NO20023248L

NO20023248L - Nukleinsyrer som koder for (poly)peptider med CHIPS-aktivitet

Info

Publication number: NO20023248L
Application number: NO20023248A
Authority: NO
Inventors: Johannes Antonius Gerar Strijp; Cornelis Petrus Maria V Kessel; Andreas Paul Peschel
Original assignee: Jari Pharmaceuticals Bv
Priority date: 2000-01-07
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2002-09-06
Also published as: EP1244790A2; US20030175881A1; US7388078B2; NO20023248D0; ES2382422T3; AU3540901A; BR0107458A; ATE490324T1; WO2001049711A3; PT1244790E; PL356838A1; KR20020073496A; EP1244790B1; IL150574A0; DK1244790T3; US7081513B2; DE60143561D1; US20060205655A1; CA2395876A1; WO2001049711A2

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår et nukleinsyremolekyl som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet. Oppfinnelsen vedrører videre anvendelsen av informasjonen i nukleinsyren for fremstillingen av det korresponderende (poly)peptidet og til vektorer og verter for anvendelse deri. Oppfinnelsen angår i tillegg ikke-(poly)peptidmolekyler med en lignende struktur og funksjon som (poly)peptidene. (Poly)peptidet med CHIPS-aktivitet som er kodet av nukleinsyremolekylet i oppfinnelsen kan bli anvendt i behandlingen av inflammasjonsreaksjoner.

(Poly)peptidene og ikke-(poly)peptidene kan dessuten bli anvendt for å inhibere aktivering av leukocytter og endotelceller.

Leukocytter er hovedsakelig involvert i å beskytte kroppen mot fremmede inntrengere (f.eks. bakterier, virus, sopp og kreftceller). De viktigste cellene er lymfocytter, monocytter og nøytrofiler. Lymfocytter utgjør det spesifikke immunsystemet og forårsaker immunreaksjoner mot inntrengere. Deres viktigste oppgave er å bygge opp spesifikk hukommelse mot inntrengeren, slik at inntrengeren blir gjenkjent, drept og raskt fjernet neste gang den ankommer kroppen. Noen ganger angriper disse lymfocyttene ikke bare inntrengere, men reagerer også mot kroppens egne strukturer og/eller molekyler (såkalte autoantigener) som forårsaker autoimmune sykdommer (f.eks. reumatoid artritt). Dreping og fjerning av inntrengere blir for det meste utført av monocytter og nøytrofiler, celler fra det medfødte immunsystemet, med direkte gjenkjenning av inntrengerne eller med hjelp av spesifikke lymfocytter.

I motsetning til det fine nettverket av de fininnstilte og kontrollerte reaksjonene av lymfocytter reagerer celler fra det medfødte systemet på en relativ uspesifikk og aggressiv måte. Siden de er en del av kroppens første forsvarslinje, er deres viktigste oppgave å drepe og fjerne den innvader-ende agensen så raskt som mulig. Dette oppnås ved hjelp av svært aggressive substanser (f.eks. frie radikaler og en zymer) som ikke bare er dødelige for inntrengeren, men også forårsaker skade på vertsceller i nærheten. Substanser fra disse skadede cellene og de lokalt aktiverte cellene fra det medfødte systemet vil videre tiltrekke økende antall nøytrofiler og monocytter som forårsaker lokal inflammasjon. I de fleste tilfellene er en slik aggressiv og ødeleggende inflammatorisk reaksjon, forårsaket av overak-tiverte nøytrofiler, unødvendig. I noen tilfeller er denne inflammatoriske responsen ansvarlig for alvorlige, enkelte ganger dødelige forstyrrelser og inkluderer tilstander som akutt lungesviktsyndrom (ARDS), alvorlig vevsskade etter trombotiske hendelser som hjerteinfarkt og slag, inflammatoriske tarmsykdommer og reumatoid artritt. Inflammasjonen vil avta med en gang alle inntrengerne har blitt drept og fjernet, sammen med de ulike cellene som er drept i prosessen. Leging av såret, forårsaket av den inflammatoriske responsen, kan deretter begynne. Selv om de har noe overlap-pende funksjoner, er hovedoppgaven til nøytrofiler å an-gripe inntrengerne og hovedoppgaven til monocytter er å fjerne restene fra dette angrepet. I tillegg har nøytro-filer en annen fredelig oppgave ved å assistere i sårtilhelingsprosessen.

Når bakterier har invadert kroppen og for eksempel infisert sentralnervesystemet (som i hjernehinnebetennelse), begyn-ner de å produsere mikrobielle substanser inkludert de for-mylerte polypeptidene (som fMLP-peptidet). Andre substanser av mikrobiell opprinnelse aktiverer komplementfaktor 5 (C5) konvertase enzym-kompleks, som omdanner C5 i komplementsy-stemet til dens aktiverte C5a form. Både C5a og fMLP er kjemoattraktorer, dvs. substanser som kan aktivere og tiltrekke celler fra blodårene (migrasjonsprosessen). Nøytro-filer responderer på disse to substansene og også på inter-leukin-8 (IL-8). Dette "kjemokinet" (navnet er gitt til kjemoattraktorer som dannes av celler i immunsystemet) pro-duseres vesentlig av aktiverte monocytter (men også i små mengder av de aktiverte nøytrofilene). Nøytrofiler inter agerer med disse substansene, fordi de har reseptorer for disse substansene på utsiden av cellemembranen.

Aktiverte nøytrofiler kan lett migrere fra blodårer. Dette er fordi kjemoattraktorene, mikrobielle produktene og substansene fra aktiverte monocytter vil ha økt permeabilitet-en til blodårene og stimulert endotelcellene i blodårevegg-ene til å uttrykke bestemte adhesjonsmolekyler. Nøytrofiler uttrykker selektiner og integriner (f.eks. CDllb/CD18) som binder til disse adhesjonsmolekylene. Når nøytrofilen har adherert til endotelcellene, kan den migrere gjennom cellene, under påvirkning av kjemoattraktorer/kjemokiner, mot infeksjonsstedet, der konsentrasjonen av disse substansene er høyest. Disse substansene aktiverer også nøytrofiler til å produsere en rekke andre molekyler, der noen av disse tiltrekker flere nøytrofiler (og dermed monocytter), men, for det meste, er de ansvarlig for å ødelegge de innvader-ende bakteriene. Noen av disse substansene (f.eks. frie radikaler,, enzymer som bryter ned proteiner (proteaser) og cellemembraner (lipaser)) er så reaktive og uspesifikke at celler fra det omkringliggende vevet (og nøytrofilene selv) ødelegges og forårsaker vevsskade. Denne skaden forverres ved nærvær av blodavledet væske som har passert den utette karveggen og er ansvarlig for hevelsen som alltid følger inflammasjon (kalt ødem). Trykket som bygges opp på grunn av denne overskuddsvæsken resulterer i ytterligere celle-skade og død.

Senere i den inflammatoriske prosessen migrerer monocytter til stedet og blir aktivert. Foruten deres rolle i fjerning av bakterier og cellerester produserer de også substanser som tumornekrosefaktor (TNF) og IL-8, som i sin tur tiltrekker flere aktiverte nøytrofiler, og forårsaker ytterligere lokal skade. TNF har også en direkte stimulatorisk effekt på nøytrofiler. Når alle inntrengerne har blitt fjernet, vil den inflammatoriske responsen avta, og området vil bli ryddet for de gjenværende restene av inntrengerne. Deretter starter sårtilhelingsprosessen. Selv om det er kjent at nøytrofiler spiller en sentral rolle i sårtilheling, er det ikke klart hvilke nøytrofilavledede substanser som er involvert og hvordan nøytrofilene er aktive i heling uten å være aggressive mot det omkringliggende vevet. Generelt vil skadet vev bli erstattet av arrvev hovedsakelig dannet av fibroblaster og kollagen. Når inflammasjon forekommer i områder av kroppen som har en viktig funksjon, som vev dannet fra hjertemuskelceller, hjerneceller eller lungealveolære celler, vil normal funksjon bli svekket av den resulterende arrdannelsen og føre til alvorlige tilstander som hjerteslag, paralyse og emfysem. For å begrense de svekkende konsekvensene av disse tilstandene, er det viktig å "dempe" den inflammatoriske reaksjonen så raskt som mulig.

Intervensjon for å kontrollere tidlig fase av den akutte inflammatoriske responsen representerer en mulighet for å bedre prognosen for et bredt spekter av pasienter, hvis symptomer kan bli sporet tilbake til en slik hendelse. En slik tilnærming har blitt forfektet for mange akutte og kroniske inflammasjonsbaserte sykdommer og vist å ha poten-sial basert på funn fra relevante sykdomsmodeller. Klassiske antiinflammatoriske midler som steroider og ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDS) har ikke den ideelle virkningsprofilen, verken i form av effektivitet

eller sikkerhet. Steroider affiserer den "gale" celletypen (monocytter), og deres dempende effekter omgås lett. NSAIDS har generelt en relativ svak effekt, delvis fordi de inter-venerer på et sent stadium i den inflammatoriske prosessen. Begge legemiddelklassene frembringer en rekke uønskede

bivirkninger som følge av andre aspekter av deres farmako-logiske aktivitet. Legemidler som virker direkte og spesifikt for å forebygge migrasjon og aktivering av nøytrofiler kan ha flere fordeler. Flere legemidler som er under tidlig utvikling interfererer bare med ett individuelt aspekt av nøytrofil aktivering (f.eks. C5 konvertaseinhibitorer, antistoffer mot C5a, C5a-reseptorblokkerende legemidler) og migrasjon (antistoffer mot integriner (som CDllb/CD18) og L-selektin på nøytrofiler og antistoffer mot adhesjonsmolekyler (som ICAM-1 og E-selektin) på endotelceller). Antistoffer mot TNF og IL-8 har effekter i kronisk inflammasjon, men bare marginale effekter i akutt inflammasjon, pga. den begrensede rollen monocytter (som vesentlig er ansvarlige for disse substansenes produksjon) spiller i den akutte fasen.

Noen ganger kan ikke årsaken til den akutte inflammasjonen bli fjernet og inflammasjonen blir kronisk. Med unntak av tuberkulose, kronisk hepatitt og bestemte andre tilstander, er dette sjelden tilfellet med infeksjoner. Kronisk inflammasjon kan imidlertid også bli forårsaket av andre stimuli enn bakterier, slik som autoimmune reaksjoner. I kronisk inflammasjon har forskning vist at rollen til monocytter er mye mer utpreget, og at nøytrofilmigrasjon og -aktivering, monocyttmigrasjon og -aktivering, vevsskade, fjerning av døde celler og sårtilheling foregår samtidig. Denne kom-plekse kaskaden av interaksjoner mellom celler og mange ulike cytokiner og kjemokiner har vært gjenstand for inten-siv forskning i mange år. Det var antatt at monocytter og deres produkter var de viktigste elementene som trengte å bli inhibert for å dempe kronisk inflammasjon. Dette for-klarer hvorfor steroider, som spesifikt interagerer med monocytter, generelt er mer effektive i kronisk inflammasjon til forskjell fra akutt inflammasjon. Langvarig behandling med steroider er imidlertid ikke et fordelaktig valg, fordi alvorlige og uakseptable bivirkninger kan fore-komme ved dosene som er nødvendige for å ha en klinisk effekt. Nyere behandlinger som benytter antistoffer mot TNF eller IL-8 har vist gode resultater og ble først betraktet som bevis for hovedrollen monocytter ble antatt å spille i kronisk inflammasjon. Ny forskning sprer tvil om en eksklu-siv rolle for monocytter i inflammasjon og peker til en kritisk rolle for nøytrofiler, som nå betraktes som å re-presentere bedre mål for terapeutisk intervensjon.

Den underliggende årsaken til en kronisk inflammatorisk tilstand er ikke alltid klar, og den opprinnelige årsaken trenger ikke alltid være ansvarlig for fremtidig tilbake-fall. Noen forskere tror at det er en sammenhengende syklus av hendelser i bestemte kroniske inflammatoriske sykdommer. Deres hypotese er at eksisterende aktiverte nøytrofiler og monocytter kontinuerlig tiltrekker og aktiverer nye grupper med celler og dermed uavbrutt fortsetter den inflammatoriske responsen, selv når den første stimulusen ikke lenger foreligger. Dette antyder at en akutt eller perio-disk behandling med en effektiv inhibitor av nøytrofil- og monocyttaktiveringen vil stoppe rekrutteringssyklusen av nye celler, som fører i riktig retning til modifisering av sykdomsprogresjon, eller til og med en fullstendig kurer-ing, og ikke bare symptomatisk lindring.

