ES2382422T3 - Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con actividad chips. - Google Patents
Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con actividad chips.Info
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un (poli)péptido con actividad de la Proteína Inhibidora de la Quimiotaxis de Staphylococcus aureus (CHIPS), dicha secuencia de nucleótido correspondiendo a una secuencia que es seleccionada del grupo consistente de: a) una secuencia de nucleótido que comprende al menos parte de la secuencia como se representa en la Figura 4 (SEC ID NO 4); b) secuencias de nucleótidos que codifican un (poli)péptido con actividad CHIPS y que tienen la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 5 (SEC ID NO 5); c) secuencias de nucleótidos que son al menos 40% idénticos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) o b); d) secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a), b) o c), y e) secuencias de nucleótidos complementarias a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a), b), c) o d), donde las condiciones rigurosas en el paso d) están constituidos por hibridación durante la noche a 42ºC en 5xSSC y lavado a 65ºC en 0.1xSSC y donde la actividad CHIPS es la capacidad de comprometer específicamente la unión ligando-(C5a o MLP).
Description
Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con
actividad CHIPS.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico que codifica un (poli) péptido con actividad
CHIPS. La invención también se refiere al uso de la información
contenida en el ácido nucleico para la preparación del (poli)
péptido correspondiente y a los vectores y huéspedes para uso en el
mismo. La invención en adición se refiere a moléculas no (poli)
péptidos que tienen una estructura y función similar a la de los
(poli) péptidos. El (poli) péptido que tiene actividad CHIPS que
esta codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención
puede ser utilizado en el tratamiento de reacciones de inflamación.
Los (poli) péptidos y no (poli) péptidos pueden en adición ser
utilizados para inhibir la activación de leucocitos y células
endoteliales.
Los leucocitos se dedican principalmente a la
protección del cuerpo contra invasores foráneos (ej., bacterias,
virus, hongos y células cancerosas). Las células más importantes son
los linfocitos, monocitos y neutrófilos. Los linfocitos forman el
sistema inmune específico y causan reacciones inmunes contra los
invasores. Su tarea más importante es construir memoria específica
contra el invasor, de modo que la próxima vez que el invasor entra
al cuerpo es reconocido, muerto y eliminado rápidamente. Algunas
veces estos linfocitos no solo atacan a los invasores, también
reaccionan contra ciertas estructuras y/o moléculas (llamadas
autoantígenos) del propio cuerpo, que causan enfermedades
autoinmunes (ej., la artritis reumatoide). La matanza y eliminación
de los invasores se hace principalmente por monocitos y neutrófilos,
células del sistema inmune innato, mediante reconocimiento directo
de los invasores o con la ayuda de linfocitos específicos.
En contraste con la delicada red de las
reacciones afinadas y controladas de linfocitos, las células del
sistema innato reaccionan de una manera relativamente no especifica
y agresiva. Ya que son parte de la primera línea de defensa del
cuerpo, su tarea más importante es matar y eliminar el agente
invasor tan pronto como sea posible. Esto se lleva a cabo a través
de sustancias muy agresivas (ej., radicales libres y enzimas) que no
solo son letales para el invasor, sino también causan daño a las
células huéspedes en las proximidades. Sustancias de estas células
dañadas y las células activadas localmente del sistema innato en si
atraerán además un número creciente de neutrófilos y monocitos,
causando inflamación local. En muchos casos, tal reacción
inflamatoria agresiva y perjudicial, causada por neutrófilos
sobreactivados, es innecesaria. En algunos casos esta respuesta
inflamatoria es responsable de trastornos graves, a veces letales e
incluye condiciones como el Síndrome de Dificultad Respiratoria
Adulta (SDRA), daño severo del tejido después de eventos trombóticos
tales como ataques cardiacos y accidentes cerebrovasculares,
enfermedades inflamatorias del intestino y artritis reumatoide. La
inflamación disminuirá una vez que todos los invasores han sido
muertos y eliminados, juntos con las diversas células muertas en el
proceso. La curación de la herida, causada por la respuesta
inflamatoria, puede entonces empezar. Aunque hay algún solapamiento
en función, la tarea principal de los neutrófilos es atacar a los
invasores y la tarea principal de los monocitos es eliminar los
desechos resultantes de este ataque. En adición, los neutrófilos
tienen otra tarea pacifica en la asistencia al proceso de
cicatrización de la herida.
Cuando las bacterias han invadido el cuerpo y,
por ejemplo, infectado el sistema nervioso central (como en la
meningitis) empiezan a producir sustancias microbianas, que incluyen
los polipéptidos formilados (como el péptido fMLP). Otras sustancias
de origen microbiano activan el complejo enzimático convertasa
factor de complemento 5 (C5), que convierte el C5 del sistema de
complemento en su forma activada C5a. Ambos C5a y fMLP son
quimio-atrayentes: sustancias que pueden activar y
atraer células de los vasos sanguíneos (el proceso de migración).
Los neutrófilos responden a estas dos sustancias y también a la
interleucina -8 (IL-8). Esta "quimioquina" (el
nombre dado a los quimio-atrayentes que son
producidos por células del sistema inmune) es producida
principalmente por monocitos activados (pero también en pequeñas
cantidades por los propios neutrófilos activados). Los neutrófilos
interactúan con estas sustancias, debido a que tienen receptores
para estas sustancias en el exterior de su membrana celular.
Los neutrófilos activados pueden fácilmente
migrar de los vasos sanguíneos. Esto es debido a que los
quimio-atrayentes, productos microbianos y
sustancias de monocitos activados habrán incrementado la
permeabilidad de los vasos y estimulado las células endoteliales de
las paredes de los vasos para expresar ciertas moléculas de
adhesión. Los neutrófilos expresan selectinas e integrinas (ej.,
CD11b/CD18) que se unen a estas moléculas de adhesión. Una vez que
el neutrófilo se adhirió a las células endoteliales, es capaz de
migrar a través de las células, bajo la dirección de
quimio-atrayentes/quimioquinas, hacia el sitio de
infección, donde la concentración de estas sustancias está a su
nivel más alto. Estas sustancias también activan neutrófilos para
producir una gama de otras moléculas, algunas de las cuales atraen
más neutrófilos (y subsecuentemente monocitos), pero, en su mayoría,
son responsables de destruir las bacterias invasoras. Alguna de
estas sustancias (ej., radicales libres, enzimas que descomponen las
proteínas (proteasas) y membranas celulares (lipasas)) son tan
reactivas y no especificas que células del tejido circundante (y los
neutrófilos en si) son destruidas, causando daños en los tejidos.
Este daño es exacerbado por la presencia de fluido derivado de la
sangre que ha traspasado la pared del vaso con fugas y es
responsable de la hinchazón que siempre acompaña a la inflamación
(llamada edema). La acumulación de presión causada por este exceso
de fluido resulta en el daño celular adicional y muerte.
Más tarde en el proceso inflamatorio, los
monocitos migran a la escena y se activan. Además de su labor en la
eliminación de bacterias y desechos celulares, también producen
sustancias tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) y
IL-8, que a su vez atrae más neutrófilos activados,
causando daños locales adicionales. TNF también tiene un efecto
estimulatorio directo en los neutrófilos. Una vez que todos los
invasores han sido eliminados, la respuesta inflamatoria disminuirá
y el área se despejara de las "víctimas" restantes. Entonces
comienza el proceso de cicatrización de la herida. Aunque se sabe
que los neutrófilos juegan un papel fundamental en la cicatrización
de heridas, no está claro qué sustancias derivadas de los
neutrófilos están implicadas y cómo los neutrófilos están activos en
la cicatrización sin ser agresivos para el tejido circundante. En
general, el tejido dañado será reemplazado por tejido cicatricial
formado principalmente de fibroblastos y colágeno. Cuando ocurre la
inflamación en áreas del cuerpo con una importante función, como los
tejidos formados a partir de células del músculo del corazón, las
células del cerebro o las células alveolares del pulmón, la función
normal se verá comprometida por la formación de la cicatriz
resultante, causando serios trastornos como insuficiencia cardiaca,
parálisis y enfisema. Para minimizar las consecuencias debilitantes
de estos trastornos, es importante "amortiguar" la reacción
inflamatoria lo más rápidamente posible.
La intervención para controlar la respuesta
inflamatoria aguda de fase temprana presenta una oportunidad para
mejorar el pronóstico para una amplia variedad de pacientes cuyos
síntomas pueden reconocerse como procedentes de tal evento. Este
enfoque ha sido defendido para muchas enfermedades basadas en
inflamaciones crónicas y agudas y que tienen potencial basado en
descubrimientos de modelos relevantes de enfermedades. Medicamentos
anti-inflamatorios clásicos tales como esteroides y
Medicamentos Anti-Inflamatorios No Esteroideos
Anti-Inflamatorios (MAINEAIS) no tienen el perfil
ideal de acción, ya sea en términos de eficacia o seguridad. Los
esteroides afectan el tipo de células "equivocado" (monocitos)
y sus efectos de amortiguación son fácilmente evitados. MAINEAIS
generalmente muestran un efecto relativamente leve en parte debido a
que intervienen en una etapa tardía en el proceso inflamatorio.
Ambas clases de medicamentos producen una serie de efectos
secundarios indeseables resultantes de otros aspectos de su
actividad farmacológica. Los medicamentos que actúan directamente y
específicamente para evitar la migración y activación de neutrófilos
pueden tener un número de ventajas. Varios medicamentos en
desarrollo temprano solo interfieren con un aspecto individual de la
activación de neutrófilos (ej., inhibidores de la convertasa C5,
anticuerpos contra C5a, medicamentos bloqueantes de receptores C5a)
y migración (anticuerpos contra integrinas (como CDIIb/CD18) y
L-selectina en neutrófilos y anticuerpos contra
moléculas de adhesión (como ICAM-1 y
E-selectina) en células endoteliales). Los
anticuerpos contra TNF y IL-8 tienen efectos en la
inflamación crónica, pero solo efectos marginales en la inflamación
aguda, debido a la función mínima que los monocitos (que son
principalmente responsables de la producción de estas sustancias)
juegan en la fase aguda.
A veces, la causa de la inflamación aguda no
puede ser eliminada y la inflamación se vuelve crónica. Con
excepción de la tuberculosis, hepatitis crónica y otras condiciones,
esto es raramente el caso de las infecciones. Sin embargo, la
inflamación crónica puede también ser causada por estímulos
diferentes que las bacterias, tales como reacciones autoinmunes. La
investigación ha demostrado que en la inflamación crónica el papel
de los monocitos es mucho más prominente, y que la migración y
activación de neutrófilos, la migración y activación del monocito,
el daño tisular, la eliminación de células muertas y la curación de
la herida van todos al mismo tiempo. Esta compleja cascada de
interacciones entre células y muchas diferentes citocinas y
quimiocinas ha sido el objeto de investigación intensiva durante
muchos años. Se creyó que los monocitos y sus productos eran los
elementos más importantes que necesitaban ser inhibidos para
amortiguar la inflamación crónica. Esto explica por qué los
esteroides, que interactúan específicamente con los monocitos, son
generalmente más efectivos en la inflamación crónica que en la
aguda. El tratamiento a largo plazo con esteroides sin embargo, no
es una opción deseable, debido a que pueden ocurrir efectos
secundarios graves e inaceptables a las dosis requeridas para
producir un efecto clínico. Los nuevos tratamientos con anticuerpos
contra TNF o IL-8 han demostrado buenos resultados,
y fueron vistos inicialmente como una prueba del papel importante
que se pensó que los monocitos jugaban en la inflamación crónica. La
investigación reciente pone en duda un papel exclusivo para los
monocitos en la inflamación y apunta a un papel crítico para los
neutrófilos, que se ve ahora que representan mejores objetivos para
la intervención terapéutica.
