PT1096924E - Inibidores de actividade proteossómica para estimulação de crescimento do cabelo - Google Patents

Description

ΕΡ 1 096 924 /PT

DESCRIÇÃO "Inibidores da actividade proteossómica para estimulação de crescimento do cabelo"

Campo Técnico O presente invento refere-se a composições e métodos para utilização no aumento da densidade e do crescimento de cabelo. Mais especificamente, o presente invento refere-se à utilização de inibidores da actividade proteossómica para este fim.

Antecedentes do Invento

Os inibidores da actividade proteossómica, e até certo ponto os inibidores da actividade de NF—KB, possuem dois efeitos fisiológicos importantes. Primeiro, são capazes de aumentar a formação de osso e são assim úteis para tratamento de distúrbios ósseos. Segundo, estimulam a produção de foliculos capilares e são assim úteis na estimulação do crescimento capilar, incluindo da densidade capilar, em indivíduos onde isto é desejável.

Efeito no Osso O osso está sujeito a constante desagregação e nova síntese num processo complexo mediado pelos osteoblastos, que produzem osso novo, e os osteoclastos, que destroem osso. As actividades destas células são reguladas por um grande número de citocinas e factores de crescimento, muitos dos quais foram agora identificados e clonados.

Existe uma pletora de condições que se caracterizam pela necessidade de aumento da formação de osso ou da inibição da reabsorção óssea. Talvez a mais óbvia seja o caso das fracturas ósseas, onde seria desejável estimular o crescimento ósseo e apressar e completar a reparação do osso. Os agentes que aumentam a formação de osso seriam também úteis em procedimentos de reconstrução facial. Outras condições de défice ósseo incluem defeitos de segmentos ósseos, doença periodontal, doença óssea metastática, doença 2

ΕΡ 1 096 924 /PT óssea osteolítica e condições onde a reparação do tecido conjuntivo seria benéfica, tais como cicatrização ou regeneração de defeitos ou ferimentos na cartilagem. Também de grande significado é a condição crónica de osteoporose, incluindo a osteoporose relacionada com a idade e a osteoporose associada ao estado hormonal pós-menopausa. Outras condições caracterizadas pela necessidade de crescimento ósseo incluem o hiperparatiroidismo primário e secundário, a osteoporose por inactividade, a osteoporose relacionada com diabetes e a osteoporose relacionada com glucocorticóides.

Actualmente não existem abordagens farmacêuticas satisfatórias para a gestão de qualquer uma destas condições. As fracturas ósseas são ainda tratadas exclusivamente utilizando moldes de gesso, aparelhos, dispositivos de fixação e outros meios estritamente mecânicos. Posterior deterioração óssea associada a osteoporose pós-menopausa tem sido tratada com estrogénios ou bisfosfonatos, que podem ter desvantagens para alguns indivíduos. Embora tenham sido tentadas várias abordagens, tal como mais discutido abaixo, permanece a necessidade de adições ao repertório de agentes que podem ser utilizados para tratar estas condições. O tratamento de distúrbios ósseos ou de outros distúrbios esqueléticos, tais como os associados a cartilagem, pode ser alcançado através do aumento da formação de osso ou da inibição da reabsorção óssea ou ambos. Foram sugeridas várias abordagens que se referem à formação de osso. 0 tecido ósseo é uma excelente fonte de factores que têm a capacidade de estimular as células ósseas. Assim, extractos de tecido ósseo bovino obtido em matadouros contêm não só proteínas estruturais que são responsáveis pela manutenção da integridade estrutural do osso, como também factores de crescimento do osso biologicamente activos que podem estimular as células ósseas a proliferar. Entre estes últimos factores estão o factor de crescimento transformante β, os factores de crescimento de ligação à heparina (p. ex., o factor de crescimento de fibroblastos ácido e básico), os factores de crescimento semelhantes à insulina (p. ex., o 3 ΕΡ 1 096 924 /PT factor de crescimento semelhante à insulina I e o factor de crescimento semelhante à insulina II) e uma família de proteínas recentemente descrita designadas proteínas morfogenéticas do osso (BMP). Todos estes factores de crescimento têm efeitos noutros tipos de células, bem como nas células ósseas.

As BMP são novos factores na alargada superfamília dos factores de crescimento transf ormantes β. A BMP 2 e a BMP4 recombinantes podem induzir formação de osso novo quando são injectadas localmente nos tecidos subcutâneos de ratos (Wozney, J. Molec. Reprod. Dev. 32: 160-67, 1992). Estes factores são expressos por osteoblastos normais à medida que se diferenciam e foi mostrado que estimulam a diferenciação dos osteoblastos e a formação de nódulos ósseos in vitro bem como a formação de osso in vivo (Harris, S. et al., J. Bone Miner. Res. 9: 855-63, 1994). Esta última propriedade sugere uma potencial utilidade como agentes terapêuticos em doenças que resultam em perda óssea.

As células que são responsáveis pela formação de osso são os osteoblastos. À medida que os osteoblastos se diferenciam a partir de precursores em células formadoras de osso maduras, expressam e segregam várias enzimas e proteínas estruturais da matriz óssea, incluindo colagénio de Tipo 1, osteocalcina, osteopontina e fosfatase alcalina. Sintetizam também vários péptidos reguladores do crescimento que são armazenados na matriz óssea e são presumivelmente responsáveis pela formação de osso normal. Estes péptidos reguladores do crescimento incluem as BMP (Harris, S. et al., 1994, supra). Em estudos de culturas primárias de osteoblastos da abóbada craniana fetal de rato, as BMP 1, 2, 3, 4 e 6 são expressas por células em cultura antes da formação de nódulos ósseos mineralizados (Harris, S. et al., 1994, supra). Tal como a fosfatase alcalina, a osteocalcina e a osteopontina, as BMP são expressas por osteoblastos em cultura à medida que estes proliferam e se diferenciam.

Embora as BMP sejam potentes estimuladores da formação de osso in vitro e in vivo, existem desvantagens quanto à sua utilização como agentes terapêuticos para aumentar a cicatrização óssea. Foram identificados receptores para as 4 ΕΡ 1 096 924 /PT proteínas morfogenéticas do osso em muitos tecidos e as próprias BMP são expressas numa ampla variedade de tecidos em padrões temporais e espaciais específicos. Isto sugere que as BMP podem ter efeitos em muitos tecidos para além do osso, potencialmente limitando a sua utilidade como agentes terapêuticos quando administradas sistemicamente. Para além disso, uma vez que são péptidos, estas teriam de ser administradas através de injecção. Estas desvantagens impõem graves limitações ao desenvolvimento de BMP como agentes terapêuticos.

Os fluoretos, também sugeridos para este fim, têm um modo de acção que pode estar relacionado com a fosforilação da tirosina dos receptores dos factores de crescimento em osteoblastos, tal como descrito, por exemplo, em Burgener et al., J. Bone Min. Res. 10: 164-171, 1995, mas a administração de fluoretos está associada a maior fragilidade óssea, presumivelmente devido a efeitos na mineralização óssea.