I forskningen som førte til den foreliggende oppfinnelsen ble en ny agens med inflammasjonsinhiberende egenskaper funnet i det ekstracellulære mediet til dyrket Staphylococcus aureus ( S. aureus). Denne agensen er temaet for innsendt søknad PCT/NL99/00442. Agensen ble funnet å være i stand til å blokkere ulike kjemokinreseptorer direkte eller indirekte. Inkubering av ulike celler med mediet resulterte i en sterkt redusert ekspresjon av flere av kjemokinreseptorene, både av ekspresjonen til reseptorer for klassiske kjemotaktiske agenser som fMLP og C5a på granulocytter og ekspresjonen av CXCR4 og CCR5 reseptorer på lymfocytter, monocytter og makrofager. Den reduserte reseptorekspresjonen var relatert til sterkt redusert kjemotakse i forhold til kjemokinene, så vel som en redusert infeksjon med hiv.

Aktiviteten til proteinet er allerede manifestert i kultursupernatanten til kultivert S. aureus. Det aktive proteinet kan bli videre renset for eksempel ved hjelp av flere ligandfargekolonner. En prerensing ble først utført på en såkalt "gul kolonne" ("Reactive Yellow 86" ligandfarge kryssbundet 4% agarosekolonne (Sigma)), etterfulgt av en absorpsjonskromatografikolonne (den såkalte "grønne kolonnen" ("Reactive Green 19" ligandfarge kryssbundet 4% agarosekolonne (Sigma)) og en DNA-kolonne (DNA Cellulose (Pharmacia)). Begge sistnevnte kolonner kan bli ombyttet. DNA-kolonnen fjerner en kontaminant som har samme molekylvekt som proteinet. Absorpsjonskromatografikolonnen konsentrerer proteinet og er selektivt for proteinet. Til slutt finner en postrensing også sted ved hjelp av gelfiltrering og anionebyttekromatografi (MonoQ, Pharmacia). I gelfiltreringen selekteres proteinet med molekylvekt på ca.

17 kDa. Dette er proteinet som ble funnet å ha kjemotakse-inhibitoriske egenskaper. Siden dette proteinet isoleres

fra supernatanten til Staphylococcus aureus og resulterer i inhibisjon av kjemotakse, ble dette proteinet kalt "CHIPS": Kjemotakseinhibitorisk protein fra Staphylococcus aureus (heri også henvist til som det "opprinnelige CHIPS").

Isolering av CHIPS-proteinet fra supernatanten til S. aureus er ikke veldig kostnadeffektivt. I tillegg er det fordelaktig for den praktiske anvendelsen av CHIPS i terapi at den aktive delen av proteinet er isolert. Mindre protein- eller peptidmolekyler har en redusert risiko for å indusere en immunologisk respons i et individ som mottar proteinet eller peptidet for terapi. Videre er det fordelaktig å være i stand til å modifisere proteinet eller peptidet for å videre øke den biologiske aktiviteten og/eller redusere immunogeniteten derav.

Det er derfor målet med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe fremgangsmåtene for å fremstille det opprinnelige CHIPS-proteinet eller andre tilsvarende (poly)peptider med CHIPS-aktivitet, så vel som funksjonelle fragmenter, derivater eller analoger derav på annen måte enn med isolering fra den naturlig produserende vertscellen .

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer derfor et nukleinsyremolekyl innbefattende en nukleotidsekvens som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, der nevnte nukleotidsekvens korresponderer til en sekvens som er valgt fra gruppen bestående av: a) en nukleotidsekvens innbefattende minst en del av sekvensen som er vist i Figur 4 (SEKV ID NR:4); b) nukleotidsekvenser som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet og med aminosyresekvensen vist i Figur 5 (SEKV ID NR:5); c) nukleotidsekvenser som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet og som har minst én del av aminosyresekvensen vist i Figur 5 (SEKV ID NR:5); d) nukleotidsekvenser som er minst 40% identiske med en hvilken som helst av nukleotidsekvensene a), b) eller c) ; e) nukleotidsekvenser som hybridiserer ved stringente betingelser med en hvilken som helst av nukleotidsekvensene a), b), c) eller d), og f) nukleotidsekvenser som er komplementære til enhver av nukleotidsekvensene a), b), c), d) eller e).

Med hensyn til likheten eller homologien som er nevnt under

d), bør det bli nevnt at statistiske parametre kan bli es-timert for oppstillinger der man tillater mellomrom

("gapped alignments") ved å anvende Smith-Waterman algorit-men som gir optimale oppstillingsverdier. Homologer av CHIPS-nukleinsyresekvensen eller -proteinsekvensen er definert med en "gap open penalty" på minst 12 og en "gap expression penalty" på minst 1.

"CHIPS-aktivitet" er definert heri som evnen til å hvert fall spesifikt svekke responsene indusert av både fMLP og C5a, i hvert fall inkludert svekkelse av ligand- (C5a eller

fMLP) binding, og eventuelt svekkelse av kjemotakse og celleaktivering (f.eks. kalsiummobilisering). Poly(peptidene) kan imidlertid dessuten ha andre biologiske aktiviteter, slik som en inhibitorisk effekt på aktivering-en av leukocytter og endotelceller.

I beskrivelsen som følger anvendes begrepene "CHIPS-protein" og "CHIPS-gen" eller "chp-gen" for henholdsvis proteinet isolert fra supernatanten til naturlig forekommende S. aureus og dets isolerte gen. "(Poly)peptid med CHIPS-aktivitet" og "nukleinsyremolekyl som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet" anvendes for alle andre korresponderende (poly)peptider og nukleinsyremolekyler som på en eller annen måte er relatert til eller avledet fra CHIPS-proteinet eller -genet, men har en aminosyre- eller nukleotidsekvens som ikke er identisk dertil. CHIPS-aktiviteten, slik den er definert over, er en naturlig egenskap til de foreliggende (poly)peptidene. Denne effekten vil bli demonstrert for CHIPS-proteinet i eksempel 5.

Sekvensen som er vist i Figur 4 (SEKV ID NR:4) er DNA-sekvensen som er isolert i henhold til oppfinnelsen. Den innbefatter en promoterregion fra nukleotid 1 til 40, en lederpeptidsekvens fra nukleotid 41 til 124, den kodende regionen for (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet fra nukleotid 125 til 490, så vel som en 3' ikke-translatert region fra nukleotid 491 til 603.

I en første utførelse av oppfinnelsen har det isolerte nukleinsyremolekylet en nukleotidsekvens som korresponderer til nukleotid 1 til 490 i Figur 4. I en alternativ utfør-else foreligger ikke promoterregionen lenger. I denne ut-førelsen korresponderer nukleotidsekvensen av nukleinsyremolekylet til nukleotid 41 til 490 i Figur 4. Med dette nukleinsyremolekylet kan en ulik promoter og/eller andre transkripsjonsregulatoriske sekvenser bli anvendt. Valget av en promoter og/eller andre regulatoriske sekvenser er avhengig av betingelsene som transkripsjon skal foregå ved. Fagfolk kan selektere egnet promoter og/eller andre transkripsjonsregulatoriske regioner.

Det isolerte CHIPS-genet i Figur 4 eller enhver nukleinsyre avledet derfra kan for eksempel bli koblet funksjonelt til trc-ekspresjonssystemet (Brosius et al., Gene 27: 161-172

(1984)). Mange andre egnede ekspresjonskontrollsekvenser og fremgangsmåter for å uttrykke rekombinante proteiner er kjent (F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY).

Nukleotidsekvensen som er gitt i Figur 4 inneholder også en lederpeptidsekvens. Den kodende regionen til det modne proteinet korresponderer til nukleotid 125 til 490 i Figur 4. Andre ledersekvenser kan bli anvendt. Eller ledersekvensen kan være fullstendig utelatt, avhengig av vertscellen hvor sekvensen skal bli uttrykt.

Aminosyresekvensen i Figur 5 er avledet fra DNA-sekvensen i

Figur 4. I ytterligere en utførelse av oppfinnelsen kan nukleinsyremolekylet dermed ha en nukleotidsekvens som korresponderer til alle degenererte varianter av det isolerte CHIPS-genet.

Oppfinnelsen angår videre nukleinsyremolekyler som koder for (poly)peptider som ikke har den fullstendige sekvensen i Figur 5, men én eller flere funksjonelle deler derav som alene eller sammen utgjør et biologisk aktivt (poly)peptid med CHIPS-aktivitet. Slike deler kan variere i størrelse fra den fullstendige aminosyresekvensen minus én aminosyre til peptider på minst 2, fortrinnsvis minst 5 aminosyrer. I tilfelle den aktive delen av proteinet ligger i to eller flere deler av den fullstendige aminosyresekvensen, angår oppfinnelsen også nukleinsyresekvenser som koder for disse separate delene på en måte som fører til en peptidkonfigu-rasjon som beholder den biologiske aktiviteten. I praksis kan for eksempel dette bety at sekvenser må bli inkorporert mellom biologisk aktive deler for å gi en biologisk aktiv konformasj on.

Når det er henvist til "minst en del av sekvensen", betyr ikke dette bare de tre delene som er beskrevet ovenfor (dvs. nukleotidene 1-490, 41-490 og 125-490), men også andre fragmenter av genet eller kombinasjoner derav gitt at de fortsatt koder for et poly(peptid) med CHIPS-aktivitet.

I ytterligere en utførelse derav tilveiebringer oppfinnelsen derfor et isolert nukleinsyremolekyl i oppfinnelsen som består av den kodende regionen til én eller flere deler av aminosyresekvensen i Figur 5, der én del av aminosyresekvensen alene eller sammen med andre deler av aminosyresekvensen utgjør regionen(e) i (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet som fører til biologisk aktivitet.

Den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset til nukleinsyremolekyler med den eksakt samme sekvensen som sekvensen vist i Figur 4 eller de ovenfor beskrevne variantene derav. I henhold til oppfinnelsen er derfor ekstra nukleinsyremolekyler fremskaffet med en nukleotidsekvens som er minst 40 %, fortrinnsvis minst 50 %, mer foretrukket minst 60 %, enda mer foretrukket minst 70 %, mest foretrukket minst 80 %, og aller mest foretrukket minst 90% identisk med en hvilken som helst av nukleotidsekvensene som er definert under a), b) eller c) ovenfor.

Det ble funnet at CHIPS er mindre enn 40% homolog med proteiner og peptider kjent per dags dato. Proteiner og peptider som har minst 40% aminosyrehomologi med CHIPS-proteinet og har CHIPS-aktivitet er derfor også del av denne oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår videre nukleinsyremolekyler med en nukleotidsekvens som hybridiserer under stringente betingelser med et nukleinsyremolekyl som korresponderer med nukleotidsekvensen gitt i Figur 4 eller degenererte sekvenser derav, som koder for en aminosyresekvens som er gitt i Figur 5. Stringente betingelser ble benyttet ved hy-bridisering natten over ved 42 °C i 5xSSC (SSC = 150 mM NaCl, 15 mM trinatriumsitrat) og vask ved 65 °C ved 0,lxSSC. I tillegg til 5xSSC kan hybridiseringsløsningen innbefatte 50% formamid, 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5x Denhardts løsning, 10% dekstransulfat og 20^ig/ml denatu-rert, fragmentert sædcelle-DNA fra laks.

Oppfinnelsen er heller ikke begrenset til genet som koder for (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet, men angår også nukleinsyremolekyler som koder for fragmenter, derivater og analoger derav. "Fragmenter" er ment å omfatte alle deler av (poly)peptidet som opprettholder dets biologiske aktivitet. "Fragmenter" kan bestå av én sekvens av påfølgende aminosyrer eller av mer enn én slik sekvens. "Derivater" er det fullstendige (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet eller fragmenter derav som er modifisert. Eksempler på modifiseringer vil følge nedenfor heri. "Analoger" er lignende (poly)peptider med CHIPS-aktivitet isolert fra andre organismer, spesielt andre patogene organismer. Alle kategori-ene ovenfor har en ting felles, nemlig at de har "CHIPS-aktivitet". CHIPS-aktivitet kan bli målt med enhver test som viser migrasjon av leukocytter mot en passende kjemotaktisk stimulus. Eksempler på slike tester inkluderer underaga-roseteknikken (som er eksemplifisert i Balasoiu, et al., Diabetes care 20: 392-395 (1997)), modifiserte Boyden-kam-merteknikker og "transwell"-systemer (systemer med brønner der det er satt inn et permeabelt nivå over brønnbunnen som ikke er i fysisk kontakt med bunnen). Den sistnevnte teknikken er videre illustrert i eksemplene.

For den foreliggende søknaden har derfor uttrykket "(poly)peptider med CHIPS-aktivitet" til hensikt å inkludere det opprinnelige CHIPS-proteinet, (poly)peptider, fragmenter, derivater og analoger som har CHIPS-aktivitet. Det isolerte nukleinsyremolekylet i henhold til oppfinnelsen kan være DNA, RNA eller cDNA.