La causa subyacente de una enfermedad
inflamatoria crónica no siempre es clara, y la causa original puede
no siempre ser responsable de la recurrencia futura. Algunos
científicos creen que en ciertas enfermedades inflamatorias crónicas
hay un ciclo continuo de eventos. Su idea es que los neutrófilos y
monocitos activados existentes continuamente atraen y activan nuevos
grupos de células, perpetuando de este modo la respuesta
inflamatoria incluso cuando los estímulos iniciales ya no están
presentes. Esto sugeriría que un tratamiento agudo o periódico con
un inhibidor eficaz de la activación del neutrófilo y monocito
pararía el ciclo de reclutamiento de células nuevas, llevando en su
debido tiempo a la modificación de la progresión de la enfermedad, o
incluso a una cura completa, y no solo un alivio sintomático.
En la investigación que condujo a la presente
invención un nuevo agente con propiedades inhibidoras de la
inflamación se encontró en el medio extracelular de crecimiento de
Staphylococcus aureus (S. aureus). Este agente es el
objeto de la solicitud co-pendiente PCT/NL99/00442.
Este agente se encontró que era capaz de bloquear directa o
indirectamente diferentes receptores de quimioquinas. La incubación
de diferentes células con el medio resultó en una expresión reducida
en gran medida de un número de los receptores de quimioquinas, tanto
de la expresión de los receptores de agentes quimiotácticos clásicos
como el fMLP y C5a en granulocitos y de la expresión de receptores
CXCR4 y CCR5 en linfocitos, monocitos y macrófagos. La reducida
expresión del receptor estaba relacionada con la quimiotaxis
reducida a gran medida relativa a las quimioquinas, así como a una
infección reducida con HIV.
La actividad de la proteína está ya manifiesta
en el cultivo supernatante del crecimiento de S. aureus. La
proteína activa podría estar más purificada, por ejemplo por medio
de un número de columnas Ligand Dye. Se realizo primero una
pre-purificación en la llamada "columna
amarilla" (tinte ligando "Reactivo Amarillo 86" reticulado
4% columna de agarosa perlada (Sigma)), seguido por una columna de
absorción cromatográfica (la llamada "columna verde" (tinte
ligando "Reactivo Verde 19" reticulado 4% columna de agarosa
perlada (Sigma)) y una columna de ADN (Celulosa ADN (Pharmacia)).
Estas últimas columnas pueden ser intercambiadas. La columna ADN
elimina un contaminante con el mismo peso molecular que la proteína.
La columna de absorción cromatográfica concentra la proteína y es
selectiva para la proteína. Finalmente, una
post-purificación también tiene lugar por medios de
filtración de gel y cromatografía de intercambio de aniones (MonoQ,
Pharmacia). En la filtración de gel la proteína con el peso
molecular de unos 17 kDa es seleccionada. Esta es la proteína que se
encontró que tenía propiedades inhibidoras de quimiotaxis. Debido a
que esta proteína es aislada del supernatante de la
Staphylococcus aureus y da inhibición de las quimiotaxis,
esta proteína fue llamada "CHIPS": "CHemotaxis
Inhibitory Protein from Staphylococcus
aureus" Proteína Inhibidora de Quimiotaxis del
Staphylococcus aureus (también referido aquí como "CHIPS
original").
El aislamiento de la proteína CHIPS fuera del
supernatante de S. aureus no es muy rentable. En adición, es
deseable para el uso práctico de CHIPS en terapia que la parte
activa de la proteína esté aislada. Moléculas más pequeñas de
proteínas o péptidos tienen un riesgo reducido de inducir una
respuesta inmunológica en un sujeto que recibe la proteína o péptido
durante la terapia. Además, es deseable que sea capaz de modificar
la proteína o péptidos para incrementar la actividad biológica y/o
disminuir la inmunogenicidad de la misma.
Es por lo tanto el objeto de la presente
invención proporcionar los medios para la producción de la proteína
CHIPS original u otros (poli)péptidos correspondientes que
tienen actividad CHIPS, así como fragmentos funcionales, derivados o
análogos de los mismos que no sea por aislamiento de la célula
huésped producida naturalmente.
La presente invención por tanto proporciona una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica un (poli)péptido que tiene actividad
CHIPS, dicha secuencia de nucleótidos correspondiendo a una
secuencia que se seleccionada del grupo consistente de:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que comprende al menos parte de la secuencia que se muestra en la Figura 4 (SEC ID NO 4);
- b)
- secuencias de nucleótidos que codifican un (poli)péptido con actividad CHIPS y con la secuencia de amino ácido mostrada en la Figura 5 (SEC ID NO 5);
- c)
- secuencias de nucleótidos que son al menos 40% idénticas a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) o b);
- d)
- secuencias de nucleótidos que hibridizan en condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a), b), o c), y
- e)
- secuencias de nucleótidos complementarias a cualquiera de las secuencias a), b), c) o d), donde las condiciones estrictas en el paso d) consisten en la hibridización repentina a 42ºC en 5xSSC y lavado a 65ºC en 0.1xSSC, y donde la actividad CHIPS es la capacidad de perjudicar específicamente la unión del ligando-(c5a o fMLP).
\vskip1.000000\baselineskip
En cuanto a la identidad u homología, como se
menciona en el punto d) debe notarse que para alineamientos
espaciados, pueden estimarse parámetros estadísticos utilizando el
algoritmo de Smith-Waterman que produce resultados
óptimos de alineación. Homólogos de la secuencia de ácido nucleico o
secuencia de proteína CHIPS están definidos por una Penalización
Abierta Espaciada de al menos 12 y una Penalización de Expresión
Espaciada de al menos 1.
"Actividad CHIPS" se define en este
documento como la capacidad de impedir específicamente por lo menos
las respuestas inducidas por ambos fMLP y C5a, incluyendo al menos
impedimento de la unión del ligando-(C5a o fMLP), y opcionalmente el
impedimento de la quimiotaxis y la activación celular (ej.,
movilización de calcio). Sin embargo los (poli)péptidos
pueden en adición tener otras actividades biológicas, tales como un
efecto inhibidor en la activación de leucocitos y células
endoteliales.
En la descripción que sigue los términos
"proteína CHIPS" y "gen CHIPS" o "gen chp" son
utilizados por la proteína aislada del supernatante de la forma
natural de S. aureus, y su gen aislado, respectivamente.
"(Poli)péptido con actividad CHIPS" y "molécula de
ácido nucleico que codifica un (poli)péptido con actividad
CHIPS" son utilizados para todo otro correspondiente
(poli)péptido y molécula de ácido nucleico que están de
alguna manera relacionados a o derivados de la proteína o gen CHIPS
pero tienen un amino ácido o secuencia de nucleótidos que no es
idéntica al mismo. La actividad CHIPS como se define más arriba es
una característica inherente de los presentes (poli)péptidos.
Este efecto será demostrado por la proteína CHIPS en el Ejemplo
5.
La secuencia como dada en la Figura 4 (SEC ID NO
4) es la secuencia ADN como aislada según la invención. Comprende
una región promotora de nucleótidos de 1 a 40, una secuencia líder
de péptidos de nucleótidos de 41 a 124, la región codificante para
el (poli)péptido teniendo actividad CHIPS del nucleótido 125
al 490, así como una región sin traducir 3' para los nucleótidos 491
al 603.
En una primera realización de la invención, la
molécula aislada de ácido nucleico tiene una secuencia de
nucleótidos que corresponde a nucleótidos de 1 a 490 de la Figura 4.
En una realización alternativa la región promotora ya no está
presente. En esta realización la secuencia de nucleótidos de la
molécula de ácido nucleico corresponde a los nucleótidos 41 a 490 de
la Figura 4. Con esta molécula de ácido nucleico puede usarse una
secuencia promotora diferente y/o otras secuencias de transcripción
regulatorias. La elección de una promotora y/o otras secuencias
regulatorias depende de las condiciones en las que la transcripción
tomará lugar. El experto en la materia es capaz de seleccionar una
promotora adecuada y/o otra regiones de transcripción
regulatoria.
El gen CHIPS aislado de la Figura 4 o cualquier
ácido nucleico derivado del mismo puede por ejemplo ser vinculado
operativamente al sistema de expresión trc (Brosius et al.,
Gen 27:161-172 (1984)). Muchas otras secuencias
adecuadas de control de expresión y métodos de expresión de
proteínas recombinantes son conocidas (F.M. Ausubel et al.,
Protocolos Actuales en Biología Molecular, Jhon Wiley E hijos, Inc.,
Nueva York, N.Y.).
La secuencia de nucleótidos como se da en la
Figura 4 también contiene una secuencia de péptido líder. La región
codificante de la proteína madura correspondiente a los nucleótidos
125 a 490 de la Figura 4. Otras secuencias líderes pueden ser
utilizadas. O la secuencia líder puede ser omitida en su totalidad,
dependiendo de la célula huésped en que la secuencia debe ser
expresada.
La secuencia de amino ácido en la Figura 5 es
deducida de la secuencia de ADN en la Figura 4. En otra realización
de la invención la molécula de ácido nucleico por lo tanto puede
tener una secuencia de nucleótidos que corresponde a todas las
variantes degeneradas del gen CHIPS asilado.
También se describen aquí las moléculas de ácido
nucleico que codifican (poli)péptidos que no tienen la
secuencia completa de la Figura 5 sino una o más porciones
funcionales de los mismos que en si mismas o en conjunto constituyen
un (poli)péptido biológicamente activo con actividad CHIPS.
Tales porciones pueden variar en tamaño desde la secuencia de
aminoácido completa menos un amino ácido a péptidos de al menos 2,
preferiblemente al menos 5 amino ácidos. En caso de que la parte
activa de la proteína descansa en dos o más porciones de la
secuencia de amino ácido completa, la secuencia de ácido nucleico
puede codificar estas porciones separadas de una forma que lleve a
una configuración de péptido que retenga la actividad biológica. En
la práctica esto puede por ejemplo significar que las secuencias
espaciadoras deben ser incorporadas entre las porciones
biológicamente activas para dar lugar a una conformación
biológicamente activa.
Por lo tanto, cuando se haga referencia a "al
menos parte de la secuencia" esto significa no solo las tres
partes descritas anteriormente (e.d. nucleótidos
1-490, 41-490 y
125-490) sino también a otros fragmentos del gen o
combinaciones de los mismos siempre que todavía codifiquen un
(poli)péptido con actividad CHIPS. También se describe en
este documento una molécula de ácido nucleico aislada de la
invención que consiste en la región codificante de uno o más
porciones de la secuencia de amino ácido de la Figura 5, donde una
porción de la secuencia de amino ácido constituye sola o con otras
porciones de la secuencia de amino ácido la(s)
región(es) del (poli)péptido con actividad CHIPS que
dan lugar a la actividad biológica.
La presente invención no esta limitada a
moléculas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia exacta
como la secuencia mostrada en la Figura 4 o las variantes descritas
más arriba de la misma. Por lo tanto, según la invención son
proporcionadas moléculas de ácido nucleico adicionales con una
secuencia de nucleótido que es al menos 40%, preferiblemente al
menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, incluso más
preferiblemente al menos 70%, mayormente preferible 80%, y lo más
preferible al menos 90% idéntica a cualquiera de las secuencias de
nucleótidos según a), b) o c).
Se encontró que CHIPS es menos de 40% homólogo
con proteínas y péptidos conocidos hasta la fecha. Las proteínas y
péptidos que muestran al menos 40% de homología de aminoácidos a la
proteína CHIPS y tienen la actividad CHIPS por tanto son también
parte de esta invención.
La invención además se refiere a moléculas de
ácido nucleico con secuencia de nucleótido que se hibridizan bajo
condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico que
corresponde con la secuencia de nucleótido dada en la Figura 4 o
secuencias degeneradas de la misma, que codifican una secuencia de
amino ácido como la dada en la Figura 5. Las condiciones rigurosas
están constituidas por la hibridación repentina a 42ºC en 5xSSC (SSC
= 150 mM NaCl, 15 mM citrato trisódico) y lavado a 65ºC a 0.1xSSC.
