PT1056452E

PT1056452E - Acidos indole-3-propionico, seus sais e esteres utilizados como medicamentos.

Info

Publication number: PT1056452E
Application number: PT99908381T
Authority: PT
Original assignee: Univ South Alabama; Univ New York
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2006-12-29
Also published as: EA200000874A1; JP5627160B2; US6395768B1; IL137848A; DE69932414D1; AU757925B2; MXPA00008216A; CA2321455C; CA2321455A1; NZ506260A; CN1147299C; EP1056452A1; JP2002503691A; BR9908165A; DE69932414T2; IL137848A0; JP2012017343A; EA005244B1; ES2270585T3; WO1999042102A1

Description

1

DESCRIÇÃO

"ÁCIDOS IND0LE-3-PR0PIÓNIC0, SEUS SAIS E ÉSTERES UTILIZADOS COMO MEDICAMENTOS" 0 presente pedido reivindica prioridade a partir do Pedido de Patente Provisório U.S. N.° De Série 60/075 555, preenchido a 23 de Fevereiro, 1998, e a partir do Pedido de Patente Provisório U.S. N.° De Série 60/1 12 565, preenchido a 16 de Dezembro, 1998.

Ao longo deste pedido, são referenciadas várias publicações, muitas entre parênteses. As citações completas destas publicações são providenciadas no final de cada parte do pedido.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com um ácido indole-3-propiónico possuindo a fórmula:

R

R‘ onde R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são independentemente seleccionados do grupo constituído por hidrogénio, grupos alquilo substituídos, grupos alquilo não substituídos, grupos arilo substituídos, grupos arilo não substituídos, grupos alcóxi, grupos amino substituídos ou não substituídos, grupos tiol, grupos alquiltio, e grupos ariltio, ou um seu éster ou sal, com a utilização como um medicamento, e, mais particularmente, com a utilização de 2 ácido indole-3-propiónico para prevenir os efeitos citotóxicos da proteina beta amilóide, para tratar doenças fibrilogénicas, para reduzir a oxidação em amostras biológicas, e para tratar doenças ou outros estados onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um papel.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO É estimado que dez por cento das pessoas com idades superiores a 65 anos possui demência moderada a grave. A Doença de Alzheimer ("AD") é a causa mais comum de demência crónica com aproximadamente dois milhões de pessoas nos Estados Unidos da América possuindo a doença. Embora tenha sido considerada um estado da média idade, é agora conhecido que as lesões histopatológicas da Doença de Alzheimer (i.e., placas amilóides neuriticas, degeneração neurofibrilar, e degeneração neuronal granulovascular) são também encontradas nos cérebros de pessoas idosas com demência. 0 número de tais lesões correlaciona-se com o grau de deterioração intelectual. Esta prevalência elevada, combinada com a taxa de crescimento do segmento idoso da população, torna a demência (e particularmente a AD) um dos problemas de saúde pública mais importantes actuais. A deposição de amilóide cerebral é um marcador neuropatológico primário da Doença de Alzheimer. A amilóide é composta por um péptido com 40-42 aminoácidos chamado a proteina beta amilóide ("Αβ") (Glenner e Wong, 1984). Os depósitos de amilóide na AD são encontrados principalmente como componentes de placas senis, e nas paredes de vasos sanguíneos cerebrais e meníngeos (Robakis e Pangalos, 1994) . 3 A clonagem molecular mostrou que a Αβ compreende uma pequena região de uma proteína precursora de amilóide maior ("APP") (Robakis et al., 1987; Weidemann et al., 1989). Resumidamente, este é uma glicoproteína de membrana integral tipo I possuindo uma porção extracitoplásmica grande, uma região intracitoplásmica mais pequena, e um domínio transmembranoso único. A APP sofre modificações pós-translacionais extensivas (Pappolla e Robakis, 1995; Robakis e Pangalos, 1994) antes da secreção da sua porção N-terminal (Sambamurti et al., 1992; Robakis e Pangalos, 1994) . 0 processamento fisiológico de APP envolve a quebra na sequência Αβ por uma enzima não identificada, alfa-secretase (Anderson et al., 1991). Quantidades menores de moléculas de APP são quebradas em dois outros sítios que poderão potencialmente produzir APP segregada amiloidogenicamente ou ligada a membrana (Robakis e Pangalos, 1994) . A Αβ é também produzida durante o metabolismo celular normal (Haass et al., 1992 ; Shoji et al., 1992).

