KR20020073496A - 칩스 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 - Google Patents
칩스 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드 암호화 핵산, 이와 같은 분자들이 잠복된 재조합 백터 및 상기 벡터를 운반하는 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CHIPS 활성을 갖는 재조합 (폴리)펩티드의 제조방법과 이와 같은 CHIPS 활성을 갖는 재조합 (폴리)펩티드를 염증반응과 HIV의 치료와 같은, 진단, 예방 및 치료에 사용하는 것에 관한 것이다. 그 밖에 본 발명은 활성 성분으로서 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드로 이루어진 치료 및 진단 조성물을 제공한다.
Description
백혈구는 주로 외부 침입자들(예를 들면, 박테리아, 바이러스, 진균류, 및 암세포들)에 대해 신체를 방어하는데 포함된다. 가장 중요한 세포들은 임파구, 단핵세포 및 호중구이다. 임파구들은 특이 면역 시스템을 형성하며 침입자에 대한 면역 반응을 일으킨다. 그들의 가장 중요한 일은 침입자에 대한 특이 기억을 형성하여, 다음에 그 침입자가 신체에 들어왔을 때, 침입자를 신속히 인식하고, 죽이고 제거하는 것이다. 때때로 이들 임파구들은 침입자를 공격할 뿐만 아니라, 자기 신체의 어떤한 구조들 및/또는 분자들(소위 자가-항원)에 대해 반응하여, 자가-면역질환을 일으킨다(예를 들면, 류마티스성 관절염). 침입자를 죽이고 제거하는 것은 주로 선천성 면역 시스템의 세포들인 단핵세포와 호중구에 의해, 침입자를 직접 인식하거나 또는 특정 임파구의 도움에 의해 행해진다.
임파구의 세밀히 조정되고 조절된 반응의 섬세한 네트워크와 대조적으로, 선천성 시스템의 세포들은 비교적 비-특이적 및 공격적 방법으로 작용한다. 그들은 신체 방어의 일차 라인의 일부이므로, 그들의 가장 중요한 일은 침입 약제를 가능한 한 빨리 죽이고 제거하는 것이다. 이것은 침입자에게 치명적일 뿐만 아니라 근처의 숙주세포에게도 손상을 일으키는 매우 공격적인 물질(예를 들면, 자유 라디칼과 효소들)을 통해 성취된다. 이들 손상 세포로부터의 물질들과 선천성 시스템 자체로부터 국부적으로 활성화된 세포들은 호중구들과 단핵세포들의 수를 증가시켜 국부 염증을 일으킨다. 대부분의 경우, 과활성화된 호중구에 의해 야기되는 이와 같은 공격적이고 손상된 염증성 반응은 불필요하다. 몇몇 경우에, 상기 염증성 반응은 심각한, 때때로 치명적인 질병을 일으키며, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 심장마비 및 뇌졸증과 같은 혈전증 사상이 따르는 심각한 조직 손상, 염증성 장질환 및 류마티스성 관절염과 같은 병태를 포함한다. 염증은 일단 모든 침입자들이 죽고, 과정중 죽은 여러 세포들과 함께 제거되면 가라 않을 것이다. 그 다음, 염증성 반응에 의한 상처가 회복되기 시작할 수 있다. 비록 몇몇 작용이 겹쳐질 수 있으나, 호중구의 주된 일은 침입자들을 공격하는 것이며, 단핵세포의 주된 일은 상기 공격으로 생긴 부스러기를 제거하는 것이다. 그 밖에, 호중구들은 상처회복과정을 돕는 또 다른 평화로운 일을 한다.
박테리아가 신체를 공격하고, 예를 들면 (수막염에서와 같이)중앙 신경계를 감염시키면, 그들은 포밀화 폴리펩티드(fMLP 펩티드 등)를 포함하여, 미생물 물질을 생산하기 시작한다. 미생물 기원의 다른 물질들은 보조인자 5(C5) 전환효소-복합체를 활성화시키며, 이것은 보조 시스템의 C5를 그의 활성화된 C5a 형태로 전환시킨다. C5a와 fMLP 모두 화학-유인물질이며: 혈관으로부터 세포를 활성화시키고 공격할 수 있는 물질이다(이동 과정). 호중구들은 이들 두 물질들에 잘 반응하며 또한, 인터로킨-8(IL-8)에도 잘 반응한다. 이 "케모킨(chemokine)"(이 명칭은 면역계의 세포들로부터 생산되는 화학-유인물질(chemo-attractants)로부터 제공되었다)은 활성화된 단핵세포들에 의해 주로(그러나 또한 활성화된 호중구 자체에 의해서도 미세량) 생산된다. 호중구들은 이들의 세포막의 외부에 상기 물질의 수용체를 갖기 때문에 이들 물질들과 상호작용한다.
활성화된 호중구들은 혈관으로부터 쉽게 이동한다. 이것은 화학-유인물질, 미생물 생성물 및 활성화된 단핵세포로부터의 물질들이 혈관의 투과성을 증가시키고 혈관벽의 내피세포가 특정 부착분자를 발현하도록 자극될 것이기 때문이다. 호중구들은 이들 부착분자들에 결합하는 셀렉틴(selectin)과 인테그린(integrin)(예를 들면, CD11b/CD18)을 발현한다. 일단 호중구가 내피세포에 결합되면, 화학-유인물질/케모킨의 안내 하에, 세포를 통해 이들 물질들의 농도가 가장 높은, 감염부위로 이동할 수 있다. 이들 물질들은 또한 호중구를 활성화시켜 일련의 다른 분자들을 생성하며, 이들 중 몇몇은 더 많은 호중구들(및 연속적으로 단핵세포들)을 공격하지만, 거의 그들은 침입 박테리아들을 파괴시키는데 책임이 있다. 이들 물질들(예를 들면, 자유 라디칼, 단백질 및 세포막을 분해하는 효소들(프로테아제 및 리파아제)중 몇몇은 매우 반응성이며 비-특이적으로 주변 조직(및 호중구 자신들)의 세포들을 파괴시켜 조직을 손상시킨다. 이와 같은 손상은 약한 혈관벽을 벗어나는 유체를 유도하는 혈액의 존재에 의해 악화되며 항상 염증을 수반하는 팽윤(부종)을 일으킨다. 상기 과량의 유체에 의해 야기된 압력의 생성은 추가의 세포 손상과 죽음을 가져온다.
염증 진행 후, 단핵세포들은 염증 현장으로 이동하여 활성화된다. 박테리아와 세포 부스러기들을 제거하는 그들의 역할 이외에, 그들은 또한 종양괴사인자 (TNF) 및 IL-8과 같은 물질을 생성하며, 이들은 반대로 더 활성화된 호중구들을 공격하여 추가의 국부적 손상을 야기한다. TNF 역시 호중구에 대한 직접 자극 효과를 갖는다. 일단 모든 침입자들이 제거되면, 염증성 반응은 가라앉고 그 영역에서는 남은 '사상자'들이 제거될 것이다. 그 다음, 상처회복 과정이 시작된다. 비록 호중구들이 상처 회복에 있어서 중추적인 역할을 하는 것이 알려져 있으나, 어떠한 호중구-유도 물질이 포함되며 어떻게 호중구가 주변 조직을 공격하지 않고 회복에 작용하는가는 명백하지 않다. 일반적으로, 손상된 조직은 주로 섬유아세포와 콜라겐으로 형성된 반흔조직으로 대체될 것이다. 심장 근육 세포, 뇌세포 또는 폐포 세포로부터 형성된 조직등의 중요 기능을 갖는 신체 영역에 염증이 발생하면, 정상 기능은 심장마비, 중풍 및 기종 등의 심각한 병태를 야기하는 생성된 반흔 형성에 의해 타협될 것이다. 이와 같은 병태의 약화된 결과를 최소화하기 위해, 염증성 반응을 가능한 한 빨리 약하게 하는 것이 중요하다.
급성 초기상 감염 반응을 조절하기 위한 중재는 다양한 환자들에 대하여 증상으로 이와 같은 사상의 유래를 확인할 수 있는 진단을 개선시킬 수 있는 기회를 제공한다. 이와 같은 접근은 여러 급성 및 만성 염증에 근거하는 질환에 대해 지지되고 있고 관련된 질병 모델로부터의 발견을 기초로 하는 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다. 스테로이드와 비스테로이드 항-염증성 약제(NSAIDS)와 같은 전통적인 항-염증성 약제들은 효율 또는 안정성의 면에서 작용의 이상적인 프로필을 갖지 않는다. 스테로이드는 '잘못된' 세포형(단핵세포)에 영향을 미치고 그들의 약화된 효능은 쉽게 무시된다. NSAIDS는 염증 반응의 마지막 단계에서 중재하기 때문에 일반적으로 얼마간 비교적 약한 효과를 나타낸다. 약제의 두 종류 모두 그들의 약제학적 활성의 다른 면에 기인하는 바람직하지 않은 부작용을 낳는다. 직접적으로 작용하며 특히 호중구의 이동 및 활성을 막기 위한 약제들은 많은 이점을 가질 수 있다. 초기 전개하의 여러 약제들은 호중구 활성(예를 들면, C5 전환효소 억제제, C5a에 대한 항체, C5a-수용체 블로킹 약제) 및 이동(호중구에서 인테그린 (CD11b/CD18)과 L-셀렉틴에 대한 항체 및 내피세포에서 부착분자(ICAM-1과 E-셀렉틴)에 대한 항체)의 하나의 개별적인 면과 상충된다. TNF와 IL-8에 대한 항체는 만성 염증에 효과를 갖지만, 급성기에서 단핵세포는 최소의 역할만을 하기 때문에, 급성 염증에는 오직 최저의 효과만을 갖는다.
때때로, 급성 염증의 원인을 제거할 수 없고 염증은 만성이 된다. 결핵, 만성 위염 및 특정의 다른 병태를 제외하고는, 감염증세가 거의 없다. 그러나, 만성 염증은 또한 자가면역반응과 같이, 박테리아 이외의 자극물에 의해 야기된다. 연구결과는 만성 염증에 있어서 단핵세포들의 역할은 훨씬 더 중요하며 호중구 이동 및 활성, 단핵세포 이동 및 활성, 조직손상, 사멸세포의 제거 및 상처회복은 같은 시간에 진행된다는 것을 나타낸다. 세포와 여러가지 다양한 시토킨 및 케모킨과의 상호작용의 복합 케스케이드는 여러해 동안 집중적인 연구의 주제가 되어왔다. 단핵세포들과 그들의 생성물은 만성 염증을 약화시키기 위해 억제되어야 하는 매우 중요한 요소들이라고 믿어진다. 이것은 스테로이드, 특히 단핵세포와 상호작용하는 스테로이드가 일반적으로 급성 염증과 대조적으로 만성 염증에 더 효과적인 이유를 설명한다. 그러나 장기간의 스테로이드 치료는 바람직한 선택이 아니며, 이것은 임상효과를 얻기 위해 요구되는 투여량에서 심각하고 허용할 수 없는 부작용이 일어날 수 있기 때문이다. TNF 또는 IL-8에 대한 항체를 이용한 새로운 치료는 양호한 결과를 나타내며 호중구의 주요 역할이 만성 염증에서 작용하는 것이라는 생각의 증거로 나타났다. 최근의 연구는 염증에서의 단핵세포들의 배타적인 역할에 의심을 던지며 호중구의 결정적인 역할을 지적하며, 이것은 치료학적 간섭을 위한 더 나은 표적을 나타내는 것으로 보여진다. 만성 염증성 병태의 근본적인 원인이 언제나 명백하지는 않으며, 초기 원인이 장래의 재발에 항상 책임이 있는 것이 아니다. 몇몇 과학자들은 특정 만성 염증성 질병에서 사상의 연속적인 주기가 있다고 믿는다. 그들의 아이디어는 존재하는 활성화된 호중구와 단핵세포들이 연속적으로 세포의 새로운 군을 공격하고 활성화시켜 초기 자극물이 더 이상 존재하지 않는 때에도 염증성 반응을 영속시킨다는 것이다. 이것은 호중구와 단핵세포 활성의 효과적인 억제제를 이용한 급성 또는 정기적인 치료가 새로운 세포 보충의 순환을 막고, 이것은단순한 증상의 완화가 아니라 질병의 진행을 완화시키거나 또는 완전히 치료함을 제안한다.
본 발명을 이끌어낸 연구에서, 염증-억제 특성을 갖는 새로운 약제가 성장Staphylococcus aureus(S. aureus)의 세포외 배지에서 발견되었다. 이 약제는 co-pending 출원 PCT/NL99/00442의 발명의 대상이다. 상기 약제는 다른 케모킨 수용체에 직접 또는 간접적으로 결합되는 능력이 있음이 발견되었다. 매질에서 다양한 세포들을 등온 배양함으로써 많은 케모킨 수용체의 발현, 과립구에 대한 fMLP와 C5a와 같은 종래의 주화성제(chemotactic agent)의 수용체의 발현과 임파구, 단핵세포 및 대식세포에 대한 CXCR4 및 CCR5 수용체의 발현 모두가 크게 약화된다. 약화된 수용체 발현은 HIV에 의한 약화된 감염 뿐만 아니라, 케모킨과 비교하여 크게 약화된 케모탁시스(chemotaxis)와 관련있다.