En adición a 5xSSC la solución de hibridación puede comprender 50%
de formamida, 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5x solución de
Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 g/ml de ADN de esperma de
salmón cortado desnaturalizado.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en
este documento no están limitadas al gen que codifica el
(poli)péptido con actividad CHIPS, sino que también se
refieren a moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos,
derivados y análogos del mismo. Los "fragmentos" se pretende
que abarquen todas las partes del (poli)péptido que retiene
su actividad biológica. Los "fragmentos" pueden consistir de
una secuencia de aminoácidos consecutivos o de más de una de estas
secuencias. Los "derivados" son el (poli)péptido
completo con actividad CHIPS o fragmentos del mismo que son
modificados de alguna manera. Ejemplos de modificaciones seguirán
abajo. Los "análogos" son (poli)péptidos similares con
actividad CHIPS aislada de otros organismos, en particular otros
organismos patógenos. Todas las categorías anteriores tienen una
cosa en común, en concreto que tienen "actividad CHIPS". La
actividad CHIPS puede ser medida por cualquier ensayo que muestre
migración directa de leucocitos hacia un estímulo quimiotáctico
apropiado. Ejemplos de tales ensayos incluyen la técnica bajo
agarosa (como se ejemplifica en Balasoiu, et al., Diabetes
care 20: 392-395 (1997)), técnicas de cámara Boyden
modificadas y sistemas trasnwell. La ultima técnica está
adicionalmente ilustrada en los ejemplos.
Por tanto, para la presente aplicación, el
termino "(poli)péptidos con actividad CHIPS" pretende
incluir la proteína CHIPS original, (poli)péptidos,
fragmentos, derivados y análogos que exhiben actividad CHIPS.
La molécula de ácido nucleico aislada según la
invención puede ser ADN, ARN o ADNc.
Son adicionalmente descritos en este documento
sondas y cebadores derivados de la molécula de ácido nucleico de la
invención. Tales cebadores son oligonucleótidos o polinucleótidos de
al menos 10 nucleótidos (nt) consecutivos, y más preferible de al
menos unos 25 nt, aun más preferible de al menos unos 30 nt, e
incluso más preferiblemente de unos 30-70 nt de la
molécula de ácido nucleico de la invención. Las sondas son más
largas y pueden por ejemplo ser una porción de la molécula de ácido
nucleico de la invención de 50-300 nt consecutivos,
o incluso tan largas como la molécula entera de ácido nucleico.
Tales oligonucleótidos o polinucleótidos son
útiles como sondas de diagnóstico o como sondas en técnicas de
hibridación convencional de ADN o como cebadores para la
amplificación de una secuencia objetivo por la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) según se describe por ejemplo en Ausubel et
al. (supra).
Además, la invención se refiere a un vector
recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico
de la invención aislada. El vector a ser utilizado puede ser
seleccionado por el experto en la materia basado en su conocimiento
común general y dependerá del huésped que se utiliza.
También son descritos en este documento las
bacteriófagos que comprenden al menos un ácido nucleico de la
invención aislado. En muchos Staphylococci positivos a CHIPS, el gen
que codifica CHIPS esta ubicado en un profago y puede volverse un
fago activo, por ejemplo mediante tratamiento con mitomicina según
los procedimientos de aislamiento de fago estándares y publicados.
Un bacteriófago es por tanto un vehículo útil para introducir en gen
CHIPS en un huésped.
En adición la invención se refiere a un método
para fabricar un vector recombinante, que comprende la inserción de
al menos una molécula de ácido nucleico aislada de la invención
dentro de un vector. Mediante la incorporación de más de una copia
en el vector, o introduciendo más de un vector dentro de un huésped
el nivel de expresión puede ser influenciado. Cuando es utilizada
una célula huésped que comprende un gen endógeno para un
correspondiente (poli)péptido con actividad CHIPS, el nivel
de expresión de la misma puede ser incrementado mediante la
introducción de más copias de una molécula de ácido nucleico (e.d.
el gen) dentro de la célula huésped o cambiando el promotor o las
regiones reguladoras.
La invención así también se refiere a huéspedes
recombinantes que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico
o un vector de la invención aislado. Un número de tipos de células
pueden actuar como huésped adecuado para la expresión de
(poli)péptidos recombinantes con actividad CHIPS. Las células
huésped incluyen la ampliamente utilizada cepa bacteriana
Escherichia coli incluyendo, pero no limitado a, el sistema
de expresión trc (Brosius et al., supra) que permite la
expresión regulada de alto nivel de promotor trc. Otras cepas
bacterianas potencialmente adecuadas incluyen cepas de bacterias
Gram-positivas, tales como Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, o cualquier cepa bacteriana capaz de
expresar proteínas heterólogas. Un proceso de producción preferido
en E. coli es dado en el Ejemplo 6.
El (poli)péptido con actividad CHIPS
puede también ser producido como una proteína recombinante
utilizando un sistema de expresión adecuado empleando eucariotas
inferiores tales como levaduras o células de insecto. Cepas de
levaduras adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia
pasatoris, Candida o cualquier cepa de levadura capaz de
expresar proteínas heterólogas. Las células de insectos usados para
la expresión de la proteína recombinante incluyen el sistema
Drosophila y el sistema Baculovirus. Alternativamente, puede
ser posible producir el (poli)péptido con actividad CHIPS en
un sistema de expresión mamífero que incluye varias células huésped
adecuadas, incluyendo células de mono COS, células de hámster CHO,
BHK o células RBL-2H3, 293 humano, 3T3, HeLa, U937,
HL-60 o Jurkat, células L de ratón y otras células
transformadas para cultivo in Vitro. Para la expresión de
(poli)péptidos con actividad CHIPS en los sistemas
eucarióticos, puede ser necesario modificar la proteína producida en
ellos con el fin de obtener una proteína funcional. Tales
modificaciones, como acoplamientos o sustituciones pueden ser
logradas utilizando métodos químicos o enzimáticos conocidos. En
adición, las secuencia de la molécula de ácido nucleico puede ser
adaptada al uso de codones de la célula huésped.
El (poli)péptido con actividad CHIPS
puede también ser expresado como un producto de animales
transgénicos, ej., como un componente de la leche de vacas, cabras,
cerdos, ovejas, conejos o ratones transgénicos que están
caracterizados por células somáticas o germinales que contienen una
secuencia de nucleótidos que codifica el (poli)péptido con
actividad CHIPS.
El (poli)péptido puede ser preparado
mediante el cultivo de células huésped transformadas bajo
condiciones de cultivo adecuadas para expresar la proteína
recombinante. La proteína resultante puede ser entonces purificada
del medio de cultivo o extractos de células utilizando un proceso de
purificación, que comprende por ejemplo los pasos de guiar a través
de una columna de cromatografía de absorción el supernatante del
cultivo de la célula huésped o un líquido obtenido del mismo después
de la pre-purificación; posteriormente guiando el
flujo continuo de la columna de cromatografía de absorción primero
sobre una columna de cromatografía de afinidad y posteriormente
guiando el eluato de la columna de cromatografía de afinidad sobre
una columna de ADN; o posteriormente guiando el flujo continuo de la
columna de cromatografía de absorción primero sobre una columna de
ADN y posteriormente guiando el flujo continuo de la columna de ADN
sobre una columna de cromatografía de absorción; guiando el flujo
continuo respectivamente el eluato de la ultima columna de paso
anterior sobre una columna de filtración en gel y columna de
intercambio de Aniones, seleccionando la fracción con un peso
molecular de unos 17 kDa y actividad CHIPS. "Flujo continuo" se
entiende en este documento que significa aquella parte del líquido
cargado que tiene situada en ella los constituyentes que vienen de
la columna sin tratamiento extra. Los constituyentes en este flujo
continuo no se unen a la columna. "Eluato" se entiende que
significa el liquido que viene de la columna después de la elución y
que contiene los constituyentes del liquido cargado en la columna
que se unieron a la columna y se liberaron otra vez de ella mediante
la elución. En este método la columna de absorción une la mayoría de
constituyentes del medio celular cargado o un líquido obtenido del
mismo después de la pre-purificación. La columna de
afinidad une el (poli)péptido con actividad CHIPS y la Snase
(Staphylococcal Nucleasa) que tiene un peso molecular similar al de
la proteína CHIPS y una afinidad similar (o falta de) para la
columna de afinidad respectivamente la columna de absorción. La
columna de ADN une solo la Snase. Este método trabaja
particularmente bien si la primera columna de cromatografía de
afinidad es una llamada columna "amarilla" tinte ligando, la
segunda columna de cromatografía de afinidad es la llamada columna
tinte ligando "verde" y la columna de ADN una columna de
celulosa ADN.
En adición, otros métodos de purificación
conocidos pueden utilizarse, como la filtración en gel,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad,
cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de
inmunoafinidad.
Alternativamente el (poli)péptido con
actividad CHIPS puede ser expresado en una forma que facilitará la
purificación. Por ejemplo, puede ser etiquetado con un epitopo
polihistidina (6xHis) y posteriormente purificado mediante el uso de
una resina a la que se unen iones de níquel por medio de un agente
quelante. El (poli)péptido con actividad CHIPS que contiene
la etiqueta es eluado de la resina reduciendo el pH o compitiendo
con imidazol o histidina. Tal epitopo es disponible comercialmente
de Invitrogen. La introducción de un sitio de corte de la proteasa,
tal como para la enteroquinasa, permite la eliminación de la
etiqueta de fusión para generar (poli)péptidos nativos
maduros recombinantes con actividad CHIPS. Los materiales y métodos
para tal sistema de expresión están disponibles comercialmente de
Invitrogen, utilizando los vectores pTrcHis Xpress^{TM} en
combinación con la resina ProBound^{TM} para el aislamiento
eficiente de proteína etiquetada His y EnterokinaseMax^{TM} como
proteasa activa altamente catalítica y resina de afinidad
enteroquinasa EK-Away^{TM} para eliminar la
presencia contaminante de la proteasa. Otras etiquetas conocidas por
los expertos en la materia que pueden ser utilizadas para facilitar
la purificación incluyen, pero no están limitadas a, glutatión S
transferasa (fusión GST), myc y HA.
El (poli)péptido con actividad CHIPS
puede también ser producido por síntesis química conocida. Los
métodos para la construcción de polipéptidos o proteínas por medios
de síntesis son conocidos por los expertos en la materia. La
proteína sintética, en virtud de compartir características
estructurales y/o conformacionales primarias, secundarias y
terciarias con el correspondiente (poli)péptido con actividad
CHIPS poseerá una actividad en común con el, lo que significa
propiedades CHIPS. Por tanto, tales proteínas producidas
sintéticamente pueden ser empleadas como sustituto biológicamente
activo o inmunológico para (poli)péptido natural purificado
con actividad CHIPS. La síntesis de CHIPS se ilustra adicionalmente
en el Ejemplo 7.
Los (poli)péptidos con actividad CHIPS
descritos en este documento también incluyen (poli)péptidos
caracterizados por secuencias de amino ácidos dentro de las cuales
las modificaciones son naturalmente proporcionadas o deliberadamente
diseñadas. Las modificaciones en el (poli)péptido o en las
secuencias de ADN puede ser hechas por aquellos expertos en la
materia utilizando conocidas técnicas convencionales. Las
modificaciones de interés en las secuencias CHIPS activas de
(poli)péptido pueden incluir la sustitución, inserción o
supresión de residuos de amino ácidos seleccionados de la secuencia
de codificación.
La información contenida en la proteína CHIPS,
su gen y otros (poli)péptidos con actividad CHIPS y sus
moléculas de ácido nucleico codificantes derivadas de los mismos
puede ser utilizada para la detección de fragmentos de los mismos u
otros agentes que son capaces de inhibir o bloquear la unión de un
(poli)péptido con actividad CHIPS a los leucocitos, y por
tanto pueden actuar como inhibidores de quimiotaxis y/o unión CHIPS
a su receptor putativo. Pruebas de detección apropiada pueden por
ejemplo utilizar la proteína CHIPS purificada etiquetada
fluorescente que se une a los neutrófilos según el análisis de
citometría por flujo o fluorometría. El Ejemplo 2 describe tal
ensayo. Un ensayos de detección adecuado podrá alternativamente
emplear receptor o dominio de receptor CHIPS purificado en un
portador con una forma de proteína CHIPS como ligando.