Oppfinnelsen angår videre prober og primere avledet fra nukleinsyremolekylet i oppfinnelsen. Slike primere er oligonukleotider eller polynukleotider på minst ca. 10 påfølgende nukleotider (nt), og mer foretrukket minst ca. 25 nt, enda mer foretrukket minst ca. 30 nt og enda mer foretrukket ca. 30-70 nt av nukleinsyremolekylet i oppfinnelsen. Prober er lengre og kan for eksempel være en del av nukleinsyremolekylet i oppfinnelsen på 50-300 påfølgende nt eller til og med så lang som hele nukleinsyremolekylet.

Slike oligonukleotider eller polynukleotider er egnet som diagnostiske prober eller som prober i konvensjonelle DNA-hybridiseringsteknikker eller som primere for amplifisering av en målsekvens med polymerasekjedereaksjon (PCR) som for eksempel er beskrevet i Ausubel et al. ( supra).

Videre angår oppfinnelsen en rekombinant vektor innbefattende minst ett isolert nukleinsyremolekyl i oppfinnelsen. Vektoren som skal bli anvendt kan bli selektert av fagper-sonen basert på hans/hennes vanlig generelle kunnskap og vil være avhengig av verten som anvendes.

I tillegg til vektorer tilveiebringer oppfinnelsen en bakteriofag innbefattende minst én isolert nukleinsyre i oppfinnelsen. I de fleste CHIPS-positive stafylokokkene er genet som koder for CHIPS lokalisert på en profag og kan bli omgjort til en aktiv fag for eksempel ved behandling med mitomycin i henhold til standard og publiserte fagiso-lerende fremgangsmåter. En bakteriofag er derfor et an-vendelig hjelpemiddel for å introdusere CHIPS-genet i en vert.

Oppfinnelsen angår i tillegg en fremgangsmåte for å lage en rekombinant vektor, innbefattende innsetning av minst ett isolert nukleinsyremolekyl i oppfinnelsen i en vektor. Ved å inkorporere mer enn én kopi i vektoren, eller introdusere mer enn én vektor i en vert, kan ekspresjonsnivået bli påvirket. Når det blir anvendt en vertscelle som innbefatter et endogent gen for et korresponderende (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, kan ekspresjonsnivået derav bli økt ved å introdusere flere kopier av nukleinsyremolekylet (dvs. genet) i vertscellen eller forandre promoteren eller regulatorregioner.

Oppfinnelsen angår derfor også rekombinante verter innbefattende minst ett isolert nukleinsyremolekyl eller vektor i oppfinnelsen. Flere typer organismer eller celler fra prokaryoter, protister, sopp, dyr eller planter kan fungere som egnet vert for ekspresjonen av rekombinante (poly)peptider med CHIPS-aktivitet. Vertsceller inkluderer den mye anvendte bakteriestammen Escherichia coli inkludert, men ikke begrenset til, trc-ekspresjonssystemet (Brosius et al., supra) som muliggjør regulert, høyt ekspresjonsnivå fra trc-promoteren. Andre potensielt egnede bakteriestammer inkluderer grampositive bakteriestammer, slik som Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus eller enhver bakteriestamme som kan uttrykke heterologe proteiner. En foretrukket produksjonsprosess i E. coli er gitt i eksempel 6.

(Poly)peptidet med CHIPS-aktivitet kan også bli produsert som et rekombinant protein ved å anvende et egnet ekspresjonssystem som benytter lavere eukaryoter, slik som gjær eller insektceller. Egnede gjærstammer inkluderer Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Candida eller enhver gjærstamme som kan uttrykke heterologe proteiner. Insektceller anvendt for rekombinant proteinekspresjon inkluderer Drosophila-systemet og Baculovirus-systemet. Alternativt kan det være mulig å produsere (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet i et pattedyrekspresjonssystem som inkluderer flere egnede vertsceller, innbefattende COS-celler fra ape, hamster CHO, BHK-celler eller RBL-2H3, human 293, 3T3, HeLa, U937, HL-60 eller Jurkat-celler, L-

celler fra mus og andre transformerte celler for kultur in vitro. For ekspresjon av (poly)peptider med CHIPS-aktivitet i eukaryote systemer kan det være nødvendig å modifisere proteinet produsert deri for å oppnå et funksjonelt protein. Slike modifiseringer, som tilsetninger eller substi-tusjoner kan bli oppnådd ved å anvende kjente kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter. I tillegg kan sekvensen til nukleinsyremolekylet bli tilpasset kodonbruken i vertscellen.

(Poly)peptidet med CHIPS-aktivitet i oppfinnelsen kan også bli uttrykt som et produkt i transgene dyr, f.eks. som en komponent i melken til transgene kuer, geiter, griser, sauer, kaniner eller mus som erkarakterisert vedsomatiske celler eller kimbaneceller inneholdende en nukleotidsekvens som koder for (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet.

(Poly)peptidet kan bli fremstilt ved å dyrke transformerte vertsceller under kulturbetingelser egnet for å uttrykke det rekombinante proteinet. Det resulterende proteinet kan deretter bli renset fra kulturmediet eller celleekstrakter ved å anvende en rensingsprosess, som for eksempel innbefatter å lede kultursupernatanten til vertscellen eller en væske fremskaffet derfra etter prerensing over en absorpsjonskromatografikolonne; deretter lede gjennomstrømnings-væsken fra absorpsjonskromatografikolonnen først over en affinitetskromatografikolonne, og deretter lede eluatet fra affinitetskromatografikolonnen over en DNA-kolonne; eller deretter lede gjennomstrømningsvæsken fra absorpsjonskroma-tograf ikolonnen først over en DNA-kolonne, og deretter lede gjennomstrømningsvæsken fra DNA-kolonnen over en absorpsjonskromatografikolonne; lede henholdsvis gjennomstrøm-ningsvæsken og eluatet fra den siste kolonnen i det forrige trinnet over en gelfiltreringskolonne og anionebyttekolonne, og selektere fraksjonen med en molekylvekt på ca. 17 kDa og CHIPS-aktivitet. "Gjennomstrømningsvæske" betyr heri den delen av den tilsatte væsken som inneholder bestanddelene som kommer fra kolonnen uten ekstra behandling. Be-

standdelene i denne gjennomstrømningsvæsken binder ikke til kolonnen. "Eluat" er væsken som kommer fra kolonnen etter eluering og som inneholder bestanddelene fra væsken tilsatt kolonnen som ble bundet til kolonnen og ble frigjort igjen derfra med elueringen. I denne fremgangsmåten binder ab-sorps j onskolonnen de fleste bestanddelene i det tilsatte kulturmediet eller en væske fremskaffet derfra etter prerensing. Affinitetskolonnen binder (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet og Snase (stafylokokknuklease) som henholdsvis har en lignende molekylvekt som CHIPS-proteinet og en lignende affinitet (eller mangel derav) for affinitetskolonnen. DNA-kolonnen binder bare Snase. Denne fremgangsmåten fungerer spesielt bra hvis den første affinitetskromatografikolonnen er en såkalt ligandfarge "gul" kolonne, den andre affinitetskromatografikolonnen er en såkalt ligandfarge "grønn" kolonne og DNA-kolonnen en DNA-cellulosekolonne.

I tillegg kan andre kjente rensingsfremgangsmåter bli anvendt, slik som gelfiltrering, ionebyttekromatografi, affinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi eller immunaffinitetskromatografi.

Alternativt kan (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet bli uttrykt i en form som vil gjøre rensing enklere. For eksempel kan det bli merket med en polyhistidin (6xHis) epitope og deretter renset ved å anvende et resin som nikkelioner er bundet til ved hjelp av en chelaterende agens.

(Poly)peptidet med CHIPS-aktivitet inneholdende markøren elueres fra resinet ved å senke pH eller ved å konkurrere med imidazol eller histidin. Slik epitope er kommersielt tilgjengelig fra Invitrogen. Introduksjon av et protease-kuttesete, som det for enterokinase, muliggjør fjerning av fusjonsmarkøren for å generere modent nativt rekombinant (poly)peptid med CHIPS-aktivitet. Materialer og fremgangsmåter for et slikt ekspresjonssystem er kommersielt tilgjengelig fra Invitrogen, ved å anvende pTrcHis Xpress™ vektorene i kombinasjon med ProBound™ resin for effektiv

isolering av His-merket protein og EnterokinaseMax™ som svært katalytisk aktiv protease og EK-Away™ enterokinaseaffinitetsresin for å fjerne det kontaminerende nærværet av proteasen. Andre markører som er kjent for fagfolk som kan bli anvendt for å gjøre rensing enklere inkluderer, men er ikke begrenset til, glutathion S transferase (GST-fusjon), mye og HA.

(Poly)peptidet med CHIPS-aktivitet kan også bli fremstilt med kjent kjemisk syntese. Fremgangsmåter for å konstruere polypeptider eller proteiner syntetisk er kjent for fagfolk. Det syntetiske proteinet, i kraft av at det deler primære, sekundære og tertiære strukturelle- og/eller kon-formasjonskarakteristika med det korresponderende (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet, vil ha aktivitet til felles med dette, dvs. CHIPS-egenskaper. Derfor kan slike syntetisk fremstilte proteiner bli anvendt som biologisk aktiv eller immunologisk substitutt for naturlig renset (poly)peptid med CHIPS-aktivitet. CHIPS-syntesen er videre illustrert i eksempel 7.

(Poly)peptidene med CHIPS-aktivitet tilveiebragt heri inkluderer også (poly)peptiderkarakterisert vedaminosyresekvenser der modifiseringer er gitt naturlig eller bevisst modifisert. Modifiseringer i (poly)peptidet eller DNA-sekvenser kan bli gjort av fagfolk ved å anvende kjente konvensjonelle teknikker. Modifiseringer av interesse i de CHIPS-aktive (poly)peptidsekvensene kan inkludere bytting, innsetning eller delesjon av selekterte aminosyrerester i den kodende sekvensen.

Informasjonen i CHIPS-proteinet, dets gen og andre (poly)peptider med CHIPS-aktivitet og deres kodende nukleinsyremolekyler avledet derfra kan bli anvendt for å screene etter fragmenter derav eller andre agenser som kan inhibere eller blokkere binding av et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet til leukocytter, og kan dermed fungere som inhibitorer av kjemotakseaktivitet og/eller CHIPS-binding til dets putative reseptor. Egnede screeningstester kan for eksempel anvende det fluorescensmerkede rensede CHIPS-proteinet som binder til nøytrofiler som analyseres med væskestrømcytometri eller fluorometri. Eksempel 2 beskriver en slik test. En egnet bindingstest kan alternativt benytte renset CHIPS-reseptor eller reseptordomene på en bærer med en form av CHIPS-protein som ligand. Alternativt kan det bli anvendt en test som screener for evnen til å binde eller konkurrere med CHIPS for binding til et spesifikt anti-CHIPS antistoff (monoklonalt, polyklonalt eller enkeltkjedet antistoff) med ulike immuntester kjent i faget, innbefattende, men ikke begrenset til, kompetitive og ikke-kompetitive ELISA-teknikker eller Biosensor-teknologi som benytter en sensorbrikke belagt med enten ligand (CHIPS), antistoff eller putativ CHIPS-reseptor (over-flateplasmaresonans (SPR) teknikk lik BiaCore). Et hvilket som helst annet (poly)peptid enn CHIPS som har CHIPS-aktivitet kan også bli anvendt i screeningstestene som er beskrevet. Alle disse fremgangsmåtene kan bli tilpasset systemer for høy kapasitetsscreening (HTS).

Isolerte poly(peptider) med CHIPS-aktivitet kan bli anvendt som inhibitorer av fMLP- og C5a-binding til deres respek-tive reseptorer FPR og C5aR, eller for å designe inhibitorer av CHIPS-binding, ved å screene for kompetitiv inhibisjon. Inhibitorer av CHIPS-binding (til den putative CHIPS-reseptoren eller reseptordomener) er også egnet for å behandle slike tilstander.

Oppfinnelsen vedrører videre molekyler som ikke er poly(peptider), men har en lignende struktur og funksjon som (poly)peptidene beskrevet heri. Eksempler på slike molekyler er peptidoetterligninger. Når man i denne søknaden henviser til (poly)peptider, er det også meningen å inkludere slike ikke-(poly)peptider som har lignende eller samme struktur og funksjon og som et resultat av dette en lignende eller den samme biologiske aktiviteten som (poly)peptidene.

