições de estringência, com uma molécula de ácido nucleico correspondente à sequência nucleotidica fornecida na Figura 4, ou suas sequências degeneradas, que codificam uma sequência de aminoácidos tal como apresentada na Figura 5. As condições de estringência são constituídas por hibridação durante a noite a 42°C em SSC 5x (SSC = NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM) e lavagem a 65°C em SSC 0,lx. Além de SSC 5x, a solução de hibridação poderá compreender formamida a 50%, fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, 12 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão desnaturado e fragmentado 20 μς/ιηΐ.

As moléculas de ácido nucleico aqui descritas não estão limitadas ao gene que codifica o (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS, referindo-se também a moléculas de ácido nucleico que codificam fragmentos, derivados e análogos deste. O termo "fragmentos" pretende englobar todas as partes do (poli)péptido que conservam a sua actividade biológica. Os "fragmentos" podem consistir em uma sequência de aminoácidos consecutivos ou em mais de uma destas sequências. Os "derivados" são o (poli)péptido completo possuindo uma actividade de CHIPS ou fragmentos deste que estão modificados de alguma forma. Os exemplos de modificações seguir-se-ão abaixo. Os "análogos" são (poli)péptidos similares possuindo uma actividade de CHIPS isolados de outros organismos, em particular outros organismos patogénicos. Todas as categorias acima têm uma coisa em comum, nomeadamente o facto de terem "actividade de CHIPS". A actividade de CHIPS pode ser medida por meio de qualquer ensaio que mostre a migração dirigida dos leucócitos na direcção de um estimulo quimiotáctico apropriado. Os exemplos destes ensaios incluem a técnica em agarose (como exemplificada em Balasoiu et al., Diabetes Care 20:392-395 (1997)), as técnicas da câmara de Boyden modificada e os sistemas de migração Transwell. A última técnica está adicionalmente ilustrada nos exemplos.

Por conseguinte, para o presente pedido, o termo " (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS" pretende incluir a proteína CHIPS original, (poli)péptidos, fragmentos, derivados e análogos que exibem uma actividade de CHIPS. A molécula de ácido nucleico isolado de acordo com o invento poderá ser um ADN, um ARN ou um ADNc.

Eencontram-se aqui adicionalmente descritas sondas e iniciadores derivados da molécula de ácido nucleico do invento. Estes iniciadores são oligonucleótidos ou polinucleótidos com pelo menos cerca de 10 nucleótidos (nt) consecutivos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25 nt, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 30 nt e 13 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ ainda mais preferencialmente cerca de 30-70 nt da molécula de ácido nucleico do invento. As sondas são mais compridas e poderão, por exemplo, ser uma porção da molécula de ácido nucleico do invento com 50-300 nt consecutivos, ou mesmo tão comprida quanto a molécula de ácido nucleico completa.

Estes oligonucleótidos ou polinucleótidos são úteis como sondas de diagnóstico, como sondas em técnicas convencionais de hibridação de ADN ou como iniciadores para a amplificação de uma sequência-alvo por meio da reacção em cadeia da polimerase (PCR de "Polymerase Chain Reaction") como descrito, por exemplo, em Ausubel et al. (supra).

Além disso, o invento refere-se a um vector recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada do invento. O vector a utilizar pode ser seleccionado pelo perito na arte com base no seu conhecimento geral e estará dependente do hospedeiro que é utilizado.

Encontram-se aqui também descritos bacteriófagos que compreendem pelo menos um ácido nucleico isolado do invento. Na maioria dos estafilococos positivos para CHIPS, o gene que codifica a proteína CHIPS está localizado num profago e pode ser transformado num fago activo, por exemplo, por tratamento com mitomicina de acordo com procedimentos normalizados e publicados para o isolamento de fagos. Um bacteriófago é, deste modo, um veículo útil para introduzir o gene CHIPS num hospedeiro.

Adicionalmente, o invento refere-se a um método de preparação de um vector recombinante, que compreende a introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada do invento num vector. Ao incorporar mais de uma cópia no vector, ou ao introduzir mais de um vector num hospedeiro, o nível de expressão pode ser influenciado. Quando se utiliza uma célula hospedeira que compreende um gene endógeno para um (poli)péptido correspondente possuindo uma actividade de CHIPS, o nível de expressão deste pode ser aumentado através da introdução de mais cópias da molécula de ácido nucleico (isto é, o gene) na célula hospedeira ou da alteração da região promotora ou reguladora. 14 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ

Assim, ο invento refere-se também a hospedeiros recombinantes compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada ou vector do invento. Vários tipos de células poderão actuar como hospedeiros adequados para a expressão dos (poli)péptidos recombinantes possuindo uma actividade de CHIPS. As células hospedeiras incluem a estirpe bacteriana amplamente utilizada Escherichia coli incluindo, embora não limitado a este, o sistema de expressão trc (Brosius et al., supra) que permite um nível elevado de expressão regulada a partir do promotor trc. Outras estirpes bacterianas possivelmente adequadas incluem estirpes bacterianas Gram-positivas, tais como Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ou qualquer estirpe bacteriana capaz de expressar proteínas heterólogas. Um processo de produção preferido em E. coli é fornecido no Exemplo 6. 0 (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS poderá também ser produzido como uma proteína recombinante, utilizando um sistema de expressão adequado que faz uso de eucariotas inferiores, tais como a levedura ou células de insecto. As estirpes de leveduras apropriadas incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Candida ou qualquer estirpe de levedura capaz de expressar proteínas heterólogas. As células de insecto utilizadas para a expressão de proteínas recombinantes incluem o sistema Drosophila e o sistema do baculovírus. Em alternativa, poderá ser possível produzir o (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS num sistema de expressão mamífero que inclui várias células hospedeiras adequadas, incluindo as células COS de macaco, as células CHO ou BHK de hamster, as células RBL-2H3, as células 293 humanas, as células 3T3, HeLa, U937, HL-60 ou Jurkat, as células L de ratinho e outras células transformadas para cultura in vitro. Para a expressão de (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS em sistemas eucarióticos, poderá ser necessário modificar a proteína aí produzida para obter uma proteína funcional. Estas modificações, tais como ligações ou substituições, poderão ser obtidas utilizando métodos químicos ou enzimáticos conhecidos. Adicionalmente, a sequência da molécula de ácido nucleico poderá ser adaptada à utilização de codões da célula hospedeira. 15 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ Ο (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS também poderá ser expresso como um produto de animais transgénicos, por exemplo, como um componente do leite de vacas, cabras, porcos, ovelhas, coelhos ou ratinhos transgénicos, que são caracterizados por células somáticas ou germinais contendo uma sequência nucleotidica que codifica o (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS. 0 (poli)péptido poderá ser preparado mediante crescimento das células hospedeiras transformadas em condições de cultura adequadas para expressar a proteína recombinante. A proteína resultante poderá então ser purificada a partir do meio de cultura ou de extractos celulares, utilizando um processo de purificação que compreende, por exemplo, os passos de dirigir para uma coluna de cromatografia de absorção o sobrenadante de cultura da célula hospedeira ou um líquido obtido a partir dele após pré-purificação; subsequentemente dirigir o fluxo de passagem da coluna de cromatografia de absorção, primeiro, para uma coluna de cromatografia de afinidade e, em seguida, dirigir o eluato da coluna de cromatografia de afinidade para uma coluna de ADN; ou subsequentemente dirigir o fluxo de passagem da coluna de cromatografia de absorção, primeiro, para uma coluna de ADN e, em seguida, dirigir o fluxo de passagem da coluna de ADN para uma coluna de cromatografia de afinidade; dirigir o fluxo de passagem ou o eluato, respectivamente, da última coluna do passo anterior para uma coluna de filtração em gel e uma coluna de permuta aniónica, seleccionando a fracção com um peso molecular de cerca de 17 kDa e actividade de CHIPS. 0 termo "fluxo de passagem" designa aqui aquela parte do líquido carregado na qual estão presentes os constituintes que saem da coluna sem qualquer tratamento adicional. Os constituintes neste fluxo de passagem não se ligam à coluna. 0 termo "eluato" designa o líquido que sai da coluna após a eluição, e que contém os constituintes do líquido carregado na coluna que estiveram presos à coluna e que foram depois libertados dela pela eluição. Neste método, a coluna de absorção liga a maioria dos constituintes do meio de cultura carregado ou de um líquido obtido a partir deste após pré-purificação. A coluna de afinidade liga o (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS, assim como a SNase (nuclease estafilocócica) 16 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ possuidora de um peso molecular similar à proteína CHIPS e uma afinidade similar (ou a sua falta) para a coluna de afinidade ou a coluna de absorção, respectivamente. A coluna de ADN liga apenas a SNase. Este método funciona particularmente bem se a primeira coluna de cromatografia de afinidade for uma denominada coluna "amarela" com corante, a segunda coluna de cromatografia de afinidade for uma denominada coluna "verde" com corante e a coluna de ADN for uma coluna de celulose-ADN.

Adicionalmente, é possível utilizar outros métodos de purificação conhecidos, tais como a filtração em gel, a cromatografia de permuta iónica, a cromatografia de afinidade, a cromatografia de interacção hidrofóbica ou a cromatografia de imunoafinidade.