단백질의 활성은 성장S.aureus의 배양 상징액에서 이미 증명되었다. 활성 단백질은 예를 들면 다수의 리간드 염료 칼럼에 의해 더 정제될 수 있다. 예비-정화는 우선 소위 "황색 칼럼"("반응성 황색 86" 리간드 염료 가교된 4% 기포가 있는 아가로스 칼럼(시그마))에서 실시되었고, 그 다음 흡수 크로마토그래피 칼럼(소위 "녹색 칼럼" ("반응성 녹색 19" 리간드 염료 가교된 4% 기포가 있는 아가로스 칼럼(시그마))과 DNA 칼럼에서 실시되었다. 나중의 두 칼럼은 뒤바꿀 수 있다. DNA 칼럼은 단백질과 동일한 분자량의 오염물을 제거한다. 흡수 크로마토그래피 칼럼은 단백질을 농축시키며 단백질에 대해 선택적이다. 최종적으로, 후-정제 역시 겔-여과 및 음이온 교환 크로마토그래피(MonoQ, Pharmacia)에 의해 일어난다. 겔 여과에서, 분자량이 약 17kDa인 단백질이 선택된다. 이것이 주화성 억제 특성을 갖는다고 발견된 단백질이다. 상기 단백질은Staphylococcus aureus의 상징액으로부터 분리되었고 주화성 억제를 제공하므로, 이 단백질은 "CHIPS":Staphylococcus aureus(이하 "원형 CHIPS"라고 명함)로부터의CHemotaxisInhibitoryProtein로 명명되었다.
S.aureus 의 상징액 중에서 CHIPS 단백질의 분리는 매우 비용-효과적이지 않다. 또한, 치료에 CHIPS의 실제적 이용을 위해 단백질의 활성부분이 분리되는 것이 바람직하다. 더 작은 단백질 또는 펩티드 분자들은 치료를 위해 단백질 또는 펩티드를 수용하는 주체에서 면역성 반응의 유도 위험이 감소된다. 더우기, 생물학적 활성을 추가로 증가시키고 그의 면역원성을 더 낮추기 위해 단백질 또는 펩티드가 변형가능한 것이 바람직하다.
본 발명은 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드 암호화 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상응하는 (폴리)펩티드의 제조에 상기 핵산에 함유된 정보를 사용하는 것 및 그것에 사용하기 위한 벡터와 숙주에 관한 것이다. 그 밖에, 본 발명은 (폴리)펩티드와 유사 구조 및 작용을 갖는 비-(폴리)펩티드 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산분자에 의해 암호화되는 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 염증반응의 치료에 사용될 수 있다. (폴리)펩티드와 비-(폴리)펩티드는 그 밖에 백혈구와 내피세포의 활성을 억제하는데 사용될 수 있다.
도 1은 모노 Q 칼럼으로부터의 용출물의 CHIPS 활성을 나타낸다.
도 2는 최종 모노 Q 크로마토그래피 단계 후 정제된 CHIPS의 코마시 블루 염색된 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 3은 CHIPS-FITC의 다양한 백혈구 집단에의 결합에 대한 농도 의존을 나타낸다.
도 4는S. aureusNewman으로 제조된 chp 유전자의 서열을 나타낸다. 샤인-달가르노 배열(AGGAGA)과 chp 개방형 해독틀(ORF)에 밑줄을 그엇다. 성숙 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드는 이중선으로 표시하였다.S. aureus1960 서열에서 뉴클레오티드의 벗어남은 서열 위에 표시하였다.
도 5는S. aureusNewmanchp유전자로부터 도출된 아미노산 서열을 나타낸다. CHIPS의 N-말단 35 아미오산과 맞는 영역에 밑줄을 그엇다.S. aureus1960 단백질에서 아미노산의 벗어남은 서열 위에 표시하였다.
도 6은S. aureus균주의 게놈중의 chp 유전자의 검출을 나타낸다.
도 7은S. aureus균주의 상징액 중에서 CHIPS의 활성을 나타낸다.
도 8은 여러가지 임상적S. aureus균주의 게놈에서 chp 유전자의 분포를 나타낸다.
도 9는 아미노산 1 내지 15의 펩티드(도 9A)로부터 유도된 CHIPS 및 정제된 CHIPS에 결합하는 래빗 항-CHIPS 항체의 2 dose 반응곡선을 나타낸다.
도 10은 완충액 처리된 세포의 백분률로 나타낸, 정제된 CHIPS에 의해 fMLP를 향한 호중구 이동 억제의 농도 의존을 나타낸다. 세포는 여러 농도 CHIPS에서 실온에서 30분동안 배양되었고 트란스웰 용기의 상부에 첨가되었다. 1x10-8M fMLP를 향한 이동은 37℃에서 60분 동안 배양 후 측정되었다.
도 11은 니켈 칼럼 위에서 친화크로마토그래피 후 E. coli 용출물로부터 얻은 최종 정제된 재조합 CHIPS(rCHIPS)과 엔테로키나아제에 의한 히스티딘 태그의 절단을 나타내는 SDS-PAGE의 상을 나타낸다.
도 12는 호중구 위의 fMLP(FPR)과 C5a(C5aR)에 대한 수용체의 발현에 대한 재조합 CHIPS(rCHIPS)의 농도에 따른 억제를 나타낸다.
도 13은 호중구에서 fMLP(FPR)과 C5a(C5aR)에 의해 유도된 세포내 유리칼슘의 방출의 농도에 따른 약화를 나타낸다.
도 14는 완전 재조합 CHIPS와 재조합 돌연변이 CHIPS4-121에 의한 CHIPS-FITC의 농도에 따른 억제를 나타낸다.
표 1은 본 발명의 (폴리)펩티드와 비-(폴리)펩티드로 처리될 수 있는 염증성 병태를 나타낸다.
표 2는 CHIPS로 면역화된 마우스로부터 유도된 단일클론성 항체의 몇몇 선택된 클론의 ELISA에서의 결합을 나타낸다. 결합은 정제된 CHIPS이며 반응 마우스 단일클론성은 HRPO-연결된 항-마우스 항체로 검출된다.
그러므로, 본 발명의 목적은 원형 CHIPS 단백질 또는 CHIPS 활성을 갖는 다른 상응 (폴리)펩티드, 뿐만 아니라 천연 생성 숙주세포로부터 분리된 것 이외의 그들의 기능적 단편, 유도체 또는 동종체를 생성하는 수단을 제공하는 것이다.
그러므로, 본 발명은 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자를 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 상응한다:
a)도 4에 나타낸 서열(SEQ ID NO 4)의 적어도 일부로 이루어진 뉴클레오티드 서열;
b)CHIPS 활성을 갖고 도 5에 나타낸 아미노산 서열(SEQ ID NO 5)을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
c)CHIPS 활성을 갖고 도 5에 나타낸 아미노산 서열(SEQ ID NO 5)의 적어도 일부를 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
d) 뉴클레오티드 서열 a), b), 또는 c) 중 어느 하나와 적어도 40 % 동일한 뉴클레오티드 서열;
e) 뉴클레오티드 서열 a), b), c) 또는 d) 중 어느 하나와 스트린전트 조건에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열; 및
f) 뉴클레오티드 서열 a), b), c), d) 또는 e) 중 어느 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열.
d)에서 언급한 바와 같이, 동일성 또는 상동관계에 관하여, 틈이 있는 배열에 대하여, 통계적 파라미터는 최적 배열 점수를 생성할 수 있는 스미스-워터만 알고리즘을 이용하여 평가할 수 있다는 것에 주의해야 한다. CHIPS 핵산 서열 또는 단백질 서열의 상동물은 적어도 12의 갭 오픈 패널티와 적어도 1의 갭 발현 패널티로 정의된다.
본 명세서에서, "CHIPS 활성"은 적어도 리간드-(C5a 또는 fMLP)결합의 약화를 포함하여, 적어도 fMLP와 C5a 모두에 의해 유도된 반응을 특이적으로 약화시킬 수 있고, 및 주화성과 세포-활성화(예를 들면, 칼슘 동원)를 임의로 약화시킬 수 있는 능력을 말한다. 그러나, (폴리)펩티드는 추가로 백혈구와 내피세포의 활성에 대한 억제 효과와 같은 다른 생물학적 활성을 가질 수 있다.
본 설명에서 "CHIPS 단백질" 및 "CHIPS 유전자" 또는 "chp 유전자"라는 용어는 각각, 천연적으로 발생하는 S. aureus의 상징액에서 분리된 단백질, 및 그것의 분리된 유전자에 대해 사용된다. "CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드" 및 "CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 분자" 는 어떤점에서는 CHIPS 단백질 또는 유전자와 관련되거나 또는 그들로부터 유도되지만 그것과 동일하지 않은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 모든 다른 상응 (폴리)펩티드와 핵산분자에 대해 사용된다. 상기 정의된 CHIPS 활성은 본 (폴리)펩타이드의 고유의 특성이다. 이 효과는 실시예 5에서 CHIPS 단백질에 대해 설명될 것이다.
도 4에 주어진 서열(SEQ ID NO 4)는 본 발명에 따라 분리된 DNA 서열이다. 이것은 뉴클레오티드 1 내지 40의 프로모터 영역, 뉴클레오티드 41 내지 124의 리더 펩티드 서열, 뉴클레오티드 125 내지 490의 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드에 대한 암호화 영역, 뿐만 아니라 뉴클레오티드 491 내지 603의 3' 미해독된 영역으로 이루어진다.
본 발명의 첫번째 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 도 4의 뉴클레오티드 1 내지 490에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 대체적인 구현예에서, 프로모터 영역은 더 이상 존재하지 않는다. 본 구현예에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 도 4의 뉴클레오티드 41 내지 490에 상응한다. 상기 핵산분자를 갖는 다양한 프로모터 및/또는 다른 전사조절 서열이 사용될 수 있다. 프로모터 및/또는 기타 조절 서열은 전사가 일어나는 조건에 따라 선택된다. 당업자들은 적당한 프로모터 및/또는 기타 전사 조절 영역을 선택할 수 있다.
도 4의 분리된 CHIPS 유전자 또는 그것으로부터 유도된 어느 핵산은 예를 들면 trc 발현 시스템에 사용가능하게 연결될 수 있다 (Brosius et al., Gene 27: 161-172(1984)). 많은 다른 적당한 발현 조절 서열 및 재조합 단백질의 발현방법이 알려져 있다(F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecualr Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y.).
도 4에 주어진 뉴클레오티드 서열은 또한 리더 펩티드 서열을 함유한다. 성숙 단백질의 암호화 영역은 도 4의 뉴클레오티드 125 내지 490에 상응한다. 다른 리더 서열들이 사용될 수 있다. 또는 상기 리더 서열은 서열이 발현되어질 숙주 세포에 따라, 완전히 생략할 수 있다.
도 5의 아미노산 서열은 도 4의 DNA 서열로부터 도출가능하다. 그러므로, 본 발명의 추가의 구현예에서 핵산 분자는 분리된 CHIPS 유전자의 모든 퇴화된 변종에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 추가로 도 5의 완전 서열을 갖지 않고, 단독 또는 함께 CHIPS 활성을 갖는 생물학적으로 활성 (폴리) 펩티드를 구성하는 하나 이상의 그것의 기능적 부분을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산분자에 관한 것이다. 이와 같은 단백질은 크기 면에서 하나의 아미노산이 없는 완전 아미노 서열로부터 적어도 2개, 바람직하기는 5개의 아미노산의 펩티드까지 변할 수 있다. 단백질의 활성부분이 완전 아미노산 서열의 두개 이상의 부분에 놓이는 경우, 본 발명은 또한 생물학적 활성을 유지하는 펩티드 배열을 가져오는 방법으로 이들 분리 단백질들을 암호화하는 핵산 서열과 관련된다. 실제적으로, 이것은 예를 들면 스페이서 서열들이 생물학적활성 형태를 가져오는 생물학적으로 활성인 부분들 사이에 병합되는 것을 의미한다.
그러므로, 참조가 "적어도 서열의 일부"에 대해 이루어질 때, 이것은 상기의 3 부분들(즉, 뉴클레오티드 1-490, 41-490 및 125-490) 뿐만 아니라 그들이 여전히 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩테드를 암호화 한다면, 유전자 또는 그것들의 결합물의 다른 단편들을 의미한다.
그것에 관하여 추가의 구현예에서, 본 발명은 도 5의 아미노산 서열의 하나 이상의 부분의 암호화 영역으로 이루어진 본 발명의 분리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서 아미노산 서열의 한 부분은 단독 또는 아미노산 서열의 다른 영역을 갖는 생물학적 활성을 가져오는 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드의 영역(들)로 이루어진다.
본 발명은 도 4에 나타낸 서열과 정확히 같은 서열을 갖는 핵산분자로 또는 그것의 상기의 변종으로 제한되지 않는다. 그러므로, 본 발명에 따르면 위의 a), b) 또는 c)에서 정의된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 적어도 40%, 바람직하기는 적어도 50%, 더욱 바람직하기는 적어도 60%, 더욱 바람직하기는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하기는 적어도 80%, 가장 바람직하기는 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 추가의 핵산분자가 제공된다.