Den funksjonelle aktiviteten til CHIPS, (poly)peptidene, deres fragmenter, derivater og analoger kan bli undersøkt med ulike fremgangsmåter. Fortrinnsvis måles denne CHIPS-aktiviteten med væskestrømcytometri ved dens evne til å hindre bindingen av fluorescerende fMLP (Bodipy-fMLP) eller fluorescerende C5a (FITC-C5a) til nøytrofiler. Eksempel 1 beskriver en slik test. CHIPS-aktivitet måles også med dens evne til å hindre migrasjon av nøytrofiler mot fMLP eller C5a ved hjelp av "transwell"-kjemotaksetesten beskrevet i Eksemplene. Alternativt kan en test basert på evnen til kjemokiner, innbefattende fMLP og C5a, til å initiere en rask og forbigående økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon bli anvendt for å screene etter CHIPS-aktivitet. Ulike tester kjent i faget kan bli anvendt innbefattende, men ikke begrenset til, anvendelsen av ulike kalsiumspesi-fikke fluorescerende prober i kombinasjon med væskestrøm-cytometri eller fluorometri, eller mikrofysiometri. Som celler for screeningen av CHIPS-aktivitet med begge fremgangsmåter kan ferskt isolerte nøytrofiler bli anvendt eller celler transfektert med enten FPR eller C5aR, villtype eller muterte former av disse reseptorene.

Isolerte (poly)peptider med CHIPS-aktivitet kan være egnet til å behandle, forebygge eller bedre inflammatoriske tilstander som er involvert i mange sykdommer og forstyrrelser som nevnt i Tabell 1. Støtte for den terapeutiske nytten av (poly)peptidene i oppfinnelsen for behandling av sykdommene i Tabell 1 kan bli funnet i følgende referanser: For ARDS: Demling RH (1995). The modern version of adult respiratory distress syndrome. Ann. Rev. Med. 4 6:193-202; og Fujishima S, Aikawa N 1995 Neutrophil-mediated tissue injury and its modulation. Intensive Care Med 21:277-285; For alvorlige infeksjoner (hjernehinnebetennelse): Tunkel AR og Scheld WM

(1993) . Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 6:118. For skade etter iskemi/reperfusjon: Helier T. et al. (1999). Selection of a C5a receptor antagonist from phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury. J. Immunol. 163:985-994. For reumatoid artritt: Edwards SW og Hallett MB (1997). Seeing the wood for the trees: the forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Immunology Today 18: 320-324; og Pillinger MH, Abramson SB (1995). The neutrophil in rheumatoid arthritis. Rheum. Dis. Clin. North Am. 1995 21:691-714. For myokardinfarkt: Byrne JG, Smith WJ, Murphy MP, Couper GS, Appleyard RF, Cohn LH (1992) . Complete prevention of myocardial stunning, contracture, low-reflow, and edema after heart transplantation by blocking neutrophil adhesion molecules during reperfusion. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:1589-96. For COPD: Cox G

(1998). The role of neutrophils in inflammation. Can. Respir. J. 5 Suppl A:37A-40A; og Hiemstra PS, van Wetering S, Stolk J (1998). Neutrophil serine proteinases and defensins in chronic obstructive pulmonary disease: effeets on pulmonary epithelium. Eur. Respir. J. 12:1200-1208. For slag: Barone FC, Feuerstein GZ (1999). Inflammatory mediators and stroke: new opportunities for novel therapeutics. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19:819-834; og Jean WC, Spellman SR, Nussbaum ES, Low WC (1998). Reperfusion injury after focal cerebral ischemia: the role of inflammation and the therapeutic horizon. Neurosurgery 4 3:1382-1396. For hjernehinnebetennelse: Tuomanen EI

(1996). Molecular and cellular mechanisms of pneumococcal meningitis. Ann. N. Y. Acad. Sei. 797:42-52. I henhold til ytterligere et aspekt derav angår derfor oppfinnelsen (poly)peptider med CHIPS-aktivitet for anvendelse i diagnose, profylakse eller terapi, spesielt for anvendelse i behandlingen av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infeksjon, mer spesielt for anvendelse i behandlingen av akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk sjokk, traumatisk hjerneskade, alvorlige infeksjoner, myokardinfarkt, slag, karkirurgi, ulcerøs kolitt, Crohns sykdom, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), reumatoid artritt, dermatose, multippel sklerose, Alzheimers sykdom, arteriosklerose, repetitiv belastningsskade (RSI), akutt transplantatrejeksjon, forbrenninger, akutt reaktiv artritt, pankreatitt, vaskulitt, glomerulonefritt, gikt, forfrysning og hjernehinnebetennelse.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av (poly)peptidene

med CHIPS-aktivitet for produksjonen av en fremstilling for diagnose, profylakse eller terapi, spesielt for behandlingen av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infeksjon, mer spesielt for behandlingen av indikasjonene

nevnt ovenfor.

Terapeutiske sammensetninger er også del av den foreliggende oppfinnelsen innbefattende et egnet hjelpestoff og (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet i oppfinnelsen. Slik sammensetning kan bli anvendt for behandlingene som er spe-sifisert ovenfor.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av nukleinsyremolekylet i oppfinnelsen, eventuelt inkorporert i en større kon-struksjon, for ulike formål som å tilveiebringe antistoffer dertil, modulere CHIPS-aktiviteten eller i en terapeutisk fremstilling.

Oppfinnelsen angår videre nukleinsyremolekyler og aminosyresekvensen kodet av nukleinsyremolekylene som kan bli identifisert med såkalt "datamaskinkloning". Mer spesifikt innbefatter denne teknikken anvendelse av (1) nukleinsyresekvensen som er vist i figur 4, eller fragmenter, derivater og analoger derav, eller (2) aminosyresekvensen som er vist i figur 5, eller fragmenter, derivater og analoger derav, for å screene nukleinsyresekvenser eller nuklein-syresekvensdatabaser, eller proteinsekvenser eller protein-sekvensdatabaser, ved å anvende søkalgoritmer som kan identifisere regioner med homologi. Slike algoritmer er kjent for fagfolk og inkluderer, men er ikke begrenset til, BLAST-søk (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410

(1990)). Sekvensdatabasene som kan bli gjennomsøkt inkluderer, men er ikke begrenset til, Genbank™-databasen og Swissprot™-databasen. Når man anvender et BLAST-søk eller modifiseringer derav, kan individer med homologi generelt bli identifisert. Identifisering er basert på størrelsen av verdien eller "smallest sum probability" P(N). Homologer av CHIPS-nukleinsyresekvensen eller (poly)peptidsekvensen er definert med en verdi som er minst 200, fortrinnsvis minst 400, mer foretrukket minst 800, mest foretrukket minst 1600. Alternativt kan P(N)-verdien bli anvendt for identifisering av homologe sekvenser. Homologer av CHIPS-nukleinsyresekvensen eller

(poly)peptidsekvensen er definert med en P(N)-verdi som er mindre enn le-3, fortrinnsvis mindre enn le-6, mer foretrukket mindre enn le-12, enda mer foretrukket mindre enn le-24, mest foretrukket mindre enn le-48.

I en fortsatt videre utførelse av oppfinnelsen er det tilveiebragt antistoffer eller biologisk aktive fragmenter derav rettet spesifikt mot (poly)peptidet i oppfinnelsen og CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler. Slike CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler og antistoffer eller biologisk aktive fragmenter derav og kimæriske forbindelser, enkeltkjeder og ekspresjonsbiblio-teker kan bli anvendt til å nøytralisere aktiviteten til CHIPS-proteinet eller beslektede (poly)peptider i profylakse eller terapi, eller kan bli anvendt til diagnostiske formål for å binde CHIPS eller beslektede (poly)peptider. Slike antistoffer og CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler er for eksempel egnet for behandlingen av staphylococcus- infeksjon. Oppfinnelsen tilveiebringer også terapeutiske sammensetninger innbefattende et egnet hjelpestoff og ett eller flere av disse antistoffene og/eller biologisk aktive fragmenter derav.

"CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler" er molekyler som konkurrerer med CHIPS i en CHIPS-bindingstest som er beskrevet i eksempel 8. Slike "CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler" kan for eksempel være molekyler som har den samme aminosyresammensetningen og aminosyresekvensen som CHIPS, men som ikke har den fullstendige sekvensen. Slike molekyler kan være enkle fragmenter av CHIPS, eller kan bestå av flere CHIPS-fragmenter, der alle fortsatt har CHIPS-aktivitet. Alle andre molekyler som oppfyller det funksjonelle kravet om å konkurrere med

CHIPS i en CHIPS-bindingstest er imidlertid også inkludert.

De isolerte nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen kan videre bli anvendt for genterapi. Nukleinsyremolekylet kan bli in-trodusert på inflammasjonsstedet for å virke lokalt eller

på et fjerntliggende sted. Genterapi foregår via virale vektorer som, men ikke begrenset til, adenovirale vektorer, adenoassosierte virale vektorer eller lentivirale vektorer. Alternativt kan ikke-virale vektorer, slik som de som er basert på liposomer eller polymerer, bli anvendt. Gen-terapeutiske strategier er basert på (1) in vivo-genterapi, der de isolerte nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen intro-

duseres i målceller in vivo, eller (2) ex vivo-genterapi, der de isolerte nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen introduseres i målceller ex vivo, etterfulgt av administrering av de transduserte cellene, eller en subpopulasjon av de transduserte cellene, inn i et individ.

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å behandle et individ som lider av inflammasjon ved å administrere en terapeutisk effektiv mengde av et (poly)peptid i oppfinnelsen og en fremgangsmåte for å genterapeutisk behandle et individ som lider av inflammasjon ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et nukleinsyremolekyl, så vel som en fremgangsmåte for å behandle et individ som lider av stafylokokkinfeksjon ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff og/eller biologisk aktivt fragment derav.

Nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen kan bli anvendt i en fremgangsmåte for å isolere et gen som koder for et protein med CHIPS-aktivitet fra en organisme, der fremgangsmåten innbefatter screening av et genomisk eller cDNA-bibliotek fra denne organismen med en probe basert på nukleinsyremolekylet og isolering av de positive klonene.

I henhold til et ytterligere aspekt derav angår oppfinnelsen en mikroorganisme med ett eller flere nukleinsyremolekyler i oppfinnelsen for anvendelse som et legemiddel for behandlingen av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infeksjon, spesielt for å behandle akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk sjokk, traumatisk hjerneskade, alvorlige infeksjoner, myokardinfarkt, slag, karkirurgi, ul-cerøs kolitt, Crohns sykdom, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), reumatoid artritt, dermatose, multippel sklerose, Alzheimers sykdom, arteriosklerose, repetitiv belastningsskade (RSI), akutt transplantatrejeksjon, forbrenninger, akutt reaktiv artritt, pankreatitt, vaskulitt, glomerulonefritt, gikt, forfrysning og hjernehinnebetennelse.

Oppfinnelsen angår videre en diagnostisk PCR-test for å screene en pasient infisert med Staphylococcus aureus for

nærvær av CHIPS-genet. CHIPS er en viktig stafylokokkviru-lensfaktor, så pasienter med CHIPS-inneholdende stafylokokker har høyere risiko for invasive sykdommer og kan trenge annen og ekstra behandling.

Alle molekyler i oppfinnelsen, dvs. nukleinsyremolekyler, (poly)peptider, ikke-(poly)peptider, fragmenter, derivater og analoger, kan ha andre anvendelser. Slike anvendelser inkluderer, men er ikke begrenset til: Isolering av faktorer som kan binde de ovenfor nevnte molekylene. Eksempler på slike faktorer er reseptorer og proteiner. Slik isolering kan for eksempel bli utført ved å anvende gjær-tohybrid-systemet eller ved å anvende merkede molekyler i oppfinnelsen som "fiskeagn".

Design av peptoider og peptidoetterligninger.

Fremstilling av fagdisplaybiblioteker, som deretter kan bli anvendt for å bestemme aktive domener, funksjonelle ekvivalenter osv.

Identifisere signaltransduksjonsveier som aktiveres

eller inaktiveres av CHIPS og molekylene i oppfinnelsen. - Test for å bestemme den biologiske CHIPS-aktiviteten (kjemotakseinhibisjon eller kjemokinreseptorekspresjon).

Alle molekylene i oppfinnelsen kan bli merket på en hvilken som helst måte. Eksempler på merking inkluderer, men er ikke begrenset til, fluorescens, biotin, radioaktiv merking osv. Slike merkede molekyler kan bli anvendt for å screene forbindelser som ligner på eller overlapper med den biologiske aktiviteten til CHIPS, så vel som for å identifisere bindingsseter, både in vivo og in vitro, og for å spore CHIPS-protein eller nukleinsyre i en organisme.

Når det er henvist heri til et poly(peptid) med en bestemt aminosyresekvens, er det også ment å omfatte poly(peptider) inneholdende én eller flere aminosyrer som er modifisert kjemisk på en måte som er innlysende for en fagperson, for-utsatt at slik modifisering ikke fjerner CHIPS-aktiviteten.