Em alternativa, o (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS poderá ser expresso sob uma forma que facilitará a sua purificação. Por exemplo, ele poderá ser marcado ("tagged") com um epitopo de poli(histidina) (6xHis) e subsequentemente purificado mediante utilização de uma resina à qual estão ligados iões níquel por meio de um agente quelante. 0 (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS e contendo a cauda é eluido da resina por redução do pH ou por competição com imidazol ou histidina. Este epitopo está disponível comercialmente através de Invitrogen. A introdução de um local de clivagem de protease, como aquele para a enterocinase, permite a remoção da cauda de fusão para gerar (poli)péptido recombinante nativo maduro possuindo uma actividade de CHIPS. Os materiais e métodos para um sistema de expressão deste tipo estão disponíveis comercialmente através de Invitrogen, utilizando os vectores Xpress™

i , , TM pTrcHis em combmaçao com a resina ProBound para o isolamento eficiente da proteína com a cauda His, EnterokinaseMax™ como protease activa extremamente catalítica e a resina de afinidade para a enterocinase EK-Away para remover a presença contaminante da protease. Outras caudas conhecidas pelos peritos na arte que podem ser utilizadas para facilitar a purificação incluem, embora não estejam limitadas a estas, a glutationa-S-transferase (fusão GST), myc e HA. 17 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ Ο (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS também poderá ser produzido através de síntese química conhecida. Os métodos para a construção de polipéptidos ou proteínas por meios sintéticos são conhecidos pelos peritos na arte. A proteína sintética, em virtude de partilhar características estruturais e/ou conformacionais primárias, secundárias e terciárias com o correspondente (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS, possuirá uma actividade em comum com ele, ou seja, as propriedades de CHIPS. Assim, estas proteínas produzidas sinteticamente podem ser empregues como substituto biologicamente activo ou imunológico do (poli)péptido natural purificado possuindo a actividade de CHIPS. A síntese de CHIPS está adicionalmente ilustrada no Exemplo 7.

Os (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS aqui descritos também incluem (poli)péptidos caracterizados por sequências de aminoácidos em que são naturalmente criadas ou deliberadamente introduzidas modificações. As modificações nas sequências do (poli) péptido ou do ADN podem ser efectuadas pelos peritos na arte, utilizando técnicas convencionais conhecidas. As modificações de interesse nas sequências do (poli)péptido activo CHIPS poderão incluir a substituição, inserção ou deleção de resíduos de aminoácidos seleccionados na sequência codificante. A informação contida na proteína CHIPS, no seu gene, em outros (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS e nas suas moléculas de ácido nucleico codificantes derivadas a partir deles pode ser utilizada para rastrear fragmentos destas espécies ou outros agentes que são capazes de inibir ou bloquear a ligação de um (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS aos leucócitos, podendo assim actuar como inibidores da actividade quimiotáctica e/ou da ligação de CHIPS ao seu receptor putativo. Os ensaios de rastreio apropriados poderão utilizar, por exemplo, a proteína CHIPS purificada e marcada de modo fluorescente que se liga aos neutrófilos, como analisado por citometria de fluxo ou fluorimetria. 0 Exemplo 2 descreve um ensaio deste tipo. Um ensaio de ligação adequado poderá, em alternativa, empregar o receptor CHIPS purificado ou um domínio do receptor purificado num transportador, utilizando uma forma da 18 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ proteína CHIPS como ligando. Em alternativa, é possível usar um ensaio que rastreia a capacidade de ligação, ou de competição com CHIPS pela ligação, a um anticorpo anti-CHIPS específico (anticorpo monoclonal, policlonal ou de cadeia simples) por meio de vários imunoensaios conhecidos na arte, incluindo, embora não limitados a estes, as técnicas de ELISA competitivas e não competitivas ou a tecnologia de biossensores, que utiliza um chip sensor revestido com ligando (CHIPS), anticorpo ou receptor CHIPS putativo (técnica de ressonância de plasma de superfície (SPR) como a BiaCore). Qualquer (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS, que não seja a proteína CHIPS, também poderá ser utilizado nos ensaios de rastreio descritos. Todos estes métodos podem ser adaptados para rastreio de elevado rendimento (HTS).

Os (poli)péptidos isolados possuindo uma actividade de CHIPS poderão ser eles próprios usados como inibidores da ligação de fMLP e C5a aos seus respectivos receptores FPR e C5aR, ou então para conceber inibidores da ligação de CHIPS, através do rastreio de inibição competitiva. Os inibidores da ligação de CHIPS (ao receptor CHIPS putativo ou a domínios do receptor) também são úteis para o tratamento destas condições.

Encontram-se aqui adicionalmente descritas moléculas que não são elas próprias (poli)péptidos, mas que possuem uma estrutura e função similares às dos (poli)péptidos aqui descritos. Exemplos destas moléculas são os compostos peptidomiméticos. Quando se faz referência neste pedido a (poli)péptidos, pretende incluir-se também estes não (poli)péptidos que possuem uma estrutura e função similares ou iguais e, como consequência, uma actividade biológica similar ou igual aos (poli)péptidos. A actividade funcional de CHIPS, dos (poli)péptidos e dos seus fragmentos, derivados e análogos pode ser analisada por vários métodos. Preferencialmente, esta actividade de CHIPS é medida através da sua capacidade para impedir a ligação de fMLP fluorescente (Bodipy-fMLP) ou de C5a fluorescente (FITC-C5a) a neutrófilos, conforme determinado por citometria de fluxo. 0 Exemplo 1 descreve um ensaio deste 19 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ tipo. A actividade de CHIPS também é medida através da sua capacidade para impedir a migração dos neutrófilos na direcção de fMLP ou C5a, conforme determinado pelo ensaio de quimiotaxia Transwell, descrito nos Exemplos. Em alternativa, um ensaio baseado na capacidade das quimiocinas, incluindo fMLP e C5a, para iniciar uma subida rápida e transitória da concentração de cálcio intracelular pode ser utilizado para rastrear a existência de actividade de CHIPS. É possível utilizar vários ensaios conhecidos na arte incluindo, embora não limitados a, utilização de várias sondas fluorescentes especificas para o cálcio em combinação com citometria de fluxo ou fluorimetria ou microfisiometria. Como células para o rastreio de actividade de CHIPS via qualquer um dos métodos, é possível utilizar neutrófilos acabados de isolar ou então células transfectadas quer com FPR quer com C5aR, as formas selvagens ou mutadas desses receptores.

Os (poli)péptidos isolados possuindo uma actividade de CHIPS poderão ser úteis no tratamento, prevenção ou melhoria das condições inflamatórias que estão envolvidas em muitas doenças e perturbações, tal como referido na Tabela 1. Evidências no sentido da utilidade terapêutica dos (poli)péptidos do invento para o tratamento das doenças na Tabela 1 podem ser encontradas nas referências que se seguem. Para a SDRA: Demling RH (1995) . The modern version of adult respiratory distress syndrome. Ann. Rev. Med. 46:193-202; e Fujishima S, Aikawa N 1995. Neutrophil-mediated tissue injury and its modulation. Intensive Care Med 21:277-285; Para infecções graves (meningite): Tunkel AR & Scheld WM (1993). Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 6:118. Para lesões após isquemia/reperfusão: Helier T. et al. (1999). Selection of a C5a receptor antagonist from phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury. J. Immunol. 163:985-994. Para a artrite reumatóide: Edwards SW & Hallett MB (1997). Seeing the wood for the trees: the forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Immunology Today 18:320-324; e

Pillinger MH, Abramson SB (1995). The neutrophil in rheumatoid arthritis. Rheum. Dis. Clin. North Am. 1995 21:691-714. Para o enfarte do miocárdio: Byrne JG, Smith WJ, Murphy MP, Couper GS, Appleyard RF, Cohn LH (1992) . Complete 20 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ prevention of myocardial stunning, contracture, low-reflow, and edema after heart transplantation by blocking neutrophil adhesion molecules during reperfusion. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:1589-96. Para a DPOC: Cox G (1998). The role of neutrophils in inflammation. Can. Respir. J. 5 Suppl A:37A-40A; e Hiemstra PS, van Wetering S, Stolk J (1998). Neutrophil serine proteinases and defensins in chronic obstructive pulmonary disease: effects on pulmonary epithelium. Eur. Respir. J. 12:1200-1208. Para o AVC: Barone FC, Feuerstein GZ (1999). Inflammatory mediators and stroke: new opportunities for novel therapeutics. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19:819-834; e Jean WC, Spellman SR, Nussbaum ES, Low WC (1998). Reperfusion injury after focal cerebral ischemia: the role of inflammation and the therapeutic horizon. Neurosurgery 43:1382-1396. Para a meningite: Tuomanen EI (1996). Molecular and cellular mechanisms of pneumococcal meningitis. Ann. N.Y. Acad. Sei. 797:42-52.

Tabela 1

Condições inflamatórias como alvos para CHIPS SISTEMA DOENÇA SISTEMA (cont) DOENÇA (cont) cardiovascular aterosclerose geniturinário infecção do trato urinário sepsia glomerulonefrite choque isquémico infecção por Trichomonas vaginalis bypass cardiopulmonar endometriose cirurgia aórtica articulações artrite reumatóide transplante cardíaco artrite reactiva aguda enfarte do miocárdio gota nervoso central meningite bacteriana respiratório SDRA meningite virai DPOC esclerose múltipla fibrose pulmonar idiopática acidente vascular cerebral fibrose cística doença de Alzheimer asma tumor cerebral empiema pleural 21 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ gastrintestinal pancreatite febre dos fumos metálicos colite ulcerativa pneumonia bacteriana doença de Crohn bronquite crónica hepatite alcoólica pneumonia de hipersensibilidade hepatite virai infecção por Mycobacterium tuber. gastrite por Heliobacter pylori infecção virai do trato respiratório carcinoma gástrico rinite alérgica carcinoma hepatocelular sinusite peritonite carcinoma broncogénico psoriase vários periodontite dermatite de contacto infecção pelo VIH dermatite atópica leucemia linfocitária crónica linfoma cutâneo de células T rejeição aguda de transplantes queimaduras glomerulonefrite frieira microtraumatismos repetidos

Encontram-se aqui adicionalmente descritos (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS para utilização em diagnóstico, profilaxia ou terapia, em particular para utilização no tratamento de reacções inflamatórias agudas e crónicas e da infecção pelo VIH, mais em particular para utilização no tratamento da sindrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), choque isquémico, lesão cerebral traumática, infecções graves, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, cirurgia dos vasos, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), artrite reumatóide, dermatoses, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, aterosclerose, microtraumatismos repetidos, rejeição aguda de transplantes, 22 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ queimaduras, artrite reactiva aguda, pancreatite, vasculite, glomerulonefrite, gota, frieiras e meningite.