CHIPS는 현재까지 알려진 단백질과 펩티드에 대해 40% 미만의 동질성을 갖는다고 알려져 있다. 그러므로, CHIPS 단백질에 대해 적어도 40% 아미노산 동질성을 나타내며 CHIPS 활성을 갖는 단백질들과 펩티드들은 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 추가로 핵산분자 분자가 도 4에 주어진 핵산서열 또는 그것의 퇴화된 서열에 상응하는 스트린전트 조건하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 관련되며, 이것은 도 5에 주어진 아미노산 서열을 암호화한다. 스트린전트 조건은 5xSSC(SSC = 150 mM Nacl, 15 mM 트리소듐 뉴클레오티드(nt)) 중에서 42 ℃에서 하루밤 동안 혼성시키고 1.0 x SSC에서 65 ℃에서 세정시켜 조성하였다. 혼성화 용액은 5xSSC 이외에 50 % 포름아미드, 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 ㎍/ml 변형 전단된 연어 혈청 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 유전자로 한정되지 않으며 그것의 단편, 유도체 및 동종체를 암호화하는 핵산분자에 관한 것이다. "단편"은 그의 생물학적 활성을 유지하는 (폴리)펩티드의 모든 부분을 포함하는 의미를 갖는다. "단편"은 연속적인 아미노산의 서열 하나 또는 이와 같은 서열 하나 이상으로 이루어질 수 있다. "유도체"는 CHIPS 활성을 갖는 완전 (폴리)펩티드 또는 몇몇 방법으로 변형되는 그것의 단편이다. 변형의 예는 다음과 같다. "동종체"는 다른 유기체, 특히 다른 병원성 유기체로부터 분리된 CHIPS 활성을 갖는 유사한 (폴리)펩티드이다. 상기 카테고리 모두는 한가지의 공통점을 갖는데, 바로 그들은 "CHIPS 활성"을 갖는다. CHIPS 활성은 알맞는 주화성 자극을 향하는 백혈구의 직접적인 이동을 나타내는 어느 조사에 의해 측정될 수 있다. 이와 같은 조사의 예로는 언더 아가로스법(Balasoiu, et al., Diabets care 20: 392-395(1997)에서 예시됨), 변형 보니덴 챔버법 및 트랜스웰 시스템이 포함된다. 후자법은 실시예에서 추가로 설명된다.
그러므로, 본 발명에 대하여, "CHIPS 활성을 갖는 (폴리) 펩티드"라는 용어는 원형 CHIPS 단백질, CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드, 단편, 유도체 및 동종체를 포함한다.
본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 cCNA 일 수 있다.
그 외에 본 발명은 본 발명의 핵산분자로부터 유도된 프로브와 프라이머와 관련된다. 이와 같은 프라이머는 올리고뉴클레오티드 또는 적어도 약 10개의 연속적인 뉴클레오티드(nt), 및 더욱 바람직하기는 적어도 약 25개의 nt, 더욱 바람직하기는 적어도 약 30개의 nt, 및 가장 바람직하기는 본 발명의 핵산 분자의 적어도 액 30 ~ 70 nt의 폴리뉴클레오티드이다. 프로브는 더욱 길며, 예를 들면 50 ~ 300 연속적인 nt의 본 발명의 핵산분자의 부분, 또는 전체 핵산분자 만큼 길 수 있다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 진단용 프로브로서 또는 종래의 DNA 혼성법의 프로브로서 또는 예를 들면 Ausubel et al.(supra)에 기재된 바와 같은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의한 표적 서열의 증폭을 위한 프라이머로서 유용하다.
더우기, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산을 적어도 하나 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 사용되어질 벡터는 당업자들에 의해 그들의 일반적 지식에 의해 사용될 숙주에 따라 선택될 수 있다.
벡터 이외에, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산을 적어도 하나 포함하는 박테리오파아지를 제공한다. 대부분의 CHIPS-양성 Staphylococci에서, CHIPS를 암호화하는 유전자는 프로파지에 위치하며, 예를 들면 표준 및 공지된 파지 분리과정에 따라 미토마이신으로 처리함으로써 활성파지로 변할 수 있다. 그러므로, 박테리아파지는 CHIPS 유전자를 숙주에 도입시키기에 유용한 매체이다.
그밖에, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산분자의 적어도 하나를 벡터에 삽입시키는 것을 포함하는, 재조합 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다. 벡터에 하나의 복사본 이상을 병합시키거나 또는 하나 이상의 벡터를 숙주에 도입시킴에 의해 발현 수준이 영행을 받을 수 있다. CHIPS 활성을 갖는 상응하는 (폴리)펩티드에 대한 내인성 유전자를 포함하는 숙주세포가 사용될 때, 그것의 발현 수준은 핵산분자(즉, 유전자)의 많은 복사본을 숙주세포에 도입시키거나 프로모터 또는 조절제 부위를 변화시킴에 의해 증가될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 분리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주에 관한 것이다. 많은 형태의 유기체 또는 원핵동물, 원생동물, 진균류, 동물, 또는 식물의 세포들이 CHIPS 활성을 갖는 재조합 (폴리)펩타이드의 발현에 적당한 숙주로서 작용할 수 있다. 숙주세포는 trc 프로모터로부터 높은 수준의 조절된 발현을 허용하는 trc 발현 시스템(Brosius et al., supra)을 포함하는, 널리 이용되는 박테리아성 균주Escherichia coli를 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.
가능성을 갖는 다른 적당한 박테리아성 균주는Bacillus subtilis,Staphylococcus aureus와 같은 그램-양성 박테리아성 균주, 또는 이형 단백질을 발현할 수 있는 어느 박테리아성 균주를 포함한다. E. coli에서의 바람직한 제조과정을 실시예 6에 나타내었다.
CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 또한 이스트 또는 곤충세포와 같은 하등 성숙핵을 이용하는 적당한 발현 시스템을 이용하는 재조합 단백질로서 생성될 수 있다. 적당한 이스트 균주로는Saccharomyces cerevisiae,Pichia pastoris,Candida또는 이형 단백질을 발현할 수 있는 어느 이스트 균주를 포함한다. 재조합 단백질 발현에 사용되는 곤충 세포들은Drosophila시스템과 Baculovirus 시스템을 포함한다. 선택적으로, CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 원숭이 COS 세포, 햄스터 CHO, BHK 세포 또는 RBL-2H3, 인간 293, 3T3, HeLa, U937, HL-60 또는 Jurkat 세포, 마우스 L 세포 및 다른 인비트로 배양을 위해 형질전환된 세포를 포함하는 여러 숙주세포를 포함하는 포유류 발현 시스템에서 생성하는 것이 가능하다. 성숙핵 시스템에서 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드의 발현을 위해, 기능적 단백질을 얻기 위해 여기서 생성된 단백질을 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 결합 또는 치환과 같은 변형은 공지의 화학적 또는 효소적 방법으로 수행될 것이다. 그밖에, 핵산 분자의 서열은 숙주세포의 코돈 용법에 적응될 수 있다.
본 발명의 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 또한 유전자 변형 동물의 산물, 예를 들면, CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 체세포 또는 생식세포에 의해 특징되는 유전자 변형 소, 염소, 돼지, 양, 토끼 또는 마이스의 우유 성분으로서 발현될 수 있다.
(폴리)펩티드는 재조합 단백질을 발현에 알맞는 배양 조건하에서 형질변환된 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 생성된 단백질은 그 다음, 예를 들면,숙주세포의 배양 상징액 또는 예비정제 후 그것으로부터 얻어진 액체를 흡수 크로마토그래피 칼럼으로 이끄는 단계; 그 후 흡수 크로마토그래피 칼럼의 통과물을 우선 친화 크로마토그래피 칼럼으로 이끌고 그 다음 친화 크로마토그래피 칼럼의 용출물을 DNA 칼럼으로 이끄는 단계; 또는 친화 크로마토그래피 칼럼을 통과물을 우선 DNA 칼럼으로 이끌고 그 다음 DNA 칼럼의 용출물을 흡수 크로마토그래피 칼럼으로 이끄는 단계; 선행 단계의 각각의 마지막 칼럼의 통과물을, 약 17 kDa의 분자량과 CHIPS 활성을 갖는 분율을 선택하여 겔여과 칼럼과 음이온 교환 칼럼으로 이끄는 단계로 이루어진 정제공정에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "통과물"은 추가 처리 없이 칼럼으로부터 나온 성분을 갖는 장전된 액체의 일부를 의미한다고 이해된다. 이 "통과물"의 성분들은 칼럼에 결합되지 않는다. "용출물"은 용출 후 칼럼으로부터 나오는, 칼럼에 결합되고 용출에 의해 다시 방출되는, 칼럼에 장전된 액체의 성분들을 함유하는 액체를 의미한다. 상기 방법에서, 흡수칼럼은 장전된 배지의 대부분의 성분들 또는 예비-정제 후 칼럼으로부터 얻은 액체를 유지한다. 친화칼럼은 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드와 CHIPS 단백질과 유사한 분자량 및 친화칼럼과 흡수칼럼 각각에 대한 유사한 친화력을 갖는 Snase(스타필로코콜 뉴클레아제)를 유지한다. DNA 칼럼은 오직 Snase만을 유지한다. 이 방법은 특히 일차 친화 크로마토그래피 칼럼이 소위 리간드 염료 "황색" 칼럼이고, 이차 친화 크로마토그래피 칼럼이 소위 리간드 염료 "녹색"이고 DNA 칼럼이 DNA 셀룰로스 칼럼일 때 특히 잘 작동한다.
추가로, 겔 여과법, 이온교환 크로마토그래피법, 친화 크로마토그래피법, 소수성 상호작용 크로마토그래피법 또는 면역친화력 크로마토그래피법 등과 같은, 다른 공지의 방법이 사용될 수 있다.
선택적으로, CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 정제가 촉진되는 형태로 발현될 수 있다. 예를 들면, 이것은 폴리히스티딘(6xHis) 에피토프로 태그될 수 있고 그 다음 칼레이트화제에 의해 니켈이온이 결합된 수지를 이용하여 정제될 수 있다. 태그를 갖는 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 pH를 낮춤에 의해 또는 이미다졸 또는 히스타딘과 경쟁시킴에 의해 수지로부터 용출시킬 수 있다. 이와 같은 에피토프는 Invitrogen사 제품이다. 프로타제 절단부위의 도입은 CHIPS 활성을 갖는 성숙 천연 재조합 (폴리)펩티드를 생성하기 위해 융합 태그의 제거를 가능하게 한다. 이와 같은 발현 시스템을 위한 재료와 방법은, His-태그된 단백질의 효율적 분리를 위한 상표명 ProBoundTM수지와 결합된 상표명 pTrcHis XpressTM벡터와 높은 촉매적 활성 프로타아제인 상표명 EnterokinaseMaxTM및 오염된 프로테아제의 존재를 제거하기 위한 상표명 EK-AwayTM엔테로키나아제 친화수지를 이용하며, Invitrogen 사로부터 시판된다.
당업자들에게 알려진 글루타틴 S 트란스퍼라제(GST 융해), myc와 HA등을 포함하는 다른 태그들이 정제를 촉진하기 위해 사용될 수 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 화학적 합성에 의해서도 생성될 수 있다. 합성에 의해 폴리펩티드 또는 단백질을 구성하는 방법은 당업자들에게 알려져 있다. 합성 단백질은 일차, 이차 및 삼차 구조 및/또는 형태적 특성을 CHIPS 활성을 갖는 상응하는 (폴리)펩티드와 공유함에 의해, CHIPS 특성을 의미하는, 여기서 공통적인 활성을 소유할 것이다. 그러므로, 이와 같이 합성 생성된 단백질은 CHIPS 활성을 갖는 천연 정제된 (폴리)펩티드에 대하여, 생물학적으로 활성이거나 또는 면역학적인 치환체로 사용될 수 있다. CHIPS의 합성은 추가로 실시예 7에 설명되어 있다.
본 명세서에 제공된 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드는 또한 자연적으로 변형이 제공되거나 또는 고의로 변형 처리된 아미노산 서열에 의해 특징되는 (폴리)펩티드를 포함할 수 있다. (폴리)펩티드 또는 DNA 서열 중의 변형은 당업자들에 의해 종래의 방법으로 이루어질 수 있다. CHIPS 활성(폴리)펩티드 서열 중의 중요한 변형은 암호화 서열에 선택된 아미노산 잔류물의 교환, 삽입 또는 삭제를 포함할 수 있다.
CHIPS 단백질에 함유된 정보, 그것의 유전자 및 CHIPS 활성을 갖고 그들로부터 유도된 그들의 암호화 핵산분자를 갖는 다른 (폴리)펩티드는 그들의 단편 또는 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드가 백혈구에 결합하는 것을 억제 또는 블로킹 할 수 있는 다른 약제에 대한 스크린에 이용될 수 있고, 그러므로 주화성 활성 및/또는 그것의 추정 수용체에 대한 CHIPS 결합의 억제제로서 작용할 수 있다. 알맞는 스크린 조사는 예를 들면 호중구에 결합된 형광 라벨된 정제 CHIPS 단백질을 흘림세포계측법 또는 형광측정법으로 분석하는데 사용할 수 있다. 적당한 결합 분석은 선택적으로 정제된 CHIPS 수용체 또는 리간드로서 CHIPS 단백질의 형태를 갖는 담체 위의 수용체 영역을 이용할 수 있다. 선택적으로, 경쟁 또는 비-경쟁 ELISA법 또는 리간드(CHIPS), 항체 또는 추정 CHIPS 수용체로 코팅된 센서 칩을 사용하는 바이오센서법(BioCore와 같은 표면 플라즈마 공명법(SPR)을 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는, 본 분야에 알려진 각종 면역분석법으로써 특정 항-CHIPS 항체(모노클론성, 폴리클론성, 또는 단일사슬 항체)에 결합하는 능력 또는 결합하기 위해 CHIPS와 경쟁하는 능력을 스크린하는 조사를 이용할 수 있다. CHIPS와 다르게 CHIPS 활성을 갖는 어느 (폴리)펩티드가 상기 스크리닝 조사에 이용될 수 있다. 모든 상기의 방법들은 고처리율 스크리닝(HTS)에 맞도록 변형될 수 있다.