Den foreliggende oppfinnelsen vil bli videre illustrert i

eksemplene som følger, men eksemplene har på ingen måte til hensikt å være begrensende for denne oppfinnelsen. I denne beskrivelsen og eksemplene er det referert til de følgende figurene og tabellene:

Figur 1 viser CHIPS-aktiviteten til eluatet fra Mono Q-kolonnen. Figur 2 viser Coomassie-blåfarget SDS-PAGE av renset CHIPS etter det siste Mono Q-kromatografitrinnet. Figur 3 viser den konsentrasjonsavhengige bindingen av CHIPS-FITC til de ulike leukocyttpopulasjonene. Figur 4 viser sekvensen til chp-genet fra S. aureus Newman. Shine Dalgarno-sekvensen (AGGAGA) og den chp åpne leseram-men (ORF) er understreket. Nukleotidene som koder for det modne proteinet er indikert med en dobbel linje. Divergerende nukleotider i S. aureus 1690 sekvens er indikert over sekvensen. Figur 5 viser aminosyresekvensen avledet fra S. aureus Newman chp-genet. Regionen som matcher de 35 N-terminale aminosyrene i CHIPS er understreket. Divergerende aminosyrer i S. aureus 1690 proteinet er indikert over sekvensen . Figur 6 viser deteksjonen av chp-genet i genomene til S. aureus-stammer. Figur 7 viser CHIPS-aktivitet i supernatantene til S. aureus-stammer. Figur 8 viser fordelingen av chp-genet i genomene til ulike kliniske S. aureus-stammer. Figur 9 viser to doseresponskurver av kanin anti-CHIPS antistoffer som binder til CHIPS-avledede peptider av aminosyre 1 til og med 15 (figur 9A) og renset CHIPS (figur 9B) som er bestemt med ELISA. Figur 10 viser den konsentrasjonsavhengige inhibisjonen av nøytrofil migrasjon mot fMLP med renset CHIPS uttrykt som prosent av bufferbehandlede celler. Celler ble inkubert med ulike CHIPS-konsentrasjoner i 30 min ved romtemperatur og satt til den øvre delen av "transwell"-beholderen. Migrasjon mot 1 x IO"8 M fMLP ble bestemt etter 60 minutters inkubasjon ved 37 °C. Figur 11 er et representativt bilde av en SDS-PAGE som viser ferdig renset rekombinant CHIPS (rCHIPS) fremskaffet fra et £.coli-lysat etter affinitetskromatografi over en nikkelkolonne og kutting av histidinmarkøren med enterokinase. Figur 12 viser den konsentrasjonsavhengige inhibisjonen av rekombinant CHIPS (rCHIPS) på ekspresjonen av reseptoren for fMLP (FPR) og C5a (C5aR) på nøytrofiler. Figur 13 viser den konsentrasjonsavhengige reduksjonen av intracellulær fri kalsiumfrigjøring indusert av fMLP og C5a i nøytrofiler. Figur 14 viser den konsentrasjonsavhengige inhibisjonen av CHIPS-FITC binding med fullstendig rekombinant CHIPS og rekombinant mutant CHIPS<4>"<121>.

Tabell 1 oppgir inflammatoriske tilstander som kan bli be-handlet med (poly)peptidene og ikke-(poly)peptidene i oppfinnelsen; og

Tabell 2 viser bindingen i ELISA av flere selekterte kloner av monoklonale antistoffer avledet fra en mus immunisert med CHIPS. Bindingen er til renset CHIPS og de reagerende monoklonale museantistoffene detekteres med et HRPO-koblet anti-mus antistoff.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Rensing av CHIPS-protein fra S. aureus-supernatant

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

1.1 Isolering av proteinet

Staphylococcus aureus 1690 (et klinisk isolat, University Medical Center Utrecht (UMC Utrecht)) eller Staphylococcus aureus Newman (en gave fra Dr. Foster, Dublin) blir kultivert natten over i IMDM-medium (Gibco) og deretter fortynnet 1:40 i fersk IMDM for en 7 timers kultur ved 37 °C. Etter pelletering av bakteriene blir S. aureus-supernatanten (henvist til som SaS) høstet, filtrert gjennom et 0,2 (im filter og umiddelbart anvendt videre (Veldkamp et al., Inflammation 21, 541-551 (1997) . En mengde på 5 liter SaS blir ledet over tre kolonner (25 ml) koblet i tandem. Disse tre kolonnene er suksessivt en "Reactive Yellow" 861, ligandfarge kryssbundet 4% agarosekolonne (Sigma), en DNA Cellulose (Pharmacia) og en "Reactive Green" 19 ligandfarge kryssbundet 4% agarosekolonne (Sigma).

Etter vask med PBS blir den grønne (Reactive Green 19) kolonnen eluert med 2 M NaCl og de neste 50 ml, inneholdende CHIPS-aktivitet, blir slått sammen. PMSF (1 mM) til settes og eluatet dialyseres i PBS i 18 timer. Prøven kon-sentreres til et volum på ± 10 ml i en dialysebag senket i polyetylenglykol. Det konsentrerte materialet separeres på en Pharmacia Superdex-200 gelfiltreringskolonne, hvoretter de aktive fraksjonene (4 ml volumer) blir slått sammen, be-handlet med PMSF (1 mM) og dialysert i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 18 timer. De sammenslåtte aktive fraksjonene blir overført til en Mono Q-anionebyttekolonne (Pharmacia) som elueres med en gradient av 10 mM Tris-HCl buffer som vari-erer fra 0 til 1 M NaCl. Aktive fraksjoner (1 ml volumer) blir slått sammen og anvendt som den endelige fremstillingen av renset CHIPS. Proteininnhold blir bestemt med en Pierce Micro-BCA test, og CHIPS blir lagret ved -20 °C i små delmengder. Det siste isolerte materialet analyseres for renhet på en 12,5% SDS-PAGE (Mini-Protean II; BioRad) etter farging med Coomassie Blue. CHIPS-proteinet viser seg som et enkelt bånd med en molekylvekt omkring 17 kDa. Alle fraksjonene blir screenet for CHIPS-aktivitet, ved hjelp av dets evne til å inhibere binding av fluorescensmerket fMLP til isolerte nøytrofiler, som blir målt med væskestrømcyto-metri.

1.2 Binding av fMLP og C5a til granulocytter

Granulocytter isoleres fra heparinisert blod fra friske, frivillige personer ved hjelp av en Histopaque-Ficoll gradient i samsvar med den standardiserte fremgangsmåten (Troelstra et al., J. Leukocyte Biol. 61, 173-178 (1997)). De gjenværende erytrocyttene i granulocyttfraksjonen lyseres med sterilt vann (i 30 sek.) og vaskes etter gjenopp-rettelse av isotoniteten. Cellene blir til slutt resuspendert i RPMI (Gibco) med 0,05% humant serumalbumin (RPMI/HSA). 50 ul celler i Falcon-rør (5 x IO<6>celler/ml) inkuberes med 50 u.1 CHIPS-inneholdende materiale (SaS, renset CHIPS eller kolonnefraksjoner) i 30 min ved 37 °C. Cellene plasseres på is og vaskes én gang med RPMI/HSA (ved 4 °C) og resuspenderes i 50 jj.1 ferskt medium. 5 (J.1 BODIPY-merket fMLP (endelig konsentrasjon 0,1 u.M; Molecular Probes) eller FITC-merket C5a (endelig konsentrasjon 1 uM; rekombinant C5a fra Sigma, merket med FITC som beskrevet i eksempel 2.1 for CHIPS) blir deretter tilsatt og prøven inkuberes i 60 minutter på is. Etter vask analyseres den fluorescerende fMLP- eller C5a-bindingen til granulocyttene med et væskestrømcytometer (FACScan; Becton Dickinson). Den gjennomsnittlige fluorescensverdien for 5000 granulocytter blir beregnet med Lysis II-programmet.

RESULTATER

Figur 1 viser elueringsprofilen (OD280) til CHIPS-aktiviteten til eluatet fra Mono Q-kolonnen. Volumfraksjonene mellom 39 og 41 ml har den sterkeste CHIPS-aktiviteten. Figur 2 viser Coomassie Blue-farget SDS-PAGE av renset CHIPS etter det siste Mono Q-kromatografitrinnet.

EKSEMPEL 2

Spesifikk binding av CHIPS til nøytrofiler og monocytter

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

2.1 FITC-merking av renset CHIPS-protein

Renset CHIPS (500 ug/ml protein) inkuberes med 1/10 volum av 1 mg/ml FITC (fluorescein isothiocyanat, Isomer I; Sigma) i en 1 M natriumkarbonatbuffer pH 9,6 i 1 time ved romtemperatur. FITC-merket CHIPS separeres fra fri FITC ved å lede blandingen over en kolonne som fjerner salt (Pharmacia, Fast Desalting HR 10/10) og sanntidmonitorere eluatet for OD28oog fluorescens med et tilkoblet fluoro-meter (Perkin Eimer) . Fraksjoner med høy OD2soog fluorescens ble slått sammen og analysert for proteininnhold med Micro BCA-proteintesten (Pierce). CHIPS-FITC lagres i små delmengder ved -20 °C.

2.2 Binding av CHIPS-FITC til leukocytter.

Den spesifikke bindingen av CHIPS-FITC til leukocytter bestemmes med væskestrømcytometri. Rensede nøytrofiler og mononukleære celler (bestående av monocytter og lymfocytter) isoleres fra heparinisert blod fra friske, frivillige personer som beskrevet (Troelstra et al., Infect. Immun. 65: 2272-2277 (1997)). Isolerte celler blir blandet på nytt for å oppnå et celleforhold som etterligner situasjonen i blod. Humane røde blodceller fremskaffes ved å vaske en liten delmengde av helblod tre ganger med PBS. Konsentrasjonen av røde blodceller bestemmes fotospektrometrisk. 50 (il leukocytter eller røde blodceller (5 x IO<6>celler/ml) inkuberes i Falcon-rør med 5 (il CHIPS-FITC ved ulike konsentrasjoner i 30 min på is. Celler vaskes én gang med medium (RPMI inneholdende 0,05% HSA) og resuspenderes i 150 ul ferskt medium. Binding av CHIPS-FITC til leukocyttene måles med væskestrømcytometri (FACScan; Becton Dickinson). Assosiering med de ulike subpopulasjonene evalueres med se-lektiv elektronisk analysering av størrelse (forward scatter; FSC) og tetthet (sideward scatter; SSC) i Lysis II-programmet (BD). Den gjennomsnittlige fluorescensverdien på den selekterte cellepopulasjonen blir beregnet med programmet .

RESULTATER

Figur 3 viser den konsentrasjonsavhengige bindingen av CHIPS-FITC til de ulike leukocyttpopulasjonene. Det kan bli observert at CHIPS-FITC binder mest effektivt til nøytro-filer, etterfulgt av monocytter. CHIPS-FITC binder ikke til røde blodceller og marginalt til lymfocytter, men bare til en subpopulasjon. Binding av CHIPS-FITC til nøytrofiler er spesifikk, fordi tilsetning av et 10-fold overskudd av ikke-fluorescensmerket CHIPS fullstendig inhiberer asso-sieringen av CHIPS-FITC til cellene.

EKSEMPEL 3

Sekvens, kloning og ekspresjon av det CHIPS-kodende genet (chp) til Staphylococcus aureus

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

3.1 Bakteriestammer, plasmider og vekstbetingelser

Staphylococcus aureus Newman, RN4220 og COL er mye anvendte laboratoriestammer. S. aureus 1690 er en klinisk stamme isolert fra en pasient med bakteriemi (K. E. Veldkamp et al., Inflammation, 21:541-551 (1997)). Escherichia coli DH5a ble anvendt som en kloningsvert (F. M. Ausubel et

al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY. (1990)). Plasmid pRB474 er en overføringsvektor for E. coli og stafylokokker inneholdende vegiI-promoteren fra Bacillus subtilis som muliggjør ekspresjon av gener klonet inn i det multiple kloningssetet i pRB474. pRB474 er et derivat av pRB374 (R. Bruckner, Gene, 122:187-192 (1992)) der neomycinresistensgenet har blitt byttet ut med et kloramfenikolresistensgen. Alle stammer ble dyrket i BM-næringsmedium (1% trypton, 0,5% gjærek-strakt, 0,5% NaCl, 0,1% K2HPO„, 0,1% glukose) ved 37 °C med mindre noe annet er nevnt.