Encontra-se aqui também descrita a utilização dos (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS na produção de uma preparação destinada ao diagnóstico, profilaxia ou terapia, em particular destinada ao tratamento de reacções inflamatórias crónicas e agudas e da infecção pelo VIH, mais em particular destinada ao tratamento das indicações referidas acima.

Encontram-se aqui também descritas composições terapêuticas compreendendo um excipiente adequado e o (poli)péptido possuindo uma actividade de CHIPS do invento. Esta composição pode ser utilizada para os tratamentos especificados acima.

Encontra-se aqui também descrita a utilização da molécula de ácido nucleico do invento, opcionalmente incorporada numa construção maior, para vários fins, tais como a produção de anticorpos contra si, a modulação da actividade de CHIPS ou numa preparação terapêutica.

Encontram-se aqui também descritas moléculas de ácidos nucleicos e a sequência de aminoácidos codificada pelas moléculas de ácidos nucleicos que podem ser identificadas pela denominada técnica de "clonagem computacional". Mais especificamente, esta técnica compreende utilizar (1) a sequência de ácido nucleico conforme representada na Figura 4, ou seus fragmentos, derivados e análogos, ou (2) a sequência de aminoácidos conforme representada na Figura 5, ou seus fragmentos, derivados e análogos, como uma sequência de busca ("query") para pesquisar sequências de ácidos nucleicos ou bases de dados de sequências de ácidos nucleicos, ou sequências de proteínas ou bases de dados de sequências de proteínas, utilizando algoritmos de pesquisa que podem identificar regiões com homologia. Estes algoritmos são conhecidos pelos peritos na arte e incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, as pesquisas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). As bases de dados de sequências que poderão ser pesquisadas incluem, mas não estão limitadas a estas, a base de dados 23 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ

Genbank™ e a base de dados Swissprot™. Quando se utiliza uma pesquisa BLAST ou modificações desta, geralmente é possível identificar os objectos que apresentam homologia. A identificação baseia-se no valor da pontuação ou probabilidade mais pequena de soma P(N). Os homólogos da sequência de ácido nucleico CHIPS ou da sequência do (poli)péptido CHIPS são definidos por uma pontuação de pelo menos 200, preferencialmente pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 800, ainda mais preferencialmente pelo menos 1600. Em alternativa, o valor P(N) pode ser utilizado para a identificação de sequências homólogas. Os homólogos da sequência de ácido nucleico CHIPS ou da sequência do (poli)péptido CHIPS são definidos por um valor P(N) que é inferior a le-3, preferencialmente inferior a le-6, mais preferencialmente inferior a le-12, ainda mais preferencialmente inferior a le-24, especialmente preferido inferior a le-48.

Encontram-se aqui também descritos anticorpos ou seus fragmentos biologicamente activos especificamente dirigidos para o (poli)péptido do invento, e moléculas de bloqueio do receptor CHIPS à base de CHIPS. Estas moléculas de bloqueio do receptor CHIPS à base de CHIPS e os anticorpos ou seus fragmentos biologicamente activos, moléculas quiméricas, cadeias únicas e bibliotecas de expressão poderão ser utilizados para neutralizar a actividade da proteína CHIPS ou de (poli)péptidos relacionados em profilaxia ou terapia, ou poderão ser utilizados para fins de diagnóstico para ligar a proteína CHIPS ou (poli)péptidos relacionados. Estes anticorpos e moléculas de bloqueio do receptor CHIPS à base de CHIPS são por exemplo úteis para o tratamento da infecção por Staphylococcus. Encontram-se aqui adicionalmente descritas composições terapêuticas que compreendem um excipiente adequado e um ou mais destes anticorpos e/ou seus fragmentos biologicamente activos.

As "moléculas de bloqueio do receptor CHIPS à base de CHIPS" são moléculas que competem com CHIPS num ensaio de ligação de CHIPS, conforme descrito no Exemplo 8. Estas "moléculas de bloqueio do receptor CHIPS à base de CHIPS" poderão, por exemplo, ser moléculas que possuem a mesma composição de aminoácidos e sequência de aminoácidos que 24 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ CHIPS, mas não a sequência completa. Estas moléculas poderão ser fragmentos únicos de CHIPS ou poderão consistir em fragmentos múltiplos de CHIPS, todos eles possuindo ainda uma actividade de CHIPS. Contudo, todas as outras moléculas que satisfazem o requisito funcional de competir com CHIPS num ensaio de ligação de CHIPS também estão incluídas.

As moléculas de ácido nucleico isoladas do invento podem ainda ser utilizadas para terapia génica. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida no local de inflamação para actuar localmente ou num local distante. A terapia génica ocorre via vectores virais, tais como, mas não exclusivamente, vectores adenovirais, vectores virais adenoassociados ou vectores lentivirais. Em alternativa, vectores não virais, como sejam aqueles à base de lipossomas ou de polímeros, poderão ser utilizados. As estratégias terapêuticas génicas baseiam-se em (1) terapia génica in vivo, em que as moléculas de ácido nucleico isoladas do invento são introduzidas em células-alvo in vivo ou (2) terapia génica ex vivo, em que as moléculas de ácido nucleico isoladas do invento são introduzidas em células-alvo ex vivo, seguindo-se a administração das células transduzidas, ou de uma subpopulação das células transduzidas, num indivíduo.

Encontra-se aqui adicionalmente descrito um método de tratamento de um sujeito que sofre de inflamação através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um (poli)péptido como aqui descrito, um método para o tratamento terapêutico génico de um sujeito que sofre de inflamação através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico, assim como um método de tratamento de um sujeito que sofre de uma infecção por estafilococos através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo e/ou um seu fragmento biologicamente activo.

As moléculas de ácido nucleico do invento podem ser utilizadas num método de isolamento, a partir de um organismo, de um gene que codifica uma proteína possuindo uma actividade de CHIPS, método este que compreende rastrear uma biblioteca genómica ou de ADNc desse organismo com uma sonda 25 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ baseada na molécula de ácido nucleico e isolar os clones positivos.

Encontra-se aqui adicionalmente descrito um microrganismo albergando uma ou mais moléculas de ácido nucleico do invento, para uso como medicamento destinado ao tratamento de reacções inflamatórias agudas e crónicas e da infecção pelo VIH, em particular destinado ao tratamento da sindrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), choque isquémico, lesão cerebral traumática, infecções graves, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, cirurgia dos vasos, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), artrite reumatóide, dermatoses, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, aterosclerose, microtraumatismos repetidos, rejeição aguda de transplantes, queimaduras, artrite reactiva aguda, pancreatite, vasculite, glomerulonefrite, gota, frieiras e meningite. 0 invento refere-se ainda a um teste de PCR de diagnóstico para rastrear um doente infectado com

Staphylococcus aureus quanto à presença do gene CHIPS. CHIPS é um factor de virulência estafilocócica importante, pelo que os doentes com estafilococos contendo CHIPS estão em maior risco de doenças invasivas e poderão necessitar de um tratamento diferente ou adicional.

Todas as moléculas aqui descritas, isto é, as moléculas de ácido nucleico, os (poli)péptidos, os não (poli)péptidos e os fragmentos, derivados e análogos, poderão ter várias outras aplicações. Estas aplicações incluem, embora não estejam limitadas a estes exemplos:

Isolamento de factores que se podem ligar às moléculas acima referidas. Os exemplos destes factores são receptores e proteínas. Este isolamento pode ser realizado, por exemplo, utilizando o sistema de dois híbridos em levedura ou utilizando moléculas marcadas ("tagged") como isco para a pesca.

Concepção de peptóides e de compostos peptidomiméticos. 26 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ - Construção de bibliotecas de apresentação em fagos, que podem ser utilizadas, pelo seu lado, para determinar domínios activos, equivalentes funcionais, etc.

Identificação de vias de transdução de sinal que são activadas ou inactivadas por CHIPS e pelas moléculas do invento. - Ensaio para determinação da actividade de CHIPS biológica (inibição da quimiotaxia ou expressão de receptores de quimiocinas).

Todas as moléculas aqui descritas podem ser marcadas de diferentes formas. Os exemplos de marcação incluem, mas não estão limitados a, fluorescência, biotina, marcação radioactiva, etc. Estas moléculas marcadas podem ser utilizadas para o rastreio de compostos que se assemelham ou sobrepõem à actividade biológica de CHIPS, assim como para a identificação de locais de ligação, tanto in vivo como in vitro, e para o seguimento do ácido nucleico ou da proteína CHIPS num organismo. É evidente que quando é aqui feita referência a um (poli)péptido possuindo uma sequência de aminoácidos particular, pretende também englobar-se os (poli)péptidos que contêm um ou mais aminoácidos que estão quimicamente modificados de uma forma óbvia para um perito na arte, desde que essa modificação não extinga a actividade de CHIPS.