Existe alguma controvérsia no modo como a amilóide causa AD; no entanto, três linhas principais de evidência reforçaram a hipótese da amilóide. A primeira parte da evidência é providenciada pela identificação de vários pontos de mutações no gene APP. Estas mutações segregam num subgrupo de pacientes sofrendo de uma forma familiar da patologia e assim sugere uma relação patogenética entre o gene APP e a AD (Chartier-Harlin et al., 1991; Kennedy et al., 1993). Em segundo lugar a deposição de amilóide precede temporariamente o desenvolvimento de alterações neurofibrilares (Pappolla et al., 1996) e esta observação é também consistente com uma ligação entre a amilóide e a 4 degeneração neuronal. Finalmente, foi mostrado que a Αβ é tóxica para os neurónios (Yankner et ai., 1990; Behl et ai., 1992; Behl et ai., 1994; Zhang et ai., 1994), uma descoberta que também reforçou a hipótese de que o péptido amilóide poderá contribuir para a patologia neuronal na AD. A descoberta que a Αβ possui propriedades neurotóxicas providenciou uma possivel conecção entre a acumulação de amilóide e a neurodegeneração. Devido à associação íntima entre o envelhecimento e a AD e as semelhanças na neuropatologia de ambos os estados, foi proposto que a tensão oxidativa desempenha um papel na génese patológica de lesões da AD. Vários investigadores demonstraram que os radicais isentos de oxigénio ("OFRs") estão relacionados com as propriedades citotóxicas de Αβ (Behl, 1992; Behl, 1994; Harris et al. , 1995; Butterfield et al., 1994; Goodman e

Mattson, 1994). Tais descobertas são importantes, uma vez que os marcadores de dano oxidativo estão topograficamente associados às lesões neuropatológicas da AD (Pappolla et al., 1992; Furuta et al., 1995; Smith et al., 1995;

Pappolla et al., 1996). Devido a estas observações, foram propostos os antioxidantes como agentes terapêuticos potenciais na AD (Mattson, 1994; Hensley et al., 1994;

Pappolla et al., 1996).

Continua uma necessidade de métodos de tratar a AD e outras doenças fibrilogénicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção relaciona-se com um método de prevenir os efeitos citotóxicos da proteína beta amilóide nas células. 0 método inclui contactar as células com uma quantidade efectiva de um ácido indole-3-propiónico ou de um seu éster ou sal. A presente invenção relaciona-se adicionalmente com um método de tratar uma doença fibrilogénica num sujeito humano. 0 método inclui administrar, ao sujeito humano, uma quantidade de ácido indole-3-propiónico ou de um seu éster ou sal efectiva para inibir ou reverter a fibrilogénese. A presente invenção também se relaciona com um método de reduzir a oxidação numa amostra biológica. 0 método inclui contactar a amostra biológica com uma quantidade efectiva de um ácido indole-3-propiónico ou de um seu sal ou éster. A presente invenção relaciona-se ainda adicionalmente com um método de tratar doenças ou outros estados onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um role. 0 método inclui administrar, ao sujeito humano, uma quantidade de indole-3-propiónico ou de um seu éster ou sal efectiva para tratar tal doença ou estado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico de barras ilustrando as viabilidades expressas como percentagens utilizando células de neuroblastoma humanas SK-N-SH expostas quer a Αβ (25-35) sozinha ou em conjunção com IPA ou PBN. A Figura 2 é um gráfico de barras ilustrando as viabilidades expressas como percentagens utilizando células 6 de feocromocitoma de rato PC12 expostas quer a Αβ (25-35) sozinha ou em conjunção com IPA ou PBN. A Figura 1 é um gráfico de barras ilustrando as viabilidades expressas como percentagens utilizando células de neuroblastoma humanas SK-N-SH expostas quer a Αβ(1 -42) sozinha ou em conjunção com IPA ou PBN. A Figura 4 é um gráfico de barras ilustrando o grau de peroxidação lipidica (medida MDA) induzida por exposição das células quer a péptido amilóide Αβ (1-42) ou a DDTC sozinho ou cada um juntamente com IPA. A Figura 5 é um gráfico de barras mostrando a actividade antioxidante de IPA por prevenção da morte celular de células de neuroblastoma de rato PC12 induzida por inibição da superóxido dismutase por DDTC.