CHIPS 활성을 갖는 분리된 (폴리)펩티드는 fMLP와 C5a가 각각의 수용체 fMLP 및 C5a에 결합되는 것을 억제하는 억제제로서, 또는 경쟁 억제를 스크리닝함에 의해, CHIPS 결합의 억제제를 고안하기 위해 사용될 수 있다. (추정 CHIPS 수용체 또는 수용체 도메인에 대한) CHIPS 결합의 억제제들은 또한 이와 같은 조건을 처리하기에 유용하다.
본 발명은 그밖에 자체로는 (폴리)펩티드가 아니지만 구조와 기능은 본 명세서에 기재된 (폴리)펩티드의 구조 및 기능과 유사한 분자들에 관한 것이다. 이들 분자들의 예는 펩티도미메틱스(peptidomimetics)이다. 본 출원에서 (폴리)펩티드에 대한 참조가 만들어졌을 때, 이것은 또한 유사 또는 동일한 구조 및 기능을 가지며 그 결과 (폴리)펩티드와 유사하거나 또는 동일한 생물학적 활성을 갖는 비-(폴리)펩티드도 포함하는 것을 의미한다.
CHIPS, (폴리)펩티드, 그들의 단편, 유도체 및 동종체의 기능적 활성은 여러가지 방법으로 조사될 수 있다. 우선적으로, 상기 CHIPS 활성은 흘림세포계측법에 의해 결정되는 바와 같이 호중구에 대한 형광-fMLP(Bodipy-fMLP) 또는 형광-C5a(FITC-C5a)의 결합을 막는 능력에 의해 측정된다. 실시예 1에 상기 조사를 기재하였다. CHIPS 활성은 또한 실시예에 기재된 Transwell 주화성 조사에 의해 결정되는 바와 같이 호중구가 fMLP 또는 C5a로 이동하는 것을 막을 수 있는 능력에 의해 측정된다. 선택적으로, 세포내 칼슘 농도의 신속하고 단기적인 상승을 개시하는, fMLP와 C5a를 포함한 케모킨의 능력을 기초로한 조사가 CHIPS 활성을 스크린하기 위해 사용될 수 있다. 흘림세포계측법 또는 형광측정법과 병합된 여러가지 칼슘 특이 형광 프로브, 또는 마이크로피지오메트리의 사용을 포함한 본 분야에 알려진 다양한 조사들이 사용될 수 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다. 어느 방법에서 CHIPS 활성의 스크린을 위한 세포로서, 방금 분리된 호중구 또는 FPR 또는 C5aR로 트란스펙트된 세포, 이들 수용체들의 야생형 또는 돌연변이형이 사용될 수 있다.
CHIPS 활성을 갖는 분리된 (폴리)펩티드는 표 1과 같이 많은 질병 및 질환을 치료, 예방 또는 감염 병태의 개선에 유용하다. 표 1의 질병의 치료를 위한 본 발명의 (폴리)펩티드의 치료학적 유용성에 대한 지지는 다음 참조에서 발견될 것이다: ARDS에 대하여:Demling RH(1995). The modern version of adult respiratory distress syndrome. Ann. Rev. Med. 46:193-202; and Frjishima S, Aikawa N 1995 Neutrophil-mediated tissue injury and its modulation. Intemsive Care Med 21:277-285; 심각한 감염(수막염)에 대하여: Tunkel AR and Scheld WM(1993). Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningitis. Clin. Microbiol.Rev. 6:118. 허혈/재관류 후의 손상에 대하여: Helier T, et al.(1999). Selection of a C5a receptor antagonist from phase libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury. J.Immunol. 163:985-994. 류마티스성 관절염에 대하여: Edwards SW and Hallett MB(1997). Seeing the wood for the trees: The forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Immunology Today 18 : 320-324; and Pillinger MH, Abramson SB(1995). The neutrophil in rheumatoid srthritis. Rheum. Dis.Clin. North Am. 1995 21:691-714. 심근경색에 대하여: Byrne JG, Smith WJ, Murphy MP, Courper GS, Appleyard RF, Cohn LH(1992). Complete prevention of myocardial stunning, contracture, low-reflow, and edema after heart transplantation by blocking neutrophil adhesion moleculas during reperfusion. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104: 1589-96. COPD에 대하여: Cox G(1998). The role of neutrophils in inflammation. Can. Respir. J. 5 Suppl A: 37A-40A; Heimstra PS, van Wetering S, Stolk J (1998). Neutrophil serin proteinases and defensions in chronic obstructive pulmonary disease: effects on pulmonary epithelium. Eur. Respir. J.12:1200-1208. 뇌졸증에 대하여: Barone FC, Feuerstein GZ(1999). Inflammatory mediators and stock:new opportunities for novel therapeutics. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19:819-834; and Jean WC, Spellman SR, Nussbaum ES, Low WC(1998). Peperfusion injury after focal cerebral ischemia: the role of inflammation and the therapeutichorizon. Neurosurgery 43: 1382-1396. 수막염에 대하여: Thomanen EI(1996). Molecular and cellular mechanisms of pneumococcal meningitis. Ann N.Y. Acad. Sci 797:42-52.
| 계통 | 질병 | 계통 | 질병 |
| 심장혈관 | 동맥경화 | 성뇨기 | 요로감염 |
| 폐혈증 | 사구체신염 | ||
| 허혈뇌졸증 | 질트리코모나스 감염 | ||
| 심폐우회증 | 자궁내막증 | ||
| 대동맥 수술 | 관절 | 류마티스성 관절염 | |
| 심장이식술 | 급성 반응성 관절염 | ||
| 심근경색증 | 통풍 | ||
| 중추신경 | 세균성 수막염 | 호흡기 | ARDS |
| 바이러스성 수막염 | COPD | ||
| 다발성경화증 | 자발성 폐동맥섬유증 | ||
| 뇌졸증 | 낭포성 섬유증 | ||
| 알츠하이머병 | 천식 | ||
| 뇌종양 | 흉막 emphema | ||
| 위장 | 췌장염 | 금속연무염 | |
| 궤양성 대장염 | 폐염 | ||
| 크론병 | 기관지염 | ||
| 알콜성 간염 | 과감작성 폐염 | ||
| 바이러스성 간염 | 미코박테리윰 튜버.감염 | ||
| 헬리오박터 필로리위염 | 바이러스성 기도감염 | ||
| 위암 | 알레르기성 비염 | ||
| 간세포암 | 정맥동염 | ||
| 복막염 | 기관지원성 암 | ||
| 피부 | 건선 | 기타 | 치근막염 |
| 접촉성 피부염 | HIV 감염 | ||
| 아토피성 피부염 | 만성 임파성 백혈병 | ||
| 피부 T-세포 임파종 | 급성 이식거부 | ||
| 화상 | 사구체신염 | ||
| 동창 | |||
| 반복적인 균주손상 |
따라서, 본 발명은 본 발명의 추가 면에 따라 진단, 예방 또는 치료, 특히 급성 및 만성 염증성 반응 및 HIV 감염, 더욱 특별히는 성인호흡곤란증후군(ARDS), 허혈뇌졸증, 외상적 뇌손상, 심각한 감염, 심근경색증, 혈관수술(vessel surgery), 궤양성 대장염, 크론병, 만성 폐동맥 폐쇄 질환(COPD), 류마티스성 관절염, 피부병, 다발성경화증, 알츠하이머병, 동맥경화증, 반복적인 균주손상(RSI), 급성 이식 거부, 화상, 급성 반응성 관절염, 췌장염, 맥관염, 사구체신염, 통풍, 동창 및 수막염의 치료에 사용하기 위한 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 진단, 예방 또는 치료, 특히 급성 및 만성 염증성 반응과 HIV 감염의 치료, 더욱 특별히는 상기의 표에 기재된 질병의 치료를 위한 제제를 제조하기 위한 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드의 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 일부는 적당한 부형제와 본 발명의 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드로 이루어진 치료학적 조성물이다. 이와 같은 조성물은 상기 특정된 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 항체를 성장시키거나, CHIPS 활성을 조절하기 위한 것 등의 여러가지 목적을 위해 임의로 더 큰 구조물에 또는 약제학적 제제에 병합된 본 발명의 핵산분자의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 핵산분자 및 소위 "컴퓨터 클로닝"에 의해 확인될 수 있는 핵산분자로 암호화된 아미노산 서열에 관한 것이다. 더욱 특별히는, 본 방법은 (1)도 4에 나타낸 핵산서열, 또는 그것의 단편, 유도체 및 동종체, 또는 (2) 도 5에 나타낸 아미노산 서열 또는 그것의 단편, 유도체 및 동종체를, 상동을 갖는 영역을 확인할 수 있는 조사 알고리즘을 이용하여, 핵산 서열 또는 핵산 서열 데이타베이스, 또는 단백질 서열 또는 단백질 서열 데이타베이스를 스크린하기 위한 쿼리로서 사용하는 것으로 이루어진다. 이와 같은 알고리즘은 당업자들에게 알려져 있으며, BLAST search(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990))를 포함하지만이것으로 제한되는 것은 아니다. 서치될 수 있는 서열 데이타베이스는 GenbankTM데이타베이스 및 SwissprotTM데이타베이스를 포함할 수 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다. BLAST 서치 또는 그것의 변형물을 이용할 때, 일반적으로 상동성을 나타내는 주체를 확인할 수 있고, 확인은 점수 또는 최소 합 확률 P(N)의 값을 근거로 한다. CHIPS 핵산 서열 또는 (폴리)펩티드 서열의 상동성은 적어도 200, 바람직하기는 적어도 400, 더욱 바람직하기는 적어도 800, 가장 바람직하기는 적어도 1600의 점수에 의해 정의된다. 선택적으로, P(N) 값은 상동성 서열의 확인에 사용될 수 있다. CHIPS 핵산 서열 또는 (폴리)펩티드 서열의 상동성은 1e-3보다 작은, 바람직하기는 1e-6보다 작은, 더욱 바람직하기는 1e-12보다 작은, 더욱 더 바람직하기는 1e-24보다 작은, 가장 바람직하기는 1e-48보다 작은 P(N)값으로 정의된다.
본 발명의 더욱 추가의 구현예에서, 항체 또는 특이적으로 본 발명의 (폴리)펩티드에 대한 특이적으로 배향되는 생물학적으로 활성인 그의 단편 및 CHIPS-기재, CHIPS 수용체-블로킹 분자가 제공된다. 이와 같은 CHIPS-기재, CHIPS 수용체-블로킹 분자 및 항체 또는 그것의 생물학적으로 활성인 단편 및 키메릭스, 단일 사슬, 및 발현 라이브러리들이 예방 및 치료법에서 CHIPS 단백질 또는 관련 (폴리)펩티드의 활성을 중화하는데 사용되거나, 또는 CHIPS 또는 관련 (폴리)펩티드를 결합하는 진단목적으로 사용될 수 있다. 이와 같은 항체 및 CHIPS-기재, CHIPS 수용체-블로킹 분자들은 예를 들면,Staphylococcus감염의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 적당한 부형제 및 이들 항체 및/또는 그것들의 생물학적으로 활성인 단편 하나 이상으로 이루어진 약제학적 조성물을 제공한다.
"CHIPS-기재, CHIPS 수용체-블로킹 분자"는 실시예 8에 기재된 CHIPS 결합조사와 경쟁한다. 이와 같은 "CHIPS-기재, CHIPS 수용체-블로킹 분자들"은 CHIPS와 동일한 아미노산 조성물과 아미노산 서열을 갖는 분자일 수 있으나 완전 서열은 아니다. 이와 같은 분자는 CHIPS의 단일 단편일 수 있거나, 또는 모두 CHIPS 활성을 갖는 다수의 CHIPS 단편으로 이루어질 수 있다. 그러나, CHIPS 결합 조사에서 CHIPS와 경쟁하는 기능적 요건을 만족시키는 모든 다른 분자들이 또한 포함된다.
본 발명의 분리된 핵산분자는 추가로 유전자 치료법에 사용될 수 있다. 핵산분자는 국부적으로 작용하기 위해 염증 부위에, 또는 떨어진 부위에 적용될 수 있다. 유전자 치료법은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 거치지만 이것으로 제한되지는 않는다. 선택적으로, 리포좀 또는 폴리머를 기재로 하는 벡터들과 같은, 비-바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 유전자 치료 전략은 (1)본 발명의 분리된 핵산 분자가 인 비보의 표적 세포로 도입되는인 비보유전자 치료법, 또는 (2)본 발명의 분리된 핵산분자가 엑스 비보의 표적 분자로 도입되고, 형질도입된 세포, 또는 형질도입된 세포의 아개체군을 개개인에게 투여하는 엑스 비보 유전자 치료법을 기초로 한다.