Moléculas pequenas que são capazes de estimular a formação óssea foram divulgadas nos pedidos PCT WO 98/17267 publicado a 30 de Abril de 1998, WO 97/15308 publicado a 1 de Maio de 1997 e WO 97/48694 publicado a 24 de Dezembro de 1997. Estes agentes compreendem geralmente dois sistemas aromáticos espacialmente separados por um ligante. Adicionalmente, o pedido PCT WO 98/25460 publicado a 18 de Junho de 1998 divulga a utilização da classe de compostos conhecidos como estatinas no aumento da formação óssea. O pedido U.S. N° de série 09/096631 apresentado a 12 de Junho de 1998 é dirigido a compostos para estimulação do crescimento ósseo que são geralmente inibidores da via dos isoprenóides. O conteúdo deste pedido, bem como o dos pedidos PCT citados acima, são deste modo incorporados por referência.

Outros agentes parecem operar através da prevenção da reabsorção óssea. Assim, a Patente U.S. N° 5280040 divulga compostos descritos como úteis no tratamento de osteoporose. Estes compostos putativamente alcançam este resultado através da prevenção da reabsorção óssea. 5

ΕΡ 1 096 924 /PT

Wang, G-J. et al., J. Formos. Med. Assoe. 94: 589-592, 1995 relatam que certos agentes de eliminação de lipidos, exemplificados pela lovastatina e bezafibrato, eram capazes de inibir a reabsorção óssea resultante da administração de esteróides em coelhos. Não houve qualquer efeito na formação óssea por estes dois compostos na ausência de tratamento de esteróides. O mecanismo de inibição da reabsorção óssea observada na presença de esteróides (e o mecanismo do efeito dos esteróides no osso per se) é tido como sendo desconhecido.

Um resumo intitulado "Lovastatin Prevents Steroid-Induced Adipogenesis and Osteoporosis" por Cui, Q. et al., surgiu no "Reports of the ASBMR, 18th Annual Meeting" (Setembro de 1996), J. Bone Mineral. Res. 11 (Sl): S510, 1996, que relata que a lovastatina diminuiu as vesículas de triglicéridos que se acumulavam quando células osteoprogenitoras clonadas a partir do estroma da medula óssea de galinhas eram tratadas em cultura com dexametasona. Foi relatado que a lovastatina diminui a expressão de certos ARNm e permite que as células mantenham o fenótipo osteogénico após tratamento com dexametasona, e as galinhas que sofreram perda óssea na cabeça do fémur em resultado do tratamento com dexametasona melhoraram através do tratamento com lovastatina.

Estes dados são, no entanto, contrários aos relatos de que a dexametasona e outros indutores, tais como BMP, induzem diferenciação osteoblástica e estimulam o ARNm da osteocalcina (Bellows, C.G. et al., Develop. Biol. 140: 132-38, 1990; Rickard, D.J., et al., Develop. Biol. 161: 218-28, 1994). Adicionalmente, Ducy, P. et al., Nature 382: 448-52, 1996, relataram recentemente que ratinhos deficientes em osteocalcina exibem um fenótipo marcado por aumento da formação óssea e ossos de melhor qualidade funcional, sem impedimento da reabsorção óssea. Ducy et al. afirmam que os seus dados sugerem que os antagonistas da osteocalcina podem ter utilização terapêutica em conjunto com terapia de substituição de estrogénios (para prevenção ou tratamento da osteoporose). 6

ΕΡ 1 096 924 /PT

Foi também mostrado que a lovastatina inibe a activação de NF-KB induzida por lipopolissacárido em células mesangiais humanas. Guijaro, C. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 11(6): 990-996, 1996. E o Seu Efeito no Crescimento de Cabelo

Os distúrbios de crescimento de cabelo humano incluem a calvície padrão masculina, alopecia areata, alopecia induzida por quimioterapia de cancro e enfraquecimento do cabelo associado ao envelhecimento. Estas condições são pouco compreendidas, mas contudo vulgares e perturbadoras, uma vez que o cabelo é um importante factor na comunicação social e sexual humana. A regulação e crescimento dos foliculos capilares ainda não são bem compreendidos, mas representam processos dinâmicos envolvendo proliferação, diferenciação e interacções celulares durante a morfogénese tecidual. Crê-se que os foliculos capilares sejam formados apenas nos estádios iniciais do desenvolvimento e não substituídos.

Hardy, M.H. et al., Trans. Genet. 8: 55-61, 1992 descrevem provas de que as proteínas morfogenéticas do osso (BMP), membros da superfamília TGFh, são expressas de forma diferencial nos foliculos capilares durante o desenvolvimento. Harris, S.E. et al., J. Bone. Miner. Res. 9: 855-863, 1994 descrevem os efeitos de TGFB na expressão de BMP-2 e outras substâncias em células ósseas. A expressão de BMP-2 em foliculos maduros também ocorre durante a maturação e após o período de proliferação celular (Hardy et al., 1992, supra) . No entanto, tal como observado por Blessing, M. et al., Genes and Develop. 7: 204-215, 1992, o papel funcional exacto de BMP-2 na maturação dos foliculos capilares permanece obscuro.

Abordagens para tratar a calvície abundam na literatura de patentes dos E.U.A. Ver por exemplo a Patente U.S. N° 5767152 (derivados de ácido cianocarboxílico), a Patente U.S. N° 5824643 (factores de crescimento de queratinócitos) e a Patente U.S. N° 5910497 (inibidores da isozima 1 da 7

ΕΡ 1 096 924 /PT 16-pirazinil-substituto-4-aza-androstano-5-alfa-redutase). Existem muitos outros factores.

Gat, U. et al.r Cell 95: 605-614, 1998 demonstraram que a β-catenina faz com que as células epiteliais do adulto criem folículos capilares, um resultado surpreendente à luz da conhecida incapacidade das células maduras o fazerem. Sabe-se que a β-catenina tem um papel na adesão célula-célula e na transfecção do sinal de factores de crescimento. Sabe-se também que após ubiquitinação, a β-catenina é degradada pelos proteossomas. Orford, K. et al., J. Biol. Chem. 272: 24735- 24738, 1997. Foi também relatado pelo menos um gene associado a crescimento de cabelo (ou a falta deste). Ahmed, W. et al.r Science 279: 720-724, 1998.

Dois agentes actualmente aceites utilizados para o tratamento de perda de cabelo são o fármaco anti-hipertensor Minoxidil e o inibidor da 5a-redutase, Finasteride. Nenhum é inteiramente satisfatório. Ambos sofrem de modesta eficácia e são inconvenientes para administrar. Um composto específico, topicamente activo e fácil de administrar com melhor eficácia que estes agentes, representaria um marcado avanço.