As concretizações mais preferidas estão indicadas nas reivindicações anexas. 0 presente invento será adicionalmente ilustrado nos exemplos que se seguem e que não se destinam, de modo algum, a limitar este invento. Nesta descrição e nos exemplos, é feita referência às seguintes figuras e tabelas: A Figura 1 representa a actividade de CHIPS do eluato proveniente da coluna Mono Q. A Figura 2 ilustra o gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie de CHIPS purificada após o passo de cromatografia Mono Q final. 27 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ A Figura 3 representa a ligação dependente da concentração de CHIPS-FITC às várias populações de leucócitos. A Figura 4 apresenta a sequência do gene chp de S. aureus Newman. A sequência de Shine-Dalgarno (AGGAGA) e a grelha de leitura aberta (ORF) de chp estão sublinhadas. Os nucleótidos que codificam a proteína madura estão indicados por uma linha dupla. Os nucleótidos divergentes na sequência de S. aureus 1690 estão indicados acima da sequência. A Figura 5 ilustra a sequência de aminoácidos deduzida a partir do gene chp de S. aureus Newman. A região que corresponde aos 35 aminoácidos N-terminais de CHIPS está sublinhada. Os aminoácidos divergentes na proteína de S. aureus 1690 estão indicados acima da sequência. A Figura 6 mostra a detecção do gene chp nos genomas de estirpes de S. aureus. A Figura 7 ilustra a actividade de CHIPS nos sobrenadantes de estirpes de S. aureus. A Figura 8 mostra a distribuição do gene chp no genoma de várias estirpes clínicas de S. aureus. A Figura 9 apresenta duas curvas dose-resposta de anticorpos anti-CHIPS de coelho que se ligam a péptidos derivados de CHIPS possuindo os aminoácidos 1 a 15 (Figura 9A) e a CHIPS purificada (Figura 9B) tal como determinado por ELISA. A Figura 10 representa a inibição, dependente da concentração, da migração de neutrófilos na direcção de fMLP por CHIPS purificada, expressa como percentagem das células tratadas com tampão. As células foram incubadas com várias concentrações de CHIPS durante 30 min à temperatura ambiente e adicionadas ao compartimento superior do recipiente Transwell. A migração na direcção de fMLP, a uma concentração de 1x10”8M, foi determinada após 60 minutos de incubação a 37°C. 28 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ A Figura 11 é uma imagem representativa de um gel de SDS-PAGE mostrando o CHIPS recombinante (rCHIPS) purificado final obtido a partir de um lisado de E. coli, após cromatografia de afinidade numa coluna de níquel e clivagem da cauda de histidina pela enterocinase. A Figura 12 representa a inibição, dependente da concentração, da expressão do receptor de fMLP (FPR) e de C5a (C5aR) nos neutrófilos por CHIPS recombinante (rCHIPS). A Figura 13 ilustra a redução, dependente da concentração, da libertação de cálcio livre intracelular induzida por fMLP e C5a nos neutrófilos. A Figura 14 mostra a inibição, dependente da concentração, da ligação de CHIPS-FITC por CHIPS recombinante completo e pelo mutante recombinante CHIPS4-121. A Tabela 1 apresenta as condições inflamatórias que podem ser tratadas com os (poli)péptidos e os não (poli)péptidos do invento; e A Tabela 2 mostra a ligação, em ELISA, de vários clones seleccionados de anticorpos monoclonais derivados de um ratinho imunizado com CHIPS. A ligação é a CHIPS purificada, e os anticorpos monoclonais reactivos de ratinho são detectados com um anticorpo anti-ratinho acoplado a hrp. EXEMPLOS EXEMPLO 1

Purificação da proteína CHIPS a partir do sobrenadante de S. aureus

MATERIAIS E MÉTODOS 1.1 Isolamento da proteína

Staphylococcus aureus 1690 (um isolado clínico, University Medicai Center Utrecht (UMC Utrecht)) ou Staphylococcus aureus Newman (uma oferta de Dr. Foster, Dublin) é crescido durante a noite em meio IMDM (Gibco) e 29 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ subsequentemente diluído de 1:40 em meio IMDM fresco para uma cultura de 7 horas, a 37°C. Após deposição das bactérias, o sobrenadante de S. aureus (designado por SaS) é recolhido, filtrado através de um filtro de 0,2 pm e imediatamente utilizado (Veldkamp et al., Inflammation 21. 541-551 (1997)). Uma quantidade de 5 litros de SaS é dirigida para três colunas (25 ml) acopladas em tandem. Estas três colunas são sucessivamente uma coluna de esferas de agarose reticulada a 4% com corante "Reactive Yellow" 861 (Sigma), uma coluna de ADN-celulose (Pharmacia) e uma coluna de esferas de agarose reticulada a 4% com corante "Reactive Green" 19 (Sigma).

Após lavagem com PBS, a coluna verde (Reactive Green 19) é eluída com NaCl 2M e os segundos 50 ml, contendo a actividade de CHIPS, são combinados. Adiciona-se PMSF (1 mM), e o eluato é dialisado em PBS durante 18 horas. A amostra é concentrada para um volume de ± 10 ml num saco de diálise encharcado em polietilenoglicol. O material concentrado é separado numa coluna de filtração em gel Superdex-200 de Pharmacia, após o que as fracções activas (volumes de 4 ml) são combinadas, tratadas com PMSF (1 mM) e dialisadas em Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) durante 18 horas. As fracções activas combinadas são carregadas numa coluna de permuta aniónica Mono Q (Pharmacia), que é eluída com um gradiente de tampão Tris-HCl 10 mM variando entre NaCl 0 a 1 M. As fracções activas (volumes de 1 ml) são reunidas e utilizadas como a preparação final de CHIPS purificada. O teor de proteína é determinado com um ensaio Micro-BCA de Pierce, e a proteína CHIPS é armazenada a -20°C em pequenas alíquotas. O material isolado final é analisado quanto a pureza num gel de SDS-PAGE a 12,5% (Mini-Protean II; BioRad), após coloração com azul de Coomassie. A proteína CHIPS surge como uma banda única com um peso molecular aparente à volta de 17 kDa. Todas as fracções são rastreadas relativamente a actividade de CHIPS por meio da sua capacidade para inibir a ligação de fMLP marcado de forma fluorescente a neutrófilos isolados, conforme medida por citometria de fluxo. 1.2 Ligação de fMLP e C5a a granulócitos

Isolam-se granulócitos a partir de sangue heparinizado de voluntários saudáveis via um gradiente de Histopaque- 30 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ

Ficoll de acordo com o método padrão (Troelstra et ai., J. Leukocyte Biol. 61, 173-178 (1997)). Os restantes eritrócitos na fracção de granulócitos são lisados com água estéril (durante 30 segundos) e lavados após recuperação da isotonicidade. As células são finalmente ressuspensas em RPMI (Gibco) contendo albumina sérica humana a 0,05% (RPMI/HSA). Em tubos Falcon, incubam-se 50 μΐ de células (5xl06 células/ml) com 50 μΐ de material contendo CHIPS (SaS, CHIPS purificada ou fracções da coluna) durante 30 minutos a 37°C. As células são colocadas em gelo, lavadas uma vez com RPMI/HSA (a 4°C) e ressuspensas em 50 μΐ de meio fresco. Adicionam-se depois 5 μΐ de fMLP marcado com BODIPY (concentração final 0,1 μΜ; Molecular Probes) ou de C5a marcado com FITC (concentração final 1 μΜ; C5a recombinante de Sigma, marcado com FITC conforme descrito no Exemplo 2.1 para CHIPS) e a amostra é incubada durante 60 minutos em gelo. Após lavagem, a ligação de fMLP ou de C5a fluorescente aos granulócitos é analisada com um citómetro de fluxo (FACScan; Becton Dickinson). O valor de fluorescência médio de 5.000 granulócitos é calculado com o software Lysis II.

RESULTADOS A Figura 1 representa o perfil de eluição (DO280) da actividade de CHIPS do eluato proveniente da coluna Mono Q. As fracções de volume entre 39 e 41 ml mostram a actividade de CHIPS mais forte. A Figura 2 ilustra o gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie da proteína CHIPS purificada, após o passo de cromatografia Mono Q final. EXEMPLO 2

Ligação específica de CHIPS a neutrófilos e monócitos MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Marcação da proteína CHIPS purificada com FITC A proteína CHIPS purificada (500 pg/ml proteína) é incubada com um décimo de volume de FITC a uma concentração de 1 mg/ml (isotiocianato de fluoresceína, isómero I, Sigma) em tampão carbonato de sódio 1M, pH 9,6, durante 1 hora à temperatura ambiente. A proteína CHIPS marcada com FITC é separada do FITC livre por passagem da mistura através de uma 31 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ coluna de dessalinização (Pharmacia, Fast Desalting HR 10/10) e monitorização da D02so e da fluorescência do eluato por meio de um fluorómetro acoplado em linha (Perkin Elmer). As fracções com D02so e fluorescência elevadas foram reunidas e analisadas quanto ao teor de proteína com um ensaio de proteína Micro BCA (Pierce). A proteína CHIPS-FITC é armazenada em pequenas alíquotas a -20°C. 2.2 Ligação de CHIPS-FITC a leucócitos A ligação específica de CHIPS-FITC aos leucócitos é determinada por citometria de fluxo. Os neutrófilos e as células mononucleares (consistindo em monócitos e linfócitos) purificados são isolados a partir de sangue heparinizado de voluntários saudáveis conforme descrito (Troelstra et al., Infect. Immun. 65: 2272-2277 (1997)). As células isoladas são remisturadas para obter uma razão de células que mimetiza a situação no sangue. Os glóbulos vermelhos humanos são obtidos por lavagem de uma pequena alíquota de sangue completo três vezes com PBS. A concentração de glóbulos vermelhos é determinada fotoespectrometricamente.