As Figuras 6A e 6B são gráficos de barras mostrando o efeito de IPA numa formação de lâmina de β após incubação de Αβ(1-40) durante 24 horas (Figura 6A) e 48 horas (Figura 6B) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada na descoberta de que o composto natural ácido indole-3-propiónico ("IPA") possui uma combinação de propriedades que o tornam particularmente útil para prevenir os efeitos citotóxicos da proteína beta amilóide em células, para tratar qualquer doença fibrilogénica, e para proteger as células de dano oxidativo. Concordantemente os compostos da presente invenção são agentes terapêuticos poderosos na Doença de 7

Alzheimer e outras doenças fibrilogénicas, tais como, sem limitação, doenças relacionadas com prião. Poderão também ser utilizados como um agente terapêutico para o tratamento de outras doenças onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um papel. Estas condições incluem a Doença de Parkinson, demência do corpo de Lewy, esclerose lateral amiotrófica, paralesia supranuclear progressiva, outras formas de amiloidoses, ataque, aterosclerose, enfisema, e algumas formas de cancro. Adicionalmente, os dados mostram que o IPA também possui actividade antifibrilogénica. A presente invenção providencia um método de prevenir os efeitos citotóxicos da proteina beta amilóide nas células. 0 método compreende expor as células a uma quantidade efectiva de um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster.

Como utilizado aqui, "proteina beta amilóide" ΓΑβ") refere-se ao péptido de 40-42 aminoácidos que forma a amilóide cerebral a qual é o marcador neuropatológico primário da Doença de Alzheimer ("AD"), e refere-se a fragmentos da Αβ capazes de provocar efeitos citotóxicos nas células. Por exemplo, um tal fragmento de Αβ é o fragmento formado por residuos de aminoácido 25-35 de Αβ (ver Glenner e Wong 1984 para a sequência de aminoácidos de Αβ, que é por este meio incorporado por referência).

Como utilizado aqui, os ácidos indole-3-propiónico significam incluir compostos possuindo a fórmula: 8

seleccionados do grupo constituído por hidrogénio, grupos alquilo substituídos, grupos alquilo não substituídos, grupos arilo substituídos, grupos arilo não substituídos, grupos alcóxi, grupos amino substituídos ou não substituídos, grupos tiol, grupos alquiltio, e grupos ariltio. Preferencialmente, R5 e R6 são hidrogénio. Um exemplo de um ácido indole-3- propiónico adequado é o ácido indole-3-propiónico, o qual possui a fórmula atrás onde cada um de R1, R2, R3, R4, R5, e R6 é um átomo de hidrogénio. Os substituintes preferidos são aqueles que não afectam significativamente as propriedades antioxidante e antifibrilogénica dos ácidos indole-3-propiónicos, como descrito em mais detalhe adiante. Outros substituintes preferidos são aqueles que intensificam a penetração no cérebro, tais como uma unidade lipofílica covalentemente ligada. Estes substituintes podem estar presentes em qualquer átomo do núcleo indole que possua um hidrogénio disponível. 0 modo de ligação da unidade lipofílica não é crítico, e pode ser efectuado por uma ligação carbono-carbono, carbono-oxigénio, carbono-azoto, ou carbono-enxofre. Para maximizar a lipofilicidade do composto resultante, no entanto, é preferido que a ligação seja efectuada de modo a minimizar a polaridade. Consequentemente, é preferido que a unidade lipofílica seja ligada através de uma ligação carbono-carbono. A unidade 9 lipofílica pode ser um hidrocarboneto, tal como um alquilo possuindo desde 5 a 20 carbonos. Estes alquilos podem ser não substituídos, tal como hexilo ou dodecilo, ou substituídos, tal como com uma unidade arilo, como no caso em que o alquilo substituído é um grupo benzilo ou um feniletilo. Alternativamente, a unidade lipofílica pode ser anéis homocíclicos substituídos ou não substituídos, tais como grupos fenilo ou uns grupos tolilo, sistemas anelares homocíclicos, anéis heterocíclicos, sistemas anelares heterocíclicos, ou unidades "cage" lipofílicas multicíclias, tais como o adamantano. Em particular, é particularmente vantajosa a utilização dos compostos "cage" multicíclios (Tsuzuki, 1991).

Alguns ácidos indole-3-propiónicos podem ser obtidos comercialmente. Outros podem ser preparados por modificações a procedimentos convencionais para a preparação de ácido indole-3-propiónico, tais como os descritos em Johnson e Crosby, 1969) e na Patente U.S. N.° 5 300 506, Patente U.S. N.° 5 077 293, e JP 03/127 732, cada uma das quais aqui incorporada por citação.