Proteossomas e NF-KB O presente invento divulga ensaios convenientes para compostos que serão úteis na estimulação do crescimento de cabelo. Os ensaios envolvem a inibição da actividade de proteases proteossómicas, de preferência proteases proteossómicas. Compostos que inibem esta actividade são geralmente úteis no tratamento de distúrbios do crescimento de cabelo. Compostos que inibam a produção destas proteases serão também úteis no presente invento. A sua capacidade para o fazerem pode ser ainda confirmada através de ensaios adicionais. 0 proteossoma é uma colecção não compartimentalizada de proteases não relacionadas que formam uma arquitectura comum na qual as subunidades proteolíticas são auto-montadas para formar complexos em forma de barril (para revisão, ver Baumeister et al., Cell 92: 367-380, 1998). O proteossoma contém um vector de actividades proteolíticas distintas 8 ΕΡ 1 096 924 /PT dentro das células eucarióticas. Os compostos que inibem a actividade proteossómica reduzem também a actividade de NF-KB através da limitação da sua capacidade para ser translocado para o núcleo (Barnes, P.J. et al., N. Engl. J. Med. 336: 1066-1071, 1997) .

Divulgação do Invento O presente invento adiciona-se ao repertório de agentes de estimulação do crescimento de cabelo proporcionando fármacos que inibem proteínas e enzimas chave envolvidas na actividade proteossómica e estimulam assim o crescimento de cabelo. De acordo com o presente invento, descobrimos que a inibição das funções das proteínas proteossómicas em células ósseas conduz à formação e estimulação de folículos capilares. Assim, a avaliação de um composto candidato quanto à sua capacidade para inibir proteínas proteossómicas proporciona um meio útil para identificar agentes anabólicos do crescimento de cabelo. O presente fascículo proporciona assim métodos para a identificação de compostos que estimulam o crescimento de cabelo através da avaliação da sua capacidade para inibir a actividade do proteossoma. São também úteis nos métodos do presente invento compostos que inibem a produção in situ das enzimas contidas no proteossoma. Uma vez identificado um composto que se verifique inibir estas actividades, este pode ser utilizado num aspecto adicional do presente invento - um método para estimular o crescimento de cabelo colocando células adequadas em contacto com o composto identificado. 0 contacto celular pode incluir administração in vivo e os compostos do presente invento são assim úteis no tratamento de calvície, alopecia e semelhantes. Estes métodos são efectuados, de acordo com o presente invento, com compostos identificados como inibidores da actividade do proteossoma ou inibidores da produção das enzimas do proteossoma.

Num primeiro aspecto o presente invento refere-se a um método cosmético para tratar um indivíduo mamífero de uma condição que beneficia da estimulação de crescimento de cabelo cujo método compreende a administração ao referido indivíduo mamífero de uma quantidade eficaz para estimular o 9 ΕΡ 1 096 924 /PT crescimento de cabelo de um composto que inibe a actividade proteossómica ou que inibe a produção destas proteínas, em que o referido composto é uma estatina, um peptidilaldeído ou uma peptidilepoxicetona, ou é seleccionado de entre o grupo que consiste em pentoxifilina, gliotoxina, SN50, BAY 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina e MG262.

Noutro aspecto o presente invento refere-se à utilização de um composto que inibe a actividade proteossómica ou que inibe a produção destas proteínas no fabrico de um medicamento para estimulação do crescimento de cabelo num indivíduo mamífero em que o referido composto é uma estatina, um peptidilaldeído ou uma peptidilepoxicetona, ou é seleccionado de entre o grupo que consiste em pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina e MG262.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra um diagrama da via dos isoprenóides. Modos de Realização do Invento

De acordo com o presente invento, são proporcionados métodos de tratamento de distúrbios do crescimento de cabelo. Os distúrbios do crescimento de cabelo podem ser o resultado de um defeito na capacidade dos folículos capilares existentes para produzir cabelo, ou podem ser o resultado de uma deficiência no número de folículos capilares per se. "Estimulação do crescimento de cabelo" refere-se ao aumento do volume do cabelo numa determinada área de um indivíduo seja isto o resultado de uma maior taxa de crescimento em comprimento e/ou em espessura a partir do mesmo número de folículos capilares, de crescimento que procede de um aumento do número de folículos capilares ou de ambos. O número de folículos capilares pode ser aumentado activando mais os folículos capilares existentes ou estimulando o aparecimento ou a proliferação de folículos capilares numa determinada região da pele.

Tal como aqui utilizado, o termo "indivíduo" engloba um ser humano bem como outras espécies animais, tais como, por 10 ΕΡ 1 096 924 /PT exemplo, caninas, felinas, bovinas, suínas, de roedores e semelhantes. Os peritos compreenderão que o indivíduo é um apropriado para que se deseje a estimulação de crescimento de cabelo. Assim, em geral, por exemplo, a estimulação de crescimento de cabelo estará confinada na maioria dos casos a animais que exibam apropriadamente tal crescimento.

As condições que beneficiariam do “tratamento" da estimulação do crescimento de cabelo incluem calvície padrão masculina, alopecia causada por quimioterapia, enfraquecimento do cabelo devido ao envelhecimento, distúrbios genéticos que resultam em deficiência da cobertura de cabelo e, em animais, proporcionar protecção adicional a baixas temperaturas. Assim, enquanto que a utilização em humanos pode ter um benefício primariamente cosmético, a utilização em animais pode também ser terapêutica.

As composições do presente invento podem ser administradas sistemicamente ou localmente. Para utilização sistémica, os compostos daqui são formulados para distribuição parentérica (p. ex., intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal ou transdérmica) ou entérica (p. ex., oral ou rectal) de acordo com métodos convencionais. A administração intravenosa pode ser por meio de uma série de injecções ou através de infusão contínua ao longo de um período prolongado. A administração através de injecção ou outras vias de administração espaçadas de forma discreta pode ser efectuada a intervalos que variam de semanais a de uma a três vezes ao dia. Alternativamente, os compostos aqui divulgados podem ser administrados de um modo cíclico (administração do composto divulgado; seguido de nenhuma administração; seguido de administração do composto divulgado e semelhantes). O tratamento continuará até ser alcançado o resultado desejado. Em geral, as formulações terapêuticas incluirão um composto do presente invento em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina, solução salina tamponada, dextrose a 5% em água, solução salina tamponada com borato contendo metais vestigiais ou semelhantes. As formulações podem incluir ainda um ou mais excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamento, albumina para prevenir perda proteica na superfície dos frascos, lubrificantes, enchimentos, 11

ΕΡ 1 096 924 /PT estabilizantes, etc. Os métodos de formulação são bem conhecidos na arte e são divulgados, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", última edição, Mack Publishing Co., Easton PA, que é deste modo incorporado por referência. As composições farmacêuticas para utilizar dentro do presente invento podem estar na forma de soluções ou suspensões líquidas, estéreis e apirogénicas, cápsulas revestidas, supositórios, pós liofilizados, adesivos transdérmicos ou outras formas conhecidas na arte. A administração local pode ser através de injecção no local do ferimento ou defeito, ou através da inserção ou ligação de um transportador sólido no local, ou através de aplicação tópica directa de um líquido viscoso, ou semelhante. Para administração local, o veiculo de distribuição é de preferência um veiculo que pode ser absorvido pelo indivíduo sem efeitos adversos.