Alternativamente, puede ser empleado un ensayo para detectar la
capacidad de unirse o competir con CHIPS para unirse a un anticuerpo
especifico anti-CHIPS (anticuerpos de cadena
monoclonal, policlonal, o sencilla) por varios inmunoensayos
conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitado a técnicas
ELISA competitivas y no competitivas o tecnología Biosensor que
emplea un chip sensor revestido con ligando (CHIPS), anticuerpo o
receptor CHIPS putativo (técnica de resonancia de plasma de
superficie (SPR) como el BiaCore). Cualquier (poli)péptido
con actividad CHIPS distinto de CHIPS puede también ser utilizado en
los ensayos de detección descritos. Todos estos métodos pueden ser
adaptados por Detección de Alto Rendimiento (HTS).
(Poli)péptidos asilados con actividad
CHIPS pueden ser utilizados ellos mismos como inhibidores de fMLP y
C5a uniéndose a sus respectivos receptores FRP y C5aR, o para
diseñar inhibidores de unión de CHIPS, por la detección de
inhibición competitiva. Los inhibidores de unión CHIPS (al receptor
o dominios del receptor putativos CHIPS) son también útiles para el
tratamiento de tales condiciones.
Además están descritas en este documento las
moléculas que no son (poli)péptidos en sí mismas pero tienen
una estructura y función similar a aquellos de los
(poli)péptidos descritos en este documento. Ejemplos de tales
moléculas son los peptidomiméticos. Cuando se hace referencia en
esta aplicación a los (poli)péptidos, se pretende incluir
también tales no (poli)péptidos que tienen similar o la misma
estructura y función y como consecuencia una similar o la misma
actividad biológica que los (poli)péptidos.
La actividad funcional de CHIPS, los
(poli)péptidos, sus fragmentos, derivados y análogos pueden
ser ensayados por varios métodos. Preferencialmente, esta actividad
CHIPS es medida por su capacidad de impedir la unión de fMLP
(Bodipy-fMLP) fluorescente o C5a
(FITC-C5a) fluorescente a neutrófilos como se
determina por citometría de flujo. El ejemplo 1 se describe tal
ensayo. La actividad CHIPS es también medida por su capacidad de
impedir la migración de neutrófilos hacia fMLP o C5a como se
determina por el ensayo de quimiotaxis Transwell, descrito en los
Ejemplos. Alternativamente, un ensayo basado en la capacidad de las
quimiocinas, incluyendo fMLP y C5a, para iniciar una subida rápida y
transitoria en la concentración de calcio intracelular puede ser
empleado para detectar la actividad CHIPS. Varios ensayos conocidos
en la materia pueden ser utilizados, incluyendo pero no limitado al
uso de varias sondas fluorescentes especificas de calcio en
combinación con citometría de flujo o fluorometría, o
microfisiometría. Como células para la detección de actividad CHIPS
por cualquiera de los métodos, pueden ser utilizados neutrófilos
aislados frescos o células transfectadas con FPR o C5a, tipo salvaje
o formas mutadas de esos receptores.
Los (poli)péptidos aislados con actividad
CHIPS pueden ser útiles en el tratamiento, prevención o en la mejora
de las condiciones inflamatorias que están implicadas en muchas
enfermedades y trastornos, tales como se lista en la Tabla 1.
Soporte para la utilidad terapéutica de los (poli)péptidos de
la invención para el tratamiento de los enfermedades de la Tabla 1
pueden encontrarse en las siguientes referencias: Para SDRA: Demling
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Adicionalmente se describen en este documento
(poli)péptidos con actividad CHIPS para su uso en
diagnósticos, profilaxis o terapias, en particular para su uso en el
tratamiento de las reacciones de inflamación aguda y crónica y la
infección del VIH, más en particular para su uso en el tratamiento
de Síndrome de Distrés Respiratorio del Adulto (SDRA), choque
isquémico, lesión traumática del cerebro, infecciones severas,
infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, cirugía vascular,
colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, Enfermedad Pulmonar
Obstructiva Crónica (COPD), artritis reumatoide, dermatosis,
esclerosis múltiple, enfermedad del Alzheimer, arteriosclerosis,
lesión por esfuerzo repetitivo (RSI), rechazo agudo de transplante,
quemaduras, artritis reactiva aguda, pancreatitis, vasculitis,
glomerulonefritis, gota, congelación y meningitis.
También está descrito en este documento el uso
de los (poli)péptidos con actividad CHIPS para la fabricación
de una preparación para diagnósticos, profilaxis o terapia, en
particular para el tratamiento de reacciones de inflamación aguda y
crónica e infecciones de VIH, más en particular para el tratamiento
de las indicaciones listadas anteriormente.
También se describen en este documento
composiciones terapéuticas que comprenden un excipiente adecuado y
el (poli)péptido con actividad CHIPS de la invención. Tal
composición puede ser utilizada para los tratamientos especificados
anteriormente.
También se describe aquí el uso de moléculas de
ácido nucleico de la invención, opcionalmente incorporadas en un
constructo mayor, para varios propósitos, tales como el aumento de
anticuerpos de ellas, modulando la actividad CHIPS o en una
preparación terapéutica.
También se describen aquí moléculas de ácido
nucleico y la secuencia de aminoácido codificada por las moléculas
de ácido nucleico que pueden ser identificadas por la llamada
"clonación computarizada". Más específicamente, esta técnica
comprende usar (1) la secuencia de ácido nucleico representada en la
figura 4, o fragmentos, derivados y análogos de la misma, o (2) la
secuencia de ácido nucleico representada en la figura 5, o
fragmentos, derivados y análogos de la misma como un requerimiento
para la detección de secuencias de ácido nucleico o bases de datos
de secuencias de ácido nucleico, o secuencias de proteínas o bases
de datos de secuencias de proteína, utilizando algoritmos de
búsqueda que pueden identificar regiones con homología. Tales
algoritmos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen,
pero no se limitan a, búsquedas BLAST (Altschul et al., J.
Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Las bases de datos
de secuencias que pueden ser investigadas incluye, pero no están
limitados a, la base de datos Genbank^{TM} y la base de datos
Swissport^{TM}. Cuando se utiliza una búsqueda BLAST o
modificaciones de la misma, generalmente se pueden identificar
sujetos que muestran homología. La identificación está basada en el
valor del Resultado o la Probabilidad de Suma más Pequeña
P(N). Homólogos de la secuencia de ácido nucleico o la
secuencia de (poli)péptido CHIPS se definen por un Resultado
que es al menos 200, preferentemente al menos 400, más
preferentemente al menos 800, más preferiblemente al menos 1600.
Alternativamente, el valor P(N) puede ser utilizado para la
identificación de secuencias homologas. Los homólogos de la
secuencia de ácido nucleico o la secuencia de (poli)péptido
CHIPS se definen por un valor P(N) que es más pequeño que
1e-3, preferentemente más pequeña que
1e-6, más preferentemente más pequeña que
1e-12, incluso más preferentemente más pequeña que
1e-24, más preferiblemente más pequeña que
1e-48.
También se describen aquí anticuerpos o
fragmentos biológicamente activos de los mismos dirigidos
específicamente al (poli)péptido de la invención y a
moléculas basadas en CHIPS y bloqueantes de receptor CHIPS. Tales
moléculas basadas en CHIPS y bloqueantes de receptor CHIPS, y
anticuerpos o fragmentos biológicamente activos y pueden ser
utilizados quiméricos, cadenas simples, y bibliotecas de expresión
para neutralizar la actividad de la proteína CHIPS o
(poli)péptidos relacionados en profilaxis o terapia, o pueden
ser utilizados para propósitos de diagnóstico para unir CHIPS o
(poli)péptidos relacionados. Tales anticuerpos y moléculas
basadas en CHIPS y bloqueantes de receptor CHIPS son por ejemplo
útiles para el tratamiento de la infección por
Staphylococcus. Además se describen aquí composiciones
terapéuticas que comprenden un excipiente adecuado y uno o más de
estos anticuerpos y/o fragmentos biológicamente activos de los
mismos.
"Moléculas basadas en CHIPS y bloqueantes de
receptor CHIPS" son moléculas que compiten con CHIPS en un ensayo
de unión CHIPS como se describe en el Ejemplo 8. Tales "moléculas
basadas en CHIPS y bloqueantes de receptor CHIPS" pueden por
ejemplo ser moléculas que tienen la misma composición de aminoácido
y secuencia de aminoácido que CHIPS, pero no la secuencia completa.
Tales moléculas pueden ser simples fragmentos de CHIPS, o pueden
consistir de fragmentos múltiples de CHIPS, todos aún con actividad
CHIPS. Sin embargo, todas las otras moléculas que cumplen el
requerimiento funcional de competir con CHIPS en un ensayo de unión
CHIPS se incluyen también.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
invención pueden además ser utilizadas para terapia génica. La
molécula de ácido nucleico puede ser introducida en el sitio de
inflamación para actuar localmente o en un sitio distante. La
terapia génica es a través de vectores virales, tales como, pero no
limitados a, vectores adenovirales, vectores virales
adeno-asociados o vectores lentivirales.
Alternativamente, vectores no virales, tales como aquellos basados
en liposomas o polímeros pueden ser utilizados. Las estrategias
génicas terapéuticas están basadas en (1) terapia génica in
vivo, donde las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
invención son introducidas en células diana in vivo, (2)
terapia génica ex vivo, donde las moléculas de ácido nucleico
aisladas de la invención son introducidas en células dianas ex
vivo, seguido por la administración de las células transducidas,
o una subpoblación de las células transducidas, en un individuo.
También se describe aquí un método para el
tratamiento de un sujeto que sufre de inflamación mediante la
administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
(poli)péptido como se describe en este documento y un método
para tratar terapéuticamente por gen un sujeto que sufre de
inflamación mediante la administración de una cantidad
terapéuticamente efectiva de una molécula de ácido nucleico, así
como un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de
infección por Staphylococcus mediante la administración de una
cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo y/o fragmento
biológicamente activo del mismo.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden ser utilizadas en un método para aislar de un organismo un
gen que codifica una proteína con actividad CHIPS, cuyo método
comprende la detección de una biblioteca genómica o de ADNc de tal
organismo con una sonda basada en la molécula de ácido nucleico, y
el aislamiento de los clones positivos.
Adicionalmente se describe aquí un
micro-organismo que acoge una o más moléculas de
ácido nucleico de la invención para uso como un medicamento para el
tratamiento de reacciones de inflamación aguda y crónica e infección
de VIH, en particular para el tratamiento del Síndrome de Distrés
Respiratorio del Adulto (SDRA), choque isquémico, lesión traumática
del cerebro, infecciones severas, infarto de miocardio, accidente
cerebrovascular, cirugía vascular, colitis ulcerosa, enfermedad de
Crohn, Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD), artritis
reumatoide, dermatosis, esclerosis múltiple, enfermedad de
Alzheimer, arterioesclerosis, lesión por esfuerzo repetitivo (RSI),
rechazo agudo de transplante, quemaduras, artritis reactiva aguda,
pancreatitis, vasculitis, glomerulonefritis, gota, congelación y
meningitis.
La invención además se refiere a una prueba de
diagnóstico de PRC para la detección de un paciente infectado con
Staphylococcus aureus en presencia del gen CHIPS. CHIPS es un
factor importante de virulencia debida a estafilococos, de modo que
los pacientes con Staphylococci que contienen CHIPS están en mayor
riesgo de enfermedades invasivas y pueden necesitar tratamiento
diferente o adicional.
Todas las moléculas descritas en este documento,
e.d. moléculas de ácido nucleico, (poli)péptidos, no
(poli)péptidos, fragmentos, derivados y análogos, pueden
encontrar otras aplicaciones. Tales aplicaciones incluyen, pero no
se limitan a:
- -
- Aislamiento de factores que pueden unir las moléculas mencionadas anteriormente. Ejemplos de tales factores son receptores y proteínas. Tal aislamiento puede por instancia ser realizado utilizando el sistema de levadura doble híbrido o utilizando moléculas etiquetadas como cebo para pesca.