Como indicado atrás, a presente invenção pode também ser levada a cabo utilizando sais dos ácidos indole-3-propiónico descritos atrás. Os sais adequados incluem, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de sódio, sais de potássio, e sais de amónio. Os sais de ácido indole-3-propiónico podem ser feitos por métodos convencionais a partir do ácido indole-3-propiónico correspondente por mistura de uma solução aquosa ou dispersão do ácido com uma base adequada (e.g., sódio, potássio, ou hidróxido de amónio, ou carbonato de sódio ou de potássio) . 10

Em adição, também como indicado atrás, a presente invenção pode ser realizada utilizando ésteres dos ácidos indole-3-propiónico descritos acima. Exemplos de tais ésteres incluem éster metilico, éster etilico, éster propilico, éster benzilico, e semelhantes. Os ésteres do ácido indole-3-propiónico suportando uma unidade éster lipofilica, tal como aquelas descritas atrás, podem também ser utilizados vantajosamente para aumentar a penetração cerebral do éster do ácido indole-3-propiónico. Os ésteres do ácido indole-3-propiónico podem ser preparados a partir dos seus ácidos ou sais correspondentes por uma variedade de métodos conhecidos daqueles peritos na técnica, tais como, por exemplo, por primeiro transformar o ácido no cloreto de ácido e em seguida fazer reagir o cloreto de ácido com um álcool adequado. Outros métodos adequados de formar ésteres são descritos em Kemp e Vellaccio, 1980.

Preferencialmente, o ácido indole-3-propiónico, sal, ou éster possui propriedades antioxidativas e/ou antifibrilogénicas e/ou previne os efeitos citotóxicos de Αβ. Vários ácidos indole-3-propiónico, sais, e ésteres podem ser ensaiados prontamente para assegurar que a função de prevenir os efeitos citotóxicos de Αβ é retida utilizando a metodologia revelada aqui, tal como ensaios de viabilidade celular, peroxidação lrprdica, Ca intracelular, e radicais livres de oxigénio. A prevenção de outros efeitos citotóxicos de Αβ nas células pode ser prontamente observada microscopicamente, tais como a prevenção da degradação da membrana, retracção celular, distribuição anormal de cromatina, e cariorrexe. Os efeitos de anti-oxidação e antifibrilogénicos dos vários ácidos indole-3-propiónico podem ser ensaiados por métodos 11 convencionais, tais como aqueles descritos nos Exemplos deste pedido.

Como indicado atrás, os efeitos citotóxicos ou de morte celular de Αβ incluem, por exemplo, celular viabilidade diminuída (i.e., morte celular), peroxidação lipídica aumentada (um indicador de radicais livres de oxigénio aumentados) , níveis aumentados de Ca2+ intracelular, degradação da membrana difusa, retracção celular, distribuição anormal de cromatina através da membrana celular, e cariorrexe.

Os efeitos citotóxicos de Αβ são mais prontamente observados em células neuronais (incluindo células dos sistemas nervoso central e periférico), e ocorrem em sujeitos humanos sofrendo de doenças fibrilogénicas, tais como a Doença de Alzheimer. A quantidade efectiva do ácido indole-3-propiónico (ou seu sal ou éster) para prevenção dos efeitos citotóxicos de Αβ pode ser prontamente determinada por métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como estabelecendo curvas dose-resposta, como descrito adiante. Entender-se-á que a quantidade do ácido índole-3-propiónico realmente preferida (ou seu sal ou éster) a ser administrada de acordo com a presente invenção variará de acordo com a forma particular do ácido indole-3-propiónico (i.e., quer seja um sal, um éster, ou um ácido), a composição particular formulada, e o modo de administração. Muitos factores que poderão modificar a acção do ácido indole-3-propiónico (ou seu sal ou éster) podem ser tomados em conta por aqueles peritos na técnica; e.g., peso 12 corporal, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, estado do sujeito, combinações de fármacos, e sensibilidades e gravidades reaccionais. A administração pode ser levada a cabo continuamente ou periodicamente dentro da dose tolerada máxima.

As taxas de administração óptimas para um dado conjunto de condições podem ser determinadas por aqueles peritos na técnica utilizando testes de administração de dosagem convencionais. A invenção providencia adicionalmente um método de tratar doenças fibrilogénicas num sujeito humano. 0 método inclui administrar uma quantidade de um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster efectiva para inibir ou reverter a fibrilogénese, i.e., inibir ou reverter a formação de fibrilo. Como utilizado aqui, "doenças fibrilogénicas" pretende incluir qualquer doença ou estado envolvendo a indesejável deposição de fibrilos. Como seus exemplos não limitantes, tais doenças ou estados incluem patologias ou doenças resultantes da formação anormal de depósitos de amilóide ou semelhantes a amilóide, tais como, mas não limitados a, encefalopatias relacionadas com prião, demência ou doença de Alzheimer ("AD"), e outras patologias amilóidoses. Exemplos de encefalopatias relacionadas com prião incluem doença de Creutzfeldt-Jakob ("CJD") e doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker ("GSS") em seres humanos, tremor epizoótico em ovelhas e cabras, e encefalopatia espongiforme em gado. 13 A presente invenção providencia adicionalmente um método de tratar doenças ou outros estados onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um papel. 0 método inclui administrar uma quantidade de um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster efectiva para tratar a doença ou estado. As doenças ou estados onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um papel incluem, sem limitação, Doença Parkinson, demência do corpo de Lewy, esclerose lateral amiotrófica, paralesia supranuclear progressiva, enfisema, e algumas formas de cancro.