Em formulações adicionais, podem ser utilizadas preparações convencionais tais como as descritas abaixo.

As suspensões aquosas podem conter o ingrediente activo misturado com excipientes farmacologicamente aceitáveis, compreendendo agentes de suspensão, tais como metilcelulose; e agentes humidificantes, tais como lecitina, lisolecitina ou álcoois gordos de cadeia longa. As referidas suspensões aquosas podem também conter conservantes, agentes corantes, agentes aromatizantes, agentes adoçantes e semelhantes de acordo com os padrões da indústria.

As preparações para aplicação tópica e local compreendem sprays de aerossóis, loções, géis e unguentos em veículos farmaceuticamente apropriados que podem compreender álcoois alifáticos inferiores, poliglicóis tais como glicerol, polietilenoglicol, ésteres de ácidos gordos, óleos e gorduras, e silicones. As preparações podem ainda compreender antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou tocoferol e conservantes, tais como ésteres de ácido p-hidroxibenzóico.

As preparações parentéricas compreendem particularmente produtos estéreis ou esterilizados. Composições injectáveis podem ser proporcionadas contendo o composto activo e 12

ΕΡ 1 096 924 /PT qualquer um dos transportadores injectáveis bem conhecidos. Estes podem conter sais para regulação da pressão osmótica.

Utilizações veterinárias dos compostos divulgados estão também contempladas, tal como exposto acima. Tais utilizações incluem tratamento de defeitos associados ao cabelo ou pêlo em animais domésticos, gado e cavalos puro-sangue.

Tal como afirmado acima, os compostos do presente invento podem também ser utilizados para estimular o crescimento de cabelo através do aumento da sua taxa de formação a partir de foliculos existentes, da estimulação de foliculos inactivos, efectuando a produção de foliculos capilares adicionais ou alguma combinação das anteriores, ou através de qualquer outro mecanismo possa ou não ser actualmente compreendido.

No âmbito do presente invento, uma "quantidade eficaz" de uma composição para utilização na estimulação de crescimento de cabelo é a quantidade que proporciona o efeito desejado em termos de comprimento ou densidade do cabelo. Tais quantidades eficazes serão determinadas utilizando técnicas de optimização de rotina e estão dependentes da condição em particular a tratar, do estado do paciente, da via de administração, da formulação e da avaliação do praticante e de outros factores evidentes para os peritos na arte. A dosagem necessária para os compostos do presente invento é manifestada como diferenças entre os indivíduos tratados com sucesso e os controlos em relação à estimulação de crescimento de cabelo e pode ser geralmente avaliada através de observação directa. A dosagem dos compostos do presente invento variará de acordo com a extensão e gravidade da necessidade de tratamento, a actividade do composto administrado, a saúde geral do indivíduo e outras considerações bem conhecidas do perito na arte. Geralmente, podem ser administrados a um ser humano típico diariamente como uma dose oral de cerca de 0,1 mg/kg-1000 mg/kg, e de preferência de cerca de 1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg. A dose parentérica será apropriadamente de 20-100% da dose oral. Embora a administração tópica seja geralmente preferível para estimulação do crescimento de 13 ΕΡ 1 096 924 /PT cabelo, uma vez que geralmente são apenas desejados efeitos locais, o tratamento sistémico pode também ser preferível nalguns casos.

Ensaios para Compostos Úteis no Invento

Os ensaios para avaliaçao da capacidade de um composto para inibir a actividade proteossómica e para inibidores da actividade de NF—KB são bem conhecidos na arte. Dois ensaios típicos, mas não limitantes, estão descritos abaixo.

Avaliação da Actividade Proteossómica A actividade proteossómica é medida através de um aumento dos complexos de proteínas ubiquitiniladas citoplasmáticos, avaliado através de "Western blotting" utilizando um anticorpo anti-ubiquitina. Células MG-63 são criadas em confluência em meios MEM-alfa e soro fetal de vitelo (FCS) a 10%. As células são então tratadas durante 24 horas com compostos específicos. Após os tratamentos indicados, as células são raspadas com um raspador descartável, lavadas duas vezes com solução salina de fosfato (NaCl 137 mM, d-glicose 10 mM, KC1 4 mM, Na2HP04 0,5 mM, KH2P04 0, 1 mM) , centrifugadas e o sedimento resultante é suspenso no tampão de amostra contendo SDS a 2%, pH 6,75. As amostras são aquecidas e a concentração de proteína total calculada por meio do Protein Assay Kit de ácido micro-bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL/USA). As amostras são diluídas para se obter uma concentração proteica final de 2 mg/ml, suplementadas com 2-mercaptoetanol a 10%, azul de bromofenol a 1% e corridas num SDS-PAGE a 4-15%. Os géis resultantes são sujeitos a "Western blot" com anticorpo policlonal de coelho anti-ubiquitina (diluído 1:100; Sigma, St. Louis, MO/USA). As amostras são visualizadas com anticorpos anti-IgG de coelho conjugados com peroxidase de rábano (Amersham Corp., Arlington Heights, IL/USA) utilizando estojos de detecção ECL (Amersham Corp.). 14

ΕΡ 1 096 924 /PT

Ensaios da Actividade de NF—KB

As células são tratadas com diferentes concentrações dos compostos e são preparados extractos nucleares. Resumidamente, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato e ressuspensas em tampão de lise (Nonidet P-40 a 0,6%, NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,9, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM e uma mistura de inibidores de proteases (Complete (TM), Boehringer Mannheim). Após incubação em gelo durante 15 min., os núcleos são recolhidos por centrifugação. 0 sedimento é ressuspenso em tampão de extracção nuclear (Hepes 10 mM, pH 7,9, NaCl 420 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 0,5 mM, inibidores de proteases (Complete (TM)), Boehringer Mannheim) , glicerol a 25%) e incubado a 4 graus C durante 30 min. O sobrenadante é recolhido e dialisado num tampão contendo Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM e glicerol a 20%. Após diálise, o extracto nuclear é centrifugado para remover as proteínas precipitadas e são armazenadas alíquotas a -70°C. A concentração proteica nos extractos nucleares é medida através do método de Bradford utilizando um estojo de ensaio de ligação a corante (Bio-

Rad) . A sonda para ensaios de mudança de mobilidade electroforética é um oligonucleótido de cadeia dupla marcado com 32P contendo a sequência de consenso específica para NF-KB (Promega). Os extractos nucleares (5 pg) são pré-incubados em misturas reaccionais de 20 μΐ contendo Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, DTT 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, MgCl2 1 mM, glicerol a 4% e 5 pg de poli(dl-dC). Após 10 minutos à temperatura ambiente, são adicionados 10-20 frmol de sonda e incuba-se durante mais 20 min. Os complexos ADN-proteína são separados dos oligonucleótidos livres num gel de poliacrilamida a 5%/TBE 0,5x (Tris-HCl 45 mM, ácido bórico 45 mM, EDTA 1 mM) . Após electroforese, os géis são secos e sujeitos a autorradiografia.