본 발명은 항체 및/또는 그것의 생물학적으로 활성인 단편의 약제학적으로 유효량을 투여함에 의해 스트라필로코코스 염증을 앓는 환자를 치료하는 방법 뿐만아니라, 본 발명의 (폴리)펩티드의 약제학적 유효량을 투여함에 의해 염증을 앓는 환자를 치료하는 방법 및 핵산 분자의 약제학적 유효량을 투여함에 의해 염증을 앓는 환자를 유전자 치료학적으로 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 유기체로부터 CHIPS 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하는 방법에 사용될 수 있는데, 상기 방법은 핵산 분자를 기준으로 하는 프로브를 갖는 유기체의 게놈성 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 본 발명은 급성 및 만성 염증반응과 HIV 감염, 특히 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 허혈뇌졸증, 외상적 뇌손상, 심각한 감염, 심근경색증, 뇌졸증, 혈관수술, 궤양성 대장염, 크론병, 만성 폐동맥 폐쇄 질환(COPD), 류마티스성 관절염, 피부병, 다발성경화증, 알츠하이머병, 동맥경화증, 반복적인 균주손상(RSI), 급성 이식 거부, 화상, 급성 반응성 관절염, 췌장염, 맥관염, 사구체신염, 통풍, 동창 및 수막염의 치료에 사용하기 위한 치료용 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 핵산 분자 하나 이상이 잠복된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, CHIPS 유전자의 존재하에Staphylococcus aureus로 감염된 환자에 대한 진단용 PCR 시험과 관련된다. Staphylococci를 함유하는 CHIPS를 갖는 환자는 침략적인 질병에 대한 위험이 더 높고 다른 또는 부가적인 치료가 필요할 것이다. 본 발명의 모든 분자들, 즉 핵산분자, (폴리)펩티드, 비-(폴리)페티드, 단편, 유도체, 동종체와 같은 분자들은 여러가지 다르게 적용될 수 있다. 상기의 적용에는 다음이 포함되지만 그것으로 제한되지는 않는다.
-상기 분자들을 결합시킬 수 있는 인자들의 분리. 이와 같은 인자들의 예는수용체와 단백질이다. 이와 같은 분리는 예를 들면, 이스트 2 혼성 시스템을 이용하여 실시하거나 또는 낚시 먹이로서 본 발명의 태그된 분자를 이용하여 실시될 수 있다.
-펩토이드 및 펩티도미메틱스의 고안.
-활성 도메인, 기능적 등가를 결정하는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 라이브러리의 제조.
-CHIPS와 본 발명의 분자에 의해 활성화 또는 비활성화되는 시그널 형질도입 경로의 확인.
-생물학적 CHIPS 활성을 결정하기 위한 조사(주화성 억제 또는 케모킨 수용체 발현)
본 발명의 모든 분자들은 어느 방법으로든 라벨될 수 있다. 라벨화의 예는 형광, 비오틴, 방사선 라벨화 등이지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 라벨된 분자들은 인 비보 및 인 비트로 모두의 결합부위의 확인 뿐만 아니라, CHIPS의 생물학적 활성과 공통점이 있거나 또는 중복되는 화합물을 스크린하는데 및 유기체에서 CHIPS 단백질 또는 핵산을 추적하는데 사용될 수 있다.
특정 아미노산 서열을 갖는 (폴리)펩티드에 대한 참조에서, 당업자들에게 명백한 방법에서 화학적으로 변형되는 아미노산을 하나 이상 함유하는 (폴리)펩티드를 포함하는 의도를 가지며, 그렇지 않으면 이와 같은 변형은 CHIPS 활성을 없앤다.
본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 설명될 것이지만, 본 발명을 제한하려는의도는 아니다. 본 명세서에서 실시예는 다음의 도면과 표를 참조할 것이다.
실시예 1
S. aureus 상징액으로부터 CHIPS 단백질의 정제
재료 및 방법
1.1 단백질의 분리
Staphylococcus aureus1690(임상적 분리물, University Medical Center Utrecht(UMC Utrecht)) 또는Staphylococcus aureusNewman(Dr. Foster의 기증물, Dublin)을 IMDM 배지(Gobco)에서 하루밤 동안 배양하고 그 다음 새로운 IMDM 중에서 1:40으로 희석하여 7 시간동안 37 ℃에서 배양하였다. 박테리아를 펠렛화한 후, S. aureus 상징액(이후 SaS로 칭함)을 수집하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과하고 즉시 더욱 사용하였다(Veldkamp et al., Inflammation 21. 541-551 (1997)). SaS 5 리터의 양을 나란히 연결시킨 3개의 칼럼(25 ml)으로 이끌었다. 이들 세개의 칼럼은 순차적으로 "반응성 황색" 861, 리간드 염료 가교된 4% 기포가 있는 아가로스 칼럼(시그마), DNA 셀룰로스(Pharmacia) 및 "반응성 녹색" 19 리간드 염료 가교된 4% 기포가 있는 아가로스 칼럼(시그마)이었다.
PBS로 세척한 후, 녹색(반응성 녹색 19 칼럼)을 2 M NaCl로 용출시키고 CHIPS 활성을 함유하는 두번째 50 ml를 풀(pool)시켰다. PMSF(1 mM)을 첨가하고 용출물을 PBS에서 18시간동안 투석하였다. 샘플을 폴리에틸렌 글리콜에 담긴 투석용기에서 ±10 ml의 부피로 농축시켰다. 농축된 재료를 Pharmacia Superdex-200 겔 여과 칼럼에서 분리하고, 그 다음 활성 분율(부피 4 ml)을 풀시키고, PMSF(1 mM)로 처리하고 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 18시간 동안 투석하였다. 풀된 활성 분율을0 ~ 1M NaCl 범위의 10mM Tris-HCl 완충액의 기울기로 용출되는 Mono Q 음이온 교환 칼럼(Pharmacia)에 장전하였다. 활성분율(1 ml 부피)을 풀 시키고 정제된 CHIPS의 최종 제제로 사용하였다. 단백질 함량은 Pierce-Micro-BCA 조사로 측정하였고 CHIPS는 작은 분취량으로 -20 ℃에서 저장하였다. 최종 분리된 재료를 코마시 블루로 염색한 후, 12.5% SDS-PAGE(Mini-Protean II; Biorad)에서 순도를 분석하였다. CHIPS 단백질은 외관상 17 kDa 부근의 분자량을 갖는 단일 밴드로 나타났다. 모든 부분들을 흘림세포계측법으로 측정한 바와 같이 형광-라벨된 fMLP가 분리된 호중구에 결합하는 것을 억제하는 능력에 의해 CHIPS 활성에 대해 스크린하였다.
1.2 과립구에 대한 fMLP와 C5a의 결합
표준법에 따라 건강한 지원자들의 헤파린화된 혈액으로부터 Histopaque-Ficoll 기울기를 통해 과립구들을 분리하였다(Troelstra et al., J. Leukocyte Biol. 61, 173-178 (1997)). 과립구 중에 남아있는 적혈구를 멸균정제수로 용해시키고(30초 동안) 등장성 회복 후 세척하였다. 세포들을 0.05% 인간 혈청 알부민으로 PRIM(Gibco) 중에서 최종적으로 재현탁시켰다. 팔콘 튜브내에 세포 50 ㎕(5x106세포/ml)를 CHIPS-함유 재료 50 ㎕로 30분 동안 37 ℃에서 배양하였다. 세포들을 얼음 위에 놓고 RPMI/HSA로(4 ℃에서) 한번 세척하고 새로운 배지 50 ㎕에서 재현탁하였다. 5 ㎕ BODIPY-라벨된 fMLP(최종 농도 0.1 μM; 분자 프로브), 또는 FITC-라벨된 C5a(최종농도 1 μM, CHIPS에 대해 실시예 2.1의 기재와 같이 FITC로 라벨된 Sigma사의 재조합체)를 그 다음 첨가하고, 샘플을 60분 동안 얼음에서 배양하였다. 세척 후, 과립구에 결합된 형광 fMLP 또는 C5a를 흘림세포계측법으로 분석하였다. 5000 과립구의 평균 형광치를 Lysis II 소프트웨어로 산출하였다.
결과
도 1은 모노 Q 칼럼으로부터의 용출물의 CHIPS 활성의 용출 프로필(OD280)을 나타낸다. 39 ~ 41 ml의 부피분율에서 가장 강한 CHIPS 활성이 나타났다. 도 2는 최종 모노 Q 크로마토그래피 단계 후 정제된 CHIPS의 코마시 블루 염색된 SDS-PAGE를 나타낸다.
실시예 2
호중구와 단핵세포에 대한 CHIPS의 특이 결합
재료 및 방법
2.1 정제된 CHIPS 단백질의 FITC 라벨링
정제된 CHIPS(500 ㎍/ml)를 실온에서 1시간 동안 pH 9.6의 탄산나트륨 1M 중에서 FITC(형광 이소티오 시아네이트, 이성질체 I; Sigma) 1mg/ml의 1/10 부피로 배양하였다. 혼합물을 탈염 칼럼을 통과시키고 용출물을 OD280및 온-라인 연결된 플루오로메타(Perkin Elmer)에 의한 형광을 모니터링하여, 유리된 FITC로부터 FITC-라벨된 CHIPS를 분리하였다. 높은 OD280및 형광을 갖는 분률을 풀 시키고 마이크로 BCA 단백질 분석기(Pierce)로 단백질 함량을 분석하였다. CHIPS-FITC를 작은 분취량으로 -20 ℃에서 저장하였다.
2.2 백혈구에 대한 CHIPS-FITC의 결합
백혈구에 대한 CHIPS-FITC의 특이 결합을 흘림세포계측법으로 결정하였다. 정제된 호중구와 (단핵세포와 임파구로 이루어진) 단핵세포를 상기와 같이 건강한 지원자들의 헤파린화된 혈액에서 분리하였다(Troelstra et al., Infect. Immun. 65: 2272-2277)). 분리된 세포를 혈액중의 상태를 모방한 세포 비율을 얻기위해 재혼합하였다. 전체 혈액의 작은 분취량을 PBS로 세번 정제하여 인간 적혈구 세포를 얻었다. 적혈구의 농도를 광분광법으로 결정하였다.
팔콘 튜브에서 백혈구 또는 적혈구 세포 50 ㎕(5x106세포/ml)를 얼음 중에서 30분 동안 여러 농도의 CHIPS-FITC로 배양하였다. 세포를 배지(HSA 0.05%를 함유하는 RPMI)로 한번 세척하고 새로운 배지 150 ㎕에 재현탁시켰다. 백혈구에 대한 CHIPS-FITC의 결합을 흐름세포분석법(FACScan; Becton Dickinson)으로 측정하였다. 다양한 아개체군과의 연합을 LysisII 소프트웨어에서 전방산란(FSC) 및 측면산란(SSC) 매개변수에 대한 선택 전극 게이팅(gating)으로 분석하였다. 선택된 세포 개체군의 평균 형광값을 소프트웨어로 계산하였다.
결과
도 3은 다양한 백혈구 개체군에 대한 CHIPS-FITC의 결합에 대한 농도 의존성을 나타낸다. CHIPS-FITC는 호중구에 가장 효과적으로 결합하고, 그 다음 단핵세포에 효과적으로 결합한다. CHIPS-FITC는 적혈구에 결합되지 않으며 림파구에는 최저로 결합하고 오직 아개체군에만 결합한다. 10 배로 과량 첨가된 비-형광 라벨된 CHIPS는 CHIPS-FITC가 세포에 결합하는 것을 완전히 억제하므로, CHIPS-FITC의 호중구에 대한 결합은 특이적이다.
실시예 3
Staphylococcus aureus의 CHIPS-암호화 유전자(chp)의 서열, 클로닝 및 발현
재료 및 방법
3.1 박테리아성 균주, 플라스미드 및 성장 조건
Staphylococcus aureusNewman, RN4220 및 COL은 일반적으로 사용되는 실험실 균주들이다.S. aureus1690은 균혈증 환자로부터 분리한 임상적 균주이다 (K.E.veldkamp et al., Inflammation, 21 : 541-551(1997) ).Escherichia coliDH5α를 클로닝 숙주로 사용하였다(F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wile and Sons, Inc., New York, N.Y.(1990). 플라스미드 pRB474는 E.coli와 pRB474의 다중 클로닝 부위로 클론된 유전자의 발현을 허용하는Bacillus subtilis로부터vegII 프로모터를 함유하는 Staphylococci의 셔틀벡터이다. pRB474는 네오마이신 내성 유전자가 클로람페니콜 내성 유전자로 대체된 pRB374(R.Bruckner, Gene, 122:187-192(1992))의 유도체이다. 모든 균주들은 다른 언급이 없는 한, BM 육즙(1% 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 0.5% NaCl, 0.1 % K2HPO4, 0.1% 글루코스)에서 37 ℃에서 성장하였다.