3.2 Sekvensanalyse

DNA ble sekvensert med syklussekvensering på en DNA-sekven-seringsmaskin 4000 L (LI-COR Inc., Lincoln, Neb., USA) ved å anvende Thermo Sequenase™ fluorescensmerket primersyklus-sekvenseringstestsett (Amersham, Little Chalfont, England). Egnede primere ble anvendt for å direkte sekvensere genomisk DNA som ble isolert i henhold til J. Mamur (J. Mol. Biol., 3:208-218 (1961)). Sekvenseringsfremgangsmåten har blitt kort beskrevet i Peschel et al. (J. Biol. Chem., 274:8405-8410 (1999)). For å utføre sekvenslikhetssøk, ble programmet BLAST 2.0 med den ikke-redundante proteindata- basen til NCBI (Bethesda, MD, USA) anvendt. Sekvenssammen-ligningene ble utført ved å anvende Higgins-Sharp algorit-men til programmet MacDNASIS Pro (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA, USA).

Tidligere ble de første 35 aminosyrene til CHIPS bestemt ved N-terminal sekvensering av det rensede proteinet. S. aureus DNA'et er veldig rikt på A og T nukleotider, mens G og C nukleotider er sjeldne (bare ca. 30% av de totale basene). For de fleste aminosyrene er derfor de mest A- og T-rike kodonene foretrukket. I henhold til denne regelen ble en primersekvens avledet fra aminosyrene 15-24 (GAAAAA-GAAAAAGCATATAAAGAA (SEKV ID NR:1)). Primeren ble anvendt for å sekvensere genomisk DNA direkte fra S. aureus Newman som gir en sekvens på flere hundre basepar. En ny primer ble avledet fra denne sekvensen for å sekvensere mot bindingssetet til den første primeren. Den kombinerte DNA-sekvensen inneholdt bindingssetet til den første primeren med to forskjeller (G i stedet for A i posisjon 3 og T i stedet for A i posisjon 15) (figur 4). Den kodet for en åpen leseramme på 450 bp som har en Shine Dalgarno-sekvens foran for initiering av translasjon (J. Shine og L. Dalgarno, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 71:1342-1346 (1974)) og etterfulgt av tre stoppkodoner. Genet ble kalt chp; det koder for et putativt protein på 149 aminosyrer med ingen likheter til noen av proteinene i databasene. De 28 N-terminale aminosyrene ser ut til å danne et signalpeptid for sekresjon tvers over den cytoplasmatiske membranen (3 posi-tivt ladede rester etterfulgt av en ikke-ladet region på 22 aminosyrer og et ALA-X-ALA konsensusmotiv for kutting med signalpeptidase 1; figur 5) (G. Von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)). Signalpeptidet er etterfulgt av en region som matcher de 35 N-terminale aminosyrene i CHIPS nesten perfekt. Det eneste unntaket er en serin i posisjon 33 i det avledede modne proteinet i stedet for en aspara-ginrest antatt ved N-terminal sekvensering. Det avledede modne proteinet har en størrelse på 121 aminosyrer og 14,1 kDa og et isoelektrisk punkt på 9,32. Det innfrir dermed alle kravene for CHIPS-proteinet. Ved å anvende de samme primerne ble chp-genet til S. aureus 1690 sekvensert. De to genene var nesten identiske med 5 avvik. På aminosyre-sekvensnivå var bare én posisjon ombyttet (figur 4 og 5).

3.3 Kloning og ekspresjon av chp-genet

chp-genet fra S. aureus Newman ble amplifisert med PCR ved å anvende primere hvis sekvens var modifisert for å introdusere restriksjonsseter som tillater kloningen av chp i ekspresjonsplasmidet pRB474. Det resulterende plasmidet pPr4-chp inneholdt den chp-kodende regionen 19 bp oppstrøms for startkodonet inneholdende Shine Dalgarno-sekvensen og 104 bp nedstrøms fra det første stoppkodonet. Fragmentet ble innsatt i den riktige retningen som tillater ekspresjon av genet med vegll-promoteren, og identiteten til fragmentet ble verifisert med sekvensanalyse. Plasmid pPr4-chp ble overført til den restriksjonsnegative stammen S. aureus RN4220 med elektroporering (J. Augustin og F. Gbtz, FEMS

Microbiol. Lett. 66:203-208 (1990)), isolert fra en positiv klon, og elektroporert inn i S. aureus COL (TIGR registreringsnr. 1280). Identiteten til plasmidet ble verifisert med restriksjonsfragmentanalyse og sekvensering av innsettet.

chp-genet var ikke del av den delvis tilgjengelige genom-sekvensen til S. aureus COL (TIGR registreringsnr. 1280). Ved hjelp av PCR-analyse ble det demonstrert at genet fak-tisk er fraværende i S. aureus COL, mens S. aureus Newman og 1690 var positive (figur 6). Videre var S. aureus COL negativ i CHIPS-aktivitetstesten (figur 7). chp-genet fra S. aureus Newman ble klonet i plasmid pPr4-chp, som mulig-gjør ekspresjon av klonede gener med en plasmid-kodet promoter. Transformasjon av S. aureus COL med plasmidet gjorde stammen positiv i CHIPS-testen (figur 7), som beviser at chp-genet koder for CHIPS-proteinet.

3.4 Deteksjon av chp-genet med PCR

Fraværet eller nærværet av chp-genet i ulike S. aureus-stammer ble bestemt med PCR ved å anvende grovekstrakter fra celler som en templatkilde. Én bakteriekoloni fra en fersk agarplate ble resuspendert i 1,5 ml saltvann, sedi-mentert og resuspendert i 100 j_tl av en lyseringsblandings-løsning inneholdende 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,1 mg lysostafin/ml og 0,1 mg akromopeptidase/ml. Prøver ble inkubert ved 37 °C i 30 min og deretter sentrifugert. Den klare supernatanten ble oppvarmet til 100 °C i 5 min og deretter fortynnet ved tilsetning av 400 ul TE-buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8). 1 ul av celleekstraktene ble satt til PCR-reaksjoner ved å anvende de chp-spesifikke primerne chp-5' (GAAAAAGAAATTAGCAACAACAG (SEKV ID NR:2)) og chp-3' (CATAAGATGATTTAGACTCTCC (SEKV ID NR:3)). Amplifisering ble utført med 35 sykluser sammensatt av 1 min ved 90 °C, 1 min ved 55 °C og 1 min ved 72 °C. Det resulterende PCR-produktet innbefattet 90,4% av chp-genet med start 2 bp nedstrøms for startkodonet og slutt 41 bp oppstrøms for det første stoppkodonet. PCR-produktene ble utsatt for aga-rosegelelektroforese. All sekvensering, PCR og rekombinante DNA-teknikker ble utført i henhold til standard fremgangsmåter (F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY. (1990)).

3.5 Test for CHIPS-aktivitet

S. aureus-stammer ble analysert for CHIPS-aktivitet i en test for binding av fluorescensmerket fMLP til humane nøy-trofiler. Stammer ble kultivert i IMDM-medium (Life Technologies, Paisley, England) i 24 timer og kultursuper-natanter ble dialysert og testet som beskrevet i eksempel 1.2.

RESULTATER

Figur 4 viser sekvensen til chp-genet fra S. aureus Newman. Shine Dalgarno-sekvensen (AGGAGA) og den chp åpne leseram-men (ORF) er understreket. Nukleotidene som koder for det

modne proteinet er indikert med en dobbel linje. Divergerende nukleotider i S. aureus 1690 sekvens er indikert over sekvensen.

Figur 5 viser aminosyresekvensen avledet fra S. aureus Newman chp-genet. Regionen som matcher de 35 N-terminale aminosyrene til CHIPS er understreket. Divergerende aminosyrer i S. aureus 1690 proteinet er indikert over sekvensen . Figur 6 viser deteksjonen av chp-genet i genomene til S. aureus-stammer. PCR-produkter fremskaffet med chp-spesifikke primere ble separert på en agarosegel. Spor 1 og 2, S. aureus Newman; spor 3 og 4, S. aureus COL; spor 5 og 6, S. aureus 1690. De følgende bakteriene ble funnet å være negative for nærvær av chp-genet som ble bestemt med PCR: Staphylococcus capitis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri og Escherichia coli. Figur 7 viser CHIPS-aktivitet i supernatantene til S. aureus-stammer. Ulike konsentrasjoner av kultursupernatant-er til S. aureus 1690 (firkanter), COL villtype (åpne sirkler) og COL med plasmid pPr4-chp (fylte sirkler) ble testet for inhibisjon av fMLP-binding til humane nøytro-filer. Bakgrunnsfluorescensen ble subtrahert og verdier er gitt som% av kontrollprøvene (inkubering uten kultursuper-natanter). Figur 8 viser fordelingen av chp-genet i genomene til ulike kliniske S. aureus-stammer. Bakterier er screenet ved hjelp av PCR med chp-spesifikke primere og evaluert for nærværet

av det spesifikke 400 bp båndet på en agarosegel. S. aureus-stammer er gruppert ved fokus på isolering fra pasi-entene. Lab = Laboratoriestammer; Andre = stammer fra andre kroppsvæsker; CAPD = kronisk ambulatoriske peritoneale dialysekulturer; Blod = blodkulturer; Sår = sårinfeksjoner; MRSA = multippel resistente S. aureus-stammer.

EKSEMPEL 4

Antistoffer som er spesifikke for CHIPS

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

4.1 Immunisering

Antistoffer som er spesifikke for CHIPS-protein kan bli fremstilt ved å anvende renset naturlig eller rekombinant

protein eller sekvensavledede syntetiske peptider som anti-gen. Både polyklonale og monoklonale antistoffer har blitt fremstilt ved å anvende standard teknikker (som beskrevet i Harlow og Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; og Erich et al.

(1989), J. Immunol. 143: 4053-4060). På grunnlag av de første 15 aminosyrene ble et syntetisk peptid fremstilt i samsvar med standard Fmoc-kjemi som beskrevet i De Haas et al., J. Immunol. 161:3607-3615. Peptidet ble koblet til "Keyhole Limpet Hemocyanin" i samsvar med produsentens in-struksjoner (Pierce) og immunisert subkutant med Freunds fullstendige adjuvans, etterfulgt av to boosterinjeksjoner med Freunds ufullstendige adjuvans.

Immunglobuliner fra seraene til immuniserte dyr eller hy-bridomcellekultursupernatanter isoleres med affinitetskromatografi ved å anvende kommersielle resiner inneholdende Protein A, protein G eller rekombinasjoner derav (Pharmacia).

4.2 ELISA

Antisera og rensede antistoffer (IgG) screenes for reakti-vitet med renset CHIPS-protein eller avledede syntetiske peptider med ELISA. Derfor blir antigenet overført til en mikrotiterplate (Nunc "Maxisorb") ved en konsentrasjon på 1 til 3 ug/ml i en 0,1 M karbonatbuffer pH 9,6 i løpet av 18 timer ved 4 °C. Etter vask blokkeres uokkupert plast med 4% BSA i PBS/Tween 20 (0,05 %) i 1 t ved 37 °C. Seriefortynninger av antistoffene lages i PBS/Tween inneholdende 2% BSA og inkuberes ilt ved 37 °C. Bundne antistoffer inkuberes med et 1/5000 fortynnet peroksidasemerket sekundært antistoff, enten geit anti-kanin IgG for polyklonale antistoffer eller geit anti-mus IgG for monoklonale antistoffer (begge fra Southern Biotechnology Associates, Inc.), ilt ved 37 °C. Reaksjoner utvikles med TMB som substrat, og den optiske tettheten (OD) avleses ved 450 nm.

RESULTATER

Figur 9 viser den spesifikke bindingen av polyklonalt IgG fra en kanin immunisert med et syntetisk peptid innbefattende de første 15 N-terminale aminosyrene til CHIPS (anti-CHIPS-peptid) . En høy OD450er vist for kanin anti-CHIPS-peptidet med peptidet (figur 9A) så vel som det rensede CHIPS-proteinet (figur 9B) bundet til brønnene. Effekten er konsentrasjonsavhengig og er allerede signifikant med en minimal konsentrasjon på 30 ng/ml IgG. En samling av nor-malt IgG fra ikke-immuniserte kaniner resulterer i noe bak-grunnsbinding, men bare ved høye antistoffkonsentrasjoner, spesielt når renset CHIPS er bundet til ELISA-platen.

Tabell 2 viser den spesifikke bindingen av selekterte hy-bridomkloner avledet fra mus immunisert med renset CHIPS-protein.

EKSEMPEL 5

Kjemotaksetest

CHIPS-aktiviteten til (poly)peptider og ikke-(poly)peptider i oppfinnelsen kan for eksempel bli bestemt med den følg-ende testen.