Ensaios para Inibição da Produção

Os compostos que inibem a produção das enzimas possuindo actividade proteossómica ou de NF-KB podem ser avaliados 15 ΕΡ 1 096 924 /PT através da medição do nível de produção destas proteínas na presença e na ausência dos compostos candidatos. Os níveis de produção podem ser facilmente medidos em sistemas in vitro utilizando, por exemplo, imunoensaios para o nível de proteína produzida. Os níveis de tais proteínas podem também ser avaliados utilizando, por exemplo, marcação de metionina e separação por tamanho das proteínas nas células a avaliar. Para efectuar um nível de produção proteica conveniente para medição, é vantajoso utilizar sistemas de expressão recombinante para as enzimas relevantes ou o NF-KB de forma a que sejam produzidas quantidades substanciais.

Abordagens típicas para inibir a produção de NF-KB ou enzimas do proteossoma incluem a utilização de tecnologia anti-sentido ou a formação de tríplices com formas de cadeia dupla de sequências nucleotídicas relevantes na expressão dos genes. Adicionalmente, várias moléculas pequenas podem também inibir esta produção.

Ensaios - Crescimento de Cabelo: Ensaio In vivo dos Efeitos dos Compostos nos Folículos Capilares, na Proliferação e no Crescimento de Cabelo O ensaio descrito acima para avaliar o efeito dos compostos no crescimento de osso da abóbada craniana pode também ser utilizado para avaliar a capacidade dos compostos para estimular o crescimento de cabelo. O composto de teste ou o veículo de controlo apropriado é aplicado na parte superior e inferior das costas de ratinhos brancos ICR Swiss machos topicamente ou através de injecção subcutânea. O veículo é seleccionado conforme apropriado para o composto a testar e para a via de administração. Opcionalmente, o pêlo na área de teste pode ser removido antes da administração. Após um intervalo adequado, tipicamente 7 dias, os ratinhos são anestesiados e é tomada uma biopsia da área de tratamento dorsal utilizando um furador dérmico de 6 mm. Os espécimes são fixados em formalina tamponada a 10% e embebidos em cera de parafina, e seccionados e corados para observar folículos capilares. Adicionalmente, pode ser utilizada fotografia para observar e registar o crescimento de pêlo; tipicamente tal crescimento é observado após 14-18 dias. Após um intervalo adequado, tipicamente 21 dias, os animais podem ser 16 ΕΡ 1 096 924 /PT submetidos a eutanásia e o pêlo analisado quanto à análise de fibras e o tecido da área de tratamento analisado quanto aos foliculos capilares.

Natureza dos Compostos Úteis no Invento

Os compostos úteis nos métodos e utilizações do presente invento são inibidores da actividade proteossómica e também de preferência inibidores do factor de transcrição NF-KB. Os inibidores conhecidos destas actividades podem ser avaliados a partir da literatura ou os compostos podem ser testados quanto a estas actividades utilizando ensaios conhecidos na arte. Adicionalmente, os inibidores que baixam o nivel de expressão eficaz da sequência nucleotidica codificando as enzimas que possuem actividade proteossómica podem ser avaliados e utilizados nos métodos do presente invento.

Os compostos assim identificados incluem compostos que inibem a via dos isoprenóides, tais como as estatinas. Uma descrição destes compostos pode ser encontrada em WO 98/25460 e na U.S. com o N° de Série 09/096631. Para conveniência, a via dos isoprenóides referida é aqui exposta na Figura 2. Uma classe de compostos que são inibidores é a das estatinas que possuem a fórmula:

HO

•COOR' .OH ΠΟ. .,.- ..,,../.0 • ·. ,o k Ϋ em que X em cada uma das fórmulas (1) e (2) representa um ligante alquileno, alcenileno ou alquinileno de 2-6C substituído ou não substituído; Y representa um ou mais anéis carbocíclicos ou heterocí clicos em que, quando Y compreende dois ou mais anéis, os referidos anéis podem estar fundidos; e ri representa um catião, H ou um grupo alquilo substituído ou não substituído de 1-6C; e 17

ΕΡ 1 096 924 /PT as linhas ponteadas representam ligações π opcionais.

Estes compostos podem ser utilizados no método do presente invento uma vez que se referem à estimulação do crescimento de cabelo.

Compostos que se sabe serem inibidores do proteossoma ou de NF-KB incluem:

Inibidores do Proteossoma PSI N-carbobenzoíl-Ile-Glu-(OtBu)-Ala-Leu-CHO MG-132 N-carbobenzoí1-Leu-Leu-Leu-CHO MG-115 N-carbobenzoí1-Leu-Leu-Nva-CHO MG-101 ou Calpaina Inh I N-Acetil-Leu-Leu-norLeu-CHO ALLM N-Acetil-Leu-Leu-Met-CHO N-carbobenzoí1-Gly-Pro-Phe-Leu-CHO N-carbobenzoí1-Gly-Pro-Ala-Phe-CHO N-carbobenzoí1-Leu-Leu-Phe-CHO N-carbobenzoí1-Leu-Ala-Leu-CHO Gliotoxina j \ N—CHj OH 0 CHjOM SN5 0 NLS de NF-KB PM 2 781 Bay 11-7082 HjC'' j CH, Capsaicina 0 Xj M I PDTC r-Λ i N—C—SNH,

Ver, por exemplo, Vinitsky, A. et al., J. Biol. Chem. 269: 29860-29866, 1994; Figueiredo-Pereira, M.E. et al., J. Neurochem. 63: 1578-1581, 1994; Wojcik, C. et al., Eur. J. Cell. Biol. 71: 311-318, 1996. 18

ΕΡ 1 096 924 /PT

Na lista anterior, sabe-se que a lactacistina é um inibidor irreversível da actividade do proteossoma. Liga-se à subunidade β-catalítica e é um inibidor específico do proteossoma 20S. Inibe também irreversivelmente NF-KB. SN50 é a NLS (sequência de localização nuclear) de p50 mais a região hidrófoba de K-FGF. Inibe a translocação do complexo activo NF—KB para o núcleo.

Certas peptidilepoxicetonas tais como EST são inibidores irreversíveis dos proteossomas. MG-132 mostra actividade contra a actividade quimiotríptica da proteína 20S sem afectar a sua actividade ATPásica ou isopeptidásica e inibe reversivelmente a actividade de NF-KB. MG-115 e MG-341 apresentam actividades semelhantes a MG-132. Vários outros inibidores de NF-KB são menos activos no ensaio ABA. Estes incluem capsaicina, curcumina e resiniferatoxina. Outros compostos que se sabe inibirem NF—KB são a gliotoxina e PDTC (ácido 1-pirrolidinocarbotiótico). Vários outros compostos tais como BAY-11-7082 e BAY-11-7085 bem como caliculina-A inibem a fosforilação de NF-KB. 0 inibidor da calpaína inibe a calpaína 1 e o proteossoma; outros compostos tais como olomoucina e roscovitina inibem cdk2 e/ou cdk5.