- -
- Diseño de péptidos y peptidomiméticos.
- -
- Haciendo bibliotecas de presentación de fagos, lo que puede a su vez ser utilizado para la determinación de dominios activos, equivalentes funcionales etc.
- -
- Identificación de vías de transducción de señales que son activadas o inactivadas por CHIPS y las moléculas de la invención.
- -
- Ensayo para la determinación de la actividad biológica CHIPS (inhibición de la quimiotaxis o la expresión del receptor de quimioquinas).
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las moléculas descritas en este documento
pueden ser etiquetadas de cualquier manera. Ejemplos de etiquetado
incluyen pero no se limitan a fluorescencia, biotina, etiquetado
radioactivo etc. Tales moléculas etiquetadas pueden ser utilizadas
para la detección de compuestos que se asemejan o se superponen con
la actividad biológica de CHIPS, así como para la identificación de
sitios de unión, in vivo e in Vitro, y para el rastreo
de proteína CHIPS o ácido nucleico en un organismo.
Esta claro que cuando se hace referencia aquí a
un (poli)péptido con una particular secuencia de aminoácido,
se pretende que también abarque los (poli)péptidos que
contienen uno o más aminoácidos que son modificados químicamente de
un modo obvio para un experto en la materia, siempre que tal
modificación no elimina la actividad CHIPS.
Las realizaciones más preferidas están listadas
en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se ilustrará
adicionalmente en los ejemplos que siguen y que de ninguna manera se
pretende que sean limitativos de la presente invención. En esta
descripción y ejemplos se hace referencia a las siguientes figuras y
tablas:
Figura 1 muestra la actividad CHIPS del eluato
de la columna Mono Q.
Figura 2 muestra la SDS-PAGE
teñida de Azul Coomassie de CHIPS purificado después del paso final
de cromatografía Mono Q.
Figura 3 muestra la unión dependiente de
concentración de CHIPS-FITC a las diferentes
poblaciones de leucocitos.
Figura 4 muestra la secuencia de gen chp a
partir de S. auereus Newman. La secuencia Shine Dalgarno
(AGGAGA) y el marco chp de lectura abierta (ORF) están subrayados.
Los nucleótidos que codifican la proteína madura se indican con una
doble línea. Nucleótidos divergentes en la secuencia de S.
aureus 1690 se indican sobre la secuencia.
Figura 5 muestra la secuencia de aminoácido
deducida a partir del gen chp S. aureus Newman. La
región que se adapta a los aminoácidos N-terminal 35
de CHIPS es subrayada. Aminoácidos divergentes en la proteína de
S. aureus 1690 se indican sobre la secuencia.
Figura 6 muestra la detección del gen chp en los
genomas de cepas de S. aureus.
Figura 7 muestra actividad CHIPS en los
supernatantes de cepas de S. aureus.
Figura 8 muestra la distribución del gen chp en
los genomas de varias cepas clínicas de S. aureus.
Figura 9 muestra dos curvas de respuesta de
dosis de anticuerpos de conejo anti-CHIPS uniéndose
a péptidos derivados de CHIPS de aminoácidos 1 hasta 15 (figura 9A)
y CHIPS purificado (figura 9B) según determinado mediante ELISA.
Figura 10 muestra la inhibición dependiente de
concentración de migración de neutrófilo hacia fMLP por CHIPS
purificado, expresado como porcentaje de células tratadas con
tampón. Las células se incubaron con varias concentraciones CHIPS
durante 30 minutos a temperatura ambiente y añadidas al
compartimiento superior del contenedor Transwell. La migración hacia
1x10^{-8} M fMLP se determinó después de 60 minutos de incubación
a 37ºC.
Figura 11 es una imagen representativa de un
SDS-PAGE que muestra el CHIPS recombinante
purificado final (rCHIPS) obtenido de un lisado de E. coli
después de cromatografía de afinidad sobre una columna de Níquel y
la división de la etiqueta Histina por Enteroquinasa.
Figura 12 muestra la inhibición dependiente de
concentración de CHIPS recombinante (rCHIPS) en la expresión del
receptor para fMLP (FPR) y C5a (C5aR) en neutrófilos.
Figura 13 muestra el deterioro dependiente de
concentración de la liberación de calcio intracelular libre inducido
por fMLP y C5a en neutrófilos.
\newpage
Figura 14 muestra la inhibición de unión de
CHIPS-FITC dependiente de concentración mediante el
CHIPS recombinante completo y el CHIPS^{4-121}
recombinante mutante.
La Tabla 1 muestra condiciones inflamatorias que
pueden ser tratadas con los (poli)péptidos y no
(poli)péptidos de la invención; y
La Tabla 2 muestra la unión en ELISA de varios
clones seleccionados de anticuerpos monoclonales derivados de un
ratón inmunizado con CHIPS. La unión es para purificar CHIPS y los
anticuerpos monoclonales de ratón reactivos se detectan con un
anticuerpo anti-ratón
HRPO-acoplado.
\vskip1.000000\baselineskip
El Staphylococcus aureus 1690 (un
aislamiento clínico, Universidad de Utrecht Centro Medico (UMC
Utrecht)) o el Staphylococcus aureus Newman (un regalo de Dr
Foster, Dublin) se cultiva durante la noche en un medio IMDM (Gibco)
y posteriormente se diluye 1:40 en IMDM fresco durante 7 horas de
cultivo a 37ºC. Después de la granulacion de la bacteria el S.
aureus supernatante (denominado como SaS) es recolectado,
filtrado sobre un filtro de 0.2 m y utilizado inmediatamente
(Veldkamp et al., Inflamación 21. 541-551
(1997). Una cantidad de 5 litros de SaS es llevada sobre tres
columnas (25 ml) acopladas en tándem. Estas tres columnas son
sucesivamente un "Reactivo Amarillo 861" tinte ligando
reticulado 4% columna de agarosa perlada (Sigma), una Celulosa de
ADN (Farmacia) y un "Reactivo Verde" 19 tinte ligando
reticulado 4% columna de agarosa perlada (Sigma).
Después del lavado con PBS la columna verde
(Reactivo Verde 19) es eluido con 2 M NaCl y los segundos 50 ml, que
contienen actividad CHIPS,son mezclados. PMSF (1 mM) es agregado y
el eluido se dializa en PBS durante 18 horas. La muestra es
concentrada a un volumen de \pm 10 ml en una bolsa de diálisis
empapada en polietilenglicol. El material concentrado es separado en
una columna de filtración en gel Pharmacia
Superdex-200, tras lo cual las fracciones activas (4
ml volumen) se agrupan, se tratan con PMSF (1 mM) y se dializan en
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) durante 18 horas. Las
fracciones activas agrupadas se cargan en una columna de intercambio
de aniones Mono Q (Pharmacia) que es eluido con un gradiente de 10
mM Tris-HCl de tampón que va de 0 a 1M NaCl. Las
fracciones activas (1 ml volumen) se agrupan y se utilizan como la
preparación final de CHIPS purificado. El contenido de proteína es
determinado con un ensayo Pierce Micro-BCA y CHIPS
es almacenado a -20ºC en pequeñas alicuotas. El material aislado
final es analizado para pureza en un 12.5% SDS-PAGE
(Mini-Protean II; BioRad) después de la tinción con
Coomassie Blue. La proteína CHIPS aparece como una banda simple con
un peso molecular aparente de 17 kDa. Todas las fracciones se
detectan para actividad CHIPS por su capacidad de inhibir la unión
de fMLP fluorescente-etiquetado a neutrófilos
aislados como se mide por citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los granulocitos son aislados de sangre
heparinizada de voluntarios sanos por medio de un gradiente de
Ficoll-Histopaque según el método estándar
(Troelstra et al., J. Leukocyte Biol. 61,
173-178 (1997)). El resto de los eritrocitos en la
fracción granulocito son lisados con agua estéril (durante 30 seg.)
y lavado después de la recuperación de la isotonicidad. Las células
son finalmente resuspendidas en PRMI (Gibco) con 0.05% de Albúmina
Sérica Humana (RPMI/HSA). En tubos Falcon 50 l de células (5x106
células/ml) son incubadas con 50 l de material que contiene CHIPS
(SaS, CHIPS purificado o fracciones de columna) durante 30 minutos a
37ºC. Las células son colocadas en hielo y lavadas una vez con
RPMI/HSA (a 4ºC) y resuspendidas en 50 l de medio fresco. 5 l de
fMLP BODIPY etiquetado (concentración final 0.1 M; Sondas
Moleculares) o FITC etiquetado C5a (concentración final 1 M; C5a
recombinante de Sigma, etiquetado con FITC como se describe en el
ejemplo 2.1 para CHIPS) es entonces agregado y la muestra es
incubada durante 60 minutos en hielo. Después del lavado se analiza
el fMLP o C5a fluorescente que une a los granulocitos con un
citómetro de flujo (FAVCcan; Becton Dickinson). El valor de
fluorescencia media de 5000 granulocitos es calculado con el
software Lysis II.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 muestra el perfil de elución
(OD_{280}) de la actividad CHIPS del eluido de la columna Mono Q.
Las fracciones de volumen entre 39 y 41 ml muestran la actividad
CHIPS más intensa. Figura 2 muestra el SDS-PAGE
teñido por Coomassie Blue de CHIPS purificado después del paso de
cromatografía Mono Q final.
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CHIPS purificado (500 g/ml de proteína) es
incubada con 1/10 de volumen de 1 mg/ml FITC (Isotiocianato de
Fluoresceína, Isómero I; Sigma) en un buffer de 1 M de carbonato de
sodio pH 9.6 durante 1 hora a temperatura ambiente. CHIPS etiquetado
FITC es separado del FITC libre pasando la mezcla por una columna de
desalación (Pharmacia, Fast Desalting HR 10/10) y supervisando el
eluido por OD_{280} y fluorescencia por un fluorómetro acoplado en
línea (Perkin Elmer). Fracciones con alto OD_{280} y fluorescencia
se combinaron y analizaron para el contenido de proteína con el
ensayo de la proteína Micro BCA (Pierce). CHIPS-FITC
es almacenado en pequeñas alícuotas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión especifica de
CHIPS-FITC a los leucocitos es determinado por
citometría de flujo. Los neutrófilos purificados y las células
mononucleares (que consisten de monocitos y linfocitos) son aislados
de la sangre heparinizada de voluntarios sanos como se describe
(Troelstra et al., Infect. Immun. 65:
2272-2277 (1997)). Las células aisladas son
remezcladas para obtener una proporción de células que imita la
situación en la sangre. Los glóbulos rojos humanos se obtienen
mediante el lavado de una alicuota pequeña de sangre entera tres
veces con PBS. La concentración de glóbulos rojos es determinada por
espectrofotometría.
En tubos Falcon 50 l de leucocitos o glóbulos
rojos (5 x 10^{6} células/ml) son incubados con 5 l
CHIPS-FITC a varias concentraciones durante 30
minutos en hielo. Las células se lavan una vez con medio (RPMI que
contiene 0.05% HSA) y resuspendidas en 150 l de medio fresco. La
unión de CHIPS-FITC a los leucocitos es medida por
citometría de flujo (FACScan; Becton Dickinson). La asociación con
diversas subpoblaciones es analizado por bloqueo electrónico
selectivo en parámetros de dispersión hacia delante (FSC) y lateral
(SSC) en el software Lysisll (BD). El valor de fluorescencia
promedio de la población celular seleccionada es calculado con el
software.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3 muestra la unión dependiente de
concentración de CHIPS-FITC a las diversas
poblaciones de leucocitos. Se puede ver que
CHIPS-FITC se une más eficientemente a los
neutrófilos, seguido por los monocitos. CHIPS-FITC
no se une a los glóbulos rojos y ligeramente a los linfocitos, pero
solo a una subpoblación. La unión de CHIPS-FITC a
los neutrófilos es especifica porque la adición de un exceso de 10
veces de CHIPS no fluorescente etiquetado inhibe completamente la
asociación con CHIPS-FITC a las células.