Em tubos Falcon, incubam-se 50 μΐ de leucócitos ou de glóbulos vermelhos (5 x 106 células/ml) com 5 μΐ de CHIPS-FITC a várias concentrações durante 30 minutos em gelo. As células são lavadas uma vez com meio (RPMI contendo HSA a 0,05%) e ressuspensas em 150 μΐ de meio fresco. A ligação de CHIPS-FITC aos leucócitos é medida por citometria de fluxo (FACScan; Becton Dickinson). A associação com as várias subpopulações é analisada por delimitação electrónica selectiva das populações ("selective electronic gating") nos parâmetros de dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC) no software Lysisll (BD). O valor de fluorescência médio da população de células seleccionada é calculado com o software.

RESULTADOS A Figura 3 representa a ligação, dependente da concentração, de CHIPS-FITC às várias populações de leucócitos. É possível ver que CHIPS-FITC se liga mais eficientemente aos neutrófilos, seguidos dos monócitos. CHIPS-FITC não se liga aos glóbulos vermelhos e apenas marginalmente aos linfócitos, mas apenas a uma subpopulação. 32 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ A ligação de CHIPS-FITC aos neutrófilos é específica porque a adição de um excesso de lOx de CHIPS não marcada de forma fluorescente inibe completamente a associação de CHIPS-FITC às células. EXEMPLO 3

Sequência, clonaqem e expressão do gene que codifica CHIPS (chp) de Staphylococcus aureus

MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Estirpes bacterianas, plasmídeos e condições de crescimento

Staphylococcus aureus Newman, RN4220 e COL são estirpes laboratoriais habitualmente utilizadas. S. aureus 1690 é uma estirpe clínica, isolada de um doente com bacteremia (K.E. Veldkamp et al., Inflammation, 21:541-551 (1997)). Utilizou-se Escherichia coll DH5a como hospedeiro de clonagem (F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y. (1990)). O plasmídeo pRB474 é um vector vaivém para E. coli e para estafilococos, contendo o promotor vegll de Bacillus subtilis que permite a expressão de genes clonados no local de clonagem múltipla de pRB474. pRB474 é um derivado de pRB374 (R. Bruckner, Gene, 122:187-192 (1992)) em que o gene de resistência à neomicina foi substituído por um gene de resistência ao cloranfenicol. Todas as estirpes foram crescidas em caldo bm (triptona a 1%, extracto de levedura a 0,5%; NaCl a 0,5%; K2HP04 a 0,1%; glucose a 0,1%) a 37°C excepto indicação em contrário. 3.2 Análise da sequência O ADN foi sequenciado por sequenciação cíclica num sequenciador de ADN 4000 L (LI-COR Inc., Lincoln, Nebrasca, EUA), utilizando o kit de sequenciação cíclica com iniciadores marcados de forma fluorescente Thermo Sequenase™ (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido). Utilizaram-se iniciadores adequados para sequenciar directamente o ADN genómico que foi isolado de acordo com J. Mamur (J. Mol. Biol., 3:208-218 (1961)). O método de sequenciação foi descrito resumidamente em Peschel et al. (J. Biol. Chem., 33 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 274:8405-8410 (1999)). Para efectuar buscas de similaridade de sequência, utilizou-se o programa BLAST 2.0 com a base de dados de proteínas não redundantes de NCBI (Bethesda, Md., EUA). Os alinhamentos de sequências foram efectuados utilizando o algoritmo de Higgins-Sharp do programa MacDNASIS Pro (Hitachi Software Engineering, San Bruno, Califórnia, EUA) .

Anteriormente, os primeiros 35 aminoácidos de CHIPS tinham sido determinados por sequenciação N-terminal da proteína purificada. O ADN de S. aureus é muito rico em nucleótidos A e T, ao passo que os nucleótidos G e C são raros (apenas cerca de 30% do número total de bases). Assim, para a maioria dos aminoácidos, os codões mais ricos em A e T são preferidos. De acordo com esta regra, derivou-se uma sequência iniciadora a partir dos aminoácidos 15-24 (GAAAAAGAAAAAGCATATAAAGAA (SEQ ID NO 1)). O iniciador foi utilizado para sequenciar directamente o ADN genómico de S. aureus Newman, originando uma sequência de várias centenas de pares de bases. Derivou-se um novo iniciador a partir desta sequência para ler na direcção do local de ligação do primeiro iniciador. A sequência de ADN combinada continha o local de ligação do primeiro iniciador com duas diferenças (G em vez de A na posição 3 e T em vez de A na posição 15) (Figura 4) . Ela codificava uma grelha de leitura aberta de 450 pb, precedida de uma sequência de Shine-Dalgarno razoável para iniciação da tradução (J. Shine & L. Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71:1342-1346 (1974)) e seguida de três codões de terminação. O gene foi designado por chp; ele codifica uma proteina putativa de 149 aminoácidos sem semelhanças com qualquer outra proteina presente nas bases de dados. Os 28 aminoácidos N-terminais parecem formar um péptido sinal para secreção através da membrana citoplasmática (3 resíduos carregados positivamente, seguidos de uma região não carregada de 22 aminoácidos e de um motivo consenso ALA-X-ALA para clivagem pela peptidase sinal 1; Figura 5) (G. von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)). O péptido sinal é seguido por uma região que corresponde quase perfeitamente aos 35 aminoácidos N-terminais de CHIPS. A única excepção é uma serina na posição 33 da proteína madura deduzida em vez de um resíduo de asparagina previsto pela sequenciação N-terminal. A proteína 34 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ madura deduzida tem um tamanho de 121 aminoácidos, 14,1 kDa e um ponto isoeléctrico de 9,32. Satisfaz, por conseguinte, todos os requisitos para a proteína CHIPS. Utilizando os mesmos iniciadores, sequenciou-se o gene chp de S. aureus 1690. Os dois genes foram quase idênticos com 5 desvios. A nível da sequência de aminoácidos, apenas uma posição estava trocada (Figura 4 e 5). 3.3 Clonagem e expressão do gene chp O gene chp de S. aureus Newman foi amplificado por PCR, utilizando iniciadores cuja sequência foi modificada para introduzir locais de restrição que permitem a clonagem de chp no plasmídeo de expressão pRB474. O plasmídeo resultante pPr4-chp continha a região codificante de chp, 19 pb a montante do codão de iniciação contendo a sequência de Shine-Dalgarno e 104 pb a jusante do primeiro codão de terminação. O fragmento foi introduzido na orientação apropriada, permitindo a expressão do gene pelo promotor vegll, e a identidade do fragmento foi verificada por análise de sequência. O plasmídeo pPr4-chp foi transferido para a estirpe negativa ao nível de restrição S. aureus RN4220 por electroporação (J. Augustin & F. Gõtz, FEMS Microbiol. Lett. 66:203-208 (1990)), isolado a partir de um clone positivo e transferido por electroporação para S. aureus COL (n.° acesso TIGR 1280). A identidade do plasmídeo foi verificada por análise de fragmentos de restrição e sequenciação da inserção. O gene chp não estava contido na sequência genómica parcialmente disponível de S. aureus COL (n.° acesso TIGR 1280). Por análise de PCR, demonstrou-se que o gene está efectivamente ausente em S. aureus COL, ao passo que S. aureus Newman e 1690 foram positivas (Figura 6). Adicionalmente, S. aureus COL foi negativa no ensaio de actividade de CHIPS (Figura 7) . O gene chp de S. aureus

Newman foi clonado no plasmídeo pPr4-chp, que permite a expressão de genes clonados por um promotor codificado pelo plasmídeo. A transformação de S. aureus COL com o plasmídeo tornou a estirpe positiva no ensaio de CHIPS (Figura 7), provando que o gene chp codifica a proteína CHIPS. 35 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ

3.4 Detecção do gene chp por PCR A ausência ou presença do gene chp em várias estirpes de S. aureus foi determinada por PCR, utilizando extractos de células em bruto como fonte para o molde. Uma colónia bacteriana de uma placa de gelose fresca foi ressuspensa em 1.5 ml de solução salina, sedimentada e ressuspensa em 100 μΐ de uma mistura de lise contendo Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; NaCl 50 mM, 0,1 mg lisostafina/ml e 0,1 mg acromopeptidase/ml. As amostras foram incubadas a 37°C durante 30 minutos e depois foram centrifugadas. O sobrenadante límpido foi aquecido a 100°C durante 5 minutos e subsequentemente diluído por adição de 400 μΐ de tampão TE (EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8). Aplicou-se 1 μΐ dos extractos celulares para as reacções de PCR, utilizando os iniciadores específicos para chp chp-5' (GAAAAAGAAATTAGCAACAACAG (SEQ ID NO 2)) e chp-3' (CATAAGATGA TTTAGACTCTCC (SEQ ID NO 3) . A amplificação foi obtida por meio de 35 ciclos constituídos por 1 min a 90°C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C. O produto de PCR resultante era constituído por 90,4% do gene chp, começando 2 pb a jusante do codão de iniciação e terminando 41 pb a montante do primeiro codão de terminação. Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose. Todas as técnicas de sequenciação, PCR e ADN recombinante foram realizadas de acordo com os procedimentos estandardizados (F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y. (1990)).

3.5 Ensaio para a actividade de CHIPS

As estirpes de S. aureus foram analisadas relativamente à actividade de CHIPS num ensaio para detectar a ligação de fMLP marcado por fluorescência a neutrófilos humanos. As estirpes foram cultivadas em meio IMDM (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) durante 24 horas, e os sobrenadantes de cultura foram dialisados e testados conforme descrito no Exemplo 1.2.