Um composto adicional que se mostrou ser um inibidor do proteossoma é a pentoxifilina (PTX) . Combaret, L. et al., Mol. Biol. Rep. 26: 95-101, 1999. É activo no ensaio in vitro da abóbada craniana descrito acima.

Tal como exposto acima, em concretizações preferidas dos métodos do presente invento, os compostos identificados inibem a via dos isoprenóides, tipicamente tal como mostrado na Figura 1. Noutras concretizações preferidas os compostos são descritos nos pedidos PCT WO 98/17267, WO 97/15308 e WO 97/48694 citados. A utilização destes compostos no método para estimular o crescimento de cabelo de acordo com o presente invento está incluída.

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar mas não limitar o presente invento. 19

ΕΡ 1 096 924 /PT

Exemplo 1

Pesquisa de Elevada Tiragem

Milhares de compostos foram testados no sistema de ensaio exposto na U.S. com o N° de Série 08/458434, apresentada a 2 de Junho de 1995. Os compostos representativos do presente invento deram respostas positivas, enquanto que a maioria dos compostos (não relacionados) são inactivos. Nesta pesquisa, o controlo positivo padrão foi o composto 59-0008 (também denominado "OS8"), que tem a fórmula:

H .N '$

N— N-OS8"

Com maior detalhe, foram empregues células 2T3-BMP-2-LUC, uma linha celular de osteoblastos estavelmente transformada descrita em Ghosh-Choudhury et ai., Endocrinology 137: 331-39, 1996, referenciada acima. As células foram cultivadas utilizando α-MEM, FCS a 10% com penicilina/estreptomicina a 1% e glutamina a 1% ("meio de plaqueamento") e foram divididas 1:5 uma vez por semana. Para o ensaio, as células foram ressuspensas num meio de plaqueamento contendo FCS a 4%, plaqueadas em placas de microtitulo a uma concentração de 5xl03 células (em 50 μ1)/ροςο e incubadas durante 24 horas a 37°C em CO2 a 5%. Para iniciar o ensaio, foram adicionados a cada poço 50 μΐ do composto de teste ou do controlo em DMSO a uma concentração de 2x, de forma a que o volume final fosse de 100 μΐ. A concentração final de soro foi de FCS a 2% e a concentração final de DMSO foi de 1%. O composto 59-0008 (10 μΜ) foi utilizado como controlo positivo.

As células tratadas foram incubadas durante 24 horas a 37°C e CO2 a 5%. O meio foi então removido e as células foram lavadas três vezes com PBS. Após a remoção do excesso de PBS, foram adicionados a cada poço 25 μΐ de reagente de lise da cultura celular lx (Promega #E153A) e incubou-se durante pelo menos dez minutos. Opcionalmente, as placas/amostras podiam 20

ΕΡ 1 096 924 /PT ser congeladas neste ponto. A cada poço foram adicionados 50 μΐ de substrato de luciferase (Promega #E152A; 10 ml de tampão de ensaio de luciferase Promega por 7 mg de substrato de ensaio de luciferase Promega). A luminescência foi medida num luminómetro de placas de 96 poços automático e foi expressa em picogramas de actividade de luciferase por poço ou como picogramas de actividade de luciferase por micrograma de proteína.

Neste ensaio, o composto 59-0008 (3-fenilazo-lH-4,1,2- benzotiadiazina) exibe um padrão de reactividade que é máximo a uma concentração de aproximadamente 3-10 μΜ. Concordantemente, outros compostos testados podem ser avaliados a várias concentrações e os resultados comparados com os resultados obtidos para 59-0008 a 10 μΜ (valor que seria normalizado para 100). Alternativamente, a reactividade de um composto a testar pode ser comparada directamente com um controlo negativo não contendo composto. 0 composto de controlo 59-0328, que é sinvastatina, dá uma boa resposta. Os inibidores do proteossoma conhecidos MG-132 e MG-115 mostram também elevada actividade; MG-132 é eficaz a concentrações mais baixas. Respostas positivas são também obtidas utilizando lactacistina. No entanto, a gliotoxina, olomoucina, roscovitina, SN50, PDTC e capsaicina não dão respostas promissoras.

Exemplo 2

Formação de Osso in vitro

Os compostos seleccionados e os controlos apropriados foram ensaiados in vitro (ex vivo) quanto à actividade de formação de osso (descrita acima em "Techniques for Neonatal Mouse Calvaria Assay (in vitro)"). Foram realizadas avaliações histomorfométricas de abóbadas cranianas ex vivo utilizando um programa de medição morfométrica de osso OsteoMetrics, de acordo com as instruções do fabricante. As medições foram determinadas utilizando uma objectiva de 10 ou 20 vezes com uma ocular reticulada de contagem de pontos padrão. 21

ΕΡ 1 096 924 /PT A formação de osso novo foi determinada (utilizando uma objectiva de 10x) através da medição da área do osso novo formado num campo em 3 secções representativas de cada osso (4 ossos por grupo). Cada medição foi realizada a 1/2 campo de distância do fim da sutura. Foram medidas as áreas tanto de osso total como de osso antigo. Os dados foram expressos como área de osso novo em μιη2.

Os resultados no Exemplo 1 foram de algum modo imperfeitamente correlacionados com os resultados deste ensaio. 0 composto de controlo, sinvastatina, apresentou formação de osso novo neste ensaio tal como MG-132 e lactacistina. MG-115 mostrou também resultados positivos embora menos dramáticos que os da sinvastatina. No entanto, a gliotoxina, que pareceu negativa no ensaio ABA do Exemplo 1 demonstrou a capacidade para estimular o crescimento de osso. Os restantes compostos, olomoucina, roscovitina, SN50, PDTC e capsaicina pareceram negativos neste ensaio. O número de osteoblastos é determinado através da contagem de pontos. O número de osteoblastos forrando a superfície óssea de ambos os lados do osso é contado num campo utilizando uma objectiva de 20x. Os dados são expressos como número de osteoblastos/mm da superfície óssea. A actividade da fosfatase alcalina é medida no meio condicionado de cultura de órgãos de murídeo, utilizando o método descrito por Majeska, R.J. et al., Exp. Cell. Res. 111: 465-465, 1978. Os meios condicionados são incubados a 37°C durante 20 minutos com substrato de fosfatase 104 (Sigma) e a reacção parou com 2 ml de NaOH 0,1 Μ. A actividade da fosfatase alcalina é calculada através da medição do substrato clivado a uma densidade óptica de 410 nm num espectrofotómetro de feixe duplo Beckman da DO410 e corrigido para a concentração proteica. PSI e MG-132 e os compostos de controlo/factores bFGF e BMP-2 e um controlo de veículo foram testados neste ensaio e as abóbadas cranianas foram analisadas histomorfometricamente, tal como descrito acima. Foi medido o aumento da área óssea em função da concentração; o aumento de 22

ΕΡ 1 096 924 /PT osteoblastos e o aumento da actividade da fosfatase alcalina para PSI.

Os dados mostram que PSI é tão bom, ou melhor, que BMP-2 e bFGF (dois agentes "padrão de ouro" para o crescimento ósseo; ver Wozney, J. Molec. Reprod. Dev. 32: 160-67, 1992; WO 95/24211) para induzir a formação de osso.