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Staphylococcus aureus Newman, RN4220, y
COL son cepas de laboratorio comúnmente utilizadas. S. aureus
1690 es una cepa clínica, aislada de un paciente con bacteriemia (K.
E. Veldkamp et al., Inflamación, 21:541-551
(1997)). Escherichia coli DH5 se utilizo como un huésped
clonante (F.M. Ausubel et al., Protocolos Recientes en
Biología Molecular, Jhon Wiley e Hijos, Inc., New York, N.Y.
(1990)). Plásmido pRB474 es un vector de transporte para E.
coli y staphylococci que contiene el promotor vegII de
Bacillus subtilis que permite la expresión de genes clonados
dentro del sitio de clonación múltiple de pRB474. pRB474 es un
derivado de pRB374 (R. Brückner, Gen, 122:187-192))
en la cual el gen de resistencia a la neomicina ha sido reemplazado
por un gen de resistencia al cloranfenicol. Todas las cepas se
cultivaron en caldo BM (1% triptona, 0.5% de extracto de levadura,
0.5% NaCl, 0.1% K_{2}HPO_{4}, 0.1% glucosa) a 37ºC a menos que
se indique lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN se secuencio mediante secuenciación
cíclica en un secuenciador de ADN 4000 L (LI-COR
Inc., Lincoln, Neb., USA) utilizando el kit Thermo Sequenase^{TM}
de secuenciación cíclica de promotor etiquetado fluorescente
(Amersham, Little Chalfont, UK). Se usaron promotores adecuados para
secuenciar ADN genómico directamente el cual fue aislada según J.
Mamur (J. Mol. Biol., 3:208-218 (1996)). El método
de secuencia ha sido descrito brevemente en Peschel et al.
(J. Biol. Chem., 274:8405-8410 (1999)). Para
realizar búsquedas de similitud de secuencias, fue utilizado el
programa BLAST 2.0 con la base de datos de la proteína no redundante
de NCBI (Bethesda, Md., USA) Los alineamientos de secuencia se
llevaron a cabo utilizando el algoritmo
Higgins-Sharp del programa MacDNASIS Pro (Hitachi
Software Engineering, San Bruno, Calif. USA).
Previamente, los primeros 35 aminoácidos de
CHIPS se determinaron por secuenciación N-terminal
de la proteína purificada. El ADN de S. aureus es muy rico en
nucleótidos A y T mientras que los nucleótidos G y C son raros (solo
un 30% de las bases totales). Por tanto, para la mayoría de
aminoácidos, son preferidos los codones más ricos en A y T. Según
esta regla, una secuencia promotora se derivó de aminoácidos
15-24 (GAAAAAGAAAAAGCATATAAA
GAA (SEC ID NO 1). El cebador se utilizo para la secuencia de ADN genómico directamente de S. aureus Newman rindiendo una secuencia de varios cientos de pares de bases. Un nuevo cebador se derivó de esta secuencia para leer hacia el sitio del primer cebador. La secuencia de ADN combinada contiene el sitio de unión del primer cebador con dos diferencias (G en vez de A en la posición 3 y T en vez de A en la posición 15) (Figura 4). Ello codificó un marco de lectura abierta de 450 bp precedida por una razonable secuencia Shine Dalgarno para iniciación de traslación (J. Shine y L. Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:1342-1346 (1974)) y seguida por tres codones de parada. El gen fue nombrado chp; codifica una proteína putativa de 149 aminoácidos sin similitudes con cualquier proteína en la base de datos. Los 28 aminoácidos N-terminal parecen formar una señal péptido para secreción a través de la membrana citoplasmática (3 residuos de carga positiva seguido por una región sin carga de 22 aminoácidos y un motivo consenso ALA-X-ALA para la ruptura de la señal paptidasa 1; Figura 5) (G. von Heijne, Nucl. Ácidos Res. 14:4683-4690 (1986)). La señal péptido es seguido por una región que coincide casi perfectamente con los 35 aminoácidos N-terminal de CHIPS. La única excepción es una serina en la posición 33 de la proteína madura deducida en vez de un residuo de asparagina predicho por secuenciación N-terminal. La proteína madura deducida tiene un tamaño de 121 aminoácidos y 14.1 kDa y un punto isoeléctrico de 9.32. Por lo tanto cumple todos los requisitos para la proteína CHIPS. Utilizando los mismos cebadores, el gen chp de S. aureus 1690 fue secuenciado. Los dos genes fueron casi idénticos con 5 desviaciones. A nivel de secuencia de aminoácido, solo una posición fue cambiada (Figura 4 y 5).
GAA (SEC ID NO 1). El cebador se utilizo para la secuencia de ADN genómico directamente de S. aureus Newman rindiendo una secuencia de varios cientos de pares de bases. Un nuevo cebador se derivó de esta secuencia para leer hacia el sitio del primer cebador. La secuencia de ADN combinada contiene el sitio de unión del primer cebador con dos diferencias (G en vez de A en la posición 3 y T en vez de A en la posición 15) (Figura 4). Ello codificó un marco de lectura abierta de 450 bp precedida por una razonable secuencia Shine Dalgarno para iniciación de traslación (J. Shine y L. Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:1342-1346 (1974)) y seguida por tres codones de parada. El gen fue nombrado chp; codifica una proteína putativa de 149 aminoácidos sin similitudes con cualquier proteína en la base de datos. Los 28 aminoácidos N-terminal parecen formar una señal péptido para secreción a través de la membrana citoplasmática (3 residuos de carga positiva seguido por una región sin carga de 22 aminoácidos y un motivo consenso ALA-X-ALA para la ruptura de la señal paptidasa 1; Figura 5) (G. von Heijne, Nucl. Ácidos Res. 14:4683-4690 (1986)). La señal péptido es seguido por una región que coincide casi perfectamente con los 35 aminoácidos N-terminal de CHIPS. La única excepción es una serina en la posición 33 de la proteína madura deducida en vez de un residuo de asparagina predicho por secuenciación N-terminal. La proteína madura deducida tiene un tamaño de 121 aminoácidos y 14.1 kDa y un punto isoeléctrico de 9.32. Por lo tanto cumple todos los requisitos para la proteína CHIPS. Utilizando los mismos cebadores, el gen chp de S. aureus 1690 fue secuenciado. Los dos genes fueron casi idénticos con 5 desviaciones. A nivel de secuencia de aminoácido, solo una posición fue cambiada (Figura 4 y 5).
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El gen chp de S. aureus Newman se
amplificó mediante PCR utilizando cebadores cuyas secuencias se
modificó para introducir sitios de restricción permitiendo la
clonación de chp en el plásmido de expresión pRB474. El
plásmido pPr4-chp resultante contiene la región
codificada de chp 19 bp hacia arriba del codón de inicio que
contiene la secuencia Shine Dalgarno y 104 bp hacia abajo del primer
codón de parada. El fragmento se insertó en la orientación apropiada
permitiendo la expresión del gen mediante el promotor vegII y
la identidad del fragmento se verificó mediante análisis de
secuencia. El plásmido pPr4-chp se transfirió a la
cepa S. aureus de restricción negativa mediante
electroporación (J. Augustin y F. Götz, FEMS Microbiol. Lett.
66:203-208 (1990)), fue aislado de un clon positivo,
y electroporado dentro de S. auereus COL (adhesión TIGR no.
1280). La identidad del plásmido se verificó por análisis de
restricción de fragmento y secuenciación del inserto.
El gen chp no estaba contenido en la
secuencia del genoma parcialmente disponible de S. aureus COL
(TIGR accession no. 1280). Mediante análisis PCR se demostró, que el
gen carece de hecho de S. aureus COL mientras que S.
auereus Newman y 1690 fueron positivos (Figura 6). Además, S.
aureus COL fue negativo en el ensayo de actividad CHIPS (Figura
7). El gen chp de S. auereus Newman fue clonado en
plásmido pPr4-chp, el cual permite la expresión de
genes clonados por un promotor plásmido codificado. La
transformación de S. aureus COL con el plásmido hizo la cepa
positiva en el ensayo CHIPS (Figura 7), probando que el gen
chp codifica la proteína CHIPS.
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La ausencia o presencia del gen chp en
diversas cepas S. aureus se determinó por PCR utilizando
extracto de células crudas como una fuente de calibración. Una
colonia bacteriana de una placa de agar fresco fue resuspendida en
1.5 ml de solución salina, sedimentada y resuspendida en 100 l de
una solución de mezcla de lisis que contiene 10 mM
Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mg lisostafina/ml,
y 0.1 mg acromopeptidasa/ml. Las muestras se incubaron a 37ºC
durante 30 minutos y luego se centrifugaron. El supernatante limpio
se calentó a 100ºC durante 5 minutos y posteriormente se diluyó por
adición de 400 l TE tampón (1 mM EDTA, 10 mM
Tris-HCl, pH 8). 1 l de los extractos celulares se
aplicó a las reacciones PCR utilizando los cebadores chp
específicos chp-5' (GAAAAAGAAATTAG
CAACAACAG (SEC ID NO 2)) y chp-3' (CATAAGATGATTTAGACTCTCC (SEC ID NO 3). La amplificación se llevó a cabo mediante 35 ciclos compuestos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC. El producto PCR resultante comprende 90.4% del gen chp a partir de 2 bp hacia arriba del codón de inicio y terminando 41 bp hacia abajo del primer codón de parada. Los productos PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa. Todas la técnicas de secuencia, PCR, y ADN recombinante se llevaron a cabo según los procedimientos estándares (F.M. Ausubel et al., Protocolos Recientes en Biología Molecular, Jhon Wiley E hijos, Inc., Nueva York, N.Y. (1990)).
CAACAACAG (SEC ID NO 2)) y chp-3' (CATAAGATGATTTAGACTCTCC (SEC ID NO 3). La amplificación se llevó a cabo mediante 35 ciclos compuestos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC. El producto PCR resultante comprende 90.4% del gen chp a partir de 2 bp hacia arriba del codón de inicio y terminando 41 bp hacia abajo del primer codón de parada. Los productos PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa. Todas la técnicas de secuencia, PCR, y ADN recombinante se llevaron a cabo según los procedimientos estándares (F.M. Ausubel et al., Protocolos Recientes en Biología Molecular, Jhon Wiley E hijos, Inc., Nueva York, N.Y. (1990)).
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas S. aureus se analizaron para
actividad CHIPS en un ensayo para unión de fMLP etiquetado
fluorescente a neutrófilos humanos. Las cepas se cultivaron en un
medio IMDM (Life Technologies, Paisley, UK), durante 24 horas y los
supernatantes cultivados se analizaron y probaron como se describe
en el ejemplo 1.2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4 muestra la secuencia del gen chp
de S. aureus Newman. La secuencia Shine Dalgarno (AGGAGA) y
el chp de marco de lectura abierto (ORF) son subrayados. Los
nucleótidos que codifican la proteína madura están indicados por una
doble línea. Los nucleótidos divergentes en la secuencia de S.
aureus 1690 se indican sobre la secuencia.
Figura 5 muestra la secuencia de aminoácido
deducida del gen chp S. aureus Newman. La región que
se empareja con los 35 aminoácidos N-terminal de
CHIPS es subrayada. Aminoácidos divergentes en la proteína S.
aureus 1690 se indican sobre la secuencia.
Figura 6 muestra la detección del gen chp en los
genomas de las cepas S. aureus. Los productos PCR obtenidos
con cebadores chp específicos se separaron en un gel de agarosa.
Vías 1 y 2, S. aureus Newman; vías 3 y 4, S. aureus
COL; vías 5 y 6, S. aureus 1690. Las siguientes bacterias
resultaron ser negativas para presencia del gen chp según lo
determinado por PCR: Staphylococcus capitis, Staphylococcus
haemolyticus, staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri y
Escherichia coli.