3.2 서열 분석
DNA를 Thermo SequenaseTM형광-라벨된 프라임 사이클 서열 키트(Amersham, Little Chalfont, UK)를 이용하여 DNA Sequencer 4000L(LI-COR Inc., Lincoln,Neb., USA)에서 사이클 서열화에 의해 서열화하였다.
J.Mamur(J. Mol. Biol., 3:208-218 (1961))에 따라 분리된 게놈성 DNA를 직접 서열화하기 위해 알맞는 프라이머를 사용하였다. 서열화법은 Peschel et al. 에 간단히 기재되어 있다(J.Biol. Chem., 274:8405-8410 (1999)). 서열 유사성을 조사하기 위해, NCBI(Bethesda, md., USA)의 비-풍부 단백질 데이타베이스를 이용하는 프로그램 BLAST 2.0을 사용하였다. 서열 배열은 프로그램 MacDNASIS Pro의 Higgins-Sharp 알고리즘(Hitachi Software Engineering, San Bruno, Calif., USA)을 사용하여 수행하였다.
그 전에, CHIPS의 일차 35 아미노산은 정제된 단백질의 N-말단 서열에 의해 결정되었다. S. aureus DNA는 A와 T 뉴클레오티드가 매우 풍부한 반면, G와 C 뉴클레오티드는 거의 없다(전체 염기의 약 30%). 그러므로, 대부분의 아미노산의 경우, A- 및 T- 풍부 코돈이 가장 바람직하다. 이 규칙에 따르면, 프라이머 서열은 아미노산 15 - 24(GAAAAAGAAAAAGCATATAAAGAA)(SEQ.ID NO 1)로부터 유도된다. 프라이머는 수백개의 염기쌍의 서열을 생성하는 S.aureus Newman으로부터 게놈성 DNA를 직접적으로 서열화하기 위해 사용된다. 새로운 프라이머는 일차 프라이머 결합 부위에 대하여 해독하기 위해 이 서열로부터 유도된다. 결합된 DNA 서열은 두개의 차이(3 위치에 A 대신 G, 및 15 위치에 A 대신 T)를 갖는 일차 프라이머의 결합부위를 갖는다(도 4). 이것은 해독을 개시하기 위한 합리적인 샤인 달가르노 서열에 의해 선행되고 3개의 정지코돈이 따라오는 450bp의 개방형 해독구조를 암호화한다 (J. Shine and L. Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:1342-1346(1974)).상기 유전자는chp로 명명되었다; 이것은 데이타 베이스의 어느 단백질과도 유사성이 없는 149 아미노산의 추정 단백질을 암호화 한다. N-말단 28 아미노산은 세포질 막을 가로지르는 세크레틴에 대한 시그널 펩티드를 형성하는 것으로 보인다(22 아미노산의 비-하전 영역 및 시그널 펩티다아제 1에 의한 절단을 위한 ALA-X-ALA 연속동기가 이어지는 3개의 양하전된 잔기; 도 5)(G. von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)). 시그널 펩티드 다음에는 CHIPS의 N-말단 35 아미노산과 거의 완전히 매치되는 영역이 따라온다. 유일한 예외는 N-말단 서열화에 의해 예상되는 아스파라긴 잔기 대신 도출된 성숙 단백질의 위치 33의 세린이다. 도출된 성숙 단백질은 121 아미노산 및 14.1 kDa의 크기를 갖고 등전점은 9.32이다. 그러므로 CHIPS 단백질의 모든 요건을 만족시킨다. 동일한 프라이머를 사용하여 S.aureus 1690의chp유전자를 서열화하였다. 두 유전자는 5개의 차이를 갖고 거의 동일하였다. 아미노산 서열 수준에서 오직 하나의 위치만이 교환되었다(도 4와 5).
3.3chp유전자의 클로닝 및 발현
S. aureusNewman의chp유전자를 발현 플라스미드 pRB474에서 chp의 클로닝을 허용하는 제한부위를 도입하기 위해 서열이 변형된 프라이머를 사용하여 PCR로 변형하였다. 생성된 플라스미드 pPr4-chp는chp암호화영역, 샤인-달가르노 서열을 함유하는 개시 코돈으로부터 상부 방향의 19 bp 및 일차 정지코돈으로부터 하류방향으로 104bp를 포함한다. 단편은vegII 프로모터에 의해 유전자의 발현을 허용하기에 알맞는 배열로 삽입되며 단편의 확인은 서열 분석으로 증명된다. 플라즈미드 pPr4-chp는 제한-음성 균주S.aureusRN4220으로 일렉트로포레이션에 의해 이동되고(J. Augustin and F.Gotz, FEMS Microbiol. Lett. 66: 203-208 (1990)), 양성 클론으로부터 분리되고 및S. aureusCOL(TIGR accession no. 1280)으로 일렉트로포레이트 된다. 플라즈미드의 확인은 제한 단편 분석과 삽입물의 서열화로 증명된다.
chp유전자는S. aureusCOL(TIGR accession no 1280)의 부분적으로 이용가능한 게놈성 서열을 함유하지 않는다. PCR 분석에 의해 S. aureus Newman과 1690이 양성인 반면,S. aureusCOL에는 유전자가 부족하다는 것이 증명되었다(도 6). 더우기,S. aureusCOL은 CHIPS 활성 조사에서 음성이었다(도 7).S. aureusNewman의chp유전자는 플라스미드 pPr4-chp에서 클론화되었고, 이것은 플라스미드-암호화 프로모터에 의해 암호화된 유전자의 발현을 허용한다. 플라스미드에 의한 S. aureus COL의 형질전환은,chp유전자가 CHIPS 단백질을 암호화하도록 CHIPS 조사에서 군주 양성이 되게 한다.
3.4 PCR에 의한chp유전자의 검출
여러가지S. aureus균주에chp유전자의 존재 유무를 주형 원료로서 원료 세포 추출물을 이용한 PCR에 의해 측정하였다. 새로운 아가 플레이트의 세균성 클로니를 1.5 ml 살린에 재현탁시키고, 침전시키고, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NxCl, 0.1 mg 리소스파핀/ml, 및 0.1 mg 아크로모펩티다아제/ml를 함유하는 용해 혼합물 용액 100 ㎕에 재현탁시켰다. 샘플을 30분 동안 37℃에서 배양시킨 다음, 원심분리하였다. 투명한 상징액을 100 ℃까지 5분동안 가열하고 이어서 TE 완충액(1mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8) 400 ㎕를 첨가하여 희석시켰다. 세포 추출물 1 ㎕를chp- 특이 프라이머 chp-5'(GAAAAAGAAATTAGCAACAACAG (SEQ ID NO 2))및 chp-3'(CATAAGATGATTTAGACTCTCC(SEQ ID NO 3)를 이용하는 PCR 반응에 적용하였다. 증폭은 90 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 및 72 ℃에서 1분으로 구성된 35 사이클로 수행하였다. 생성된 PCR 산물은 개시코돈의 하류방향 2 bp로 시작하고 일차 정지 코돈의 상부방향 41bp로 끝나는 chp 유전자의 90.4%를 구성한다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동시켰다. 모든 서열화, PCR, 및 재조합 DNA법을 표준 방법에 따라 실시하였다(F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y. (1990)).
3.5 CHIPS 활성 조사
S. aureus균주를 인간 호중구에 대한 형광-라벨된 fMLP의 결합에 대해 조사하여 CHIPS 활성을 분석하였다. 균주들을 IMDM 배지(Life Technologies, Paisley, UK)에서 24 시간동안 배양하고 배양 상징액을 투석하고 실시예 1.2의 기재와 같이 시험하였다.
결과
도 4는S. aureusNewman의 chp 유전자의 서열을 나타낸다. 샤인-달가르노 배열(AGGAGA)과 chp 개방형 해독틀(ORF)은 밑줄을 그엇다. 성숙 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드는 이중선으로 표시하였다.S. aureus1960 서열에서 뉴클레오티드의 벗어남은 서열 위에 표시하였다.
도 5는S. aureusNewmanchp유전자로부터 도출된 아미노산 서열을 나타낸다. CHIPS의 N-말단 35 아미노산과 매치되는 영역에 밑줄을 그엇다.S. aureus1960 단백질에서 아미노산의 벗어남은 서열 위에 표시하였다.
도 6은S. aureus균주의 게놈에서 chp 유전자의 검출을 나타낸다. chp-특이 프라이머로 얻어진 PCR 산물을 아가로스 겔에서 분리하였다. 레인 1과 2,S. aureusNewman; 레인 3과 4,S. aureusCOL; 레인 5와 6,S. aureus1690. PCR에 의해 결정된 바에 따라, 아래의 박테리아들이 chp 유전자의 존재에 대해 음성임을 발견하였다:Staphylococcus capitis,Staphylococcus haemolyticus,Staphylococcus hominis,Staphylococcus epidermidis,Strphylococcus saprophyticus,Staphyloccus warneri및Escherichia coli.
도 7은S. aureus균주의 상징액 중에서 CHIPS의 활성을 나타낸다.S. aureus1690(사각형), COL 야생형(흰 동그라미) 및 플라스미드 pPr4-chp를 갖는 COL(검은 동그라미)의 배양 상징액의 다양한 농도에서 인간 호중구에 대한 fMLP 결합 억제에 대해 시험하였다. 배경 형광을 제외한 값을 대조군 샘플(배양 상징액 없이 배양)의 %로 제공하였다.
도 8은 여러가지 임상S. aureus균주의 게놈에서 chp 유전자의 분포를 나타낸다. 박테리아를chp-특이 프라이머를 이용한 PCR로 스크린하고 아가로스 겔에 의하여 특이 400 bp 밴드의 존재를 평가하였다.S. aureus균주를 환자로부터의 분리에 맞추어 분류하였다. Lab=실험실 균주; 기타=다른 신체 분비물의 균주; CAPD=만성 외래 복막 투석 배지; 혈액=혈액배지; 상처= 상처감염; MRSA=복합 내성S. areus균주.
실시예 4
CHIPS에 대한 항체 특이성
재료 및 방법
4.1 면역화
CHIPS 단백질에 대한 항체 특이성은 정제된 천연 또는 재조합 단백질 또는 항원과 같은, 합성 펩티드로부터 유도된 서열을 이용하여 생성할 수 있다. 폴리클론성과 모노클론성 항체 모두 표준법(Harlow and Lane(1988), Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Erich, et al(1989), J. Immunol. 143: 4053-4060))을 이용하여 제조하였다. 일차 15 아미노산을 기준으로, De Haas et al., J. immunol 161:3607-3615의 기재와 같이 표준 Fmoc 화학법에 따라 합성 펩티드를 제조하였다. 펩티드를 제조지침(Pierce)에 따라 Keyhole Limpet Hemocyanin에 결합시키고 프로인트 완전 보조액으로 면역화시키고 프로인트 불완전 보조액으로 2번 추가면역 접종하였다.
면역화된 동물의 혈청의 면역글로블린 또는 혼성종양세포 배양 상징액을 Protein A, Protein G 또는 그들의 재결합물(Pharmacia)을 함유하는 시판 수지를 이용한 친화크로마토그래피로 분리하였다.
4.2 ELISA
항혈청 및 정제된 항체들(IgG)을 정제된 CHIPS 단백질 또는 유도된 합성 펩티드와의 반응성에 관하여 ELISA로 스크린하였다. 그것을 위해, 항체를 미세역가 플레이트에 농도 1 ~ 3 ㎍/ml로 4 ℃에서 18 시간동안 0.1 M 카보네이트 완충액 pH9.6 에서 코팅하였다. 세척 후, 사용되지 않은 플라스틱을 37℃에서 1 시간동안 PBS/Tween 20(0.05%)중의 4% BSA로 블록하였다. 항체를 2% BSA를 함유하는PBS/Tween중에서 연속 희석 시키고 37℃에서 1 시간동안 배양시켰다. 결합된 항체들은 1/5000 희석된 페옥시다제 라벨된, 폴리클론성 항체에 대한 염소 항-토끼 IgG 또는 단일클론성 항체에 대한 염소 항-마우스 IgG인(모두 Aouthern Biotechnology, Associates, Inc.) 이차 항체로 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 반응을 기질로서 TMB로 전개하고 광학밀도(OD)를 450 nm에서 측정하였다.
결과
도 9는 CHIPS의 일차 15 N-말단 아미노산으로 이루어진 합성 펩티드(항-CHIPS- 펩티드)로 면역화된 토끼의 다클론성 IgG의 특이 결합을 나타낸다. 높은 OD450은 펩티드를 갖는 토끼 항-CHIPS-펩티드(도 9A) 뿐만 아니라 웰에 코팅된 정제된 CHIPS 단백질(도 9B)를 나타낸다. 효과는 농도에 의존하며, IgG의 최소농도 30 ng/ml에서 이미 의미를 갖는다.
정상 토끼 IgG의 비-면역화된 풀은 오직 높은 항체 농도에서만, 특히 정제된 CHIPS가 ELISA 플레이트에 코팅된 경우, 약간의 배경 결합을 제공한다.