Uma vez que o ácido indole-3-propiónico e seus sais e ésteres são efectivos para tratar doenças ou outros estados onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um papel assim como para prevenir os efeitos citotóxicos da proteína beta amilóide nas células, é esperado que estes compostos sejam particularmente úteis no tratamento de doenças associadas à proteína beta amilóide, tais como a AD.

Para todas as indicações de ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster, as quantidades de dosagem adequada são discutidas atrás, e as vias de administração adequadas incluem administração sistémica (particularmente nos casos onde o ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster empregue é um que atravessa a barreira sanguínea cerebral). A administração sistémica inclui administração parentérica e oral, por exemplo, como discutido em detalhe adicional adiante. 0 ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster pode ser administrado sozinho ou em combinação com veículos 14 compatíveis como uma composição. Os veículos compatíveis incluem veículos ou diluentes farmacêuticos adequados. Os componentes do diluente ou veículo deverão ser seleccionados de modo a que não diminuam os efeitos terapêuticos do ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster como utilizado na presente invenção.

As composições poderão ser formadas em qualquer forma adequada para a utilização desejada; e.g., administração oral, parentérica, ou tópica. As formas de dosagem adequadas para utilização oral incluem comprimidos, pós dispersíveis, grânulos, cápsulas, suspensões, xaropes, elixires, e emplastros para a pele. Os diluentes e veículos inertes para os comprimidos incluem, por exemplo, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, e talco. Os comprimidos poderão também conter agentes granulantes e desintegrantes tais como amido e ácido algínico, agentes ligantes tais como amido, gelatina, e acácia, e agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio , ácido esteárico, e talco Os comprimidos poderão ser não revestidos ou poderão ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e a absorção. Os diluentes e veículos inertes que poderão ser utilizados em cápsulas incluem, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, e caulino. As suspensões, xaropes, e elixires poderão conter excipientes convencionais, por exemplo, metilcelulose, tragacanta, alginato de sódio; agentes humidificantes, tais como lecitina e estearato de polioxietileno; e conservantes, e.g., etil-p-hidroxibenzoato.

As formas de dosagem adequadas para administração parentérica incluem soluções, suspensões, dispersões, 15 emulsões, e semelhantes. Poderão também ser fabricadas na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou suspensas num meio injectável estéril mediatamente antes da utilização. Poderão conter agentes de suspensão ou de dispersão conhecidos na técnica. Exemplos de administração parentérica são a administração intraventricular, intracerebral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, rectal, e subcutânea. A presente invenção também se relaciona com um método de diminuir a oxidação numa amostra biológica. Exemplos dos tipos de oxidações que podem ser reduzidas utilizando este método incluem processos de peroxidação lipidica e oxidações que são mediadas por radicais livres de oxigénio. A amostra biológica pode ser, por exemplo, uma célula ou um grupo de células, e.g., um tecido. A amostra biológica é contactada com um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster, tais como as descritas atrás. 0 contacto pode ser levado a cabo utilizando qualquer método adequado. Por exemplo, o ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster pode ser distribuído no ambiente extracelular envolvendo a amostra biológica. Alternativamente, o ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster pode ser introduzido directamente numa célula, por exemplo, por microinjecção. A quantidade de ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster efectiva para reduzir os processos oxidativos pode ser determinada por métodos convencionais, tais como por distribuição de quantidades variáveis do ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster e monitorando a concentração dos produtos de oxidação, tais como radicais livres de oxigénio ou os produtos de peroxidação lipidica. 16 A presente invenção será melhor entendida com respeito aos exemplos não limitativos seguintes.

Exemplo 1

Foram conduzidos testes para determinar se o IPA tinha actividade neuroprotectora contra o péptido amilóide de Alzheimer ("Αβ"). A deposição cerebral amplamente difundida deste péptido de 40-43 aminoácidos causa uma degeneração extensiva e a morte de neurónios na Doença de Alzheimer.