RESULTADOS A Figura 4 mostra a Sequência do gene chp de S. aureus Newman. A sequência de Shine-Dalgarno (AGGAGA) e a grelha de leitura aberta (ORF) de chp estão sublinhadas. Os nucleótidos 36 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ que codificam a proteína madura estão indicados por uma linha dupla. Os nucleótidos divergentes na sequência de S. aureus 1690 estão indicados acima da sequência. A Figura 5 representa a sequência de aminoácidos deduzida a partir do gene chp de S. aureus Newman. A região que corresponde aos 35 aminoácidos N-terminais de CHIPS está sublinhada. Os aminoácidos divergentes na proteína de S.aureus 1690 estão indicados acima da sequência. A Figura 6 ilustra a detecção do gene chp nos genomas de estirpes de S. aureus. Os produtos de PCR obtidos com iniciadores específicos para chp foram separados num gel de agarose. Pistas 1 e 2, S. aureus Newman; pistas 3 e 4, S. aureus COL; pistas 5 e 6, S. aureus 1690. As bactérias seguintes revelaram-se negativas quanto à presença do gene chp conforme determinado por PCR: Staphylococcus capitis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri e Escherichia coli. A Figura 7 ilustra a actividade de chips nos sobrenadantes de estirpes de S. aureus. Testaram-se várias concentrações dos sobrenadantes de cultura de S. aureus 1690 (quadrados), COL de tipo selvagem (círculos brancos) e COL com o plasmídeo pPr4-chp (círculos pretos) relativamente à inibição da ligação de fMLP a neutrófilos humanos. A fluorescência do fundo foi subtraída, e os valores são fornecidos como % das amostras de controlo (incubação sem os sobrenadantes de cultura). A Figura 8 representa a distribuição do gene chp nos genomas de várias estirpes clínicas de S. aureus. As bactérias são rastreadas por PCR com iniciadores específicos para chp e avaliadas quanto à presença da banda específica de 400 pb num gel de agarose. As estirpes de S. aureus estão agrupadas em foco de isolamento a partir dos doentes. Lab = estirpes laboratoriais; Outras = estirpes de outros fluidos corporais; DPAC = culturas de diálise peritoneal ambulatorial crónica; Sangue = culturas sanguíneas; Ferida = infecções com ferida; SAMR = estirpes de S. aureus multirresistentes. 37 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ EXEMPLO 4

Anticorpos específicos para CHIPS MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Imunização

Os anticorpos específicos para a proteína CHIPS podem ser produzidos utilizando, como antigénio, a proteína natural ou recombinante purificada ou péptidos sintéticos derivados da sequência. Já foram produzidos anticorpos policlonais e monoclonais utilizando técnicas padrão (como descrito em Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Erich, et al (1989), J. Immunol. 143: 4053-4060). Com base nos primeiros 15 aminoácidos, preparou-se um péptido sintético de acordo com a química Fmoc comum, tal como descrito em De Haas et al., J. Immunol. 161:3607-3615. O péptido foi acoplado a hemocianina de lapa, de acordo com as instruções do fabricante (Pierce), e utilizado para imunização subcutânea com adjuvante completo de Freund, seguido de duas injecções de reforço com adjuvante incompleto de Freund.

As imunoglobulinas dos soros dos animais imunizados ou dos sobrenadantes de cultura das células de hibridoma são isoladas por cromatografia de afinidade, utilizando resinas comerciais contendo Proteína A, Proteína G ou as suas formas recombinantes (Pharmacia).

4.2 ELISA

Os antissoros e os anticorpos purificados (IgG) são rastreados quanto a reactividade com a proteína CHIPS purificada ou com péptidos derivados sintéticos por meio de ELISA. Por conseguinte, o antigénio é aplicado como revestimento numa placa de microtitulação (Nunc 'Maxisorb')/ numa concentração de 1 a 3 pg/ml em tampão carbonato 0,1 M; pH 9,6; durante 18 horas a 4°C. Após lavagem, o plástico não ocupado é bloqueado com BSA a 4% em PBS/Tween 20 (a 0,05%) durante 1 hora a 37°C. Efectuam-se diluições em série dos anticorpos em PBS/Tween contendo BSA a 2% e incuba-se durante 1 hora a 37°C. Os anticorpos ligados são incubados com um 38 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ anticorpo secundário marcado com peroxidase e diluído de 1/5.000, quer IgG de cabra anti-coelho para os anticorpos policlonais quer IgG de cabra anti-ratinho para os anticorpos monoclonais (ambos de Southern Biotechnology Associates, Inc.), durante 1 hora a 37°C. As reacções são desenvolvidas utilizando TMB como substrato e a densidade óptica (DO) foi lida a 450 nm.

RESULTADOS A Figura 9 representa a ligação específica de IgG policlonal de um coelho imunizado com um péptido sintético compreendendo os primeiros 15 aminoácidos N-terminais de CHIPS (péptido anti-CHlPS). Observa-se uma DO450 elevada para o péptido anti-CHIPS de coelho com o péptido (Figura 9A), assim como com a proteína CHIPS purificada (Figura 9B) aplicados como revestimento nos poços. O efeito é dependente da concentração e já é significativo com uma concentração mínima de 30 ng/ml IgG. Uma "pool" não imunizada de IgG de coelho normal proporciona alguma ligação de fundo, mas somente a concentrações elevadas de anticorpo, especialmente quando a proteína CHIPS purificada está aplicada como revestimento na placa de ELISA. A Tabela 2 apresenta a ligação específica de clones de hibridoma seleccionados, derivados de ratinhos imunizados com a proteína CHIPS purificada.

Tabela 2 nome do clone DO450 Fundo 0,056 25-1 0, 973 25-2 0,985 25-3 1,286 29-1 1,847 29-2 1,433 29-3 1,564 29-4 2,123 39 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ EXEMPLO 5

Ensaio de quimiotaxia A actividade de CHIPS dos (poli)péptidos e não (poli)péptidos do invento pode ser determinada, por exemplo, com o seguinte ensaio.

De forma a determinar a migração dirigida, utiliza-se, por exemplo, o sistema Transwell (Costar) que consiste num compartimento superior e um compartimento inferior separados por uma membrana de policarbonato de 3 pm. Os granulócitos são marcados com BCECF (2-carboxietil-5-(e—6 —) carboxifluoresceina; Molecular Probes), um marcador fluorescente que entra no citoplasma das células. As células (5xl06) são incubadas durante 20 minutos a 22°C com BCECF-AM a uma concentração de 3 μΜ (o éster acetometilico de 2-carboxietil-5-(e—6 —)-carboxifluoresceina), subsequentemente lavadas três vezes e ressuspensas para 5xl06 células/ml em RPMI/HSA. 100 μΐ de células e a quantidade desejada da proteina CHIPS são introduzidos no compartimento superior do sistema Transwell, e o conjunto é suspenso nos poços de uma placa de microtitulação de 24 poços comum (Costar). Cada poço contém 600 μΐ de rpmi/hsa, com ou sem adição do quimioatractor para teste. Os quimioatractores são: C5a recombinante (Sigma), interleucina-8 recombinante (Pepro Tech), factor de activação das plaquetas 16 (PAF-16; Calbiochem) ou fMLP (Sigma). Após 60 minutos de incubação a 37°C, o recipiente Transwell é levantado dos poços e a placa de microtitulação é analisada em termos de fluorescência num equipamento CyoFluorlI (PerSeptiveBiosystems). O grau de fluorescência é uma medida directa do número de granulócitos que migrou através da membrana e é expresso como uma percentagem da fluorescência do número de células adicionado.

RESULTADOS A Figura 10 mostra a inibição, dependente da concentração, da migração de neutrófilos na direcção de fMLP pela proteina CHIPS purificada, expressa como percentagem das células de controlo tratadas com tampão. 40 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ EXEMPLO 6

Produção de polipéptido recombinante possuindo uma actividade de CHIPS em E. coli O polipéptido CHIPS foi produzido em E. coli e verificou-se que era biologicamente tão activo como a proteína CHIPS de ocorrência natural de S. aureus. O método de produção utilizado para a produção de CHIPS recombinante também pode ser utilizado para outros (poli)péptidos possuindo uma actividade de CHIPS. Este método de produção está ilustrado abaixo. A sequência de ADN de CHIPS oriunda de S. aureus é clonada num vector adequado que permite uma expressão eficiente de CHIPS em células hospedeiras de E. coli competentes, utilizando técnicas de biologia molecular convencionais. A estratégia utilizada permite a expressão da proteína CHIPS completa ligada a uma cauda HIS removível na extremidade N-terminal, no citoplasma de E. coli. Utilizou-se o sistema de expressão trc (vector pTrcHlS B; Invitrogen) que permite a expressão de proteínas não tóxicas em E. coli. Este sistema utiliza o promotor trc para uma expressão regulada e de nível elevado em qualquer estirpe de E. coli com um vector de multiclonagem. O vector contém uma cauda de poli(histidina) (6xHis) N-terminal para purificação rápida, um epitopo Xpress para detecção fácil com um anticorpo anti-Xpress e um sítio de clivagem da enterocinase para remoção da cauda de fusão. O ADN cromossómico de S. aureus Newman foi utilizado como molde para a reacção de PCR, utilizando a ADN-polimerase Pwo que resulta num produto de PCR com extremidades lisas. Os iniciadores utilizados são CHIPS-TTT (começa exactamente com o primeiro aminoácido de CHIPS (F) e CHIPS-TAA (contendo um codão de terminação e um local EcoRI). O produto de PCR é digerido com EcoRI e o vector pTrcHIS B com BamHl. A extremidade coesiva em 5' é removida com a nuclease SI para conferir ao local BamHl extremidades lisas, exactamente onde a enterocinase (EK) digerirá a proteína. Em 41 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ seguida, ο vector é digerido com EcoRI e ligado ao produto de PCR digerido.