표 2는 정제된 CHIPS 단백질로 면역화된 마이스로부터 유도된 선택된 혼성종양세포 클론의 특이 결합을 나타낸다.
| 클론 명칭 | OD450 |
| 배경 | 0.056 |
| 25-1 | 0.973 |
| 25-2 | 0.985 |
| 25-3 | 1.286 |
| 29-1 | 1.847 |
| 29-2 | 1.433 |
| 29-3 | 1.564 |
| 29-4 | 2.123 |
실시예 5
주화성 조사
본 발명의 (폴리)펩티드와 비-(폴리)펩티드의 CHIPS 활성은 예를 들면 다음의 조사로 측정할 수 있다.
직접적인 이동을 결정하기 위해, 3 ㎛ 폴리카보네이트막으로 분리된 상부 구획과 하부 구획으로 이루어진 트란스웰 시스템(Costar)이 사용된다. 과립구를 BCECF(2-카르복시에틸-5-(및 -6-)카르복시플루오레신; 분자 프로브), 세포의 세포질에 도입되는 형광 라벨로 라벨화하였다. 세포(5x106)를 3 μM BCECF-AM(2-카르복시에틸-5-(및 -6-)-카르복시플루오레신의 아세토메틸 에테르)로 22℃에서 20분 동안 배양하고, 그 다음 세번 세척하고 RPMI/HSA중에서 5x106세포/ml로 재현탁하였다. 세포 100 ㎕와 필요한 양의 CHIPS 단백질을 트란스웰 시스템의 상부구획에 도입시키고 전체를 표준 24-웰 미세역가 플레이트(Costar)의 웰에 현탁시켰다. 각 웰은 시험용 화학유인제와 함께 또는 화학유인제 없이 RPMI/HSA 600 ㎕를 함유하였다. 화학유인제는: 재조합체 C5a(Sigma), 재조합체 인터로킨-8(Pepro Tech), 플레이틀렛 활성 인자-16(PAF-16; Calbiochem) 또는 fMLP(Sigma)이다. 37 ℃에서 60분동안 배양 후, 웰로부터 트란스웰 용기를 옮기고 CyoFluorII 중에서 형광에 대해 미세적정 플레이트를 분석하였다(PerSeptiveBiosystems). 형광도는 막을 통해 이동한 과립구의 수를 직접적으로 측정하며 세포의 첨가된 수의 형광의 백분률로 표시된다.
결과
도 10은 완충액 처리된 대조 세포의 백분률로 타나낸, 정제된 CHIPS에 의해 fMLP를 향한 호중구 이동 억제의 농도 의존을 나타낸다.
실시예 6
E.coli에서 CHIPS 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 생성
CHIPS를E.coil중에서 생성하였고S.aureus로부터의 CHIPS를 자연적으로 나타낼 정도로 생물학적으로 활성인 것을 발견하였다.
재조합 CHIPS의 생성을 위해 사용되는 생성법은 CHIPS 활성을 갖는 다른 (폴리)펩티드들을 사용할 수 있다. 이 생성법을 아래에 설명하였다.
S.aureus의 CHIPS에 대한 DNA 서열을 종래의 분자 생물학법을 이용한E.coli숙주세포와 경쟁하는 CHIPSs의 효율적인 발현을 가능하게하는 알맞는 벡터로 암호화하였다. 사용전략은 E. coli의 세포질의 N-말단에서 제거가능한 HIS-태그에 연결된 완전 CHIPS 단백질의 발현을 가능하게 한다. trc 발현 시스템(pTrcHIS B 벡터; Invitrogen)이E. coli에서 비-독성 단백질의 발현을 가능하도록 사용되었다. 이 시스템은 복합클로닝 벡터를 갖는 어느E.coli균주에서 높은 수준의 조절된 발현을 위해 trc 프로모터를 사용한다. 상기 벡터는 신속한 정제를 위해 N-말단 폴리히스티딘(6xHis) 태그, 항-Xpress 항체를 이용한 용이한 검출을 위한 Xpress 에피토프 및 용해 태그를 제거하기 위한 엔터로키나제 절단 부위를 갖는다.
S. aureusNewman 염색체 DNA를 무딘 말단 PCR 산물을 낳는 Pwo- DNA 폴리머라제를 이용하는 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 사용된 프라이머는 (정확히CHIPS(F)의 일차 아미노산으로 시작하는) CHIPS-TTT와 (정지 코돈과 EcoRI-부위를 갖는)CHIPS-TAA이다.
PCR 산물은 EcoRI와 BamHI를 갖는 pTrcHIS B 벡터로 분해된다. 5' 돌출은 엔테로키나아제(EK)가 단백질을 분해하는 정확한 BamHI 부위 무딘 말단을 제조하도록 S1-뉴클레아제로 제거되었다. 그 다음, 상기 벡터는 EcoRI로 소화되고 소화된 PCR 산물로 결찰되었다.
벡터의 형질전환을 위해, TOP-10E.coli를 이용하는 표준 칼슘 침전법(F.M. Ausubel et al., 1990, Current Protocols on Molecualr Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y.)을 이용하였다(InVitroGen). 클론들을 플레이트를 갖는 앰피실린에서 스크린하고 CHIPS 유전자의 적당한 결찰은 분리된 플라스미드 (clone-29)의 서열화에 의해 확인하였다.
CHIPS 유전자의 발현 후,E.coli박테리아를 용해시키고 단백질 혼합물을 니켈-이온 친화칼럼(ProBond) 위에 적용하였다. 그러므로, LB 배지 + 50 ㎍/ml 앰피실린 중의 클론 29의 배양은 37 ℃에서 4시간 동안 1 mM IPTG로 개시된다. 박테리아를 원심분리하고 펠렛을 냉각 인산염 완충액 pH 7.8중에 재현탁시키고 -20 ℃에서 보관하였다. 세포 용해를 위해, 얼음에서 15분 동안 리소좀(100 ㎍/ml)을 첨가하고, 튜브를 고주파분해하고, 액체 질소중에 냉동시키고 37 ℃의 수조에서 해동시켰다. 상기의 고주파분해/냉동/해동의 순환을 3회 반복하였다.
그 다음, RNase와 DNase(5㎕/ml)를 30분 동안 얼음중에서 첨가하였다. 혼합물을 4 ℃에서 30 분 동안 3000 g에서 원심분리하였다. 최종 용해질을 냉각 인산염완충액 pH 7.8과 1:1로 희석하고 장전된 니켈칼럼을 통해 흘렸다. 칼럼을 인산염 완충액 pH 7.8로, 인산염 완충액 pH 6.0 및 인산염 완충액 pH 5.3으로 세척하였다. 결합된 CHIPS를 pH 6.0 인산염 완충액중에서 이미다졸 500 mM로 용출시켰다.
HIS-태그를 엔테로키나제 절단에 의해 제거하고, EK-Away 엔테로키나제 친화수지로 프로테아제를 제거하였다. 그러므로, 용출물을 냉각 침지 완충액(50 mM Tris-HCl, 1mM CaCl2와 0.1 % Tween-20, pH8.0)에서 하루밤 동안 투석하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과하고 0.175 ㎕ 엔테로키나아제/ml HIS-CHIPS 산물로 소화시켰다. 상기 양의 엔테로키나아제는 회분-의존이며 산물이 분해되는 것을 막기위해 부분적으로 소화되었다. 소화된 산물을 인산염 완충액 pH7.8에 대해 투석시키고 새로운 니켈 칼럼을 통과시켜 비절단된 His-태그 CHIPS(HIS-CHIPS)을 제거하였다. 소화안된 HIS-CHIPS는 잠시의 소화 순회 동안 니켈 칼럼으로부터 용출될 수 있다. 니켈 칼럼은 최종적으로 50 mM EDTA, 0.5M NaOH, 5 mg/ml NiCl2, 물로 세척되고 20 % 에탄올 중에 보관된다.
HIS-CHIPS의 분리 및 소화의 모든 단계는 16.5% Tris-Tricine Ready gel(BipRad) 중의 SDS-PAGD로 확인된다. 샘플들을 샘플 완충액(200 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 40 % 글리세롤, 0,04% 코마시)과 1:1로 혼합하고, 5분 동안 가열하고 겔 위에 장전하였다.
발현된 단백질의 HIS-태그는 항-X-프레스 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 HIS-CHIPS 산물을 검출할 수 있는 X-프레스 에피토프를 함유한다. 그 밖에, CHIPS는 특별히 폴리클로날 래빗 항-CHIPS 펩티드 항체로 검출된다. 단백질들은 니트로셀룰로스 막으로 이동되고 PBS 중의 4% 젤라틴으로 블록되며 항체와 적당한 이차 퍼옥시다제 라벨된 켄쥬게이트로 프로브된다(Harlow & lane, 1988, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratiry).
호중구 위의 fMLP(FPR)과 C5a(C5aR)의 수용체의 발현에 대한 재조합 CHIPS(rCHIPS)의 농도에 따른 억제를 다음과 같이 설명하였다. 세포들을 다양한 농도의 rCHIPS로 15분동안 실온에서 배양하고, 얼음에 놓고, 그 다음 BODIPY-라벨된 fMLP(실시예 1.2 참조) 또는 이차 FITC-라벨된 염소-항-마우스 Ig(DAKO, 1:30)와 공동으로 C5aR(클론 5 S/1, SeroTec)를 향하는 모노크로날 항체로 프로브하였다. 최종적으로, 세포들을 세척하고 FACScan에서 5000 호중구의 형광을 측정함으로써 수용체 발현을 분석하였다. 수용체 발현은 완충액 처리된 세포들과 비교되었고 상대값으로 표시되었다.
호중구에서 fMLP와 C5a에 의해 유도되는 세포내 유리 칼슘 방출의 약화에 대한 농도 의존성을 다음과 같이 시험하였다. 세포들을 칼슘 특이 세포내 프로브(Fluo-3 아세트옥시메틸(AM)에스테르; 분자 프로브)로 장전하고 여러 농도의 rCHPIS로 15분동안 실온에서 배양시켰다. 각 샘플로부터, 2000 세포를 측정함으로써 FACScan으로 초기 형광값을 결정하였다. 그 다음, 자극을 추가하고((10-9M fMLP 또는 10-10M rC5a), 정확히 자극 투여 15초 후, 동일 샘플로부터 형광 세기를 측정하였다(양쪽 길항근에 대해 최적 시간점). 호중구에 fMLP 또는 C5a를 장전하는 것은 유리 세포내 칼슘 농도의 신속하고 단기적인 증가를 개시하며 이것은 Fluo-3 형광시그널의 증가로 측정된다. 각각의 활성화된 샘플로부터, 초기 기본적인 형광값을 제하였다. 결과는 fMLP 또는 C5a로 자극된 완충액 처리 세포의 백분률로 나타내었다.
결과
도 11은 최종 정제된 재조합 CHIPS(rCHIPS)을 나타내는 SDS-PAGE의 대표적인 상이다. 두개의 두개의 측면 레인(1과 3)은 추가의 히스티딘 태그로 CHIPS 단백질을 발생시키는 백터에 의해 암호화되는 완전 재조합 산물과 엔테로키나아제 분열 부위를 나타낸다. 이것은 외관 분자량 21kDa 의 단백질을 암호화하는 반면, 정제된 엔테로키나아제 처리된 CHIPS는 외관 분자량 17kDa에서 작동하며,S.aureus로부터 천연 정제된 CHIPS에서 똑같이 나타난다(실시예 1.1 및 도 2 참조). 정제된 rCHIPS는 MALDITOF MS로 특징되며 분자질량 14.12250을 나타내는데, 이것은 CHIPS 서열을 기준으로 예상되는 분자 질량 14.12217과 비교하여 매우 비슷하다.
도 12 및 13은 생물학적 효과를 나타낸다.
실시예 7
합성 CHIPS 단백질의 제조
본 실시예는 천연 및 재조합 CHIPS와 정확히 동일한 활성을 갖는 합성 폴리펩티드를 제조할 수 있는 본 발명에 따라 설명되었다. 제조방법은 다음과 같다.
FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLNTPLAEDR KNVELLGKMYKTYFFKKGESKSSYVINGPGKTNEYAY 펩티드를 9-플루오레닐메틸옥시카보닐- 을 갖는 TGT 수지와 그곳에 연결된 및 O t-but 보호된 티로신[FmocTyr(t-but)]을 펩티드 합성기로 운송하고, 디메틸포름아미드(DMF; 18 ml)중의 피페리딘의 용액(12ml)를 수지에 첨가하여 합성하였다. 용액을 1 시간 동안 회전시키고 수지를 DMF(3x 30 ml), 디클로로메탄(DCM; 3 x 30 ml)으로 세척하고 진공하에 5분동안 건조시켰다. 아미노산의 잔류물은 사용한 표준 Fmoc 화학을 이용하여 수집하였다. 단백질 수지를 트리플루오로아세트산/테트라이소프로필실란/H2O [90:8:2 v/v/v]의 용액으로 처리하여 단백질을 절단하였다. 원 생성물(2.1 grm)을 에테르 침전과 고성능 액체 크로마토그래피로 정화하여 분리하였다. 정제된 생성물은 MALDI MS로 특성을 나타내었다.
유사 방법을 기재하고 있는 참조문헌은 다음과 같다:
E.Bayer et al., in:Peptides, Chemistry, Structure and Biology. Proceedings of the 13th American Peptide sumposium. RS hodeges and JA Smith(eds) ESCOM, Leiden, (1994) p. 156.