Para ilustrar os efeitos citoprotectores do IPA contra os efeitos citotóxicos de Αβ. foram usadas células da linha celular de neuroblastoma humano SK-N-SH. Estas células foram expostas a Αβ (25-35) 50 μΜ, a actividade do fragmento tóxico de Αβ. (Yankner et al., 1990) com ou sem 50 μΜ de IPA. Como um controlo, as experiências foram repetidas sem Αβ. Como um controlo positivo, o anti-oxidante bem conhecido, fenil-iV-t-butilnitrona ("PBN") foi substituído por IPA.

Os resultados são mostrados na Figura 1 como um gráfico de barras ilustrando as viabilidades expressas como percentagens. Enquanto que a Αβ.sozinha tem um efeito citotóxico pronunciado nas células, ambos IPA e PNB têm actividade protectora forte.

Exemplo 2 A experiência do Exemplo 1 foi repetida usando células de feocromocitoma de rato PC12. Os resultados são mostrados na Figura 2 e são essencialmente idênticos aos resultados ilustrados na Figura 1. 17

Exemplo 3 A experiência do Exemplo 1 foi repetida usando o péptido Αβ(1-42) usando a linha celular de neuroblastoma humano SK-N-SH. Os resultados são mostrados na Figura 3 e são consistentes com aqueles mostrados com respeito ao Exemplo 1.

Exemplo 4

De modo a investigar a possibilidade de as propriedades citoprotectoras de IPA serem também o resultado, pelo menos em parte, da actividade antioxidante, foram testados os niveis de aldeído malónico ("MDA"), um marcador de peroxidação lipídica, em células PC12 expostas a Αβ ou a tensão oxidativa. A tensão oxidativa foi distribuída por exposição das células ao ditiocarbonato dietílico ("DDTC"), um inibidor da superóxido dismutase e um modelo estabelecido de lesão oxidativa. As células PC12 foram expostas tanto ao péptido amilóide sozinho ou ao péptido amilóide juntamente com IPA. Noutras experiências, as células foram expostas tanto a DDTC sozinho ou a DDTC com IPA. Os resultados são mostrados na Figura 4. Pode ser observado que o IPA diminui significativamente a produção de anidrido malónico em células tratadas, indicando que o IPA possui actividade antioxidante. A Figura 4 mostra ambas as actividades neuroprotectora e antioxidante do IPA.

Exemplo 5

Para confirmar adicionalmente as observações mostradas no Exemplo 4, nós estudamos se o IPA foi efectivo na prevenção da morte de células expostas a tensão oxidativa (DDTC). As células de neuroblastoma PC12 foram tratadas com quantidades variáveis de DDTC, com ou sem variação das quantidades de IPA. Os resultados são mostrados na Figura 18 5. É mostrada a actividade antioxidante de IPA na prevenção da morte celular de células de neuroblastoma induzida pela inibição da superóxido dismutase por DDTC. Isto está de acordo com os dados apresentados previamente em que IPA aumenta a sobrevivência das células expostas a DDTC.

Exemplo 6

Para determinar se o IPA teve um efeito na f ibrilogénese de Αβ Αβ (1-40) 150 μΜ foi incubada com IPA300 μΜ, sal de sódio, dissolvido em água ultra pura (i.e., destilada, filtrada, e esterilizada) a um pH de 7. Como um controlo, a água ultra pura utilizada para dissolver o IPA contendo uma quantidade equivalente de cloreto de sódio foi adicionada a Αβ (1-40) 150 μΜ a um pH de 7. Numa experiência, cada uma das soluções (i.e., a solução contendo IPA e a solução de controlo) foi encubada durante 24 horas. Numa segunda experiência, cada uma das soluções foi incubada durante 48 horas. No final de cada periodo de incubação foi adicionado tampão glicina-NaOH (pH 9,2) 50 mM contendo tioflavina T 2 μΜ a cada amostra (5 μΐ) para um volume final de 2 ml. Foi medida a fluorescência, que é uma medida directa da formação de lâminas de β, com um comprimento de onda de excitação de 435 nm e um comprimento de onda de emissão de 485 nm utilizando um espectrómetro de fluorescência Hitachi F-2000. Foi determinada a média dos desvios padrão e a média de 3 amostras por condição, e os resultados são apresentados (como gráfico de barras) na Figura 6A (24 horas de incubação) e na Figura 6B (48 horas de incubação). Em ambas as experiências de 24 e 48 horas de incubação, a quantidade de fluorescência é significativamente menos nas amostras contendo IPA (marcado A-beta + ipa) relativamente ao 19 controlo (marcado A-beta). Isto indica que ocorreu menor formação de lâminas de β nas amostras contendo IPA relativamente ao controlo, que, por sua vez, indica que o IPA é antifibrilogénico.