For å bestemme den målstyrte migrasjonen ble det for eksempel benyttet et "transwell"-system (Costar) bestående av en øvre del og en nedre del separert med en 3 um polykarbo-natmembran. Granulocyttene merkes med BCECF (2-karboksy-etyl-5-(og-6-) karboksyfluorescein; Molecular Probes), en fluorescerende markør som ankommer cytoplasmaet til cellene. Cellene (5 x IO<6>) inkuberes i 20 minutter ved 22 °C med 3 uM BCECF-AM (acetometylesteren til 2-karboksyetyl-5-(og-6-)-karboksyfluorescein), vaskes deretter tre ganger og resuspenderes til 5 x IO<6>celler/ml i RPMI/HSA. 100 ul celler og den ønskede mengden av CHIPS-proteinet introduseres i den øvre delen av "transwell"-systemet, og alt blandes i brønnene til en standard 24-brønners mikrotiterplate (Costar). Hver brønn inneholder 600 ul RPMI/HSA med eller uten tilsetning av kjemoattraktoren for testing. Kjemoattraktorene er: rekombinant C5a (Sigma), rekombinant inter-leukin-8 (Pepro Tech), blodplateaktiverende faktor-16 (PAF- 16; Calbiochem) eller fMLP (Sigma). Etter 60 minutters inkubering ved 37 °C løftes "transwell"-beholderen fra brønnene og mikrotiterplaten analyseres for fluorescens i en CyoFluorll (PerSeptiveBiosystems). Graden av fluorescens er et direkte mål for antallet granulocytter som har mi-grert gjennom membranen og er uttrykt som en prosent av fluorescensen til det tilsatte antallet celler.

RESULTATER

Figur 10 viser den konsentrasjonsavhengige inhibisjonen av nøytrofil migrasjon mot FLMP med renset CHIPS, uttrykt som prosent av bufferbehandlede kontrollceller.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av rekombinant polypeptid med CHIPS-aktivitet i E. coli

CHIPS ble produsert i E. coli og ble funnet å være like biologisk aktivt som det naturlig forekommende CHIPS fra S. aureus.

Fremstillingsmåten anvendt for produksjonen av rekombinant CHIPS kan også bli benyttet for andre poly(peptider) med CHIPS-aktivitet. Denne fremstillingsmåten er illustrert heri nedenfor.

DNA-sekvensen til CHIPS fra S. aureus klones inn i en egnet vektor som muliggjør effektiv ekspresjon av CHIPS i kompe-tente E. coli-vertsceller ved å anvende konvensjonelle molekylærbiologiske teknikker. Den anvendte strategien mu-liggjør ekspresjon av hele CHIPS-proteinet koblet til en fjernbar HIS-markør på N-terminalen i cytoplasma til E. coli. Trc-ekspresjonssystemet (pTrcHIS B-vektor; Invitrogen) ble anvendt som muliggjør ekspresjon av ikke-toksiske proteiner i E. coli. Dette systemet anvender trc-promoteren for regulert, høyt ekspresjonsnivå i enhver E. coli-stamme med en multikloningsvektor. Vektoren inneholder en N-terminal polyhistidin (6xHis) markør for hurtig rensing, en Xpress-epitope for enkel deteksjon med et anti-Xpress antistoff og et enterokinasekuttesete for fjerning av fusjonsmarkør.

S. aureus Newman kromosomalt DNA ble anvendt som templat for PCR-reaksjonen ved å benytte Pwo-DNA polymerase som resulterer i et rettendet PCR-produkt. Primerne som ble anvendt er CHIPS-TTT (som starter nøyaktig med den første aminosyren til CHIPS (F)) og CHIPS-TAA (inneholdende et stoppkodon og et EcoRI-sete).

PCR-produktet blir kuttet med EcoRI og pTrcHIS B-vektoren med BamHI. 5' overhenget fjernes med Sl-nuklease for å gjøre BamHI-setet rettendet nøyaktig der enterokinasen (EK) vil kutte proteinet. Deretter blir vektoren kuttet med EcoRI og ligert med det kuttede PCR-produktet.

For transformasjon av vektoren blir TOP-10 E. coli anvendt (Invitrogen) ved anvendelse av standard kalsiumpresipiter-ing (F. M. Ausubel et al., 1990, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY). Kloner screenes på ampicillininneholdende plater, og korrekt ligering av CHIPS-gen verifiseres ved sekvensering av det isolerte plasmidet (klon-29).

Etter ekspresjon av CHIPS-genet lyseres E. coli-bakteriene, og proteinblandingen overføres til en nikkelionaffinitets-kolonne (ProBond). Derfor initieres en kultur av klon29 i LB-medium + 50 ug/ml ampicillin med 1 mM IPTG i 4 t ved 37 °C. Bakterier sentrifugeres og pelleten resuspenderes i kald fosfatbuffer pH 7,8 og lagres ved -20 °C. For cellely-sering tilsettes det lysozym (100 ug/ml) i 15' på is, rør sonikeres, fryses i flytende N2og tines i et 37 °C vannbad. Denne syklusen med sonikering/frysing/tining repe-teres tre ganger.

Deretter tilsettes RNase og DNase (5 ug/ml) i 30' på is. Blandingen sentrifugeres ved 3000 g i 30' ved 4 °C og fil-treres gjennom et 0,45 um filter. Det endelige lysatet fortynnes 1:1 med kald fosfatbuffer pH 7,8 og kjøres gjennom en ladet nikkelkolonne (Invitrogen). Kolonnen vaskes med fosfatbuffer pH 7,8, med fosfatbuffer pH 6,0 og med fosfatbuffer pH 5,3. Bundet CHIPS elueres med 500 mM imidazol i pH 6,0 fosfatbuffer.

HIS-markøren fjernes ved enterokinasekutting etterfulgt av fjerning av proteasen med et EK-Away

enterokinaseaffinitetsresin. Derfor blir eluatet dialysert natten over i kald kuttebuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2og 0,1% Tween-20, pH 8,0), filtrert gjennom et 0,45 um filter og kuttet med 0,175 ul enterokinase/ml HIS/CHIPS-produkt. Denne mengden av enterokinase er batch-avhengig og resulterer i en delvis kutting for å unngå dannelsen av nedbrytningsprodukter. Det kuttede produktet dialyseres mot fosfatbuffer pH 7,8 og føres over en fersk nikkelkolonne

for å eliminere ukuttet His-merket CHIPS (HIS-CHIPS); gjen-nomkjøringsvæsken er rent rekombinant CHIPS (rCHIPS). Ukuttet HIS-CHIPS kan bli eluert igjen fra nikkelkolonne for en ny runde med kutting. Nikkelkolonnen vaskes til slutt med 50 mM EDTA, 0,5 M NaOH, vann, 5 mg/ml NiCl2, vann og lagres i 20% etanol.

Alle trinnene i isoleringen og kuttingen av HIS-CHIPS sjek-kes med SDS-PAGE på en 16,5% Tris-Tricin Ready-gel (BioRad). Prøver blir blandet 1:1 med prøvebuffer (200 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 40% glyserol, 0,04% Coomassie), kokt i 5 min og tilsatt gelen. HIS-markøren til det ut-trykte proteinet inneholder en X-press epitope som mulig-gjør deteksjon av HIS-CHIPS produktet med Western blot ved å anvende anti-X-press antistoffet (Invitrogen). I tillegg detekteres CHIPS spesifikt med det polyklonale kanin anti-CHIPS peptidantistoffet. Proteiner overføres til en nitro-cellulosemembran, membranen blokkeres med 4% gelatin i PBS, og antistoffproben og det passende sekundære peroksi- dasemerkede konjugatet (Harlow & Lane, 1988, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory) tilsettes deretter.

Den konsentrasjonsavhengige inhibisjonen av rekombinant CHIPS (rCHIPS) på ekspresjonen av reseptoren for fMLP (FPR) og C5a (C5aR) på nøytrofiler ble demonstrert som følger. Celler ble inkubert med ulike rCHIPS-konsentrasjoner i 15 min ved romtemperatur, plassert på is og deretter tilsatt enten BODIPY-merket fMLP (se eksempel 1.2) eller et monoklonalt antistoff rettet mot C5aR (klon 5 S/l, SeroTec) i kombinasjon med et sekundært FITC-merket geit-anti-mus lg (DAKO, 1:30). Til slutt ble cellene vasket og analysert for reseptorekspresjon i en FACScan ved å måle fluorescensen til 5000 nøytrofiler. Reseptorekspresjon sammenlignes med bufferbehandlede celler og uttrykkes som en relativ verdi.

Den konsentrasjonsavhengige reduksjonen av intracellulær fri kalsiumfrigjøring indusert av fMLP og C5a i nøytrofiler ble testet som følger. Celler ble mettet med en kalsiumspe-sifikk intracellulær probe (Fluo-3, acetoksymetyl (AM) ester; Molecular Probes) og inkubert med ulike rCHIPS-konsentrasjoner i 15 min ved romtemperatur. Den opprinnelige fluorescensverdien fra hver prøve ble bestemt i FACScan ved å måle 2000 celler. Deretter ble stimulus tilsatt (IO-9 M fMLP eller 10~<10>M rC5a), og fluorescensintensiteten fra den samme prøven ble bestemt nøyaktig 15 sekunder etter administrering av stimulusen (det optimale tidspunktet for begge agonistene). Trigging av nøytrofiler med fMLP eller C5a initierer en rask og forbigående økning i fri intracellulær kalsiumkonsentrasjon som blir målt med en økning i Fluo-3 fluorescenssignal. Den opprinnelige basale fluorescensverdien ble subtrahert fra hver aktiverte prøve. Resultater er uttrykt som en prosent av bufferbehandlede celler stimulert med enten fMLP eller C5a.

RESULTATER

Figur 11 er et representativt bilde av en SDS-PAGE som viser ferdig renset rekombinant CHIPS (RCHIPS). De to

flankerende sporene (1 og 3) viser det fullstendige rekombinante produktet som er kodet for av vektoren som genere-rer CHIPS-proteinet med en ekstra histidinmarkør og enterokinasekuttesete. Denne koder for et protein med en molekylvekt på 21 kDa, mens renset enterokinasebehandlet CHIPS har en molekylvekt på 17 kDa, som tilsvarer det som er vist for naturlig renset CHIPS fra S. aureus (se eksempel 1.1 og figur 2). Renset rCHIPS blekarakterisertmed MALDITOF MS og viste en molekylmasse på 14,12250, som er svært komparabelt med den antatte molekylmassen på 14,12217 basert på CHIPS-sekvensen.

Figur 12 og 13 illustrerer den biologiske effektiviteten.

EKSEMPEL 7

Fremstilling av et syntetisk CHIPS-protein

Det ble demonstrert i henhold til oppfinnelsen at det er mulig å fremstille et syntetisk polypeptid som har den nøyaktig samme aktiviteten som naturlig og som rekombinant CHIPS. Fremstillingsprosessen er som følger: Syntese av FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRN-YLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLNTPLAEDRKNVELLGKMYKTYFFKKGESKS SYVINGPGKTNEYAY peptid med TGT-resin som har 9-fluorenylme-tyloksykarbonyl-og 0 t-but beskyttet tyrosin [Fmoc Tyr (t-but)] festet dertil (5 g, 0,3 mmol, NovaBiochem) ble over-ført til peptidsyntesemaskin, og en løsning av piperidin (12 ml) i dimetylformamid (DMF; 18 ml) ble satt til resinet. Løsningen ble rørt i 1 time, og resinet vasket med DMF (3 x 30 ml) etterfulgt av diklormetan (DCM; 3 x 30 ml) og fikk tørke under vakuum i 5 minutter. Resten av aminosyrene ble deretter satt sammen ved å benytte standard Fmoc-kjemi. Kutting av proteinet ble oppnådd ved å behandle proteinre-sinet med en løsning av trifluoreddiksyre/ tetraisopropyl-silan/H20 [90:8:2 v/v/v] i 2,5 time. Grovproduktet (2,1 gms) ble isolert med eterpresipitering etterfulgt av rensing ved å anvende høytrykksvæskekromatografi. Det rensede produktet blekarakterisertmed MALDI MS.

Referanser som beskriver lignende fremgangsmåter er:

E Bayer et al., i: Peptides, Chemistry, Structure and Biology. Proceedings of the 13th American Peptide symposium. RS Hodeges og JA Smith (red.) ESCOM, Leiden,

(1994) s. 156.

G Grubler et al., i: Innovation and perspectives in Solid Phase Synthesis 3rd International Symposium. RE Pron (red) Mayflower Worldwide, Birmingham (1994) s. 517.

EKSEMPEL 8

Konkurranse for CHIPS-binding til dets putative reseptor

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

8.1 Fremstilling av rekombinant CHIPS4"121

Når flere E. coli-kolonier inneholdende plasmidet med rekombinant CHIPS ble analysert for korrekt innsetning av chp-genet med sekvensering, ble flere ufullstendige innset-ninger funnet. Én av dem som inneholder den fullstendige HIS-markøren, enterokinasekuttesetet og CHIPS-proteinet minus de tre første aminosyrene (CHIPS<4>"<121>; klon 19) ble eks-pandert videre og renset som beskrevet for fullstendig CHIPS (se eksempel 6).