Numa experiência adicional pentoxifilina (PTX) foi testada no ensaio anterior. Exibiu capacidade para aumentar a formação de osso novo em concentrações tão baixas como 0,1 μιη. A uma concentração de 10 μΜ, PTX pareceu aumentar o osso novo em relação ao controlo em mais de 100%; a 100 μΜ, o aumento foi de aproximadamente três (3) vezes o do controlo.

Exemplo 3

Dados do Crescimento de Osso de Abóbadas Cranianas in vivo PSI e MG-132 foram ensaiados in vivo de acordo com o procedimento descrito anteriormente (ver "In vivo Assay of Effects of Compounds on Murine Calvarial Bone Growth", supra). Como controlo, a sinvastatina proporcionou um aumento de 1,5 vezes no número de osteoblastos.

Numa experiência, o controlo de veículo, bFGF e doses variadas de PSI foram testados no ensaio de crescimento de osso de abóbada craniana in vivo. Os resultados são relatados como medição da área do osso total, % de aumento na área em relação ao controlo de veículo, e % de aumento na espessura do osso novo tal como mostrado abaixo.

Composto Área de Osso Total (μιη2) % de Aumento1' na Área de Osso em Comparação com o Controlo % de Aumento* na largura do Osso Novo Controlo 0,64 ± 0,03 0,1 mg/kg/dia 0,74 ± 0,02 21,7 ± 3,5 1 mg/kg/dia 0,83 ± 0,02 35,4 ± 3,4 19,9 ± 2,0 5 mg/kg/dia 0,79 ± 0,03 32,1 ± 5,6 19,9 ± 4,4 *p < 0,05 *p < 0,001 23

ΕΡ 1 096 924 /PT

Adicionalmente, o exame histológico mostrou a confirmação de crescimento de osso tanto quando foi utilizado 5 mg/kg/dia de PSI como quando foi utilizado 1 mg/kg/dia.

Exemplo 4

Resumo dos Efeitos da Formação de Osso A tabela abaixo resume os resultados obtidos para compostos testados nos vários ensaios expostos acima. Observa-se que compostos que são inibidores do proteossoma aumentam também a formação de osso. No entanto, nos compostos testados nesta tabela os compostos que se sabe serem inibidores apenas de NF—KB mas que não conseguem inibir a actividade proteossómica, não aumentam a actividade da luciferase (indicativo de actividade promotora de BMP-2) no ensaio de elevado rendimento, nem aumentam a formação de osso no ensaio de abóbada craniana in vitro, até uma extensão tão grande como os inibidores do proteossoma.

Os compostos úteis no presente invento incluem:

Composto Estrutura Actividade da Luciferase (DEso-μΜ) Formação de Osso (DEso-μΜ) Actividade do Proteossana (DEso-μΜ) Sinvastatina 1Ϊ 0, 2 ít 0, 2 li Lactacistina i o V" *c*“CPV"y,m CH} 1Ϊ 1 ít 1 li 1/5 PSI Z-Ile-Glu-(OtBu)-Ala-Leu-CHO 1Ϊ 0,05 ít 0,03 li 0, 035 MG-132 Z-Leu-Leu-Leu-CHO 1Ϊ 0,25 ít 0, 5 li 0,3 MG-262 1Ϊ 0,1 ít 0,1 li 0,07 24

ΕΡ 1 096 924 /PT

Composto Estrutura Actividade da Luciferase (DEso-μΜ) Formação de Osso (DEso-μΜ) Actividade do Proteosscma (DEso-μΜ) MG-115 Z-Leu-Leu-Nva-CHO fí 2 fí 1 1 ALLN N-acetil-Leu-Leu- Nle-CHO fí 10 1,5 Ciclosporina A fí 10 1,0 Gliotoxina CHsOH fí 10 SN50 NLS de NF-KB PM 2781 - - - - - - ALLM N-acetil-Leu-Leu- Met-CHO - - - - 4 PPM-18 ocjxf0 Bay 11-7082 HjC'! CH, Capsaicina 30 PDTC

Exemplo 5

Efeito de PSI e de Outros Inibidores do Proteossoma na Produção de Foliculos Capilares O ensaio de crescimento de osso da abóbada craniana in vivo do Exemplo 3 foi modificado para observar o número de 25 ΕΡ 1 096 924 /PT folículos capilares em ratinhos tratados. Nas observações iniciais, PSI (5 mg/kg/dia) foi injectado três vezes por dia durante 5 dias ao longo da abóbada craniana de ratinhos ICR Swiss tal como descrito acima. Dezasseis dias depois os ratinhos foram sacrificados. A histologia das abóbadas cranianas revelou um aumento muito grande no número de foliculos capilares nos ratinhos tratados com PSI versus os ratinhos de controlo. Para além do PSI, o MG-132 (10 mg/kg), MG-115 (10 mg/kg) e a lactacisina administrados do mesmo modo também estimularam um aumento no número de foliculos capilares.

Exemplo 6

Estimulação do Crescimento de Cabelo

Ratinhos Swiss ICR machos foram primeiro tratados para remover o pêlo do escalpe e das regiões dorsais como se segue. Cera de parafina foi liquefeita aquecendo a 55°C e a cera liquefeita foi então aplicada pincelando o escalpe e/ou as costas (sob anestesia). A cera foi deixada solidificar e depois removida. No dia seguinte após a depilação, foi injectado PSI (1 mg/kg/dia) subcutaneamente três vezes ao dia durante cinco dias no escalpe e na região dorsal. No dia 7 foi tomada uma biopsia por furo dérmico; a histologia revelou um grande aumento no número de foliculos capilares em ratinhos aos quais se administrou PSI versus ratinhos de controlo. No dia 18, era observável que os ratinhos tratados tinham uma taxa de crescimento de pêlo superior à dos ratinhos no grupo de controlo.

Os ratinhos foram sacrificados no dia 21 e a histologia efectuada na derme do escalpe e na região dorsal. Nos ratinhos tratados, os foliculos capilares maduros em número muito maior que nos controlo tinham migrado para a região inferior da derme. Após um exame mais próximo, observou-se que os ratinhos que tinham recebido apenas veiculo tinham foliculos capilares quiescentes. Quando tratados com PSI tais foliculos eram estimulados a diferenciar-se em folículos capilares maduros e a migrar para a região inferior da derme. 26

ΕΡ 1 096 924 /PT

Exemplo 7

Administração Tópica PSI foi preparado como formulação tópica, onde o veiculo foi propilenoglicol a 50%, etanol a 30%, água desionizada a 20%, a uma concentração de PSI de 0,1%. A solução foi aplicada 3 vezes ao dia durante 5 dias. Os ratinhos num grupo tratado foram observados em comparação com os controlos tratados de forma semelhante apenas com veiculo. Os resultados no dia 16 mostraram estimulação do crescimento de pêlo relativamente aos controlos.