REFERENCIAS

Anderson, J.P., et al., Neurosci Lett 128:126-129 (1991) .

Behl, C., et al., Biochem Biophys Res Commun 186: 944-950 (1992).

Behl, C., et al., Brain Res 645:253-264 (1994).

Behl, C., et al., Cell 77:817-827 (1994).

Burdick, D., et al., J Biol Chem 267:546-554 (1992).

Busciglio, J., et al., Neurobiol Aging 13:609-612 (1992) .

Busciglio, J., et al., J Neurochem 61(4):1565-1568 (1993) .

Butterfield, D.A., et al., Biochem Biophys Res Commun 200:710-715 (1994).

Chartier-Harlin, M.C., et al., Nature 353(6347): 844- 846 (1991).

Copani, A., et al., Molecular Pharmacology 47(5): 890-897 (1995).

Furuta, A., et al., Am J Pathol 146:357-367 (1995).

Glanner, G. G., and Wong, C.W., Biochem Biophys Res Commun 120:885-890 (1984). 20

Goodman, Y., and Mattson, M.P., Exp Neurol 128: 1-12 (1994) .

Haass, C., et al., Nature 359:322-324 (1992).

Harris, M.E., et al., Experimental Neurol 131: 193-202 (1995) .

Hensley, K., et al., Proc Natl Acad Sei USA 91(8): 3270-32 74 (1994).

Johnson, H.E., and Crosby, D.G., J Org Chem, 25: 569ff (1969)

Kemp, D.S., and Vallaccio, F., eds., Organic Chemistry, Worth Publishers, Inc., pp. 371 -377 and 1258 (1980).

Kennedy, A.M., et al., Brain 116: 309-324 (1993) .

Le, W-D., et al., Brain Res 686:49-60 (1995).

Mark, R.J., et al., J Neurosci 15: 6239-6249 (1995).

Mattson, M.P., Ann N Y Acad Sei 747:50-76 (1994).

Mattson, M.P., et al., Trends Neurosci 16: 409-414 (1993) .

Mattson, M.P., et al., J Neurosci 12:376-389 (1992).

Pappolla, M.A., et al., Am J Pathol 140: 621-628 (1992) .

Pappolla, Μ. A., and Robakis, N.K., In: Perspectives in behavioural medicine, Alzheimer's disease and AIDS. Eds Stein, M., and Baum, M., Academic Press, San Diego, CA, pp. 3-20 (1995).

Pappolla, M.A., et al., Mol Chem Neuropathol 28: 21-34 (1996) . 21

Pike, C.J., et al., J Neurosci 13:1676-1 687 (1993).

Robakis, N.K., and Pangalos, M.N., Neurobiol Aging 15: S127-129 (1994).

Robakis, N.K., et al., Proc Natl Acad Sei USA 84: 4190-41 94 (1987).

Sambamurti, K., et al., J Neurosci Res 33: 319-329 (1992) .

Shoji, M., et al., Science 258: 126-1 29 (1992).

Smith, M.A., et al., Amer J Pathol 145:42-47 (1994).

Tsuzuki et al., Biocham Pharmacol, 41:R5-R8 (1991).

Weidamann, A., et al., Cell 57:115-126 (1989).

Weiss, J.H., et al., J Neurochem 62(1): 372-375 (1994).

Yankner, D.A., et al., Science 250: 279-282 (1990). Zhang, Z., et al., Neurosci Lett 177: 162-164 (1994).

Lisboa, 17 de Outubro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um ácido indole-3-propiónico possuindo a fórmula:

onde R1, R2, R3, R4, R1 e R2 são seleccionados independentemente do grupo constituído por hidrogénio, grupos alquilo substituídos, grupos alquilo não substituídos, grupos arilo substituídos, grupos arilo não substituídos, grupos alcoxi, grupos amino substituídos ou não substituídos, grupos tiol, grupos alquiltio, e grupos ariltio; ou um seu sal ou éster, para utilização como um medicamento.

2. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal de acordo com a reivindicação 1, em que R1 e R2 são hidrogénio.

3. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal de acordo com reivindicação 1, onde R1, R2, R3, R4, R1 e R2 são hidrogénio.

4. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um de R1, R2, R3, R4, R1 e R2 é uma unidade lipofílica ligada covalentemente. 1 Um ácido indole-3-propiónico ou um seu sal ou éster de 2 acordo com reivindicação 4, em que a unidade lipofílica é 2 seleccionada de um alquilo substituído ou não substituído possuindo de 5 a 20 carbonos, um anel homocíclico substituído ou não substituído, sistema de anel homocíclico, anel heterocíclico, ou unidade "cage" lipofílica multicíclica.

6. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu éster ou sal de acordo com qualquer uma das revindicações atrás para utilizar como um medicamento para o tratamento de doenças associadas aos efeitos citotóxicos da proteína beta amilóide.

7. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu éster ou sal de acordo com qualquer uma das revindicações 1-6, para utilizar como um medicamento para tratar uma doença f ibrilogénica tal como a doença de Alzheimer, uma encefalopatia relacionada com prião ou suas combinações.

8. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu éster ou sal de acordo com qualquer uma das revindicações 1-6, para utilizar como um medicamento para o tratamento de doenças ou outros estados onde os radicais livres e/ou a tensão oxidativa desempenham um papel, tais como doença de Parkinson, demência do corpo de Lewy, esclerose lateral amiotrófica, paralisia supranuclear progressiva, ataque, aterosclerose, enfisema e cancro.

9. Um ácido indole-3-propiónico ou um seu éster ou sal de acordo com qualquer uma das revindicações atrás para utilizar como um medicamento adequado para administração sistémica. 3

10. Uma composição compreendendo um ácido indole-3-propiónico ou um seu éster ou sal de acordo com qualquer uma das revindicações atrás em combinação com um veiculo ou diluente farmacêutico adequado, para utilizar como um medicamento.

11. Um método de reduzir a oxidação numa amostra biolóqica compreendendo contactar a amostra biolóqica com uma quantidade efectiva de um ácido indole-3-propiónico possuindo a fórmula:

onde R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são seleccionados independentemente do grupo constituído por hidrogénio, grupos alquilo substituídos, grupos alquilo não substituídos, grupos arilo substituídos, grupos arilo não substituídos, grupos alcoxi, grupos amino substituídos ou não substituídos, grupos tiol, grupos alquiltio, grupos ariltio e semelhantes; ou um seu sal ou éster.

12. Um método de acordo com a reivindicação 11, em que R5 e R6 são hidrogénio.

13. Um método de acordo com a reivindicação 11, em que R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são hidrogénio. 4

14. Um método de acordo com a reivindicação 11, em que pelo menos um de R1, R2, R3, R4, R5 e R6 é uma unidade lipofilica ligada covalentemente.

15. Um método de acordo com a reivindicação 14, em que a unidade lipofilica é seleccionada de um alquilo substituído ou não substituído possuindo desde 5 a 20 carbonos, um anel homocíclico substituído ou não substituído, sistema anelar homocíclico, anel heterocíclico, sistema anelar heterocíclico, ou unidade "cage" lipofilica multicíclica; ou um seu éster ou sal.

16. Um método de acordo com qualquer uma das revindicações 11-15, onde a amostra biológica é uma célula ou um grupo de células, e.g., um tecido.

17. Um método de acordo com qualquer uma das revindicações 11-16, em que a referida redução de oxidação resulta numa peroxidação lipídica decrescente e/ou radicais livres de oxigénio decrescentes. Lisboa, 17 de Outubro de 2006 1/4 F/Θ. /

{JJ Μ) + ΚΆΒΑ 31ΡΑ PBfM 50 μ Μ FIG.2 κι Ρϋ D α »4 Μ *“ Ο 540 5 20 i 100 80 80 40 -20 0

0 50 0 50 Α^25~ 35 ® + 50 μ Μ nada 31 PA ΡΒΝ 2/4 Π G. 3

( ρ JV?) + controlo tOOfjfVÍ 3-IPÂ 100jjM ΡΒΝ FfG. 4 <1 Ο 3 2,5 2 ί, 5 1 0,5 I JÍL ώ. χ τ Ο. η Μ <\1 ^ ^ *3 + ο- + ς & * 3. ÍTS r<f tf* CL 2X CL A ^ O ffio «jhQ^QhmO o <Kr~ O 10 Q hí o <3^ in 0 2 3/4 F/G.5

120- M DE VIABILID

025 22 55 000 ODTC fmM) 0 0 0 50100 100 500 50100500 ΙΡΑΙμΜΪ _X_ 4 4/4 Ff G- 6A 24 hrs a, y 3 U m o D & tu 0 A-BETA A-BETA + IPA Fí G. 6B

A-ΘΕΤΑ A-8ETA + IPA