Para a transformação do vector, utiliza-se E. coli TOP-10 (InVitroGen) e o método comum de precipitação com cálcio (F.M. Ausubel et al., 1990, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y.). Os clones são rastreados em placas contendo ampicilina e a correcta ligação do gene CHIPS é verificada por sequenciação do plasmideo isolado (clone 29) .

Após expressão do gene CHIPS, as bactérias E. coli são lisadas e a mistura de proteínas é aplicada numa coluna de afinidade de ião níquel (ProBond). Deste modo, inicia-se uma cultura do clone 29 em meio LB + ampicilina 50 pg/ml com IPTG 1 mM, durante 4h a 37°C. As bactérias são centrifugadas, e o depósito é ressuspenso em tampão fosfato frio, pH 7,8; e armazenado a -20°C. Para a lise celular, adiciona-se lisozima (100 pg/ml) durante 15' em gelo, os tubos são sonicados, congelados em n2 líquido e descongelados num banho de água a 37°C. Este ciclo de sonicação/congelação/descongelação é repetido 3 vezes.

Em seguida, adiciona-se ARNase e ADNase (5 pg/ml) durante 30' em gelo. A mistura é centrifugada a 3.000 xg durante 30' a 4°C e filtrada através de um filtro de 0,45 pm. O lisado final é diluído de 1:1 com tampão fosfato frio, pH 7,8; e corrido através de uma coluna de níquel carregada (InVitroGen). A coluna é lavada com tampão fosfato, pH 7,8; com tampão fosfato, pH 6,0; e com tampão fosfato, pH 5,3. O polipéptido CHIPS ligado é eluído com imidazol 500 mM em tampão fosfato, pH 6,0. A cauda HIS é removida por clivagem com enterocinase, seguida de remoção da protease com uma resina de afinidade para a enterocinase EK-Away. Deste modo, o eluato é dialisado durante a noite em tampão de digestão frio (Tris-HCl 50 mM, CaCl2 1 mM e Tween-20 a 0,1%; pH 8,0), filtrado através de um filtro de 0,45 pm e digerido com 0,175 pl de enterocinase/ml de produto HIS-CHIPS. Esta quantidade de enterocinase depende do "batch" e resulta numa digestão parcial para evitar a geração de produtos de degradação. O produto digerido é 42 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ dialisado contra tampão fosfato, pH 7,8; e passado por uma coluna de níquel fresca para eliminar o polipéptido CHIPS com cauda His não clivado (HIS-CHIPS); o fluido de passagem pela coluna é CHIPS recombinante puro (rCHIPS). 0 polipéptido HIS-CHIPS não digerido pode ser novamente eluído da coluna de níquel para um segundo ciclo de digestão. A coluna de níquel é finalmente lavada com EDTA 50 mM, NaOH 0,5 M; água, NiCl2 5 mg/ml, água e armazenada em etanol a 20%.

Todas as etapas no isolamento e digestão do polipéptido HIS-CHIPS são verificadas por SDS-PAGE num gel Tris-Tricine Ready a 16,5% (BioRad) . As amostras são misturadas 1:1 com tampão de amostragem (Tris-HCl 200 mM, pH 6,8; SDS a 2%; glicerol a 40%; Coomassie a 0,04%), fervidas durante 5 minutos e carregadas no gel. A cauda HIS da proteína expressa contém um epitopo X-press que permite a detecção do produto HIS-CHIPS por transferência de Western, utilizando o anticorpo anti-X-press (Invitrogen). Adicionalmente, o polipéptido CHIPS é especificamente detectado com o anticorpo policlonal de coelho anti-péptido CHIPS. As proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose, bloqueadas com gelatina a 4% em PBS e pesquisadas com o anticorpo e o conjugado de anticorpo secundário marcado com peroxidase apropriado (Harlow & Lane, 1988, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory). A inibição, dependente da concentração, da expressão do receptor de fMLP (FPR) e de C5a (C5aR) em neutrófilos por CHIPS recombinante (rCHIPS) foi demonstrada da forma que se segue. As células foram incubadas com várias concentrações de rCHIPS durante 15 minutos à temperatura ambiente, colocadas em gelo e, em seguida, pesquisadas com fMLP marcado com BODIPY (ver Exemplo 1.2) ou com um anticorpo monoclonal dirigido contra o C5aR (clone 5 S/l, SeroTec) em combinação com um Ig secundário de cabra anti-ratinho marcado com FITC (DAKO, 1:30). Finalmente, as células foram lavadas e analisadas quanto à expressão dos receptores num aparelho FACScan, através de medição da fluorescência de 5.000 neutrófilos. A expressão dos receptores é comparada com as células tratadas com tampão e expressa como um valor relativo. 43 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ A redução, dependente da concentração, da libertação de cálcio livre intracelular induzida por fMLP e C5a em neutrófilos foi testada da seguinte forma. As células foram carregadas com uma sonda intracelular especifica para o cálcio (Fluo-3, éster acetoximetilico (AM); Molecular Probes) e incubadas com várias concentrações de rCHIPS durante 15 minutos à temperatura ambiente. 0 valor da fluorescência inicial de cada amostra foi determinado no equipamento FACScan, através da medição de 2.000 células. Subsequentemente, o estimulo foi adicionado (fmlp 10”9 M ou rC5a 10~10 M), e a intensidade de fluorescência da mesma amostra foi determinada exactamente 15 segundos após a administração do estimulo (o ponto temporal óptimo para ambos os agonistas). A activação dos neutrófilos com fMLP ou C5a dá inicio a um aumento rápido e transitório da concentração de cálcio intracelular livre, que é medida por meio de um aumento do sinal de fluorescência de Fluo-3. Subtrai-se o valor da fluorescência basal inicial de cada amostra activada. Os resultados são expressos como uma percentagem das células tratadas com tampão e estimuladas com fMLP ou com C5a.

RESULTADOS A Figura 11 é uma imagem representativa de um gel de SDS-PAGE ilustrando o polipéptido CHIPS recombinante purificado final (rCHIPS) . As duas pistas laterais (1 e 3) mostram o produto recombinante completo que é codificado pelo vector, gerando a proteína CHIPS com uma cauda de histidina adicional e um local de clivagem da enterocinase. Este codifica uma proteína com um peso molecular aparente de 21 kDa, enquanto CHIPS tratado com enterocinase e purificado tem um peso molecular de 17 kDa, tal como mostrado para a proteína CHIPS purificada natural de S.aureus (ver Exemplo 1.1 e Figura 2). O polipéptido rCHIPS purificado foi caracterizado por EM MALDI-TOF e revelou uma massa molecular de 14,12250; que é muito comparável à massa molecular prevista de 14,12217 baseada na sequência CHIPS.

As Figuras 12 e 13 ilustram a eficácia biológica. 44 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ EXEMPLO 7

Produção de uma proteína CHIPS sintética

Demonstrou-se, de acordo com o invento, que é possível produzir um polipéptido sintético que tem exactamente a mesma actividade que a proteína CHIPS natural e que CHIPS recombinante. 0 processo de produção é como se segue: A síntese do péptido ftfepfptneeiesnkkmlekekaykes- FKNSGLPTTLGKLDERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLNTPLAEDRKNVEL LGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAY em resina TGT possuindo tirosina protegida com 9-fluorenilmetiloxicarbonilo e com 0-ter-butilo [Fmoc Tyr (t-but)] ligada (5 g; 0,3 mmoles; NovaBiochem) foi transferida para um sintetizador peptídico e adicionou-se uma solução de piperidina (12 ml) em dimetilformamida (DMF; 18 ml) à resina. A solução foi girada durante 1 hora, e a resina lavada com dmf (3 x 30 ml), seguida de diclorometano (DCM; 3 x 30 ml) e deixada secar sob vácuo durante 5 minutos. Os restantes aminoácidos foram sequencialmente reunidos empregando síntese química Fmoc comum. A clivagem da proteína foi obtida por tratamento da resina contendo a proteína com uma solução de ácido trifluoroacético/tetraisopropilsilano/H20 [90:8:2 v/v/v] durante 2,5 horas. 0 produto em bruto (2,1 g) foi isolado por precipitação em éter, seguida de purificação por meio de cromatografia líquida de elevado desempenho. O produto purificado foi caracterizado por EM MALDI.

As referências que descrevem métodos similares são: E. Bayer et al. in: Peptides, Chemistry, Structure and Biology. Proceedings of the 13th American Peptide Symposium. RS Hodeges & JA Smith (eds) ESCOM, Leiden, (1994) p. 156. G Grubler et al. in: Innovation and perspectives in Solid Phase Synthesis 3rd International Symposium. RE Pron (ed) Mayflower Worldwide, Birmingham (1994) p. 517 EXEMPLO 8

Competição pela ligação de CHIPS ao seu receptor putativo MATERIAIS E MÉTODOS 8.1 Produção de CHIPS4-121 recombinante

Quando várias colónias de E. coli contendo o plasmídeo com CHIPS recombinante foram analisadas relativamente à 45 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ correcta inserção do gene chp por sequenciação, encontraram-se várias inserções incompletas. Uma delas que contém a cauda HIS completa, o local de clivagem da enterocinase e a proteína CHIPS menos os primeiros três aminoácidos (CHIPS4- 121 ; clone 19) foi adicionalmente propagada e purificada como descrito para CHIPS completo (ver Exemplo 6).

8.2 Competição com a ligação de CHIPS-FITC

Em tubos Falcon, prepararam-se diluições em série de 5 μΐ de CHIPS recombinante ou de CHIPS4-121 e misturaram-se com 5 μΐ de CHIPS-FITC (10 pg/ml; ver Exemplo 2) . Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de neutrófilos isolados numa quantidade de 5 x 106 células/ml e incubou-se durante 30 minutos em gelo. As células foram lavadas e analisadas relativamente à ligação de CHIPS-FITC por citometria de fluxo, como descrito no Exemplo 2.