Figura 7 muestra actividad CHIPS en los
supernatantes de las cepas S. aureus. Diversas
concentraciones de cultivos de supernatantes de S. aureus
1690 (cuadrados), COL de tipo salvaje (círculos abiertos) y COL con
plásmido pPr4-chp (círculos sólidos) se ensayaron
para inhibición de unión de fMLP a neutrófilos humanos. La
fluorescencia de fondo fue restada y los valores dados como % de las
muestras de control (incubación sin cultivo de supernatantes).
Figura 8 muestra la distribución del gen
chp en los genomas de diversas cepas clínicas S.
aureus. Las bacterias son detectadas por PCR con cebadores
chp específicos y evaluados por la presencia de la banda 400
bp especifica en un gel de agarosa. Las cepas S. aureus son
agrupadas en focos de aislamiento de los pacientes. Lab =
Laboratorio de cepas; Otros = cepas de otros fluidos corporales;
CAPD = cultivos de Diálisis Peritoneal Crónica Ambulatoria; Sangre =
cultivos de sangre; Herida = infecciones de heridas; MRSA = Cepas
S. aureus de Múltiple Resistencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos específicos para la proteína
CHIPS pueden ser producidos utilizando proteína purificada natural o
recombinante o péptidos sintéticos derivados de secuencia, como
antígeno. Ambos anticuerpos policlonales y monoclonales han sido
producidos utilizando técnicas estándar (como se describe en Harlow
y Lane (1988), Anticuerpos, Un Manuel de Laboratorio, Cold Spring
Harbor Laboratory Press; y Erich, et al (1989), J. Immunol.
143: 4053-4060). Sobre la base de los primeros 15
aminoácidos, un péptido sintético fue hecho según con química
estándar Fmoc como se describe en De Haas et al., J. Immunol.
161:3607-3615. El péptido se acopló a Hemocianina de
Lapa Californiana según las instrucciones del fabricante (Pierce) y
se inmunizó subcutáneamente con Adyuvante Completo de Freund,
seguido por dos inyecciones de refuerzo con adyuvante incompleto de
Freund.
Las inmunoglobinas de sueros de animales
inmunizados o supernatantes de cultivo celular de hibridoma son
aislados por cromatografía de afinidad utilizando resinas
comerciales que contienen Proteína A, Proteína G o recombinantes de
los mismos (Pharmacia).
\vskip1.000000\baselineskip
Antisueros y anticuerpos purificados (IgG) son
examinados para detectar la reactividad con proteína CHIPS
purificada o péptido sintético derivado por ELISA. Para ello el
antígeno se recubre sobre una placa de microtitulación (Nunc
"Maxisorb") a una concentración de 1 a 3 g/ml en un 0.1 M de
tampón de carbonato pH 9.6 durante 18 horas a 4ºC. Después del
lavado, el plástico no ocupado es bloqueado con 4% BSA en PBS/Tween
20 (0.05%) durante 1 hora a 37ºC. Se hacen diluciones en serie de
los anticuerpos en PBS/Tween conteniendo 2% BSA y se incuban durante
1 hora a 37ºC. Los anticuerpos ligados son incubados con un
anticuerpo secundario etiquetado peroxidasa diluido1/5000, ya sea
IgG de cabra anti-conejo para anticuerpos
policlonales o IgG de cabra anti-ratón para
anticuerpos monoclonales (ambos de Southern Biotechnology
Associates, Inc.), durante 1 hora a 37ºC. Las reacciones son
desarrolladas con TMB como sustrato y la Densidad Optica (OD) se
leyó a 450 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9 muestra la unión especifica de IgG
policlonales de un conejo inmunizado con un péptido sintético que
comprende los primeros 15 aminoácidos N-terminal de
CHIPS (péptido anti-CHIPS). Una elevada OD_{450}
es mostrada para el péptido anti-CHIPS de conejo con
el péptido (figura 9A) así como la proteína CHIPS purificada (figura
9B) revestida a los pocillos. El efecto es dependiente de
concentración y es ya significativo con una concentración mínima de
30 ng/ml IgG. Una combinación no inmunizada de IgG de conejo normal
da alguna unión de fondo, pero solo a concentraciones elevadas de
anticuerpos, especialmente cuando CHIPS purificado es recubierto
sobre la placa ELISA.
La Tabla 2 muestra la unión específica de clones
hibridoma seleccionados derivados de ratones inmunizados con
proteína CHIPS purificada.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad CHIPS de (poli)péptidos y
no-(poli)péptidos de la invención puede por ejemplo ser
determinada con el siguiente ensayo.
Con el fin de determinar la migración directa se
hace uso por ejemplo de un sistema Transwell (Costar) que consiste
de un compartimiento superior y de un compartimiento inferior
separados por una membrana de policarbonato de 3 m. Los granulocitos
son etiquetados con BCECF
(2-carboxietilo-5-(y-6-)
carboxifluoresceina; Sondas Moleculares), una etiqueta fluorescente
que entra en el citoplasma de las células. Las células (5x10^{6})
son incubads durante 20 minutos a 22ºC con 3 M
BCECF-AM (el éster acetometilo de
carboxifluoresceina
2-carboxietilo-5-(y-6-),
posteriormente lavado tres veces y resuspendido a 5x10^{6}
células/ml en RPM/HSA. 100 l de células y la cantidad deseada de
proteína CHIPS es introducido dentro del compartimento superior del
sistema Transwell y todo se suspende en los pocillos de una placa de
microtitulación estándar de 24 pocillos (Costar). Cada pocillo
contiene 600 l RPM/HSA con o sin adición del quimiotáctico para el
ensayo. Los quimiotácticos son: C5a recombinante (Sigma),
interleucina-8 recombinante (Pepro Tech), Activador
de Plaquetas Factor-16 (PAF-16;
Calbiochem) o fMLP (Sigma). Después de 60 minutos de incubación a
37ºC el contenedor de Transwell es levantado de los pocillos y la
placa de microtitulación es analizada por fluorescencia en un
CyoFluorII (PerSeptiveBiosystems). El grado de fluorescencia es una
medida directa para un número de granulocitos que ha migrado a
través de la membrana y es expresado como un porcentaje de la
fluorescencia del número de células agregadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10 muestra la inhibición de la migración
de neutrófilo dependiente de concentración hacia FLMP por CHIPS
purificado, expresado como porcentaje de células de control tratadas
con tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo CHIPS en E. coli y resultó ser
tan activo biológicamente como el CHIPS de origen natural de S.
aureus.
El método de producción utilizado para la
producción de CHIPS recombinante puede también ser utilizado por
otros (poli)péptidos con actividad CHIPS. Este método de
producción es ilustrado más adelante.
La secuencia ADN para CHIPS de S. aureus
es clonada dentro de un vector adecuado que permite la expresión
eficiente de CHIPS en células huésped E. coli competentes
utilizando técnicas de biología molecular convencionales. La
estrategia utilizada permite la expresión de la proteína CHIPS
completa vinculada a un etiqueta HIS removible en el
N-termino en el citoplasma de E. coli. Fue
utilizado el Sistema de Expresión trc (vector pTrcHIS B; Invitrogen)
que permite la expresión de proteínas no tóxicas en E. coli.
El vector contiene una etiqueta de polihistidina (6xHis)
N-terminal para purificación rápida, un epitopo
Xpress para una detección fácil con un anticuerpo
anti-Xpress y un sitio de corte de enteroquinasa
para eliminación de la etiqueta de fusión.
El ADN cromosómico S. aureus Newman fue
utilizado como calibre para la reacción PCR utilizando polimerasa
Pwo-ADN que resulta en un producto de PCR terminado
romo. Los cebadores utilizados son CHIPS-TTT
(comienzan exactamente con el primer aminoácido de CHIPS (F) y
CHIPS-TAA (que contiene un codón de parada y un
sitio EcoRI).
El producto PCR es asimilado con RcoRI y el
vector pTrcHIS B con BamHI. El rebose 5' es eliminado con
S1-nucleasa para hacer el sitio BamHI de extremo
romo exactamente donde la enteroquinasa (EK) asimilara la proteína.
Posteriormente el vector es asimilado con EcoRI y ligado con el
producto PCR asimilado.
Para transformación del vector, es utilizada
TOP-10 E. coli (InVitroGen) usando
precipitación de calcio estándar (F.M. Ausubel et al., 1990,
Protocolos Recientes en Biología Molecular, Jhon Wiley E hijos,
Inc., Nueva York, N.Y.). Los clones son examinados en placas que
contienen ampicilina y la ligación apropiada del gen CHIPS se
verifica mediante secuencia del plásmido aislado
(clon-29).
Después de la expresión del gen CHIPS, las
bacterias E. coli se lisan y la mezcla de proteínas es
aplicada sobe una columna de afinidad ión-níquel
(ProBond). Por lo tanto se inicia un cultivo de clone29 en el medio
LB + 50 g/ml ampicilina con 1 mM IPTG durante 4 horas a 37ºC. Las
bacterias son centrifugadas y el granulado resuspendido en tampón
frío fosfato pH 7.8 y almacenado a -20ºC. Para la lisis celular, se
agrega lisozima (100 g/ml) durante 15' en hielo, se sonican los
tubos, se congelan en N_{2} liquido y se descongelan luego en un
baño de agua a 37ºC. Este ciclo de
sonicación/congelación/descongelación se repite tres veces.
Posteriormente se agrega RNasa y DNasa (5 g/ml)
durante 30' en hielo. La mezcla es centrifugada a 3000 g durante 30'
a 4ºC y filtrada a través de un filtro de 0.45 m. El lisado final es
diluido 1:1 con tampón de Fosfato pH 7.8 frío y pasado por una
columna Nickel cargada (InVitroGen). La columna es lavada con tampón
de fosfato pH 7.8, con tampón de fosfato pH 6.0 y con tampón de
fosfato pH 5.3. El CHIPS ligado es eluido con 500 mM de imidazol en
tampón de fosfato pH 6.0.
La etiqueta HIS es eliminada por escisión de
enteroquinasa seguido por la eliminación de la proteasa con una
resina de afinidad enteroquinasa EK-Away. Por lo
tanto el efluente se dializa durante la noche en tampón de
asimilación frío (50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl_{2} y
0.1% Tween-20, pH 8.0), filtrado a través de un
filtro de 0.45 m y asimilado con 0.175 l de producto
Enteroquinasa/ml de HIS-CHIPS. Esta cantidad de
Enteroquinasa es dependiente del lote y resulta en una asimilación
parcial para evitar la generación de productos de ruptura. El
producto asimilado es dializado contra tampón de fosfato pH 7.8 y
pasado sobre una columna fresca Nickel para eliminar CHIPS
etiquetados HIS no escindidos (HIS-CHIPS); el
producto pasado es CHIPS recombinante puro (rCHIPS). El
HIS-CHIPS sin asimilar puede ser eluido otra vez de
una columna Nickel para una segunda ronda de asimilación. La columna
Nickel es finalmente lavada con 50 mM EDTA, 0.5 M NaOH, agua, 5
mg/ml NiCL_{2}, agua y se almacena en 20% de etanol.
Todos los pasos en el aislamiento y asimilación
de HIS-CHIPS son revisados por
SDS-PAGE en un gel de 16.5%
Tris-Tricine Ready (BioRad). Las muestras son
mezcladas 1:1 con tampón de muestra (200 mM Tris-HCl
pH 6.8 2% SDS, 40% glicerol, 0.04% Coomassie), hervidas durante 5
minutos y cargadas en el gel. La etiqueta HIS de la proteína
expresada contiene un epítopo X-press que permite la
detección del producto HIS-CHIPS mediante Western
blot utilizando el anticuerpo
anti-X-press (InVitroGen). En
adición, CHIPS es específicamente detectado con el anticuerpo
péptido policlonal de conejo anti-CHIPS. Las
proteínas son transferidas a una membrana de nitrocelulosa,
bloqueada con 4% de gelatina en PBS y probada con el anticuerpo y el
apropiado conjugado etiquetado de peroxidasa secundaria (Harlow
& Lane, 1998, Anticuerpos: un manual de laboratorio, Laboratorio
Cold Spring Harbor).