8.2 Konkurranse med CHIPS-FITC binding

5 ul seriefortynninger av rekombinant CHIPS eller CHIPS<4>"<121>ble fremstilt og blandet med 5 (il CHIPS-FITC (10 ug/ml; se eksempel 2) i Falcon-rør. Deretter ble 50 ul isolerte nøy-trofiler tilsatt ved 5 x IO<6>celler/ml og inkubert i 30 min på is. Celler ble vasket og analysert for CHIPS-FITC binding med væskestrømcytometri som beskrevet i eksempel 2.

RESULTATER

Figur 14 viser den konsentrasjonsavhengige inhibisjonen av CHIPS-FITC binding med både fullstendig rekombinant CHIPS så vel som rekombinant mutant CHIPS<4>"<121>. Begge fremstill-ingene har et lignende inhibisjonsmønster med like effektive konsentrasjoner.

Claims

1. Isolert nukleinsyremolekyl innbefattende en nukleotidsekvens som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, der nevnte nukleotidsekvens korresponderer til en sekvens som er selektert fra gruppen bestående av: a) en nukleotidsekvens innbefattende minst en del av sekvensen som er vist i figur 4 (SEKV ID NR:4); b) nukleotidsekvenser som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet og som har aminosyresekvensen vist i figur 5 (SEKV ID NR:5); c) nukleotidsekvenser som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet og som har minst én del av aminosyresekvensen vist i figur 5 (SEKV ID NR:5); d) nukleotidsekvenser som er minst 40% identiske med en hvilken som helst av nukleotidsekvensene a), b) eller c) ; e) nukleotidsekvenser som hybridiserer ved stringente betingelser med en hvilken som helst av nukleotidsekvensene a), b), c) eller d), og f) nukleotidsekvenser som er komplementære til enhver av nukleotidsekvensene a), b), c), d) eller e).

2. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i krav 1, der delen av nukleotidsekvensen som er definert i krav 1 under a) korresponderer til nukleotidene 1 til 490 i figur 4 (SEKV ID NR:4).

3. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i krav 1 eller 2, der delen av nukleotidsekvensen som er definert i krav 1 under a) korresponderer til nukleotidene 41 til 490 i figur 4 (SEKV ID NR:4).

4. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i krav 1, 2 eller 3, der delen av nukleotidsekvensen som er definert i krav 1 under a) korresponderer til nukleotidene 125 til 490 i figur 4 (SEKV ID NR:4).

5. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-4, der nukleotidsekvensen som er definert i krav 1 under d) er minst 50 %, fortrinnsvis minst 60 %, mer foretrukket minst 70 %, enda mer foretrukket minst 80 %, mest foretrukket minst 90% identisk med en hvilken som helst av nukleotidsekvensene a), b) eller c).

6. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-5, der de stringente betingelsene ble benyttet ved hybridiser-ing natten over ved 42 °C i 5xSSC og vask ved 65 °C i 0,lxSSC.

7. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-6, der den minst ene delen av aminosyresekvensen som er definert i krav 1 under c) alene eller med andre deler av aminosyresekvensen utgjør regionen(e) i (poly)peptidet med CHIPS-aktivitet som fører til biologisk aktivitet.

8. Isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-7, der nukleinsyren er DNA, RNA eller cDNA.

9. Rekombinant vektor innbefattende minst ett isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8.

10. Fremgangsmåte for å fremstille en rekombinant vektor innbefattende innsetning av minst ett isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8 i en vektor.

11. Bakteriofag innbefattende minst ett isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8.

12. Rekombinant vert innbefattende minst ett isolert nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8, en vektor som er krevd i krav 9 eller en bakteriofag som er krevd i krav 11.

13. Rekombinant vert som er krevd i krav 12, der verten er selektert fra gruppen bestående av prokaryoter, protister, sopp, dyr eller planter.

14. Rekombinant vert som er krevd i krav 12 eller 13, der verten er selektert fra gruppen bestående av bakteriene Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, gjærene Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Candida, insektceller fra Drosophila-systemet og Baculovirus-systemet, pattedyrcellene COS-celler fra ape, hamster CHO, hamster BHK-celler, human 293, human 3T3, human HeLa, human U937, humane Jurkat-celler og L-celler fra mus.

15. Fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, innbefattende å dyrke en rekombinant vert i kravene 12-14 under betingelser slik at nevnte (poly)peptid blir uttrykt og isolere nevnte (poly)peptid.

16. Fremgangsmåte som er krevd i krav 15, der verten er en Escherichia coli-celle.

17. Fremgangsmåte som er krevd i krav 15, der verten er en Staphylococcus aureus-celle.

18. Fremgangsmåte som er krevd i krav 17, der Staphylococcus aureus-cellen er fra en stamme som allerede produserer et endogent protein med CHIPS-aktivitet (CHIPS).

19. Fremgangsmåte for å fremstille et syntetisk (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, innbefattende å avlede aminosyresekvensen kodet av et nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8 og produsere et (poly)peptid syntetisk med den nevnte aminosyresekvensen.

20. (Poly)peptid med CHIPS-aktivitet som kan fremskaffes med en hvilken som helst av fremgangsmåtene krevd i kravene 15-19.

21. (Poly)peptid som er krevd i krav 20 for anvendelse i diagnose, profylakse eller terapi.

22. (Poly)peptid som er krevd i krav 20 eller 21 for anvendelse i behandlingen av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infeksjon.

23. (Poly)peptid som er krevd i krav 20 eller 21 for anvendelse i behandlingen av akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk sjokk, traumatisk hjerneskade, alvorlige infeksjoner, myokardinfarkt, slag, karkirurgi, ulcerøs kolitt, Crohns sykdom, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), reumatoid artritt, dermatose, multippel sklerose, Alzheimers sykdom, arteriosklerose, repetitiv belastningsskade (RSI), akutt transplantatrejeksjon, forbrenninger, akutt reaktiv artritt, pankreatitt, vaskulitt, glomerulonefritt, gikt, forfrysning og hjernehinnebetennelse.

24. Anvendelse av (poly)peptidet som er krevd i krav 20 for produksjonen av en terapeutisk fremstilling for diagnose, profylakse eller terapi.

25. Anvendelse som er krevd i krav 24 for behandlingen av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infek-s jon.

26. Anvendelse som er krevd i krav 24 eller 25 for behandlingen av akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk sjokk, traumatisk hjerneskade, alvorlige infeksjoner, myokardinfarkt, slag, karkirurgi, ulcerøs kolitt, Crohns sykdom, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), reumatoid artritt, dermatose, multippel sklerose, Alzheimers sykdom, arteriosklerose, repetitiv belastningsskade (RSI), akutt transplantatrejeksjon, forbrenninger, akutt reaktiv artritt, pankreatitt, vaskulitt, glomerulonefritt, gikt, forfrysning og hjernehinnebetennelse.

27. Terapeutisk sammensetning innbefattende et egnet hjelpestoff og (poly)peptidet som er krevd i krav 20.

28. Sammensetning som er krevd i krav 27 for behandling av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infeksjon.

29. Sammensetning som er krevd i krav 27 for behandling av akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk sjokk, alvorlige infeksjoner, myokardinfarkt, slag, karkirurgi, ulcerøs kolitt, Crohns sykdom, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), reumatoid artritt, dermatose, multippel sklerose, Alzheimers sykdom, arteriosklerose, repetitiv belastningsskade (RSI), akutt transplantatrejeksjon, forbrenninger, akutt reaktiv artritt, pankreatitt, vaskulitt, glomerulonefritt, gikt, forfrysning og hjernehinnebetennelse.

30. Antistoff eller biologisk aktivt fragment derav rettet spesifikt mot (poly)peptidet som er krevd i krav 20.

31. Antistoff eller biologisk aktivt fragment derav som er krevd i krav 30 for anvendelse i diagnose, profylakse eller terapi.

32. Antistoff eller biologisk aktivt fragment derav som er krevd i krav 30 eller 31 for anvendelse i behandlingen av stafylokokkinfeksjon.

33. Anvendelse av et antistoff som er krevd i krav 30 for produksjonen av en terapeutisk fremstilling for diagnose, profylakse eller terapi.

34. CHIPS-basert, CHIPS-reseptorblokkerende molekyl karakterisert ved dets evne til å konkurrere med CHIPS i en CHIPS-bindingstest som er beskrevet i eksempel 8.

35. CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler som er krevd i krav 34 for anvendelse i diagnose, profylakse eller terapi.

36. CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler som er krevd i krav 34 eller 35 for anvendelse i behandlingen av stafylokokkinfeksjon.

37. Anvendelse av CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler som er krevd i krav 34 for produksjonen av en terapeutisk fremstilling for diagnose, profylakse eller terapi.

38. Anvendelse som er krevd i krav 33 eller 37 for behandlingen av stafylokokkinfeksjon.

39. Terapeutisk sammensetning innbefattende et egnet hjelpestoff og ett eller flere antistoffer som er krevd i krav 30 og/eller biologisk aktive fragmenter derav og/eller ett eller flere CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler som er krevd i krav 34.

40. Isolert nukleinsyremolekyl for anvendelse i genterapi.

41. Fremgangsmåte for behandling av et individ som lider av inflammasjon og AIDS ved å administrere en terapeutisk effektiv mengde av et (poly)peptid som er krevd i krav 20.

42. Fremgangsmåte for genterapeutisk behandling av et individ som lider av inflammasjon og AIDS ved å administrere en terapeutisk effektiv mengde av et nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8.

43. Fremgangsmåte for å behandle et individ som lider av stafylokokkinfeksjon ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff og/eller biologisk aktivt fragment derav som er krevd i krav 30 og/eller ett eller flere CHIPS-baserte, CHIPS-reseptorblokkerende molekyler som er krevd i krav 34.

44. Fremgangsmåte for å isolere et gen som koder for et protein med CHIPS-aktivitet fra en organisme, som innbefatter å screene et genomisk eller cDNA-bibliotek til denne organismen med en probe basert på nukleinsyremolekylet som er krevd i kravene 1-8, isolere de positive klonene og teste om de positive klonene har CHIPS-aktivitet.

45. Fremgangsmåte for å identifisere nukleinsyresekvenser som koder for et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, innbefattende sammenligning av sekvensen som er vist i figur 4 (SEKV ID NR:4) med nukleinsyresekvensinformasjonen i en database.

46. Fremgangsmåte for å identifisere aminosyresekvenser til et (poly)peptid med CHIPS-aktivitet, innbefattende sammenligning av sekvensen som er vist i figur 5 (SEKV ID NR:5) med nukleinsyresekvensinformasjonen i en database.

47. Mikroorganisme som har et nukleinsyremolekyl som er krevd i kravene 1-8 for anvendelse som et legemiddel for behandlingen av akutte og kroniske inflammasjonsreaksjoner og hiv-infeksjon.

48. Mikroorganisme som er krevd i krav 47 for behandling av akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk sjokk, alvorlige infeksjoner, myokardinfarkt, slag, karkirurgi, ulcerøs kolitt, Crohns sykdom, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), reumatoid artritt, dermatose, multippel sklerose, Alzheimers sykdom, arteriosklerose, repetitiv belastningsskade (RSI), akutt transplantatrejeksjon, forbrenninger, akutt reaktiv artritt, pankreatitt, vaskulitt, glomerulonefritt, gikt, forfrysning og hjernehinnebetennelse.

49. Fremgangsmåte for å fremstille (poly)peptid(er) med CHIPS-aktivitet, innbefattende å dyrke villtype, ikke-re kombinante Staphylococcus- stammer som produserer endogent kjemotakseinhibitorisk (poly)peptid(er) og isolere dette.

50. (Poly)peptid med en aminosyresekvens som er minst 40% homolog med aminosyresekvensen vist i figur 5 (SEKV ID NR:5) og som har CHIPS-aktivitet.

51. (Poly)peptider med en aminosyresekvens som er identisk med én eller flere deler av aminosyresekvensen vist i figur 5 (SEKV ID NR:5) og som har CHIPS-aktivitet.

52. (Poly)peptider som er krevd i krav 50 og 51 for anvendelse i identifiseringen av konkurrenter for CHIPS-binding .

53. Diagnostisk test for anvendelse i diagnostisering av pasienter infisert med Staphylococcus aureus for nærvær av CHIPS-genet i infiserende S. aureus, der testen er en PCR-test hvor primerne er designet på grunnlag av nukleotidsekvensen vist i figur 4 (SEKV ID NR:4).