G Grubler er al., in: Innovation and perspectives in Solid Phase Synthesis 3rd International Symposium. RE Pron (ed) Mayflower Worldwide, Birmingham(1994) p.517.
실시예 8
CHIPS의 추정 수용체에 대한 CHIPS 결합의 경쟁
재료 및 방법
8.1 재조합 CHIPS4-121의 제조
재조합 CHIPS를 갖는 플라즈미드를 함유하는 여러E. coli클로니를 서열화함에 의해 chp 유전자의 바람직한 삽입에 대해 분석하였을 때, 여러 불완전 삽입이 발견되었다. 완전 HIS-태그, 엔테로키나아제 절단부위 및 처음 세개의 아미노산이 없는 CHIPS 단백질(CHIPS4-121; 클론 19)를 함유하는 그들 중 하나를 추가로 증식시키고 완전 CHIPS에 대해 설명된 바와 같이 정제하였다(실시예 6 참조).
8.2 CHIPS-FITC 결합과의 경쟁
Falcon 투브에 재조합 CHIPS 또는 CHIPS4-121의 일련의 희석물 5 ㎕를 준비하고 CHIPS-FITC(10 ㎕/m; 실시예 2 참조) 5 ㎕와 혼합하였다. 그 다음, 분리된 호중구 50 ㎕를 5x106세포/ml에서 첨가하고 30 분 동안 얼음에서 배양하였다. 세포들을 세척하고 실시예 2의 기재와 같이 흐름세포분석법으로 CHIPS-FITC 결합에 대해 분석하였다.
결과
도 14는 완전 재조합 CHIPS 뿐만 아니라 재조합 성숙 CHIPS4-121모두에 의한 CHIPS-FITC 결합의 농도 억제를 나타낸다. 두 제제는 동일 유효농도에서 유사한 억제 패턴을 나타낸다.
Claims (53)
- CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산분자로서, 상기 뉴클레오티드 서열은a)도 4에 나타낸 서열(SEQ ID NO 4)의 적어도 일부로 이루어진 뉴클레오티드 서열;b)CHIPS 활성을 갖고 도 5에 나타낸 아미노산 서열(SEQ ID NO 5)을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;c)CHIPS 활성을 갖고 도 5에 나타낸 아미노산 서열(SEQ ID NO 5)의 적어도 일부를 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;d) 뉴클레오티드 서열 a), b), 또는 c) 중 어느 하나와 적어도 40 % 동일한 뉴클레오티드 서열;e) 뉴클레오티드 서열 a), b), c) 또는 d) 중 어느 하나와 스트린전트 조건에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열; 및f) 뉴클레오티드 서열 a), b), c), d) 또는 e) 중 어느 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 것인 분리된 핵산분자.
- 제 1항에 있어서, 제 1항에서 a)로 정의된 상기 핵산 서열의 일부가 도 4(SEQ ID NO 4)의 뉴클레오티드 1 내지 490에 상응하는 것인 분리된 핵산분자.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 제 1항에서 a)로 정의된 상기 핵산 서열의 일부가 도 4(SEQ ID NO 4)의 뉴클레오티드 41 내지 490에 상응하는 것인 분리된 핵산분자.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1항에서 a)로 정의된 상기 핵산 서열의 일부가 도 4(SEQ ID NO 4)의 뉴클레오티드 125 내지 490에 상응하는 것인 분리된 핵산분자.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1항에서 d)로 정의된 상기 뉴클레오티드 서열이 상기 뉴클레오티드 서열 a), b) 또는 c)중 어느 하나와 적어도 50%, 바람직하기는 적어도 60 %, 더욱 바람직하기는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하기는 적어도 80%, 가장 바람직하기는 적어도 90% 동일한 것인 분리된 핵산분자.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스트린전트 조건이 42 ℃에서 5xSCC 중에서 하루밤 동안 혼성화 및 65 ℃에서 0.1xSSC로 세척하는 것으로 구성되는 것인 분리된 핵산분자.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제 1에서 c)로 정의된 상기 아미노산 서열의 적어도 일부가 단독으로 또는 상기 아미노산 서열의 다른 영역과 함께 생물학적 활성을 가져오는 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드의 영역을 구성하는 분리된 핵산분자.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산이 DNA, RNA 또는 cDNA인 분리된 핵산분자.
- 적어도 하나의, 제 1항 내지 제 8항에 따른 분리된 핵산분자를 포함하는 재조합 백터.
- 적어도 하나의, 제 1항 내지 제 8항에 따른 분리된 핵산분자를 벡터로 삽입시키는 것으로 이루어지는 재조합 백터의 제조방법.
- 적어도 하나의, 제 1항 내지 제 8항에 따른 분리된 핵산분자를 포함하는 박테리오파아지.
- 적어도 하나의, 제 1항 내지 제 8항에 따른 분리된 핵산분자, 제 9항에 따른 벡터 또는 제 11항에 따른 박테리오파아지를 포함하는 재조합 숙주.
- 제 12항에 있어서, 상기 숙주가 원핵동물, 원생동물, 진균류, 동물 또는 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 숙주.
- 제 12 항 또는 제 13항에 있어서, 상기 숙주가Escherichia coli,Bacillus subtilis,Staphylococcus aureus의 박테리아,Saccharomyces cerevisiae,Pichia pastoris,Candida의 이스트,Drosophila계 및 Baculovirus 계의 곤충 세포들, 원숭이 COS 세포, 햄스터 CHO, 햄스터 BHK 세포, 인간 293, 인간 3T3, 인간 HeLa, 인간 U937, 인간 Jurkat 세포, 마우스 L 세포의 포유류 세포 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 숙주.
- CHIPS 활성을 갖는 재조합 (폴리)펩티드의 제조방법으로, 상기 (폴리)펩티드가 발현되는 조건하에서 제 12항 내지 제 14항중 어느 하나의 항의 재조합 숙주를 배양하고, 상기 (폴리)펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 숙주가Escherichia coli세포인 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 숙주가Staphylococcus aureus세포인 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기Staphylococcus aureus세포가 이미 CHIPS 활성을 갖는 내인성 단백질을 생산하는 균주로부터 유래되는 방법.
- CHIPS 활성을 갖는 합성 (폴리)펩티드의 제조방법으로, 제 1항 내지 제 8항에 따른 핵산분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 도출하고, 상기 아미노산 서열을 갖는 (폴리)펩티드를 합성적으로 제조하는 것으로 이루어진 방법.
- 제 15항 내지 제 19항 중 어느 하나의 방법으로 제조될 수 있는, CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드.
- 제 20항에 있어서, 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 (폴리)펩티드.
- 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 급성 및 만성 염증반응과 HIV 감염의 치료에 사용하기 위한 (폴리)펩티드.
- 제 20항 또는 제21항에 있어서, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 허혈뇌졸증, 외상적 뇌손상, 심각한 감염, 심근경색증, 뇌졸증, 혈관수술, 궤양성 대장염, 크론병, 만성 폐동맥 폐쇄 질환(COPD), 류마티스성 관절염, 피부병, 다발성경화증, 알츠하이머병, 동맥경화증, 반복적인 균주손상(RSI), 급성 이식 거부, 화상, 급성 반응성 관절염, 췌장염, 맥관염, 사구체신염, 통풍, 동창 및 수막염의 치료에 사용하기 위한 (폴리)펩티드.
- 진단, 예방 또는 치료용 치료학적 제제의 제조를 위한 제 20항의 (폴리)펩티드의 용도.
- 제 24항에 있어서, 급성 및 만성 염증성 반응 및 HIV 감염의 치료를 위한 용도.
- 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 허혈뇌졸증, 외상적 뇌손상, 심각한 감염, 심근경색증, 뇌졸증, 혈관수술, 궤양성 대장염, 크론병, 만성 폐동맥 폐쇄 질환(COPD), 류마티스성 관절염, 피부병, 다발성경화증, 알츠하이머병, 동맥경화증, 반복적인 균주손상(RSI), 급성 이식 거부, 화상, 급성 반응성 관절염, 췌장염, 맥관염, 사구체신염, 통풍, 동창 및 수막염의 치료를 위한 용도.
- 적당한 부형제 및 제 20항의 (폴리)펩티드로 이루어진 치료학적 조성물.
- 제 27항에 있어서, 급성 및 만성 염증성 반응 및 HIV 감염의 치료를 위한 조성물.
- 제 27항에 있어서, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 허혈뇌졸증, 외상적 뇌손상, 심각한 감염, 심근경색증, 뇌졸증, 혈관수술, 궤양성 대장염, 크론병, 만성 폐동맥 폐쇄 질환(COPD), 류마티스성 관절염, 피부병, 다발성경화증, 알츠하이머병,동맥경화증, 반복적인 균주손상(RSI), 급성 이식 거부, 화상, 급성 반응성 관절염, 췌장염, 맥관염, 사구체신염, 통풍, 동창 및 수막염의 치료를 위한 조성물.
- 제 20항의 (폴리)펩티드에 특이적으로 배향된 항체 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편.
- 제 30항에 있어서, 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편.
- 제 30항 또는 제 31항에 있어서, Staphylococcus 감염의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편.
- 진단, 예방 또는 치료용 치료학적 제제를 제조하기 위한 제 30항의 항체의 용도.
- 실시예 8의 기재와 같이 CHIPS 결합 조사에서 CHIPS와 경쟁항 수 있는 능력으로 특징되는 CHIPS-기재, CHIPS-수용체 블로킹 분자.
- 제 34항에 있어서, 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 CHIPS-기재, CHIPS-수용체 블로킹 분자.
- 제 34 또는 제 35항에 있어서, Staphylococcus 감염의 치료에 사용하기 위한 CHIPS-기재, CHIPS-수용체 블로킹 분자.
- 진단, 예방 또는 치료용 치료학적 제제를 제조하기 위한 제 34항의 CHIPS-기재, CHIPS-수용체 블로킹 분자의 용도.
- 제 33항 또는 제 37항에 있어서, Staphylococcus 감염의 치료를 위한 용도.
- 적당한 부형제 및 하나 이상의 제 30항의 항체 및/또는 그들의 생물학적으로 활성인 단편 및/또는 하나 이상의 제 34항의 CHIPS-기재, CHIPS-수용체 블로킹 분자로 이루어진 치료학적 조성물.
- 유전자 치료에 사용하기 위한 분리된 핵산분자.
- 제 20항의 (폴리)펩티드를 치료에 효과적인 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 염증 및 AIDS을 앓는 환자를 치료하는 방법.
- 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 핵산분자를 치료에 효과적인 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 염증 및 AIDS을 앓는 환자를 유전자 치료학적으로 치료하는 방법.
- 제 30항에 따른 항체 및/또는 생물학적으로 활성인 그의 단편 및/또는 하나 이상의 제 34항의 CHIPS-기재, CHIPS-수용체 블로킹 분자를 효과적인 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 Staphylococcus 감염을 앓는 환자를 치료하는 방법.
- CHIPS 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 유기체로부터 분리하는 방법으로, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 핵산분자에 기초한 프로브로 상기 유기체의 게놈성 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 양성 클론을 분리하고, 그리고 상기 양성 클론이 CHIPS 활성을 나타내는지 여부를 시험하는 것으로 이루어지는 방법.
- CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 확인하는 방법으로, 도 4에 나타낸 서열(SEQ ID NO 4)을 데이타베이스에 함유된 핵산 서열 정보와 비교하는 것으로 이루어지는 방법.
- CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드의 아미노산 서열을 확인하는 방법으로, 도 5에 나타낸 서열(SEQ ID NO 5)을 데이타베이스에 함유된 핵산 서열 정보와 비교하는 것으로 이루어지는 방법.
- 급성 및 만성 염증 반응 및 HIV 감염의 치료용 약제로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 핵산분자가 잠복된 미생물.
- 제 47항에 있어서, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 허혈뇌졸증, 외상적 뇌손상, 심각한 감염, 심근경색증, 뇌졸증, 혈관수술, 궤양성 대장염, 크론병, 만성 폐동맥 폐쇄 질환(COPD), 류마티스성 관절염, 피부병, 다발성경화증, 알츠하이머병, 동맥경화증, 반복적인 균주손상(RSI), 급성 이식 거부, 화상, 급성 반응성 관절염, 췌장염, 맥관염, 사구체신염, 통풍, 동창 및 수막염을 치료하기 위한 미생물.
- CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드(들)의 제조방법으로, 내인성 주화성 억제 (폴리)펩티드(들)를 생산하는 야생형, 비-재조합체,Staphylococcus균주를 배양하고 그리고 동일물을 회수하는 것으로 이루어지는 방법.
- 도 5에 나타낸 아미노산 서열(SEQ ID NO 5)과 적어도 40% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드.
- 도 5에 나타낸 아미노산 서열(SEQ ID NO 5)의 하나 이상의 부분과 동일한 아미노산 서열을 가지며 CHIPS 활성을 갖는 (폴리)펩티드.
- 제 50항 또는 제 51항에 있어서, CHIPS 결합에 대한 경쟁물의 확인에 사용하기 위한 (폴리)펩티드.
- CHIPS 유전자의 감염성S.aureus에 존재에 대한Staphylococcus aureus로 감염된 환자를 진단하는데 사용하기 위한 진단용 시험으로, 상기 시험은 프라이머가 도 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO 4)를 기준으로 고안된 PCR 시험인 진단시험.
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