La inhibición dependiente de concentración de
CHIPS recombinante (rCHIPS) en la expresión del receptor para fMLP
(FPR) y C5a (C5aR) en neutrofilos fue demostrada de la siguiente
manera. Se incubaron células con diversas concentraciones rCHIPS
durante 15 minutos a temperatura ambiente, puestas en hielo y
posteriormente probadas con ya sea fMLP etiquetado BODIPY (ver
ejemplo1.2) o un anticuerpo monoclonal dirigido contra C5aR (clon 5
S/1, SeroTec) en combinación con un Ig de cabra anti ratón
secundario etiquetado FITC (DAKO, 1:30). Finalmente las células
fueron lavadas y analizadas para receptor de expresión en un FAScan
midiendo la fluorescencia de 5000 neutrófilos. La expresión de
receptor es comparada a células tratadas con tampón y expresadas
como un valor relativo.
El deterioro dependiente de concentración de la
liberación de calcio intracelular libre inducido por fMLP y C5a en
neutrófilos fue probado como sigue. Se cargaron células con una
sonda intracelular especifica de calcio (Fluo-3,
acetoximetilo (AM) ester; Sondas Moleculares) y se incubaron con
diversas concentraciones rCHIPS durante 15 minutos a temperatura
ambiente. De cada muestra fue determinado el valor de fluorescencia
inicial en el FACScan mediante la medición de 2000 células.
Posteriormente, se agregó estimulo (10-^{9} M fMLP
o 10-^{10} M rCSa) y la intensidad de
fluorescencia de la misma muestra se determinó exactamente 15
segundos después de la administración del estimulo (el punto de
tiempo optimo para ambos agonistas). La activación de neutrófilos
con fMLP o C5a inicia un aumento rápido y transitorio en
concentración de calcio intracelular libre el cual es medido por
aumento de señal de fluorescencia Fluo-3. De cada
muestra activada, es sustraído el valor inicial de fluorescencia
basal. Los resultados son expresados como un porcentaje de células
tratadas con tampón estimuladas con fMLP o C5a.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 11 es una imagen representativa de un
SDS-PAGE que muestra el CHIPS recombinante
purificado final (rCHIPS). Las dos vías de acompañamiento (1 y 3)
muestran el producto recombinante completo que es codificado por el
vector generando la proteína CHIPS con una etiqueta Hestidina
adicional y sitio de corte de enteroquinasa. Esto codifica para una
proteína con un peso molecular aparente de 21 kDa, mientras que
CHIPS tratados por Enteroquinasa purificada pasa a un peso molecular
aparente de 17 kDa, igualmente a lo mostrado para CHIPS purificado
natural de S. aureus (ver Ejemplo 1.1 y Figura 2). El rCHIPS
purificado fue caracterizado por MALDITOF MS y reveló una masa
molecular de 14.12250, que es altamente comparable con la masa
molecular prevista de 14.12217 en base a la secuencia CHIPS.
Figuras 12 y 13 ilustran la efectividad
biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se demostró según la invención que es posible
producir un polipéptido sintético que tiene exactamente la misma
actividad que CHIPS natural así como recombinante. El proceso de
producción es como sigue:
La síntesis del péptido
FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKES-FKNSGLPTTLGKLDERLRNNYLKKGTK
NSAQFEKM-VILTENKGYYTVYLNTPLAEDR-KNVELLGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAY por
la resina TGT con Tirosina 9-fluorenilmetiloxicarbonilo-and O t-but protegida [Fmoc Tyr (t-but)] unida a él (5 g, 0.3 mmol, NovaBiochem) fue transferida al sintetizador de péptido, y una solución de piperidina (12 ml) en dimetilformamida (DMF; 18 ml) se agregó a la resina. La solución se agitó durante 1 hora y la resina lavada con DMF (3 x 30 ml) seguido por diclorometano (DCM; 3 x 30 ml) y dejada a secar al vacío durante 5 minutos. Los aminoácidos restantes fueron montados secuencialmente empleando química Fmoc estándar. La escisión de la proteína se logró mediante tratamiento de la resina de la proteína con una solución de ácido trifluoroacetico/tetraisopropilsilano/H_{2}O [90:8:2 v/v/v] durante 2.5 horas. El producto crudo (2.1 gms) fue aislado por precipitación por éter seguido por purificación mediante el uso de Cromatografía Liquida de Alto Rendimiento. El producto purificado fue caracterizado por MALDI MS.
NSAQFEKM-VILTENKGYYTVYLNTPLAEDR-KNVELLGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAY por
la resina TGT con Tirosina 9-fluorenilmetiloxicarbonilo-and O t-but protegida [Fmoc Tyr (t-but)] unida a él (5 g, 0.3 mmol, NovaBiochem) fue transferida al sintetizador de péptido, y una solución de piperidina (12 ml) en dimetilformamida (DMF; 18 ml) se agregó a la resina. La solución se agitó durante 1 hora y la resina lavada con DMF (3 x 30 ml) seguido por diclorometano (DCM; 3 x 30 ml) y dejada a secar al vacío durante 5 minutos. Los aminoácidos restantes fueron montados secuencialmente empleando química Fmoc estándar. La escisión de la proteína se logró mediante tratamiento de la resina de la proteína con una solución de ácido trifluoroacetico/tetraisopropilsilano/H_{2}O [90:8:2 v/v/v] durante 2.5 horas. El producto crudo (2.1 gms) fue aislado por precipitación por éter seguido por purificación mediante el uso de Cromatografía Liquida de Alto Rendimiento. El producto purificado fue caracterizado por MALDI MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias que describen métodos similares
son:
E Bayer et al., in: Peptides,
Chemistry, Structure and Biology. Proceedings of the 13th
American Peptide symposium.
RS Hodeges and JA Smith (eds) ESCOM, Leiden,
(1994) p. 156.
G Grübler et al., in:
Innovation and perspectives in Solid Phase Synthesis 3rd
International Symposium. RE Pron (ed) Mayflower Worldwide,
Birmingham (1994) p. 517.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando varias colonias de E. coli
conteniendo el plásmido con CHIPS recombinante fueron analizadas
para una inserción apropiada del gen chp mediante secuenciación,
varias inserciones incompletas fueron encontradas. Una de ellas que
contiene la etiqueta HIS completa, sitio de corte de enteroquinasa y
la proteína CHIPS menos los primeros tres aminoácidos
(CHIPS^{4-121}; clon 19) fue propagada
adicionalmente y purificada como se describe para CHIPS completo
(ver Ejemplo 6).
\vskip1.000000\baselineskip
En tubos Falcon 5 l, diluciones seriadas de
CHIPS recombinante o CHIPS^{4-121} fueron
preparadas y mezcladas con 5 l CHIPS-FITC (10 g/ml;
ver Ejemplo 2). Después 50 l de neutrófilos aislados en 5 x 10^{6}
células/ml se añadieron e incubaron durante 30 minutos en hielo. Las
células se lavaron y analiza para unión CHIPS-FITC
por citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 14 muestra la inhibición dependiente de
concentración de la unión CHIPS-FITC ya sea por
CHIPS recombinante así como por CHIPS^{4-121}
mutante recombinante. Ambas preparaciones muestran un patrón de
inhibición similar con iguales concentraciones eficaces.
Claims (18)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
(poli)péptido con actividad de la Proteína Inhibidora de la
Quimiotaxis de Staphylococcus aureus (CHIPS), dicha secuencia
de nucleótido correspondiendo a una secuencia que es seleccionada
del grupo consistente de:
- a)
- una secuencia de nucleótido que comprende al menos parte de la secuencia como se representa en la Figura 4 (SEC ID NO 4);
- b)
- secuencias de nucleótidos que codifican un (poli)péptido con actividad CHIPS y que tienen la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 5 (SEC ID NO 5);
- c)
- secuencias de nucleótidos que son al menos 40% idénticos a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) o b);
- d)
- secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con cualquiera de las secuencias de nucleótidos a), b) o c), y
- e)
- secuencias de nucleótidos complementarias a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a), b), c) o d), donde las condiciones rigurosas en el paso d) están constituidos por hibridación durante la noche a 42ºC en 5xSSC y lavado a 65ºC en 0.1xSSC y donde la actividad CHIPS es la capacidad de comprometer específicamente la unión ligando-(C5a o MLP).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una molécula de ácido nucleico aislada según
la Reivindicación 1, de la cual la parte de la secuencia de
nucleótidos como se define en la Reivindicación 1 bajo a)
corresponde a nucleótidos 1 a 490 de la Figura 4 (SEC ID NO 4).
3. Una molécula de ácido nucleico aislada según
la Reivindicación 1 o 2, de la cual la parte de la secuencia de
nucleótidos como se define en la Reivindicación 1 bajo a)
corresponde a nucleótidos 41 a 490 de la Figura 4 (SEC ID NO 4).
4. Una molécula de ácido nucleico aislada según
la Reivindicación 1, 2 o 3, de la cual la parte de la secuencia de
nucleótidos como se define en la Reivindicación 1 bajo a)
corresponde a nucleótidos 125 a 490 de la Figura 4 (SEC ID NO
4).
5. Una molécula de ácido nucleico aislada según
las Reivindicaciones 1-4, donde la secuencia de
nucleótidos como se define en la Reivindicación 1 bajo c) es al
menos 50% idéntica a cualquiera de las secuencias de nucleótidos a)
o b).
6. Una molécula de ácido nucleico aislada según
la Reivindicación 5, donde la secuencia de nucleótidos como se
define en c) es al menos 70% idéntica a cualquiera de las secuencias
de nucleótidos a) o b).
7. Una molécula de ácido nucleico aislada según
la Reivindicación 6, donde la secuencia de nucleótidos como se
define en c) es al menos 90% idéntica a cualquiera de las secuencias
de nucleótidos a) o b).
8. Una molécula de ácido nucleico aislada según
las Reivindicaciones 1-7, cuyo ácido nucleico es
ADN, ARN o ADNc.
9. Un vector recombinante que comprende al menos
una molécula de ácido nucleico aislada según las Reivindicaciones
1-8.
10. Un método para hacer un vector recombinante
que comprende la inserción de al menos una molécula de ácido
nucleico aislada según las Reivindicaciones 1-8
dentro de un vector.
11. Un huésped procariótico recombinante que
comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada según las
Reivindicaciones 1-8, un vector según la
Reivindicación 9.
12. Un huésped recombinante según la
Reivindicación 11, donde el huésped es seleccionado del grupo que
consiste de la bacteria Escherichia coli, Bacillus subtilis,
o Staphylococcus aureus.
13. Un método para la producción de un
(poli)péptido recombinante con actividad CHIPS, que comprende
el cultivo de un huésped recombinante de la Reivindicación 11 o 12
bajo condiciones tales que dicho (poli)péptido es expresado y
recuperar de dicho (poli)péptido donde la actividad CHIPS es
la capacidad de comprometer específicamente la unión ligando-(C5a o
fMLP).
14. Un método según la Reivindicación 13, donde
el huésped es una célula Escherichia coli.
15. Un método según la Reivindicación 13, donde
el huésped es una célula Staphylococcus aureus.
16. Un método según la Reivindicación 15, donde
la célula Staphylococcus aureus es de una cepa que ya produce
una proteína endógena con actividad CHIPS (CHIPS).
17. Un método para el aislamiento de un
organismo de un gen que codifica una proteína con actividad CHIPS,
que comprende cribar una biblioteca genómica o ADNc de tal organismo
con una sonda basada en la molécula de ácido nucleico según las
Reivindicaciones 1-8, aislar los clones positivos, y
probar si los clones positivos muestran actividad CHIPS donde la
actividad CHIPS es la capacidad de comprometer específicamente la
unión ligando-(C5a o fMLP).
18. Prueba de diagnóstico para uso en el
diagnóstico de pacientes infectados con Staphylococcus aureus
para la presencia en la S. aureus infecciosa del gen CHIPS,
cuya prueba es una prueba PCR para la cual los cebadores son
diseñados en base a la secuencia de nucleótidos representada en la
Figura 4 (SEC ID NO 4).
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