Para além de estimular o crescimento de pêlo, PSI foi capaz de espessar tanto o pêlo como o veio do pêlo. O PSI aumenta a contagem de pêlos quando a área de foliculos é superior a 0,01 mm2. Quando o protocolo acima foi repetido utilizando uma solução de PSI a 0,5% em grupos contendo 5 ratinhos cada um, o número de pêlos por 0,8 mm2 foi de 60 nos ratinhos tratados versus cerca de 10 no grupo de controlo. A percentagem da área de foliculos numa região de cerca de 0,8 mm2 foi de cerca de 30% em média no grupo tratado em comparação com 15% em média no grupo de controlo.

Exemplo 8 Doses Requeridas

Para determinar a dosagem eficaz mínima de PSI, quando utilizado topicamente, foi preparada um curva de resposta à dose para PSI. Todas as experiências foram efectuadas de acordo com os actuais regulamentos das boas práticas laboratoriais (21CFR58). Os ratinhos foram divididos em 7 grupos, 10 ratinhos cada, em que um grupo foi tratado com controlo apenas com veículo e os grupos 1-6 com uma série de concentrações crescentes de PSI num veículo compreendendo propilenoglicol a 50%, etanol a 30%, água desionizada a 20%. As concentrações foram de 0,006%, 0,012%, 0,025%, 0,05%, 0,1% e 0,5%.

Os ratinhos foram anestesiados (50 μΐ de Mistura de Ratinho contendo 3 ml de cetamina, 2 ml de Rompum para animais pequenos, 5 ml de NaCl), identificados através de um código num furo na orelha, pesados e o pêlo no lado dorsal 27

ΕΡ 1 096 924 /PT foi removido com cera tal como descrito no Exemplo 6. Após a remoção da cera, os animais foram fotografados. No dia seguinte (dia 1), 100 μΐ de PSI nas concentrações de cima em veiculo foram pincelados sobre a área de pêlo removido. Uma aplicação semelhante de solução de PSI foi efectuada diariamente durante mais 4 dias.

No dia 7 os ratinhos foram anestesiados e foi tomada uma biopsia da área de tratamento dorsal utilizando um furador dérmico de 6 mm; os espécimes foram fixados em formalina tamponada a 10% e embebidos em cera de parafina. Foram cortadas secções utilizando um micrótomo padrão.

Os ratinhos foram monitorizados diariamente quanto a sinais de crescimento de pêlo e qualquer crescimento de pêlo foi registado através de fotografia. No dia 21 os animais foram sujeitos a eutanásia (fenobarbital a 75 mg/kg de peso corporal, injecção IP) , foram tomadas amostras de pêlo de 2 cm para análise óptica baseada nas fibras e a restante área de tratamento dorsal foi fixada em formalina tamponada a 10% para posterior análise histológica. A análise incluiu a quantificação da espessura do pêlo e a quantificação dos foliculos capilares maduros. Os resultados foram expressos como a média = ± o erro padrão da média. Os dados foram analisados através de medições repetidas da análise de variância seguida pelo pós-teste de Tukey-Kramer; valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

Os resultados indicam que a dose eficaz mínima de PSI é de 0,5% aplicada 1 vez ao dia durante 4 dias; experiências adicionais mostraram que 0,1% de PSI aplicados topicamente 3 vezes ao dia durante 5 dias eram também eficazes. A observação grosseira dos ratinhos que receberam uma dose eficaz indicou uma maior taxa de crescimento de pêlo, um espessamento do diâmetro do pêlo, um aumento no diâmetro do revestimento e uma diferenciação dos foliculos capilares quiescentes em formas mais maduras.

Lisboa,

Claims (16)

1. ΕΡ 1 096 924 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método cosmético para tratar um indivíduo mamífero relativamente a uma condição que beneficie da estimulação de crescimento de cabelo, método este que compreende a administração ao referido indivíduo mamífero de uma quantidade eficaz para estimular o crescimento de cabelo de um composto que inibe a actividade proteossómica ou que inibe a produção destas proteínas, em que o referido composto é uma estatina, um peptidilaldeído ou uma peptidilepoxicetona, ou é seleccionado de entre o grupo que consiste em pentoxifilina, gliotoxina, SN50, Bay 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina e MG262.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto é uma estatina ou é PSI.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido indivíduo é humano.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida condição a tratar é calvície padrão masculina, alopecia causada por quimioterapia, enfraquecimento do cabelo devido a envelhecimento ou a um distúrbio genético.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido indivíduo é um mamífero não humano.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referido crescimento de cabelo proporciona protecção adicional a baixas temperaturas.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido crescimento de cabelo se caracteriza por uma maior taxa de crescimento em comprimento e/ou na espessura do cabelo, ou pelo surgimento de proliferação de novos folículos capilares.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido composto é co-administrado numa película ou matriz biodegradável com um agente promotor do crescimento ou da infiltração de tecidos. ΕΡ 1 096 924 /PT 2/3
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido agente é um factor de crescimento epidérmico, um factor de crescimento de fibroblastos, um factor de crescimento derivado das plaquetas, um factor de crescimento transformante, uma hormona paratiróide, um factor/inibidor de leucemia ou um factor de crescimento semelhante à insulina.
10. 10. Utilização de um composto que inibe a actividade proteossómica ou que inibe a produção destas proteínas no fabrico de um medicamento para estimulação de crescimento de cabelo num indivíduo mamífero em que o referido composto é uma estatina, um peptidilaldeído ou uma peptidilepoxicetona, ou é seleccionado de entre o grupo que consiste em pentoxifilina, gliotoxina, SN50, BAY 11-7082, capsaicina, PDTC, PPM-18, lactacistina e MG262.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido composto é uma estatina ou é PSI.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o medicamento é para o tratamento de calvície padrão masculina, alopecia causada por quimioterapia, enfraquecimento do cabelo devido a envelhecimento ou um distúrbio genético.
13. 13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que o referido crescimento se caracteriza por uma maior taxa de crescimento em comprimento e/ou na espessura do cabelo, ou pelo surgimento de proliferação de novos folículos capilares.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, em que o referido composto é co-administrado numa película ou matriz biodegradável com um agente promotor do crescimento ou da infiltração de tecidos.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido agente é um factor de crescimento epidérmico, um factor de crescimento de fibroblastos, um factor de crescimento derivado das plaquetas, um factor de crescimento ΕΡ 1 096 924 /PT 3/3 transformante, uma hormona paratiróide, um factor/inibidor de leucemia ou um factor de crescimento semelhante à insulina.
16. 16. Método para identificar um composto que estimula o crescimento de cabelo, método este que compreende: - sujeição de um composto candidato a um ensaio para avaliar a sua capacidade para inibir a actividade proteossómica, através do qual um composto que inibe a actividade proteossómica é identificado como um composto que estimula o crescimento de cabelo; ou - sujeição de um composto candidato a um ensaio para avaliar a sua capacidade para inibir a produção de enzimas com actividade proteossómica, através do qual um composto que inibe a produção de enzimas com actividade proteossómica é identificado como um composto que estimula o crescimento de cabelo. Lisboa,