RESULTADOS A Figura 14 ilustra a inibição, dependente da concentração, da ligação de CHIPS-FITC tanto por CHIPS recombinante completo como pelo mutante recombinante CHIPS4-121. Ambas as preparações apresentam um padrão de inibição similar com concentrações efectivas iguais.

Lisboa, 2011-03-01

Claims (18)

1. ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um (poli)péptido possuindo uma actividade de proteína inibidora da quimiotaxia de Staphylococcus aureus fCHIPS), em que a referida sequência nucleotídica corresponde a uma sequência seleccionada entre o grupo que consiste em: a) uma sequência nucleotídica compreendendo pelo menos parte da sequência representada na Figura 4 (SEQ ID NO 4); b) sequências nucleotídicas que codificam um (poli)péptido possuindo a actividade de CHIPS e possuindo a sequência de aminoácidos representada na Figura 5 (SEQ ID NO 5); c) sequências nucleotídicas que têm pelo menos 40% de identidade com qualquer uma das sequências nucleotídicas a) ou b); d) sequências nucleotídicas que hibridam em condições de estringência com qualquer uma das sequências nucleotídicas a), b) ou c) e e) sequências nucleotídicas complementares de qualquer uma das sequências nucleotídicas a), b) , c) ou d), em que as condições de estringência no passo d) consistem em hibridação durante a noite a 42°C em SSC 5x e lavagem a 65°C em SSC 0,lx, e em que a actividade de CHIPS é a capacidade para comprometer especificamente a ligação ligando-(C5a ou fMLP).
2. 2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a parte da sequência nucleotídica tal como definida na reivindicação 1 em a) corresponde aos nucleótidos 1 a 490 da Figura 4 (SEQ ID NO 4).
3. 3. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a parte da sequência nucleotídica tal como definida na reivindicação 1 em a) corresponde aos nucleótidos 41 a 490 da Figura 4 (SEQ ID NO 4) .
4. 4. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que a parte da sequência ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 2/3 nucleotídica tal como definida na reivindicação 1 em a) corresponde aos nucleótidos 125 a 490 da Figura 4 (SEQ ID NO 4) .
5. 5. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com as reivindicações 1 a 4, em que a sequência nucleotídica tal como definida na reivindicação 1 em c) tem pelo menos 50% de identidade com qualquer uma das sequências nucleotídicas a) ou b) .
6. 6. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência nucleotídica tal como definida em c) tem pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das sequências nucleotídicas a) ou b).
7. 7. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 6, em que a sequência nucleotídica tal como definida em c) tem pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das sequências nucleotídicas a) ou b).
8. 8. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com as reivindicações 1 a 7, em que o ácido nucleico é um ADN, um ARN OU um ADNc.
9. 9. Vector recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada de acordo com as reivindicações 1 a 8.
10. 10. Método para preparar um vector recombinante, compreendendo a inserção de pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada de acordo com as reivindicações 1 a 8 num vector.
11. 11. Hospedeiro procariótico recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada de acordo com as reivindicações 1 a 8, um vector de acordo com a reivindicação 9.
12. 12. Hospedeiro recombinante de acordo com a reivindicação 11, em que o hospedeiro é seleccionado entre o grupo constituído pelas bactérias Escherichia coli, Bacillus subtilis ou Staphylococcus aureus. ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 3/3
13. 13. Método para produzir um (poli)péptido recombinante possuindo uma actividade de CHIPS, compreendendo a cultura de um hospedeiro recombinante de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em condições tais que o referido (poli)péptido é expresso, e a recuperação do referido (poli)péptido, em que a actividade de CHIPS é a capacidade para comprometer especificamente a liqação liqando-(C5a ou fMLP).
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o hospedeiro é uma célula de Escherichia coll.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o hospedeiro é uma célula de Staphylococcus aureus.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a célula de Staphylococcus aureus é de uma estirpe que já produz uma proteína endógena possuindo a actividade de CHIPS (CHIPS) .
17. 17. Método para isolar, a partir de um organismo, um gene que codifica uma proteína possuindo uma actividade de CHIPS, compreendendo o rastreio de uma biblioteca genómica ou de ADNc desse organismo com uma sonda à base da molécula de ácido nucleico de acordo com as reivindicações 1 a 8, o isolamento dos clones positivos e o teste para verificar se os clones positivos apresentam a actividade de CHIPS, em que a actividade de CHIPS é a capacidade para comprometer especificamente a ligação ligando-(C5a ou fMLP).
18. 18. Teste diagnóstico para utilização no diagnóstico de doentes infectados por Staphylococcus aureus quanto à presença, no S. aureus infeccioso, do gene CHIPS, em que o teste é um teste de PCR para o qual os iniciadores são concebidos com base na sequência nucleotídica representada na Figura 4 (SEQ ID NO 4). Lisboa, 2011-03-01 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 1/15 FIG.1

    CD Ο CD LO CM LO co M- m- m· o ·*· CD CO CM CM CO 00 CM M" CM O CM wj*sr o CO

    SDS-PAGE corado com Coomassie Fracções de Mono Q 39 40 41 M 42 43 44 45

    FIG.2 Μ D μ Ligação de CHIPS-FITC a leucócitos humanos Fluorescência

    Concentração de CHIPS-FITC (ng/ml) Id/06Z. EP 1 244 790/PT 4/15 ATAAATTTAAATATAGAATTTAAGGAGAATTAACATCATTATGAAAAAGAAATTAGCAACAACAGTTT 0oo 3o f-< H 3 U t-> 3 oo 3o 3 u 3 tHo 3o tHs o 0 3 u CD CD Os Eh £h Eh tn Eh O Eh Eh 3 U CD 3 Eh tH <T ΚΩ 3 Eh 3 0 0 3 3 Eh 0 Eh Eh Ej 3 0 Eh 0 3 3 Eh Eh ίΐ EH Eh Eh 3 Eh 0 0 Eh Eh Eh Eh 3 0 Eh 0 3 3 0 | 0 3 Eh 3 0 h 0 Eh 3 0 0 3 0 <J 0 Eh Eh Eh pí 3 0 3 Eh 3 Eh 0 Ei Eh 3 0 Eh Eh 0 0 3 0 Eh O Eh Eh 0 Eh 3 0 Eh Eh Eh 3 3 0 3 Eh o 3 3 3 U Eh Eh 0 Eh Eh 3 Eh Eh Eh £h 0 Eh Eh 3 Eh 3 Eh 0 3 3 H 3 Eh Ej Eh Eh 3 0 0 3 rf: Eh 3 Eh 0 0 3 3 3 3 0 3 Eh EH Eh 3 Eh 0 0 t£ 3 0 0 0 (2 0 tH 3 3 3 3 3 3 Eh pí EH 0 3 O p? 3 Eh 3 3 0 3 0 3 EH 0 0 3 3 Ej 3 Eh 3 3 3 3 Eh 0 Eh 3 O Eh EH O 3 3 3 0 Eh Ej Eh 3 0 0 3 O 0 Eh 3 0 0 tH Eh 0 3 Eh 0 0 3 Eh Eh 0 3 0 Eh 0 Eh 0 0 0 Eh 0 0 3 3 0 Eh 3 3 Eh 0 Eh 0 3 0 Eh 3 3 3 0 3 Eh 3 Eh 3 3 3 3 3 E-J 3 3 Eh 3 3 0 Eh Eh 3 Eh Eh 0 3 o O 0 3 pi 3 Eh Eh Ej 3 o 3 Eh 3 Eh 0 E~> 0 υ Eh 0 3 3 o Eh 3 . Eh Eh Ej 3 3 0 3 3 0 3 3 0 Eh Eh 0 0 3 3 3 3 3 3 3 IO n rH (Ti O f" -a* O r~ <N1 CSJ oo -¾1 Tfd LL EHoss s EH EH EHo O ts O Eh Eh 3 CD ri! lO 'vP IO ie:/ 06V. 17 iz s τ da Sequência de aminoácidos derivada de CHIPS FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGE DERLRNYLKKGTKNSAQFEKMV1LTEMGYYTVYLNTPL AEDRKNVELLGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAY FI6.5 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 6/15 PCR do gene chips em S. aureus 1. S.aureus Newman 2. S.aureus Newman 3. S.aureus Coi 4. S.aureus Col 5. S.aureus 1690 6. S.aureus 1690 FIG.6 PCR em S. aureus

    ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 7/15

    Distribuição do gene CHIPS entre estirpes de S. aureus

    8/15 μ ΙΌ £ -J O \ D H 0% 20% 40% 60% 80% 100% Percentagem de estirpes positivas Μ D Anticorpo policlonal específico para CMIPS (coelho): revestimento de péptido : vj O \ D H

    Concentração de anticorpo (pg/ml) Id/06Z. T <33 Anticorpo policlonal específico para CHIPS (coelho): revestimento de CHIPS

    ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 11/15

    100% ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 12/15

    HIS-CHIPS rCHIPS FIG.11 ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 13/15 Fig. 12 Actividade de rCHIPS sobre a expressão de receptores

    ConcCHIPS (ng/ml) ΕΡ 1 244 790/PT 14/15 Fig. 13 Efeito de rCHIPS sobre sinalização do cálcio

    Cone rCHIPS (ng/ml) ΕΡ 1 244 790/ΡΤ 15/15 Fig. 14 ϋ (0 ÇL χ ο ω Ό Ο ΐ(0 θ' (0 σ (0 Ό Ο ΐ(0 θ' !5 c

    1 10 Concentração de CHIPS ^g/ml) 100